DE60023915T2

DE60023915T2 - Replikationsprotein-a-bindendes transkriptionsfaktor (rbt1) und dessen verwendungen

Info

Publication number: DE60023915T2
Application number: DE60023915T
Authority: DE
Inventors: A. Moulay ALAOUI-JAMALI; John Myung-Jae Westmount CHO
Original assignee: CENTRE FOR TRANSLATIONAL RESEARCH IN CANCER MONTREAL; CT FOR TRANSLATIONAL RES IN CA
Current assignee: CENTRE FOR TRANSLATIONAL RESEARCH IN CANCER MONTREAL; CT FOR TRANSLATIONAL RES IN CA
Priority date: 1999-08-19
Filing date: 2000-08-17
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2020-08-18
Also published as: AU6675900A; ATE309354T1; DE60023915D1; EP1206542B1; CA2377730A1; WO2001014546A3; WO2001014546A2; EP1206542A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
(a) Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Replikationsprotein A (RPA) und insbesondere einen RPA-Transkriptionsfaktor.
(b) Beschreibung des Standes der Technik
Replikationsprotein A (RPA), auch als Replikationsfaktor A (RFA) bekannt, ist ein ubiquitäres, häufig vorkommendes heterotrimeres Protein, das für die Replikation, Reparatur und Rekombination der DNA in Eukaryonten benötigt wird. RPA bindet unspezifisch einzelsträngige DNA und spielt eine wesentliche Rolle bei der Regulation des DNA-Metabolismus über vielfache Proteinwechselwirkungen und/oder RPA-Phosphorylierung. Insbesondere bindet RPA einzelsträngige DNA mit starker Affinität (Assoziationskonstante von 10²–10¹³ M^–1) und der größten Affinität für Polypyrimidin-Trakte. RPA bindet auch doppelsträngige DNA mit geringerer Affinität und erleichtert wahrscheinlich das DNA Unwinding. RPA kann bei der Regulation der Transkription durch das Binden von regulatorischen Elementen in Promotoren eine Rolle spielen; in Hefe bindet RPA bestimmte regulatorische Sequenzen in den Promotoren von DNA-Reparatur- und Metabolismusgenen (Singh K. et al., 1995, Proceedings of the National Academy of Science USA 92(11): 4907-11).
RPA ist aus drei Untereinheiten aufgebaut: einer 70-kDa-Untereinheit (RPA70), einer mittleren 32-KDa-Untereinheit (RPA32) und einer 14-kDa-Untereinheit (RPA14). Die RPA32- Untereinheit ist in Zellzyklus-abhängiger Weise phosphoryliert.
RPA-Protein-Wechselwirkungen scheinen weitgehend durch die große 70-kDa-Untereinheit (RPA70) vermittelt zu sein. RPA70 steht in Wechselwirkung mit den p53, GAL4, VP16, EBNA1 und SV40T Antigenen und mit DNA-Polymerase Alpha (Wold, M., 1997, Annual Review of Biochemistry, "Replication Protein A: A Heterotrimeric, Single-Stranded DNA-binding Protein Required for Eukaryotic DNA Metabolism"). Es ist auch bei der Wechselwirkung mit DNA-Reparaturproteinen wichtig, die mit der Erkennung und dem Herausschneiden von Fehlern beschäftigt sind.
Die Wechselwirkung mit XPF stimuliert die 5'-bindungsspezifische Endonucleaseaktivität, die Wechselwirkung mit XPG richtet diese Endonuclease auf beschädigte DNA und die Wechselwirkung mit ERCC1 (ERCC1 bindet ferner den xeroderma pigmentosum Gruppe A Faktor, XPA, der ein weiterer NER-Faktor ist) fördert die Exonucleaseaktivität.
Die Möglichkeit der Wechselwirkung durch die vorstehend genannten Reparaturproteine mit RPA 32 wurde nicht vollständig aufgeklärt. Die Wechselwirkungen mit einigen Proteinen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, scheinen jedoch von RPA32 vermittelt zu werden, wie z. B. die Wechselwirkung mit XPA und Uracil-DNA-Glykosylase (Nagelbus, T. A. et al., 1997, Journal of Biological Chemistry, 272(10), S. 6561–6566). Eine Region mit signifikanter Homologie zwischen Uracil-DNA-Glykosylase und XPA wurde ebenfalls berichtet, was die Möglichkeit eines gemeinsamen Bindungsmotivs an RPA32 über mehrere verschiedene Proteine nahelegt. Ferner scheinen an einigen wichtigen Proteinwechselwirkungen, wie z. B. RAD52, alle drei Untereinheiten von RPA beteiligt zu sein (Hays, S. et al., 1998, Molecular and Cellular Biology 18(7): 4400–4406).
In Zellen wird RPA durch DNA-abhängige Proteinkinase (DNA-PK) phosphoryliert, wenn RPA während der S-Phase und nach der DNA-Beschädigung an einzelsträngige DNA gebunden ist; und möglicherweise auch durch ATM.
Die Phosphorylierung von RPA wird in einer Zellzyklus-abhängigen Weise und in Reaktion auf DNA-Beschädigung (d. h. UV-Licht, Röntgenstrahlen, Cisplatin) in eukaryontischen Systemen beobachtet. Diese Phosphorylierung findet vorherrschend an der N-terminalen Region von RPA32 statt, und bisher wurde angenommen, dass sie durch DNA-abhängige Proteinkinase (DNA-PK) bewirkt wird. Die RPA-Hyperphosphorylierung findet jedoch auch in SCID-Zellen statt, in welchen angenommen wird, dass DNA-PK für ihre Reparatur und Rekombinationsdefekte verantwortlich ist. Mutiertes Ataxia telangiectasia-Gen (ATM), eine wichtige Zellzyklus-Checkpoint-Proteinkinase, die zu der gleichen Kinasefamilie wie DNA-PK gehört, kann für die in vivo-Phosphorylierung von RPA32 verantwortlich sein. In Saccharomyces cerevisiae ist das ATM-Homolog, MEC1, für die RPA-Phosphorylierung essenziell. Ferner ist die durch ionisierende Strahlung induzierte Phosphorylierung von RPA32 in primären Fibroblasten von unter Ataxia telangiectasia leidenden Patienten im Vergleich zu normalen, gealterten Fibroblasten mangelhaft und reduziert.
Das Resultat der RPA32-Phosphorylierung für den DNA-Metabolismus ist weitgehend ungelöst. Es wurde festgestellt, dass IR-induzierte RPA-Phosphorylierung von dem S-Phasen-Checkpoint in Ataxia telangiectasia-Zellen entkoppelt werden kann, was nahelegt, dass die RPA-Phosphorylierung für ein Anhalten der S-Phase nicht erforderlich oder ausreichend ist. Die Phosphorylierung kann jedoch die Konformation von RPA beeinflussen und dadurch seine Affinität für DNA und ihre Protein-Interaktoren modulieren und das Gleichgewicht zwischen DNA-Replikation und Reparatur ändern. Die Hyperphosphorylierung von RPA32 in vivo geht mit einer Verminderung der Bindung von RPA an einzelsträngige DNA einher. Diese Beobachtung ist interessant, da phosphoryliertes RPA hauptsächlich in der S-Phase des Zellzyklus gefunden wird.
Es wurde festgestellt, dass RPA eine hohe Affinität für UV-beschädigte und Cisplatin-beschädigte DNA hat und die begleitende phosphorylierte Form von RPA steht stark mit einer Reduzierung der in vitro-DNA-Replikationsaktivität der betroffenen Zellextrakte in Zusammenhang.
Es wäre daher höchst wünschenswert, physiologisch relevante Protein-Interaktoren der RPA 32-Untereinheit von Replikationsprotein A zu identifizieren. Die Identifizierung derartiger Protein-Interaktoren würde zum Verständnis der DNA-Reparatur, -Transkription und Zell-Signalisierung beitragen. Die an der Nucleotid-Excisionsreparatur (NER) beteiligten Proteine beispielsweise sind sehr zahlreich und die Grundlage für ihre Wechselwirkung und Funktion ist noch nicht vollständig aufgeklärt. Das Verständnis der Regulierung dieser Pfade würde sicher eine Klärung ihrer Rolle bei der Krebsanfälligkeit mit sich bringen. RPA als ein wesentlich an der Modulierung der Reparatur, Replikation und Rekombination von DNA beteiligtes Protein wäre der Schlüssel zum Verständnis der Verbindungen zwischen und innerhalb der Pfade. Die Auswirkungen auf Krebs-Therapeutika und/oder -Prävention wären bedeutend.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen Protein-Interaktor der RPA32-Untereinheit von Replikationsprotein A (RPA) zu schaffen.
Gemäß vorliegender Erfindung wird ein Gen geschaffen, codierend für ein Protein, das in der in SEQ ID NO:2 dargelegten Aminosäuresequenz besteht.
Das Gen kann von einem Menschen, einer Maus, einer Ratte oder einer Hefe stammen.
Gemäß vorliegender Erfindung wird ferner ein Protein geschaffen, das in der in SEQ ID NO:2 dargelegten Aminosäuresequenz besteht.
Das Protein kann von einem Menschen, einer Maus, einer Ratte oder einer Hefe stammen.
Antikörper können gegen das Gen gebildet werden.
Das Gen, Replikationsprotein A bindender Transkriptionsaktivator 1 (RBT1), codiert für einen Protein-Interaktor des Replikationsproteins A (RPA). Insbesondere wurde ein Protein-Interaktor der Replikationsprotein A Untereinheit mit 32 KD identifiziert. RBT1 bindet RPA32.
Das RBT1-Gen hat eine hohe Aktivität in Krebszellen im Vergleich zu normalen Zellen, kann an der Karzinogenese beteiligt sein und wird in Krebszellen stark transaktiviert.
Das RBT1-Nucleotid und/oder die Aminosäuresequenzen können zur Erzeugung von Reagenzien, wie z. B. Plasmiden und Antikörpern, verwendet werden.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 zeigt die Nucleotid- (SEQ ID NO:1) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:2) von RBT1.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß vorliegender Erfindung wird eine Gensequenz geschaffen, die für einen Protein-Interaktor von Replikationsprotein A codiert, identifiziert unter Verwendung des Hefe-zwei-Hybridsystems. Das Gen, als RPA bindender Transkriptionsaktivator 1 (RBT1) bezeichnet, hat einen angenommenen offenen Leseraster von 196 Aminosäuren. Die codierende Sequenz von RBT1 entspricht mehreren exprimierten Sequenz-Tags (ESTs), darunter eines, das von einer Eierstock-Tumorzelllinie hergeleitet ist. Das Gen gemäß vorliegender Erfindung wirkt als ein starker Transkriptionsaktivator in Hefe und Säugetierezellen. Ferner zeigte die Transkriptionsaktivierung, wie durch das Luciferase-Reportergen geprüft, dass die Aktivität des RBT1-Gens gemäß vorliegender Erfindung im Vergleich zu normalen, nicht immortalisierten Zellen in Krebszellen höher ist. Die RBT1-Expression ist in Krebszellen im Vergleich mit normalen Zellen höher. Insbesondere wurde ein Protein-Interaktor des menschlichen Replikationsproteins A 32 (RPA32) identifiziert.
BLASTP Homologie-Untersuchungen gegen die hergeleitete Aminosäuresequenz von RBT1 zeigen, dass es ein undefiniertes Protein mit geringer Homologie zu bekannten Proteinsequenzen ist. BLASTN Homologie-Untersuchungen identifizierten nur annähernd 20 menschliche exprimierte Sequenztags (ESTs), die eine hohe Homologie zu RBT1 hatten.
Northern Blot unter Verwendung einer RBT1 DNA-Sonde zeigte ein Transkript mit einer Größe von annähernd 1,55 kb. In silicio-Analyse legte nahe, dass RBT1 aus einem offenen Leseraster (ORF) von 196 Aminosäuren besteht, sowie ein theoretisches Molekulargewicht von 22 kDa. Dies steht in Übereinstimmung mit der Western Blot Analyse.
Die differenzielle Expression von RBT1 wurde ebenfalls untersucht, da sie mit Krebs in Zusammenhang steht. Die semiquantitative Analyse hat gezeigt, dass RBT1 in der Zelllinie H661 (Krebszellen) mindestens zehnmal mehr als in NHBEC (normale Zellen) exprimiert wird.
Verschiedene Zelllinien werden untersucht, um sicherzustellen, ob RBT1 für die Karzinogenese von Bedeutung ist. In silicio-Analyse legte ferner nahe, dass die N-terminale Domäne von RBT1 eine angenommene DNA-bindende Domäne enthält. Ob RBT1 spezifische DNA-regulatorische Elemente bindet, wird ebenfalls untersucht.
Die Anwesenheit einer sauren Domäne in der C-terminalen Domäne von RBT1 führte zur Untersuchung, ob RBT1 ein potenzieller Transkriptionsaktivator ist. Mit der LexA-Bindungsdomäne verschmolzenes RBT1 fördert stark die Transkription der Reportergene LacZ und HIS3 in dem Hefe-zwei-Hybrid System, was seine mögliche Rolle als ein Transkriptionsaktivator nahelegt.
RBT1 Deletionskonstrukte wurden gestaltet, um die transaktivierende Domäne zu bestimmen und die Domäne zu definieren, die für die RPA32-Wechselwirkung essenziell ist. Die Transaktivierungsdomäne von RBT1 liegt innerhalb von 30 Aminosäuren an dem C-Terminus. Die Truncation von RBT1 von dem C-terminalen Ende führt zu einer beträchtlichen Reduzierung der Transaktivierung der Reportergene.
Ein Säugetier-Transaktivierungs-Assay bestätigte, dass ein GAL4-RBT1-Fusionsprotein tatsächlich als ein starker Transkriptionsaktivator wirkt. Ferner ist die Transkriptionsaktivierung, wie durch ein Luciferase-Reportergen geprüft, zwar in allen untersuchten Krebszelllinien hoch, jedoch in der Zelllinie MCF7 mindestens viermal höher. Transaktivierungsuntersuchungen wurden auch unter Verwendung eines Säugetiersystems durchgeführt, um zu verifizieren, dass RBT1 in seiner nativen zellulären Umgebung als Transkriptionsaktivator wirkt. Mit einer GAL4 DNA-bindenden Domäne verschmolzenes RBT1 fördert stark die Transkription des Luciferase-Reportergens. Diese Transaktivierung wurde durch die Truncation des Gens von dem C-terminalen Ende stark gedämpft. Ferner ergab die relative Transaktivierung des Luciferase-Reporters durch RBT1 mit voller Länge höhere Werte als das positive Kontrollkonstrukt TLS in den Zelllinien 293, MDA231, MCF7 und Saos-2, was eine mögliche Rolle bei Krebs nahelegt.
RBT1 bindet RPA32 in dem Hefe-zwei-Hybridsystem. Die Truncation von RBT1 legt nahe, dass die für die Bindung an RPA32 verantwortliche Domäne von RBT1 zwischen Aminosäure 1-120 liegt. Diese Region enthält ferner eine angenommene DNA-bindende Domäne, die aufgeklärt werden muss. Es wurde festgestellt, dass ein GST-RBT1-Konstrukt in vitro translatiertes RPA32 bindet. Ein GFP-RBT1 wurde in die Zelllinie 293 transfiziert und es wurde gezeigt, dass es sich in dem Nucleus in einem Muster lokalisiert, das ähnlich demjenigen und möglicherweise überlappend mit demjenigen von RPA32 ist.
RPA32 wurde aus MCF7 cDNA amplifiziert und im Raster in pBTM116 geklont, ein LexA Zwei-Hybrid-Plasmid, das nachfolgend als RPA34-pBTM116 bezeichnet wird. Dieses Plasmidkonstrukt wurde in den Hefestamm L40 (MATa trp1 leu2 his3 URA3:(lexAop)8-lacZ LYS2::(lexAop)4-HIS3 lys2 ura3 ade2 gal80 gal4) vor der Bibliothekstransformation transformiert. Es wurde festgestellt, dass die Transkription des HIS3 Reportergens in der Abwesenheit von Protein-Protein-Wechselwirkung auftritt; dies wurde der potenziellen Transaktivierungsfunktion von RPA32 zugeschrieben. Um den Hintergrund zu reduzieren, wurde 3-Aminotriazol (3-AT), ein metabolischer Inhibitor, in Medien mit fehlendem Histidin eingeschlossen, um die Genauigkeit des Screenings zu steigern. Eine menschliche Osteosarkom GAL4 cDNA Bibliothek wurde gemäß den von CLONTECH empfohlenen Protokollen amplifiziert.
400.000 Kolonien wurden gescreent und 72 Kolonien wurden identifiziert, die in der Lage waren, auf Medien mit fehlendem Histidin, die 25 mM 3-AT enthielten, zu wachsen. Diese Kolonien wurden auf den gleichen Medien neu aufgebracht und auf X-gal enthaltende Medien repliziert. Auf der Grundlage von Wachstumsraten auf SC-Histidin (25 mM 3-AT) und des Niveaus der Induzierung des B-gal Reportergens wurden positive Kolonien in drei Gruppen, starke, mittlere und schwache Interaktoren klassifiziert. Alle Kolonien, die hohe Induzierungsniveaus des B-gal Reportergens zeigten, wurden durch PCR unter Verwendung eines für RPA14 und ADC1, einer Sequenz in der Terminatorregion des Bibliotheksplasmids, spezifischen Primers geprüft. Wechselwirkende Plasmide aus mehreren dieser Kolonien wurden gereinigt und sequenziert. Sowohl der PCR- als auch der Sequenzierungsversuch zeigten, dass die stärksten Interaktoren RPA32 repräsentierten.
Eine putative positive Probe, die als ein RPA32 wechselwirkendes Protein identifiziert wurde, wurde sequenziert, und es wurde festgestellt, dass keine starke Homologie mit bekannten Proteinen vorhanden ist. Dieses Gen, das als RBT1 bezeichnet wird, wurde von dem pACT2 Vektor zum Zweck des Mini-Screening der Zwei-Hybridbibliothek in pBTM116 subkloniert. Die Bibliothek konnte jedoch aufgrund der äußerst starken Transaktivierung der Hefe-Reportergene durch sie selbst nicht unter Verwendung von RBT1-pBTM116 als Köder gescreent werden. Diese Beobachtung legt nahe, dass RBT1 ein Transkriptionsaktivator sein kann. Obgleich einige Proteine zufällig Transkriptions-Transaktivierung zeigen, unterstützt die Bindung an RPA32 den Gedanken, dass RBT1 möglicherweise nicht unter diesen Proteinen ist. Experimente wurden in dem Versuch durchgeführt, sicherzustellen, ob RBT1 als ein Transkriptionsaktivator wirkt.
Es gibt mehrere dbEST Übereinstimmungen für RBT1 in GenBank. Zwei repräsentative Klone voller Länge wurden erhalten, DNA wurde gereinigt und kann vollständig sequenziert werden.
Plasmidkonstrukte mit Truncationen am 3'-Ende von RBT1 wurden geklont und in den Hefestamm L40 transformiert. ONPG-Assays zeigen eine beträchtliche Verminderung der B-gal-Aktivitäten bei nur 60 bp, die vom 3' deletiert wurden, was nahelegt, dass die potenzielle Transkriptions-Aktivierungsdomäne von RBT1 am Carboxy-Terminus liegt.
Ähnliche Konstrukte können in einen Vektor für die Transkription in menschliche Zellen geklont werden, unter Verwendung einer Verschmelzung im Raster an die GAL4 DNA-bindende Domäne und unter Nutzung eines zweiten Plasmids, das ein Luciferase-Reportergen unter Kontrolle mehrerer GAL4-bindender Stellen trägt. Diese Experimente bestimmen, ob die in dem Hefesystem festgestellten Transaktivierungen physiologisch relevant sind.
RBT1 kann in verschiedenen menschlichen Zelllinien überexprimiert werden, um mögliche phänotypische Effekte sicherzustellen. Die Experimente können Konfrontation mit UV und Chemikalien einschließen.
Antikörper gegen RBT1 können für anschließende Proteinlokalisierungsexperimente in menschlichen Zellen gebildet werden. Dieser Antikörper kann auch für verschiedene Coimmunpräzipitationsexperimente verwendet werden, um RPA-RBT1-Bindung zu zeigen.
SEQUENZ-LISTE

Claims

Gen, codierend für ein Protein, das in der wie in SEQ ID NO:2 dargelegten Aminosäuresequenz besteht.
Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen von einer Spezies stammt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Menschen, einer Maus, einer Ratte und einer Hefe.
Protein, bestehend in der in SEQ ID NO:2 dargelegten Aminosäuresequenz.
Protein, nach Anspruch 3, wobei das Protein von einer Spezies stammt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Menschen, einer Maus, einer Ratte und einer Hefe.
Antikörper, gebildet gegen ein Gen nach Anspruch 1.
Antikörper, gebildet gegen ein Protein nach Anspruch 3.