DE10012861C2 - Rekombinante HHV8-DNA - Google Patents
Rekombinante HHV8-DNAInfo
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Description
Die Erfindung betrifft rekombinante HHV8-DNA sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.
Die Entdeckung des Genoms eines Herpesvirus in Kaposisarkomzellen stellte einen
Durchbruch beim Verständnis der Pathogenese des Kaposisarkoms dar1. Das als
Kaposisarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV) oder humanes Herpesvirus 8 (HHV8)
bezeichnete Virus kodiert für eine Anzahl von Cytokinen (MIP, IL-6, Interferon-
Regulationsfaktor), Cyclin-Homologen und G-Proteinen, die als Wachstumsfaktoren wirken
oder die Zellproliferation fördern. All diese Proteine könnten am Tumorzellwachstum
beteiligt sein.
Weiterhin identifiziert wurden virale Apoptoseinhibitoren und virale Proteine mit
transformierenden Eigenschaften. Aus diesen Gründen scheint das Virus an der Entstehung
von Kaposisarkomen und anderen, Virusassoziierten Erkrankungen direkt oder indirekt
beteiligt zu sein.
Gleichwohl bleibt eine Anzahl grundlegender Fragen zu beantworten:
Bisher kennt man die Targetzelle von HHV8 nicht, und auch der Zellstammbaum des Kaposisarkoms ist umstritten. Weiterhin kann HHV8 in Kultur nicht vermehrt werden. Das Virus kann nur durch Behandlung bestimmter Zellinien mit TPA und Butyrat erhalten werden, die latent mit HHV8 infiziert sind. Weiterhin wurden bisher alle Daten, die das transformierende Potential dieses Virus betreffen, aus Experimenten mit einzelnen viralen Genprodukten abgeleitet, und die Funktion dieser Genprodukte im Kontext mit dem gesamten Virus ist bisher unbekannt.
Bisher kennt man die Targetzelle von HHV8 nicht, und auch der Zellstammbaum des Kaposisarkoms ist umstritten. Weiterhin kann HHV8 in Kultur nicht vermehrt werden. Das Virus kann nur durch Behandlung bestimmter Zellinien mit TPA und Butyrat erhalten werden, die latent mit HHV8 infiziert sind. Weiterhin wurden bisher alle Daten, die das transformierende Potential dieses Virus betreffen, aus Experimenten mit einzelnen viralen Genprodukten abgeleitet, und die Funktion dieser Genprodukte im Kontext mit dem gesamten Virus ist bisher unbekannt.
Weiterhin ist unbekannt, ob alle oder nur einzelne virale Transformationsproteine zur
Transformation der Zellen erforderlich sind. Hierzu ist es beispielsweise notwendig, das virale
Genom von HHV8 gezielt zu mutieren, was natürlich am einfachsten in Prokaryontenzellen,
beispielsweise E. coli-Zellen, durchführbar ist.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, HHV8-DNA bereitzustellen, die in prokaryonten
Organismen wie E. coli replizierbar ist und die eine Produktion infektiöser Teilchen ohne
induzierende Agenzien wie TPA oder Butyrat ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine rekombinante HHV8-DNA
bereitgestellt wird, die zumindest ein inaktiviertes essentielles Gen von HHV8 aufweist und
weiterhin die Information für die Replikation der HHV8-DNA in Prokaryontenzellen oder
Hefezellen und zumindest ein in einem prokaryonten Organismus oder einer Hefezelle
selektierbares Markergen enthält.
Unter "Information für die Replikation" sind solche Sequenzbereiche zu verstehen, die
insbesondere den Replikationsursprung und wahlweise auch Bindungsstellen für
Replikationsfaktoren umfassen. Sie sind für die Initiation der DNA Replikation
verantwortlich. In ihrer Gesamtheit bezeichnet man sie auch als Replikons.
Durch das Einführen eines prokaryonten Replikons oder Hefereplikons in die HHV8-DNA
zusammen mit zumindest einem in Prokaryontenzellen oder Hefezellen selektierbaren
Markergen, ist sowohl eine Replikation der HHV8-DNA in Prokaryontenzellen oder
Hefezellen durchführbar, und es wird auch die Möglichkeit eröffnet, das HHV8-Genom durch
an sich bekannte Verfahren zu mutagenisieren, beispielsweise gezielt Deletionen, Insertionen,
insbesondere Fremdgene in das HHV8-Genom einzuführen.
Als Markergene, die in prokaryonten Organismen oder Hefezellen selektierbar sind, werden
insbesondere Antibiotikaresistenzgene und fluoreszierende Gene oder das lacZ-Gen
bevorzugt. In prokaryonten Organismen, beispielsweise E. coli oder in Hefezellen, z. B. S.
cerevisiae oder S. pombe, selektierbare Antibiotikaresistenzgene sind dem Fachmann
bekannt. Beispiele hierfür sind das Chloramphenicolresistenzgen und Ampicillinresistenzgen.
Ein Beispiel für ein Gen, welches für ein fluoreszierendes Protein kodiert, ist das gfp-Gen. In
einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist auch ein in eukaryonten tierischen oder
menschlichen Zellen selektierbares Markergen enthalten. Hierzu gehören wiederum für
fluoreszierende Proteine kodierende Gene und Antibiotikumresistenzgene. Beispiele für
Antibiotikumresistenzgene sind das Hygromycinresistenzgen und Neomycinresistenzgene.
Die Information für die Replikation in Prokaryonten stammt in einer bevorzugten
Ausführungsform der Erfindung aus dem F-Faktor von E. coli.
Ein weiteres wichtiges Merkmal der erfindungsgemäß bereitgestellten rekombinanten HHV8-
DNA ist die Inaktivierung eines essentiellen Gens von HHV8. Unter "essentielles Gen" sind
solche Gene zu verstehen, die bei der Regulation der viralen Genexpression essentiell sind.
Hierzu gehören insbesondere die viralen Transkriptionsfaktoren, nämlich die immediate-early
Gene, und die frühen Gene der DNA-Replikation. Ein Beispiel für ein immediate-early Gen
ist der Transfektionsfaktor ORF50. Beispiele für frühe Gene der DNA-Replikation sind die
Polymerase ORF9, das DNA-Bindungsprotein ORF6, die Primase ORF56 die Helicase
ORF44 und die Helicase/Primase ORF40/ORF41 sowie der DNA-Polymerase-akzessorische
Faktor ORF59.
Die Inaktivierung des essentiellen Gens kann beispielsweise durch Deletion, Integration,
Basenaustausch oder Addition eines oder mehrerer Nukleotide erfolgen. In einer bevorzugten
Ausgestaltungsform der Erfindung wird der Replikationsursprung und/oder das in
Prokaryonten und/oder das in Eukaryonten selektierbare Markergen in ein für HHV8
essentielles Gen integriert, wodurch in einem Schritt sowohl die Inaktivierung des essentiellen
Gens als auch die Integration der für die vorliegende Erfindung weiteren notwendigen
Merkmale durchführbar ist. Selbstverständlich sind auch andere Ausgestaltungen möglich.
Die Integration in das essentielle Gen wird dadurch erleichtert und ist zielgerichtet
durchführbar, daß die in das essentielle Gen zu integrierende DNA von HHV8 homologen
Abschnitten flankiert wird, die eine homologe Rekombination ermöglichen.
Essentielle Gene sind somit solche Gene, die die Virussynthese und Virusreifung regulieren.
Das HHV8-Genom hat eine Größe von ca. 170 kbp (BC3). Es können selbstverständlich aber
auch HHV8-Moleküle mit den Merkmalen des Anspruchs 1 hergestellt werden, die andere
Größen haben. Beispiele hierfür sind HHV8-DNA-Moleküle mit einer Größe von mindestens
100, 120, 130, 140, 150, 170, 200 und 230 kbp. Ein HHV8-Genom mit 230 kbp ist durch eine
partielle Duplikation des Genoms entstanden. Ein Beispiel hierfür ist das BC-1-Virus.
Denkbar sind aber auch größere Moleküle von beispielsweise 250 kbp. Alle diese Moleküle
sind aufgrund ihrer Größe mit den üblichen Techniken in Prokaryonten nicht replizierbar und
mutagenisierbar.
Untersuchungen über die Funktion einzelner Abschnitte auf dem HHV8-Genom wurden
deshalb bisher an isolierten HHV8-DNA-Bruchstücken durchgeführt und nicht am
Gesamtgenom.
Ein Fachmann würde zunächst aufgrund der Größe die Möglichkeit einer Replikation der
HHV8-DNA als Gesamtgenom in Prokaryonten für nicht möglich halten. Selbst wenn er aber
versuchen würde, ein prokaryontes Replikon in die HHV8-DNA einzuführen, würde er
vernünftigerweise versuchen, dieses Replikon an einer Stelle im HHV8-Genom zu
integrieren, die essentielle Gene nicht schädigt, um die Replikation der HHV8-DNA in
tierischen oder menschlichen Eukaryontenzellen, die Expression von HHV8-Genen in diesen
Eukaryontenzellen und die Bildung von HHV8-Viurspartikeln nicht zu gefährden. Dieser
Weg hat sich erfindungsgemäß als nicht gangbar herausgestellt. Völlig überraschend wurde
gefunden, daß das Einbringen eines prokaryonten Replikons oder Hefereplikons in die
HHV8-DNA nur dann zielführend ist, wenn die Integration des Replikons in ein essentielles
virales Gen erfolgt, so daß dieses inaktiviert wird.
Wie oben bereits dargestellt ist es aber auch zielführend, wenn zumindest ein essentielles
virales Gen durch andere Mechanismen, beispielsweise durch eine Deletion oder durch einen
Basenaustausch, inaktiviert wird. In einem solchen Fall kann die Integration des Replikons
oder Hefereplikons und/oder der Markergene auch in nicht-essentielle virale Gene erfolgen.
In einer bevorzugten Form der Erfindung erfolgt durch die Integration des prokaryonten
Replikons oder Hefereplikons eine Inaktivierung eines für die lytische produktive Phase von
HHV8-verantwortlichen Gens, beispielsweise eines für die DNA-Replikation
verantwortlichen Proteins, so daß die Virussynthese unterbunden wird. Ohne "knock-out"
eines essentiellen Gens, beispielsweise durch eine Insertionsmutagenese, ist eine Übertragung
des HHV8-Genoms in stabiler und latenter Form in transformierte Zellen, beispielsweise 293
Zellen, nicht möglich.
Das in das HHV8-Genom eingeführte Replikon kann ein beliebiges prokaryontes Replikon
sein. Beispiele hierfür sind: P1 Replikon, ColE1, SC1-01, p15A, Ti. Beispiele für
Hefereplikons sind: Replikationsursprung von "2 micron circle", autosomal replicating
sequence (ARS).
Ein erfindungsgemäß bevorzugtes Replikon ist das Replikon des F-Faktors von E. coli. Der für
die Replikation der HHV8-DNA in Prokaryonten verantwortliche Abschnitt enthält zumindest
den Replikationsursprung des F-Faktors.
Zur Selektion des rekombinanten HHV8-Genoms in Prokaryonten oder Hefen werden
weiterhin Markergene in die HHV8-DNA eingeführt, beispielsweise Antibiotikaresistenzgene
und fluoreszierende Gene. Weitere Beispiele sind der low affinity nerve growth factor
receptor 1NGF-R, die sekretorische alkalische Phosphatase, Resistenzgene gegen die
Antibiotika Puromycin, Zeomycin, Neomycin. Ein weiteres Beispiel für ein
Antibiotikaresistenzgen ist die Chloramphenicolacetyltransferase. Ein Beispiel für ein
fluoreszierendes Gen ist das "green fluorescence protein". Weiterhin bevorzugt wird in die
HHV8-DNA ein in tierischen oder menschlichen Eukaryontenzellen selektierbares Markergen
eingeführt. Hierbei kann es sich wiederum um ein Fluoreszenzprotein oder ein
Antibiotikumresistenzgen handeln. Ein Beispiel für ein Antibiotikumresistenzgen ist die
Hygromycinphosphotransferase.
Das prokaryonte Replikon oder das Hefereplikon und die Markergene liegen bevorzugt auf
einem zusammenhängenden Genabschnitt. Sie können aber auch nicht zusammenhängend,
also einzeln, in die HHV8-DNA eingeführt werden Entscheidend ist, daß zumindest ein
essentielles Gen von HHV8 durch die Integration inaktiviert wird.
Die Integration der Fremd-DNA in die HHV8-DNA erfolgt vorzugsweise durch homologe
Rekombination über flankierende DNA-Abschnitte, die die einzubringende Fremd-DNA
flankieren. Die flankierenden Sequenzen sind homolog mit den Integrationsorten der HHV8-
DNA. Die Länge der flankierenden homologen Sequenzen beträgt mindestens 300 bp,
bevorzugt ein kbp oder größer, beispielsweise 1,5, 2, 2,5 und 3 kbp.
Die Rekombination erfolgt in Eukaryontenzellen, die mit HHV8 infiziert sind. Beispiele für
derartige Zellinien sind die Zellinien BC-1, BC-2, BC-3, BCBL1 und BCP1 (wobei
menschliche Keimzellen und menschliche, embryonale
Stammzellen ausgeschlossen sind).
Diese Eukaryontenzellen sind dadurch gekennzeichnet, daß sie HHV8-Molküle enthalten,
deren essentielle Gene nicht inaktiviert wurden, insbesondere HHV8-Virusmoleküle vom
Wildtyp. In diesen Eukaryontenzellen liegt das HHV8-Genom beispielsweise in latenter Form
vor, d. h. es findet keine Virusproduktion statt. Es sind jedoch auch Zellen verwendbar, die mit
HHV8 persistent infiziert sind und Zellen, bei denen ein Gleichgewicht zwischen dem Virus
und dem Wirt vorliegt.
Die erfolgreiche und ortsgenaue Rekomination kann durch an sich bekannte Techniken,
beispielsweise Hybridisierungstechniken, bevorzugt Southern-Blot-Hybridisierung, und durch
PCR-Techniken nachgewiesen werden.
Die so erhaltenen rekombinanten HHV8-Genome sollten in prokaryonte Organismen,
beispielsweise in E. coli, oder Hefezellen, übertragbar sein. Es erwies sich jedoch in vielen
nachfolgenden Versuchen als unmöglich, diese rekombinanten HHV8-Genome direkt in E.
coli zu übertragen. Es mußte deshalb eine neue besondere Strategie entwickelt werden, um ein
Überführen der rekombinanten HHV8-Moleküle in eine prokaryonte Zelle oder Hefezelle zu
ermöglichen. Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß es zielführend war, in den latent mit
HHV8 infizierten Zellen, die sowohl die rekombinanten HHV8-Genommoleküle als auch
HHV8-Wildtyp-Genommoleküle enthalten, den lytischen Zyklus zu induzieren. Eine
Möglichkeit ist die Induktion über chemische Agenzien, beispielsweise Phorbolester. Die
Inkubation dieser Zellen mit diesen Verbindungen führt zur Induktion der Virusproduktion.
Da die Zellen sowohl rekombinante HHV8-Genome als auch Wildtyp-HHV8-Genome tragen,
entsteht eine Mischpopulation, und die Viren dieser Mischpopulation werden in den
Zellkulturüberstand abgegeben.
In einem nächsten Schritt werden die rekombinanten Viruspartikel von den Wildtyp-
Viruspartikel unterschieden. Hierzu werden transformierte Zellen, beispielsweise 293 Zellen,
mit dem Virusüberstand (enthaltend eine Virusmischpopulation) infiziert. Infizierte Zellen
werden von nicht-infizierten Zellen durch Selektion, beispielsweise mit einem Antibiotikum,
selektiert, wenn die rekombinanten Virusgenome ein Antibiotikumresistenzgen tragen. Ein
Beispiel für ein Antibiotikumresistenzgen ist das Hygromycinresistenzgen. Die verwendeten
transformierten Zellen stellen eine Art biologisches Filter dar, durch welche rekombinante
und nicht-rekombinante Wildtyp-HHV8-Viren diskriminierbar sind. Für den Erfolg dieses
Schrittes war es wiederum entscheidend, daß das rekombinante HHV8-Virusgenom einen
stabilen, latenten Zustand in den infizierten Zellen, beispielsweise 293 Zellen, einnimmt.
Hierzu wiederum, und hier schließt sich der Kreis, ist die Inaktivierung eines essentiellen
viralen Gens, wie es im vorliegenden HHV8-DNA-Genom erzeugt wurde, essentiell.
Aus den so erhaltenen Zellen wird Virus-DNA präpariert, die in die prokaryonte Zelle,
bevorzugt E. coli oder eine Hefezelle, übertragen wird. Bei E. coli handelt es sich lediglich um
eine bevorzugt verwendbare Prokaryontenzelle. Es sind jedoch auch andere Wirte wie
Enterobacteriaceae, Pseudomonaden, Bacillen und auch Hefen einsetzbar. In diesen Zellen ist
das rekombinante HHV8-Genom durch an sich bekannte Manipulationsverfahren
veränderbar.
Durch die hier beschriebene Vorgehensweise gelang erstmals die erfolgreiche Klonierung des
gesamten HHV8-Genoms in E. coli auf der Grundlage eines rekombinanten, auf einem F-
Faktor basierenden Plasmids. Die so erhaltene rekombinante HHV8-DNA kann in
Prokaryonten, bevorzugt E. coli, durch an sich bekannte Verfahren manipuliert werden. Das
klonierte virale Genom kann in transformierte Zellen, bevorzugt 293 Zellen, eingebracht
werden, und in diesen Zellen können dann infektiöse Teilchen ohne Zugabe weiterer
chemischer Agenzien wie TPA oder Butyrat produziert werden.
Die Transfektion der rekombinanten HHV8-DNA kann auf beliebige Zellen ausgedehnt
werden, die von HHV8 schwierig oder sogar gar nicht infizierbar sind. Da das
erfindungsgemäß bereitgestellte rekombinante HHV8-Genom nunmehr Markergene trägt, die
in Prokaryonten und/oder Eukaryonten identifizierbar sind, beispielsweise Gene, die für
fluoreszierende Proteine wie GFP kodieren, kann der Infektionsweg von HHV8 direkt
verfolgt werden, und die Targetzellen von HHV8 sind nunmehr wesentlich einfacher als
durch die aus dem Stand der Technik bekannten Methoden identifizierbar.
Für den Fachmann sind selbstverständlich weitere Abänderungen des vorstehend
beschriebenen Verfahrens möglich, ohne von der Erfindung abzuweichen. Die in
beispielsweise E. coli veränderten rekombinanten HHV8-Moleküle könne wiederum in HHV8
infizierbare Zellen, beispielsweise 293 Zellen, eingebracht werden. Anstatt der 293 Zellen
können allgemein Endothelzellen, B-Zellen und Spindelzellen eingesetzt werden.
Die Produktion von Viruspartikeln wird dadurch ermöglicht, daß das inaktivierte essentielle
HHV8-Gen durch an sich bekannte Verfahren komplementiert wird (rescueing). Alternativ
kann die rekombinante HHV8-DNA auch in Säuger-Zellen eingeführt werden, die Wildtyp
HHV8-DNA enthält. Nach Induktion der Virusproduktion z. B. durch Expression von frühen
viralen Trankriptionsfaktorgenen durch heterologe Promotoren, die z. B. zusammen mit der
rekombinanten HHV8-DNA in die Zelle eingeführt und z. B. konstitutiv exprimiert werden,
können aus den so erhaltenen Viruspartikeln die DNA-Plasmide präpariert und wiederum in
beispielsweise E-coli-Zellen transferiert werden. Alternativ kann auch direkt aus den mit
Wildtyp HHV8 und rekombinanten HHV8-Molkülen infizierten Zellen die Plasmid-DNA
isoliert und beispielsweise in E. coli transferiert werden. Die rekombinanten Moleküle werden
dadurch in E. coli von den Wildtyp-Molekülen unterschieden, daß beispielsweise auf ein
Antibiotikumresistenzgen, das ausschließlich in den rekombinanten Molekülen vorliegt,
selektioniert wird.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels und der beiliegenden
Figuren beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht hierauf beschränkt. Zur Ausführung der
Erfindung werden übliche Techniken aus der rekombinanten Gentechnologie eingesetzt.
Verwiesen sei hier z. B. auf (9) und (10)
Die Figuren zeigen:
Fig. 1: Schematische Darstellung des zur homologen Rekombination eingesetzten
Konstrukts. Ein Plasmid-Rückgrat, bestehend aus einem F-Plasmid-Replikon,
dem Gen für die Hygromycinresistenz und dem GFP-Gen, wird von HHV8-
Sequenzen flankiert, die links und rechts von der SpeI-Site des ORF56-Gens
lokalisiert sind. Durch eine erfolgreiche homologe Rekombination wird das F-
Plasmid, das Hygromycinresistenzgen und das GFP-Gen in den ORF56-
Genlokus unter Ausschaltung dieses Gens insertiert. Da zur Schaffung der
flankierenden Sequenzen Cosmide des HHV8-Virusstamms BC1 eingesetzt
wurden und da dieser Stamm bekannterweise einige Sequenzunterschiede vom
BC3-Virus zeigt, wurde der gesamte 8 kbp große Abschnitt um die im ORF56-
Gen enthaltene SpeI-Stelle sequenziert. Die Sequenzierung zeigte nur vier
Mutationen.
Fig. 2: Gardella-Genanalyse der hygromycinresistenten 293 Zellklone. 293 Zellen
wurden mit Überständen aus induzierten BC3-Zellklonen, die das
rekombinante HHV8/F-Plasmid enthielten, infiziert. Nach
Hygromycinselektion wurden sieben Klone auf das Vorliegen der das F-
Plasmid tragenden zirklären Moleküle hin analysiert. Nach Hybridisierung mit
einer für das F-Plasmid spezifischen Sonde konnte gezeigt werden, daß alle
Zellinien das rekombinante Virusgenom trugen.
Fig. 3: Restriktionsanalyse der rekombinanten HHV8-DNA.
Aus einem hygromycinresistenten 293 HHV8/FIII-Zellklon, von dem man
annahm, daß er das HHV8/F-Plasmid in rekombinanter Form enthielt, wurden
zirkuläre Moleküle extrahiert. Nach Elektroporation in den E. coli-Stamm
DH10B und Chloramphenicolselektion, wurde Plasmid-DNA extrahiert und
mit NheI und BamHI Restriktionsenzymen verdaut.
Fig. 4: Infektion von 293 Zellen mit dem rekombinanten HHV8/F-Plasmidvirus.
Die 293 HHV8/FIII-Zellinie wurde mit auf einem Expressionsplasmid
klonierten ORF56 transfiziert. Nach drei Tagen wurden die Überstände dieser
transfizierten Zellinie mit HHV8-negativen 293 Zellen inkubiert. Nach zwei
Tagen konnte man GFP-positive, HHV8-infizierte 293 Zellen beobachten.
Eine Voraussetzung zur Manipulation des HHV8-Genoms in E. coli-Zellen ist das Einführen
eines prokaryotischen Replikons in das Virusgenom. Da Herpesviren ein großes Genom
besitzen, wählten wir das Replikon des F-Plasmids, das bekanntlich große DNA-Insertionen
akzeptieren und stabil in E. coli replizieren kann. Die Gene, für die Hygromycin-Resistenz
und das Grün-Fluoreszenzprotein codieren, wurden eingefügt, wobei Plasmid p19194
erhalten wurde. Zur Förderung seiner homologen Rekombination mit dem Virusgenom
wurden flankierende HHV8-Regionen hinzugefügt. Wir entschlossen uns, das 1919-F-
Plasmidderivat in den offenen Leserahmen 56 (ORF56) von HHV8 zu inserieren. Dieses Gen
ist das Homologon des EBV-Virus-Gens BSLF1, das für die lytische Virus-DNA-Replikation
unentbehrlich ist. Folglich ist die endgültige Virusmutante replikationsinkompetent, aber ihr
Defekt lässt sich leicht komplementieren. Dazu konstruierten wir das endgültige Plasmid
p2421 mit dem Grundgerüst von p1919, flankiert von HHV8-Sequenzen mit etwa 3 und 4 kbp
Länge, um den ORF56-Locus anzusteuern (Fig. 1). Das linearisierte Plasmid-DNA-Fragment
wurde dann in die BC3-Zelllinie eingebracht, die mehrere extrachromosomale Kopien des
HHV8-Genoms enthält. Die Zellen wurden nach der Plattierung in 96-Loch-Clusterplatten
einer Hygromycinselektion (300 µg/ml) unterworfen. Vier Wochen nach der Selektion
wurden mehr als 40 hygromycinresistente Zellklone, die positiv für das
Grünfluoreszenzprotein waren, etabliert und mittels Southern-Blot-Analyse charakterisiert. Es
wurde gefunden, dass ein Zellklon das korrekt in das HHV8-Genom inserierte F-Plasmid trug
(Daten nicht gezeigt). Von diesem Klon wurde Zellkulturüberstand nach Inkubation mit TPA
und Butyrat erzeugt. Dieser Überstand enthielt infektiöse Virionen, wie durch die Expression
des Grünfluoreszenzproteins nach der Infektion von 293-Zellen angezeigt wurde. Nach der
Selektion mit Hygromycin (100 µg/ml) wurden sieben 293-Zellklone erhalten, die das
Virusgenom enthielten, wie durch eine Gardella-Gel-Analyse gezeigt wurde (Fig. 2). Keiner
dieser 293-HHV8/F-Klone produzierte spontan Virionen, wie durch die Insertionsmutagenese
des offenen Leserahmens 56 während der Rekombination erwartet worden war. Die Southern-
Blot-Analyse der 293-HHV8/F-Zellklone zeigte, dass sie nur rekombinante Plasmide
enthielten, was eine Coinfektion mit Wildtyp-HHV8 ausschloss (Daten nicht gezeigt).
Die mit Überstand der BC3-Zelllinie infizierten 293-HHV8/F-Zellklone enthielten
extrachromosomale Kopien des rekombinanten HHV8-Genoms, wie in Fig. 2 gezeigt ist. Die
Rettung dieser zirkulären Moleküle ergab chloramphenicolresistente E. coli-Zellklone, die
offensichtlich das HHV8/F-Plasmid-Hybrid enthielten (Fig. 3). Der Vergleich des erzeugten
Restriktionsmusters mit dem aus der Analyse veröffentlichter genomischer HHV8-Sequenzen
abgeleiteten ergab, dass das gerettete Genom das vollständige HHV8-Genom war. Kleinere
Variationen bei bestimmten Restriktionsenzymen waren nachweisbar, aber die Subklonierung
des HHV8/F-Plasmids und die partielle Sequenzierung bestimmter Subklone bestätigten die
erfolgreiche Klonierung des BC3-Genoms in E. coli.
Als nächstes wollten wir die Fähigkeit der 293-Zelllinie, die das rekombinante HHV8/F-
Plasmid-Genom enthielt, zur Unterstützung der lytischen Phase des HHV8-Lebenszyklus
untersuchen. Die transiente Transfektion eines Expressionsplasmids, das das ORF56-Gen
trug, in 293-HHV8/F-Zellen führte zur Produktion infektiöser Partikel, wie durch Infektion
der parentalen 293-Zellen angezeigt wird (Fig. 4). Die Anzahl der für das
Grünfluoreszenzprotein positiven Zellen war ähnlich wie die mit Überständen, die 105
infektiöse EBV-Partikel pro ml enthalten, erhaltene11. Es ist schwierig, den Virustiter in
diesen Überständen zu bestimmen, da unklar ist, ob alle 293-Zellen mit HHV8 infiziert
werden können16. Es lässt sich folgern, dass sich das rekombinante Virus hinsichtlich der
Infektiösität als vollständig funktionell erwies. Auch stabil mit der aus E. coli gereinigten
HHV8/F-Plasmid-DNA transfizierte 293-Zellen produzierten nach der Transfektion mit dem
ORF56-Expressionsplasmid infektiöse Virionen, was zeigt, dass die Passage der Virus-DNA
ihre Eigenschaften nicht änderte.
Zellen. 293 ist eine menschliche embryonale Nierenepithel-Zelllinie, die mit den Proteinen
E1a und E1b des Adenovirusstamms 5 transformiert ist2. Diese Zelllinie wurde in RPMI 1640
mit 10% fötalem Kälberserum (Life Technologies, Eggenstein, Deutschland) gezüchtet. Die
BC3-Zelllinie ist eine Körperhöhlenlymphom-Zelllinie, von der gezeigt wurde, dass sie das
HHV8-Virus enthält3. Diese Zelllinie wurde in RPMI mit 20% fötalem Kälberserum
vermehrt.
p1919 ist ein prokaryotisches Replikon auf F-Faktor-Basis, das den Replikationsursprung des
F-Faktors, das Chloramphenicolresistenzgen, die Verteilungsgene A und B, die
Hygromycinresistenz-Kassette und das zuvor beschriebene Gen4, das das
Grünfluoreszenzprotein codiert, enthält. Um flankierende Bereiche für die homologe
Rekombination mit dem HHV8-Genom bereitzustellen, wurde ein DNA-Fragment
(Nukleotidkoordinaten # 77407 bis # 87155) aus dem HHV8-Genom BC15, das aus dem
HHV8-Cosmid GA21 stammte, in das mit NheI gespaltene Plasmid pACYC177 eingebracht,
so dass p2388 erhalten wurde. Dieser Subklon umfasst den ORF56 aus HHV8, das
Homologon des EBV-BSLF1-Gens. Das gesamte Plasmid p1919 wurde in die einzelne SpeI-
Stelle von p2388 eingebracht, so dass das endgültige Plasmid p2421 erhalten wurde (Fig. 1).
Transfektionen von Zelllinien mit Plasmid-DNA wurden unter
Verwendung von Lipidmizellen oder Elektroporation durchgeführt. 293-Zellen wurden 2
Stunden mit Optimem-Minimalmedium (Life Technologies, Eggenstein, Deutschland)
inkubiert, und die in Lipidmizellen eingebettete DNA wurde 4 Stunden lang zugegeben
(Lipofectamin, Life Technologies, Eggenstein, Deutschland). BC3-Zellen (107 Zellen)
wurden in RPMI1640 ohne fötales Kälberserum gewaschen, in 250 µl des gleichen Mediums
resuspendiert und mit der Plasmid-DNA in Elektroporationsküvetten mit 0,4 cm-Spalt
überführt. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Elektroporators (BioRad, München,
Deutschland) bei 230 V und 960 µF transfiziert.
Einen Tag nach der Infektion oder Transfektion wurde Hygromycin
(Calbiochem, Deutschland) zum Kulturmedium der BC3- oder 293-Zellen (300 bzw. 100 µg/ml)
gegeben. Die Zellen wurden wöchentlich mit frischem RPMI1640 mit der gleichen
Hygromycinkonzentration versorgt.
Zirkuläre DNA-Moleküle wurden aus F-Faktor-positiven 293-
und BC3-Klonen unter Verwendung eines Denaturierungs-/Renaturierungsverfahrens, wie
beschrieben6, isoliert. E. coli vom Stamm DH10B wurden mittels Elektroporation (1800 V, 25 µF,
100 Ohm) mit der isolierten DNA transformiert. Die Zellen wurden auf Agarplatten
plattiert, die 15 µg/ml Chloramphenicol enthielten.
293-Zellen (2 × 105) wurden mit filtrierten (0,45 mm Porengröße) Überständen
von BC3/F-Plasmid-Zellen, in denen der lytische Zyklus mittels TPA und Butyrat induziert
worden war, oder von 293-HHV8/F-Plasmid-Zellen, die mit einem das ORF56-Gen
enthaltenden Expressionsplasmid transfiziert worden waren, infiziert. In einigen Fällen
wurden 293-Zellen dann in 6-Loch-Clusterplatten auf Hygromycinresistenz selektiert (2 ×
107) und einmal wöchentlich mit RPMI1640, das 10% fötales Kälberserum enthielt, versorgt.
Das Verfahren zur Gardella-
Gelelektrophorese, gefolgt von Southern-Blot-Hybridisierung, ist zuvor beschrieben
worden7,8.
1. Schulz, T. F. & Moore, P. S. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus: a new human tumor
virus, but how? Trends Microbiol 7, 196-200 (1999).
2. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C. & Nairn, R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen. Virol. 36, 59-74 (1977).
3. Arvanitakis, L., et al. Establishment and characterization of a primary effusion (body cavity-based) lymphoma cell line (BC-3) harboring kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV/HHV-8) in the absence of Epstein-Barr virus. Blood 88, 2648-54 (1996).
4. Delecluse, H. J., Hilsendegen, T., Pich, D., Zeidler, R. & Hammerschmidt, W. Propagation and recovery of intact, infectious Epstein-Barr virus from prokaryotic to human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8245-50 (1998).
5. Russo, J. J., et al. Nucleotide sequence of the Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (HHV8). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14862-7 (1996).
6. Griffin, B. E., Björk, E., Bjursell, G. & Lindahl, T. Sequence complexity of circular Epstein-Barr virus DNA in transformed cells. J. Virol. 40, 11-19 (1981).
7. Delecluse, H.-J., Schüller, s. & Hammerschmidt, W. Latent Marek's disease virus can be activated from its chromosomally integrated state in herpesvirus-transformed lymphoma cells. EMBO J. 12, 3277-3286 (1993).
8. Gardella, T., Medveczky, P., Sairenji, T. & Mulder, C. Detection of circular and linear herpesvirus DNA molecules in mammalian cells by gel electrophoresis. J. Virol. 50, 248- 254 (1984).
9. Ibelgaufts, H., Gentechnologie von A-Z, VCH, Weinheim 1990 und nachfolgende Auflagen.
10. Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982, CSHL Press und nachfolgende Auflagen.
2. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C. & Nairn, R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen. Virol. 36, 59-74 (1977).
3. Arvanitakis, L., et al. Establishment and characterization of a primary effusion (body cavity-based) lymphoma cell line (BC-3) harboring kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV/HHV-8) in the absence of Epstein-Barr virus. Blood 88, 2648-54 (1996).
4. Delecluse, H. J., Hilsendegen, T., Pich, D., Zeidler, R. & Hammerschmidt, W. Propagation and recovery of intact, infectious Epstein-Barr virus from prokaryotic to human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 8245-50 (1998).
5. Russo, J. J., et al. Nucleotide sequence of the Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (HHV8). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14862-7 (1996).
6. Griffin, B. E., Björk, E., Bjursell, G. & Lindahl, T. Sequence complexity of circular Epstein-Barr virus DNA in transformed cells. J. Virol. 40, 11-19 (1981).
7. Delecluse, H.-J., Schüller, s. & Hammerschmidt, W. Latent Marek's disease virus can be activated from its chromosomally integrated state in herpesvirus-transformed lymphoma cells. EMBO J. 12, 3277-3286 (1993).
8. Gardella, T., Medveczky, P., Sairenji, T. & Mulder, C. Detection of circular and linear herpesvirus DNA molecules in mammalian cells by gel electrophoresis. J. Virol. 50, 248- 254 (1984).
9. Ibelgaufts, H., Gentechnologie von A-Z, VCH, Weinheim 1990 und nachfolgende Auflagen.
10. Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1982, CSHL Press und nachfolgende Auflagen.
Claims (26)
1. Rekombinante HHV8 DNA,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie zumindest die Information für die Replikation der HHV8 DNA in
Prokaryonten oder Hefen und zumindest ein in Prokaryonten oder Hefen selektierbares
Markergen enthält, und zumindest ein für HHV8 essentielles Gen inaktiviert ist.
2. HHV8 DNA nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie weiterhin ein in tierischen oder menschlichen Eukaryontenzellen selektierbares
Markergen enthält.
3. HHV8 DNA nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Markergen ein Antibiotikumresistenzgen oder ein für ein fluoreszierendes
Protein kodierendes Gen oder das lacZ Gen ist.
4. HHV8 DNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß das essentielle Gen durch Integration, Deletion, Addition oder Austausch eines
oder mehrerer Nukleotide inaktiviert ist.
5. HHV8 DNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß das essentielle Gen ein für die Regulation der Genexpresssion oder ein für virale
Transkriptionsfaktoren kodierendes Gen ist.
6. HHV8 DNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Inaktivierung im essentiellen Gen in einem für ein HHV8 DNA
Replikationsprotein kodierenden Gen ist.
7. HHV8 DNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß zumindest die Information für die Replikation in Prokaryonten aus dem E. coli-
Plasmid F Faktor stammt.
8. HHV8 DNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie zumindest eine Größe von 100, 150, 170, 200 oder bis zu 230 kbp oder darüber
aufweist.
9. Prokaryontenzelle oder Hefezelle, enthaltend HHV8 DNA nach einem oder mehreren
der vorhergehenden Ansprüche.
10. Prokaryontenzelle nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie eine E. coli Zelle ist.
11. Tierische oder menschliche Eukaryontenzelle, enthaltend eine rekombinante HHV8
DNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.
12. Eukaryontenzelle nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennezeichnet,
daß sie weiterhin HHV8 DNA enthält, deren essentielle Gene nicht inaktiviert sind.
13. Eukaryontenzelle nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennezeichnet,
daß die HHV8 DNA mit nicht inaktivierten essentiellen Genen in latenter Form
vorliegt.
14. HHV8 Viruspartikel, enthaltend HHV8 DNA nach einem oder mehreren der
vorhergehenden Ansprüche.
15. Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten HHV8 DNA durch Einführen von
DNA in das Genom von HHV8, die eine Replikation der HHV8 DNA in Prokaryonten
oder Hefen sicherstellt, und von zumindest einem in Prokaryonten oder Hefezellen
selektierbaren Markergen und durch Inaktivierung zumindest eines für HHV8
essentiellen Gens.
16. Verfahren nach Anspruch 15,
dadurch gekennzeichnet,
daß die eingeführte DNA von Abschnitten des HHV8 Genoms flankiert ist, die eine
homologe Rekombination mit der HHV8 DNA ermöglichen.
17. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die flankierenden homologen HHV8 Sequenzen eine Größe von ≧ 300 bp,
bevorzugt ≧ 1 kbp oder darüber aufweisen.
18. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die eingeführten DNA-Sequenzen aus dem F-Plasmid von E. coli stammen.
19. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die homologen flankierenden Sequenzen aus einem für HHV8 essentiellen Gen
stammen.
20. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die homologen flankierenden Sequenzen aus einem für die lytische virale DNA
Replikation von HHV8 verantwortlichen Gen stammen.
21. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die rekombinante HHV8 DNA, die zumindest ein inaktiviertes essentielles Gen
von HHV8, ein in Prokaryontenzellen oder Hefezellen selektierbares Markergen und
die Information für die Replikation der HHV8 DNA in Prokaryonten oder Hefezellen
trägt, in eine tierische oder menschliche Eukaryontenzelle eingeführt wird, die HHV8-
DNA ohne die Inaktivierung des essentiellen Gens enthält.
22. Verfahren nach Anspruch 21,
dadurch gekennzeichnet,
daß die rekombinante HHV8 DNA linearisiert vorliegt.
23. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß in den Eukaryontenzellen, die die rekombinante HHV8 DNA und HHV8-DNA
ohne die Inaktivierung des essentiellen Gens enthalten, der lytische Zyklus von HHV8
induziert wird, um die Produktion von rekombinantem HHV8 Virusgenom zu
induzieren.
24. Verfahren nach Anspruch 23,
dadurch gekennzeichnet,
daß auf solche Eukaryontenzellen selektiert wird, die rekombinante HHV8 DNA
enthalten.
25. RNA, die sich von der HHV8-DNA nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-8
ableitet.
26. Verwendung einer rekombinanten DNA oder RNA nach einem oder mehreren der
vorhergehenden Ansprüche zur weiteren Mutagenese von HHV8 Genen und
funktionellen Untersuchungen von HHV8.
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