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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Genmanipulation, genauer gesagt
beschreibt sie ein Verfahren zur Ligation von DNA und einen Gen-Klonierungskit.
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Verfahren
zur Spaltung eines Gens an einer gewünschten Stelle und solche zur
selektiven Ligation eines jeden Gens (oder DNA) sind in der Genmanipulation
unentbehrlich. Ein typisches Beispiel des Ersteren ist die Spaltung
durch das entsprechende Verdauungsenzym und ferner, je nach Bedarf,
die sequenzielle Spaltung der Mononukleotide unter Verwendung von
Exonukleasen, vorausgesetzt, dass es eine Stelle gibt, die ein Verdauungsenzym
nahe der gewünschten
Stelle erkennt.
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Andererseits
sind Beispiele für
das Verfahren zur Ligation einer speziellen Stelle die Ligation
unter Verwendung einer DNA-Ligase eines kohäsiven Endes eines durch ein
Verdauungsenzym gespaltenen DNA-Fragments, falls geeignet, oder
eines stumpfen Endes eines DNA-Fragments, wie es ist, oder eines stumpfen
Endes, an welches ein zweckmäßiger Adapter
hinzugefügt
worden ist.
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Das
Verfahren unter Verwendung eines kohäsiven Endes kann nicht angewendet
werden, wenn keine Stelle für
ein Verdauungsenzym, das dem Zielgen entspricht, vorhanden ist,
und das Verfahren unter Verwendung eines stumpfen Endes erfordert
Manipulationen, wie etwa die Isolierung eines ge wünschten
Ligats aus anderen Ligaten, weil die Richtung der Ligation nicht
genau bestimmt werden kann.
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Das
Verfahren unter Einsatz eines Adapters kann unabhängig vom
Typ der zu legierenden DNA-Nukleotidsequenz angewendet werden, jedoch
sind die Manipulationen kompliziert, erfordern mehrstufige Manipulationen,
wie etwa eine Adapterligation, eine Entfernung von nicht abreagierten
Adaptern, eine Phosphorylierung und so fort, und erfordert ebenso
einige Erfahrung in diesen Manipulationen. Insbesondere ist es vermehrt
kompliziert, falls gerade das gewünschte Gen aus PCR-Produkten
kloniert wird, weil die Behandlung von Nebenprodukten, welche das
objektive PCR-Produkt kontaminieren, aufgrund der Eigenschaften
der PCR notwendig werden. Das stumpfe Ende selbst, das durch PCR
erhältlich
ist, kann in der Tat für
die Ligation zugänglich
gemacht werden, aber in diesem Falle können zusätzlich zu dem Erfordernis der
Behandlungen für
die vorstehend erwähnten
Nebenprodukte auch andere Probleme auftreten, z.B. dass die Richtung
der Ligation statistisch wird.
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Ohne
die Verwendung von Verdauungsenzymen und DNA-Ligase schlagen C.
Aslanidis et al. (in Nucleic Acids Research, Band 18 (1990), 6069–6073) ein
Verfahren vor, das die Ausbildung eines bimolekularen Assoziierungsprodukts
(zirkulär)
durch ein spezielles Verfahren über
einzelsträngige
(ss) Enden eines PCR-Produkts, das unter Verwendung eines eine einzigartige
wiederholte Sequenz umfassenden Primers, amplifiziert worden ist,
und eines auf die gleiche Art und Weise amplifizierten Plasmidvektors;
das Einführen des
assoziierten Produkts in ein Bakterium; und das selektive Erhalten
einer zirkulären
bzw. ringförmigen
Rekombinanten umfasst. Da jedoch dieses Verfahren den Einsatz eines
Vektors, der eine einzigartige wiederholte Sequenz umfasst, und
eines PCR-Primers mit einer korrespondierenden Sequenz und ebenso
das Einzelsträngigmachen
der Enden der PCR-Produkte
durch Enzyme, gefolgt von einer PCR mittels eines speziellen Verfahrens,
erfordert, kann es nicht als ein vielseitiges Verfahren angesehen
werden.
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Fujiware
et al. beschreiben in "Direct
probing: covalent attachment of probe DNA to double-stranded target
DNA", Nucleic Acid
Research, 26, Seite 5728, ein Verfahren zur Ligation einer doppelsträngigen DNA und
einer weiteren doppelsträngigen
DNA mit einem einzelsträngigen
DNA-Ende unter Verwendung eines homologen Proteins. Die Ligation
wird stabilisiert und so durch Ausbildung einer kovalenten Bindung
zwischen den DNA-Enden, die mit dem homologen Protein unter Verwendung
von DNA-Ligase reagieren, vervollständigt.
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Ferner
beschreiben Fujiwara et al. in "Direct
cloning by covalent attachment of probed DNA to target DNA", Nucleic Acid Research,
26, Seite 5734, ein Verfahren zur Klonierung, basierend auf dem
gleichen wie vorstehend beschrieben Verfahren.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein DNA-Ligationsverfahren
bereitzustellen, das nicht die Gegenwart einer Verdauungsenzymstelle
erfordert, leicht zu manipulieren ist und ebenso vielseitig ist.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung hatten ein spezielles Interesse
an der homologen Rekombination von DNA in vivo. Als Ergebnis ihrer
Forschung wurde gezeigt, dass ein durch das Rec A-Protein ex vivo gebildete
DNA-Komplex in mehreren Aspekten verwendet werden kann. Die vorliegende
Erfindung wurde basierend auf diesen Erkenntnissen vervollständigt, welche
ein Teil der Erfindung sind, nämlich
dass ein einzelsträngiges
Abschnittsende (ss) und ein doppelsträngiges Abschnittsende (ds)
mit Homologie zu dem ss- Abschnittsende
oder einer komplementären
End- bzw. Abschlusssequenz, einen dreisträngigen Abschnitt durch die
Wirkung des Rec A-Proteins ausbilden, wobei sich ein stabiles Ligat
mit einem weiten Anwendungsbereich ergibt.
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Deshalb
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Ligieren des
ds-Abschnittsendes und des ss-Abschnittsendes einer doppelsträngigen DNA
gemäß Anspruch
1.
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Da
das vorstehend erwähnte
Ligationsverfahren und ebenso Mittel, welche die Ausbildung eines
ringförmigen
DNA-Bestandteils
einschließen,
zur Klonierung der gewünschten
Gene und insbesondere PCR-Produkte zweckmäßig sind, kennzeichnet die
Erfindung ebenso einen Kit, der für solche Klonierungen eingesetzt werden
kann.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
ein Reaktionsdiagramm des DNA-Klonierungsverfahrens mittels der
Rec A-Reaktion zur Ausbildung eines Dreifachstrangs.
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2 zeigt
ein Diagramm der 5'RACE-Reaktion
durch die Rec A-Reaktion zur Ausbildung eines dreifachen Strangs.
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3 zeigt
eine Fotografie des Gelelektrophoresemusters, das im Beispiel 1
erhalten wurde, in welchem die DNA-Klonierung durch die Rec A-Reaktion
zur Dreifachstrangausbildung durchgeführt wurde.
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4 zeigt
eine Fotografie des Gelelektrophoresemusters, das im Beispiel 2
erhalten wurde, in welchem die durch die Rec A-Reaktion zur Dreifachstrangausbildung
ligierte DNA bestätigt
wurde.
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5 zeigt
eine Fotografie des Gelelektrophoresemusters, das im Beispiel 3
erhalten wurde, in welchem die Enzymabhängigkeit der Ligationsreaktion
der durch die Rec A-Reaktion zur Dreifachstrangausbildung untersucht
wurde.
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6 zeigt
eine Fotografie des Gelelektrophoresemusters, das im Beispiel 4
erhalten wurde, in welchem die Wärmestabilität der ligierten
DNA, die durch die Rec A-Reaktion zur Dreifachstrangausbildung ligiert worden
war, untersucht wurde.
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7 zeigt
eine Fotografie des Gelelektrophoresemusters, das im Beispiel 5
erhalten wurde, in welchem die Abhängigkeit eines jeden Reaktanten
in der DNA-Endreaktion
zur Dreifachstrangausbildung unter Verwendung von Oligonukleotiden
untersucht wurde.
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8 zeigt
eine Fotografie des Gelelektrophoresemusters, das im Beispiel 6
erhalten wurde, in welchem die Sequenzorientierung der Oligonukleotide
in der DNA-Endreaktion
zur Dreifachstrangausbildung unter Verwendung von Oligonukleotiden
untersucht wurde.
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9 zeigt
eine Fotografie des Gelelektrophoresemusters, das im Beispiel 7
erhalten wurde, in welchem die Wärmestabilität der Oligonukleotidsequenz
in der DNA-Endreaktion zur Dreifachstrangausbildung untersucht wurde.
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10 zeigt
eine Fotografie des Gelelektrophoresemusters, das im Beispiel 8
erhalten wurde, in welchem eine cDNA-Klonierung durch die Rec A-Reaktion
zur Dreifachstrangausbildung durchgeführt wurde.
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11 zeigt
eine Fotografie des Gelelektrophoresemusters, das im Beispiel 9
erhalten wurde, in welchem der Effekt der Modifikationsreaktion
des ligierten cDNA-Komplexes unter Verwendung von Modifikationsenzymen
mittels der Rec A-Reaktion zur Dreifachstrangausbildung untersucht
wurde.
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12 zeigt
eine Fotografie des Gelelektrophoresemusters, das im Beispiel 10
erhalten wurde, in welchem die ligierte cDNA durch die Rec A-Reaktion
zur Dreifachstrangausbildung bestätigt wurde.
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13 zeigt
ein Reaktionsdiagramm aus Beispiel 12, in welchem die Ligation von
zwei cDNAs mittels der Rec A-Reaktion zur Dreifachstrangausbildung
durchgeführt
wurde.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Der
Ausdruck "Homologie", wie er hierin verwendet
wird, betrifft eine Sequenzhomologie zwischen zwei Typen von einzelsträngigen DNAs
im weiten Sinne. Erfindungsgemäß steht
er für
eine Identität
einer Sequenz, die zur Ausbildung der später erwähnten dreisträngigen Struktur
hinreichend ist. Deshalb ist eine perfekte Übereinstimmung zwischen den
Nukleotidsequenzen der zwei Typen von einzelsträngigen DNAs nicht gefragt und
bevorzugt ist eine Identität
von 95% oder höher
genügend.
Ebenso wird eine Homologie, wie sie erfindungsgemäß definiert
ist, akzeptiert, für
den Fall, dass geringe Unterschiede in den Längen der zwei Typen der einzelsträngigen DNA-Sequenzen
vorliegen. Ebenso versteht man unter "komplementär", dass Basenpaare gegenseitig zwischen
den zwei Typen der einzelsträngigen
DNAs ausgebildet werden oder wenn sie in einer Beziehung stehen,
in der eine Hybri disierung bei strengen Bedingungen auftreten kann.
Deshalb sollten sie in einer Beziehung stehen, in der wenigstens
95% oder mehr beider DNA-Sequenzen die ursprünglichen Basenpaare ausbilden
können
und sie werden als komplementär
angesehen, selbst wenn sie kleinere Unterschiede in der Länge der
zwei Typen von einzelsträngigen
DNA-Sequenzen aufweisen.
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Die
vorliegende Erfindung kennzeichnet ein Verfahren zur Ligierung des
ss-Abschnittsendes einer doppelsträngigen DNA, umfassend ein einzelsträngiges Abschnittsende
(ss-Abschnitt), und des ds-Abschnittsendes einer doppelsträngigen DNA,
umfassend ein doppelsträngiges
Abschnittsende (ds-Abschnitt) mit einer Sequenz, die zu der Nukleotidsequenz
des vorstehend erwähnten
ss-Abschnitts homolog ist (deshalb ist der andere Strang komplementär zu der
Nukleotidsequenz). Diese Ligation kann vermutlich simultan oder sequenziell
an einem Punkt oder an mehreren Positionen in einem linearen DNA-Molekül auftreten,
obwohl die Ligation an zwei Punkten bevorzugt ist. Eine ringförmige oder
eine lineare DNA-Ligation
wird ausgebildet, falls die Ligation an einem Punkt oder mehreren
Punkten in jedem Ende einer oder mehrerer DNAs auftritt. Obwohl es
nicht darauf beschränkt
ist, ist die Ausbildung eines ringförmigen DNA-Ligats besonders
bevorzugt. DNA-Ligate, ebenso als DNA-Komponenten oder DNA-Rekombinanten in
dieser Anmeldung bezeichnet, stehen für solche, die durch eine einzelne
oder mehrere doppelsträngige
DNAs aufgebaut sind.
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Die "Ligation" gemäß der vorliegenden
Erfindung tritt typischerweise in der Art und Weise auf, wie sie durch
das vereinfachte Diagramm in 1 gezeigt
ist, ist aber nicht darauf beschränkt. Obwohl eine Ligation zwischen
dem doppelsträngigen
Abschnittsende (ds-Abschnitt) der DNA 1 und des einzelsträngigen Abschnitts
(ss-Abschnitt) der DNA 2 gezeigt ist, können gemäß 1 diese
ds-Abschnittsenden und ss-Abschnittsenden auf dem gleichen DNA-Molekül oder auf
zwei oder mehreren DNA-Molekülen
existieren. Falls ein ds-Abschnittsende und ein ss-Abschnittsende
auf dem gleichen Molekül
existieren (nämlich
DNA 1 und DNA 2 sind ein und das gleiche), wird eine ringförmige DNA-Komponente
mit einem dreisträngigen
Strukturbereich ausgebildet.
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Falls
das ss-Abschnittsende und/oder das ds-Abschnittsende auf zwei oder
mehreren DNAs existieren, wie in 1 gezeigt
ist, (i) kann ein ds-Abschnitt und ein ss-Abschnitt jeweils entsprechend
für DNA
1 und DNA 2 existieren, oder (ii) kann ein ds-Abschnittsende sowohl
auf dem 5'-Ende
als auch 3'-Ende
der DNA 1 existieren, und kann ein ss-Abschnittsende sowohl auf dem 5'-Ende als auch dem
3'-Ende der DNA
2 existieren, oder (iii) kann ein ds-Abschnittsende auf dem 5'-Ende oder dem 3'-Ende der DNA 1 existieren
und kann ein ss-Abschnittsende auf dem 3'-Ende oder dem 5'-Ende der DNA 1 existieren, und kann
ein ds-Abschnittsende auf dem 5'-Ende
oder dem 3'-Ende
der DNA 2 existieren und kann ein ss-Abschnittsende auf dem 3'-Ende oder dem 5'-Ende der DNA 2 existieren.
Die vorliegende Erfindung umfasst ebenso eine Ligation, falls die
vorstehende DNA 1 und DNA 2 entgegengesetzt sind, und wenn eine
oder mehrere zusätzliche
DNA mit einem ds-Abschnitt und/oder einem ss-Abschnitt an beiden
Enden oder an einem Ende ligiert sind.
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Bevorzugt
sind Ligationen zwischen zwei Typen von DNA, wie solchen der vorstehend
erwähnten
(ii) bis (iii). In diesem Fall können
die zwei ds-Abschnittsenden, die auf DNA 1 und/oder DNA 2 existieren,
die gleichen oder unterschiedliche Nukleotidsequenzen aufweisen,
und analog können
die zwei ss-Abschnittsenden die gleichen oder unterschiedliche Nukleotidsequenzen
aufweisen, die den entsprechenden vorstehend erwähnten ds-Abschnittsenden entsprechen. "Entspre chend korrespondieren" steht dafür, dass
ein zu ligierendes ds-Abschnittsende und ss-Abschnittsende in einer
solchen Beziehung stehen, welche die Ausbildung einer dreisträngigen Struktur
gemäß der vorliegenden
Erfindung erlaubt. Es bedeutet nämlich,
dass die Nukleotidsequenzen der Sense-Kette (z.B. die Kette, die der einzelsträngigen DNA
entspricht, die zu der doppelsträngigen
DNA aus 1 stromaufwärtig ist, wird zur Vereinfachung
in dieser Art und Weise bezeichnet; ebenso wird die andere stromabwärtige Kette
Antisense-Kette bezeichnet) des zu ligierenden ds-Abschnittsende und die
Sense-Kette des ss-Abschnittsende (in der gleichen Bedeutung wie
vorstehend eingesetzt) homolog sind. Wann sie "homolog" sind, beziehen wir uns auf die vorstehende
Definition.
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Erfindungsgemäß sollten
die vorstehend erwähnten
zwei ss-Abschnittsenden
bevorzugt unterschiedliche Nukleotidsequenzen und insbesondere solche
sein, die nicht zueinander komplementär sind. Wenn ein solcher Aufbau
verwendet wird, kann eine Bindung vermieden werden, die andererseits
zwischen den zwei ss-Abschnittsenden auftreten könnte, und die Verwendung eines
jeden ss-Abschnittsendes zur Ausbildung der dreisträngigen Struktur
mit einem ds-Abschnittsende erhält
Priorität.
Falls im Speziellen. die vorliegende Erfindung zur Klonierung von
Genen, wie später
erwähnt
wird, angewendet wird, ist es bevorzugt, dass die zwei ss-Abschnittsenden
die 5'- und 3'-Enden der gleichen
DNA aufbauen und ebenso können
die ss-Abschnittsenden entweder in der Sense-Kette oder der Antisense-Kette
existieren, aber es ist bevorzugt, dass ein ss-Abschnittsende in
jedem der 3'-Enden
oder 5'-Enden der
Sense-Kette und dem 3'-Ende
oder 5'-Ende der
Antisense-Kette der gleichen DNA existiert.
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Die
Länge der
Nukleotidsequenz der vorstehend erwähnten ss-Abschnittsenden ist
wenigstens 6mer und bevorzugt 13mer oder mehr. Wenn es kleiner als
6mer ist, kann die dreisträngige
Struktur, welche zur Ligation gemäß der vorliegenden Erfindung
notwendig ist, eine mangelnde Stabilität aufweisen. Die obere Grenze
der verstehenden Länge
ist theoretisch nicht beschränkt
und liegt im Allgemeinen bei 500mer (oder Basen) oder weniger.
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Die
in dem Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung angewandte DNA-Quelle ist nicht wichtig und kann jede
DNA sein. Wenn jedoch zwei DNAs ligiert werden, ist z.B. eine bevorzugt
eine DNA, die in eine zweckmäßige kompetente
Zelle eingeführt
werden kann und sich von einem Vektor ableitet, der innerhalb dieser
Zellen autorepliziert werden kann. Solche Vektoren werden gemäß den kompetenten
Zellen, in welche das Ligat später
eingeführt
wird, ausgewählt.
Bei Verwendung von E. coli als die Zellen, können die kommerziell erhältlichen
pBR322- und pUC-Serien (z.B. pUC18, pSP64, pGEM-3, pBluescript)
und solche Vektoren oder Plasmide eingesetzt werden. Ebenso können bei
Verwendung von Hefen als die Zellen, YEP24, Ylp5 und so weiter eingesetzt
werden, und bei Verwendung von Bacillus können pHY300, PLK und solche
Vektoren und Plasmide eingesetzt werden.
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Für die andere
DNA wurden solche vorgeschlagen, die sich aus dem Genom oder den
Mitochondrien von Mikroben oder Tieren ableiten, aber sie können ebenso
eine synthetisierte oder teilweise synthetisierte DNA sein oder
können
von genetisch erzeugter DNA abgeleitet sein.
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Bei
Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Klonierung von Genen wird eine Ausführungsform als eine DNA ausgewählt, in
welcher ein ss-Abschnittsende, welches eine zu der Nukleotidsequenz für beide
ds-Abschnittsenden einer das gesamte oder einen Teil des Zielgens
umfassenden DNA entsprechende Sequenz umfasst, an beide Enden einer
DNA des vorstehend erwähnten
Vektorursprungs gebunden ist. Die vorstehend erwähnten beiden ds-Abschnittsenden
können
Nukleotidsequenzen eines ursprünglichen Gens
sein, können
aber ebenso z.B. solche sein, die hergestellt wurden, damit sie
Nukleotidsequenzen umfassen, die dem gesamten oder einem Teil des
vorstehend erwähnten
ss-Abschnittsende entsprechen. Ein auf diese Art und Weise hergestelltes
Beispiel ist ein PCR-Produkt, das unter Verwendung eines Oligonukleotids, das
zwei ss-Abschnittsendsequenzen, gefolgt durch die Nukleotidsequenz
des 5'- oder 3'-Endabschnitts des Zielgens,
umfasst, als dem Primer hergestellt worden ist.
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Die
Länge der
vorstehend erwähnten
DNA ist nicht beschränkt,
solange sie mit der Aufgabe der vorliegenden Erfindung übereinstimmt
und die funktionellen Effekte der vorliegenden Erfindung erfüllt. Der
geeignete Umfang der vorstehend erwähnten Länge kann durch den Fachmann
unter Bezugnahme auf die gesamte Beschreibung der Anmeldung oder
der nachstehend gezeigten Beispiele oder durch Ausführen von
Experimenten gemäß diesen
Beispielen verstanden werden.
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Erfindungsgemäß werden
das vorstehend erwähnte
ds-Abschnittsende und ss-Abschnittsende in Gegenwart eines zweckmäßigen homologen
rekombinanten Proteins innerhalb eines flüssigen Mediums in Kontakt gebracht.
Die Quelle eines solchen homologen, rekombinanten Proteins (oder
eines multifunktionellen Proteins, das in der allgemeinen Rekombination
umfasst ist), ist nicht wichtig und jedes Protein kann eingesetzt werden,
solange das vorstehend erwähnte
ds-Abschnittsende
und ss-Abschnittsende einen stabilen Komplex über das Protein ausbilden können, wenn
das Protein vorhanden ist. Spezielle Beispiele von solchen homologen,
rekombinanten Proteinen sind das Rec A-Protein des Ursprungs von
E. coli (E. coli origin), multifunktionelle Proteine, die durch
das Rec A-Gen in wärmebeständigen Bakterien
(Thermus thermophillus) und anderen Enteralbakterien und schon bekannten
Rec A-artigen Proteinen von Agrobacterium tumefaciens, Bacillus subtilis,
Methylophilus methylotrophus, Vibrio cholerae, Ustilago maydis und
solchen Ursprüngen
kodiert sind. Hefe (Saccharomyces cerevisiae) und vom Menschen stammende
Rec A-artige Proteine sind ebenso in den vorstehend erwähnten homologen
rekombinanten Proteinen umfasst. Hinsichtlich der Erwerbbarkeit,
der Stabilität
und der Funktion ist für
den Einsatz ein von E. coli abgeleitetes Rec A-Protein oder ein
Protein mit einer ähnlichen
Funktion (z.B. ein modifiziertes Protein des Proteinursprungs oder
ein Fragment davon) bevorzugt. Als ein modifiziertes Protein kann
eines angegeben werden, das ein durch Mutagenese an spezifischen
Stellen des Rec A-Gens usw. geschaffenes Rec A-Genprodukt ist, und
ebenso die Aminosäuresequenz
des Rec A-Proteins umfasst, in welcher eine oder mehrere Aminosäuren entfernt,
ersetzt oder hinzugefügt
worden sind, und welches eine äquivalente
Funktion zu dem Rec A-Protein aufweist, um einen Komplex auszubilden,
der das vorstehend erwähnte
dreisträngige
DNA-Protein umfasst. Als ein modifiziertes Protein mit mehreren
Aminosäuredeletionen
kann ein Peptid oder Protein angegeben werden, das die Bindungsdomäne an die
einzelsträngige
DNA des Rec A-Proteins umfasst. Beispiele von solchen Peptiden sind
solche, die in der Publikation von Voloshin et al., Science, Band
272, 1996: 868–872,
angegeben sind. Wie durch das Vorstehende verständlich geworden ist, wird das
Wort "Protein" erfindungsgemäß als eine
Definition eingesetzt, die Peptide ebenso umfasst.
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Zum
Zeitpunkt der vorstehend erwähnten
Kontaktierung ist es notwendig, dass Nukleosidtriphosphate (dATP,
dUTP, dCTP, dTTP, cGTP, ATP, TTP, CTP, UTP, GTP) ebenso vorhanden
sind. Beispiele von solchen Nukleosidtriphosphaten sind Adenosin-5'-triphosphat (ATP) oder seine Analoga,
z.B. Adenosin(γ- thio)-triphosphat
(ATP-γS),
GDP-γS,
AMP-PNP oder regenerierende Systeme (NTP + Phosphocreatin + Creatinphosphokinase)
von NTP (ATP, TTP, GTP, CTP). In dem vorstehenden Komplexbildungssystem
ist es bevorzugt, ATP-γS
einzusetzen, falls ATP den biologischen Abbau bewirkt.
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Das
vorstehende Inkontaktbringen wird durch ein zweckmäßiges flüssiges Medium,
z.B. in Lösungen, die
sicher durch zweckmäßige Puffermittel
gepuffert: sind, durchgeführt.
Zum Beispiel ein Puffer vom Tris-Typ, der durch Einstellen des pH-Werts
auf 6,5 bis 7,5 und bevorzugt ungefähr 7,2 mit Tris (nämlich Tris(hydroxymethyl)aminomethan)
und einer zweckmäßigen Säure (z.B.
Essigsäure,
Salzsäure)
hergestellt worden ist. Das Pufferungsmittel wird im Allgemeinen
bei 10 mM bis 50 mM und bevorzugt 30 mM eingesetzt. Die vorstehend erwähnte zu
ligierende DNA wird in einem solchen flüssigen Medium gelöst, das
homologe rekombinante Protein und Nukleosidtriphosphat werden hinzugegeben
und die vermischte Lösung
wird zur Durchführung
der vorstehend erwähnten
Kontaktierung inkubiert.
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Das
Verhältnis
der zu ligierenden DNAs ist nicht beschränkt und kann jedes sein, solange
es innerhalb eines Bereichs liegt, welches die korrekte Ligation
eines jeden Endes nicht nachteilig beeinflusst. Jedoch ist es bei
Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Klonierung eines spezifischen Gens bevorzugt, die zu ligierende
DNA in einer Konzentration einzusetzen, die beinahe äquimolar
zu der das gesamte Gen oder das Teilgen umfassenden DNA ist. Das
eingesetzte Verhältnis
des homologen rekombinanten Proteins kann nicht beschränkt sein,
da es gemäß der Kettenlänge des
ss-Abschnitts variiert, ist aber im Allgemeinen eine molare Menge,
welche die den ss-Abschnitt aufbauende Nukleotidanzahl übersteigt,
und ist bevorzugt eine ungefähr
1 molare Menge gegenüber
drei Nukleotiden.
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Das "Kontaktieren" gemäß der vorliegenden
Erfindung kann durch Inkubieren der, wie vorstehend erwähnt, bei
4°C bis
54°C hergestellten
Mischung bevorzugt für
15 Minuten bei ungefähr
37°C, und
im Allgemeinen für
30 Minuten vervollständigt
werden. Als Ergebnis wird ein DNA-Ligat (oder eine DNA-Komponente),
die wenigstens einen dreisträngigen
Strukturbereich umfasst, ausgebildet.
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Die
so ausgebildete DNA-Komponente existiert im Allgemeinen in der Form
eines Komplexes, in welchem wenigstens das homologe rekombinante
Protein an den dreisträngigen
Strukturbereich gebunden vorliegt. Solche Komplexe können aus
der Reaktionsmischung durch zweckmäßige Reinigungsverfahren isoliert werden,
z.B. durch eine Phenol/Chloroform-Extraktion, eine Gelfiltration
und verschiedene elektrophoretische Verfahren. Der so isolierte
Komplex ist bei normalen, exogenen, physiologischen Bedingungen
stabil und kann zur Analyse von Genen und DNA-Sequenzen, die den
Komplex aufbauen, eingesetzt werden.
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Ohne
Isolieren des vorstehenden Komplexes aus der Reaktionsmischung (oder
manchmal nach dem Isolieren) kann das homologe rekombinante Protein
aus dem Komplex durch Behandlung mit Proteinasen (z.B. Proteinase
K) entfernt werden. Die somit deproteinierte DNA-Komponente ist
ebenso stabil. Die Komponente, welche durch Ligation von zwei DNA-Typen
ausgebildet worden ist und welche eine dreisträngige Struktur an zwei Stellen
besitzt, ist insbesondere stabil und kann ferner durch im Stand
der Technik gewöhnliche Verfahren
effizient in Zellen eingeführt
werden. Vor der Einführung
ermöglicht
die Umwandlung des dreisträngigen
Strukturbereichs (siehe 1) in eine doppelsträngige Struktur
durch eine Endonuklease, die spezifisch auf eine einzel strängige Nukleinsäure einwirkt,
dass die DNA-Komponente effizienter in eine Zelle eingeführt werden
kann.
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Das
Verfahren zur Einführung
kann zweckmäßigerweise
gemäß dem Ausgangsmaterial
(Vektor) der als eine der DNAs eingesetzten Vektor-DNA ausgewählt werden.
Zum Beispiel kann bei Auswahl eines zur Autoreplikation in E. coli
als einem Vektor oder Plasmid ausgewählten Vektors und von E. coli
als die kompetente Zelle die Einführung der DNA-Komponente unter
Verwendung eines Verfahrens, wie etwa einem Elektroporationsverfahrens
und eines Calcium-Behandlungsverfahrens ausgeführt werden. Durch Kultivierung
der Zellen, in welche die vorstehende DNA-Komponente eingeführt worden
war, kann eine ringförmige
DNA-Komponente amplifiziert werden, in welcher der vorstehend erwähnte dreisträngige Strukturbereich
(falls vorhanden) in einen doppelsträngigen Strukturbereich umgewandelt
worden ist (es wird angenommen, dass dieser Strukturbereich in einem
Zustand vorliegt, in welchem die dem vorstehend erwähnten ss-Abschnittsende
korrespondierende Nukleotidsequenz aus dem vorstehend erwähnten ds-Abschnittsende
entfernt worden ist, und in welchem das ds-Abschnittsende und das
ss-Abschnittsende kovalent über
eine Phosphodiesterbindung gebunden vorliegen).
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Wenn
zur Einführung
eines Gens in die vorstehend erwähnten
Zellen gewöhnlicherweise
eingesetzte Verfahren verwendet werden, wird eine ringförmige DNA-Komponente
effizienter als eine lineare DNA-Komponente eingeführt. Deshalb
werden bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Einsatz
eines PCR-Produkts (welches durch eine PCT erhalten worden ist,
ein der ein Oligonukleotid, umfassend Nukleotidsequenzen, die den
zwei Typen der ss-Abschnittsenden entsprechen, gefolgt von jeweils
den Nukleotidsequenzen des 5'-
oder 3'-Abschnittsbereichs
des zu ligierenden Gens, als einen Primer und das Gen als ein Templat
eingesetzt worden ist) als die DNA mit dem ds-Abschnittsende solche
Nebenprodukte, die nicht korrekt durch die PCR verlängert worden
sind, nicht in Zellen eingeführt,
da sie keine ringförmigen
DNA-Komponenten ausbilden. Deshalb können durch das erfindungsgemäße Verfahren
nur die PCR-Produkte erhalten werden, die aus der korrekten Amplifikation
des mittels PCR zu klonierenden Gens resultieren.
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Da
die vorstehende ringförmige
DNA-Komponente innerhalb einer zweckmäßigen Zelle autoreplizieren
kann, können
die ringförmige
DNA-Komponente so wie sie ist oder ihr Replikat für die Analyse
der DNA-Sequenz oder der Struktur oder Funktion des in der kreisförmigen DNA-Komponente
enthaltenen Gens verwendet werden. Deshalb stellt eine weitere Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
eine DNA-Komponente
bereit, die eine ringförmige
DNA ist und wenigstens einen dreisträngigen Strukturabschnitt besitzt,
der aus einem einzelsträngigen
Abschnittsende (ss-Abschnitt) und eine zu dem vorstehend erwähnten ss-Abschnittsende
homologen Sequenz umfassenden, doppelsträngigen Abschnittsende (ds-Abschnitt)
hergestellt worden ist. Eine solche DNA-Komponente wird aus den vorstehend erwähnten zwei
DNAs hergestellt, von denen eine eine Nukleotidsequenz besitzt,
die zur Autoreplikation innerhalb einer Zelle fähig ist, und bei der die andere
das gesamte oder einen Teil des zu klonierenden Gens umfasst, und
bevorzugt zusätzlich
zwei dreisträngige
Strukturabschnitte besitzt. Die Größe des "Genteils" ist nicht wichtig, solange es eine
Nukleotidsequenz besitzt, die zur Unterscheidung von anderen Genen
hinreichend ist. Ferner können
zwei oder mehrere Gene umfasst sein.
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Ein
Beispiel eines Verfahrens zur Umwandlung einer dreisträngigen Struktur
in eine doppelsträngige Struktur
ist das Verfahren, welches die Transfektion des Nukleinsäureli gats,
das durch die Reaktion zur Dreifachstrangausbildung erhalten worden
war, in eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle und die Umwandlung
des Nukleinsäure-ligierten
Abschnitts, der die dreisträngige
Struktur mit einschließt,
in eine doppelsträngige
DNA umfasst.
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Die
folgenden zwei repräsentativen
Transfektionsverfahren für
Gene können
als Verfahren zur Umwandlung des Nukleinsäure-ligierten Abschnitts mit
der dreisträngigen
Struktur in eine doppelsträngige
DNA innerhalb prokaryontischer/eukaryontischer Zellen, in welche
das Nukleinsäureligat,
erhalten durch die Reaktion zur Dreifachstrangausbildung, eingeführt worden
war, genannt werden.
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Unter
Verwendung chemischer Gen-Transduktionsverfahren wird das Nukleinsäureligat,
das der Ausbildung eines dreifachen Strangs unterzogen worden war,
in Colibacili (Escherichia coli), Spalthefen (Saccharomyces cerevisiae),
sich entfaltende Hefen (budding yeasts, S. Pombe), Pichia (Pichia
pastoris) und solche prokaryontischen oder eukaryontischen kompetenten
Zellen, einschließlich
dem Abschnitt mit Dreifachstrangausbildung, der die DNA-Bindungsstelle
ist, eingeführt
und kann in die ursprüngliche,
doppelsträngige
Struktur innerhalb der kompetenten Zellen umgewandelt werden.
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Alternativ
dazu kann unter Verwendung des Elektroporationsverfahrens das Nukleinsäureligat,
das der Dreifachstrangausbildung unterzogen worden war, in Säugetierkulturzellen,
wie etwa menschlichem Hybridoma, pflanzlichen Protoplasten, wie
z.B. Tabakprotoplasten, Pflanzen, wie z.B. Getreide, Mikrobenzellen,
wie z.B. Spalthefen (Saccharomyces cerevisiae) oder Bakterien, wie
z.B. E. coli und Lactobacillus eingeführt werden und die durch die
Ligationsreaktion ausgebildete Nukleinsäurestruktur, einschließlich des
Ab schnitt mit Dreifachstrangausbildung, der die DNA-Bindungsstelle
ist, kann in die ursprüngliche,
doppelsträngige
Struktur innerhalb der vorstehenden Zellen umgewandelt werden.
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Die
durch die Ligationsreaktion ausgebildete Nukleinsäurestruktur
einschließlich
des Abschnitt mit Dreifachstrangausbildung, der die DNA-Bindungsstelle
ist, kann ebenso in die ursprüngliche,
doppelsträngige Struktur
unter Verwendung eines Klenow-Fragments durch seine Polymeraseaktivität und die
3' → 5'-Exonukleaseaktivität umgewandelt
werden. Ebenso kann in dem Nukleinsäureligat, das der Dreifachstrangausbildung unterzogen
worden war, die Struktur der Dreifachstrangausbildung, welche die
DNA-Ligationsstelle ist, in die ursprüngliche, doppelsträngige DNA
umgewandelt werden.
-
Wie
vorstehend erwähnt,
kann das erfindungsgemäße Verfahren
zur Klonierung von Genen angewendet. werden. Eine solche Klonierung
kann herkömmlicherweise
durch den nachstehend beschriebenen Genklonierungskit durchgeführt werden,
welcher als eine unterschiedliche Ausführungsform vorgesehen ist.
Ein solcher Kit umfasst wenigstens die Komponenten (A) bis (D) wie
sie in Anspruch 9 definiert sind.
-
Die
Länge der
vorstehend erwähnten
Nukleotidsequenz des ss-Abschnitts und des doppelsträngigen Abschnitts
(nämlich
abgeleitet aus dem Vektor oder dem Plasmid, das innerhalb der kompetenten
Zellen zur Autoreplikation fähig
ist) liegen im schon erwähnten
Bereich. Ebenso sind die Längen
der Teilsequenz des einen Ende des zu klonierenden Gens und die
Teilsequenz des anderen Endes Längen,
die als Primer der PCR fungieren, wenn sie jeweils mit dem vorstehend
erwähnten
ss-Abschnitt kombinieren, und wenn das Gen als das Templat eingesetzt
wird.
-
Gemäß einer
Ausführungsform
der Anwendung des Kits gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine Ligation zwischen der DNA von (A) und den PCR-Produkten
(entsprechend der DNA, die ein ds-Abschnittsende umfasst), die durch
den Einsatz der Primer von (B) und (C) amplifiziert worden sind,
durchgeführt.
Wie vorstehend erläutert,
wird die Ligation in Gegenwart eines homologen, rekombinanten Proteins
und Nukleosidtriphosphat innerhalb einer zweckmäßigerweise gepufferten wässrigen
Lösung
durchgeführt.
Deshalb kann der erfindungsgemäße Kit anders
als die vorstehenden DNA-Proben ein vorstehend erwähntes Protein,
Nukleosidtriphosphat und ein Pufferungsmittel enthalten. Außerdem kann
es ebenso eine Proteinase zur Entfernung eines vorstehend erwähnten Proteins,
das an die durch Ligation erhaltene DNA-Komponente gebunden ist,
mit einschließen.
-
Das
Ligationsverfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung besitzt die folgenden Charakteristiken.
-
- (i) Eine Ligation ist selbst dann möglich, wenn
keine zweckmäßige Restriktionsenzymstelle
auf der zu ligierenden DNA vorhanden ist.
- (ii) Es ist ebenso möglich,
die Kontamination durch Nebenprodukte, welche bei der Genklonierung
unerwünscht
sind, zu vermeiden, weil die Autoligationsreaktion der Vektor-DNA
nicht. auftritt, da keine Ligationsenzyme verwendet werden.
- (iii) Da die Ligationsstelle gewöhnlicherweise innerhalb der
kompetenten Zellen, in welche das Ligat als nächsten Schritt eingeführt wird,
wieder hergestellt wird, ist eine Ligation nicht notwendigerweise
erforderlich.
- (iv) Bei Anwendung zur Klonierung von PCR-Produkten, obwohl
nicht darauf beschränkt,
ist der Hintergrund niedrig, weil PCR-Nebenprodukte nicht in kompetente
Zellen eingeführt
werden.
- (v) Die Ligation kann nukleotidspezifisch und orientierungsspezifisch
durchgeführt
werden, da ein homologes rekombinantes Protein (d.h. Rec A) eingesetzt
wird.
- (vi) Die Transformation kann gemäß herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden,
und zwar mit einer gleichen oder höheren Effizienz.
- (vii) Die Vielseitigkeit ist höher als die des vorstehend
erwähnten
Verfahrens von C. Aslandis et al., da keine speziellen Vektoren
erforderlich sind.
-
Deshalb
ist die vorliegende Erfindung auf dem Gebiet der Genmanipulation
höchst
nützlich.
-
Die
vorliegende Erfindung zeigt einen dramatischen Effekt für 5'-RACE (A. Michael
et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, Vol. 85 (1998), 8998–9002) (siehe 2).
Zum Beispiel kann die folgende Reaktion ausgeführt werden. In 2 überlappt
die cDNA1, die der Sequenz auf Seiten des 3'-Endes der cDNA an einigen Teilen entspricht,
mit der cDNA2, welche eher zu der mehr auf Seite des 5'-Endes liegenden
Sequenz als der 1 entspricht, und welche unter Verwendung der Sequenz
der 5'-Seite der
cDNA1 als Primer und der cDNA als dem Templat amplifiziert worden
war. Dieser überlappende,
doppelsträngige
Abschnitt wird in einen einzelsträngigen Abschnitt durch Reaktion
der Exonuklease III auf der cDNA1 umgewandelt, wobei die doppelsträngige DNA
(cDNA2) und die einzelsträngige
DNA (cDNA1) in diesem überlappenden
Bereich in eine dreisträngige Struktur
durch das erfindungsgemäße Verfahren
ausgebildet werden, und dann zur Ausbildung einer doppelsträngigen DNA
transformiert werden. Durch diese Manipulation kann die cDNA1 und
cDNA2 als eine sequenzielle cDNA-Sequenz ohne irgendeine Lücke erhalten
werden.
-
Die
vorliegende Erfindung wird nachstehend detaillierter unter Bezugnahme
auf die Beispiele beschrieben, soll aber nicht auf diese beschränkt sein.
-
Beispiel 1
-
DNA-Klonierung unter Verwendung
des Rec A-Proteins
-
Eine
lineare Vektor-DNA, deren beide Seiten vorstehende 3'-Enden mit 13mer
(Sequenz A) und 14mer (Sequenz B) aufwiesen, wurde als die Vektor-DNA
hergestellt. Die mittels PCR unter Verwendung von Oligonukleotid
1, umfassend Sequenz A an dem 5'-Ende,
gefolgt von der Sequenz eines Endes des Exon 11 des menschlichen
p53-Gens, Oligonukleotid 2, umfassend Sequenz B an dem 5'-Ende, gefolgt von
der anderen Endsequenz des Exon 11, und menschliche Genom-DNA als
das Templat erhaltenen Amplifikationsprodukte wurden als die Insert-DNA
hergestellt. Die Reaktion der Dreifachstrangausbildung wurde zwischen
der vorstehend erwähnten
Vektor-DNA und der Insert-DNA durchgeführt. In 40 μl der Reaktionslösung waren
200 ng Insert-DNA, 6,0 μg
Rec A-Protein, 4,8 mM ATP-γS,
30 mM Tris-Acetat (pH 7,2), 1 μg
Vektor-DNA und 21,5 mM Magnesiumacetat enthalten. Diese Reaktionslösung wurde
bei 37°C
für 30
Minuten inkubiert. 0,5% (W/Vol) SDS und 0,7 mg/ml Proteinase K wurden
hinzugegeben, es wurde bei 37°C
für 30
Minuten inkubiert und dann wurden 60 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) hinzugegeben,
um ein Ge samtvolumen von 100 μl
zu ergeben. Nach der Durchführung
einer einfachen Phenol/Chloroform-Extraktion und einer einfachen
Chloroform-Extraktion wurde eine Ethanol-Präzipitation
durchgeführt
und die DNA wurde in 10 μl
destilliertem Wasser aufgelöst.
2 ml davon wurden in E. coli der Zelllinie DH10B durch gewöhnliche
Elektrophorese transformiert. Nach der Kultivierung über Nacht
in einem Agarmedium mit Ampicillin wurden IPTG- und X-Gal-Plasmide
aus den resultierenden weißen
Kolonien mit Inserts bzw. Einfügungen
hergestellt und die Insert-DNA wurde dann untersucht. Die Anwesenheit
der durch das Verdauungsenzym BamHI rund um die Mitte der Insert-DNA
und nahe der Stelle, in welche das DNA-Insert in die Vektor-DNA
eingefügt
worden ist, erkannte Stelle wurde verifiziert. Als nächstes wurde,
nachdem die Insert-DNA unter Verwendung von BamHI herausgeschnitten
worden war, das Elektrophoresemuster der DNA simultan durch Agarosegel-Elektrophorese
analysiert, um zu verfizieren, ob die Insert-DNA die gewünschte ist
oder nicht. Das Ergebnis ist in 3 gezeigt.
Bahn 1 bis Bahn 5 in dieser Figur zeigen die aus den weißen Kolonien
hergestellten Plasmidderivate, welche aus der Kultur resultieren,
Bahn 6 bis Bahn 7 sind Derivate der aus den blauen Kolonien hergestellten
Plasmide, die aus der Kultur resultieren. Bahn M zeigt die DNA-Größenmarker
und die Größen sind
am linken Rand der Figur gezeigt. Diese Größenmarker wurden durch Spaltung
der λDNA
mit dem Verdauungsenzym HindIII erhalten.
-
Aus
dieser Figur wird die herausgeschnittene DNA-Bande bei der Position
um 600 bp sichtbar. Es wurde ebenso verifiziert, dass ein Teil der
Insert-DNA in der gewünschten
Orientierung in der Vektor-DNA ligiert worden war. Ebenso ist erkennbar,
dass die das Insert nicht umfassenden Plasmide der blauen Kolonien
das Insert nicht enthielten.
-
Oligonukleotid 1 (SEQ
ID NO: 1)
-
- 5'-gacgacgacaaga
c acctgaagtc caaaaagggt cagtc-3'
-
Oligonukleotid 2 (SEQ
ID NO: 2)
-
- 5'-gaggagaagcccgg
tggcag caaagtttt:a ttgtaaaata-3'
- (In der vorstehenden Sequenz entsprechen die Sequenzen von dem
vierzehnten c und danach und von dem fünfzehnten t und danach der
menschlichen Genomsequenz).
-
Beispiel 2
-
Verifikation der ligierten
DNA
-
Bahn
1 der 4 ist das Ergebnis einer Elektrophorese mit 10%igem
Agarosegel der DNA-Mischung vor der Transformierung in E. coli in
Beispiel 1. Bahn 2 ist das Ergebnis einer ähnlichen Elektrophorese der DNA-Mischung
vor der Transformierung in E. coli, wobei die DNA-Mischung durch
Reaktion unter Verwendung der Insert-DNA aus Beispiel 1, welche
die Sequenz A, aber nicht die Sequenz B an beiden Enden umfasst, erhalten
wurde. Bahn 3 ist das Ergebnis einer ähnlichen Elektrophorese der
DNA-Mischung vor der Transformierung in E. coli, wobei die DNA-Mischung
durch Reaktion unter Verwendung der Insert-DNA aus Beispiel 1, umfassend
die Sequenz B, aber nicht die Sequenz A, an beiden Enden, erhalten
wurde. Bahn 4 ist das Ergebnis einer ähnlichen Elektrophorese der
DNA-Mischung vor der Transformierung in E. coli, wobei die DNA-Mischung
durch die Reaktion unter Verwendung der Insert-DNA aus Beispiel
1, umfassend weder Sequenz A noch Sequenz B an den entsprechenden
Enden (Oligonukleotid 3 bzw. 4) erhalten wurde. Bahn 5 ist das Ergebnis
einer Elektrophorese von nur der Insert-DNA, die in Bahn 1 eingesetzt
wurde. Bahn 6 ist das Ergebnis einer Elektrophorese von nur der
Insert-DNA, die in Bahn 2 eingesetzt wurde. Bahn 7 ist das Ergebnis
einer Elektropho rese von nur der Insert-DNA, die in Bahn 3 eingesetzt
wurde. Bahn 8 ist das Ergebnis einer Elektrophorese von nur der
Insert-DNA, die in Bahn 4 eingesetzt wurde. Bahn 9 ist die eingesetzte
Vektor-DNA. Bahn M zeigt die Größenmarker
und die Größen sind
am linken Rand. der Figur angegeben. Diese Größenmarker wurden durch Spaltung
von λDNA
durch das Verdauungsenzym HindIII erhalten.
-
Aus
dieser Figur ergibt sich, dass die DNA in einer spezifischen Art
und Weise der Sequenz durch die Rec A-Reaktion ligiert worden ist.
-
Oligonukleotid 3 (SEQ
ID NO: 3)
-
- 5'-c acctgaagtc
caaaaagggt cagtc-3'
-
Oligonukleotid 3 (SEQ
ID NO: 4)
-
- 5'-tggcag
caaagtttta ttgtaaaata-3'
-
Die
gleiche Probe wie in den Bahnen 1 bis 4 der 4 und Bahn
9 wurde in E. coli der Zelllinie DH10B durch das gewöhnliche
Verfahren der Elektroporation transformiert. Dann wurde nach einer
Kultivierung in einem Agar-Medium mit Ampicillin, IPTG und X-Gal über Nacht
kultiviert, wobei die Anzahl der resultierenden E. coli-Kolonien
gezählt
wurde. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt.
-
-
- (Bemerkung: "Weiße Kolonie" in Tabelle 1 bezieht
sich auf eine Kolonie, die die Insert-DNA umfasst, welche in den Vektor
insertiert wurde, und "Blaue
Kolonie" bezieht
sich auf eine Kolonie, die nicht die Insert-DNA trägt).
-
Wie
aus Tabelle 1 und der Figur ersichtlich ist, wird die DNA in einer
spezifischen Art und Weise der Sequenz durch die Rec A-Reaktion
ligiert.
-
Beispiel 3
-
Die Enzymabhängigkeit
der Ligationsreaktion
-
Bahn
1 der 5 zeigt das Ergebnis der Elektrophorese auf 10%igem
Agarosegel der DNA-Mischung, die für die Transformation in E.
coli in Beispiel 1 eingesetzt wurde. Bahn 2 zeigt das Ergebnis der
gleichen Reaktion ohne Zugabe von ATP-γS. Bahn 3 zeigt das Ergebnis
der gleichen Reaktion ohne Zugabe von Rec A. Bahn M zeigt die Größenmarker,
und die Größen sind
auf dem linken Rand der Figur angegeben. Diese Größenmarker
wurden durch Spaltung von λDNA
durch das Restriktionsenzym HindIII erhalten.
-
Aus
der Figur ist ersichtlich, dass die Enzymreaktion für die Rec
A-vermittelte Ligation der Target-DNA absolut notwendig ist.
-
Beispiel 4
-
Die Stabilität der ligierten
DNA
-
Die
Stabilität
der ligierten DNA wurde über
die Ausbildung der dreisträngigen
Struktur überprüft. Es wurde überprüft, ob es
möglich
ist, die ligierte DNA mit verschiedenen Modifikationsenzymen vor
der Transformation in E. coli gemäß den Bedürfnissen zu behandeln. Wärmestabile
DNA-Ligase (Ampligase), welche eine der Modifikationsenzyme ist,
wurde hierin getestet. Genauer gesagt läuft die Reaktion folgendermaßen ab.
In der Reaktion des Beispiels 1 wurde nach der Inkubierung bei 37°C für 30 Minuten
eine äquivalente
Menge der Ligationsreaktionslösung
hinzugegeben, vermischt und bei 55°C für eine Stunde inkubiert. Die
Ligationsreaktionslösung
enthielt 40 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 20 mM MgCl2,
1,0 mM NAD, 0,02% Triton X-100, pH 8,3 und 40 Einheiten Ampligase.
Als nächstes
wurden 0,5% (W/Vol) SDS und 0,7 mg/ml Proteinase K hinzugegeben, bei
37°C für 10 Minuten
inkubiert und dann wurden 20 ml TE-Pufferlösung (10 mM Tris-HCl, 1 mM
EDTA) hinzugegeben, um ein Gesamtvolumen von 100 μl zu erreichen.
Die enthaltenen DNA-Moleküle
wurden konzentriert und mit einer einfachen Phenol/Chloroform-Extraktion
und einer einfachen Chloroform-Extraktion isoliert, gefolgt von
einer Ethanol-Präzipitation.
Die resultierende DNA wurde in 10 μl destilliertem Wasser gelöst. Eine Elektrophorese
mit 1,0%igem Agarosegel wurde für
die Gesamtmenge durchgeführt.
Nach der Elektrophorese wurde eine Ethidiumbromidfärbung durchgeführt, Fotografien
wurden zur Beobachtung der DNA gemacht. Bahn 1 aus 6 zeigt
die Ergebnisse. Bahn 2 zeigt das Ergebnis für die gleiche Reaktion wie
in Bahn 1, aber ohne Zugabe von Ampligase. Bahn 3 zeigt die Ergebnisse
für die
gleiche Reaktion wie in Bahn 1, wenn destilliertes Wasser anstelle
von der vorstehenden Reaktionslösung
eingesetzt wurde und wenn die Inkubation der Ligation nicht durchgeführt wurde.
Bahn M zeigt die Größenmarker
und die Größen sind
auf dem linken Rand der Figur angegeben. Diese Größenmarker
wurden durch Spaltung von λDNA
mittels des Restriktionsenzyms HindIII erhalten.
-
6 zeigt,
dass es keine merkliche Änderung
des Elektrophoresemusters gab, selbst nachdem die ligierte DNA für eine Stunde
bei 55°C
in Amplikase-Pufferlösung
inkubiert worden war. Die Ergebnisse der Bahn 2 und Bahn 3 zeigen, dass
der durch die vorliegende Erfindung ausgebildete DNA-Komplex extrem stabil ist.
Daher ist es möglich,
die Ligation durch DNA-Ligase in Gegenwart des Rec A-Proteins durchzuführen, falls notwendig.
Es ist möglich,
die Insert-DNA in
die Vektor-DNA durch eine kovalente Bindung einzuführen, und ebenso
Einschnitte (nicks) in der DNA zu modifizieren. Und ebenso sind
Modifikationen von verschiedenen ligierten DNA-Komplexen unter Verwendung
anderer wärmebeständiger DNA-Modifikationsenzyme
möglich.
-
Beispiel 5
-
Die Abhängigkeit
eines jeden Reaktants in der Reaktion zur Dreifachstrangausbildung
-
Als
die Target-DNA wurden M13mp18RF-DNA, linearisiert durch das Verdauungsenzym
SnaBI, und 60mer-Oligonukleotid 5, umfassend die Sequenz des Target-DNA-Endabschnittes,
hergestellt. Das 5'-Ende dieses
Oligonulkeotids wurde unter Verwendung von [γ-32P]-ATP
mit 32P markiert. Für die Reaktion zur Dreifachstrangausbildung
zwischen der Target-DNA und dem Oligonukleotid 5 waren 1 pmol markiertes
Oligonukleotid, 6,0 μg
Rec A-Protein, 4,8 mM ATP-γS,
30 mM Tris-Acetat (pH 7,2), 200 ng Target-DNA und 21,5 mM Magnesiumacetat
in 40 ml der Reaktionslösung
enthalten. Nach Zugabe von 0,5 (W/Vol) SDS und 0,7 mg/ml Proteinase
K wurde die Reaktionslösung
bei 37°C
für 30
Minuten zur Entfernung von Rec A inkubiert. Dann wurde die Gesamtmenge
einer Elektrophorese auf 1%igem Agarosegel unterzogen, und danach
wurde eine Ethidiumbromidfärbung
durchgeführt
und Fotografien des Gels wurden aufgenommen. Das Ergebnis ist in 7(B) gezeigt. Das Gel wurde dann mit der Oberseite
auf ein Filterpapier gelegt und in einem Trockner getrocknet. Die
Detektion des Signals wurde mittels einer Autoradiografie des getrockneten
Gels auf einem Röntgenstrahlfilm
aufgezeichnet. 7 (A), Bahn 1, zeigt das Ergebnis.
anschließend
folgte ein Vergleichsexperiment. Bahn M zeigt die Größenmarker
und die Größen sind
auf dem linken Rand der Figur angegeben. Diese Größenmarker
wurden durch Spaltung von λDNA
mit Verdauungsenzym HindIII erhalten und die 5'-Enden waren unter Verwendung von [γ-32P]-ATP mit 32P
markiert. Bahn 2 ist äquivalent
zu Bahn 1, außer
hinsichtlich der Tatsache, dass die Reaktion ohne Rec A durchgeführt wurde.
Bahn 3 ist äquivalent
zu Bahn 1, außer
der Tatsache, dass die Reaktion ohne ATP-γS
durchgeführt
wurde. Bahn 4 ist äquivalent
zu Bahn 1, außer
hinsichtlich der Tatsache, dass die Reaktion mit einem reversen,
komplementären
Oligonukleotid 6 durchgeführt
wurde. Bahn 5 ist äquivalent
zu Bahn 1, außer
hinsichtlich der Tatsache, dass die Reaktion ohne ein Oligonukleotid durchgeführt wurde.
Bahn 6 ist äquivalent
zu Bahn 1, außer
hinsichtlich der Tatsache, dass die Reaktion mit dem Oligonukleotid
7 durchgeführt
wurde. In Bahn 7 ist die Probe gezeigt, für welche die Reaktion unter
Verwendung des Oligonukleotids 7 gegen die Target-DNA, erhalten
durch Spaltung von pBR322-DNA mit Verdauungsenzym ScaI, durchgeführt wurde.
Bahn 7 ist äquivalent
zu Bahn 1, außer
hinsichtlich der Tatsache, dass pBR322-DNA, gespalten durch Verdauungsenzym
ScaI als die Target-DNA eingesetzt wurde und ebenso hinsichtlich
der Tatsache, dass das markierte Oligonukleotid 7 mit der Sequenz
des Endabschnitts dieser Target-DNA eingesetzt wurde.
-
Aus
der Figur und wie in Bahn 1 von (A) gezeigt, erfordert die Dreifachstrangausbildung
die Zugabe von allen Reaktanten zu der Reaktion. Da ebenso die Dreifachstrangausbildung
nicht mit einem reversen, komplementären Oligonukleotid und einem
reversen homologen Nukleotid erhalten werden kann, ist die Orientierung
des Oligonukleotids in einer Richtung.
-
Oligonukleotid 5 (SEQ
ID NO: 5)
-
- 5'-agaggctttg
aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac-3'
-
Oligonukleotid 6 (SEQ
ID NO: 6)
-
- 5'-gtattttacc
cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct caaagcctct-3'
-
Oligonukleotid 7 (SEQ
ID NO: 7)
-
- 5'-cact
gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagt-3'
-
Beispiel 6
-
Sequenzorientierung der
in der Reaktion zur Dreifachstrangausbildung eingesetzten Nukleotide
-
Die
gleiche Reaktion wie in Bahn 1 von 7(A) wurde
in 8(A), Bahn 1 durchgeführt. Bahn
2 ist die gleiche Reaktion wie Bahn 1, außer hinsichtlich der Tatsache,
dass das markierte Oligonukleotid 4, umfassend eine reverse komplementäre Sequenz,
eingesetzt wurde. Bahn 3 ist die gleiche Reaktion wie in Bahn 1, außer hinsichtlich
der Tatsache, dass das markierte Oligonukleotid 8 eingesetzt wurde.
Bahn 4 ist die gleiche Reaktion wie Bahn 1, außer hinsichtlich der Tatsache,
dass ein markiertes Oligonukleotid 9 eingesetzt wurde. (B) zeigt
eine Fotografie einer gesamten DNA-Färbung des gleichen Agarosegels
wie in (A).
-
Die
Figur zeigt, dass die Dreifachstrangausbildung an beiden Enden der
linearen Target-DNA möglich ist
und dass dafür
eingesetzte Oligonukleotide homologe Sequenzen mit der gleichen
Richtung einer der beiden Endsequenzen des Targets besitzen sollten.
-
Oligonukleotid 8 (SEQ
ID NO: 8)
-
- 5'-tgttttagtg
tattctttcg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta gtggcattac-3'
-
Oligonukleotid 9 (SEQ
ID NO: 9)
-
- 5'-gtaatgccac
tacgaaggca ccaacctaaa acgaaagagg cgaaagaata cactaaaaca-3'
-
Beispiel 7
-
Wärmestabilität der Oligonukleotidsequenzen
für die
Dreifachstrangausbildungsstruktur
-
Bahn
1 von 9(A) zeigt die Probe, in welcher
als erstes die gleiche Reaktion wie in 8(A),
Bahn 1, durchgeführt
wurde, gefolgt von einer Zugabe von 20 mM NaCl zu 10 μl der Probe
und einer Wärmebehandlung
für 10
Minuten bei 37°C.
Bahn 2 besitzt die Probe, die für
10 Minuten bei 45°C
wärmebehandelt
worden war. Bahn 3 besitzt die Probe, die bei 55°C für 10 Minuten wärmebehandelt
worden war. Bahn 4 besitzt die Probe, die für 10 Minuten bei 65°C wärmebehandelt
worden war. Bahn 5 besitzt die Probe, die für 10 Minuten bei 75°C wärmebehandelt
worden war. Bahn 6 besitzt die Probe, die für 10 Minuten bei 85°C wärmebehandelt worden
war. (B) zeigt eine Fotografie der gesamten DNA-Färbung des
gleichen Agarosegels wie in (A). In (C) wurde das gleiche Experiment
wie in (A) unter Verwendung eines 40mer langen Oligonukleotids 10,
umfassend die Sequenz des Endabschnittes der Target-DNA (M13np18RF-DNA,
gespalten durch das Verdauungsenzym SnaBI) durchgeführt. (D)
zeigt eine Fotografie der gesamten DNA-Färbung des gleichen Agarosegels wie
in (C).
-
Oligonukleotid 10 (SEQ
ID NO: 10)
-
- 5'-actttttcat
gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac-3'
-
Die
Figur zeigt, dass eine Temperatur um 85°C stark die Grenze der Wärmestabilität des Dreifachstrangs
unter Verwendung von Oligonukleotid 5 mit 60mer ist und dass sie
rund 75°C
bei Verwendung des Oligonukleotids 10 mit 40mer ist.
-
Beispiel 8
-
cDNA-Klonierung durch
Rec A-Reaktion
-
Das
mittels NotI und SalI gespaltene Plasmid pBluescript (SK+) wurde
als die Vektor-DNA eingesetzt. Ferner wurden beide Enden unter Verwendung
von Exonuklease III überstehen
gelassen. Genau genommen wurden 100 μl einer Exonuklease-Reaktionslösung (50
mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM MgCl2, 10 mM 2-Mercaptoethanol
und 180 Einheiten Exonuklease III) mit 300 ng der DNA, in welcher
das 5'-Ende mit
Verdauungsenzymen NotI und SalI überstehen
gelassen worden war, bei 37°C
für eine
Minute zur Reaktion gebracht. Die DNA wurde konzentriert und die
Enzyme durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation
deaktiviert. Eine 7 kb lange Ratten-cDNA (siehe Ohara, O. et al.,
Brain Res. Mol. Brain Res. 57(2) 181–192 (1988); GenBank accession
No. AB008551) wurde als die Insert-DNA eingesetzt. Beide Enden dieser
cDNA umfassten Sequenzen, die mit dem Endabschnitt der Vektor-DNA überlappten,
und zwar mit Längen
von 54 bp bzw. 55 bp. Die Reaktion zur Dreifachstrangausbildung
wurde zwischen der vorstehend erwähnten Vektor-DNA und Insert-DNA
durchgeführt.
Für die
Reaktion zur Dreifachstrangausbildung waren 200 ng Insert-DNA, 6,0 μg Rec A-Protein,
4,8 mM ATP-γS,
30 mM Tris-Acetat (pH 7,2), 1 μg
Vektor-DNA und 21,5 mM Magnesiumacetat in 40 μl der Reaktionslösung enthalten.
Diese Reaktionslösung
wurde bei 37°C
für 30
Minuten inkubiert. 0,5% (W/Vol) SDS und 0,7 mg/ml Proteinase K wurden
hinzugegeben, bei 37°C
für 30
Minuten inkubiert und dann wurden 60 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl,
1 mM EDTA) hinzugegeben, um ein Gesamtvolumen von 100 μl zu erhalten.
Nach Durchführung
einer einfachen Phenol/Chloroform-Extraktion, einer einfachen Chloroform-Extraktion
und nach der Durchführung
einer Ethanol-Präzipitation
wurde die DNA in 10 μl
destilliertem Wasser gelöst.
Die Gesamtmenge wurde einer Elektrophorese auf 1%igem Agarosegel
unterzogen und das Ergebnis ist in Bahn 1 der 10 gezeigt.
Bahn M zeigt die kb-DNA-Leitermarker. Bahn 2 zeigt die gleichen
Ergebnisse wie Bahn 1, außer
dass die Exonukleasereaktion über
2 Minuten durchgeführt
worden war.
-
Die
Figur zeigt, dass eine Komplexausbildung mit der Rec A-Reaktion gegenüber Exo-behandeltem Vektor
und Insert gezeigt werden kann. Die Exo-Behandlung kann für eine oder
zwei Minuten sein. Obwohl die Länge
des linearisierten Abschnitts nicht direkt gemessen worden ist,
wird angenommen, dass es ungefähr 100
bis 200 Nukleotide pro Minute sind.
-
Beispiel 9
-
Die Reparaturreaktion
der ligierten DNA
-
Die
Probe vor der Elektrophorese in der Reaktion des Beispiels 1 wurde
mit T4-DNA-Polymerase-Reaktionslösung
und Klenow-Reaktionslösung
vermischt und bei 37°C
für 15
Minuten inkubiert. Die T4-DNA-Polymerase-Reaktionslösung enthält 0,25
mM 4dNTPs, 33 mM Tris-Acetat, pH 7,66 mM CH3CK,
10 mM (CH3COO)2Mg,
0,5 mM DTT, 0,01% BSA und 4 Einheiten T4-DNA-Polymerase. Nach der
Reaktion wurden 20 μl
TE-Pufferlösung
(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) hinzugegeben, um ein Gesamtvolumen von
100 μl zu
ergeben. Eine einfache Phenol/Chloroform-Extraktion, eine einfache
Chloroformextraktion und eine Ethanol-Präzipitation wurden zur Konzentrierung
und Isolierung der enthaltenen DNA-Moleküle durchge führt. Das DNA-Präzipitat
wurde in 10 μl
destilliertem Wasser gelöst.
Eine Elektrophorese auf 1,0%igem Agarosegel wurde für eine zweckmäßige Menge
davon durchgeführt.
Nach der Elektrophorese wurde eine Ethidiumbromidfärbung durchgeführt und
eine Fotografie wurde zur Beobachtung der DNA aufgenommen. Bahn
1 der 11 zeigt die DNA vor der Reaktion.
Bahn 2 zeigt die Ergebnisse nach der Reaktion mit T4-DNA-Polymerase. Bahn
M zeigt den kb-DNA-Leitermarker.
-
Die
Figur zeigt, dass obwohl die nahe der 6 kb-Position identifizierte
Bande durch die T4-Polymerasebehandlung verschwindet, die Bande
des Vektor/Insert-Komplexes um 10 kb nicht verschwindet.
-
Beispiel 10
-
Verifikation der ligerten
DNA
-
Die
Ergebnisse sind in 12 gezeigt. Bahn M zeigt den
kb-DNA-Leitermarker. Die gleiche Probe wie in Bahn 1 der 11 wurde
in E. coli aus der Zelllinie DH10B durch das gewöhnliche Elektroporationsverfahren
transformiert. Nach der Kultivierung über Nacht in einem Agar-Medium
mit Ampicillin, wurden Plasmide von den 500 Klonen auf der Platte
gesammelt und eine Agarosegelelektrophorese wurde durchgeführt. Das
Ergebnis ist in Bahn 1 gezeigt. Bahn 2 zeigt das Ergebnis für die gleiche
Probe wie in Bahn 2 der 11, die
genauso wie Bahn 1 behandelt worden war.
-
Die
Figur zeigt, dass DNA selbst nach einer T4-Polymerasebehandlung
kloniert worden war.
-
Beispiel 11
-
Der Effekt
der Endonuklease-Behandlung auf den DNA-Ligationskomplex
-
Vor
der Transformation der ligierten DNA (mit der teilweisen dreisträngigen Struktur)
in E. coli wurde sie mit verschiedenen Endonukleasen behandelt und
die Änderung
der Effizienz der dann folgenden Transformation wurde untersucht.
Der durch die Dreifachstrangausbildung gemäß dem Verfahren des Beispiels
1 ligierte DNA-Komplex wurde den folgenden Experimenten unterzogen;
Experiment 1: Reaktion von Cleavase (R) (Third Wave Technologies,
Inc.) (vermischt mit einer Reaktionslösung (Zusammensetzung unbekannt),
das Gesamtvolumen betrug 20 μl
und es wurde bei 54°C
für 60
Minuten inkubiert), Experiment 2: Reaktion mit Munc Bean Nuklease
(vermischt in einer S1-Nuklease-Reaktionslösung mit 30 Einheiten Munc
Bean Nuklease (TaKaRa), 30 mM Natriumacetat (pH 5,0), 100 mM NaCl,
1 mM (CH3COO)2Zn
und 5% Glycerin, Gesamtvolumen 20 μl, inkubiert bei 37°C für 30 Minuten),
Experiment 3: S1-Nukleasereakaion (vermischt in einer S1-Nukleasereaktionslösung mit
10 Einheiten S1-Nuklease (TaKaRa), 30 mM Natriumacetat (pH 4,6),
280 mM NaCl, 1 mM ZnSO4, Gesamtvolumen 20 μl, inkubiert
bei 37°C
für 10
Minuten), Experiment 4: BAL31-Nukleasereaktion (vermischt in einer
BAL31-Nukleasereaktionslösung
mit 10 Einheiten BAL31-Nuklease
(TaKaRa), 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 600 mM NaCl, 12 mM CaCl2, 12 mM MgCl2 und
1 mM EDTA, Gesamtvolumen 20 μl,
inkubiert bei 20°C
für 30
Minuten) und Experiment 5: keine Behandlung. Nach der Reaktion des
DNA-Ligatkomplexes mit den vorstehenden verschiedenen Enzymtypen
wurden 80 μl
einer TE-Pufferlösung
(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) hinzugegeben, um ein Gesamtvolumen von
100 μl zu
ergeben. Nach Ausführung
einer einfachen Phenol/Chloroform-Extraktion und einer einfachen
Chloroformextraktion wurde eine Ethanolpräzipitation durchgeführt und
die resultierende DNA wurde in 10 μl destilliertem Wasser aufgelöst. 2 ml
davon wurden in E. coli der Zelllinie DH10B mittels der gewöhnlichen
E lektroporation transformiert. Nach der Kultivierung über Nacht
in einem Agarmedium mit Ampicillin, IPTG und X-Gal wurden die resultierenden
weißen
Kolonien mit Insert-DNA gezählt.
Tabelle 2 zeigt nachstehend die erhaltenen Ergebnisse.
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Basierend
auf diesen Daten wurde die Transformationseffizienz eines jeden
Experiments abgeschätzt und
ist nachstehend in Tabelle 3 gezeigt.
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Tabelle
3 Die
Transformationseffizienz der in den Behandlungen eingesetzten modifizierten
Enzyme
-
Die
Tabellen 2 und 3 bestätigen,
dass die Transformationseffizienz durch Behandlung mit einer Exonuklease
vor der Transformation verbessert werden kann.
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Beispiel 12
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cDNA-Ligation durch die
Rec A-Reaktion
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Eine
annähernd
4 kbp lange menschliche Gehirn-cDNA (eine cDNA, welche die Hühnchen-Myosin-artige
Sequenz umfasst; GenBank accession No. AB023217) und eine 0,9 kbp
cDNA, hergestellt basierend auf seiner 5'-Endsequenz durch das 5'-RACE-Verfahren,
wurden durch die Rec-A-Reaktion ligiert. Die Reaktionsstrategie
ist in 13 gezeigt. Wie in 13(A) gezeigt ist, besitzen die 4 kbp cDNA und
die 0,9 kbp cDNA überlappende
gemeinsame Sequenzen. Wie in 13(B) gezeigt
ist, wurde die 0,9 kbp cDNA aus dem Vektor durch das Verdauungsenzym
NotI/SalI herausgeschnitten und die 4 kbp cDNA wurde mit SalI und
Exonuklease III behandelt und dann wurde die Ligationsreaktion zwischen
diesen cDNAs durchgeführt.
Eine 4,9 kbp cDNA wurde als das Endprodukt der Reaktion erhalten,
wie in 13(C) gezeigt ist.
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Die
spezifischen Details der Reaktion sind folgendermaßen. Für die 4
kbp cDNA, kloniert mit der Stelle des Verdauungsenzyms NotI/SalI,
wurde das eingesetzt, welches durch das Verdauungsenzym SalI gespalten worden
war. Dies führt
zu einer an dem 5'-Ende
gespaltenen 4 kbp cDNA. Ferner waren durch Verwendung von Exonuklease
III beide Enden vorstehende 5'-Enden.
Genauer gesagt wurden 100 μl
einer Exonuklease-Reaktionslösung
(50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM MgCl2, 10
mM 2-Mercaptoethanol und 180 Einheiten Exonuklease III), die 1000
ng der DNA enthielten, bei 37°C
für 1 Minute
zur Reaktion gebracht. Die DNA wurde konzentriert und die Enzyme
wurden durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Präzipitation
deaktiviert. 0,9 kbp cDNA wurde basierend auf dem 5'-RACE-Verfahren unter
Verwendung von SuperScript Plasmid System (Gibco BRL) hergestellt
und dann wurde die 0,9 kbp cDNA, welche in das Plasmid pBluescript
(SK+) subkloniert worden war, mit dem Verdauungsenzym BssHII herausgeschnitten.
In beiden Enden dieser cDNAs ist eine annähernd 50 bp lange zusätzliche
Sequenz vorhanden. Die Ligationsreaktion der vorstehenden zwei cDNAs
wurde folgen dermaßen
ausgeführt.
In der Dreistrang-Ausbildungsreaktion enthielten 40 μl der Reaktionslösung 200
ng 0,9 kb cDNA, 600 ng 4 kbp cDNA, 6,0 μg Rec A-Protein, 4,8 mM ATP-γS, 30 mM
Tris-Acetat (pH 7,2), 1 μg
Target-DNA und 21,5 mM Magnesiumacetat. Als nächstes wurden 0,5% (W/Vol)
SDS und 0,7 mg/ml Proteinase K hinzugegeben und es wurde bei 37°C für 30 Minuten
inkubiert, und dann wurden 60 μl TE-Pufferlösung (10
mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) hinzugegeben, um ein Gesamtvolumen von 100 μl zu ergeben. Nach
einer einfachen Phenol/Chloroform-Extraktion und einer einfachen
Chloroform-Extraktion, gefolgt von einer Ethanol-Präzipitation,
wurde die resultierende DNA in 10 μl destilliertem Wasser gelöst. 2 μl davon wurden in
E. coli der Zelllinie DH10B transformiert. Dann wurde nach einer
Kultivierung über
Nacht in einem Agar-Medium mit Ampicillin die Nukleotidsequenz der
in den resultierenden Kolonien enthaltenen Plasmid-DNA untersucht.
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Als
Ergebnis der Untersuchung der 30 Kolonien mit Insert-DNA umfassenden Plasmiden
wurde ein Plasmid mit dem beabsichtigten ligierten DNA-Insert, in
welchen die 0,9 kbp cDNA und die 4 kbp cDNA ligiert vorlagen, erhalten. SEQUENZLISTE
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein DNA-Ligationsverfahren. Genauer
gesagt wird ein DNA-Komplex, umfassend eine dreisträngige Struktur
in jedem der Enden der doppelsträngigen
DNAs, wobei eine einen einsträngigen
Abschnitt am Ende und die andere keinen einsträngigen Abschnitt am Ende besitzt,
in Gegenwart eines homologen, rekombinanten Proteins ausgebildet
wird. Außerdem
wird gemäß dem Bedarf
der DNA-Komplex in Gastzellen eingeführt und diese Zellen werden
kultiviert.
