KR101870260B1 - 피부 염증 반응 측정용 신규한 세포주, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 측정용 신규한 세포주, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 pTSLP-renilla_pCMV-firefly를 지속적으로 발현하는 피부 염증 측정용 세포주에 관한 것으로서, 시험물질로 인한 TSLP 프로모터의 활성 정도를 비교함으로써 시험물질이 염증 유발 물질인지 여부 및 시험물질의 염증 유발 정도를 측정할 수 있다. 또한 세포 생존율의 변화로 인한 오차를 보정하여 정규화하기 위한 유전자를 지속적으로 발현하므로 보다 비교가 쉽고 빠르고 정확하게 시험물질의 염증 유발을 측정할 수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 측정용 신규한 세포주, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)는 사이토카인의 일종인 염증 세포 유도 케모카인으로 상피세포(epithelial cell), 섬유아세포(fibroblast) 등에서 분비되는 18kDa 크기의 단백질이다. TSLP는 IL-17 유사 사이토카인으로 자극에 의해 세포에서 분비되어 CD11c+ 수지상 세포를 활성화하여 순차적으로 염증 세포의 활성화 및 분화에 관여하는 것으로 알려져있다. 분비된 TSLP는 thymic stromal lymphopoietin receptor CRLF2와 IL-7R alpha로 구성된 헤테로다이머 수용체 복합체(heterodimeric receptor complex)에 결합하여 신호를 전달하고, STAT5 인산화는 전사인자의 발현을 유도하여 B 세포, T 세포 등의 생물학적 활성을 일으켜 면역 반응을 발생시킨다.
또한, TSLP의 돌연변이는 심각한 아토피 질환의 발달과 관련된다고 보고되었으며, 이외에도 천식, 알레르기, 염증성 관절염(inflammatory arthritis), 습진(eczema) 등 다양한 알레르기 상태의 유발에 관여한다.
한편, 현재 TSLP의 발현 정도의 측정에 의해 피부 염증을 측정하는 방법으로는 ELISA, 웨스턴 블롯, PCR 등의 방법이 사용되고 있으나, 이는 측정에 시간이 오래 걸리고 절차가 복잡하며 비용이 많이 소모된다는 단점이 있다.
따라서, 기존의 피부 염증 반응의 측정상 문제를 해결하기 위한 효율적인 벡터의 구축 및 세포주 확립에 대한 필요성이 대두되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 TSLP 프로모터를 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 세포주를 제작하였고, 이를 이용하여 피부 염증 반응 또는 농약 피부 독성을 확인할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 제1 재조합 벡터 및 제2 재조합 벡터로 형질전환된 피부 염증 측정용 세포주를 제공하는 것이다:
상기 제1 재조합 벡터는 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
상기 제2 재조합 벡터는 CMV(cytomegalo virus) 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 세포주를 포함하는 TSLP 프로모터의 활성 측정용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 세포주를 포함하는 피부 염증 유발 물질 스크리닝용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 a) TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 프로모터 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 재조합 벡터를 세포주에 도입하는 단계; 및
b) CMV(cytomegalo virus) 프로모터 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 재조합 벡터를 세포주에 도입하는 단계;
를 포함하는, 피부 염증 측정용 세포주의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 다음의 단계를 포함하는 피부 염증 유발 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다:
a) 제1항의 세포주에 시험물질을 처리하는 단계; 및
b) 상기 세포주에서 제1 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자의 발현과 제2 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자의 발현을 비교하는 단계.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제1 재조합 벡터 및 제2 재조합 벡터로 형질전환된 피부 염증 측정용 세포주를 제공한다:
상기 제1 재조합 벡터는 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
상기 제2 재조합 벡터는 CMV(cytomegalo virus) 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 세포주를 포함하는 TSLP 프로모터의 활성 측정용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포주를 포함하는 피부 염증 유발 물질 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 프로모터 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 재조합 벡터를 세포주에 도입하는 단계; 및
b) CMV(cytomegalo virus) 프로모터 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 재조합 벡터를 세포주에 도입하는 단계;
를 포함하는, 피부 염증 측정용 세포주의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 피부 염증 유발 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다:
a) 제1항의 세포주에 시험물질을 처리하는 단계; 및
b) 상기 세포주에서 제1 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자의 발현과 제2 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자의 발현을 비교하는 단계.
본 발명은 pTSLP-renilla_pCMV-firefly를 지속적으로 발현하는 피부 염증 측정용 세포주에 관한 것으로서, 시험물질로 인한 TSLP 프로모터의 활성 정도를 비교함으로써 시험물질이 염증 유발 물질인지 여부 및 시험물질의 염증 유발 정도를 측정할 수 있다. 또한 세포 생존율의 변화로 인한 오차를 보정하여 정규화하기 위한 유전자를 지속적으로 발현하므로 보다 비교가 쉽고 빠르고 정확하게 시험물질의 염증 유발을 측정할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 레닐라 루시퍼라제 서열과 TSLP 프로모터 서열을 포함하는 벡터를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 세포주에 자일렌을 처치한 후 파이어플라이 루시퍼라제 측정 값과 레닐라 루시퍼라제 측정 값을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 세포주에 프탈산디부틸을 처치한 후 파이어플라이 루시퍼라제 측정 값과 레닐라 루시퍼라제 측정 값을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 세포주에 클로르피리포스를 처치한 후 파이어플라이 루시퍼라제 측정 값과 레닐라 루시퍼라제 측정 값을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 세포주에 트리프록시스트로빈을 처치한 후 파이어플라이 루시퍼라제 측정 값과 레닐라 루시퍼라제 측정 값을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 세포주에 자일렌을 처치한 후 파이어플라이 루시퍼라제 측정 값과 레닐라 루시퍼라제 측정 값을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 세포주에 프탈산디부틸을 처치한 후 파이어플라이 루시퍼라제 측정 값과 레닐라 루시퍼라제 측정 값을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 세포주에 클로르피리포스를 처치한 후 파이어플라이 루시퍼라제 측정 값과 레닐라 루시퍼라제 측정 값을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 세포주에 트리프록시스트로빈을 처치한 후 파이어플라이 루시퍼라제 측정 값과 레닐라 루시퍼라제 측정 값을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 제1 재조합 벡터 및 제2 재조합 벡터로 형질전환된 피부 염증 측정용 세포주를 제공한다:
상기 제1 재조합 벡터는 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
상기 제2 재조합 벡터는 CMV(cytomegalo virus) 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 특징은 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 프로모터에 작동적으로 연결된(operatively linked) 리포터 유전자와 CMV(cytomegalo virus) 프로모터에 작동적으로 연결된(operatively linked) 리포터 유전자가 발현되는 듀얼 루시퍼라제 시스템을 갖도록 설계한 세포주를 이용하여 피부 염증을 측정하는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 특정 세포 내에서 발현할 수 있는 외인성 작동성 유전자를 포함하는 모든 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 벡터는 인간, 조류 또는 곤충 세포 배양 시스템 내에서 발현되는 2개 이상의 단백질을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터는 TSLP 프로모터 또는 CMV 프로모터 각각의 다운스트림에 리포터 유전자를 포함하는 한, 상기 벡터는 당업계에 공지되고 이용할 수 있는 임의의 벡터일 수 있으며, 예컨대, TSLP 프로모터(pTSLP)-레닐라 루시퍼라제(renilla luciferase)로 구성된 벡터일 수 있고, CMV 프로모터(pCMV)-파이어플라이 루시퍼라제(firefly luciferase)로 구성된 벡터일 수 있다. 바람직하게 TSLP 프로모터를 포함하는 벡터는 pLenti6-V5-DEST 일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은, 본 발명의 프로모터 서열의 다운스트림에 유전자가 연결될 때, 해당 유전자의 발현이 가능한 형태로 연결되는 것을 의미하며, 상기 목적을 달성하기 위하여 임의의 서열이 추가로 포함될 수 있다. 상기 임의의 서열을 예로 들면, 오퍼 레이터(operator) 서열, 인프레임(in frame)을 위한 서열 등이 있으며, 또한 본 발명의 유전자 이외에 인핸서 (enhancer)와 같은 시스 요소 (cis element), 스플라이싱 시그널 (splicing signal), 폴리 A 추가 시그널 (poly A addition signal), 선택 표지(selection marker), 라이보좀 결합 서열 (ribosome binding sequence) 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉 생물의 어떤 계통의 세포에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포의 주었을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상으로 형질변환, 형전환 또는 형변환 등이라고도 한다.
본 발명에서 용어 "형질전환체"는 형질전환으로 인해 생성된 형질전환식물 또는 형질전환동물을 의미하며, 유전자 재조합 기술을 이용하여 특정 유전자의 변형 또는 변이가 유발되어 생성된 유전자 재조합체를 포함한다
본 발명자들은 상기 바이러스 벡터로 생성된 바이러스를 이용하여 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 프로모터에 작동적으로 연결된(operatively linked) 리포터 유전자와 CMV(cytomegalo virus) 프로모터에 작동적으로 연결된 (operatively linked) 리포터 유전자를 정상 인간 피부 각질 세포주인 HaCaT 세포에 동시에 삽입하여 세포가 pTSLP-renilla와 pCMV-firefly를 지속적, 안정적으로 동시에 발현하도록 세포주를 제작하였고, 이를 이용하여 세포주를 형질감염시켜 형질전환체인 세포주를 제작하였다.
본 발명에서 리포터 유전자는 그 업스트림(upstream)의 프로모터 활성에 따라 유전자가 발현되어 세포 내에서 그 발현 여부를 확인할 수 있는 유전자이면 제한 없이 사용될 수 있고, 바람직하게 리포터 유전자는 발색을 나타낼 수 있는 모든 리포터 유전자를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 피부 염증은 표피, 진피 및 피하지방층으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 부위에서 유발되는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 피부 염증 반응은 알레르기 반응, 아토피를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 피부 염증은 농약에 의해서 유발되는 것일 수 있고, 예컨대 클로르피리포스 또는 트리프록시스트로빈의 처리에 의해 유발될 수 있다.
또한, 상기 TSLP 프로모터는 서열번호 1의 서열로 표시되는 것일 수 있고, 서열번호 1로 표시되는 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 제1 재조합 벡터의 벡터맵은 바람직하게는 도 1로 표시될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 리포터 유전자는 파이어플라이 루시퍼라제(firefly luciferase), 레닐라 루시퍼라제(renilla luciferase), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 증강된 적색 형광 단백질(enhanced red fluorescent protein, ERFP), 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein, BFP), 증강된 청색 형광 단백질(enhanced blue fluorescent protein, EBFP), 황색 형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 증강된 황색 형광 단백질(enhanced yellow fluorescent protein, EYFP), 남색 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 증강된 남색 형광 단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP) 및 DsRed로 구성된 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 파이어플라이 루시퍼라제(firefly luciferase), 레닐라 루시퍼라제(renilla luciferase), 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein) 및 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP)로 구성된 군으로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 파이어플라이 루시퍼라제(firefly luciferase) 또는 레닐라 루시퍼라제(renilla luciferase)이다. 본 발명에 있어서 제1 재조합 벡터의 리포터 유전자와 제 2 재조합 벡터의 리포터 유전자는 상호 식별 가능한 리포터 유전자의 조합으로 선택될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 선택 표지로서의 진핵세포에 작용하는 항생제에 대한 내성 유전자를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 항생제는 퓨로마이신, 하이그로마이신, 블라스티시딘, 네오마이신, 제네티신 및 카나마이신으로 구성된 군으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는 하이그로마이신 또는 블라스티시딘이다.
본 발명의 바이러스 벡터는 다양한 바이러스에 기반할 수 있으며, 바람직하게는, 베큘로바이러스(baculovirus), 아데노바이러스(Adeno viruses), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses, AAV), 레트로바이러스(Retrovirus), 렌티바이러스(Lentivirus), 헤르페스심플렉스 바이러스(Herpes Simplex virus) 또는 배시니아 바이러스(vaccinia virus)이고, 가장 바람직하게는 렌티바이러스(Lentivirus)이다.
본 발명에 따르면, 상기 형질전환에 이용되는 세포주는 특정 세포주로 한정되지 않고 피부 염증 반응 또는 농약에 의해 유발된 피부 염증을 평가하는데 사용할 수 있는 세포주를 제한 없이 포함할 수 있으며, 바람직하게는 인간 피부 각질 세포주(normal human skin keratinocyte cell line)이다.
또한, 본 발명은 상기 세포주를 포함하는 TSLP 프로모터의 활성 측정용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 세포주 내 도입된 상술한 듀얼 루시퍼라제 시스템을 이용하여 TSLP 프로모터의 활성 정도를 측정하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 세포주를 포함하는 피부 염증 유발 물질 스크리닝용 조성물을 제공한다.
TSLP 프로모터의 활성 정도를 측정함으로써 피부 염증, 예컨대 표피, 진피 또는 피하지방층에서 유발된 염증이나 알레르기 반응, 아토피 또는 농약의 피부 독성을 측정할 수 있다.
본 발명에서 TSLP 프로모터의 활성 정도 측정 및 본 발명의 프로모터의 다운스트림 유전자들에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준 확인은 다운스트림 유전자가 발색을 수반하는 리포터 유전자를 이용하여 해당 유전자의 발현을 형광 강도 측정과 같은 발색 여부 및 발색량을 측정함으로써 확인할 수 있으며, 기존에 유전자의 활성 또는 단백질 발현 정도를 확인하기 위해 사용하였던 PCR, ELSIA, 웨스턴 블롯 등의 방법과 비교하여 손쉽고 빠르게 확인할 수 있다.
또한, 본 발명은 a) TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 프로모터 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 재조합 벡터를 세포주에 도입하는 단계; 및
b) CMV(cytomegalo virus) 프로모터 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 재조합 벡터를 세포주에 도입하는 단계;
를 포함하는, 피부 염증 측정용 세포주의 제조방법을 제공한다.
상기 세포주는 재조합 벡터로 세포주를 형질감염(transfection)시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명에서 용어 “형질감염”은 벡터를 숙주 세포 내로 혼입시킬 수 있는 모든 기전을 지칭한다. 성공적인 형질감염으로 인해, 숙주 세포가 해당 벡터에 의해 수반된 모든 작동성 유전자를 발현시킬 수 있는 능력이 생긴다. 형질감염은 안정적이거나 일시적일 수 있다. 일시적 형질감염의 한 가지 예는 벡터가 숙주 세포 게놈 내에 통합되지 않는, 특정 세포 내에서의 벡터 발현을 포함한다. 또 다른 한편, 안정적 형질감염은 벡터가 벡터가 숙주 세포 게놈 내에 통합되는, 특정 세포 내에서의 벡터 발현을 포함한다. 형질감염을 일으키는 방법 및 조건은 당업계에 잘 공지되어 있다.
본 발명의 방법은 상기 a) 단계 및 b) 단계를 순차적으로, 동시에 또는 역순으로 수행하는 것을 제한 없이 포함할 수 있다.
상기 세포주는 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 프로모터 및 CMV(cytomegalo virus)를 발현하는 듀얼 루시퍼라제 시스템을 갖는다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 피부 염증 유발 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
a) 본 발명의 세포주에 시험물질을 처리하는 단계; 및
b) 상기 세포주에서 제1 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자의 발현과 제2 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자의 발현을 비교하는 단계.
이하, 본 발명의 각 단계를 상세히 설명한다.
본 발명의 a) 단계는 본 발명의 세포주에 시험물질을 처리하는 단계이다.
본 발명에서 용어 "시험물질"은 세포 내에서 유의하게 일어나는 유전자 발현량의 변화를 간접적 또는 직접적으로 억제 또는 유도할 수 있을 것으로 예상되는 모든 물질을 의미한다.
본 발명의 b) 단계는 상기 세포주에서 제1 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자의 발현과 제2 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자의 발현을 비교하는 단계이다.
제1 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자의 활성 측정에 의해서 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 프로모터의 활성 수준을 알 수 있다.
제2 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자는 세포의 생존율에 의한 오차를 보정해주는 정규화 역할을 하므로, 제1 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자의 발현을 제2 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자의 발현과 비교함으로써 세포 하나당 평균적으로 발현된 상대적 TSLP 프로모터의 활성을 비교할 수 있다.
상기 b) 단계에서 리포터 유전자의 발현을 비교한 비교한 결과 제1 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자의 발현 수준이 제2 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자의 발현 수준에 비해 증가한 경우, 상기 시험물질을 피부에서 염증 또는 농약 독성을 유발하는 물질로 판단할 수 있다.
상기 발현 수준의 증가는 바람직하게 1.5배 이상, 더욱 바람직하게는 2배 이상의 증가를 의미한다.
따라서, 시험물질 존재 및 부재 하에서의 본 세포주에 대한 본 발명의 프로모터의 활성을 해당 프로모터의 다운스트림 유전자의 발현량 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 염증 또는 독성 유발 물질을 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
레닐라
루시퍼라제
(
renilla
luciferase
) 서열과
TSLP
프로모터 서열을 포함하는 재조합 벡터(
pTSLP
-
renilla
)의 제조
레닐라 루시퍼라제 서열과 TSLP 프로모터 서열을 포함하는 벡터를 제조하기 위해서, 하기의 pLenti6/V5-DEST 벡터를 사용하였다.
상기 벡터에서 ClaI 제한효소와 Xho1 제한효소를 이용해서 CMV 프로모터를 제거하였다.
하기의 pLightSwitch_Prom(Switchgear Genomics) 벡터로부터 서열번호 1의 TSLP 프로모터 서열을 얻었다.
CMV 프로모터 서열이 제거된 벡터에 프라이머 세트(정방향: TCCATCAAAACAAAACGAAACAA, 역방향: AGTCGAGCACGTTCATCTGCTT)를 사용하여 레닐라 루시퍼라제 서열과 TSLP 프로모터 서열을 삽입하였다. 이와 같이 제조된 레닐라 루시퍼라제 서열과 TSLP 프로모터 서열을 포함하는 벡터를 도 1에 나타내었으며 이하 "pTSLP-renilla"로 지칭한다.
실시예
2.
pTSLP
-
renilla를
포함하는
렌티바이러스의
제조
상기 실시예 1에서 제조한 pTSLP-renilla를 포함하는 렌티바이러스를 제조하기 위해서 ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix와 리포펙타민 2000을 이용하여 pTSLP-renilla를 렌티바이러스를 생산하는 293FT 세포주에 형질감염(transfection)시킨 후, 이틀 뒤 배지 내에 생성된 렌티바이러스를 수확하였다.
실시예
3. 피부 염증 반응 확인을 위한 세포주의 제조
상기 실시예 2에서 제조한 렌티바이러스를 정상 인간 피부 각질 세포주(normal human skin keratinocyte cell line)인 HaCaT 세포에 형질감염(transfection)시킨 후 블라스티시딘(blasticidin)을 이용하여 형질도입된 세포를 선별하였다.
CMV 프로모터와 파이어플라이 루시퍼라제 서열을 포함하는 벡터를 코스모진텍에 의뢰하여 제작하였다. 선별된 세포에 상기 벡터를 포함하는 렌티바이러스를 도입하였다. 상기 세포에 하이그로마이신(hygromycin)을 2주 동안 처치하여 선별하여 최종적으로 pTSLP-renilla와 파이어플라이 루시퍼라제 서열을 포함하여 안정적으로 발현하는 사람 유래 정상 피부 각질 세포주를 제조하였다. 이하 상기 세포주를 pTSLP-renilla_pCMV-firefly를 발현하는 “HaCaT-TSLP 세포주”로 지칭한다.
실시예
4. 염증 유발 물질의 처리에 따른
HaCaT
-
TSLP
세포주에서
TSLP
발현 측정
상기 실시예 3에서 구축한 HaCaT-TSLP 세포주의 효율을 측정하기 위하여 하기와 같이 듀얼 루시퍼라제 레포터 유전자 분석법(Dual luciferase reporter gene assay)을 실시하였다.
4-1. 자일렌 처리시
HaCaT
-
TSLP
세포주에서
TSLP
발현 측정
HaCaT-TSLP 세포주에 염증 유발 물질인 자일렌(xylene)을 0.06, 0.13, 0.25%로 처치하고 24시간, 48시간 후에 TSLP 프로모터의 활성 변화를 확인하였다. 구체적으로, 파이어플라이 루시퍼라제의 측정 값과 레닐라 루시퍼라제의 측정 값(Relative Luminescence Units)의 비율을 그래프화하여 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 자일렌 처치 후 HaCaT-TSLP 세포주에서 TSLP의 활성이 증가함을 확인하였다.
따라서, 염증 유발 물질이 TSLP 프로모터의 활성을 증가시키며, 본 발명에서 제조한 HaCaT-TSLP 세포주가 염증 유발 물질에 의해서 TSLP 프로모터의 활성 증가를 나타냄을 확인하였다.
4-2.
프탈산디부틸
처리시
HaCaT
-
TSLP
세포주에서
TSLP
발현 측정
HaCaT-TSLP 세포주에 염증 유발 물질인 프탈산디부틸(dibutyl phthalate)을 0.013, 0.025, 0.05, 0.1%로 처치하고 24시간, 48시간 후에 상기 4-1과 같은 방식으로 TLSP 프로모터의 활성 변화를 확인하였다. 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 프탈산디부틸 처치 후 HaCaT-TSLP 세포주에서 TSLP 프로모터의 활성이 증가함을 확인하였다.
따라서, 염증 물질인 프탈산디부틸의 처치에 의하여 TSLP 프로모터의 활성이 프탈산디부틸의 농도와 시간 의존적으로 증가하였음을 확인하였다.
상기와 같이, 본 발명의 HaCaT-TSLP 세포주를 이용하면 기존에 유전자의 활성 또는 단백질의 발현 정도를 확인하는 데 사용하였던 PCR, ELSIA, 웨스턴 블롯 등의 방법과 비교하여 손쉽고 빠르게 TSLP 프로모터의 활성을 측정할 수 있다. 또한 TSLP 프로모터의 활성을 피부 세포에서 확인하였으므로, 상기 세포를 이용하여 후보물질이 피부 염증 반응을 유발하는지 여부를 확인하는데 활용할 수 있음을 확인하였다.
실시예
5. 농약의 처리에 따른
HaCaT
-
TSLP
세포주에서
TSLP
발현 측정
본 발명의 HaCaT-TSLP 세포주를 농약에 의한 피부 독성 측정에 활용할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 하기와 같이 다양한 농약을 처치한 후 HaCaT-TSLP 세포주에서 TSLP의 발현을 측정하였다.
농약인 클로르피리포스(Chlorpyrifos (CPF)) 제품(명사수, ㈜아그로텍, 1/640000, 1/320000, 1/160000, 1/80000 희석)을 48시간 동안, 트리프록시스트로빈(Trifloxystrobin (TRF)) 제품(프린트, ㈜바이엘 크롭사이언스, 1/1280000, 1/640000, 1/320000, 1/60000 희석)을 48시간 동안 HaCaT-TSLP 세포주에 처치한 후, 상기 4-1과 같은 방식으로 TSLP 프로모터의 활성 변화를 확인한 결과를 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 농약의 처치에 따라 피부 각질 세포주에서 TSLP 프로모터의 활성이 증가함을 확인하였다.
따라서, 농약의 피부 노출에 의한 염증 반응 유발 여부 및 유발 정도를 본 발명의 세포주를 통하여 확인할 수 있다. 본 발명의 세포주를 이용하면 기존의 농약 피부 독성 확인 시험에 비해 간편하고 빠르게 농약 피부 독성을 확인할 수 있어 새로운 피부 염증 반응에 대한 시험법으로 유용하게 활용할 수 있다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation
<120> Novel cell line for evaluating inflammatory skin response,
composition comprising the same, and uses thereof
<130> 1_114_1
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1039
<212> DNA
<213> TSLP promoter
<400> 1
tctaaggatt gatgctgtgc tccaggtctc tccagtgttt tagatgtttc aggatgctat 60
ttattacaga atatggtgta cttggaattt tttttaacat acagtagtaa tcattttcct 120
gattaaccta atttctagac agagtttgca ttcatgaatg gccacagtac agatgcggac 180
atccaaagga tggcattatt actcacaagc atagtgctat gtgcagttat ggcttgaggg 240
aagggagggg ggaggtcgcc ctctgagacc tgaacctttt ggtgtggttt caagcactaa 300
ccagcactat ctaatggcta tttcactgcc ttgtcaatga cataggaaaa aggtacctga 360
gtggaaactg ttttcagggc acctttaaag cctgggagca aagggtggag ggatgatttt 420
ccttgtggac ttaaaagtct ttaccctctt tgtcctattt ttctttcttc cagaccaaaa 480
gtaccgagtt caacaacacc gtctcttgta gcaatcgggt gagtagagag ttcagtgctg 540
ctggctttct ccagggagac gccaggcatt ttggagaggg agtatcctgc tacgtgcaga 600
actccgagag gtgcctgggc tccgggacgc cgccgccggg ggaaagggga catctgggct 660
gtcagagcgg ggctgcgcct agcttgggac aacacttctg ttccaattta gggagaggaa 720
gtctctatcc ggaggaaagg caaattggga actgggacga gggaacgttg ttaggggcac 780
cacctgctgg ggtccggcgc ctccgcgctc gggctcggaa ttttggcagc ctccgccccc 840
tggagacttg ggaggagcga gcgtgggtga cagtcttttc gcgacgagtg ccctccgcca 900
ccctcgccac gcccctgctc ccccgcggtt ggttcttcct tgctctactc aaccctgacc 960
tcttctctct gactctcgac ttgtgttccc cgctcctccc tgaccttcct cccctcccct 1020
ttcactcaat tctcaccaa 1039
Claims (15)
- 제1 재조합 벡터 및 제2 재조합 벡터로 형질전환된 피부 염증 측정용 세포주:
상기 제1 재조합 벡터는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
상기 제2 재조합 벡터는 CMV(cytomegalo virus) 프로모터; 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며;
상기 세포주는 인간 피부 각질 세포주임.
- 제1항에 있어서, 상기 피부 염증은 표피, 진피 및 피하지방층으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상에서 유발되는 것인, 피부 염증 측정용 세포주.
- 제1항에 있어서, 상기 피부 염증은 농약에 의해서 유발되는 것인, 피부 염증 측정용 세포주.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 제1 재조합 벡터는 하기 벡터 맵으로 표시되는 것인, 피부 염증 측정용 세포주
.
- 제1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 파이어플라이 루시퍼라제(firefly luciferase), 레닐라 루시퍼라제(renilla luciferase), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 증강된 적색 형광 단백질(enhanced red fluorescent protein, ERFP), 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein, BFP), 증강된 청색 형광 단백질(enhanced blue fluorescent protein, EBFP), 황색 형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 증강된 황색 형광 단백질(enhanced yellow fluorescent protein, EYFP), 남색 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 증강된 남색 형광 단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP) 및 DsRed로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 피부 염증 측정용 세포주.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 선택 표지로서 진핵세포에 작용하는 항생제에 대한 내성 유전자를 추가적으로 포함하는, 피부 염증 측정용 세포주.
- 제7항에 있어서, 상기 항생제는 퓨로마이신, 하이그로마이신, 블라스티시딘, 네오마이신, 제네티신 및 카나마이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 피부 염증 측정용 세포주.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 렌티바이러스(Lentivirus), 베큘로바이러스(baculovirus), 아데노바이러스(Adeno viruses), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses, AAV), 레트로바이러스(Retrovirus), 헤르페스심플렉스 바이러스(Herpes Simplex virus) 및 배시니아 바이러스(vaccinia virus)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 피부 염증 측정용 세포주.
- 삭제
- 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 세포주를 포함하는, TSLP 프로모터의 활성 측정용 조성물.
- 제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 세포주를 포함하는, 피부 염증 유발 물질 스크리닝용 조성물.
- a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 프로모터 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 재조합 벡터를 인간 피부 각질 세포주에 도입하는 단계; 및
b) CMV(cytomegalo virus) 프로모터 및 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 재조합 벡터를 인간 피부 각질 세포주에 도입하는 단계;
를 포함하는, 피부 염증 측정용 세포주의 제조방법.
- 다음의 단계를 포함하는 피부 염증 유발 물질의 스크리닝 방법:
a) 제1항의 세포주에 시험물질을 처리하는 단계; 및
b) 상기 세포주에서 제1 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자의 발현과 제2 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자의 발현을 비교하는 단계.
- 제14항에 있어서, 상기 b) 단계의 비교 결과 제1 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자의 발현 수준이 제2 재조합 벡터에 포함된 리포터 유전자의 발현 수준에 비해 증가한 경우, 상기 시험물질이 피부에서 염증을 유발하는 물질로 판단하는 것을 특징으로 하는, 피부 염증 유발 물질 스크리닝 방법.
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2006023226A2 (en) * | 2004-07-28 | 2006-03-02 | Tanox, Inc. | Thymic stromal lymphopoietin promoter and uses therefor |
-
2016
- 2016-11-14 KR KR1020160151094A patent/KR101870260B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006023226A2 (en) * | 2004-07-28 | 2006-03-02 | Tanox, Inc. | Thymic stromal lymphopoietin promoter and uses therefor |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Eur J Immunol. 43(4):1053-62 (2013.04.)* |
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