DE10116826A1

DE10116826A1 - Nachweisverfahren für homologe Rekombinationsereignisse

Info

Publication number: DE10116826A1
Application number: DE2001116826
Authority: DE
Inventors: Felix Bestvater; Tobias A Knoch; Eberhard Spies
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2001-04-04
Filing date: 2001-04-04
Publication date: 2002-10-17
Also published as: AU2002304884A1; WO2002081675A2; WO2002081675A3

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Bestimmung von Rekombinationsereignissen, das auf der Transfektion der gewünschten Zelle mit einem oder mehreren Vektoren basiert, die unterschiedliche Gene für nachweisbare Proteine, vorzugsweise unterschiedliche Fluoreszenz-Proteine, enthalten, wobei ein aufgrund einer Homologie zwischen den unterschiedlichen Genen stattgefundenes Rekombinationsereignis zu einem nachweisbaren veränderten Expressionsmuster der unterschiedlichen Gene führt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Rekombinationsereignissen, das auf der Transfektion der gewünschten Zelle mit einem oder mehreren Vektoren basiert, die unterschiedliche Gene für nachweisbare Proteine, z. B. unterschiedliche Fluoreszenz-Proteine, enthalten, wobei ein aufgrund einer Homologie zwischen den unterschiedlichen Genen stattgefundenes Rekombinationsereignis zu einem nachweisbaren, veränderten Expressionsmuster der unterschiedlichen Gene führt.

Die bisher durchgeführten Bestimmungen von Rekombinationsprozessen innerhalb der Zelle (z. B. homologe Rekombination, Reparaturmechanismen) über in-vivo- oder in-vitro-Verfahren, z. B. zur Untersuchung der Auswirkung von chemischen oder physikalischen (z. B. Strahlung, Hitze etc.) Einflüssen etc., basieren im wesentlichen darauf, daß die Zellen lysiert und danach mit Hilfe von ELISA-Tests, Western-Blots, DNA-Expressions-Chips oder ähnlichen Verfahren die an der Rekombination beteiligten Proteine quantifiziert werden, woraus man dann indirekt auf die Fähigkeit z. B. zur homologen Rekombination schließen kann. Eine weitere Methode ist der Nachweis von Proteinen mittels immunhistologischer Färbeverfahren. Hierbei müssen die Zellen fixiert werden; anschließend läßt man an diese einen entsprechenden, farbstofftragenden Antikörper binden und weist die Bindung z. B. über mikroskopische Verfahren nach. Die bisher angewandten Verfahren weisen jedoch eine Reihe von Nachteilen auf. So wurden die bisherigen in-vivo- Untersuchungen zur homologen Rekombination meist an der Menge eines beteiligten Proteins/Stoffs gemessen und nicht direkt an der DNA-Sequenz, was somit keine Aussage über die tatsächliche Aktivität der beteiligten Faktoren zuläßt; auch sind die bisherigen Verfahren aufgrund der notwendigen Präparation der Zellen nicht artefaktfrei. Nachteilig ist auch, daß bisher die Versuche ohne Zellverbrauch nicht an denselben Zellen fortgeführt werden können und Messungen an einzelnen Zellen ebenfalls nicht möglich sind. Schließlich sind diese Verfahren auch aufgrund des Benötigens einer Reihe von verschiedenen Substanzen, Kits etc. mit hohen Kosten verbunden. Diese Nachteile treten auch bei den bisher für ein Massenscreening eingesetzten, immunologischen Färbemethoden, ELISA-Tests etc. ein. Außerdem sind Massenscreenings nur eingeschränkt und nicht in vivo möglich, und eine Selektion und Züchtung von Zellen mit bestimmten Rekombinationseigenschaften ist kaum möglich.

Neben des Nachweises von Proteinen wurde bisher zur Untersuchung von Rekombinationsereignissen auch direkt eine veränderte DNA-Sequenz untersucht, d. h. aus den Zellen gewonnen und anschließend sequenziert. Dabei wird zuerst eine DNA-Sequenz in die Zellen oder den Organismus eingeschleust, die dann in den Zellen selbst verändert (z. B. repariert) wird oder eine bereits in den Zellen befindliche Sequenz verändert. Dies führt allerdings lediglich zu einer positivnegativ-Entscheidung hinsichtlich darüber, ob homologe Rekombination auftritt oder nicht, und auch mit diesem Vorgehen sind auch keine in-vivo- Untersuchungen möglich. Darüber hinaus ist dieses Verfahren ebenfalls mit hohen Kosten verbunden und zeitaufwendig, da die benötigten DNA-Konstrukte über aufwendige Restriktions-, Ligations-, Transfektions-, Knockout- oder chemische Syntheseverfahren hergestellt werden müssen.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, ein Verfahren zur Untersuchung der homologen Rekombination bereitzustellen, das die vorstehend diskutierten Nachteile der bisherigen Verfahren nicht aufweist.

Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt. Es stellte sich während den zu dieser Erfindung führenden Experimenten heraus, daß die vorstehend beschriebenen Nachteile der bisherigen Verfahren durch Anwendung eines Verfahrens vermieden werden können, das auf der Transfektion der Zelle, in der Rekombinationsvorgänge (z. B. homologe Rekombination, Replikation, Reparaturmechanismen und ähnliche Prozesse, nachstehend mit "RRRP" bezeichnet) untersucht werden sollen, mit einem oder mehreren Vektoren basiert, die unterschiedliche Gene für nachweisbare Proteine, z. B. unterschiedliche Fluoreszenz-Proteine, enthalten, wobei ein aufgrund einer Homologie zwischen den unterschiedlichen Genen stattgefundenes Rekombinationsereignis zu einem nachweisbaren, veränderten Expressionsmuster der unterschiedlichen Gene führt. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können folgende Probleme in vitro und in vivo gelöst werden:

1. Bestimmung des Auftretens und Quantifizierung von RRRP in Zellen unter Einwirkung chemischer oder physikalischer Einflüsse;
2. Bestimmung des Auftretens und Quantifizierung von RRRP in lebenden Zellen in Abhängigkeit von der DNA-, Chromatin-, Kern-, Zellstruktur und Zelldynamik, im Zellzyklus, bei der Zelldifferenzierung, in unterschiedlichen Zellarten oder in Abhängigkeit von sonstigen zellabhängigen/physiologischen Faktoren, z. B. zellphysiologische Veränderungen, wie erhöhte, homologe Rekombination;
3. Bestimmung des Auftretens und Quantifizierung von RRRP in lebenden Zellen in Abhängigkeit von der Tumorgenizität der Zellen und damit umgekehrt eine Bestimmung der Tumorgenizität der Zellen;
4. Bestimmung des Auftretens und Quantifizierung von RRRP in Geweben/Organen im lebenden Organismus in Abhängigkeit von den vorstehenden Punkten 1. bis 3.;
5. Untersuchung von Reparaturmechanismen und Genregulationskontrolle in Zellen oder in einem Organismus in Abhängigkeit von den vorstehenden Punkten 1. bis 4.;
6. Untersuchung von Replikationsvorgängen in Zellen oder in einem Organismus in Abhängigkeit von den vorstehenden Punkten 1. bis 4.;
7. Optimierung und Screening von Rekombinations-, Replikations- und Reparatursystemen sowie deren Einzelkomponenten in Abhängigkeit von den vorstehenden Punkten 1. bis 6., und
8. Selektion und Züchtung von Zellen oder Organismen mit bestimmten (gewünschten) Rekombinationseigenschaften.

Dabei kann mittels der vorstehenden Untersuchungen auch eine DNA- Sequenzabhängigkeit ermittelt werden, und außerdem können sich diese auch auf Viren bzw. die Beziehung von Viren zu zellulären Organismen beziehen.

Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erzielbaren Vorteile sind somit u. a.:

1. Die Möglichkeit der integralen in-vivo-Untersuchung der RRRP, das heißt, z. B. der Prozeß der homologen Rekombination wird direkt an der DNA-Sequenz gemessen und nicht z. B. an der Menge eines beteiligten Proteins oder Stoffs.
2. Die Möglichkeit der in-vivo-Analyse der vorstehend diskutierten Fragestellungen.
3. Weitgehende Artefaktfreiheit und Kosten- und Zeitersparnis durch Wegfall aufwendiger Präparationsmethoden durch Begutachtung in vivo am Mikroskop (Echtzeit-Analyse).
4. Die Untersuchungen können ohne Zellverbrauch an denselben Zellen fortgeführt werden; Messungen an einzelnen Zellen sind nun möglich.
5. Massen-Screenings sind einfach (und auch in vivo) möglich.
6. Die Möglichkeit der Selektion und Züchtung von Zellen mit bestimmten Rekombinationseigenschaften.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von Rekombinationsereignissen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Herstellung eines Vektors oder mehrerer Vektoren, die ein ein erstes, nachweisbares Protein (NP₁) kodierendes Gen und ein ein zweites, nachweisbares Protein (NP₂) kodierendes Gen enthalten, wobei beide Gene homologe Bereiche zueinander aufweisen und wobei vor dem nachzuweisenden Rekombinationsereignis (1) kein oder nur ein NP nachweisbar ist oder (2) die beiden NP in unterschiedlichen Zellkompartimenten nachweisbar sind;
b) Transfektion der gewünschten Zelle und Kultivieren der Zelle, und
c) Bestimmung der Anwesenheit und/oder Konzentration der Proteine NP₁ und NP₂, wobei eine veränderte Anwesenheit, Konzentration und/oder subzelluläre Lokalisation der Proteine NP₁ und NP₂ ein Anzeichen für ein stattgefundenes Rekombinationsereignis ist.

Falls in Schritt c) ein Rekombinationsereignis festgestellt wird, kann sich ein Schritt d) anschließen, der die Herstellung eines Zellysats, die Reinigung von Nukleinsäuren und die Bestimmung des Rekombinationsereignisses über Sequenzierung beinhaltet. Die Herstellung eines Zellysats zur Gewinnung der Nukleinsäuren, deren Reinigung und Sequenzierung kann mittels dem Fachmann bekannten Routineverfahren erfolgen, z. B. mittels des in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahrens.

Je nach Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens können die NP₁ und NP₂ kodierenden Gene bzw. weitere, benötigte, genetische Elemente sich auf einem einzigen Vektor oder auf zwei oder mehrere Vektoren verteilt befinden. Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Vektoren, die die NP kodierenden Gene und geeigneten Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in-vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren sowie in-vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)) beschrieben sind. Die NP kodierenden Gene können auch in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA-Sequenz inseriert werden, so daß die NP beispielsweise in Form von Fusionsproteinen exprimiert werden können.

Das Verfahren läßt sich sowohl in vivo als auch in vitro durchführen. Die in-vivo- Durchführung erfolgt am lebenden Organismus, während die in-vitro-Durchführung mit entsprechenden Zellextrakten funktioniert. Dabei kann dann entweder das Nukleinsäureprodukt über Sequenzierung nachgewiesen werden oder durch die Expression des entsprechenden Konstruktes. Da die Proteinsynthese in vitro nicht ganz unkompliziert ist, kann die entsprechende Nukleinsäure auch wieder in Zellen gebracht werden, um dort exprimiert und nachgewiesen zu werden. Dabei sollte dann darauf geachtet werden, daß hierbei wieder Rekombination etc. auftreten kann. Um die Rekombination dann genauer zu quantifizieren, ist eine genaue Eichung des Systems notwendig.

Der Fachmann kann auch gemäß Standardverfahren den vorstehenden Vektor bzw. die Vektoren so herstellen, daß die Bedingungen bezüglich Schritt c) erfüllt werden. Beispielsweise kann bei der Konstruktion des Vektors bzw. der Vektoren so vorgegangen werden, daß nur das Gen für NP₁ mit einem Promotor funktionell verknüpft ist, nicht jedoch das Gen für NP₂. Nach der Transfektion der Zellen wird somit nur NP₁ exprimiert. Bei einer stattgefundenen Rekombination zwischen dem Gen für NP₁ und NP₂ gerät jedoch das Gen für NP₂ unter Kontrolle des Promotors, und somit ist die Expression von NP₂ anstelle von NP₁ ein Indiz für ein Rekombinationsereignis.

Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßer Vektor zum Nachweis von Konversions(Rekombinations)ereignissen aus den folgenden vier Elementen aufgebaut sein, wobei drei dieser Elemente die DNA-Sequenzen von genetischen Markergenen, die z. B. fluoreszierende Proteine kodieren, enthalten (siehe auch Fig. 6):

1. Der erste genetische Marker (z. B. NP₁) ist der zu analysierende Marker. Er wird mittels eines Promotors exprimiert und kann mit einer spezifischen Lokalisierungssequenz fusioniert sein. Der Marker enthält eine Mutation, die diesen inaktiviert (Knockout); somit wird dieses Konstrukt erst nach einer Konversion korrekt exprimiert. Bei dem Promotor kann es sich auch um einen induzierbaren Promotor handeln (z. B. das TetOn/TetOff-System); somit kann die Konversionskontrolle an- oder ausgeschaltet werden.
2. Der zweite genetische Marker (z. B. NP₂) hält die korrekte Sequenz für den ersten genetischen Marker bereit; somit wird nach der Konversion diese korrekte Sequenz in den ersten genetischen Marker eingeführt, und als Folge davon wird der erste genetische Marker korrekt exprimiert. Der zweite genetische Marker wird nicht exprimiert und sollte zur Verhinderung der Expression unter fremden Promotoren vorzugsweise an seinem Anfang keine ATG-Startsequenz aufweisen.
3. Der dritte (optionale) genetische Marker kann als interner Standard hinsichtlich Transfektion und Expression zur korrekten Quantifizierung der Konversion verwendet werden. Er wird entweder über einen normalen Promotor exprimiert oder einen bidirektionalen Doppelpromotor, der sowohl die Expression des dritten genetischen Markers als auch des ersten genetischen Markers steuert. Die letztere Vorgehensweise hat den Vorteil, daß der konvertierte, erste, genetische Marker direkt mit dem internen Standard verbunden ist, somit die Quantifizierung der Konversion noch bessere Ergebnisse liefert. Der dritte Marker muß sich so von dem zweiten genetischen Marker unterscheiden, daß er als solcher nicht funktionell ist. Dies bedeutet, daß der dritte Marker geringe Homologie zum ersten Marker und zweiten Marker hat und somit keine Konversion eingehen kann.
4. Das vierte Element enthält ein übliches Resistenzgen zur Selektion in Bakterien, Säugerzellen etc.

Der erste genetische Marker kann z. B. ein nichtmutiertes XFP (XFP = allgemeine Bezeichnung für fluoreszierendes Protein) sein, der zweite genetische Marker ein anderes XFP und der dritte genetische Marker ein drittes XFP (insbesondere DsRed). In diesem Zusammenhang wird auch auf die nachstehend näher beschriebenen Ausführungsformen und die nachstehenden Beispiele verwiesen.

Der hier verwendete Ausdruck "Rekombinationsereignis", betrifft nicht nur homologe Rekombinationsereignisse, sondern auch Prozesse, wie Replikation oder Reparaturmechanismen.

Der hier verwendete Ausdruck "wobei beide Gene homologe Bereiche zueinander aufweisen" meint, daß der Homologiegrad zwischen beiden Genen so hoch ist, daß Ereignisse wie eine homologe Rekombination stattfinden können.

Der verwendete Ausdruck "Nukleinsäure" bedeutet DNA oder RNA.

Die nachweisbaren Proteine NP₁ und NP₂ müssen sich insofern voneinander unterscheiden als sie über unterschiedliche Nachweismittel, d. h. getrennt nachweisbar sein müssen. Für das erfindungsgemäße Verfahren eignen sich grundsätzlich Proteine (NP), die über folgende Nachweismittel nachweisbar sind: unterschiedliche Fluoreszenz, andere spektrale Excitation und/oder Emission, unterschiedliche Lebensdauer und Quantenausbeute, andere Diffusionszeit etc. Beispiele für nachweisbare Proteine sind fluoreszierende Proteine, β-Galactosidase, Luciferase, Resistenzgene und andere Markergene.

Der hier verwendete Ausdruck "Zelle" betrifft jede Zelle, wobei es sich um eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle handeln kann. Bevorzugte, eukaryotische Zellen sind tierische Zellen oder Gewebe/Organe, wobei Säugerzellen besonders bevorzugt sind. Der Fachmann kennt auch Verfahren zur Transfektion und Kultivierung der Zellen. Zu den Transfektionsverfahren zählen z. B. Transfektion mit einem Transfektionsreagenz, z. B. einem in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Reagenz, Elektroporation, Ca-Präzipitation, Mikroinjektion etc.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist NP₁ ein erstes fluoreszierendes Protein (XFP₁) und NP₂ ein zweites fluoreszierendes Protein (XFP₂), wobei sich beide Proteine hinsichtlich ihrer Fluoreszenz unterscheiden. Besonders bevorzugt sind die fluoreszierenden Proteine Blue Fluorescent Protein (BFP), Cyan Fluorescent Protein (CFP), Yellow Fluorescent Protein (YFP), Red Fluorescent Protein (RFP) und Green Fluorescent Protein (GFP) (Fa. Clontech, Heidelberg).

In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das nach dem Rekombinationsereignis nachzuweisende NP₁ ursprünglich nicht exprimiert, wobei in einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens das NP₁ (z. B. als Fusionsprotein) kodierende Gen mit einem Promotor funktionell verknüpft ist und exprimiert wird und das NP₂ kodierende Gen mit keinem Promotor oder einem inaktiven Promotor funktionell verknüpft ist und nicht exprimiert wird. Nach einem Rekombinationsereignis gerät das NP₂ kodierende Gen unter die Kontrolle des Promotors, wird exprimiert und ist dann erst nachweisbar.

In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens entspricht NP₂ einer mutierten Form von NP₁ (oder umgekehrt), wobei die Mutation zu einem in seiner biologischen Funktion veränderten oder inaktivierten Protein führt. Dabei unterscheidet sich die die mutierte Version von NP1 kodierende DNA- Sequenz gegenüber der das aktive Protein kodierenden Sequenz durch Deletion(en), Insertion(en), Austausch(e) und/oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen bzw. stellt ein Fragment des ursprünglichen DNA-Moleküls dar. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der DNA-Sequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., supra. Der Fachmann ist auch in der Lage, zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten DNA-Sequenz kodiertes Protein hinsichtlich seiner biologischen Eigenschaften verändert bzw. inaktiviert ist, z. B. indem bei einem XFP untersucht wird, ob es noch Fluoreszenzeigenschaften aufweist.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist NP₁ ein XFP₁ und NP₂ eine mutierte Form von XFP₁ (oder umgekehrt), wobei die Mutation zu einem nicht mehr fluoreszierenden Protein führt. Andererseits kann auch eine Veränderung anderer, spektraler Eigenschaften erfolgen, z. B. Änderung der Excitation/Emission, Lebensdauer oder Quantenausbeute. Am meisten bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem das NP₂, vorzugsweise XFP₂ kodierende Gen mit einem Promotor funktionell verknüpft ist und exprimiert wird, jedoch aufgrund einer Mutation inaktiv ist, und das NP₁, vorzugsweise XFP₂ kodierende Gen mit keinem Promotor oder einem inaktiven Promotor funktionell verknüpft ist und nicht exprimiert wird.

In einer alternativen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß:

a) die NP₁ und NP₂ kodierenden Gene jeweils mit einem Promotor funktionell verknüpft sind und exprimiert werden;
b) NP₁ und NP₂ als Fusionsproteine exprimiert werden, wobei sich die Fusionspartner so unterscheiden, daß die Fusionsproteine in unterschiedlichen Zellkompartimenten lokalisiert sind, und
c) wobei eine Veränderung der Lokalisierung oder des Expressionsgrads in den unterschiedlichen Zellkompartimenten ein homologes Rekombinationsereignis anzeigt.

Dabei wird durch ein Rekombinationsereignis bei einem oder beiden Fusionsproteinen das NP, vorzugsweise XFP, ausgetauscht, so daß dann diese Veränderung durch die neue Lokalisation im Falle eines XFP durch eine neue Lokalisierung der unterschiedlichen Fluoreszenzen innerhalb der Zelle dokumentiert wird; siehe dazu auch die nachstehenden Beispiele, die sich auf diese Ausführungsform beziehen.

Der Fachmann kann gemäß Standardverfahren die für das erfindungsgemäße Verfahren benötigten Fusionsproteine bzw. die diese kodierenden DNA-Sequenzen herstellen, wobei er darauf achtet, daß beide Partner noch über die gewünschten, biologischen Eigenschaften verfügen, d. h. das NP, z. B. XFP, muß nach nachweisbar sein, d. h. im Fall eines XFP noch Fluoreszenz aufweisen; der für die Lokalisierung des Fusionsproteins benötigte Partner muß noch die gewünschte Lokalisierung bewirken können. Vorzugsweise stellt das Lokalisierungs-Polypeptid den N- terminalen Partner des Fusionsproteins dar. Geeignete Lokalisierungs-Signale bzw. -Polypeptide sind dem Fachmann bekannt, und dazu zählen z. B. Polypeptide für nukleäre Lokalisation, für Lokalisation im Golgi-Apparat und/oder endoplasmatischem Retikulum und/oder Mitochondrien bzw. an/in der Zellmembran. Vorzugsweise ist der eine NP-Fusionspartner ein Polypeptid für nukleäre Lokalisation und der Fusionspartner für das andere NP ein Polypeptid für die Lokalisation in/an der Zellmembran. In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform ist der eine NP-Fusionspartner ein Polypeptid für die nukleäre Lokalisation und der Fusionspartner für das andere NP ein Polypeptid für die Lokalisation im Golgi- Apparat und/oder endoplasmatischen Retikulum.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der NP₁-Fusionspartner ein humanes Histon, z. B. H1, H2A, H2B, H3 oder H4, vorzugsweise H2A.1, und/oder der NP₂-Fusionspartner humanes Catepsin- B-Protein.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt auch die Untersuchung von sequenzabhängigen Rekombinationseffekten. Somit enthalten in einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens der Vektor oder die Vektoren zur Untersuchung von sequenzabhängigen Rekombinationseffekten noch die NP₁ und/oder NP₂ kodierenden Gene flankierende Sequenzen. Diese können beispielsweise solche sein, die eine bestimmte Krümmung in der DNA induzieren, die spezielle Symmetrien aufweisen, die Splicing bewirken oder betimmte Bindesequenzen für Proteine darstellen.

Der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete Vektor bzw. die Vektoren (DNA- oder RNA-Vektor(en), Viren) können weitere, genetische Elemente enthalten, vorzugsweise einen weiteren, genetischen Marker NP3 als internen Standard hinsichtlich der Transfektions- und Expressionseffizienz. Bei diesem Marker kann es sich z. B. um ein weiteres XFP handeln, das sich hinsichtlich seiner Fluoreszenzeigenschaften und Homologien von dem XFP1 und XFP2 unterscheidet. Dieser weitere Marker steht vorzugsweise unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors.

Es besteht auch die Möglichkeit, eine doppelte oder mehrfach simultane Transfektion von Zellen mit den Vektoren durchzuführen. Dies sollte so beschaffen sein, daß kein RRRP mehr auftritt. RRRP kann verhindert werden durch:

a) Einsatz eines Transporters für die Konstrukte, die RRRP weniger unterstützen;
b) Senkung des Homologiegrades der verwendeten Konstrukte, z. B. durch Veränderung der "Codon-Usage". Damit kann das resultierende Protein nach der Transkription gleich sein, der Homologiegrad aber weit abgesenkt werden.

Es wird deshalb ein Verfahren zur getrennten Amplifikation mehrerer DNA- Sequenzen in vivo unter Vermeidung von Rekombinationsereignissen zwischen einzelnen DNA-Sequenzen beansprucht, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:

a) Herstellung eines Vektors oder mehrerer Vektoren, die mehr als eine DNA- Sequenz enthalten, wobei die DNA-Sequenzen einen so geringen Homologiegrad zueinander aufweisen, daß keine Rekombination zwischen den einzelnen DNA-Sequenzen auftreten kann;
b) Transfektion der gewünschten Zelle und Kultivieren der Zelle, und
c) Selektion von transfizierten Zellen und Isolierung der amplifizierten DNA- Sequenzen.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren bzw. Vektorgemische mit den vorstehend definierten Elementen bzw. Eigenschaften sowie einen diesen Vektor bzw. ein Vektorgemisch und gegebenenfalls Nachweismittel für NP1 und/oder NP2 enthaltenden Kit. Je nach Ausgestaltung des Kits können die Nachweismittel frei vorliegen oder an einen festen Träger immobilisiert sein, beispielsweise eine Plastikschale, ein Teströhrchen, eine Mikrotiterplatte, ein Teststäbchen etc. Der Kit kann auch Anleitungen enthalten, die die Verwendung der enthaltenen Nachweismittel in einem Assay zur Bestimmung der NP₁/NP₂-Aktivität bzw. Lokalisation erläutern. Der Kit kann weiterhin geeignete Reagenzien zum Nachweis von Markierungen oder zur Markierung positiver und negativer Kontrollen, Waschlösungen, Verdünnungspuffer etc. enthalten.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch Zellen (eukaryotisch oder prokaryotisch) bzw. Zellinien, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor oder Vektorgemisch transfiziert sind und zur Untersuchung von Rekombinationsereignissen geeignet sind, z. B. hinsichtlich der Auswirkung von karzinogen Substanzen oder sonstigen chemischen oder physikalischen Noxen auf die Rekombinations- oder Reparaturrate innerhalb der Zelle. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung auch Organe und ganze Organismen, die mit einem erfindungsgemäßen Vektor oder Vektorgemisch transfiziert sind und sich somit zur Untersuchung von Rekombinationsereignissen eignen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein in-vivo- und in-vitro-Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäure-Sequenzen. Dieses Verfahren weist die folgenden Schritte auf:

a) Herstellung eines Vektors oder mehrerer Vektoren, die eine erste und eine zweite oder mehrere Teilsequenz(en) enthalten, wobei die Teilsequenzen homologe Bereiche zueinander aufweisen.;
b) Transfektion der gewünschten Zelle mit dem Vektor oder den Vektoren aus Schritt (a) und Kultivieren der Zelle, und
c) Selektion von transfizierten Zellen, bei denen eine Rekombination der Teilsequenzen stattgefunden hat.

Das vorgenannte Verfahren erlaubt die Herstellung von Nukleinsäure-Konstrukten, die normalerweise nicht komplett in einem einzigen Schritt in vitro oder in vivo amplifiziert werden können und/oder in eine Zelle eingebracht werden können. Falls man in eine Zelle eine Nukleinsäure-Sequenz einbringen möchte, deren Länge zu lang ist oder aus verschiedensten Gründen nicht in einem Stück herstellbar ist, gibt es die Möglichkeit, die Sequenz zu teilen, wobei darauf zu achten ist, daß die beiden Sequenzen überlappen; z. B. bei einer 1000 bp langen Sequenz würde man z. B. ein Stück von 1-600 bp und das andere von 400-1000 bp herstellen und beide in Zellen, Gewebe oder Organismen einbringen, wo die Rekombination zu einer einzigen Sequenz erfolgt. Auf diese Art sind ganze Genbanken herstellbar. Genauso ist es denkbar, z. B. zwei nicht-funktionelle Konstrukte in Zellen einzubringen, die nach Stattfinden eines Rekombinationsereignisses zu einem einzigen, funktionellen Konstrukt werden. Das Verfahren kann somit Anwendung finden, wenn ein gewünschtes Nukleinsäure-Konstrukt z. B. aufgrund einer bestimmten Faltung etc. nicht in eine Zelle eingeschleust werden kann. Diese Faltung kann zwar z. B. durch eine bestimmte Mutation verhindert werden, aber dies führt in der Regel dazu, daß das Konstrukt nicht mehr funktionell ist. Auch dieses Problem kann man durch das erfindungsgemäße Verfahren umgangen werden, nämlich wiederum dadurch, daß das Ursprungskonstrukt in zwei oder mehrere Teilsequenzen aufgespalten wird, die zueinander homologe Bereiche aufweisen, die entsprechende Mutation tragen und nicht funktionell sind, aber in eine Zelle eingebracht werden können. Durch homologe Rekombination in der Zelle wird dann das gewünschte Konstrukt erhalten.

Kurze Beschreibung der Figuren Fig. 1

A) Physikalische Karte für pSV-Hx-XFP.
In den Beispielen wurde pSV-H2A-CFP verwendet und H2A-YFP oder H2A-GFP wurden exprimiert.
B) Physikalische Karte von pcDNA3-hCB-eYFP.

Fig. 2

Homologievergleich der Vektoren pSV-H2A-CFP und pcDNA3-HCB-eYFP.

Die vergrößerten Sequenzen von CFP und YFP offenbaren einen Unterschied von 16 Basenpaaren. Pfeile markieren die Primer, die in der genomischen PCR zum Nachweis der Sequenzkonversion von H2A-CFP zu H2A-YFP verwendet wurden, und deren Richtungen.

Fig. 3

Mögliche Phänotypen nach gleichzeitiger Co-Transformation mit pSV-H2A-CFP und pcDNA3-hCB-eYFP.

Fig. 4

A) LCLC103H-Zellen exprimieren pSV-H2A-CFP im Nukleus und pcDNA3-HCB- eYFP im endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat.
Ein Nukleus enthält ein Gemisch aus H2A-CFP und H2A-YFP, was eine positive Genkonversion anzeigt.
B) Übersicht (Falschfarbe) über LCLC103H-Zellen, die mit pSV-H2A-CFP (grün) und pcDNA3-HCB-eYFP (rot) transfiziert wurden.
Die Population zeigte eine angereicherte Fraktion von H2A-YFP und H2A-CFP + H2A-YFP.

Fig. 5

Die Ergebnisse der Sequenzierung und ein Homologie-Vergleich der genomischen PCR (siehe auch Fig. 4A) belegen die Konversion von der Expression von H2A- CFP zu H2A-YFP.

Fig. 6

Plasmidkarte für den Test auf Konversionen.

Das Plasmid kann außerdem auch weitere funktionelle Elemente, wie z. B. Replikationsursprünge etc., enthalten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Dabei wurden simultane Co- Transfektionen mit DNA-Konstrukten (siehe Fig. 1), die mit unterschiedliche Fluoreszenzproteine (XFPs) kodierenden Genen ausgestattet waren, mittels einer Reihe unterschiedlicher Transfektionsverfahren und Zellinien (Tabelle 1) durchgeführt. Entsprechend der verwendeten Konstrukte und Verfahren (Fig. 2 und 3) trat eine Konversion der Fluoreszenzeigenschaften der DNA-Konstrukte ein (Fig. 4). Die Tatsache, daß die Konversion auf der DNA-Ebene eintrat, wurde mittels genomischer PCR und Sequenzierung (Fig. 2 und 5) nachgewiesen.

Beispiel 1 Konstruktion von Vektoren mit XFP-Fusionsproteine kodierenden Insertionen a) pSV-Hx-XFP

Der für das humane Histon H2A.1 kodierende Bereich wurde amplifiziert (DE 100 13 204.9) und in einen von dem promotorlosen Plasmid pECFP-1 (Clontech, Heidelberg) abstammenden, eukaryontischen Expressionsvektor über die EcoRI- und BamHI-Restriktionsstellen kloniert. Dieser Vektor enthält einen SV40- Promotorbereich in reverser Orientierung (was in diesem Fall zu einer höheren Expressionseffizienz führt) und die ECFP (Enhanced cyan fluorescent protein) kodierende Sequenz am 3'-Terminus des Fusionsgens. Durch diese Vorgehensweise wurde ein Plasmid mit folgender Struktur erhalten:

p-(HindIII)-P_SV40rv-(HindIII)-(EcoRI)-hH2A.1-(BamHI)-ECFP-1 (Fig. 1A)

b) pcDNA3-hCB-eYFP

Die das humane Cathepsin-B-Protein ohne das C-terminale Propeptid kodierende Nukleinsäuresequenz wurde mittels PCR von dem IMAGE-Klon ID380482 amplifiziert. Während der Amplifikation wurden die Restriktionssstellen für KpnI (5'- Ende) und SaII (3'-Ende) angefügt. Die eYFP (enhanced yellow fluorescent protein) kodierende Nukleinsäuresequenz wurde von einem von pEYFP-1 stammenden Plasmid (Clontech) ebenfalls über PCR erhalten, wobei gleichzeitig die Restriktionsstellen für SaII (5'-Ende) und NotI (3'-Ende) angefügt wurden. Unter Verwendung dieser Restriktionsstellen wurde nach verschiedenen Klonierungsschritten ein Säuger-Expressionsvektor mit folgender Struktur erhalten:

pcDNA3-(KpnI)-hCB(flmCpro-)-(SaII)-ECFP-(NotI) (Fig. 1B)

Die Expression des Fusionsproteins ist dabei unter der Kontrolle des CMV- Promotors aus dem Cytomegalievirus. Die pcDNA3 ist von Invitrogen erhältlich.

Beispiel 2 I. Verwendete Transfektionsverfahren a) Transfektion mit FuGENE™ 6

Die Transfektion der Zellen wurde mit dem FuGENE™-6-Transfektionsreagenz (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim) gemäß dem Standardverfahren durchgeführt. Dazu wurden 0,5 × 10⁵ Zellen auf Lab-Tek™-"2-well"-Kammerträger (Nung, Wiesbaden) ausgesät und 12 Stunden später mit den angegebenen Plasmiden transfiziert. Für jede zu transfizierende Vertiefung wurde das FuGENE™- 6-Reagenz mit nicht-komplettem RPMI-1640-Kulturmedium vermischt (Endvolumen: 50 µl). Nach 5 Min. Inkubation wurde zu dem Transfektionsgemisch 1 µg Plasmid- DNA gegeben, und nach weiteren 15 Min. wurde das Gemisch den Zellen verabreicht.

Außerdem wurden die folgenden Reagenzien getestet: Dmrie-C, Cellfectin, Lipofectin und GibcoPlus (Transfection Reagent Sample Pack, Cat #10552-016 von Gibco Life-Technologies, Gaithersburg, MD, USA).

b) Transfektion über Elektroporation

Etwa 10⁷ Zellen wurden geerntet und in 1 ml Zellkulturmedium suspendiert. Die Elektroporation mit 5 µg Plasmid-DNA wurde bei Raumtemperatur unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:

Bei #1 und #2 überlebten die Zellen quantitativ.

c) Transfektion mittels Ca₂PO₄

Die Zellen wurden zu 50% Konfluenz in Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm wachsen gelassen. Das Medium wurde 2 Stunden vor der Transfektion gewechselt. Es wurden zwei Lösungen hergestellt:
A: 2 × HBS (50 mM Hepes, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na₂HPO₄, pH-Wert: genau 6,95).
B: 2,5 M CaCl₂, 20 µg DNA, mit Wasser auf 500 µl aufgefüllt.

Die Lösungen A und B wurden tropfenweise vermischt, und nach jedem Tropfen wurde gevortext. Nach 20 Min. bei Raumtemperatur wurde das Gemisch einschließlich der Ca-Präzipitate zu dem Medium gegeben. Das Medium wurde erneut nach 16 Stunden gewechselt.

II. Kultivierung der Zellen

Lungenkarzinom-Zellen (LCLC103H), HeLa- und Cos7-Zellen wurden zur Etablierung stabil transfizierter Zellinien verwendet. Permanent transfizierte Zellen wurden durch Selektion mit G418 (800 µg/ml) für mindestens 1 Woche erhalten, und diese wurden in RPMI-1640-Kulturmedium mit 10% FCS und 6 mM Glutamin bei 37°C mit 5% CO₂ gehalten.

III. Fluoreszenz-Mikroskopie und Quantifizierung der zellulären Fluoreszenz a) Fluoreszenz-Mikroskopie

Einen Tag nach der Transfektion wurden die Kulturen der lebenden Zellen mit einem Zeiss-Mikroskop "Axiovert S100 TV" unter Verwendung von 10×-, 20×- und 40×- Objektiven für den Phasenkontrast- und Fluoreszenz-Modus analysiert. Die Fluoreszenzsignale wurden unter Verwendung von Einzel-Anregungsfiltern für ECFP (436/10, Omega, Brattleboro, VT05302, USA) und EYFP (515/10, Omega), einem Zweiband-Emissionsfilter (470/30-555140, Omega) und einem Zweiband- Strahlenteiler (475/565, Omega) überwacht. Die Bilder wurden mittels einer gekühlten Digital-CCD-Kamera (Hamamatsu C4742-95) gespeichert und mittels der Software für Zell-Bilddarstellung "OpenLab" (Improvision, Warwick, UK) auf einem Macintosh-Computer ausgewertet.

b) Quantifizierung der zellulären Fluoreszenz

Nach neun Tagen G418-Selektion wurden für die statistischen Analysen die Zellen in Schalen mit einem Durchmesser von 10 cm bei einer geeigneten Dichte (ca. 106 Zellen pro 20 cm²) ausgesät. Zu einer gegebenen Zeit wurden drei Bilder (kalibriert zu den hellsten Intensitäten) aufgenommen: Ein Phasenkontrastbild mit 30 ms Belichtungszeit, dem ECFP-Kanal bei 500 ms und dem EYFP-Kanal bei 1 Min. sowie bei 30% Verstärkung für die Signalamplifikation. Nach der Hintergrund-Subtraktion wurden die Bilder der beiden Fluoreszenz-Kanäle (mit einer Basis- Intensitätsschwelle von etwa 5% geschnitten) dichtegeschnitten (wobei damit nur die Histon-GFP-Signale aufgrund der geringeren Signalintensität der CB-GFP- Expression gemessen werden konnten). Dann wurden die Fluoreszenz-Kanäle verbunden. Die binäre Maske wurde auf beide Kanäle angewendet, und die mittleren Grauwerte der nukleären Signale wurden gemessen und gegeneinander aufgetragen.

Tabelle 1

Quantifizierung der Konversion von H2A-CFP zu H2A-YFP unter Verwendung unterschiedlicher Konstrukte, Zellinien und Transfektionsverfahren

Beispiel 3 Bestimmung der Nukleotidsequenz a) Lysatextraktion und Reinigung der genomischen DNA

Einzelne H2A-Zellklone mit konvertierten Fluoreszenzeigenschaften wurden bis zur Konfluenz in Zellkulturflaschen (25 cm², etwa 10⁷ Zellen) gezüchtet. 5 ml Lysatpuffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris) und 0,1 mg/ml (Endkonzentration) Proteinase K wurden zugegeben, und dann wurde bei 37°C ü. N. inkubiert. Das extrahierte Lysat wurde zweimal durch Zugabe von 5 ml Phenol/Chloroform (1 : 1, V./V.), anschließender Verwirbelung (1 bis 3 Min.) und fünfminütiger Zentrifugation bei 3.000 UpM gereinigt. Die DNA wurde durch Zugabe von NaCl (0,1 M Endkonzentration) und 10 ml 10% Ethanol präzipitiert. Die genomische DNA wurde mit einer Pasteurpipette aus der Lösung entnommen und in TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA) resuspendiert. Die verbliebenen DNA-Fragmente wurden bei -20°C inkubiert und 45 Min. bei 15.000 UpM zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde mit Ethanol gewaschen und auch in TE-Puffer resuspendiert.

b) Bestimmung der Nukleotidsequenz

Die die rekombinierten XFP-Sequenzen enthaltende, extrahierte DNA wurde mittels PCR mit verschiedenen Primern überprüft, die entweder für XFP- oder Vektorsequenzen entworfen worden waren. Die PCR wurde auf einem "Minicycler" von Biozym Diagnostik (Hess. Oldendorf) mit einem Vorerhitzungsschritt für 1 Min. bei 94°C und 35 Zyklen (Denaturierung: 30 Sek. bei 94°C; Elongation: 210 Sek. bei 65°C; End-Annealing: 1 Min. bei 65°C) durchgeführt. Die gleichen Primer wurden zur direkten Sequenzierung der genomischen DNA verwendet.

c) Sequenzvergleiche

Die Homologiestudien für Nukleinsäuresequenzen wurden mit den Sequenzvergleichsprogrammen "AlignPlus" (Scientific & Educational Software) und MACAW von Greg Schuler (Version 2.0.5) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung von Rekombinationsereignissen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Herstellung eines Vektors oder mehrerer Vektoren, die ein ein erstes nachweisbares Protein (NP₁) kodierendes Gen und ein ein zweites nachweisbares Protein (NP₂) kodierendes Gen enthalten, wobei beide Gene homologe Bereiche zueinander aufweisen und wobei vor dem nachzuweisenden Rekombinationsereignis 1. kein oder nur ein NP nachweisbar ist oder 2. die beiden NP in unterschiedlichen Zellkompartimenten nachweisbar sind oder 3. ihre Fluoreszenzeigenschaften geändert sind;
b) Transfektion der gewünschten Zelle und Kultivieren der Zelle, und
c) Bestimmung der Anwesenheit und/oder Konzentration der Proteine NP₁ und NP₂, wobei eine veränderte Anwesenheit, Konzentration und/oder subzelluläre Lokalisation der Proteine NP₁ und NP₂ ein Anzeichen für ein stattgefundenes Rekombinationsereignis ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei NP₁ ein erstes fluoreszierendes Protein (XFP₁) ist und NP₂ ein zweites fluoreszierenden Protein (XFP₂) ist und wobei sich beide Proteine hinsichtlich ihrer Fluoreszenz unterscheiden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das fluoreszierende Protein BFP, (e)CFP, (e)YFP, RFP oder GFP ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das nach dem Rekombinationsereignis nachzuweisende NP₁ ursprünglich nicht exprimiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das NP₁ kodierende Gen mit einem Promotor funktionell verknüpft ist und exprimiert wird und das NP₂ kodierende Gen mit keinem Promotor oder einem inaktiven Promotor funktionell verknüpft ist und nicht exprimiert wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei NP₂ eine mutierte Form von NP₁ ist (oder umgekehrt) und wobei die Mutation zu einem in seiner biologischen Funktion veränderten oder inaktivierten Protein führt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei NP₁ ein XFP₁ ist und NP₂ eine mutierte Form von XFP₁ (oder umgekehrt) und wobei die Mutation zu einem nicht mehr fluoreszierenden Protein führt.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei das NP₂ kodierende Gen mit einem Promotor funktionell verknüpft ist und exprimiert wird, jedoch aufgrund einer Mutation inaktiv ist, und das NP₁ kodierende Gen mit keinem Promotor oder einem inaktiven Promotor funktionell verknüpft ist und nicht exprimiert wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei:

a) die NP₁ und NP₂ kodierenden Gene jeweils mit einem Promotor funktionell verknüpft sind und exprimiert werden;
b) NP₁ und NP₂ als Fusionsproteine exprimiert werden, wobei sich die Fusionspartner so unterscheiden, daß die Fusionsproteine in unterschiedlichen Zellkompartimenten lokalisiert sind, und
c) wobei eine Veränderung der Lokalisierung in den unterschiedlichen Zellkompartimenten ein homologes Rekombinationsereignis anzeigt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der NP₁-Fusionspartner ein Polypeptid für nukleäre Lokalisation und der NP₂-Fusionspartner ein Polypeptid für Lokalisation im Golgi-Apparat und/oder endoplasmatischem Retikulum (oder umgekehrt) ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei der NP₁-Fusionspartner humanes Histon H2A.1 ist und der NP₂-Fusionspartner humanes Catepsin-B-Protein.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Vektor oder die Vektoren zur Untersuchung von sequenzabhängigen Rekombinationseffekten noch die NP₁ und/oder NP₂ kodierenden Gene flankierende Sequenzen enthalten.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der (die) Vektor(en) außerdem einen weiteren, genetischen Marker als internen Standard hinsichtlich der Transfektions- und Expressionseffizienz enthalten.

14. Verfahren zur Herstellung einer gewünschten Nukleinsäure-Sequenz aus Teilsequenzen, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

a) Herstellung eines Vektors oder mehrerer Vektoren, die eine erste Teilsequenz und eine zweite oder mehrere Teilsequenz(en) enthalten, wobei die Teilsequenzen homologe Bereiche zueinander aufweisen;
b) Transfektion der gewünschten Zelle mit dem Vektor oder den Vektoren aus Schritt a) und Kultivieren der Zelle, und
c) Selektion von transfizierten Zellen, bei denen eine Rekombination der Teilsequenzen stattgefunden hat.

15. Verfahren zur getrennten Amplifikation mehrerer DNA-Sequenzen in vivo unter Vermeidung von Rekombinationsereignissen zwischen einzelnen DNA- Sequenzen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Herstellung eines Vektors oder mehrerer Vektoren, die mehr als eine DNA-Sequenz enthalten, wobei die DNA-Sequenzen einen so geringen Homologiegrad zueinander aufweisen, daß keine Rekombination zwischen den einzelnen DNA-Sequenzen auftreten kann;
b) Transfektion der gewünschten Zelle und Kultivieren der Zelle;
c) Selektion von transfizierten Zellen und Isolierung der amplifizierten DNA-Sequenzen.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die DNA-Sequenzen ein erstes nachweisbares Protein (NP₁) und/oder ein zweites nachweisbares Protein (NP₂) gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1-9 kodieren.

17. Vektor oder Vektorgemisch, der (das) die in Ansprüchen 1 bis 16 definierten Elemente enthält.

18. Kit, der den Vektor oder das Vektorgemisch gemäß Anspruch 17 enthält und gegebenenfalls Nachweismittel für NP₁ und/oder NP₂.

19. Zelle, die mit einem Vektor oder Vektorgemisch nach Anspruch 14 transfiziert ist.

20. Zelle nach Anspruch 19, wobei diese eukaryotisch oder prokaryotisch ist.

21. Verwendung der Zelle nach Anspruch 19 oder 20 zur Untersuchung von homologen Rekombinationsereignissen.