DE19718705A1

DE19718705A1 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl von Transgenkopien in gentechnisch veränderten Zellen

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Publication number: DE19718705A1
Application number: DE19718705A
Authority: DE
Inventors: Christoph Dr Fiehn; Nina Wettschureck; Alexandra Krauthoff
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-05-02
Filing date: 1997-05-02
Publication date: 1998-11-05
Also published as: WO1998050580A3; AU8208698A; WO1998050580A2

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl von Transgenkopien in gentechnisch veränderten Zellen. Dies ermöglicht erfindungsgemäß ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl von gentechnisch veränderten Zellen anhand der Anzahl der Transgenkopien.

Als somatische Gentherapie wird das Einschleusen von genetischem Material in den Organismus bezeichnet. Bei der somatischen Gentherapie werden genetische Defekte in Körperzellen korrigiert oder Gene, die therapeutisch nützliche Genprodukte codieren, in Zellen eingeschleust, wobei die gentherapeutischen Veränderungen nicht an Nachkommen weitervererbt werden. Das Einschleusen des genetischen Materials, hier als Transgen bezeichnet, kann sowohl ex vivo (in vitro) als auch in vivo vorgenommen werden. Bei dem ex vivo-Verfahren werden die Zielzellen außerhalb des Körpers kultiviert und nach erfolgter gentechnischer Manipulation anschließend in den Patienten rücküberführt. Dazu wird in Zellkultur mittels eines Selektionsgens auf die erfolgreich manipulierten Zellen selektioniert. Beim in vivo-Verfahren wird das genetische Material direkt in den Körper des Patienten injiziert und mittels eines geeigneten Transportvehikels, z. B. eines modifizierten Virus, in die Zielzellen eingeschleust. Die Wirksamkeit der somatischen Gentherapie wird durch eine begrenzte Lebensdauer der transfizierten Zellen beeinträchtigt. Als Zielzellen der somatischen Gentherapie sind daher Zellen mit besonders langer Lebensdauer, wie z. B. selbsterneuernde hämatopoetische Stammzellen besonders geeignet. Durch die Verwendung dieser Zellen wird die somatische Gentherapie optimiert.

Für die Auswahl der gentechnisch manipulierten Zielzellen in Zellkultur als auch für die Überwachung (engl. monitoring) der somatischen Gentherapie nach erfolgter Überführung des Transgens in den Patienten ist es wichtig, einen empfindlichen und spezifischen Nachweis der transfizierten Zielzellen in Gewebe und Blut von Patienten bzw. Versuchstieren zu haben, mit dem die Anzahl der genetisch stabil veränderten Zellen und die Anzahl der eingeschleusten Transgenkopien pro Zelle bestimmt werden kann. Bisher führt man die Überwachung der somatischen Gentherapie anhand der semiquantitativen Bestimmung der Transkripte (mRNA) des eingeschleusten Transgens durch (Li et al., 1991, J.Exp.Med. , 174, 1259). Dazu wird die Polymerasekettenreaktion (PCR) nach einer Reverse Transkriptase Reaktion und anschließender Southern-Blot-Hybridisierung verwendet. Falls eine quantitative Bestimmung der genetisch veränderten Zielzellen durchgeführt werden soll, verwendet man semiquantitative Methoden, z. B. den Vergleich der erhaltenen PCR-Bande nach Gelelektrophorese mit einem in einer parallelen PCR amplifizierten Haushaftsgen (engl.: housekeeping gene) etwa dem β- Actin-Gen. Für die Bestimmung der Transkriptionseffizienz bei in vitro transfizierten Zellen werden üblicherweise die nach dem Selektionsschritt überlebenden Zielzellen gezählt oder die transfizierten Zellen werden mittels eines Reportergens wie z. B. lacZ, das extra in den transfizierten Vektor kloniert werden muß, sichtbar gemacht.

Weder durch den Nachweis der Transgentranskripte mittels konventioneller PCR noch mittels Southern-Blot-Analyse läßt sich jedoch die Kopienzahl eines Transgens genau bestimmen. Die häufig verwendeten semiquantitativen Methoden wie der Vergleich der Banden nach einer PCR mit einem β-Actin-Gen und mit dem nachzuweisenden Transgen sind unzuverlässig und ungenau, da hier die Ergebnisse zweier unterschiedlicher PCR-Ansätze mit unterschiedlichen Primerpaaren verglichen werden. Das Verfahren zum Nachweis von in vitro transfizierten Zellen ist langwierig oder setzt einen speziell konstruierten Vektor mit einem Reportergen wie z. B. dem lacZ-Gen voraus.

Der vorliegenden Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, das einen sensitiven und quantitativen Nachweis der Anzahl der Transgenkopien in gentechnisch veränderter Zellen ermöglicht. Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren bereitzustellen, das einen sensitiven und quantitativen Nachweis unabhängig vom Typ des Vektors und des Transgens ermöglicht. Eine weitere Aufgabe ist es, ein Verfahren bereitzustellen, das einen sensitiven und quantitativen Nachweis gentechnisch veränderter Zellen anhand der Anzahl der Transgenkopien ermöglicht. Weiterhin soll das Verfahren unabhängig vom Typ des Vektors und des Transgens und innerhalb eines Tages durchführbar sein.

Die erste Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereistellung eines Verfahrens zur quantitativen Bestimmung der Anzahl von Transgenkopien in gentechnisch veränderten Zellen gelöst, umfassend: a) das Isolieren von DNA, hier Ziel-DNA genannt, aus Zellen, b) das Durchführen einer kompetitiven PCR unter Verwendung der in Schritt a) isolierten Ziel-DNA und einer Standard-DNA, wobei als Standard-DNA ein deletiertes DNA-Fragment der Ziel- DNA eingesetzt wird, und c) dem Nachweis der Amplikonkonzentration mittels Gelelektrophorese. Besonders bevorzugt ist ein Verfahren, in dem eine zweite PCR mit verschachtelten (engl.: nested) Primern durchgeführt wird. Diese zweite PCR steigert die Sensitivität und Spezifität der DNA-Vervielfältigung erheblich. Insbesondere bevorzugt ist ein Verfahren, in dem für die kompetitive PCR die Standard-DNA und die Ziel-DNA von einem Selektionsgen stammen. Weiterhin besonders bevorzugt ist ein Verfahren, in dem das Selektionsgen das Neomycin-Resistenzgen ist. Die Standard-DNA kann jede beliebige Größe haben. Die in die Standard-DNA eingeführte Deletion kann ebenfalls jede beliebige Größe haben. Bevorzugt ist jedoch eine Standard-DNA, die einfach vervielfältigt werden kann und sich dabei in ihrer Größe von der Ziel-DNA deutlich unterscheidet, so daß die Amplikons in einem üblichen Agarosegel in einer Gelelektrophorese gut sichtbar getrennt werden. In einer besonderen Ausführungsform ist die Standard-DNA ein 717 Basenpaar (Bp) großes Neomycin-DNA-Fragment mit einer 103 Bp großen Deletion gemäß SEQ ID NO. 1.

Die zweite Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man nach a) dem Isolieren von DNA aus Zellen, b) dem Durchführen einer kompetitiven PCR unter Verwendung der in Schritt a) isolierten Ziel-DNA und einer Standard-DNA, wobei als Standard-DNA ein deletiertes DNA-Fragment der Ziel-DNA eingesetzt wird, und c) dem Nachweisen der Amplikonkonzentration mittels Gelelektrophorese noch d) anhand der Anzahl der Transgenkopien die Anzahl der gentechnisch veränderten Zellen bestimmt. In einer besonderen Ausführungsform stammen die gentechnisch veränderten Zellen aus der Körperflüssigkeit oder aus dem Gewebe eines Patienten oder Versuchtieres. Besonders bevorzugt ist ein Verfahren, in dem eine zweite PCR mit verschachtelten (engl.: nested) Primern durchgeführt wird. Diese zweite PCR steigert die Sensitivität und Spezifität der DNA-Vervielfältigung erheblich. Insbesondere bevorzugt ist ein Verfahren, in dem für die kompetitive PCR die Standard-DNA und die Ziel-DNA von einem Selektionsgen stammen. Weiterhin besonders bevorzugt ist ein Verfahren, in dem das Selektionsgen das Neomycin-Resistenzgen ist. Die Standard-DNA kann jede beliebige Größe haben. Die in die Standard-DNA eingeführte Deletion kann ebenfalls jede beliebige Größe haben. Bevorzugt ist jedoch eine Standard-DNA, die einfach vervielfältigt werden kann und sich dabei in ihrer Größe von der Ziel-DNA deutlich unterscheidet, so daß die Amplikons in einem üblichen Agarosegel in einer Gelelektrophorese gut sichtbar getrennt werden. In einer besonderen Ausführungsform ist die Standard-DNA ein 717 Bp großes Neomycin-DNA-Fragment mit einer 103 Bp großen Deletion gemäß SEQ ID NO. 1.

Die vorliegende Erfindung hat die folgenden Vorteile:

- ein sensitiver und quantitativer Nachweis der Anzahl von Transgenkopien in transfizierten Zellen in Zellkultur,
- die Auswahl von transfizierten Zellen mit einer gewünschten Anzahl von Transgenkopien zur Rücküberführung in den Patienten oder ein Versuchstier,
- eine Überwachung der Gentherapie durch die Bestimmung der Anzahl von gentechnisch veränderten Zellen insbesondere in Körperflüssigkeiten und Geweben von Patienten,
- ein schneller und sicherer Nachweis der Transgenkopien und der gentechnisch veränderten Zellen ohne Verwendung von Radioaktivität oder Southern-Blot-Analyse,
- ein technisch einfacher Nachweis aufgrund der Verwendung von DNA statt mRNA,
- ein von einem Selektionsgen unabhängiger Nachweis, da die kompetitive PCR mit Standard- und Ziel-DNA jedes Transgens durchgeführt werden kann.

Die Abbildungen dienen der Erläuterung der Erfindung:

Abb. 1 ist eine schematische Darstellung des overlap extension deletion-Verfahrens zur Herstellung einer 717 Bp langen Neomycin-Resistenzgen-Standard-DNA, die gegenüber dem normalen Neomycin-Resistenzgen eine 103 Bp lange Deletion enthält.

Abb. 2 zeigt die Nucleinsäuresequenz der 717 Bp langen Neomycin-Resistenzgen- Standard-DNA gemaß SEQ ID NO. 1.

Abb. 3 zeigt eine schematische Darstellung des Ergebnisses der Gelelektrophorese zur Feinabstimmung der kompetetiven verschachtelten PCR zur Einstellung der Verdünnungsstufen mit der 717 Bp langen Neomycin-Resistenzgen-Standard-DNA. Die Zahlenangaben 1×10^-8 usw. geben die Verdünnungen der Standard-DNA in den jeweiligen PCR-Reaktionen an. Das 597 Bp lange Amplikon stammt von der Ziel-DNA. Das 494 Bp lange Amplikon stammt von der Standard-DNA.

Abb. 4 zeigt das Ergebnis einer kompetitiven verschachtelten PCR mit der 717 Bp langen Neomycin-Resistenzgen-Standard-DNA und einer aus Gewebe isolierten Ziel-DNA. Die Zahlenangaben 1×10^-8 usw. geben die Verdünnungen der Standard-DNA in den jeweiligen PCR-Reaktionen an. Das 597 Bp lange Amplikon stammt von der Ziel-DNA. Das 494 Bp lange Amplikon stammt von der Standard-DNA.

Abb. 5 zeigt die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmte Anzahl von Transgenkopien in verschiedenen Organen einer Maus 6 Wochen nach einer Knochenmarktransplantation. "KM" bedeutet Knochenmark, "Lk mes" bedeutet mesenteriale Lymphknoten.

Der Begriff "Transgen" umfaßt jedes in eine Zelle eingeführte fremde genetische Material. Dabei kann das Transgen ein funktionstüchtiges oder ein defektes Gen oder ein Genfragment umfassen. Beispielsweise kann ein funktionsfähiges Gen ein therapeutisch nützliches Cytokin wie IL-2 codieren oder einen Wachstumsfaktor wie den Granulocyten/Makrophagen koloniestimulierenden Faktor. Ferner kann das Transgen ein Gen umfassen, das ein bei einer angeborenen Erbkrankheit nicht funktionsfähiges Gen z. B. das bei der zystischen Fibrose defekte CFTR-Gen (cystic fibroses transmembrane conductance regulator), ersetzt. Weiterhin kann der Begriff "Transgen" auch ein Selektionsgen umfassen, z. B. das Neomycin- Resistenzgen oder die die Bleomycinresistenz, die Puromycinresistenz, oder die Ampicillinresistenz codierenden Gene. Ferner kann der begriff Transgen auch die Bestandteile der Vektor-Nucleinsäure, z. B. den viralen langen terminalen Repeat(LTR)-Promotor umfassen.

Der Begriff "Amplikon" bedeutet einen DNA-Abschnitt, der in einer PCR vervielfältigt wurde. Der Begriff "Standard-DNA" umfaßt ein partiell deletiertes DNA-Fragment, das bis auf die Deletion identisch zum nachzuweisenden eingeführten fremden genetischen Material, d. h. dem Transgen ist. Der Begriff "Ziel-DNA" umfaßt das nachzuweisende Transgen.

Für eine kompetitive PCR wird eine Ziel-DNA und eine Standard-DNA benötigt. Die Standard-DNA ist eine Kopie des nachzuweisenden Transgen. Sie enthält jedoch eine genau definierte Deletion, wobei die Deletion von DNA-Sequenzen flankiert wird, die mit der Ziel- DNA identisch sind. Die Ziel-DNA, d. h. das nachzuweisende Transgen, kann ein therapeutisches funktionsfähiges, defektes oder ein Genfragment oder ein Selektionsgen wie das Neomycin-Resistenzgen sein. Das Neomycin-Resistenzgen wird in den meisten Vektoren z. B. viralen Vektoren oder Genfähren, als Selektionsgen verwendet. Mit Hilfe einer Methode, die von Ho et al., 1989, Gene 77, 51-68, beschrieben wurde, und als overlap extension deletion bezeichnet wird, kann man ein deletiertes Neomycin-DNA-Fragment herstellen, das in der kompetitiven PCR als Standard-DNA eingesetzt wird.

Für die kompetitive PCR wird ein Primerpaar benötigt, oder falls eine zweite PCR durchgeführt werden soll, wird ein zweites verschachteltes (engl.: nested) Primerpaar benötigt, das innerhalb des ersten Primerpaares liegt. Die zweite PCR steigert die Sensitivität und Spezifität der DNA-Vervielfältigung erheblich. Das Reaktionsgemisch der kompetitiven PCR umfaßt neben den üblichen Puffern, Nucleotiden und DNA-Polymerasen folgende Bestandteile: die Ziel-DNA, die Standard-DNA und das erste Primerpaar, wobei die Standard-DNA mit der Ziel-DNA um die Bindung der Primer konkurriert. Wird eine zweite PCR durchgeführt, so gibt man zu einem Aliqout der durchgeführten ersten PCR die verschachtelten zweiten Primer hinzu. Es wird dann ein Amplikon erzeugt, das der Sequenz der Primer und der dazwischenliegenden DNA-Sequenz entspricht. Setzt man die Standard-DNA in Titerstufen in die PCR ein, entspricht die Anzahl der Amplikons der Standard-DNA dann der Anzahl der Kopien der Ziel-DNA, wenn die Konzentration der Amplikons der Standard-DNA und der Ziel-DNA in einer Titerstufe identisch ist. Die Standard-DNA und die Ziel-DNA ergeben in der PCR aufgrund der Deletion in der Standard-DNA zwei unterschiedlich große Amplikons, die in einem üblichen Agarosegel nach der Gelelektrophorese gut sichtbar aufgetrennt werden können. Anhand der eingesetzten DNA-Mengen läßt sich dann in bekannter Weise die Anzahl der Transgenkopien in den Zellen berechnen. Die Konzentration der unverdünnten Standard- DNA wird photometrisch bestimmt. Anhand der Länge der Standard-DNA (in Basenpaaren), der durchschnittlichen Molmasse einer Base (330 g/mol), der Avogadro'schen Zahl (6×10²³ Teilchen/mol) und der bestimmten Konzentration der Standard-DNA wird die Anzahl der Kopien der Standard-DNA in der unverdünnten Probe bzw. den Verdünnungen berechnet. Die allgemeine Formel zur Berechnung der Anzahl der Kopien der Standard-DNA in der unverdünnten Probe lautet:

wobei C die photometrisch bestimmte Konzentration der Standard-DNA in g/ml, und L die Länge der Standard-DNA ist.

Für den Nachweis der Transkriptionseffizienz in vitro und die Langzeitpräsenz von transfizierten Zellen in vivo ist eine erfindungsgemäße quantitative Bestimmung der Anzahl von Transgenkopien nützlich. Die Transkriptionseffizienz läßt sich in vitro durch unterschiedliche Stimulation der Zielzellen mit Wachstumsfaktoren oder Addieren von Substanzen wie Polybrene, die die virale Transfektion erleichtern, verbessern. Weiterhin ist die Konstruktion des Virus von entscheidender Bedeutung für das Erreichen einer hohen Transkriptionseffizienz. In vivo sind die Form der Applikation von transfizierten Zellen, die eventuelle Konditionierungstherapie, z. B. bei Knochenmarktransplantationen und die Wahl der Zielzellen entscheidend, um eine Langzeitpräsenz von transfizierten Zellen zu erreichen. Um die Effizienz der verschiedenen Methoden in vitro und in vivo zu bestimmen und zu optimieren, benötigt man die Möglichkeit, die Anzahl der transfizierten Zellen kontinuierlich schnell und genau zu bestimmen. Bei der Therapie mit adenoviralen Vektoren entsteht häufig eine Immunreaktion gegen virale Proteine, die die Lebensdauer der transfizierten Zellen verkürzt. Da die therapeutische Wirkung mit der Abnahme der transfizierten Zellen nachläßt, muß man die Menge der transfizierten Zellen z. B. bei der Behandlung der zystischen Fibrose in der bronchialen Mukosa messen, um rechtzeitig einen nächsten Zyklus der Gentherapie durchzuführen. Alternativ kann man versuchen die Zerstörung der transfizierten Zellen durch das Immunsystem mit Hilfe von immunsuppressiver Therapie zu verhindern. Für diese nützlichen und wichtigen klinischen Anwendungen aber auch für wissenschaftliche Untersuchungen zur Verbesserung der Methoden zur Transfektion und Gentherapie ist das erfindungsgemäße Verfahren nützlich.

Ein typisches aber nicht beschränkendes Beispiel für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Standard-DNA-Fragment gemäß SEQ ID NO. 1 ist nachfolgend beschrieben.

Beispiel 1 Herstellung einer deletierten Standard-DNA des Neomycin-Resistenzgens

Für das erfindungsgemaße Verfahren wurde die Standard-DNA des Neomycin-Resistenzgens mittels overlap extension (Ho et al., 1989, Gene 77, 51-68) hergestellt. Diese Methode basiert auf der Polymerasekettenreaktion (PCR) und ermöglicht die Verknüpfung zweier DNA-Stücke anhand von Primern mit überhängenden zueinander komplementären DNA-Enden. Zunächst wurden die Randstücke der Standard-DNA in zwei getrennten Reaktionen mit der Matrize des normalen Neomycin-Resistenzgens amplifiziert wobei ein Abschnitt von 103 Bp ausgespart blieb. Für diesen Amplifikationsschritt wurden die Primer Neo350 (5'- AAGAGACAGGATGAAGGATCG-3') und Neo1206 (5'-GCCATGATGGATACTTTCT-3') bzw. Neo1150 (5'-CAGAAGAACTCGTCAAGA-3') und Neo1309 (5'- AAGTATCCATCATGGCCTTGTCGATCAGGATGAT-3') kombiniert. In einem zweiten Amplifikationsschritt wurden die in üblicher Weise aufgereinigten Amplikons dieser Reaktionen als Ausgangsmaterial für eine PCR mit den Primern Neo350 und Neo1150 verwendet. Da Primer Neo1309 so gewählt wurde, daß die 15 Basen seines 5'-Endes komplementär zu Primer Neo1206 sind, kommt es im ersten Zyklus zur Anlagerung der beiden Amplikons. In den folgenden Zyklen wird das entstandene verkürzte Neomycin-DNA- Fragment mit den Primern Neo350 und Neo1150 amplifiziert. Die Reaktionsbedingungen der einzelnen PCR waren dieselben wie in Beispiel 2 angegeben. Das Amplikon, also die Standard- DNA, hatte eine Länge von 717 Bp mit einer 103 Bp großen Deletion gegenüber der normalen Neomycin-Sequenz. Die Deletion wurde durch eine in üblicher Weise durchgeführte DNA-Sequenzierung überprüft. Wie erwartet war die Sequenz zwischen den ursprünglichen Basen 1206 und 1310 deletiert. Sowohl der Primer Neo350 (an Position 15) als auch der verschachtelte Primer Neo450 (an Position 5) enthielten gegenüber der normalen Neomycin- DNA-Sequenz ein zusätzliches Adenosin-Nucleotid. Es stellte sich heraus, daß nur mit diesen zusätzlichen Nucleotiden eine Vervielfältigung der Matrizen-DNA durchgeführt werden konnte. Das könnte an der eventuell fehlerhaften Neomycin-Sequenz liegen, die aus der Husar- Datenbank stammt und deren Sequenz nicht durch eine Sequenzierung überprüft wurde.

Beispiel 2 Durchführung der kompetitiven PCR

Zunächst wurde für die Standard-DNA eine Verdünnungsreihe mit 36 verschiedenen Verdünnungsstufen angelegt (5×10^-4, 2×10^-4, 1×10^-4, 5×10^-5usw. bis 1×10^-15). Die Konzentration der unverdünnten Standard-DNA wurde in üblicher Weise photometrisch bestimmt. Anhand der Länge der Standard-DNA (717 Bp), der durchschnittlichen Molmasse einer Base (330 g/mol), der Avogadro'schen Zahl (6×10²³ Teilchen/mol) und der bestimmten Konzentration der Standard-DNA (55 mg/ml) wurde die Anzahl der Kopien der Standard-DNA in der unverdünnten Probe bzw. den Verdünnungen anhand der allgemeinen Formel

berechnet, wobei C die photometrisch bestimmte Konzentration der Standard-DNA in g/ml, und L die Länge der Standard-DNA ist. Die Konzentration der Standard-DNA in der unverdünnten Probe betrug 7,036 × 10¹⁴ Kopien pro ml.

Nach der in üblicher Weise durchgeführten Isolierung der Ziel-DNA aus Gewebeproben wurde dann die Standard-DNA in den Verdünnungsstufen 10^-8 10^-9, 10^-10, 10^-10, 10^-11 und 10^-12 in die PCR eingesetzt, um den Äquivalenzpunkt zwischen der Standard-DNA und der Ziel-DNA grob zu bestimmen. Zur genauen Einstellung wurde eine weitere PCR mit kleineren Verdünnungsschritten von 1×10^-8 bis 1×10^-10 durchgeführt. Es wurden stets 200 ng Ziel-DNA und 1 µl Standard-DNA-Verdünnungen eingesetzt.

Die quantitative Bestimmung der Anzahl der Transgenkopien, bzw. der Anzahl der Zellen, die das Transgen enthielt erfolgte in zwei aufeinanderfolgenden PCR-Runden, wobei die zweite PCR mit verschachtelten Primern durchgeführt wurde. Für die erste PCR-Runde wurden für die jeweiligen Verdünnungen folgende Reaktionen angesetzt:

5 µl 10× Puffer (AGS, Heidelberg)
20 pmol Neo350 (5'-AAGAGACAGGATGAAGGATCG-3')
20 pmol Neo1150 (5'-CAGAAGAACTCGTCAAGA-3')
2 mM dNTPs
1 µl Standard-DNA-Verdünnungen
100 ng Ziel-DNA
2 U Taq-Polymerase (AGS, Heidelberg)
Aquq dest. ad 50 µl.

Die Reaktion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:

40 Zyklen:
4 min 94°C und
30 sec 94°C, 60 sec 60°C, 180 sec 72°C und
10 min 72°C.

Nach der ersten PCR wurde ein 717 Bp großem Amplikon, das von der Standard-DNA stammte und ein 820 Bp großes Amplikon, das von der Ziel-DNA stammte, erhalten.

Für die zweite PCR-Runde mit den verschachtelten Primern Neo450 und Neo1027 wurden die Proben der durchgeführten ersten PCR-Ansätze jeweils 1 : 100 verdünnt und die folgenden Reaktionen angesetzt:

5 µl 10× Puffer (AGS, Heidelberg)
20 pmol Neo450 (5'-ACAAACAGACAATCGGCTGCT-3')
20 pmol Neo1027 (5'-GCCAACGCTATGTCCTGATA-3')
2 mM dNTPs
5 µl 1 : 100 Verdünnung der Proben der ersten durchgeführten PCR-Ansätze
2 U Taq-Polymerase (AGS, Heidelberg)
Aquq dest ad 50 µl.

Die zweite PCR wurde bei den selben Bedingungen wie die erste PCR-Runde durchgeführt. Die Auswertung der PCR nach Gelelektrophorese auf einem üblichen 1,5% Agarosegel nach Anfärbung mit Ethidiumbromid zeigte ein 494 Bp großes Amplikon, das von der Standard- DNA stammte und ein 597 Bp großes Amplikon, das von der Ziel-DNA stammte. Die Anzahl der Standard-DNA und Ziel-DNA war bei einer Konzentration der Standard-DNA von 1×10^-9 gleich, d. h. dieser Verdünnungsansatz ergab nach der Gelelektrophorese gleich starke Banden der Amplikons, enthielt also die Moleküle in gleicher Kopienzahl. Da die Anzahl der Standard- DNA in der unverdünnten Probe 7,036×10¹⁴ Kopien pro ml betrug, enthielt die Verdünnung 1×10⁹ Kopien Standard-DNA als auch Ziel-DNA pro ml.

Beispiel 3 Anwendungsbeispiel

Für eine quantitative Bestimmung der Anzahl von Transgenkopien in gentechnisch veränderten Zellen wurde DNA aus mit retroviralen Vektoren transfizierten Zellkulturen sowie Blut, Knochenmark und anderen Geweben gentherapeutisch behandelter Versuchstiere in üblicher Weise gewonnen. Zur Aufreinigung der genomischen DNA wurde das QIAamp Blood Kit der Firma Qiagen, Hilden, nach den Angaben des Herstellers verwendet. Als ein typisches aber nicht beschränkendes Beispiel wird das erfindungsgeinäße Verfahren zur Bestimmung der Transgenkopienanzahl in den Organen (Knochenmark, Leber, mesenteriale Lymphknoten, Milz, Thymus) einer Maus 6 Wochen nach einer Knochenmarktransplantation beschrieben.

Das Knochenmark einer Maus war vor Transplantation ex vivo nach dem folgenden Protokoll mit einem Neomycin-Resistenzgen tragenden retroviralen Vektor transfiziert worden. DBA/1- Mäuse wurden in üblicher Weise mit 150 mg/kg Körpergewicht 5-Fluoruracil i.p. behandelt, um frühe hämatopoetische Stammzellen anzureichern. Fünf Tage später wurde das Knochenmark aus Femurae und Tibiae entnommen und für zwei Tage mit der Verpackungszellinie GP+E 86 (Y. Chernajovsky, Kennedy Institute of Rheumatology, London) in Gegenwart von IL-3 (20 ng/ml), IL-6 (15 ng/ml), GM-CSF (1 ng/ml), SCF (100 ng/ml) und Polybrene (6 µg/ml) cokultiviert. Die Verpackungszellinien produzieren den retroviralen Vektor MBAE, der als Transgen das Neomycin-Resistenzgen und das murine IL- 4-Gen trägt. Das Neomycin-Resistenzgen diente als Selektionsmarker, damit in der in Gegenwart von Geneticin (0,5 mg/ml) kultivierten GP+E 86-Kultur nur virustragende Zellen wachsen. Nach zwei Tagen wurde das Knochenmark in bekannter Weise durch Spülen der Cokulturen wiedergewonnen und intravenös in syngene Empfangermäuse injiziert, die vorher durch eine Ganzkörperbestrahlung mit 9 Gray konditioniert worden waren. Die Mäuse wurden entweder nach 13 oder 39 Tagen getötet und die oben genannten Organe entnommen. Die DNA wurde wie beschrieben isoliert und eine quantitative PCR wie beschrieben durchgeführt. Es wurden jeweils 200 ng der Ziel-DNA und je 1 µl der Standard-DNA des Neomycin- Resistenzgens in Verdünnungsstufen bis zu 1×10^-12 eingesetzt. Nach 39 Tagen enthielt z. B. die Leber pro 200 ng Ziel-DNA über 30000 Kopien der Ziel-DNA. Anhand der isolierten Zellen, aus denen die Ziel-DNA aufgereinigt wurde, kann dann ferner die Anzahl der Transgen enthaltenden Zellen berechnet werden.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl von Transgenkopien in gentechnisch veränderten Zellen, umfassend:

a) Isolieren von DNA aus Zellen oder Gewebe,
b) Durchführen einer kompetitiven PCR unter Verwendung der in Schritt a) isolierten Ziel-DNA und einer Standard-DNA, wobei als Standard-DNA ein deletiertes DNA-Fragment der Ziel-DNA eingesetzt wird, und
c) Nachweisen der Amplikonkonzentration mittels Gelelektrophorese.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt b) eine zweite PCR mit verschachtelten Primern durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Standard-DNA und die Ziel-DNA in Schritt b) von einem Selektionsgen stammen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Standard-DNA und die Ziel-DNA in Schritt b) vom Neomycin-Resistenzgen stammen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Standard-DNA ein 717 Bp großes Neomycin- DNA-Fragment gemäß SEQ ID NO. 1 ist.

6. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Anzahl von gentechnisch veränderten Zellen anhand der Anzahl der Transgenkopien, umfassend:

a) Isolieren von DNA aus Zellen oder Gewebe,
b) Durchführen einer kompetitiven PCR unter Verwendung der in Schritt a) isolierten Ziel-DNA und einer Standard-DNA, wobei als Standard-DNA ein deletiertes DNA-Fragment der Ziel-DNA eingesetzt wird,
c) Nachweisen der Amplikonkonzentration mittels Gelelektrophorese, und
d) Berechnen der Anzahl der gentechnisch veränderten Zellen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei in Schritt b) eine zweite PCR mit verschachtelten Primein durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Standard-DNA und die Ziel-DNA in Schritt b) von einem Selektionsgen stammen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Standard-DNA und die Ziel-DNA in Schritt b) vom Neomycin-Resistenzgen stammen.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Standard-DNA ein 717 Bp großes Neomycin- DNA-Fragment gemaß SEQ ID NO. 1 ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei die Zellen aus Körperflüssigkeit oder aus Gewebe eines Patienten oder Versuchtieres stammen.

12. Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO. 1.