AT396939B - Komplexes virales antigen von hiv-1 bindendes rekombinantes protein - Google Patents

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Description

AT 396 939 B
Humane monoklonale Antikörper (mAk) lassen sich hersteilen, indem man B-Lymphozyten von Menschen, welche gegen ein Antigen beispielsweise durch Krankheit eine Immunreaktion zeigen, gewinnt, und diese B-Lymphozyten durch Fusion mit geeigneten Zellinien, im besonderen mit Myelomzellinien, immortalisiert Solcherart gewonnene Hybrid-Zellinien, Hybridomas, dienen als Produktionsvehikel für m Ak's. Sie können in vitro S in Form von Zellkulturen eingesetzt werden und in dam erforderlichen Maßstab kultiviert werden (1).
Die dabei produzierte Substanz stellt im Regelfall einen kompletten mAk dar, charakterisiert durch 2 schwere Ketten und 2 leichte Ketten, welche untereinander durch Disulfidbriicken und durch nicht-kovalente Bindungen verbunden sind, und in ihrer Gemeinschaft den spezifisch bindenden Antikörper bilden (2).
DieStruktur eines solchen Antikörpers läßtsich unterteilen in einekonstanteRegion, welche für die sogenannten 10 Effektorfunktionen, wie z. B. Komplementaktivierung, verantwortlich ist, und in eine variable Region, welche die spezifische Bindung des jeweiligen Antigens hervorruft.
Antikörper können durch biochemische Methoden enzymatisch gespalten werden. Beispielsweise kann durch Papain bzw. durch Pepsin ein Teil der konstanten Region abgespalten werden. Die auf diese Weise hergestellten Fab* bzw. (FabOZ Fragmente sind in einer dem ursprünglichen Antikörper analogen Weise in der Lage, das betreffende 15 Antigen zu binden (2). Auch die proteolytische Abspaltung der kompletten konstanten Regionen, welche zu einem sogenannten Fv Fragment führt, wurde beschrieben. Sie ist jedoch bei weitem nicht so reproduzierbar durchführbar wie die weiter oben erwähnte Papain- bzw. Pepsin-Spaltung von Antikörpern (3,4). Mit Methoden der Gentechnik gelingt es jedoch, Fv Fragmente auf reproduzierbare Weise herzustellen. Die dazu notwendigen Voraussetzung«! sowie die angewandten Methoden werden in der Folge beschrieben. 20 Mt Hilfe von Routinemethoden wird eine cDNA Bank von einer mAk-produzierenden Hybridomzellinie hergestellt. Aus mAk-produzierenden Hybridomas wird gesamt-RNA isoliert. Diese RNA enthält neben ribosomaler RNA die Gesamtheit der Transkripte der Zelle. Es liegen sowohl unvollständig prozessierte, nukleäre Transkripte, als auch die reifen, cytoplasmatischen Transkripte, die sogenannten messenger RNA's, vor. Diese zeichnen sich durch einen poly-Adenosin-Schwanz am 3’-Ende aus. Diese poly-A Region kann verwendet werden, um durch 25 Affinitätschromatographie mit oligo-dT Zellulose die reifen mRNAs zu isolieren. Mt Hilfe des Enzyms "reverse
Transkriptase" kann die mRNA zu einer sogenannten cDNA umgeschrieben werden. Durch Verwendung geeigneter Vektoren kann das erhaltene Gemisch von cDNAs Moniert werden, was zu einer sogenannten cDNA Bank führt (5). Immunglobulin-spezifische Hybridisierungssonden erlauben die Identifikation und Isolierung von Klonen, welche die gewünschten Sequenzen enthalten. Durch Sequenzieren der DNA dieser Klone und Sequenzvergleich mit 30 bekanntenImunglobulingenen(EMBLNucleotideSequenceDataLibrary, Heidelberg, BRD) kann Sicherheitüber die Identität der Klone gewonnen werden (5). Auf diese Weise können beispielsweise Klone isoliert werden, die die Sequenzen der leichten bzw. der schweren Kette eines mAK tragen.
Durch Sequenzanalyse der solcherart erhaltenen Immunglobulin-cDNAs lassen sich durch Vergleich mit bekannten Immunglobulinsequenzen die einzelnen Domänen der schweren bzw. der leichten Kette identifizieren: 35 es ist möglich, die variable und die konstante Region zu identifizieren und z. B. innerhalb der variablen Region die sogenannten "hypervariablen" oder "complementarity determining regions", welche eigentlich für die spezifische Antigenbindung verantwortlich sind (6).
Solcherart Monierte Antikörpergene lassen sich in verschiedenen Systemen zur Expression bringen. Einerseits können tierischeZellkulturen verwendet werden, wie z. B. Myelomzellen, wenn man geeignete Expressionsvektoren 40 verwendet (7). Die Verwendung von Hefe (8) bzw. von Bakterienzellen (9) als Expressionsvehikel für komplette Antikörper istproblematisch, da solche Zellen offenbar nicht in der Lage sind, die für sie sehr großen Moleküle, wie Antikörper sie darstellen, korrekt zu synthetisieren. Erfolg in dieser Richtung zeichnete sich erst ab, als versucht wurde, Subfiagmente von Antikörpern in niederen Eukaryonten bzw. in Prokaryonten zur Expression zu bringen. Im Folgenden werden vier verschiedene Methoden beschrieben, welche die Expression von Fv bzw. Fab Fragmenten 45 in Escherichia coli erlauben:
Skerra und Plückthun (1988, (10)) insertierten die Gene für die variablen Regionen eines murinen anti-Phosphorylcholin -Antikörpers (McPC603) im Anschluß an die LacPromoter/Operator Region, gefolgt von je einer bakteriellen Leader-Sequenz, welche zur Ausschleusung der Produkte in den periplasmatischen Raum der Bakterien dienLEshandeltsichdabeiumdenLeaderdesoutermembraneproteinA(opmA)sowiederAlkalischenPhosphatase 50 (phoA). Nach Transfektion dieses Plasmids in Escherichia coli wurde die Expression von funktionellem, d. h. Antigen-bindendem Protein im periplasmatischen Raum der Bakterien nachgewiesen.
Better et al. (1988, (11)) produzierten das Fab-Fragment eines Chimären murin/humanen Antikörpers, welcher ein Gangliosid-Antigen, wie es häufig an der Oberfläche humaner Karzinomzellen gefunden wird, erkennt. Die hiebei angewandte Plasmidkonstruktion besteht aus dem Salmonella typhimurium araB Promoter, sowie der pelB 55 leader Sequenz jeweils vor der für die jeweilige Kette kodierenden Sequenz. Es wurden Antigen-bindende Fab Fragmente aus dem Kulturüberstand der transformierten Bakterien gewonnen,
Interessanterweise benützten sowohl Skerra und Plückthun (1988, (10)) und Better et al. (1988, (11)) sogenannte dicistronische Konstruktionen, d. h, solche, bei denen auf einem einzigen messenger-RNA Molekül die Information -2-
AT 396 939 B für die beiden getrennt zu exprimierenden Ketten vorliegt. Die Autoren geben an, daß dadurch die räumliche Nähe der entstehenden Polypeptidketten gewährleistet ist, welche eine Voraussetzung für die korrekte Zusammenlagerung der variablen Region der schweren (Vh) mit der der leichten Kette (Vl) Kette bildet.
Genau dieses Problem, nämlich die Ausbildung des Fv-Peptid-Heterodimers (in der Natur nicht kovalent verbunden) wurde von Huston et al. (1988,(12))und von Bird et al. (1988,(13))auf andere Weise zu lösen versucht, nämlich durch kovalente Verknüpfung der Ketten über eine Aminosäure-Linkersequenz, wie sie in der Natur nicht vorkommt. Diese Linkersequenz zeichnet sich dadurch aus, daß sie aus ein» bestimmten Zahl und Sequenz von Aminosäuren besteht, sodaß sie die Distanz, welche in der natürlichen Konformation eines Antikörpers zwischen den zu verbindenden Regionen besteht, überbrücken kann, ohne unnötigen Streß in die Konformation einzuführen:
Huston et aL (1988, (12)) verknüpften die variablen Regionen eines murinen anti-Digoxin Antikörpers über einen Link» von 15 Aminosäuren der Sequenz GGGGSGGGGSGGGGS. Die gewählte Anordnung war: Vh - Link» -Vl. Dieses sogenannte single-chain Fv Fragment wurde in Verbindung mit d» MLE Leader Sequ»iz unter der Kontrolle des synthetischen trp-Promoter/Operators in Form unlöslich» Inclusion bodies exprimiert. Nach deren Auflösung in 6M Guanidin-HCl und Entfernung des Leaders durch saure Hydrolyse zwischen den Aminosäuren Asp undPro, sowie nach einigen Chromatographieschritten wurde aküves, Antigen-bindendes single-chain Fv Fragment gewonnen.
Eine im Prinzip analoge Vorgangsweise wurde von Bird et al. (1988, (13)) für die Konstruktion eines murinen Antigen-bindenden Proteins, welches spezifisch Fluoreszein bindet, gewählt Diese Gruppe verwendete jedoch einen Link» von 18 Aminosäuren mit d» Sequenz KESGSVSSEQLAQFRSLD. Dieser Link» ist ein Teil d» Sequenz der humanen "carbonic Anhydrase", und wurde aus d» Brookhaven Proteinstruktur-Datenbank als Loopstniktur ausgewählt, welche räumlich genauaufdiePositiondermiteinanderzu verbindenden Aminosäuren des Fv Fragments paßt Die Anordnung der einzelnen Regionen war hier anders als bei Huston et al. (1988, (12)), nämlich Vl - Linker - Vh-
Die oben beschriebenen Genkonstruktionen zur Produktion von Antikörperfragmenten in Escherichia coli beziehen sich auf murine Sequenzen bzw. in einem Fall auf ein murin/human Chimäres. Es wurden noch keine entsprechenden Versuche mit humanen Sequenzen publiziert.
Fab', (Fab'te und Fv Fragmente bieten verschiedene Vorteile gegenüb» kompletten Antikörpern. Auf Grund ihrer Kleinheit im Vergleich zu kompletten Antikörpern können sie leichter und schneller diffundieren, sowohl in vitro als auch bei eventuellen in vivo Applikationen. Aus demselben Grund sind sie gen»ell leicht» handhabbar und sind in den meisten Fällen, bei denen die Funktionen der konstanten Regionen (z. B. Effektorfunktionen, Bindung an Zellrezeptoren, Bindung an andere Moleküle) nicht benötigt w»den bzw. sogar Nachteile bringen, kompletten Antikörpern gleichwertig bzw. gegebenenfalls sogar vorzuziehen. Beispielweise entstehen beimTumor-Imaging bei der Verwendung komplett» Antikörper häufig Probleme durch unspezifische Hintergrundsignale, welche durch unspezifische Bindung der Antikörper an Zellrezeptoren, vermittelt durch die konstanten Regionen d» Antikörper, bedingt sind. Es ist bekannt, daß bei Verwendung von Fab-Fragmenten solche Probleme reduzi»t werden können. Es ist demnach zu erwarten, daß der Einsatz von Fv-Fragmenten bzw. von single-chain Fv-Fragmenten weitere Verbesserungen in dies» Beziehung bringen wird (13,12).
Bis jetzt wurde mit Antikörpern murinen Ursprungs gearbeitet, welche an kleine, gut beschrieb»» Antigene, wie Fluoreszein bzw. Digoxin binden. Die gesamte Genkonstruktion ist darauf aufgebaut, daß als Antigen eine niedermolekulare Substanz (MG kleiner 1000) gebunden wird. Die in der Natur bei weitem am häufigsten vorkommenden antigenen Substanzen sind Peptide, Peptidoglycane, Proteine und Polysaccharide, und als solche hochmolekluar.
Erfindungsgemäß enthält das Protein der eingangs genannten Art nur die variablen Regionen eines von der Zellinie 3D6 (Accession Nr. 87110301, PHLS, Porton Down, UK (1,14,15,16)) stammenden Antikörpers. Damit wird erstmals ein Protein humanen Ursprungs erhalten, welches die gewünschten Bindungseigenschaften aufweist und welches auch in einzelligen Mikroorganismen, wie Hefe oder Bakterien, exprimiert werden kann.
Weiters wird gemäß der vorliegenden Erfindung die Herstellung einer single-chain Konstruktion, die von einem humanen Antikörp» abgeleitet ist, beschrieben. Diese single-chain Konstruktion bind» an ein hochmolekulares, komplexes, virales Antigen, im Gegensatz zu kleinen, gut definierten Antigenen.
Es war nicht vorauszusehen, daß die entsprechenden Methoden zur Konstruktion der single-chain Fragmente auch bei anderen als den publizierten Antikörpern, im besonderen bei humanen Antikörpern, zu funktionellen, d. h. Antigenbindenden Molekülen führen würden.
Desgleichen liegt es nicht auf d» Hand, daß komplexe Antigene wie z. B. Antigene an d» Oberfläche von Viren, bei denen erfahrungsgemäß eine größ»e Zahl von Aminosäuren an der Antigen-Antikörperbindung beteiligt sind als bei kleinen Antigenen, in der gleichen Weise Manipulationen im Bereich d» variablen Regionen der entsprechen-den bindenden Antikörp» tolerieren.
Ausgehend von der Zellinie 3D6, welchen einen humanen monoklonalen Antikörper des Typs IgGl/kappa -3-
AT 396 939 B produziert, welcher spezifisch mit HIV-l-gp41 reagiert, und eine schwache Kreuzreaktion mit HIV-1 gpl20 zeigt (3D6; (1,14,15,16)), wurdegesamt-RNA isoliert Dabei wurde die Methode derGuanidin-IsothiocyanatExtraktion und Ultrazentrifugation über einen Polster von 5,7M CsCl angewandt (5).
Aus der gesamt-RNA wurde durch Adsorption an oligo-dT-Cellulose die poly A+ - Fraktion, also die mRNA 5 isoliert. (mRNA purification Kit Fa. Pharmacia, Schweden).
Die mRNA diente als Substrat für die Synthese von cDNA (cDNA synthesis Kit Fa. Pharmacia, Schweden).
Die Klonierung der cDNA Bank erfolgte im Plasmidvektor pUC19. Die rekombinanten Plasmide wurde in Escherichia coli, Stamm HB 101, transformiert und auf LB Medium (5) kultiviert
PositiveKlone wurden durch Hybridisierung mit spezifischen Oligonucleotid-Sonden identifiziert. Die Sequenzen 10 fürdieSondenwurdenderEMBLDNA-SequenzDatenbankauskonstantenRegionen von humanen IgGl-schweren bzw. Kappa-leichten Ketten entnommen. Die durch positive Hybridisierungssignale identifizierten Klone wurden durchRestriktionsanalyse weiter charakterisiert und diejenigen Klone, welche die Plasmide mit den längsten Inserts tragen, identifiziert. Durch Sequenzanalyse dieser Klone wurde je ein Klon mit der kompletten kodierenden Region für die schwere bzw. für die leichte Kette des Antikörpers identifiziert. Diese Klone tragen die Bezeichnung 15 nUC3D6HC (SEQ ID NO: 1) bzw. PUC3D6LC (SEQ ID NO: 2).
Beispiel 1
In der Sequenz der Inserts der Klone pUC3D6HC (SEQ Π) NO: 1) bzw. pUC3D6LC (SEQ ID NO: 2) wurden dieübergangsstellen zwischen der Region des Leaderpeptids und der variablenRegion sowie zwischen der variablen 20 Region und der konstanten Region identifiziert. Durch Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese (in vitro mutagenesis
System, Amersham, UK) wurden an diesen Übergangsstellen die folgenden Mutationen durchgeführt (siehe auch Frg.1-4): 1) Erkennungssequenzen für bestimmte Restriktionsenzyme wurden hineinmutiert. Mit Hilfe dieser 25 Restriktionsstellen wurden die variablen Regionen der schweren bzw. der leichten Kette des Antikörpers 3D6 aus den jeweiligen Plasmiden herausgeschnitten. 2) Die für die spätere Expression benötigten Start- und Stopcodons wurden einmutiert
Um die variablen Regionen des Antikörpers 3D6 mit einem Linker verknöpfen zu können, wurden zwei 30 synthetische Oligonucleotide hergestellt, welche die beiden DNA-Stränge des Linkers bilden. Die beiden Oligonucleotide wurden so gewählt, daß, wenn sie miteinander hybridisieren, eine Doppelstrang-DNA entsteht, an deren Enden überhängende einzelsträngige DNA Regionen vorliegen, welche genau denjenigen überhängenden Enden entsprechen, die beim Schneiden mit den entsprechenden Restriktionsenzymen an den oben erwähnten einmutierten Restriktionsstellen entstehen. Dies erlaubt die Ligation der mit Hilfe dieser Restriktionsenzyme 35 isolierten variablen Regionen mit den synthetischen Oligonucleotiden des Linkers.
Durch Ligation der 3 entsprechend vorbehandelten Fragmente (VH, Linker, VL) miteinander wurde ein Gen erhalten, welches an denübergangsstellen zwischen den variablen Regionen und dem Linker noch die hineinmutierten Restriktionsstellen trug, welche Nucleotide beinhalten, die nicht den an diesen Stellen natürlich vorkommenden Nucleotiden entsprechen. Dadurch ergab sich auch eine veränderte Aminosäuresequenz (Fig. 5 und 6). 40 Um die ursprüngliche Aminosäuresequenz wiederherzustellen, wurde an den erwähnten Übergangsstellen durch einen neuerlichen Mutationsvorgang die erwünschte DNA Sequenz hergestellt (Fig. 5 und 6).
Mit Hilfe dieser Methoden wurde also ein Gen konstruiert, daß die Struktur Vh - Linker - Vl besitzt. Dieses Konstrukt wird als sc3D6 (single-chain 3D6) bezeichnet, und wurde in den Klonierungsvektor pUCl9 insertiert (SEQ ID NO: 3). Der resultierende Vektor trägt die Bezeichnung nUCsc3D6. 45 Das sc3D6-Gen wurde aus dem Plasmid pUCsc3D6 durch Restriktionsenzyme herausgeschnitten, und in den bakteriellen Expressionsvektor pKK223-3 (Pharmacia) insertiert, welcher den mit Isopropyl-ßthio-galactosid (DPTG) induzierbaren tac-Promoter enthält Der resultierende Vektor trägt die Bezeichnung nKKsc3D6 und wurde in den E. coli Stamm JM105 transformiert. 50 Kultivierung der Bakterien
Die transformierten Bakterien wurden in einem Laborfermenter bis zu einer OD600 von 2,0 in LB Nährmedium (5) kultiviert Danach erfolgte die Induktion der Expression durch Zugabe von Isopropylthiogalaktosid (IPTG). Die Bakterien wurden 3 Stunden in Gegenwart von IPTG weiterkultiviert, sodann durch Zentrifugation geerntet und bei -80 °C gelagert Danach wurde das Protein extrahiert und gereinigL 55
Extraktion und Reinigung Für jeden Versuchsansatz wurden 10 g Biomasse (Naßgewicht) eingesetzt Die Zellen wurden mittels Lysozym -4-
AT 396 939 B aufgeschlossen. Die gefrorene E. coli-Paste wird in kleine Stücke gebrochen und mit STE-Puffer (10 mM Tris, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH 8,0) wird eine 10 %-ige Suspension bereitet Zu dieser Suspension wird ein Aufschlußcocktail, der Nukleasen, Lysozym und Inhibitoren enthält hinzugefügt (siehe Tabelle 1).
DieseE.coli-Suspensionwirdl5Minutenbei420Cinkubiert DurchZugabe von Triton-X-100 (Endkonzentration 0,5 %) und einer neuerlichen fünfminütigen Inkubation bei 42 °C werden die Zellen lysiert
Ernten derlnchisinnbodies
Das Sediment wird in STE-Puffer resuspendiert und 8 h bei 4 °C gerührt. Die Inclusionbodies werden durch Zentrifugation angereichert Hierzu wird ein Glycerinkissen (50 % Glycerin/in Phosphate Buffered Saline (PBS)) in Zentrifugenröhrchen vorgelegt mit dem gleichen Volumen Suspension überschichtet und zentrifugiert (30 Minuten, 6000 ipm, 4 °C, JA-20 Rotor, J2-21 Zentrifuge, Fa. Beckman). Lösen der Inclusionbodies
Die angereicherten Inclusionbodies werden in 6M GuHCl (Guanidinhydrochlorid) in PBS, pH 8,3 unter Rühren bei 4 °C (12 h) gelöst Anschließend wird der Proteingehalt photometrisch bestimmt
Refolding
Das in GuHCl gelöste Protein wird in Gegenwart von Fremdproteinen umgefaltet Zunächst erfolgte eine Proteinbestimmung. Die gelösten Inclusionbodies werden mitRefolding-Puffer (GuHCl IM, Glutathion reduziert 30 mM, Glutathion oxidiert 3 mM, EDTA 100 μΜ, in PBS, pH 8,3) so verdünnt daß die Endkonzentration 80 mg Protein/1 beträgt
Das Verdünnen der gelösten Inclusionbodies erfolgt im Labormaßstab unter Verwendung einer Bürette durch langsames Zutropfen der Proteinlösung in den Refolding Buffer. Man arbeitet am besten bei 37 °C.
Die Rückfaltung wurde mittels Reversed-phase HPLC verfolgt Dazu wurden Proben entnommen, der pH-Wert auf 5,5 gestellt um ein weiteres Refolding zu unterbinden, die Probat zentrifugiert (Millipore Tischzentrifuge, 4700 ipm, Zimmertemperatur), sterilfiltriert (Porenweite 0,22 μτη, low protein binding), falls nötig aufkonzentriert (Millipore, Tischzentrifuge, 4700 rpm, 20 °C) und jeweils 250 μΐ mittels Reversed Phase Chromatography HPLC analysiert (Nucleosil 300, 5 μτη. 4 x 125 mm., Fa. Macherey und Vogel, BRD. Ein linearer Gradient 0,1 % TFA/Acetonitril 10 - 60 % wurde innerhalb von 40 Minuten an die Säule angelegt).
Der umgefaltete sc3D6 wird ultradiafiltrieit Es wird eine 10000Dalton cutoff Polysulfonmembrane verwendet Die diafiltrierte Proteinlösung wird auf einen Anionen tauscher aufgetragen und dann mit 100 mM NaCI von der Säule eluiert. Der sc3D6 wird mit Sephadex G-25 (Fa. Pharmacia, Schweden) Gelfiltration entsalzt und nach der Methode von Nakane et al. (17) mit alkalischer Phosphatase konjugiert.
Das gereinigte sc3D6 Protein wurde durch SDS-PAGE kontrolliert (Fig. 7). Zum Nachweis der Funktionalität des sc3D6 Proteins wurde ein Western Blot Test mit HIV-l-Teststreifen (Fa. BioRad, USA) durchgeführt. Als positive Kontrolle wurde ein analoger Test mit dem aus tierischen Zellen isolierten, natürlichen Antikörper durchgeführt. Als negative Kontrolle diente eine Präparation von gesamt-Protein aus E. coli. Das Ergebnis dieses Tests war positiv und ist in Fig. 8 gezeigt.
Reinigung von sc3D6 Protein mittels Affinitäts-chromatoaraphie
Mit dem entsprechend gereinigten sc3D6 Protein wurde ein Kaninchenserum unter Standardbedingungen mit komplettem Freundschen Adjuvans hergestellt. Mit Hilfe von CM-Sephaiose Fast Flow Chromatographie (Fa. Pharmacia, Schweden) wurde die IgG Fraktion aus dem Kaninchenserum gewonnen. Die Spezifität der Antikörper wurde mittels ELISA festgestellt. Mit Hilfe eines Peptidsynthesizers wurde das 15 Aminosäuren lange Linkeipeptid (Sequenz: GGGGSGGGGSGGGGS) hergestellt und anschließend mittels Carbodiimidkondensation mit Rinderserumalbumin (BS A) im molaren Verhältnis von 6:1 konjugiert. Mit diesem Konjugat wurden Mikrotiterplatten beschichtet Die Serumprobe wurde in den beschichteten Mikrotiterplatten inkubiert, und der gebundene Antikörper wurde mit einem Peroxidase-markierten Ziege-Anti-Kaninchen IgG nachgewiesen. Das derartig hergestellte und überprüfte anti-sc3D6 IgG an eine BiCN aktivierte Sepharose 4B (Fa. Pharmacia, Schweden) gebunden. Das nicht gebundene Material wurde ausgewaschen. Ein vorgereinigter Extrakt von sc3D6 Protein, der wie oben beschrieben rückgefaltet und mit Sephadex G-25 (Fa. Pharmacia, Schweden) entsalzt wurde, wurde auf die anti-sc3D6 Säule aufgetragen. Das nicht gebundene Material wurde ausgewaschen und das spezifisch gebundene sc3D6 Protein wurde mit einem 0,1M Glycin HCl Puffer pH 2,5 eluiert. Anschließend wurde das Eluat mit IM Tris Puffer neutralisiert und sc3D6 Protein wie beschrieben auf mittels SDS-Elektrophorese charakterisiert und mittels Western Blot auf Funktionalität überprüft
Eine andere Methode zur immunaffinitätschromatographischen Reinigung von sc3D6 Protein ist wie folgt:
Mit dem oben beschriebenen an BSA gekoppelten Linkerpeptid wurde ein Kaninchenserum mit Hilfe von -5-
AT 396 939 B komplettem Freundschen Adjuvans hergestellt. Die IgG Fraktion wurde durch CM-Sepharose Fast Flow Chromatographie (Fa. Pharmacia, Schweden) gewonnen und über eine BS A-Sepharose 4B Säule (Fa. Pharmacia, Schweden) weitergereinigt, um die anti-BSA Antikörper zu entfernen. Das so gewonnene anti-Linker IgG wurde an eine BrCN aktivierte Sepharose 4B (Fa. Pharmacia, Schweden) gekoppelt. Ein vorgereinigter Extrakt von sc3D6 5 Protein, der wie oben beschrieben rückgefaltet und mit Sephadex G-25 (Fa. Pharmacia, Schweden) entsalzt wurde, wurde auf die anti-Linker Säule aufgetragen. Das nicht gebundene Material wurde ausgewaschen und das spezifisch gebundene sc3D6 Protein wurde mit einem 0,1M Glycin HCl Puffer pH 3,0 eluiert Anschließend wurde das Eluat mit IM Tris Puffer neutralisiert und das sc3D6 Protein wie beschrieben mittels SDS-Elektrophorese charakterisiert und mittels Western Blot auf Funktionalität überprüft 10
Immunaffinitätschromatograohische Reinigung von HIV-1 gpl60
Zur Herstellung einer sc3D6-Immunaffinitätssäule wurde das gereinigte sc3D6 Protein auf eine 1 ml NHS Säule (Fa. Pharmacia, Schweden) gebunden (lt Protokoll der Fa. Pharmacia).
Die Vorreinigung des gpl60 (des coat Proteins von HIV-1, welches vom Antikörper 3D6 sowie vom sc3D6 IS Protein spezifisch gebunden wird) wurde nach Barrett et aL (18) durchgeführt
Das vorgereinigte Material, welches das rekombinante gpl60 enthält, wurde über eine Ultra/Diafiltration ankonzentriert und für die sc3D6-ImmunafiMtätschromatographie konditioniert Dieses konditionierte Material wurde auf die sc3D6-Immunaffinitätssäule aufgetragen. Als Äquilibrierungspuffer wurde ein 100 mM Tris Puffer pH 7,4 mit 0,1 % Tween 20 verwendet Das rekombinante Antigen wurde mit 3M Rhodanid eluiert. Die Ausbeuten 20 der einzelnen Stufen sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Beispiel 2
Eine andere Klonierung des sc3D6, bei der das sc3D6-Gen mit dem aus Escherichia coli isolierten Gen für Alkalische Phosphatase (EcphoA) fusioniert wurde, wurde wie folgt ausgeführt; 25 Das sc3D6-Gen wurde aus dem Plasmid pUCsc3D6 durch Restriktionsenzyme herausgeschnitten, und in den
Vektor pEcphoAMut3 (19) insertiert Der resultierende Vektor trägt die Bezeichnung pAPsc3D6. Der Vektor pEcphoAMut3 enthält das aus Escherichia coli isolierte Gen für Alkalische Phosphatase (20) in welches durch Olignucleotid-gerichtete Mutagenese am 3'-Ende der codierenden Region eine Restriktionsstelle einmutiert wurde, welche die Fusion des EcphoA-Gens mit anderen Genen erlaubt Auf diese Weise können durch Expression eines 30 Fusionsgens Fusionsproteine, d. h. Proteine, bei denen die jeweiligen codierenden Regionen untereinander durch Peptidbindungen über Aminosäuren verknüpft sind, hergestellt werden.
Das EcphoA - sc3D6 Fusionsgen wurde aus pAPsc3D6 mit Restriktionsenzymen herausgeschnitten und in den bakteriellen Expressionvektor pKK223-3 (Fa. Pharmacia, Schweden) insertiert. Das resultierende Plasmid trägt die Bezeichnung pKKAPsc3D6. 35 Das Plasmid pKKAPsc3D6 wurde in den Escherichia coli Stamm JM105 transformiert und die transformierten
Bakterien in LB Nährmedium (5) kultiviert. Nach Induktion mit IPTG wurde aktives EcPhoA - sc3D6Fusionsprotein aus dem periplasmatischen Raum der Bakterien wie folgt gereinigt:
Die Bakterien werden durch Zentrifugation geerntet und mit einem 10 mM Tris Puffer pH 7,5, der mit 30 mM NaG versetzt ist, gewaschen. Die gewaschenen Bakterien werden in 33 mM Tris Puffer pH 7,5 resuspendiert und 40 mit dem gleichen Volumen 40 % Saccharoselösung in (33 mM Tris Puffer) versetzt und EDTA auf eine Endkonzentration von 0,1 mM zugegeben. Nach 10 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur werden die Bakterien abzentrifugiert und in 0,5 mM MgG2 Lösung aufgenommen. Nach lOminütiger Inkubation bei 0 X wird ein Proteaseinhibierungscocktail, der aus PMSF und EGTA besteht, zugesetzt und die Bakterien abzentrifugiert. Der Überstand wird mit IM Tris Lösung pH 7,5 auf eine Endkonzentration von 25 mM Tris gebracht Durch diese 45 Prozedur wird der periplasmatische Raum der E. coli Zellen freigelegt.
Durch Zentrifugation bei 12000 g wird die Proteinlösung geklärt und anschließend über Ultrafiltration ankonzentriert
Das EcPhoA-sc3D6 Protein wird mit Hydrophobie Interactionchromatographie weiter gereinigt Eine Phenylsepharose Fast Flow (Fa. Pharmacia, Schweden) wurde mit 60 % gesättigter Ammoniumsulfatlösung in 50 25mMTrisPufferpH 7,5 äquilibriert. Die Proteinlösung wurde abwechselndmitdem Äquilibrierungspuffer auf die Säule aufgetragen. Das sc3D6 wirdmiteinem linearen Gradienten von 60 % Ammoniumsulfatauf 0 % Ammoniumsulfat eluiert Die Fraktionen welche das EcPhoA-sc3D6 Protein enthalten weiden durch Gelfiltration entsalzt
Zum Nachweis der Funktionalität des EcPhoA-sc3D6 Proteins wurde ein Western Blot Test mit HTV-1-Teststreifen (Fa. BioRad, USA) durchgeführt Zur Kontrolle wurde ein analog«1 Test mit dem aus tierischen Zellen 55 isolierten, natürlichen Antikörper durchgeführt Als negative Kontrolle diente eine Präparation von gesamt-Protein aus E. coli. Das Ergebnis dieses Tests war positiv und ist in Abbildung 8 gezeigt -6-
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Direkter Nachweis von HIV-1 Antigen mittels ELISA
Ein gpl20-spezifischer monoklonaler Antikörper (Klon 25 C2, Accession Nr. 89120601, PHLS, Porten Down, UK) wurde auf Mikrotiteiplatten (Grade I, Fa. Nunc, Dänemark) beschichtet. HIV-1 hältiger Kulturüberstand (16) wurde auf die beschichteten Mikrotiterplatten aufgetragen. Als Standard wurde rekombinantes gpl60 (18) verwendet
Nach Auswaschen des ungebundenen Materials wurde das EcPhoA-sc3D6 Protein aufgetragen und inkubiert Das ungebundene Matmal wurde neuerlich ausgewaschen und mit p-Nitrophenylphosphat wurde das gebundene EcPhoA-sc3D6 Protein photometrisch bei 602 nm nachgewiesen. In Abbildung 9 ist die Standardkurve und verschiedene Proben von HIV-1 positiven Kulturüberständen dargestellt.
Kompetitiver Anti-HIV-ΐ ELISA
Mikrotiterplatten (Grade I, Fa. Nunc, Dänemark) wurden miteiner Lösung von 10 mg/ml rekombinantem gpl60 (18) beschichtet Sodann wurden die Platten mit PBS + 0,1 % Poly(oxyethylen)n-sorbitan-monolaurat (Tween 20) + 1 % BSA gewaschen.
EineLösung von 5 pg/ml EcPhoA-sc3D6 Fusionsprotein wurde im Verhältnis 1:1 mitHIV-1 positiven bzw. HIV-lnegativenSerengemischtundaufdiebeschichtetenPlatten aufgetragen. AlsKontrolle wurde mitVerdünnungspuffer gemischtes EcPhoA-sc3D6 Fusionsprotein aufgetragen und bei 37 °C 60 min. inkubiert Danach wurde das ungebundene Material ausgewaschen.
Durch Zugabe von p-Nitrophenylphosphat wurde der Anteil an gebundenem EcPhoaA-sc3D6 Protein nachgewiesen. Die entstandene Farbe wurde photometrisch bei 602 nm quantifiziert Die Inhibition der Sera wurde in Prozenten der Extinktion von EcPhoA-sc3D6 Protein ohne Serum ermittelt Wie in Abbildung 10 dargestellt, inhibieren alle HIV-1 positiven Sera die Bindung von EcPhoA-sc3D6 Fusionsprotein an gpl60. Alle HIV-1 negativen Sera zeigten weniger Inhibition als die HIV-1 positiven Sera.
Beispiel 3
Eine andere Expressionsart für das sc3D6 Protein, bei welcher Maus-Myelomzellen als Wirtszellen benutzt wurden, wurde wie folgt ausgeführt:
Der 3' Teil des sc3D6-Gens wurde aus dem Plasmid pUCsc3D6 (SEQ ID NO: 3) durch partiellen EcoRV Verdau sowiedurchkomplettenHindin Verdau isoliert (LängedesFragments: 401bp).AusdemPlasmidpUC3D6HC(SEQ ID NO: 1) wurde der 3' Teil des Gens für die schwere Kette durch Schneiden mitEcoRV und Hindin entfernt In den verbleibenden Vektor wurde das über Agarose-Gelelektrophorese isolierte und gereinigte 401 bp Fragment des sc3D6-Gens insertiert Das so rekombinierte Gen besteht also aus der Sequenz für das Leaderpeptid der schweren Kette des Antikörpers 3D6, gefolgt von der Sequenz des sc3D6 Gens. Das Plasmid trägt die Bezeichung nLsc3D6. Diese Konstruktion erlaubt die Ausschleusung des sc3D6 Proteins in tierischen Zellen. Das codierende Gen wurde aus pLsc3D6 mit den Enzymen Ncol und Hindin isoliert, die überhängenden Enden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt und in die Smal Stelle des für tierischeZellen geeigneten Expressionsvektors pRcRSV (Invitrogen, USA) kloniert. Die Smal Stelle dieses Expressionsvektor liegt zwischen dem Long Terminal Repeat von RSV, also einem Starken viralen Promoter, undTranskriptions-Terminationssequenzen, welche ursprünglich vomRinder-Wachstums-hormon stammen. Durch Insertion in diese Restriktionsstelle ist es möglich, beliebige Strukturgene in eine molekulare Umgebung zu bringen, welche die Expression der Gene in tierischen Zellen erlaubt. Außerdem besitzt der Vektor pRcRSV noch einen Selektionsmarker "Neomycinresistenz", welcher die Selektion von erfolgreich transformierten tierischen Zellen in der Kultur erlaubt.
Das solcherart konstruierte Plasmid trägt die Bezeichnung pRcRSVLsc3D6. Es wurde in Mausmyelomzellen der Linie P3-X63-Ag8.653 (21) transfiziert. Nach Selektion von transformierten Zellen mit dem Antibiotikum Neomycin wurden in 2 Klonierungs- und Screeningrunden insgesamt 5 Klone selektiert, welche das sc3D6 Gen exprimieren. Die Expressionslevei der einzelnen Klone wurden mittels Antigen-spezifischem ELISA getestet und liegen zwischen 0,5 und 1 ug/ml.
Der das sc3D6 Protein enthaltende Kulturüberstand der transfizierten Mausmyelomzellen wurde durch Zentrifugation bei 5000 g in einer Becherzentrifuge geklärt. Der geklärte Kulturüberstand wurde um das 10-fache durch Ultrafiltration (Minitan, PTGC, cut off 10000 Dalton, Fa. Millipore) aufkonzentriert und mit einem 50 mM Tris Puffer pH 7,2 mit dem 5-fachen Volumen diafiltriert.
Die diafiltrierte Proteinlösung wurde mit Q-Sepharose Fast Flow (Fa. Pharmacia, Schweden) weitergereinigt (Äqulibrierungspuffer 50 mM Tris Puffer pH 7,2). Die Elution des sc3D6 Proteins erfolgte mit 150 mM NaCl. Das gereinigte Protein wurde mittels Antigen-spezifischem ELISA getestet.
Die Ausbeuten der einzelnen Reinigungsstufen sind in Tabelle 3 dargestellt. -7-
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Beispiel 4
DasPlasmid pRcRS VLsc3D6 wurde in Chinese Hamster Ovary (CHO) Zellen transfiziert. In analog» Weise wie in Beispiel 3 beschrieben, wurden transformierte Zellen selektiert und gescrecnt und das sc3D6 Protein aus dem Zellkulturüberstand gereinigt. Die Testung der Expressionsleveis mittels Antigen-spezifischem ELISA brachte 5 Werte zwischen 1 und 5 pg/ml Antikörper.
Beispiel 5
Das sc3D6-Gen wurde aus dem Plasmid pUCsc3D6 durch Restriktionsenzyme herausgeschnitten und in den Hefe-Expressionsvektor pGl (Qontech Laboratories Ine., Palo Alto, USA) insertiert. In dieser Konstruktion wird 10 das sc3D6-Gen unter die Regulation des durch Galaktose induzierbaren GALl-Promoters gestellt Das Konstrukt wurde in den Saccharomyces cerevisiae Stamm SHY2 (trpl*) transfiziert und in Medium ohne Tryptophan auf Komplementierung der Tryptophan-Auxotrophie selektiert. Positive Transformanten wurden isoliert und zur Produktion von sc3D6Protdnherangezogen. Die Bedingungen für die Kultivierung des Produktionsstammes, sowie für die Isolierung, Aufarbeitung und Reinigung des Produktes erfolgten gemäß Standardprotokollen (22). 15
Beispiel 6
Das sc3D6-Gen wurde aus dem Plasmid pUCsc3D6 durch Restriktionsenzyme herausgeschnitten und in den Vector pAc373 insertiert (23). Dieses rekombinante Plasmid wurde gemeinsam mit DNA des Baculovirus Autographa califomica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) in die von Spodoptera frugiperda stammende Zellinie 20 Sf9 transfiziert. Die Kultivierung der Sf9 Zellen »folgte gemäß Standardmethode, wie im Katalog d» American Type Culture Collection beschrieben. 3 bis 5 Tage nach der Transfektion wurden Plaques von rekombinanten Viren mikroskopisch identifiziert und isoliert. Um sicher zu gehen, daß die isolierten rekombinanten Viren nicht durch Wildtypviren kontaminiert sind, wurden drei weitere Plaqu»einigunsvorgänge angeschlossen. Infektion von Sf9 Zellen mit rekombinantem Virus führte nach 3 bis 5 Tagen zur Lyse der infizierten Zellen, und, damit verbunden, 25 zur Produktion von sc3D6 Protein im Überstand des Zellysats. Das sc3D6 Protein wurde aus diesem Überstand in analoger Weise wie in Beispiel 3 beschrieben gereinigt und analysiert Auf diese Weise konnte die Funktionalität dieses rekombinanten Proteins nachgewiesen werden.
Beispiel 7 30 Die für das Protein Avidin codierende Sequenz (24) wurde durch synthetische Oligonucleotide als synthetisches
Gen hergestellt, und zwar so, daß zusätzlich am 5'-Ende des Gens die Sequenz des Leadeipeptids für E. coli Alkalische Phosphatase (20) und am 3'-Ende eine Polylinkerregion zur Insertierung ander» Gene vorliegt In dies» Polylinkenegion insertierte Gene werden unter geeigneten Bedingungen als Fusionsproteine mit Avidin als Fusionspartner exprimiert Mit Hilfe des am 5'-Ende befindlichen Lead»s werden diese Fusionsproteine in aktiv» 35 Form in den periplasmatischen Raum von Escherichia coli ausgeschleust Dieses Konstrukt wurde in eine geeignete
Restriktionsstelle des bakteriellen Expressionsvektors pET-3a (25) insertiert, welch» zur Expression Moniert» Gene den Bacteriophage T7-01O Promotor sowie den 0 Terminator enthält. Der resultierende Vektor trägt die Bezeichnung pET-3a-Av.
DerBacteriophageT7-0lOPromotorhatdieEigenschaft,inAbwesenheitderBacteriophageT7RNAPolymerase 40 in E. coli Zellen nicht transkribiert zu werden. Wird jedoch beispielsweise eine dichtgewachsene E. coli Kultur mit einem Phagen-Vektor, welch» die genetische Information für die T7 Polymerase trägt, infiziert, so führt die dadurch produzierte T7 Polymerase zur Expression von Genen, die beispielsweise in Vektoren wie dem oben beschriebenen Moniert vorliegen. Diese Eigenschaft ist für die Expression von Avidin und Avidin-Fusionsproteinen in E. coli sehr wichtig, da das Avidin für wachsende E. coli Kulturen toxisch ist. 45 Das sc3D6 Gen wurde aus dem Vektor pUCsc3D6 durch Restriktionsenzyme herausgeschnitten und in die
Polylinkenegion des Vektors pET-3a-Av insertiert. Der resultierende Vektor trägt die Bezeichnung pET-3a-Av-sc3D6. Geeignete E. coli Wirtszellen (z. B. HMS174) wurden mitdiesem Vektor transformiert und kultiviert. Sobald die Kultur eine ODßQO von 0,6 eneicht hatte, wurde mit dem Bact»iophagen CE6 (Lambda cIts857Sam7) (25) welcher das BacteriophagenT7 Genl trägt, infiziert. Die dadurch gebildeteT7 Polymerase führtezur Expression des 50 Avidin-sc3D6 Fusionsproteins im periplasmatischen Raum der E. coli. SobalddieExpressionihr Maximum eneicht hatte (je nach Kulturbedingungen zwischen 3 und 12 Stunden nach Infektion mit dem Phagen), wurde das rekombinante Protein in analoger Weise wie in Beispiel 2 beschrieben freigesetzt und durch Ultrafiltration ankonzentriert.
Die konzentrierte Proteinlösung wird über eine Gelchromatographiesäule (Sephacryl S 200 Fa. Pharmacia) 55 weit»g»einigtundeinzweitesMalmittelsUltradiafiltrationankonzentriert.DieseLösungwirdaufeineBiotinsäule aufgebracht. Das entsprechende Fusionsprotein Avidin-sc3D6 bleibt spezifisch gebunden. Die Verunreinigungen werdenausgewaschen. Die so hergestellte Affinitätssäulewurde für dieReinigungvon rekombinantem gpl60 analog -8-
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Beispiel 1 eingesetzt, das heißt, die vorgereinigte Proteinlösung nach Barrett et al. (18) wurde auf die Affinitätssäule aufgetiagen und nach Auswaschen des ungebundenen Materials wurde das rekombinante gpl60 mit 3M Rhodanid eluierL Die dabei erzielten Ausbeuten verhalten sich analog den in Tabelle 2 dargestellten Ergebnissen.
Tabelle 1
Aufschlußchemikalien in der Zellsusnension.
Substanz Endkonzentration Lysozym 0,2 mg/ml RNase 15 U/ml DNase 15U/ml EDTA 100 mM
Tabelle 2
Ausbeuten der einzelnen Stufen der immunaffinitätschromatographischen Reinigung von rekombinantem gp!60 mit sc3D6 als Affinitätsligand
Stufe Volumen (ml) Protein (mg) gp 160 (mg) Ausbeute Extraktion 7000 38200 600 100% Lentil-Sepharose sc3D6*Affinitäts- 520 1000 372 62% Chromatographie 130 148 144 24%
Tabelle 3
Ausbeuten der einzelnen Stufen der Reinigung von sc3D6 Protein aus dem Kulturflberstand von transformierten Mausmveiomzellen.
Stufe Volumen (ml) Protein (mg) Titer Kulturüberstand 3500 7600 1:256 Ultradiafiltraiion 350 5300 1:2048 Q-Sepharose 50 72 1:10000
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ART DES MOLEKÜLS: Plasmid-DNA mit Insert von humaner cDNA URSPRÜNGLICHE HERKUNFT ORGANISMUS: Mensch UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: NAME DER ZELLINIE: 3D6 40 45 50 MERKMAT .F: von 1 bis 36 bp Plasmid pUC19 Polylinker von 37 bis 1527 bp Insert schwere Kette des Antikörpers 3D6 von 37 bis 98 bp 5' nicht translatierte Region von 99 bis 1526 bp codierende Region von 99 bis 155 bp Signalpeptid von 156 bis 1526 bp reifes Peptid von 156 bis 533 bp variable Region von 156 bis 245 bp Rahmenregion 1 von 246 bis 260 bp Hypervariable Region 1 von 261 bis 302 bp Rahmenregion 2 von 303 bis 353 bp Hypervariable Region 2 von 354 bis 449 bp Rahmenregion 3 von 450 bis 500 bp Hypervariable Region 3 von 501 bis 533 bp Rahmenregion 4 von 534 bis 1526 bp konstante Region von 1527 bis 1547 bp Plasmid pUC 19 Polylinker EIGENSCHAFTEN: cDNA Klon der schweren Kette des Antikörpers 3D6 insertiert in das Plasmid PUC19. -11- 55
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GTGAATTCGA GCTCGGTACCC GGGGATCCTC TAGAGTCCCÄ GCCCTGAGAT TCCCAGGTGT TTCCATTCAG TGATCAGCACT GAACACAGAG GACTCACC ATG GAG TTG GGÄ CTG AGC TGG ATT TTC CTT TTG GCT ATT TTA AAA MET Glu Leu Gly Leu Ger Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys -15 -10 -5 GGT GTC CAG TGT GAA GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG Gly Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 1 5 10 GTA CAG CCT GGC AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 15 20 25 TTC ÄCC TTT AAT GAT TAT GCC ATG CAC TGG GTC CGG CAA GCT CCA Phe Thr Phe Asn Asp Tyr Ala MET His Trp Val Arg Gin Ala Pro 30 35 40 GGG AÄG GGC CTG GAG TGG GTC TCA GGT ATA AGT TGG GAT AGT AGT Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asp Ser Ser 45 50 55 AGT ATA GGC TAT GCG GAC TCT GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC serble Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 60 65 70 AGA GAC AAC GCC AAG AAC TCC CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGT CTG Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin MET Asn Ser Leu 75 80 85 AGA GCT GAG GAC ATG GCC TTA TAT TAC TGT GTA AAA GGC AGA GAT Arg Ala Glu Asp MET Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Lys Gly Arg Asp 90 95 100 TAC TAT GAT AGT GGT GGT TAT TTC ACG GTT GCT TTT GAT ATC TGG Tyr Tyr Asp Ser Gly Gly Tyr Phe Thr Val Ala Phe Asp Ile Trp 105 110 115 120 GGC CAA GGG ACA ATG GTC ACC GTC TCT TCA GCC TCC ACC AAG GGC Gly Gin Gly Thr MET Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 125 130 135 CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 140 145 150 GGC ACA GCA GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 155 160 165 CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 170 175 180 CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 185 190 195 AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 200 205 210 TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 215 220 225 -12-
AT 396 939 B 3 AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 230 235 240 CCG TGC CCA GCÄ. CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 245 250 255 TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu MET Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 GAG GTC ACA -TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His GlU Asp Pro Glu 275 280 285 GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly val GlU val His Asn Ala 290 295 300 AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC TCC ACG TAC CGT GTG Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 320 325 330 GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 335 340 345 GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg GlU Pro Gin 350 355 360 GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin 365 370 375 GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAÄ GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 380 385 390 GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAG Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro GlU Asn Asn Tyr Lys 395 400 405 ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 410 415 420 AGC AAG CTC ACC GTG GÄC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val 425 430 435 TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACA Phe Ser Cys Ser Val MET His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 440 445 450 CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TGA Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Stop 455 460
GACCTGCAGG CATGCAAGCT T 13-
AT 396 939 B SEQIDNO:2 ART DER SEQUENZ: Nucleotide mit entsprechendem Protein SEQUENZLÄNGE: 945 Basenpaare STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: zirkulär
ART DES MOLEKÜLS: Plasmid-DNA mit Insert von humaner cDNA URSPRÜNGLICHE HERKUNFT ORGANISMUS: Mensch UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: NAME DER ZELLINIE: 3D6 MERKMALE: von 1 bis 21 bp Plasmid pUC19 Polylinker von 22 bis 732 bp Insert leichte Kette des Antikörpers 3D6 von 22 bis 27 bp 5' nicht translatierte Region von 28 bis 732 bp codierende Region von 28 bis 93 bp Signalpeptid von 94 bis 732 bp reifes Peptid von 94 bis 408 bp variable Region von 94 bis 162 bp Rahmenregion 1 von 163 bis 195 bp Hypervariable Region 1 von 196 bis 240 bp Rahmenregion 2 von 241 bis 261 bp Hypervariable Region 2 von 262 bis 357 bp Rahmenregion 3 von 358 bis 378 bp Hypervariable Region 3 von 379 bis 408 bp Rahmenregion 4 von 409 bis 732 bp konstante Region von 733 bis 905 bp 3' nicht translatierte Region von 906 bis 945 bp Plasmid pUC 19 Polylinker EIGENSCHAFTEN: cDNA Klon der leichten Kette des Antikörpers 3D6 insertiert in das Plasmid PUC19.
GTGAATTCGA GCTCGGTACC CCACAGC ATG GAC ATG AGG GTC CCC GCT CAG CTC CTG GGG CTC CTG CTG CTC 72 MET Asp MET Arg Val -18 Pro Ala Gin Leu Leu -13 Gly Leu Leu Leu Leu -8 TGG CTC CCA GGT GCC AAA TGT GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCT 117 Trp Leu Pro Gly Ala -3 Lys Cys Asp Ile Gin 3 MET Thr Gin Ser Pro 8 TCC ACC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC 162 Ser Thr Leu Ser Ala 13 Ser Val Gly Asp Arg 18 Val Thr Ile Thr Cys 23 CGG GCC AGT CAG AGT ATT AGT AGG TGG TTG GCC TGG TAT CAG CAG 207 Arg Ala Ser Gin Ser 28 Ile Ser Arg Trp Leu 33 Ala Trp Tyr Gin Gin 38 AAA CCA GGG AAA GTC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AAG GCA TCT AGT 252 Lys Pro Gly Lys Val 43 Pro Lys Leu Leu Ile 48 Tyr Lys Ala Ser ser 53 -14-
AT 396 939 B TTA GAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA TCT GGG Leu GlU Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly ser Gly 58 €3 68 ACA GAA TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAT GAT TTT Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Asp Asp Phe 73 78 83 GCA ACT TAT TAC TGC CAA CAG TAT AAT AGT TAT TCT TTC GGC CCT Ala Thr Tyr Tyr cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Ser Phe Gly Pro 88 93 98 GGG ACC AAA GTG GAT ATC AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val 103 108 113 TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp GlU Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala 118 123 128 TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT ccc AGA GAG GCC AAA Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 133 138 143 GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG Val Gin Trp Lys val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 148 153 158 GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC GlU ser Val Thr GlU Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 163 168 173 AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA Ser ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 178 183 188 GTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val 193 198 203 ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAG Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Stop 208
CACCTGCTCC TCAGTTCCAG CCTGACCCCC TCCCATCCTT TGGCCTCTGA CCCTTTTTCC ACAGGGGACC TACCCCTATT GCGGTCCTCC AGCTCATCTT TCACCTCACC CCCCTCCTCC TCCTTGGCTT TAATTATGCT AATGTTGGAG GAGAATGAAT AAATAAAGTG AATGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGCAAGCT TGG SEQ ID NO: 3 ART DER SEQUENZ: Nucleotide mit entsprechendem Protein SEQUENZLÄNGE: 776 Basenpaare STRANGFORM: Einzelstrang TOPOLOGIE: zirkulär
ART DES MOLEKÜLS: Plasmid-DNA mit Insert von engineerter humaner cDNA URSPRÜNGLICHE HERKUNFT ORGANISMUS: Mensch UNMITTELBARE EXPERIMENTELLE HERKUNFT: NAME DER ZELLEMIE: 3D6 -15- 5
AT 396 939 B 10 15 20 MERKMALE; von 1 bpbis 13 von 14 bpbis 760 von 14 bpbis 16 von 14 bpbis 394 von 17 bpbis 106 von 107 bpbis 121 von 122 bpbis 163 von 164 bpbis 214 von 215 bpbis 310 von 311 bpbis 361 von 362 bpbis 394 von 395 bpbis 440 von 441 bpbis 760 von 441 bpbis 508 von 509 bpbis 542 von 543 bpbis 588 von 589 bpbis 607 von 608 bpbis 703 von 704 bpbis 724 von 725 bpbis 757 von 758 pbbis 760 von 761 bpbis 776 bp Plasmid pUC19 Polylinker bp Insert sc3D6 bp Start codon bp Variable Region schwere Kette bp Rahmenregion 1 schwere Kette bp Hypervariable Region 1 schwere Kette bp Rahmenregion 2 schwere Kette bp Hypervariable Region 2 schwere Kette bp Rahmenregion 3 schwere Kette bp Hypervariable Region 3 schwere Kette bp Rahmenregion 4 bp Linker bp Variable Region leichte Kette bp Rahmenregion 1 leichte Kette bp Hypervariable Region 1 leichte Kette bp Rahmenregion 2 leichte Kette bp Hypervariable Region 2 leichte Kette bp Rahmenregion 3 leichte Kette bp Hypervariable Region 3 leichte Kette bp Rahmenregion 4 bp Stop codon bp Plasmid pUC 19 Polylinker EIGENSCHAFTEN: Klon des Einzelketten-Fv-Fragments des Antikörpers 3D6 insertiert in das Plasmid 25 PUC19. 30 35 40 45 50 AAÄAGAÄTTC CCC 13 ATG GAA GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG CCT 58 MET GlU Val Gin Leu 5 Val Glu Ser Gly Gly 10 Gly Leu Val Gin Pro 15 GGC AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTT 103 Gly Arg Ser Leu Arg 20 Leu Ser Cys Ala Ala 25 Ser Gly Phe Thr Phe 30 ÄÄT GAT TAT GCC ATG CAC TGG GTC CGG CAA GCT CCA GGG AAG GGC 148 Asn Asp Tyr Ala MET 35 His Trp Val Arg Gin 40 Ala Pro Gly Lys Gly 45 CTG GAG TGG GTC TCA GGT ATA AGT TGG GAT AGT AGT AGT ATA GGC 193 Leu GlU Trp Val Ser 50 Gly Ile Ser Trp Asp 55 Ser Ser Ser Ile Gly 60 TAT GCG GAC TCT GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAC 238 Tyr Ala Asp Ser Val 65 Lys Gly Arg Phe Thr 70 Ile Ser Arg Asp Asn 75 GCC AAG AAC TCC CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGT CTG AGA GCT GAG 283 Ala Lys Asn Ser Leu 80 Tyr Leu Gin MET Asn 85 Ser Leu Arg Ala Glu 90 G&C ATG GCC TTA TAT TAC TGT GTA AAA GGC AGA GAT TAC TAT GAT 328 Asp MET Ala Leu Tyr 95 Tyr Cys Val Lys Gly 100 Arg Asp Tyr Tyr Asp 105 AGT GGT GGT TAT TTC ACG GTT GCT TTT GAT ATC TGG GGC CAA GGG 373 Ser Gly Gly Tyr Phe 110 Thr Val Ala Phe Asp 115 Ile Trp Gly Gin Gly 120 CA ATG GTC ACC GTC TCT TCA GGT GGC GGT GGC TCG GGC GGT GGT 418 xhr MET Val Thr Val 125 Ser Ser Gly Gly Gly 130 Gly Ser Gly Gly Gly 135 16- 55

Claims (12)

  1. AT 396 939 B ATG ACC CAG TCT CCT 463 MET Thr Gin Ser Pro 150 GTC ACC ATC ACT TGC 508 Val Thr Ile Thr Cys 165 GCC TGG TAT CAG CAG 553 Ala Trp Tyr Gin Gin 180 TAT AAG GCA TCT AGT 598 Tyr Lys Ala Ser Ser 200 GGC AGT GGA TCT GGG 643 Gly Ser Gly Ser Gly 215 CAG CCT GAT GAT TTT 688 Gin Pro Asp Asp Phe 230 TAT TCT TTC GGC CCT 733 Tyr Ser Phe Gly Pro 245 760 GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCT GAC ATC CAG Gly Ser Gly Gly Gly 140 Gly Ser Asp Ile Gin 145 TCC ACC CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA Ser Thr Leu ser Ala 155 Ser Val Gly Asp Arg 160 CGG GCC AGT CÄG AGT ATT AGT AGG TGG TTG Arg Ala Ser Gin Ser 170 Ile Ser Arg Trp Leu 175 AAA CCA GGG AAA GTC CCT AAG CTC CTG ATC Lys Pro Gly Lys Val 1S5 Pro Lys Leu Leu Ile 190 TTA GAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC Leu Glu Ser Gly Val 205 Pro Ser Arg Phe Ser 210 ACA GAA TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGC CTG Thr Glu Phe Thr Leu 220 Thr Ile Ser Ser Leu 225 GCA ACT TAT TAC TGC CAA CAG TAT AAT AGT Ala Thr Tyr Tyr Cys 235 Gin Gin Tyr Asn Ser 240 GGG ACC AAA GTG GAT ATC AAA CGÄ TAA Gly Thr Lys Val Asp 250 GCTTCTGCÄC CATCTG Ile Lys Arg Stop--- 776 PATENTANSPRÜCHE 1. An ein komplexes virales Antigen von HIV-1 bindendes rekombinantes Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es nur die variablen Regionen eines von der Zellinie 3D6 stammenden Antikörpers enthält
  2. 2. Rekombinantes Protein nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es die variable Region der schweren Kette gemäß SEQ ID NO: 1 enthält
  3. 3. Rekombinantes Protein nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die variable Region der leichten Kette gemäß SEQ ID NO: 2 enthält
  4. 4. Rekombinantes Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es gemäß SEQ ID NO: 3 aufgebaut ist, wobei die variable Region der schweren Kette mit der variablen Region der leichten Kette über einen Linker verbunden ist
  5. 5. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA Insertion sc3D6 bzw. eine mit dieser Insertion hybridisierende Sequenz oder eine durch Degeneration aus dem exprimierten Protein abgeleitete Sequenz in ein Plasmid eingeführt, mit diesem Plasmid ein Wirt transformiert und das Konstrukt exprimiert wird.
  6. 6. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es als Fusionsprotein, insbesondere zusammen mit Alkalischer Phosphatase oder zusammen mit Avidin, exprimiert wird. -17- AT 396 939 B
  7. 7. Insertion zum Einsatz in dem Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertion sc3D6 die in SEQ ID NO: 3 angegebene Nucleotidsequenz aufweist
  8. 8. Verfahren zur Reinigung des rekombinanten Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeich-5 net, daß spezifische Antikörper gegen das Protein und/oder gegen den Linker zwischen den beiden variablen Anteilen eingesetzt weiden.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Reinigung eingesetzten Antikörper an einem Träger immobilisiert sind. 10
  10. 10. Verfahren zur Isolierung und/oder Reinigung von HIV-1 Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung und/oder Reinigung durch Affinitätschromatographie erfolgt wobei, gegebenenfalls nach entsprechender Vorreinigung, das sc3D6 Protein oder das Avidin-sc3D6 Protein als Ligand für die Affinitätschromatographie eingesetzt wird. 15
  11. 11. Vorfahren zum direkten Nachweis von HIV-1 Antigen, dadurch gekennzeichnet daß ein Fusionsprotein eingesetzt wird, welches EcphoA-sc3D6 Protein als kombiniertes Detektions- und Signalprotein beinhaltet
  12. 12. Verfahren zum Nachweis von HIV-1-positiven Seren in kompetitiven Immunassays, dadurch gekennzeichnet, 20 daßeinFusionsprotein eingesetzt wird, welchesEcphoA-sc3D6 Protein aiskombiniertes Detektions-undSignalprotein enthält 25 Hiezu 5 Blatt Zeichnungen 30 35 40 45 50 -18- 55
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