PT92506A - Metodo para o enriquecimento e clonagem de dna contendo uma insercao ou correspondendo a uma delecao - Google Patents

Description

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METODO PARA O ENRIQUECIMENTO E CLONAGEM DE DNA CONTENDO UMA INSERÇÃO OU CORRESPONDENDO A UMA DELEÇÃO

Referência cruzada a pedidos de patente relacionados

Este pedido e uma continuação em parte do Pedido de Patente U.S. No. de Série 07/280,866 (entregue em 7 de Dezembro de 1988).

Campo do Invento 0 invento refere-se à tecnologia de DNA recombinante e mais especificamente, a um método para o enriquecimento e clonagem de uma molécula de ácido nucleico pretendido.

Fundamento do Invento A capacidade de identificar e clo-nar uma sequência genética particular pretendida de um vírus procariota ou eucariota é de grande importância para a biolo gia molecular e medicina. Tais sequências de genes clonadas podem ser usadas no diagnóstico da presença de uma doença ou da predisposição de um paciente para manifestar uma doen ça. Tais sequências de genes clonadas podem também ser usadas para expressar um produto genético pretendido e portanto podem ser potencialmente usadas em aplicações que variam da catálise à substituição de genes. 0 estudo de tais produtos expressos pode trazer elucidação à patologia e tratamento de doenças humanas.

Foi desenvolvida uma variedade de métodos para o isolamento e clonagem de sequências de genes pretendidos. Os métodos iniciais permitiram apenas a identi^ ficação e isolamento de sequências genéticas que possuíam -4-

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uma propriedade única como seja a proximidade relativamente a um sítio de integração de profago, capacidade para auto-replicação, peso molecular distinto, grande abundância, etc. (The Bacteriophage Lambda,A.D.Hershey, d., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1971); Miller, J.H. Experimen ts in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1972); Molecular Biology of the Gene, Watson, J.D. et_ al_ (4a. ed.) Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA ( 1 987 ); Darnell, J. et_ al. Molecular Biology, Scientif ic American Books, NY, NY (1986)). Devido a estes métodos se basearem em propriedades distintas de uma sequência genética, eles são largamente (ou completamente) inadequados para a identificação e clonagem da maior parte das sequências genéticas.

Para identificar sequências genéti^ cas pretendidas que não possuam uma propriedade distinta foram explorados sistemas genéticos bem caracterizados (tais como células de Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, de milho, de mamífero, etc.). De acordo com este método as células são mutagenizadas por meios químicos (tais como luz UV, hidroxilamina, etc. (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1971)) ou genéticos (tais como adição de transposões (Davis, RW. et al_. A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(1980)) para produzir mutantes tendo deficiências genéticas discerníveis. Uma sequência de gene pretendida é então identificada pela sua capacidade para complementar ( i.e. remediar) as deficiências genéticas de tais células mutantes. Tal identificação genética permitiu a caracateriza ção genética das sequências de genes e a construção de 3 mapas genéticos que localizam a sequência do gene numa região de um cromossoma particular (Taylor, Bacteriol Rev. 34 :155 (1970)). -5- I s

Com o advento das tecnologias de DNA recombinante, tornou-se possível clonar (i.e. isolar fi^ sicamente) tais sequências de genes geneticamente caracteri-zados. Fragmentos ao acaso de um genoma puderam ser introdu zidos em vectores de auto-replicação para produzir bibiotecas de genes, em que cada membro contém sem fragmento único(Mania tis, T. ejt aJ. , em: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1981)). Ao fazer-se o despiste dos membros de tais bibiotecas relativa mente aos que são capazes de complementar a deficiência de uma célula mutante, foi possível clonar a sequência de gene pretendida.

Apesar destes métodos permitirem a identificação e clonagem de muitas sequências, de genes, eles podem ser empregues apenas quando existe uma célula ho£ pedeira que possuí uma mutação conferindo uma deficiência discernível e a sequência de gene pode ser clonada num sist£ ma de inserção de sequências genéticas (como seja um vector) capaz de entrar na célula hospedeira e ser expresso.

te sequências que permitem dida mesmo na A capacidade para isolar fisicamen de genes conduziu ao desenvolvimento de métodos o isolamento de uma sequência genética preten-ausência de mutações ou vectores.

Numa dessas técnicas, conhecida como "passeio no cromossoma" ("chromosome walking"), uma sequência pretendida pode ser obtida através do isolamento de uma sequência de gene que é capaz de hibridar com uma s£ quência referência particular. Esta sequência de gene isola da é então empregue como sequência referência numa experiên cia de hibridação subsequente para clonar uma sequência de gene que é adjacente e que parcialmente se sobrepõe à sequên cia originalmente isolada. Este processo é repetido até se obter a sequência de gene pretendida. Conforme será avaliado a capacidade para clonar uma sequência de gene, na ausência -6-

de mutantes genéticos ou vectores, requere alguma informação inicial respeitante à sequência de nucleotídeos ou perfil de digestão com endonucleases de restrição da sequência preten dida.

Como alternativa, o cromossoma de um vírus ou célula pode ser caracterizado para produzir um mapa físico baseado na sequência de nudeotídeos ou nos dados de clivagem com endonucleases de restrição (i.e. um mapa RFLP). Usando tal mapa, fragmentos de restrição do cromossoma podem ser clonados sem qualquer determinação prévia da sua função genética.

Mais recentemente, a clonagem de genes foi conseguida produzindo moléculas de oligonucleotí-deos cuja sequência foi deduzida a partir da sequência de aminoácidos de uma proteína isolada, fazendo cópias de cDNA de RNA isolados, por hibridações diferenciais de colónias ou subtractivas de bibliotecas usando duas fontes de RNA diferen tes ou cDNA e RNA.

Se bem que estes métodos possam ser empregues mesmo na ausência de mutantes ou de um sistema de inserção de sequências de genes, eles permitem que uma sequên cia de gene pretendida seja identificada e clonada apenas se as sequências naturalmente ligadas à sequência pretendida ti_ verem sido caracterizadas e isoladas ou se a sequência ou ma pa de restrição de tais sequências tiverem sido obtidos. Uma vez que frequentemente não se dispõe de tais dados, estes métodos são por vezes inúteis para a identificação e clonagem de uma sequência de gene pretendida.

Assim, resumindo, a capacidade para clonar DNA correspondendo a um locus definido apenas através de uma mutação é um assunto relativamente simples quando se trabalha com E. coli, S. cerevisiae ou outros organismos em que a transformação e complementação com bibliotecas genómi-

cas é possível. As técnicas de"passeio no cromossoma" podem ser usadas noutros organismos para clonar loci geneticamente definidos se o mutante for obtido por adição de transposões, se o locus puder ser ligado a marcas num mapa RFLP ou se exi£ tir uma biblioteca do genoma. Infelizmente existem numerosos organismos em que foram isolados mutantes com fenotipos int£ ressantes mas para os quais não foram desenvolvidos tais pro cessos. Assim, muitas sequências de genes não puderam ser isoladas usando os métodos acima.

As técnicas existentes podem, em geral, ser aplicadas para permitir a identificação e isolamento de uma sequência de gene pretendida se certas condições adicionais existirem. Estas condições requerem a existência de dados genéticos ou estruturais. Face a estas restrições, são de grande interesse os métodos capazes de permitir, ou facilitar, a identificação e clonagem de sequências de genes que não possam ser facilmente isoladas usando técn:L cas correntes.

Breve descrição da figura A Figura 1 é um diagrama do método de enriquecimento e clonagem da realização preferida do presente invento. 0 DNA está representado como uma linha a cheio; DNA biotilinado está descrito como uma linha de riscas pretas e brancas; os adaptadores Sau3a estão apresentados como uma linha a branco, as esferas de avidina estão a-presentadas como círculos ponteados; os fragmentos marcados radioactivamente estão apresentados como asteriscos.

Sumário do Invento

Foi desenvolvida uma técnica desi^ gnada "subtracção genómica" para o isolamento de DNA ausente em mutantes de deleção. 0 método remove do DNA tipo selva

gem todas as sequências que estão presentes nos genomas tipo selvagem e nos mutantes de deleção. 0 método de subtracção genomica foi exemplificado por clonagem de DNA de uma estir pe de levedura correspondendo a uma deleção de 5 Kb de DNA de levedura. Resumidamente, o método consegue um enriqueci^ mento em sequências eliminadas ao permitir que DNA tipo sel^ vagem se reassocie com um excesso do DNA mutante de deleção biotinilado. Após reassociação, as sequências biotiniladas são removidas por ligação a esferas de vidro revestidas com avidina. Este processo de subtracção foi então repetido vá rias vezes. Em cada ciclo o DNA tipo selvagem não ligado da volta anterior foi hibridado com novo DNA de mutante de dele ção biotinilado. As amostras de DNA não ligado de cada ciclo foram providas de adaptadores nos extremos (como sejam adaptadores Sau3A) e amplificadas usando uma cadeia do adaptador como iniciador na reacção de cadeias com poliraerase. Réplicas de uma biblioteca genomica de levedura tipo selvagem foram despistadas com os produtos amplificados marcados. Todos os clones genomicos que hibridaram com o DNA marcado da tercei^ ra volta de subtracção verificou-se possuirem sequências el.i minadas no mutante. 0 presente invento diz assim respeito a um método para o enriquecimento, e facultativamente isolamento clonal, de sequências de genes que contêm uma in serção ou que correspondera a deleção. E de salientar especi almente um método capaz de tal enriquecimento e isolamento, mesmo quando a inserção ou deleção não foi geneticamente ca racterizada ou é incapaz de causar uma deficiência discerni vel.

Detalhadamente, o invento proporciona um método para o enriquecimento numa sequência de gene pretendida ausente numa população de molécula de ácido nu-cleico mas presente numa outra, o qual se caracteriza por: > > o nucleico desnaturado suspeitas de gene pretendido, com um excesso de moléculas de ácido nucleico desnatu ssuirem a sequência do gene preten-população de moléculas foi marcada primeira população de moléculas não a) mistura de·uma primeira população de moléculas de ácid possuírem a sequência do uma segunda população de rado suspeitas de não po dido, em que a segunda com uma marca e em que a possui a marca; b) permitir às moléculas misturadas da primeira e segunda populações de moléculas que hibridem e portanto formam moléculas de ácido nucleico de cadeia dupla; c) isolamento de quaisquer moléculas de cadeia dupla da mistura que sejam compostas unicamente por moléculas renaturadas da primeira população. 0 invento diz ainda respeito aos métodos atrás descritos em que o passo (c) compreende os sub-passos: 1. incubação da primeira e segunda populações de moléculas misturadas com um agente capaz de se ligar à marca da segunda população de molécula; 2. permitir que o agente se ligue à marca da segunda população de moléculas; e 3. separação de quaisquer moléculas da segunda população da mistura por separação selectiva do agente ligado, juntamente com a sua molécula marcada e liga da da segunda população de moléculas, a partir da mistura. -10-

V Ο invento diz ainda respeito aos métodos atrás descritos em que a marca da segunda população marcada de moléculas é uma marca biotina ou uma marca anticorpo. 0 invento diz ainda respeito aos métodos atrás descritos em que o agente é um anticorpo ou avidina, em solução ou ligado (como seja a esferas ou resina). 0 invento também diz respeito aos métodos atrás descritos em que a avidina em solução, apos ligação à molécula marcada da segunda população de moléculas, é removida da solução juntamente com a molécula ligada marca da, por separação de afinidade com biotina ou por separação de imunoafinidade com um anticorpo anti-avidino.

Descrição das realizações preferidas 0 presente invento diz respeito a um método para o enriquecimento e isolamento clonal de uma sequência de gene presente numa população de ácidos nuclei-cos mas ausente numa outra.

Conforme aqui é usado o termo "sequência de gene" pretende referir-se a uma molécula de ácido nucleico que pode ser DNA ou RNA. A molécula de ácido nucleico preferida constituindo a sequência de gene será uma molécula de DNA. A sequência de gene pode ser capaz de expre£ sar um produto de gene (i.e. pode possuir sequências reguladoras suficientes para permitir a sua transcrição em RNA e a sua tradução numa proteína ou polipeptídeo) , ou como alte£ nativa, pode ser incapaz de tal expressão, 0 termo "sequência de gene" pretende ainda incluir sequências que não são transcritas (tais como sequências reguladoras), não traduzi das (tais como intrões e sequências de processamento) ou que codificam genes ou fragmentos de genes.

Uma"sequência de gene" pode conter mais ‘do que uma destas sequências. As sequências de genes do presente invento podem ser virais, procariotas ou encariotas ou podem ser sintéticas ou recombinantes.

As sequências de genes pretendidas respeitantes ao presente invento estão "presentes numa popu lação de ácidos nucleicos aos ausentes numa outra" .

Tal pode compreender uma inserção cia, mas ausente numa outra. sequência de gene pretendida que esteja presente uma sequên

Tal sequência de gene pretendido, pode compreender uma inserção que esteja presente numa sequên cia, mas ausente numa outra. Exemplos de tal inserção um vírus integrado, duplicação de genes, inserção mutacional, inscrição de transposões, etc. Como alternativa, tal sequên cia de gene pretendida pode compreender um elemento extracro^ mossonico, como seja um pleonídeo, episssoma, vírus, etc. o qual está presente numa fonte mas ausente numa outra. Tal sequência de gene pretendida, pode em alternativa compreender uma sequência que é incapaz de hibridar com uma segunda sequência (como seja por ser altamente divergente relativamente à segunda sequência). A sequência de gene pretendida pode como alternativa compreender uma sequência que corresponde a uma deleção que está presente numa sequência particu lar. 0 termo "deleção" pretende referir-se à ausência de uma sequência particular de nucleotídeos derivada de uma molécula de DNA ou RNA particular que normalmente e naturalmente contém a sequência.

Uma sequência de ácido nucleico é referida como "tendo uma deleção" se quando comparado com uma segunda sequência de ácido nucleico, se verifica não pos suir pelo menos um nucleotídeo que está presente naquela sequência. Por exemplo, se uma sequência de ácido nucleico -12-

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possuir a sequência "ATGCGTAA" e uma segunda sequência possuir a sequência11ATGAA',1 então diz-se que a segunda sequência possuí uma deleção da sequência "CGT". Os nucleotídeos eliminados ("CGT") estando entre "ATG" e "AA".

Uma sequência de ácido nucleico e referido como "tendo ou sendo portadora de uma inserção" ou "como correspondendo à deleção" se possuir uma sequência que corresponde a toda ou parte da sequência de nucleotídeos que está ausente da sequência que possui a deleção. Assim referindo-se ao exemplo atrás, a sequência "CGT" corresponde à sequência eliminada na sequência "ATGAA".

As expressões "contem uma inserção" ou "corresponde a uma deleção" pretendem ser equivalentes e reflectir apenas se a referência é a molécula contendo a de leção ou a molécula que corresponde à deleção. Assim, por exemplo, se uma sequência particular, normalmente presente numa molécula de ácido nucleico, estiver ausente da molécula de ácido nucleico de um mutante, então o mutante é referido como "tendo ou possuindo" uma deleção destas sequências. 0 presente invento permite o enriquecimento e isolamento clo-nal de uma molécula de ácido nucleico que corresponde a esta deleção.

De modo semelhante, se uma sequên cia particular não estiver normalmente presente numa molécu la de ácido nucleico (como seja a sequência de um vírus integrado), mas estiver presente na molécula de ácido nucleico de um mutante então o mutante é referido como "tendo ou possuindo" uma inserção destas sequências (i.e. possui ou é portadora de uma sequência que corresponde a uma "deleção" no não mutante). 0 presente invento permite o enriquecimento e isolamento clonal de uma molécula de ácido nucleico que contém esta inserção (i.e. que corresponde a esta "deleção").

Os métodos do ='presente invento são igualmente aplicáveis independentemente de a deleção resultar da perda de uma sequência de nucleotídeos de uma molécu la de ácido nucleico referência ou reflectir uma inserção numa molécula de ácido nucleico que não está presente numa molécula de ácido nucleico referência. E pois, importante que o termo "deleção" signifique apenas que foi feita uma comparação entre duas sequências de ácido nucleico e que se encontrou uma sequência que não possui uma sequência encontrada noutra. Conforme aqui é usado, a sequência "ausente" numa molécula é conhecida como a deleção. A sequência na ou tra molécula que corresponde à deleção pode ser uma inserção ou uma sequência que "corresponde à deleção".

Um objectivo do presente invento é conseguir o "enriquecimento" de sequências de genes que correspondem a uma deleção particular (ou que contêm uma inserção). Conforme aqui é usado o termo "enriquecimento" pretende referir-se a um aumento da concentração de uma sequência de gene particular relativamente à concentração total de sequências de genes numa amostra.

Uma vez feito o enriquecimento na sequência de gene pretendida, é possível inserir a sequência de gene enriquecida num vector virai ou plasmídeo adequado e portanto obter o isolamento clonal da sequência de gene enriquecida. Como alternativa, a sequência de gene pode ser marcada e usada como sendo de outras sequências. Os métodos que podem ser usados para conseguir tal inserção estão descritos por exemplo, por Maniatis, T. et_ a_l. (Em: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold

Spring Harbor, NY (1982)). I. Métodos de clonagem de deleção/inserção

Duas abordagens gerais têm sido descritas para a clonagem de sequências que estão presentes numa estirpe e ausentes noutra. A primeira abordagem, despis^ te diferencial, foi usada para clonar o gene esc de Drosophi-la. Usando DNA genomico de estirpes com e sem uma deleção para fazer a sonda de réplicas de uma biblioteca genómica C£ loca dificuldades técnicas que se tornam desanimadoras para grandes genomas. Em adição, a deleção deve cobrir pelo menos uma inscrição completa na biblioteca genómica que não contém quaisquer sequências repetidas. A segunda abordagem, hibridação com petitiva, proporciona uma alternativa elegante ao despiste diferencial. Esta técnica foi usada por Lamar e_t al (Cell 3_7:171-177 ( 1984 ))' para isolar clones específicos do cromosso ma y humano. De acordo com este método, um excesso de DNA quebrado de mulher é desnaturado e reemparelhado juntamente com uma pequena quantidade de DNA de homem (o DNA derivado de homem tendo sido previamente tratado para possuir extremos coesivos). A maior parte do DNA de homem reassociou com o DNA quebrado dando fragmentos não clonáveis sem extremos coe sivos. Porém os fragmentos únicos do cromossoma y puderam reassociar-se apenas com a cadeia complementar (derivada do cromossoma y). Tal reassociação permitiu obter assim fragmen tos clonáveis com extremos coesivos. Esta técnica também foi usada com êxito para clonar DNA correspondendo a deleções do locus da distrofia muscular Duchenne e coroideremia.

Infelizmente o método de hibridação competitiva não proporciona um grau de enriquecimento suficientemente grande. Por exemplo, obtiveram-se enriqueci mento de cerca de cem vezes para as sequências de interesse nas experiências atrás. Com enriquecimentos, de ordem de gran deza tão baixa, a técnica é prática apenas quando se trabalha -15-

com grandes deleções. De facto, mesmo se a;deleção cobrir 0,1% do genoma, muitos clones positivos putativos têm de ser testados individualmente por marcação e sondagem de transferências genémicas Southern (Southern, J., J. Molec. Biol. £8:503-517 ( 1975))· 0 método conforme descrito não é prático para deleções da ordem de 1 Kbp (quilopares de bases) a menos que se trabalhe com um genoma pequeno de procariotico II. 0 Método de clonagem de deleção/inserção do presente Invento. 0 presente invento consegue o enriquecimento das sequências de genes que correspondem a uma deleção usando ciclos repetidos de hibridação subtractiva para enriquecimento em sequências ausentes numa população de moléculas de ácido nucleico mas presentes numa outra. 0 méto do está esquematizado na Figura 1.

De acordo com os métodos do presen te invento são necessárias duas fontes de ácido nucleico. A primeira fonte contém uma molécula de ácido nucleico que não possui uma sequência presente no ácido nucleico da segun da fonte. A sequência que está ausente da primeira fonte (a fonte que"contém a deleção”) mas que está presente na segunda fonte (a fonte que"contém a sequência que corresponde à deleção") é a "sequência pretendida" cujo enriquecimento e clonagem é o objectivo dos métodos do presente invento. A deleção existente no ácido nuclei co da primeira fonte pode ser induzido artificialmente, como seja através da utilização de mutagénios ou de transposões (Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1972); Davis, R.W. et al. A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial

Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY -16-

( 1 980 ) ) , ralmente genética etc., como alternativa, a deleção pode surgir natu-durante a evolução e portanto reflectir uma relação (ou não) entre as duas fontes. 0 ácido nucleico das duas fontes foi extraído e misturas de moléculas de ácido nucleico foram purificadas a partir de outros componentes celulares. Com esta finalidade, pode-se seguir os processos de Maniatis, T. et al., Em: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)). A molécula de ácido nucleico portadora da deleção pode ser DNA ou RNA. A molécula de ácido nucleico que corresponde à deleção pode também ser DNA ou RNA. No entanto, devido a pretender-se a amplificação desta molécula apos o seu enriquecimento,é preferível que a molécula de ácido nucleico que corresponde a deleção seja uma molécula de DNA. A realização mais preferida do presente invento emprega fontes de DNA para a sequência de gene com deleção e para a sequência de gene pretendida. Na discussão que se segue do invento, o invento será descrito em termos desta realização preferida. nucleico q amostra é ácido nucl cialmente (se a amos

Uma vez obtida uma amostra de ácido ue contém a sequência de gene com deleção, esta tratada para diminuir o tamanho das moléculas de eico que contém. Com esta finalidade são preferen entregues uma ou mais endonucleases de restrição tra for DNA. A endonuclease de restrição preferida é Sau3a no entanto podem ser empregues outras endonucleases de restrição. E desejável que a molécula de ácido nucleico seja clivada em fragmentos que variam entreO,1-100 Kb de tamanho e mais preferencialmente 0,1-10 Kb de tamanho. Para uma deleção de aproximadamente 5 Kb, o DNA é de preferência reduzido para aproximadamente 3 Kb de tamanho. Os métodos para a clivagem de moléculas de DNA com endonucleases de res_ trição estão descritos por Maniatis, T. et êQ, Em: Molecular -17-

Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)). A amostra que contem a molécula de ácido nucleico portadora da deleção é cisalhada, usando meios convencionais, de modo a que o tamanho médio das mo léculas de ácido nucleico seja semelhante ao das moléculas atrás descritas. 0 ácido nucleico desta amostra é modificado de preferência com biotina, de tal modo que as moléculas to£ nam-se capazes de se ligarem a avidina imobilizada (como se jam esferas ou coluna de avidina (Patente U.S. No. 4 228 237 (Hevey et_ al_. ) ; Hofman e_t J.Amer Chem. Soc. 100:3585-3590 (1978)). A modificação é de preferência conseguida usando fotobiotina (Vector Laboratories). Outros métodos podem certa mente ser empregues para produzir tais moléculas biotiniladas, zados os processos ido nucleico tratadas suficientes para cau de cadeia dupla, as preparações separa cadeia simples. As em misturadas umas com da molécula de ácido excesso relativamente leico que corresponde

Uma vez reali atrás descritos, as duas amostras de ác são misturadas e incubadas em condições sar demonstração de quaisquer moléculas Como alternativa é possível desnaturar das e depois misturar as preparações de amostras de ácido nucleico são para ser as outras de modo a que a concentração nucleico portadora da deleção esteja em à concentração da molécula de ácido nuc à deleção.

Uma vez conseguida a mistura/des-naturação, a amostra misturada é arrefecida e incubada nas condições necessárias para permitir a hibridação e a reasso ciação de cadeias complementares. As condições de tal hibridação podem ser controladas para aumentar ou optimizar a velocidade de hibridação. Por exemplo, podem ser usadas con centrações elevadas de sais tais como 1M Nall, Dextran-sulfa to, 4M Cloreto de Lítio, Sulfato de amonio 2M, etc. Tal incubação resultará na produção de cinco classes de moléculas -18-

de ácido nucleico. (1) Molécula de cadeia dupla em que ambos os extremos estão biotinilados. Tais moléculas re sultam do reemparelhamento de duas cadeias, ambas derivadas da amostra, contendo a molécula de ácido nucleico portadora da deleção. Uma vez que ambas as cadeias estão biotiniladas, e portanto derivam da fonte possuidora da deleção, nenhum membro desta classe de moléculas pode conter a sequência de gene pretendida (a qual corresponde à deleção e portanto de_ ve derivar de outra fonte). (2) Moléculas de cadeia dupla ten do apenas uma cadeia biotinilada. Tais moléculas resultam do reemparelhamento de uma cadeia derivada da amostra contendo a molécula de ácido nucleico que corresponde à deleção e uma cadeia derivada da molécula de ácido nucleico da amostra que continha a deleção. Uma vez que tais moléculas são híbridos de ambas as fontes de ácido nucleico, todos os membros desta classe de moléculas contêm sequências que não estão relacicj nadas com a sequência da deleção (uma vez que aquela sequên cia não está presente na fonte de ácido nucleico biotinilado)

(3) Moléculas de cadeia simples biotiniladas. Tais moléculas resultam do facto de uma molécula de ácido nucleico derivada da fonte contendo a deleção não reem parelhar com uma outra cadeia. Uma vez que esta classe de moléculas deriva da amostra contendo a molécula de ácido nu cleico portadora da deleção, nenhum membro desta classe de molécula pode conter a sequência de gene pretendida. (4) Moléculas de cadeia simples não biotiniladas. Tais moléculas resultam do facto da molécula de ácido nucleico derivada da fonte contendo uma molécula de ácido nucleico que corresponde à deleção não empare lhar com uma outra cadeia. Uma vez que esta classe de moléculas deriva da amostra contendo a sequência de gene preten- -19-

dida, membros desta classe moléculas contêm potencialmente a sequência de gene pretendida. (5) Moléculas de cadeia dupla em que nenhuma das cadeias está biotinilada. Tais moléculas re sultam do emparelhamento de duas cadeias ambas derivadas da amostra contendo a molécula de ácido nucleico que correspon de à deleção. Uma vez que esta classe de moléculas deriva da amostra contendo a sequência de gene pretendida, os membros desta classe de moléculas contêm potencialmente a sequência de gene pretendida. Os membros desta classe de moléculas são especialmente desejáveis uma vez que a sua natureza de cadeia dupla permite que sejam incorporados em vectores de clonagem.

Como será facilmente apreendido face à discussão atrás, o numero de moléculas que cai nas classes 4 e 5 decrescerá à medida que se adicione à mistura mais áci_ do nucleico biotinilado contendo deleções. Assim, ao ter-se tal DNA biotinilado em excesso, a quantidade de moléculas da classe 4 ou classe 5 (relativamente às quantidades de moléculas da classe 1,2 e 3, será baixa.

Apesar do facto das moléculas não desejáveis das classes 1,2 e 3 estarem presentes em grande excesso relativamente às moléculas pretendidas das classes 4 e 5, é possível remover facilmente as moléculas indesejáveis da mistura devido ao facto das moléculas das classes n^s. 1 ,2 e 3 estarem biotiniladas.

Tais moléculas biotiniladas, hibri^ dadas com uma molécula biotinilada complementar (classe 1), hibridadas com uma molécula não biotinilada complementar (classe 2), ou de cadeia simples (classe 3) podem ser removi das da amostra através de uma série de processos. Tais moléculas podem ser incubadas na presença de avidina livre em solução ou em suspensão, nas condições necessárias para per mitir que a avidina se ligue à biotina das moléculas biotini -20-

ladas. A preparação pode ser então incubada na presença de biotina ligada (por exemplo, esferas, resinas, colunas bio-tiniladas, etc.) nas condições necessárias para permitir que a avidina ligada ao ácido nucleico biotinilado se ligue à biotina da coluna (a avidina possui múltiplos sítios de liga ção à biotina e pode, portanto, ligar-se simultaneamente à molécula de ácido nucleico biotinilada e às esferas ou resina biotiniladas). Com esta finalidade usa-se de preferência uma coluna de avidina imobilizada. Em vez da coluna de avidina e possível empregar outros métodos para remover as moléculas biotiniladas da mistura. Por exemplo, pode-se usar uma matrix de estreptavidina-celulose-avidina-agarose ou avidina acopla da a esferas magnéticas, etc. As moléculas não ligadas das classes 4 e 5 podem ser então recuperadas do eluato da colu na biotinilada ou do sobrenadante das esferas biotiniladas centrifugadas , etc.

Num método preferido alternativo as moléculas biotiniladas das classes 1-3 são incubadas na presença de esferas de avidina, resinas, etc. (i.e. uma avi dina imobilizável ou imobilizada). Com esta finalidade, são especialmente preferidas esferas de polistireno revestido com avidina. As moléculas de ácido nucleico biotiniladas e a avidina foram incubadas em condições que permitem que as moléculas biotiniladas se liguem à avidina. As moléculas li^ gadas à avidina são então removidas da solução por centrifu gação, sedimentação, ou mais preferivelmente, por filtração microcentrifuga, cromotografia de afinidade, etc., para pro duzir uma solução contendo apenas as moléculas da classe 4 pretendidas.

Conforme será facilmente avaliado face à discussão anterior, o presente invento não requere a utilização de biotina e avidina. Tais reagentes são empregues na realização preferida do invento. Qualquer par de reagentes são empregues na realização preferida do invento. Qualquer par de reagentes capazes de se ligarem especificamente um ao outro pode ser usado desde que um dos reagentes possa ser ligado a uma molécula de ácido nucleico e que tal molécula ligada não seja incapaz de hibridar com uma molécula de áci do nucleico complementar. Exemplos de tais agentes alternativos incluem modificação de moléculas de ácido nucleico com um antigénio (por exemplo digoxigenina) e purificação das moléculas indesejáveis da mistura usando um anticorpo especí fico para o antigénio, (como seja o anticorpo anti-digoxig£ nina). 0 efeito directo da cromatografia de afinidade será o enriquecimento nas sequências de genes que correspondem à sequência da deleção. 0 ácido nucleico obtido no efluente da cromatografia de afinidade ou como so lução resultante da remoção das esferas de avidina ligadas ao ácido nucleico biotinilado não contém quaisquer sequências de genes biotiniladas. Tal ácido nucleico pode ser recuperado e passado repetidamente melo mesmo ciclo (usando mais molécu las de ácido nucleico contendo deleções). Tais ciclos repeti dos são capazes de enriquecer substancialmente a concentração de uma sequência de gene pretendida.

Em geral, 3-5 destes ciclos são efectuados para enriquecer uma sequência de levedura de 5 Kb particular até à homogeneidade. Uma vez que o genoma de lev^ dura contém aproximadamente 10^ fragmentos Sau3a e um fragmen to de 5 Kb seria de esperar ter aproximadamente 20 sítios Sau3a, os métodos do presente invento, os quais permitem o isolamento de fragmentos contendo um destes 20 sítios, pro porcionam um enriquecimento de vários milhares de vezes.

Uma vez obtido um grau de enrique cimento suficiente, a sequência de gene enriquecida pode ser introduzida num vector de clonagem adequado. A eficácia de clonagem pode ser substancialmente aumentada se a sequência de gene enriquecida for amplificada antes da clonagem. -22-

Se bem que qualquer método de amplificação possa ser usado, é preferível amplificar as sequências de genes usando a reacção de cadeias com polimerase descrito por Mullis na Patente U.S. No.4,683,195 e por Saiki et^ al . (Science 239 : 487-491 (1988)), referências que aqui são incluídas por referência. Numa realização preferida, os fragmentos são providos de adaptadores que possuem extremos coesivos. Os adap tadores tendo um extremo Sau3a clivado constituem 0 adaptador de extremos coesivos preferido. Como alternativa podem ser usados outros adaptadores. Caso se pretenda, tais adaptadores podem ser adicionados aos extremos das moléculas em qual^ quer fase, mesmo antes da primeira hibridação. Os fragmentos ligados podem então ser amplificados usando polimerase Taq e um excesso de uma cadeia adaptadora que serve como iniciador. A colocação de adaptadores e amplificação é uma estra tégia geral para a amplificação de fragmentos de sequência desconhecida. Os nucleotídeos radioactivos são incluídos no DNA amplificado num ciclo final de polimerização. 0 DNA mar cado foi usado no despiste de uma biblioteca genomica feita a partir de DNA tipo selvagem. Os sinais mais intensos deve^ rão corresponder a colónias que contêm DNA coincidente com as sequências eliminadas no mutante.

nagem ou pela reacção ser u sado para fazer teca (i .e . , cDNA , etc thern ). 0 DNA amplifi te de transferências bliot eca clonada ampl modo a en contrar clon queci das na sonda. dação subtractiva foi a DNA que tinha sido bacteriófago T4 (Baut

Uma vez amplificado o DNA, por cio de cadeias com polimerase, este pode o despiste de qualquer tipo de biblio-.) ou transferência (Northern ou Sou-cado pode ser clonado e usado no despi£ ou bibliotecas. Ê possível usar tal bi^ ificada com DNA marcado amplificado de es que correspondem a sequências enri- 0 conceito de utilização de hibri^ usado para isolar mRNAs correspondendo eliminado de um mutante de deleção do z et al., Science 151:328-330 (1966). -23-

Vários laboratórios publicaram recentemente, métodos para o enriquecimento em sequências de DNA com deleções a partir de DNA genomico (Lancer e_t al_. , Cell 37 : 171-1 77 ( 1 984); Welcher et al. , Nucl. Acids Res. 14:10027-100^ ( 1 986 );

Bjourson et al. , Appl .Environ . Microbiol, 5_4 :2852-2855 ( 1988 ) 0 processo de subtracçao genomica aqui descrito torna possí vel conseguir enriquecimentos muito maiores do que utilizan do tais métodos. Os enriquecimentos obtidos por técnicas de hibridação competitivas de um único passo como seja, a desen volvida por Lamar e Palmer (Lamar e_t al_, Cell 37:171-177 (1984)) podem não ser superiores à razão entre o DNA do mu-tante de deleção e o DNA selvagem. Este problema que é um factor em qualquer esquema de enriquecimento que usa DNA de cadeia dupla pode ser ultrapassado usando um grande excesso de DNA do mutante de deleção ou empregando uma abordagem repetitiva como fizémos. Os protocolos de subtracçao usando o DNA de cadeia simples e mRNA (Timberlake, Devei. Biol. 78:497-510 (1980) não requerem estas medidas uma vez que as cadeias dentro das duas populações de ácido nucleico não podem emparelhar umas com as outras. Os enriquecimentos reais usando o método de um único passo têm sido inferiores a 100 vezes (Lamar et al, Cell 37 : 171-177 ( 1984 ); Kunkel e_t al. , Proc.Natl.Acad. Sei. USA 82: 4778-4782 (1985); Nussbaum et^ al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 6521-6525 ( 1987)). 0s métodos anteriores que empregam ciclos múltiplos de subtrac ção na purificação de sequências que ocorrem numa estirpe de bactérias mas não numa outra (Welcher ejt aJ., Nucl .Acids Res. 10027-10044 (1986 ); Bjourson et al. , Appl. Environ

Microbiol 54_: 2852-2855 (1988 )). Os factores de enriquecimen to necessários para se conseguir purificação dos fragmentos bacterianos foram muito inferiores (cerca de 200 vezes inf<2 riores na referência 14) aos da experiência aqui descrita. £ difícil obter simultaneamente bons enriquecimentos e quan tidades úteis de DNA usando técnicas que carecem de um passo de amplificação. -24-

Assim, combinando a subtracção de DNA com um passo de amplificação consegue-se atingir grandes factores de enriquecimento minimizando simultaneamente a quan tidade de DNA necessária. Os métodos do presente invento pr£ ferencialmente efectuam tal amplificação incorporando a rea cção de cadeias com polimerase para amplificar o DNA apos o ciclo final de subtracção. A reacção de cadeias com polimerase está descrita por Mullis na Patente U.S. No .4,683,195 cuja referência é aqui incluída por referência.

Usando o DNA amplificado para o despiste de uma biblioteca reduz grandemente o tempo do des; piste comparado com o despiste de transferências Southern com clones individuais. 0 sinal gerado por uma sequência par ticular na sonda e proporcional à sua fracção da sonda. Assim os fragmentos na sonda que são eliminados no mutante não necessitam de ser purificados para alvejar com precisão os cor respondentes clones numa biblioteca. Os fragmentos pretendidos devem apenas estar mais representados na sonda do que qualquer outro fragmento particular.

Os factores de enriquecimento el£ vados dependem da minimização da acumulação de espécies con taminantes amplificáveis nas fracções de DNA não ligadas.E de esperar que duas classes de fragmentos contaminem o DNA não ligado: ao acaso e sem ser ao acaso. A classe ao acaso é composta por cadeias tipo selvagem reassociadas que não derivam da região eliminada, sequências que são de cadeia simples devido a tempos de reassociação insuficientes e sequências que emparelharam com DNA mutante que não se liga às esferas revestidas com avidina. São possíveis contaminan tes sem ser ao acaso os fragmentos que não podem hibridar com DNA biotinilado durante a subtracção (e.g. sequências de "snap-back" ou fragmentos com Tm abaixo da temperatura de hibridação), as que correspondem a uma deleção num outro lo-cus, sequências repetidas que são muito mais numerosas na es_ tirpe selvagem do que na estirpe da deleção (neste caso as -25-

sequências biotiniladas podem não ser em ‘e-xceàso suficiente) e DNA de organismos contaminantes da cadeia tipo selvagem. III. Utilizações dos métodos do presente invento

Os métodos do presente invento podem ser usados para gerar uma colecção de fragmentos de res trição de uma estirpe que não ocorre numa outra estirpe. Estas estirpes podem diferir por serem muito distantes uma da outra ou por terem sido mutagenizadas com agentes que causam taxas elevadas de mutantes de deleção. Sintetizaram-se oligo nucleotídeos que correspondem na sequência a cada uma das cadeias de cada um daqueles fragmentos. Juntaram-se todos estes oligonucleotídeos. Extraiu-se DNA de uma pequena amostra de tecido e combinou-se com os oligonucleotídeos reunidos e depois amplificou-se usando a reacção de cadeias com polime-rase. Se o tecido deriva ou contém a estirpe sem os fragmentos de restrição, não surgem quaisquer bandas num gel corado com brometo de etídio após amplificação. No entanto, se o te eido derivar ou possuir a estirpe com os fragmentos de restri^ ção, surge uma banda correspondente a cada um dos fragmentos. As duas estirpes podem ser cruzadas e conjugada a progénie F1 Os organismos F2 resultantes, foram analisados por amplifica ção do DNA usando os oligonucleotídeos iniciadores seguido de electroforese em gel. A co-segregação dos fragmentos pode ser avaliada fazendo um mapa de ligação ("linkage”) destes fragmentos .

Esta abordagem simplifica o mapea mento de novas marcas genéticas. 0 mutante obtido na estirpe contendo os fragmentos, foi cruzado com a estirpe sem os fra gmentos e depois a progénie (f 1 ) conjuga„da entre si. A progé nie deste cruzamento (F2) é então avaliada quanto ao fenotipo Extraiu-se DNA de uma pequena amostra de tecido e amplificou -se usando o conjunto de sondas do parágrafo anterior. Os produtos amplificados foram avaliados quanto à presença ou 26- / .

ι

ausência dos vários fragmentos num gel. Deste modo a marca fenotípica pode ser ligada geneticamente a marcas de fragmen tos de restrição.

De modo semelhante, podem ser cons^ truídas árvores filogenéticas isolando fragmentos que ocorrem num organismo mas ausentes (ou que divergiram de tal modo que não hibridam nas condições usadas no protocolo de subtração) num organismo afastado. Sintetizaram-se oligonucleotídeos correspondendo a tais fragmentos. 0 tecido de organismos rela cionados poderá então ser avaliado quanto ao grau de parentesco com os dois organismos originais simplesmente amplificando uma pequena quantidade de DNA usando os oligonucleotídeos como iniciadores. Pode-se construir uma árvore filogenética a partir do padrão de bandas observado num gel.

De modo semelhante pode-se obter uma colecção de fragmentos humanos, usando esta técnica, que estejam presentes em sub-series de populações humanas. Pode--se sintetizar oligonucleotídeos correspondendo de cada uma das cadeias de cada um daqueles fragmentos. 0 DNA de uma amos tra forense de uma só célula (como seja um folículo do cabelo) pode ser amplificado usando este conjunto de oligonucleo tídeos como iniciadores. 0 padrão de bandas resultantes é com parável à impressão digital do indivíduo e pode ser usado em justiça do mesmo modo que uma impressão digital. 0 método pode ser usado para isolar novos patogénios (e.g., vírus). 0 DNA de um indivíduo infectado pode ser tratado como o DNA tipo selvagem na clonagem de delações, o DNA de tecido não infectado do mesmo indivíduo ou de outro ou outros indivíduos (de preferência ambos os pais não infectados do indivíduo) é tratado como o DNA mutan te de deleção na clonagem de deleção. -27-

\ Ο método pode ser usado para isolar loci determinantes do sexo, loci determinantes da resistência a doenças, loci causadores de doenças ou loci de resistêcia a drogas, se tais loci possuírem fragmentos de restrição úni^ cos presentes num organismo mas não noutro. 0 DNA ausente num tecido mas presente num outro pode também ser isolado usando o método.

Por exemplo, pode surgir um tumor se ambas as cópias funcionais de um oncogene recessivo forem eliminadas. Usando o mé todo com DNA de tumor e DNA de tecido não afectado poder-se-á clonar, o oncogene recessivo. 0 presente invento tembém permite a identificação da Natureza de um patogénio bacteriano, virai levedura ou fungo e proporciona assim auxílio no diagnóstico da etiologia de doenças infecciosas. Como descrito atrás faz--se uma colecção de fragmentos de restrição, a partir de uma estirpe que não ocorre numa outra estirpe. Estas estirpes p£ dem diferir por estarem mais ou menos afastadas uma da outra. Sintetizam-se oligonucleotídeos que correspondem em sequência a cada uma das cadeias daqueles fragmentos. Estes oligonucleo^ tídeos são reunidos. 0 DNA de uma pequena amostra de tecido ou fluido do corpo (sangue, saliva, urina, fezes etc.) é extraído, combinado com os oligonucleotídeos reunidos e depois amplificados (de preferência usando a reacção de cadeia com polimerase). Se a amostra possuir DNA da estirpe sem os fra gmentos de restrição, não se observam bandas no gel corado com o etídio após amplificação. No entanto, se a amostra possui DNA da estirpe contendo os fragmentos de restrição , surge uma banda correspondendo a cada fragmento. Comparando o resultado obtido com o originado por estirpes conhecidas é possível identificar a estirpe. A aplicação da subtração genómica está sujeita a várias restrições. Deve-se dispor de estirpes -28-

viáveis cora deleções homozigoticas ou hemizigóticas do locus a ser clonado. A deleção deve cobrir pelo menos um fragmento de restrição (por exemplo, um fragmento Sau3a) que seja com posto na totalidade por sequências não repetitivas. Idealmer^ te, as duas estirpes deverão ser isogénicas de modo que as sequências cobertas pelas deleções ocorrendo em loci irrel£ vantes não sejam recuperadas. A clonagem de DNA que corresponde a sequências que faltam em mutantes de deleção deverá ser especialmente útil em sistemas em que os mutantes possam ser isolados mas para os quais não foram ainda desenvolvidos métodos de clonagem. Devido à facilidade, eficácia e velocidade da subtração genómica este método pode também tornar-se útil em organismos para os quais são normalmente usadas outras técnicas de clonagem tais como colagem de transposões ou "pa£ seio no cromossoma". Para organismos com grandes genomas ou para aqueles que apresentam politenia, podem ser despistados citologicamente mutantes de deleções. Na ausência de evidên cia citologica, é necessária uma análise extensiva da estru tura fina genética para provar que uma mutação é causada por uma deleção. Em vez de provar que um mutante é causado por uma deficiência, a subtração genómica pode ser efectuada numa série de mutantes alélicos que foram induzidos por testamentos que provocam deleções com uma frequência elevada. Por exemplo os raios X (Coté et^ al_. , Genetics 1 12:769-783 ( 1986 ); Kelley et^ al_. , Genetics 109:365-377 ( 1985)), diepoxibutano (Reardon et^ al_, Genetics 1 15:323-331 ( 1987 )), e clorambacilo (Russel et_ a^. , Proc. Natl.Sci.USA 86^3704-3708 ( 1989)), podem induzir elevadas proporções de mutantes de deleção. Os métodos do presente invento destinam-se a facilitar o proces_ sarnento de múltiplas amostras com um mínimo de esforço.

Assim, a subtração genómica pode ser usada para isolar genes que provocam doenças em humanos, em situações em que se pode encontrar pacientes com deleções ou em que podem ser identificadas linhas celulares que dife- -29-

rem na presença ou ausência do locus. 0 método também pode ser usado para isolar DNA de patogénios a partir de tecido infectado. Os genes da virulência podem ser clonados a partir de ura agente patogénico se existir uma estirpe relacionada não patogénica. Os clones obtidos através da aplicação do método a organismos afastados podem ser usados para fazer o despiste de espécies intermédias permitindo a construção de árvores filogenéticas. De modo semelhante, os fragmentos de DNA que estão presentes numa estirpe mas ausentes numa outra podem ser usados como marcadores RFLP. Se se sintetizarem oligonucleotídeos adequados muitos marcadores podem ser avaliados simultaneamente por uma amplificação do DNA genómico. A tecnologia que desenvolvemos pode ser aplicada à maior parte das experiências que requeiram seleção por su]d tração ou positiva de ácidos nucleicos. 0 método pode ser prolongado para o isolamento de DNA plantas superiores e ani mais através da aceleração da cinética das reacções de reas sociação de DNA (Wieder et^ al. ,Biopolymers 20:1537-15^7 (1981)).

Tendo agora descrito o invento de um modo geral, o mesmo será mais facilmente compreendido através da referência aos exemplos que se seguem os quais são apresentados com fins ilustrativos e não pretendem ser limitantes do presente invento, a menos que seja especificado

EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DE DNA

Para ilustrar os métodos de um modo geral aplicáveis do presente invento, extraiu-se DNA a partir de duas estirpes de Saccharomyces cerevisiae: estirpe T1 753 (alfa, ura3, trpl, his3, leu2 , can^ cir°) e TD33.3 (alfa, ura3, trpl, his3, leu2, canrm çir° e Del (lis2)). A mutação Del (lys2) da estirpe TD33.3 contém uma deleção de Λν s' 5 Kb bem caracterizada. A sequência correspondendo a esta deleção foi previamente clonada e caracterizada. As células foram cultivadas em condições de culturá convencionais, colhidas e tratadas para recuperar o DNA genémico.

Extraiu-se DNA como descrito por Rogers £t_ aJL_. (Plant Molec. Biol. 5:69-76 ( 1 985 ), cuja refe rência é aqui incluída por referência ). 0 DNA da subtração genómica deverá estar puro (i.e. sem DNA de contaminantes biológicos, RNA, nucleotídeos, polissacáridos e proteínas). E importante que as concentrações de DNA genómico sejam medidas cuidadosamente. As concentrações de DNA genómico são preferencialmente determinadas por comparação de intensidades de bandas após electroforese em gel das amostras de DNA genómico e várias diluições de DNA do bacteriófagoλ de concentração conhecida. As medidas de concentração de DNA por espectroscopia de absorvância não são geralmente suficiente^ mente preciosas para esta aplicação. Para organismos que são ricos em polissacáridos e/ou glicoproteínas, são úteis as preparações CTAB ("CTAB preps") (Murray £t al_. , Nucleic Acids 8:4321-4325 (1980), cuja referência é aqui incluída por referência ).

Par ra, os sedimentos de 4 litros suspensos em 240 ml de 167 mg ^ME/0,1 mg/ml de zimolase (Se EDTA. Após incubação durante centrifugadas durante 20 min. a 4200 rpm. Os sedimentos for mM glucose/25 mM Tris HC1 pH pensão resultante adicionámos 0,5 M Tris HC1 pH 8. Preparou de acordo com o método de Mur Nucleic Acids 8^:432 1-4325 ( 1 9 Molec. Biol. 5:69-76 (1985)). a a preparação de DNA de levedu de cultura saturada f oram res- /ml de sorbitol (0,2% (v/ v) ikagaku; 10^ unidades/mg) 100 mM 1 ho ra a 37°C as célul as foram a 4 °C num rotor Beckman JS4.2 am r essuspensos em 60 ml de 50 8/10 mM EDTA. Aos 100 ml de sus 25 ml de 3,5 M Nal/0, 1M EDTA/ -se DNA a partir desta su ispensão ray e Thomoson (Murray et a_l. , 80) ) ; Roger s , S .0 . et_ al . Plant 0 sedimento do passo final de -31-

de precipitação com etanol (EtOH) foi ressuspenso em 10 ml de 10 mM Tris HC1 pH8/1mM EDTA (TE). Adicionou-se RNase A (Sigma) (Maniatis e_t aJ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,

New York) (1982)) a 100 /*g/ml e a solução foi incubada a 37°C durante 1 hora. A solução foi levada até 0,3M NaOAc e extraí da duas vezes com fenol/cloroformio (1:1). Apos adição de 2 volumes de EtOH, o DNA foi retirado da solução, ressuspenso em 5 ml de TE e depois levado até 0,3M de acetato de sodio (NaOAc). 0 DNA foi removido da solução de EtOH por enrolamento mais duas vezes, lavado em EtOH a 100% e ressuspenso em TE. Uma porção do DNA genómico isolado a partir da estirpe TD33.3 foi cisalhado por sonicação até um tamanho médio de aproximadamente 3000 pb usando um sonicador Ultrasonics modelo W-375. 0 DNA quebrado foi concentrado até 0,5 ml por extracção com sec-butanol, centrifugado a 13000 X g durante 1 minuto para remover algum material insolúvel, desnaturado por fervura durante 3 minutos, lavado até 0,3M NaOAc, prec:L pitado pela adição de 2 volumes de EtOH, lavado em 100% EtOH, seco e ressuspenso a 1 mg/ml em água. Evitou-se a utilização do tampão Tris nesta fase uma vez que ele pode reagir com fotobiotina.

Preparou-se um adaptador Sau3a por emparelhamento dos oligonucleotídeos sintéticos GACACTCTCGAG ACATCACCGTCC e GATCGGACGGTGATGTCTCGAGAGTG. Este último oligo nucleotídeo foi fosforilado no extremo 5' usando polinucleo tídeo cinase de T4 (New England Biolabs) (Maxam et_ al. , Methods Enzymol 65^:499-560 ( 1980 )). Combinou-se uma massa igual de cada uma das duas cadeias. A mistura foi aquecida até 100°c durante 2 minutos num banho-maria de 200 ml o qual foi então deixado arrefecer até à temperatura ambiente. No final, o adaptador resultante possui um extremo coesivo com patível com Sau3A com um fosfato 51 e no outro extremo uma protuberância 5' incompatível com Sau3a. As protuberâncias incompatíveis e o fosfato 5' asseguram que apenas se ligue uma molécula de adaptador a cada extremo de um fragmento Sau3A 0 fragmento Β1ΙΙ da região eliminada na estirpe TD33-3 foi subclonado por ligação do produto da digestão de YIp33-3 com BglII a pUC13 que foi previamente cortado com BamHI. 0 fragmento eliminado foi removido deste plasnídeo cortando com EcoRI e PstI (os sítios BglII tinham sido destruídos durante a subclonagem) . Este fragmento, refe rido abaixo como"fragmento BglII de 5Kb", foi purificado em gel de 2% de agarose de ponto de furão baixo (Ansubel et^ al Current Protocolo in Molecular Biology (Greene Publishing Associates e John Wiley & Sons, New York) (1987), cuja refe rência á aqui incluída como referência). EXEMPLO 2

MODIFICAÇÃO DE DNA COM FOTOBIOTINA 0 DNA partido em água (1 g/ml) ou em 10mM Tris HC1 ph8/1mM EDTA (TE) que tinha sido fervido durante 2 minutos e arrefecido num banho de gelo, foi misturado com igual volume de fotobiotina (1 /g/ml) (adquirida à Vector Laboratories) ou de preferência, acetato de fotobiotina (1 fig/ml) (adquirido à Clonetech # 5000-2 (5mg em 2,5 ml de água para uma concentração de 2 /tg/ml)) num tubo de poli^ propileno de 2 ml. 0 tubo aberto foi colocado num tabuleiro flutuante Styrofoam num banho de gelo 10 cm abaixo de uma GE Sunlamp (modelo RSM/H, equipada com uma lampada electrica de 275 W). Após aproximadamente quinze minutos apagou-se a lampada e a reacção foi levada até 100mM Tris HC1 pH9 pela adi^ ção de uma solução "stock" 1M. A fotobiotina que não reagiu foi removida extraindo três, de preferência quatro vezes com n-butanol saturado com água. Após precipitação com etanol o DNA modificado foi ressuspenso a 2 mg/ml em TE (1OmM Tris HC1 , 1mM e DTA, pH8) ou de preferência, EE (EE é lOmM (Na) Epps, pH 0,25; 1 mM EDTA, pH8 ajustado a um pH final de 8,0. EE é feito com EE 10X usando 1M (Na)Epps, pH8,25 e 0,5M EDTA, pHB). EPPS (ácido N-(2-hidroxietil)plperazino-N '-3-propanos-sulfónico) é um composto químico parecido com HEPES. 0 seu

pKfl é 8,0 ( a 20°C) e o pKa muda apenas ligeiramente com a temperatura (-0,007 unidades/°C). o pH de EE1X a 100°C deverá ser de aproxiraadamente 7,4. Manter o pH neutro e importan te para este processo de modo a evitar a despurinação do DNA. Esta ocorre rapidamente a pH ácido e a altas temperaturas. Tris é inadequado una vez que o pKa cai rapidamente com o aumento da temperatura. E importante manter ura pH neutro durante incubações extensas a temperaturaeeievada de modo a minimizar a despurinação do DNA (Lindahl e;t al. , Biocheraistry 11 ; 310-318 ( 1972 )). Usou-se EPPS porque o seu pKa (8,0 a 20°C muda com a temperatura (-0,007 unidades/°C). Usou-se uma solu ção "stock" 1M de EPPS pH 8,25 para fazer todos os tampões contendo EPPS. EXEMPLO 3

REASS0CIAÇÕES DE DNA DNA de T1753 digerido com Sau3A (0.5 pg), DNA biotinilado da estirpe TD33.3 (10 /ig), um oli-«onucleotídeo sintético de 84 bases marcado nos extremos (70 000 cpm) e 40 jug de tRNA de levedura (Sigma) foram desna turadas em EE 2X fervendo durante 1 minuto. 0 tRNA de levedu ra liofillzado foi ressuspenso ea Q,3M NaOAc. Extraiu-ss de preferência duas vezes cora fenol/clorofórmio (1:1), preoipi tou-se com EtOH e ressuspendeu-se de modo a que a concentra ção fosse de 20 Jkg! jd antes de usar. 0 84-mero, que não hibrida com DNA de levedura, foi marcado noa extremos usando polinucleotídeo cinase de T4 (New England Biolabs) e (New England

Nuclear). A molécula de oligonucleotídeo foi incluída como marcador para as fracções contendo DNA que não -34-

se ligam a avidina e foi usada para calcular o rendimento global- Qualquer DNA radioactivo desde que não seja honologo do DNA modificado pode ser usado para controlar a eficácia das reacções e para localizar as fracções contendo DNA duran te a cromatografia de afinidade. 0 marcador ideal deverá ser suficientemente longo para se assemelhar ao fragmento Sau3a; ser de cadeia simples (de modo a indicar o destino das moló cuias de cadeia simples que aderem mais facilmente às paredes dos tubos, etc. e não deve hibridar com o genoma a 1M Nall, 65°C). 0 DNA marcado (100 000 cpm) e tRNA (20 g) neces sitam de ser adicionados apenas à primeira reacção de reasso ciação. A mistura foi lavada ate 1M NaCl/ 5mM EDTA/1OOmM Hepes pH7,5 (1XSHE) pela adição de SHE 4X.

As concentrações finais de DNA estão entre 1 e 2 mg/ml. A mistura foi deixada reassociar durante 21-4*1 horas a 65°C.

As reacções atingiram valores de Cot superiores ou iguais a vinte vezes o valor de C0t^/2 para o DNA de levedura nestas condições.

Como alternativa, e de preferência, a mistura foi liofilizada, ressuspensa em 4 /<1 de EE 2,5X e depois misturada com 1 1 de 5MNaCl. As hibridações foram efectuadas numa estufa a 65°C em tubos de centrífuga de 0,5ml para manter constante os volumes das amostras. Após 17 horas a 65°C, 95 pX de EEn (EEN é 0,5M NaCl; 10mM (Na) Epps, pH8,25 1mM EDTA, pH8; ajustado a um pH final de 8,0) foi adicionado e rapidamente misturado com a amostra que foi então combinada com 100 pl de uma suspensão a 5% de esferas de polistireno revestidas com avidina (Fluoricon Avidin Polystyrene Assay Particles, Baxter Healthcare Corporation Pandex Division, #31-040-1 (0,7-0,9 JXde diâmetro) (Syvanen et al. , Nucl .Acids Res. 16 : 11327-11338 (1988)) que tinham sido lavadas em EEN. A amostra foi incubada à temperatura ambiente durante 30 min. adicionada ao copo de uma unidade de filtração em tubo de microcentrífuga (Millipore, UFC3, OGV 00) e sedimentada a -35-

ι

13 000 Xg durante 15 segundos. As esferas. que foram retidas pelo filtro, foram lavadas uma vez com 200 jJX de EEN. 0 ácido nucleico não ligado no filtrado foi precipitado a -70°C após a adição de dois volumes de etanol. 0 sedimento resultante foi lavado com etanol, seco e ressuspenso em 5 /J. de EE, 0,5 /<1 foi usado para subsequente análise. A amostra foi combinada com 10 /<g de DNA biotinilado de TD33.3, 20 jug de tRNA de levedura e levada atá EE 2 X. Efectuaram-se mais qua tro ciclos de desnaturação, reassociação e selecção com avi dina como descrito atrás. Guardaram-se amostras (1/10 de ca da fracção não ligada) para cada ciclo. Adicionou-se tRNA (20 /tg) conforme necessário para manter um sedimento visível após centrifugação. A recuperação de DNA não capaz de hibri-dar variou entre 80-90% por ciclo, conforme avaliado pela perda do oligonucleotídeo marcado. Apos 5 ciclos de subtrac ção e recuperação de olidonucleotídeo marcado foi de 44% do rendimento teórico.

Caso se pretenda, o protocolo atrás pode ser modificado para permitir a recuperação do DNA liga do. As esferas foram lavadas com EEN, o DNA ligado eluído com 100 mM NaOH e o filtrado foi neutralizado.

Os fragmentos que têm Tm perto ou abaixo de 65°C em 1M NaCl não podem hibridar eficazmente nas condições de hibridação descritas atrás e portanto serão en contrados na fracção não ligada de cada ciclo de subtracção. Para assegurar que tais fragmentos sejam completamente desnaturados de modo a não poderem ser providos de adaptadores e a não poderem ser amplificados, preferencialmente fez-se um passo de incubação a temperatura elevada antes da adição dos adaptadores.

Para este passo, aproximadamente 20% do DNA foi guardado após ciclos 1-4 e 10% da fracção não ligada do ciclo 5 foi ressuspenso em 50 juL de 1M NaCl/EE/400 /tg/ml de tRNA. Após incubação a 80°C durante 30 minutos, EE -36-

(200 pl) foi adicionado, as amostras foram precipitadas e lavadas com EtOH e o DNA ressuspenso eni 5 μΧ de EE. Metade do DNA de cada amostra foi ligado a adaptadores Sau3A (50 ng) usando 6 unidades de DNA-ligase de (Pharmacia) em 100 μΧ a 15°C durante. 7 horas. Em adição, DNA de T1753 digerido com Sau3A e o fragmento BglII, clonado, cortado com Sau3A e puri^ ficado em gel foram ligados a adaptadores. EXEMPLO 4

CROMATOGRAFIA EM BI0TINA-CELUL0SE

Numa realização do presente inven to, a preparação de moléculas de ácido nucleico biotiniladas e não biotiniladas são incubadas na presença de avidina não ligada para remover as moléculas biotiniladas de amostra.

Para se conseguir efectuar tal pro cesso, adicionou-se avidina (10 μχ de 1 mg/ml de avidina por /tg de DNA modificado) à reacção de reassociação e misturou--se muito bem à temperatura ambiente. A reacção foi levada ate SHE 1 x pela adição de SHE 4 x e a mistura foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos. A biotina-celulose foi preparada misturando uma pasta a 50% (30 μΧ de pasta///g de DNA modificado) com SHE 4 x (333 /4L/ml de pasta) e tRNA de levedura (100 g/ml de pasta). A matrix foi então lavada duas vezes misturando com 50 ml de SHE 1 x e centrifugando durante 1 minuto numa centrífuga clínica. A mistura avidina: DNA foi adicionada ao sedimento de biotina-celulose lavado, agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos e vertida numa coluna de plástico ou ponta de pipeta rejeitável tapada na ponta com lã de vidro siliconizada. Como alternativa, o DNA pode ser ligado passando a mistura directamente numa coluna de biotina-celulose. A coluna foi lavada com SHE 1 x e as fracções contendo radioactividade foram colhidas. Estas fracções foram extraídas com 50% fenol/50% clorofórmio, con centradas duas vezes por extracção com sec-butanol, caso se -37-

pretenda , e depois combinad incubação durante 5 minuto nol e centrifugação durant nucleico foi ressuspenso e e deixado precipitar como ressuspenso em TE e pode s do com biotina ou amplific as com dois volumes de etan s num banho de neve carbóni e 5 minutos a 15 000 Xg, 0 m 0 ,5 ml de acetato de sódi ant eriorment e. 0 sed imento er combinado com novo DNA m ado ol. Após car eta ácido o, 0,3 M seco foi odifica-

J

J i

EXEMPLO 5

As amostras de DNA do Exemplo 4 foram sujeitas a 4 ciclos de hibridações subtractivas e cro-matografia de afinidade. Após cada ciclo as amostras foram amplificadas usando a reacção de cadeias com polimerase ou outros meios. 0 DNA amplificado foi marcado com 32p e usa(j0 como sonda em replicas de uma biblioteca genómica de levedura Aproximadamente 10^ colónias genómicas de levedura foram traní feridas para cada filtro. Após 4 ciclos de enriquecimento e amplificação não alteraram o número de colónias capazes de hi bridarem com o DNA amplificado ou de colónias específicas que hibridaram com o DNA marcado. Este resultado indica que o mé todo teve êxito no enriquecimento da sequência de gene preten dida (i.e. de tal modo que a mesma quantidade de DNA continha menos espécies além da sequência de gene pretendida e portan to foram capazes de hibridar com menos colónias na biblioteca genómica).

Numa experiência subsequente, as colónias que se verificou serem capazes de hibridar com o DNA marcado, enriquecido e amplificado foram testadas quanto à sua capacidade para hibridar com a sequência previamente cio nada que se sabia corresponder à deleção Del (lys 2).Todas as colónias que foram capazes de hibridar com o DNA presente após o quarto ciclo de enriquecimento e amplificação foram também capazes de hibridar com as sequências que se sabia corresponderem à deleção Del (lys 2). Este resultado mostra 4 -38-

que o método de facto resulta no enriquecimento da sequência de gene pretendida. EXEMPLO 6

MÉTODO PREFERIDO PARA A SUBTRAÇÃO

Para demonstrar esta realização do invento, as estufas de levedura atrás descritas TD33.3 (sem um fragmento BglIIde 5 Kb cobrindo o gene lys 2) e T1 753 f£ ram novamente usadas para clonar a região lys 2.

Para esta realização do invento, o DNA foi purificado e biotinilado como descrito atrás. 0 ác_i do nucleico tendo uma inserção ou contendo DNA correspondendo à deleção cuja clonagem se pretende foi incubado na presença de Sau3A (uma superdigestão de 10 vezes é aceitável). 0 DNA cortado foi ressuspenso a 0,1 pgl jul em EE. 0 DNA bio tinilado derivado de uma fonte portadora da deleção e não biotinilado de uma fonte tendo DNA que corresponde à deleção foram desnaturados, misturados e deixados hibridar com cadeias complementares como descrito atrás.

Em vez de usar avidina livre em solução como um meio para remover o DNA biotinilado indesejável, tal DNA foi removido da amostra ao deixar-se que se ligue a esferas de polistireno que foram previamente revestidas com avidina. Esferas revestidas com avidina adquiridas comercialmente foram tratadas para remover azida ou avidina livre, a qual pode estar associada a tais esferas. Para con seguir tal remoção, 2 ml de esferas de Avidina 5% (p/v) foram centrifugados durante 1 minuto numa microcentrifuga. 0 sobrenadante foi recuperado e rejeitado. 0 sedimento (conten do as esferas de avidina) foi ressuspenso em 1 ml de tampão EE. A suspensão foi centrifugada e lavada mais duas vezes, de cada vez usando 1 ml de tampão EE. 0 sedimento final foi -39

ressuspenso em EEN para 1,8 ml a fracção de esferas AP que se nas lavagens). ou aproximado ' (considerando calculou terem sido perdidos 0 DNA foi sonicado em 3 ml de EE em tubos não rentilizáveis de 15 ml. Tipicamente parte-se algumas centenas de /tg de DNA portador da deleção, de prefe rência durante 15 segundos usando um sonicador Ultrasonics modelo W-375 com uma microponta de modo contínuo (i.e. sem pulsos) com uma saída marcada para 5. Tal tratamento resultou numa preparação de DNA cujo DNA tinha um comprimento má dio de ~3 Kb. 0 comprimento medio do DNA não e crítico. No entanto, o DNA partido deverá ser suficientemente comprido para que a probabilidade de um fragmento não reagir com foto biotina seja negligível. Uma vez que cerca de 1 em 100 núcleo tídeos serão biotinilados, os fragmentos deverão ser bastante maiores que 100 pb. 0 DNA foi concentrado para 0,5 ml usando sec - Butanol ("sec - BuOH"). Adicionou-se aproxima-damente 2,5 ml de sec - BuOH por ml de água. A mistura foi agitada com vortex durante aproximadamente 10 segundos e centrifugada numa centrífuga clínica durante aproximadamente 10 segundos. A fase superior (sec - BuOH) foi removida e re jeitada. Facultativamente pode-se reextrair com sec - BuOH, usando um volume de sec - BuOH igual ao volume da fase aquo sa corrente. A fase aquosa foi fervida durante 3 minutos e adicionado 50 jug de 3M N.aOAc e a amostra foi misturada. Quan do se usa DNA de levedura, pode-se formar um precipitado bran co quando o NaOAe é adicionado após a concentração com sec-BuOH. Este material pensa-se ser um polissacárido e pode ser removido por centrifugação.

Adicionou-se então 1 ml de EtOH à amostra para precipitar o DNA. A precipitação com etanol foi conseguida por incubação da amostra durante 5 minutos num banho de neve carbónica/EtOH. A mistura foi depois centrifu- -40-

gada durante 5 minutos numa microcentrífuga, lavada em 100% de EtOH e seca. 0 DNA foi ressuspenso em água a 1 yug/yul - Uma vez que o Tris pode reagir com a fotobiotina, e preferível ressuspender em água do que em tampão Tris (como seja TE). 0 DNA foi biotinilado como se segue: 1 volume de 2 de fotobiotina (em água) foi mistu rado com 1 volume de 1 jug/j/l de DNA partido (em água) num tubo de microcentrífuga. Uma amostra (100/tl) da mistura de DNA/fotobiotina foi pipetada para o fundo de tubos de micro centrífuga de 2 ml (com fundos cónicos de grande ângulo). 0 tubo (tampa aberta) foi posto a flutuar num banho de gelo 10 cm abaixo de uma lampada como descrito atrás. Após ter-se dado a fotobiotinilação adicionou-se 0,2 volumes de 1M Tris pH9. Isto corresponde a 10% do volume corrente. A amostra foi extraída 4 vezes com n-BuOH saturado com água e a fase inferior (aquosa) foi guardada de cada vez. 0 volume da amos tra foi levado até 0,45 ml e 50 de 3M NaOAc foi adiciona do no tubo da microcentrífuga. A amostra foi precipitada com etanol como descrito atrás e a amostra final foi ressuspensa em 0,4 volumes de EE 2,5 x (i.e. a 2,5 A amostra fi nal estava então pronta para usar na hibridação subtractiva. EXEMPLO 7

HIBRIDAÇÃO SUBTRACTIVA

Para a primeira hibridação subtractiva, 5/d de 0,1 jjig/μΧ de DNA " + " digerido com Sau3A (conten do DNA correspondente à deleção que se pretende clonar 4^ de 2,5/íg//cL de DNA fotobiotinilado e partido (contendo DNA portador da deleção), 3/<1 de EE 10 X, 1 /ÃL de DNA marcador, marcado radioactivamente (N 10^ cpm do 84-mero sintéti- -41-

co atrás discutido) e 2 /1 de tRNA de levedura a 1 pg/ pl.

A mistura foi fervida durante 1 minuto, liofilizada e ressu£ pensa em 4 pl de água. Adicionou-se 1 ^ de 5M NaCl e a amos tra foi misturada e depois centrifugada. A amostra foi então incubada numa estufa de ar a 65°C para Cot?20 X 0 DNA hibridado foi incubado com as esferas revestidas com avidina previamente preparadas. A reacção de hibridação foi levada ate um volume de 100 pl com EEN e vortex. 100 pl das esferas de polistireno revestidas com avidina lavadas a 5% foram adicionadas a 100 pl da mistura de hibridação. A mistura foi então incubada durante 30 minutos à temperatura ambiente. 0 DNA não ligado foi colhido pip£ tando a mistura amostra/esferas para o copo de uma unidade de filtração para microcentrífuga (Millipore, #UFC3 0GV 00 é um tubo de microcentrífuga adequado tendo um copo removível contendo um filtro PVDF de 0,2 pua ) . A unidade foi então centrifugada durante 15 segundos numa microcentrífuga. 0 tu bo usado na hibridação e a ponta da pipeta foram então lavados com 200 pl de EEN e esta solução de lavagem foi adicionada ao copo da unidade de filtração. A unidade foi então centrifugada durante mais de 15 segundos (o volume do filtra do no tubo da unidade de filtração foi de~400 1). Adicionou--se ao filtrado cerca de 1 ml de EtOH e a amostra com EtOH foi precipitada como descrito atrás.

Para efectuar as hibridações sub-tractivas subsequentes, o sedimento foi ressuspenso na presença de 4 pl de DNA fotobiotinilado e partido a 2,5 pg! pl em EE 2,5 X. Se se desejar guardar uma amostra para amplificação, então o sedimento deverá ser ressuspenso em 4,4 pl de DNA e 0,4 pl guardado diluindo-o em 5 pl de TE (antes da fervura). Se houver preocupação acerca da presença de DNA genomico biotinilado na amostra, então o sedimento deverá ser ressuspenso em TE, deverá ser guardada uma amostra(e.g.1/ljj -42-

e o resto da amostra liofilizada e ressuspensa em 4 μΧ de 2,5 /cg/ μΧ de DNA biotinilado. A amostra ressuspensa destinada a usar nas hibridações subtractivas adicionais foi então fervi^ da durante 1 minuto, apos o que se adicionou 1 μΧ de 5M NaCl. A amostra foi então misturada e centrifugada e a quantidade de marcador radioactivo determinada por contagem Cerenkov. A amostra foi então incubada numa estufa de ar a 65°C de pr£ ferência sob óleo de parafina para minimizar qualquer evapo ração do solvente ate Cgt> 20 X C^i/2· 0 DNA não ligado foi colhido como descrito atrás.

Os fragmentos que possuem Tm’s perto ou abaixo de 65°C em IMNaCl não podem hibridar eficazmente nas condições de hibridação usadas nestas experiências e portanto serão encontrados na fracção não ligada após cada ciclo de subtração. Para assegurar que tais fragmentos fiquem totalmente desnaturados de modo a não poderem ser dotados de adaptadores e portanto não poderem ser amplificados o passo de incubação a temperatura elevada atrás descrito foi de pr£ ferência conduzido antes da adição dos adaptadores.

Assim, o DNA da estirpe selvagem TD33-3 foi cortado com Sau3A. 0 DNA da estirpe T1753 foi par tido por sonicação até um tamanho médio de 3000 pb. Partindo de 0,5 μΒ de DNA tipo selvagem e usando 20 Ag de DNA mutante com deleção e biotinilado em cada volta, efectuaram-se 5 ci^ cios de subtração na amostra preparada de acordo com o Exemplo 6. Após cada ciclo guardou-se uma amostra de DNA não ligado ao qual foram ligados adaptadores Sau3A. Uma fracção de cada amostra foi amplificada usando a reacção de cadeias com polimerase.

Para tal amplificação, uma fracção (e.g.1/.|Q) do DNA não ligado foi adicionada a um tubo de 500 μΧ contendo: 44 μΧ de água; 10 μΧ de 5M NaCl; 5 μΧ de EE 10 X 43-

e 1 μΐ de tRNA de levedura a 20 /ig/ /d. A mistura foi incuba da a 80°C durante 30 minutos numa máquina PCR ("Polymerase Chain Reaction") ou banho-maria. No final da incubação, 200 /JX de EE foram adicionados a amostra e o DNA precipitado com EtOH em 500 /d de EtOH como descrito atrás (-70°C, 5 minutos; centrífuga 5 minutos; lavagem com 100% EtOH, secagem.Apos tal precipitação o DNA foi ressuspenso em 5 /d de EE.

Para amplificar o DNA adicionaram--se adaptadores aos extremos. E desejável ligar adaptadores ao DNA vector digerido com Sau3A. Isto servirá como controle positivo na reacção de amplificação. Poderá também ser útil para ligar adaptadores ao DNA "+" original digerido com Sau3A.

Para adicionar tais adaptadores, 2,5 /d de DNA não ligado "fundido" foram misturados com 2 jú. do adaptador Sau3A a 25 mg/ /<1 lAÍde tampão de ligação, 10X 4 /d de TE e 0,5 μλ de DNA ligase de T4. A mistura de reacção foi incubada a 15°C durante 2 horas. EXEMPLO 8

AMPLIFICAÇÃO DE DNA E HIBRIDAÇÃ0 DE C0L0NIAS

Para a amplificação de DNA dotado de adaptadores (1/-|q da reacção de ligação) foi amplificado num sistema térmico cíclico (ericomp) com o "Kit" Gene Amp^ (parkin-Elmer Cetus Instruments) usando 0,5 yug de cadeia a-daptadora fosforilada GACACTCTCGAGACATCACCGTCC como iniciador. 0 iniciador foi fosforilado para facilitar a subsequente cio nagem do DNA amplificado. Cada um dos 50 ciclos incluiu 3 segmentos. 30 seg a 93°C, 30 seg a 55°C e 3 min a 72°C 0,5 /tg da cadeia adaptadora fosforilada foi usado para iniciar a reacção com polimerase. E importante usar a cadeia correcta (i.e. a cadeia cujo extremo 3' é parte do sítio Sau3A do a-daptador). A cadeia é de preferêncoa fosforilada para facili- -:: -44- S i

\

tar a clonagem do DNA amplificado. As testemunhas que se seguem são úteis; - 10 fg de DNA „+„ cortado com gau3A e provido de adaptadores; e um iniciador apenas controle (sem mol de ). 0 DNA amplificado (1 /Ίq da amostra) foi desnaturado na presença da cadeia do adaptador GACACTCTCG AGACATCACCGTCC (0,2 /<g) e marcado usando Z*-32p7 dCTP e o fragmento Klenow de DNA-polimerase I).

Removeram-se os nucleotídeos livres do DNA amplificado por centrifugação das amostras através de colunas (Mariatis e_t al_. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,

New York) (1982) compostas por Sephadex-G25 (Pharmacia)-exten sivamente lavado.

Uma análise electroforética do DNA amplificado derivado dos ciclos 1-3 foi efectuada usando um gel de 2% de agarose contendo brometo de etídio (EtBr) (0,25 M-g!/cl). Os produtos dos ciclos 4 e 5 pareceram idênticos ao do ciclo 3. Os produtos obtidos quando da amplificação de 10 fg do fragmento BglII clonado e cortado com Sau3A foram também detectados. 0 padrão de bandas obtido apos 3 ciclos parece quase idêntico ao padrão do fragmento BglII clonado e cortado com Sau3A que foi eliminado na estirpe TD33.3· Isto indicou que se conseguiu um grau elevado de enriquecimento para os fragmentos correspondendo à deleção apos 3 ciclos de subtração. Comparando o produto da digestão com Sau3A amplificado do fragmento com deleção clonado com o fragmento dige^ rido não amplificado, tornou-se aparente que várias bandas grandes não foram eficazmente amplificadas. De modo semelhan te, a comparação de DNA de T1 753 cortado com Sau3A não amplificado e amplificado indicou que os fragmentos superiores a cerca de 700 pb não foram eficazmente amplificados. Os fragmentos nas amostras não amplificadas não foram dotados de adaptadores e portanto migraram mais rapidamente do que os * 1

co rrespondentes fragmento s noutras faixa s. 0 DNA am plific ado d os ciclos 2 e3 fo i marcado e u sado como sonda par a os f iltro s com répli cas fe itas a partir de uma pl aca conte ndo ce rca d e 10 clone s ge nómicos de le vedura em plasmídeo s. Par a tal hibridação de co lónias, o DNA amplificado (1/1Q da amo str a) foi desnat ura- do na presença da cadeia adaptador a GACACTCTCGAGACATCACCGTCC (0,2 yUg) e marcado usando £í.-3^P J dCTP e o fragmento Klenow da DNA-polimerase I (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates e John Wiley & Sons, New York) (1987)). 0 plasmideo YIp33-3 contendo o gene lys 2 de levedura clonado foi digerido com BglII e Xhp I. Os dois fragmentos compreendendo o fragmento BglII que foi eliminado na estirpe TD33.3 foram purificados em gel e marca dos usando hexamers ao acaso como iniciadores (Feinberg et al Anal.Biochem. 137:266-267 (1984). Os filtros com as réplicas contendo cerca de 1X10^ clones genómicos de levedura foram hibridados com o DNA marcado (Hanahan £t al_. , Gene 10:63-67 ( 1 980); Grunstein et al_. , Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72 : 39 61 — 3965 (1975)). 0 fragmento BglII d e 5 Kb clonado que falta na estirpe TD33-3 foi marcado e h ib r id ado com um filtro de réplicas feito a partir da mesma pi aca . Os clones gen ómicos contendo sequênci as que foram eli mi nad asna estir pe TD33.3 foram observados por autoradiogra fi a d os 3 filtros de réplic as, como pontos qu e hibridaram com 0 fr agmento BglII de 5 Kb m arcado. Assim, 3 c iclos de subtraç ão ge nóraica pro- por cionar am enriquecimento suficiente para id ent ificar os clones contendo sequências que estão ausent es no mutante de del eção. A maior parte das colónias que hib ri dam com a sonda do ciclo 2 não contêm sequências eliminadas 1 no entanto, vá- rios sinais mais escuros são sobreponiveis com os pontos no filtro que foi despistado com as sequências eliminadas clo-nadas indicando algum enriquecimento no que respeita às sequências eliminadas o qual ocorreu após 2 ciclos de subtração.

Uma fracção pequena dos clones que foram localizados pela sonda de deleção clonada não surgiram como pontos no filtro do ciclo 3. A análise dos filtros em duplicado despistados com a sonda do ciclo 3 indicou que fa!L tam pontos devido a uma transferência infiel. Também, numa experiência de subtração genomica independente todos os clones que hibridaram com a sonda de deleção clonada foram também assinalados pela sonda experimental. cado e não ligado madamente 10 vezes Cerca de 95% dos c com as sequências A análise do DNA clonado, amplifi-indicou enriquecimentos médios de aproxi-durante cada um dos primeiros três ciclos, lones derivados do quarto ciclo hibridaram eliminadas.

Resultados semelhantes aos descritos atrás foram obtidos em mais duas experiências independen tes de subtração genomica. Numa experiência, foram necessários 5 ciclos de subtração para se obter resultados comparáveis aos descritos atrás. Na outra experiência (Exemplos 4 e 5) o DNA foi incubado com avidina livre e ligadas as amostras a uma matrix de biotina-celulose em vez de usar esferas reves tidas com avidina (Kasher et^ a^. , Mol.Cell. Biol. 6 : 3 11 7-31 27 (1986)). Enriquecimentos comparáveis aos aqui descritos foram obtidos após 4 ciclos na última experiência.

As tentativas para efectuar subtra ção genomica quando os adaptadores foram adicionados no começo da experiência (i.e.apos digestão com Sau3A do DNA tipo selvagem) não resultaram em enriquecimentos iguais aos aqui apresentados. Isto pode ser devido à amplificação de quanti dades significativas de DNA que permanece não ligado durante os passos de afinidade por razões que não sejam 0 facto de eles corresponderem a uma deleção cromossómica. 47- * '» «

Resumindo, usando subtração genómica isolámos eficazmente sequências que estão ausentes numa dele-ção que abrange 1/4000 do genoma de levedura. A clonagem de sequências que correspondem a deleções que representam frac-ções mais pequenas de um genoma deverá ser possível simplesmente efectuando mais ciclos de subtração.

J

Se bem que o invento tenha sido descrito em relação a realizações específicas dele, será com preendido que poderá ter outras modificações e este pedido pretende cobrir quaisquer variações, utilizações ou adaptações do invento seguindo, em geral, os princípios do invento e incluindo tais desvios da presente divulgação, como é prático corrente, na área em que o invento se inclui quando p£ dendo ser aplicados às características essenciais aqui descri tas atrás e de acordo com o âmbito das reivindicações apensas.

Claims (2)

1. -48- '♦ * REIVINDICAgÕES

   J J I 1â. - Método para o enriquecimento de uma sequência genética pretendida, ausente numa população de moléculas de ácido nucleico, mas presente numa outra, ca-racterizado por: a) se misturar uma primeira população de moléculas de ácido nucleico desnaturado, suspeitas de possuirem a refe rida sequência genética pretendida, com uma quantidade em ex cesso de uma segunda população de moléculas de ácido nucleico desnaturado suspeitas de não terem a referida sequência genética pretendida, em que a referida população de moléculas foi marcada com uma marca, e a referida primeira população de moléculas não tem a referida marca; b) se permitir a hibridação das moléculas misturadas das referidas primeiras e segundas populações de molécu las e, deste modo, formar moléculas de ácido nucleico de ca deia dupla; e c) se isolar quaisquer moléculas de da referida mistura, compostas unicamente por turadas da referida primeira população. 2S. - Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a referida marca da referida segunda população marcada de moléculas ser uma marca de bio tina ou uma marca de antigénio. cadeia dupla moléculas rena 3ã. - Método de acordo vindicação 1, caracterizado por o referido passo ender os sub-passos de: com a rei-(c) compre 49- » 1

   i) se incubar as referidas primeira e segunda po pulações de moléculas com um agente capaz de se ligar à referida marca da referida segunda população de moléculas. ii) se permitir que o referido agente se ligue à referida segunda população de moléculas; e iii) se separar qualquer uma da referida segunda população de moléculas da referida mistura, mediante a sepa ração selectiva, do referido agente ligado, juntamente com a sua molécula ligada e rotulada da referida segunda popula ção de moléculas, da referida mistura. 4â. - Método de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por a referida marca da referida segunda população de moléculas ser uma marca de biotina. 5^. - Método de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por o referido agente ser um anticorpo. vindicação 3, 6§. - caracterizado por Método de acordo com a Rei-o agente ser avidina. 7â. - Método de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por a referida avidina se encon trar em solução. 8â. - Método de acordo com a Reivindicação 7, caracterizado por a referida avidina em solução, depois de ligada à referida molécula marcada da referi da segunda população de moléculas, ser removida da solução juntamente com a referida molécula ligada e marcada, através de separação por afinidade com biotina, ou através de separa ção por imunoafinidade com um anticorpo anti-avidina. vindicação 9®. - 6, caracterizado por Método de acordo com a Rei-a avidina estar ligada. vindicação gada a uma
2. 103. - Método de acordo com a Rei-9, caracterizado por a referida avidina estar li pérola ou a uma resina. Lisboa, 6 de Dezembro de 1989

   Agsnts Oficia! da Prsprieáaes industrial RUA VICTCR COP.OON, 10-A, 1.* 1200 LIS0OA