ES2294777T3 - Sistema de amplificacion de adn mediado por ligasa termoestable para la deteccion de enfermedades geneticas. - Google Patents
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- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A LA CLONACION DE UN GEN DE UNA LIGASA TERMOFILICA DE DNA, A PARTIR DE LA CADENA HB8 DEL "THERMUS AQUATICUS" Y EL USO DE ESTA LIGASA PARA LA DETECCION DE SECUENCIAS ESPECIFICAS DE NUCLEOTIDOS EN UNA VARIEDAD DE MUESTRAS DE ACIDO NUCLEICO, Y MAS PARTICULARMENTE EN AQUELLAS MUESTRAS QUE CONTIENEN UNA SECUENCIA DE DNA CARACTERIZADA POR UNA DIFERENCIA EN LA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO A PARTIR DE UNA SECUENCIA ESTANDAR QUE INCLUYA CAMBIOS, ELIMINACIONES, INSERCIONES O TRANSUBICACIONES DE PARES BASES DE ACIDO NUCLEICO SIMPLE.
Description
Sistema de amplificación de ADN mediado por
ligasa termoestable para la detección de enfermedades genéticas.
Se han identificado más de 2000 afecciones como
efectos de un solo gen para los cuales el riesgo de producir
progenie afectada puede predecirse matemáticamente. Entre estas
afecciones en el hombre se incluye corea de Huntington, fibrosis
quística, eficiencia de antitripsina alfa_{1}, distrofia muscular,
síndrome de Hunter, síndrome de Lesch-Nyhan,
síndrome de Down, enfermedad de Taylor-Sachs,
hemofilias, fenilcetonuria, talasemias, y anemia de células
falciformes.
Se han desarrollado recientemente tres técnicas
importantes para detectar de modo directo estos cambios, deleciones,
inserciones, translocaciones u otras mutaciones de pares de bases
de ácido nucleico simples. Sin embargo, dos de estas técnicas no
pueden automatizarse fácilmente. En la primera de dichas técnicas,
la presencia o ausencia de la mutación en una muestra clínica de un
paciente se detecta por análisis de un material digerido por
restricción del DNA del paciente utilizando transferencia Southern
[véase Journal of Molecular Biology 98:503 (1975)]. Sin embargo, la
técnica de transferencia Southern no puede utilizarse para
enfermedades genéticas en las cuales la mutación no altera un sitio
de restricción como, por ejemplo, en la deficiencia de antitripsina
alfa_{1}. La segunda técnica consiste en la utilización de sondas
de DNA, lo que implican la síntesis de un oligonucleótido de
aproximadamente 19 pares de bases que es complementario a la
secuencia de DNA normal alrededor del sitio de mutación. La sonda
se marca y se utiliza para distinguir genes normales de genes
mutantes por aumento de la severidad de hibridación hasta un nivel
en el cual la sonda se hibridará de manera estable al gen normal,
pero no al gen mutante con el que la misma tiene un desapareamiento
de un solo par de bases [véase Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278
(1983)]. El método original se ha modificado por inmovilización del
oligonucleótido y sondeo con una muestra amplificada por PCR
marcada. En esta modificación, se deja que la muestra se hibride a
un oligonucleótido inmovilizado y se elimina luego por lavado
aumentando la severidad de hibridación como se ha descrito arriba
[véase Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230 (1989)]. Se han
desarrollado otros métodos que utilizan iniciadores PCR
fluorescentes para amplificar específicamente una mutación o un
alelo [véase Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9178 (1989)]. Este método
requiere la separación de productos de los iniciadores mediante
columnas de centrifugación o electroforesis en gel y por tanto no es
susceptible de automatización en gran escala. La tercera técnica
utiliza la presencia tanto de sondas de diagnóstico como de sondas
contiguas en condiciones en las cuales la sonda de diagnóstico se
mantiene unida de modo sustancialmente covalente a la sonda
contigua únicamente en el caso en que el ácido nucleico de la
muestra contiene la secuencia diana exacta. Adicionalmente, la
sonda oligonucleotídica de diagnóstico puede contener un
"gancho" (por ejemplo, un oligonucleótido biotinilado) que es
capturado (por ejemplo, por estreptavidina) como un medio de
aumentar la eficiencia de la técnica, y la sonda contigua puede
contener un resto detectable o marcador [véase Science 241:1077
(1988) y la patente U.S. 4883750].
Aunque no siempre es necesario, la detección de
mutaciones de un solo par de bases en DNA va precedida usualmente
por técnicas para aumentar o amplificar la cantidad de material
muestra de DNA. Existen varias técnicas para realizar la
amplificación de ácido nucleico, entre las cuales se encuentran: (1)
la reacción en cadena de polimerasa, que puede amplificar DNA un
millón de veces a partir de una sola copia en cuestión de horas
utilizando polimerasa Taq y realizando 20 a 30 ciclos de
reacción en un instrumento de ciclación térmica [véase Science
239:487 (1988), y las Patentes de Estados Unidos 4683195, 4683202, y
4800159]; (2) la replicación auto-sostenida de la
secuencia o 3SR puede amplificar DNA o RNA diez millones de veces a
partir de una sola copia en menos de una hora utilizando
transcriptasa inversa, RNA-polimerasa T7, y Rnasa H
en condiciones isotermas a 37ºC [véase Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:1874 (1990)]; y (3) la Beta Replicasa Q puede replicar varios
miles de moléculas de RNA que contienen una secuencia de
reconocimiento especial de 300 pb mil millones de veces en 30
minutos. Están disponibles técnicas adicionales, y una de ellas, la
reacción en cadena de ligasa, se expone en la descripción siguiente
de la ligasa termófila clonada.
Además de diversas enfermedades genéticas que
pueden diagnosticarse utilizando la presente invención, pueden
diagnosticarse diversas enfermedades infecciosas por la presencia en
una muestra clínica de una secuencia de DNA específica
característica del microorganismo causante. Éstos incluyen
bacterias, virus y parásitos. En tales procedimientos, puede estar
presente un número relativamente pequeño de organismos patógenos en
una muestra clínica procedente de un paciente infectado y el DNA
extraído de estos organismos puede constituir sólo una fracción muy
pequeña del DNA total en la muestra. Sin embargo, la amplificación
específica de secuencias específicas de patógenos sospechosos antes
de la inmovilización y detección por hibridación de las muestras de
DNA debería mejorar notablemente la sensibilidad y especificidad de
los procedimientos tradicionales. Adicionalmente, la amplificación
es particularmente útil si un análisis de este tipo debe realizarse
sobre una muestra pequeña utilizando técnicas de detección no
radiactivas que pueden ser inherentemente insensibles, o en los
casos en que se emplean técnicas radiactivas, pero en los cuales es
deseable una detección rápida.
Aunque están disponibles técnicas tales como
éstas, la búsqueda de otras técnicas para determinación de
mutaciones de un solo par de bases continúa. La presente invención,
es decir la amplificación de DNA por una reacción en cadena de
ligasa (LCR) utilizando la ligasa de DNA termófila de Thermus
aquaticus para detectar una secuencia diana de DNA forma parte
de dicho esfuerzo continuado.
Aunque se han intentado otras técnicas que
utilizan DNA-ligasa de E. coli o T4 para
amplificación de DNA, se ha encontrado que éstas son inaceptables
debido a niveles elevados de "ruido" de fondo (al cabo de un
número tan pequeño como 10 ciclos), condición que no existe en la
reacción en cadena de ligasa de acuerdo con la presente
invención.
Se ha intentado también la amplificación y/o
detección de DNA utilizando ligasas específicas. Por ejemplo, ha
sido consignada una reacción de amplificación de ligasa [véase Gene
76:245 (1989)] que puede amplificar DNA partiendo de 500.000 copias
en 95 horas, utilizando 75 ciclos y restableciendo la
DNA-ligasa T4 utilizada después de cada ciclo. Sin
embargo, esta técnica publicada es lenta y requiere la adición de
ligasa T4 nueva en cada paso, requisitos ambos que hacen esta
técnica publicada inaceptable para automatización. La reacción en
cadena de ligasa de acuerdo con la presente invención permite la
amplificación de DNA a partir de 200 copias en 3 horas utilizando
30 ciclos y no requiere la adición de ligasa después de cada
ciclo.
A lo largo de la descripción siguiente de la
presente invención, se utilizará terminología específica para el
campo tecnológico. Con objeto de evitar cualquier interpretación
equivocada en cuanto a lo que se está citando, y proporcionar al
lector una comprensión clara de lo que se describe, se utilizarán
las definiciones siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
- "Amplificación" hace referencia al aumento en el número de copias de un fragmento de ácido nucleico particular resultante, o bien de una reacción enzimática en cadena (tal como una reacción en cadena de polimerasa, una reacción en cadena de ligasa, o una replicación de secuencia auto-sostenida), o de la replicación del vector en el que se ha clonado.
- "Ligación de extremos romos" hace referencia al enlace covalente de dos extremos de DNA que son completamente lisos, es decir que no tienen ningún saliente cohesivo final.
- "Célula", "línea de células", y "cultivo de células" pueden utilizarse intercambiablemente y la totalidad de dichas designaciones incluyen progenie. Así, los términos "transformantes" o "células transformadas" incluyen la célula primaria en cuestión y cultivos derivados de ella sin relación al número de transferencia. Se entiende también que toda la progenie no puede ser exactamente idéntica en el contenido de DNA debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Sin embargo, se incluye toda la progenie mutante que tiene la misma funcionalidad que la seleccionada en la célula transformada originalmente.
- "Clon" hace referencia a un grupo de moléculas, células u organismos genéticamente idénticos que descienden asexualmente de un ancestro común. "Clonación" es el proceso de propagación de dichas moléculas, células u organismos idénticos. Las técnicas de DNA recombinante cohesivo hacen que sea posible clonar genes individuales; a esto se hace referencia como "clonación molecular".
- "Unión covalente" hace referencia a la formación de un enlace químico covalente entre dos sustancias.
- "Ciclo" hace referencia a un solo proceso de fusión y enfriamiento de DNA. Por ejemplo, a temperaturas muy altas tales como 94ºC, virtualmente todo el DNA bicatenario (con independencia de su longitud) se desenrolla y funde. Si se hace bajar la temperatura (hasta 45-65ºC) en presencia de oligonucleótidos complementarios, éstos pueden hibridarse a las secuencias correctas del DNA desenrollado fundido. El DNA que ha sido fundido y enfriado en presencia de oligonucleótidos complementarios es ahora un sustrato para la reacción de ligasa del DNA. Véase "T_{m}".
- "Porción de diagnóstico" hace referencia a aquella porción de la secuencia diana que contiene el cambio de nucleótido, cuya presencia o ausencia debe detectarse. "Porción contigua" se refiere a una secuencia de DNA que es una continuación de la secuencia de nucleótidos de dicha porción de la secuencia seleccionada como diagnóstico. La continuación puede tener lugar en cualquier dirección.
\vskip1.000000\baselineskip
Se reconocerá, basándose en la descripción
siguiente, que la posición precisa de los oligonucleótidos
seleccionados que contienen la porción de diagnóstico es
arbitraria, excepto que la misma debe contener el o los nucleótidos
que diferencian la presencia o ausencia de la secuencia diana en uno
de sus extremos. Así, el oligonucleótido que contiene la porción
contigua continúa la secuencia de este oligonucleótido seleccionado
arbitrariamente que contiene la porción de diagnóstico de tal modo
que el o los nucleótidos de diagnóstico se encuentra(n) en
la unión de los dos oligonucleótidos.
\vskip1.000000\baselineskip
"Endonucleasa" hace referencia a una enzima
(v.g., endonucleasa de restricción, Dnasa I) que corta el DNA en
sitios internos de la molécula.
"Sistema de expresión" se refiere a
secuencias de DNA que contienen una secuencia codificante deseada y
secuencia de control en enlace que puede hacerse operativo de tal
manera que los hospedadores transformados con estas secuencias son
capaces de producir las proteínas codificadas. Con objeto de
efectuar la transformación, el sistema de expresión puede estar
incluido en un vector, o el DNA vector transformado puede integrarse
también en el cromosoma hospedador.
"Gen" hace referencia a una secuencia de
DNA que codifica un polipéptido bioactivo recuperable o precursor.
El polipéptido puede estar codificado por una secuencia de gen de
longitud total o cualquier porción de la secuencia codificante con
tal que se retenga la actividad enzimática.
"Genoteca de genes" o "genoteca" hace
referencia a un conjunto de fragmentos clonados aleatoriamente que
abarcan sustancialmente el genoma completo de una especie dada. Se
hace referencia también a esto como un banco de clones o una
colección de perdigonada.
"Genoma" hace referencia al DNA entero de
un organismo.
"Gancho" hace referencia a una modificación
de una sonda que permite al usuario aislar rápida y convenientemente
sondas que contienen esta modificación por "captura" del
gancho. La interacción entre el gancho y el mecanismo de captura
puede ser, por ejemplo, unión covalente o fijación ligando/receptor
de afinidad suficiente. Tales ganchos pueden incluir antígenos que
pueden ser recuperados por anticuerpos, biotina que puede ser
recuperada por avidina o estreptavidina, secuencias de DNA
específicas que pueden ser recuperadas por ácido nucleico
complementario, o proteínas de fijación del DNA (represores), y
grupos funcionales químicos específicamente reactivos que pueden
ser recuperados por otros grupos reactivos apropiados.
"Hibridación" y "fijación", en el
contexto de las sondas y del DNA desnaturalizado fundido se utilizan
intercambiablemente. Las sondas que se hibridan o fijan a DNA
desnaturalizado están apareadas en bases o "agregadas" a
secuencias complementarias en el polinucleótido. El que una sonda
particular permanezca o no apareada en bases o agregada con el
polinucleótido depende del grado de complementariedad, de la
longitud de la sonda, y de la severidad de las condiciones de
fijación. Cuanto mayor es la severidad, tanto mayor debe ser el
grado de complementariedad, y/o tanto más larga debe ser la
sonda.
"Fragmento Klenow" hace referencia a un
polipéptido de 76.000 daltons obtenido por digestión proteolítica
parcial de la DNA-polimerasa I. Esta enzima posee
las actividades de polimerasa 5'\rightarrow3' y exonucleasa
3'\rightarrow5', pero no la actividad 5'\rightarrow3' de la
DNA-polimerasa I.
"Marcador" hace referencia a una
modificación del ácido nucleico sonda que permite al usuario
identificar el ácido nucleico marcado en presencia de ácido
nucleico sin marcar. En la mayoría de los casos, éste es el
reemplazamiento de uno o más átomos con isótopos radiactivos. Sin
embargo, otros marcadores pueden emplearse en lugar de los isótopos
como, por ejemplo, cromóforos unidos covalentemente, restos
fluorescentes, enzimas, antígenos, grupos con reactividad
específica, restos quimioluminiscentes, y restos detectables por vía
electroquímica.
"Ligasa" hace referencia a una enzima que
cataliza la formación de un enlace fosfodiéster en el sitio de una
rotura monocatenaria en DNA dúplex. La enzima ligasa cataliza
también la unión covalente del DNA dúplex; extremo romo a extremo
romo, o un extremo cohesivo a otro extremo cohesivo
complementario.
"Reacción en Cadena de LIgasa (LCR)" hace
referencia a la amplificación de un producto de ligación de
oligonucleótidos. Por ejemplo, si se diseñan oligonucleótidos tales
que los productos de DNA de un ciclo pueden convertirse en los
sustratos de DNA del ciclo siguiente, la repetición de tales ciclos
causará una amplificación exponencial del DNA (una "reacción en
cadena"). Dado que una enzima ligasa termófila es capaz de
mantenerse activa durante muchos ciclos de fusión y enfriamiento de
DNA, esto hace posible que se produzca rápida y automáticamente una
amplificación de DNA en un solo recipiente de reacción sujeto a
muchos ciclos térmicos en los cuales se amplifica el producto de
ligación del oligonucleótido.
"Reacción de detección de ligasa (LDR)"
hace referencia al uso de dos oligonucleótidos adyacentes para la
detección de secuencias específicas con ayuda de una ligasa
termófila con amplificación lineal del producto.
"Secuencia de DNA-ligasa"
hace referencia a la secuencia de DNA en Thermus aquaticus
HB8 para la ligasa termófila que comprende, en el término amino de
la proteína ligasa, la secuencia de ácido nucleico siguiente:
Los aminoácidos correspondientes son:
"Ligación" hace referencia a la unión
covalente de secuencias de polinucleótidos juntas para formar una
sola secuencia. Esto se realiza típicamente por tratamiento con una
ligasa que cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre el
extremo 5' y de una secuencia y el extremo 3' de la otra. Sin
embargo, en el contexto de la invención, el término "ligación"
tiene por objeto abarcar otros métodos para unir covalentemente
tales secuencias, v.g., por medios químicos. Los términos "unión
covalente" y "ligación" pueden utilizarse de modo
intercambiable.
"Actividad de cierre de mella" hace
referencia al enlace covalente de cadenas adyacentes de DNA. La
misma puede utilizarse para ensayar la actividad de ligasa en
virtud de la conversión de DNA abierto circular (OCDNA) en el DNA
circular cerrado covalentemente (CCCDNA) y determinación de la
velocidad a la cual migra el espécimen de DNA en un gel de agarosa
teñido con bromuro de etidio (el OCDNA migra más lentamente que el
CCCDNA).
"Oligonucleótido" hace referencia a una
molécula constituida por dos o más desoxirribonucleótidos o
ribonucleótidos, preferiblemente más de tres. Su tamaño exacto
dependerá de la función o uso últimos del oligonucleótido. El
oligonucleótido puede derivarse sintéticamente o por clonación.
"Enlazado operativamente" se refiere a la
yuxtaposición de tal modo que puede realizarse la función normal de
los componentes. Así, una secuencia codificante "enlazada
operativamente" a secuencias de control hace referencia a una
configuración en la cual las secuencias codificantes pueden
expresarse bajo el control de las secuencias de control.
"Cepa superproductora" hace referencia a
una cepa de bacterias u otra célula hospedadora que puede ser
inducida a producir en exceso una enzima o sustancia química
particular.
"Polimerasa" hace referencia a enzimas que
catalizan el ensamblaje de desoxirribonucleótidos en DNA.
"Reacción en cadena de polimerasa (PCR)"
hace referencia a un proceso patentado [descrito en las Patentes de
Estados Unidos 4683202 y 4683195] para la amplificación exponencial
de un fragmento de DNA específico por utilización de dos
iniciadores oligonucleotídicos que se hibridan a las cadenas
opuestas y flanquean la región de interés en un DNA diana. El
proceso consiste en una serie repetitiva de ciclos que implican
desnaturalización del molde, reasociación de iniciador, y la
extensión de los iniciadores reasociados por
DNA-polimerasa Taq.
"Sonda" hace referencia a un
oligonucleótido diseñado para ser suficientemente complementario a
una secuencia en un ácido nucleico desnaturalizado a sondar (en
relación con su longitud) para fijarse en condiciones de severidad
seleccionadas. "Sonda contigua", describe una sonda que es
complementaria a la porción contigua. "Sonda de diagnóstico"
describe una sonda que es complementaria a la porción de
diagnóstico. "Sonda diana" describe una sonda que es
complementaria a la secuencia diana y se produce por unión covalente
(ligación) de la sonda de diagnóstico y la sonda contigua.
"Grupo informador" hace referencia a un
grupo que significa la presencia de un resto particular (véase
"marcador").
"Endonucleasas de restricción" se refiere a
aquellas enzimas que cortan el DNA por reconocimiento de secuencias
específicas internas de la molécula y corte subsiguiente del DNA en
ambas cadenas en sitios que se encuentran dentro o fuera de la
secuencia de reconocimiento.
"Ligación de extremos cohesivos" hace
referencia a la unión covalente de dos extremos de DNA que contienen
salientes monocatenarios 5' o 3' que tienen usualmente, pero sin
carácter limitante, una longitud de 1 a 5 nucleótidos.
"Severidad" se refiere a la combinación de
condiciones a las que se someten los ácidos nucleicos que hacen que
el DNA bicatenario se disocie en sus cadenas simples componentes;
entre éstas se encuentran valores extremos de pH, temperatura
elevada, y concentración de sal. "Severidad alta" se refiere a
las condiciones, específicamente de hibridación y lavado, que son
suficientes para permitir la detección de secuencias singulares
utilizando una sonda oligonucleotídica o secuencias estrechamente
afines en protocolos estándar de hibridación Southern [como se
describe en J. Mol. Biol. 98:503 (1975)].
"T_{m}" hace referencia a la temperatura
a la que se desenrollan y se separan dos cadenas de DNA
complementarias. Ésta es función de la longitud del DNA
monocatenario y de su composición de bases - para fragmentos
pequeños, un valor aproximado de T_{m} en ºC es igual a
4(G+C) + 2(A+T). Por ejemplo, un oligonucleótido que
tiene 5 bases G, 7 bases C, 5 bases A, y 4 bases T tiene una
temperatura de 4(5+7) + 2(5+4) o 66ºC.
"Secuencia diana" hace referencia a una
secuencia de ácido nucleico, cuya presencia o ausencia se desea
detectar. En el contexto de una aplicación preferida del método de
acuerdo con la presente invención, se trata de una secuencia que
forma parte de una región codificante en un gen asociado con una
enfermedad genética, tal como la anemia de células falciformes. En
muchas enfermedades de este tipo, la presencia de la aberración
genética se caracteriza por pequeños cambios en la secuencia
codificante; en la mayoría de los casos, los individuos normales
tienen secuencias que difieren en un solo nucleótido de las
secuencias correspondientes presentes en los individuos afectados
por la "deficiencia" genética. En el método de acuerdo con la
presente invención, puede utilizarse como secuencia diana la
secuencia normal o la alterada.
"Enzima termófila" se refiere a una enzima
que funciona a temperaturas altas de 50 a 90ºC; algunas de ellas
pueden sobrevivir a una exposición breve a temperaturas de 94 a
100ºC, a las cuales las enzimas normales se desnaturalizan y se
vuelven por tanto inactivas.
"Ligasa termoestable" hace referencia a una
enzima que es estable al calor, es termorresistente, y cataliza
(facilita) la ligación, a temperaturas altas de 50 a 90ºC, de
oligonucleótidos adyacentes de la manera apropiada para formar un
producto que es complementario a la cadena de ácido nucleico diana.
Generalmente, la enzima activa el extremo 5' de un oligonucleótido
y enlaza éste con la cadena 3' de una molécula de DNA adyacente.
Sin embargo, pueden existir enzimas termoestables que utilizan otros
mecanismos para unirse covalentemente a oligonucleótidos
adyacentes. La ligasa termoestable puede, en las condiciones
apropiadas, enlazarse covalentemente a cierto número de sustratos
de ácido nucleico diferentes a temperaturas altas de 50 a 90ºC, por
ejemplo cierre de "mellas" en DNA, y ligaciones de extremos
cohesivos y extremos romos.
La enzima termoestable utilizada en la presente
invención debe satisfacer un criterio simple para ser eficaz en la
reacción de amplificación, a saber, la enzima no debe
desnaturalizarse (desactivarse) irreversiblemente, cuando se somete
a las temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para
efectuar la desnaturalización de ácidos nucleicos bicatenarios. Por
"desnaturalización irreversible", tal como se utiliza en este
contexto, se entiende un proceso que da lugar a una pérdida
permanente y completa de la actividad enzimática. Las condiciones
de calentamiento necesarias para la desnaturalización dependerán,
v.g., de la concentración de sal tampón y la longitud y composición
de nucleótidos de los ácidos nucleicos que se desnaturalizan, pero
típicamente están comprendidas desde aproximadamente 85ºC, para los
oligonucleótidos más cortos hasta aproximadamente 105ºC durante un
tiempo que depende fundamentalmente de la temperatura y la longitud
del ácido nucleico, por regla general desde aproximadamente 0,25
minutos para los oligonucleótidos más cortos a 4,0 minutos para
fragmentos de DNA más largos. Pueden tolerarse temperaturas más
altas a medida que aumenta la concentración de sal tampón y/o la
composición de GC del ácido nucleico. Preferiblemente, la enzima no
llegará a desnaturalizarse de modo irreversible a aproximadamente
90 a 100ºC. La enzima termoestable utilizada en la presente
invención tiene una temperatura de funcionamiento óptima, que es
mayor que aproximadamente 45ºC, comprendida probablemente entre 50
y 90ºC, y óptimamente entre 60 y 80ºC.
Una comprensión más exhaustiva y completa de la
clonación de la secuencia de la ligasa termófila y el uso de esta
enzima en el procedimiento de amplificación de DNA mediado por
ligasa termófila para la detección de diferencias de secuencias de
un solo par de bases en enfermedades genéticas puede obtenerse por
referencia a las figuras y ejemplos que siguen, que se presentan
únicamente a modo de ilustración y no tienen por objeto, ni deben
considerarse por tanto, como limitantes del alcance de la invención
reivindicada.
Con referencia específica a las figuras,
Fig. 1 es una representación gráfica de los
plásmidos pDZ1 y pDZ7;
Fig. 2 es un diagrama de flujo de la Reacción en
Cadena de Ligasa (LCR) de acuerdo con la presente invención;
Fig. 3 es un autorradiograma que demuestra la
especificidad de la ligasa termófila de T. aquaticus en
condiciones de amplificación tanto LDR como LCR.
Fig. 4 es un autorradiograma que demuestra la
amplificación LCR para concentraciones de diana diferentes;
Fig. 5 es un autorradiograma que demuestra la
detección de alelos de \beta-globina utilizando
DNA genómico humano.
Fig. 6 es una visión de conjunto de un ensayo de
ligación de oligonucleótidos basado en ELISA.
Fig. 7 es una representación fotográfica de
electroforesis en gel SDS-poliacrilamida al 10% de
la ligasa termoestable en diferentes etapas de purificación.
Fig. 8 es una segunda representación fotográfica
de electroforesis en gel SDS-poliacrilamida al 10%
de la ligasa termoestable, en diferentes etapas de
purificación.
Fig. 9 es una representación gráfica de tres
clones utilizados en la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
En Fig. 7, las pistas A y G representan
proteínas marcadoras (los pesos moleculares se dan en kd); B
representa células enteras después de la inducción; C representa el
sobrenadante bruto después de sonicación; D representa el flujo
directo de DEAE agrupado después de tratamiento térmico; y E y F
representan las fracciones 23 y 24 después de cromatografía con
fosfocelulosa. En Fig. 8, las pistas A y H representan proteínas
marcadoras (se dan los pesos moleculares en kd); B representa
células enteras después de la inducción; C representa el
sobrenadante bruto después de sonicación; D representa el flujo
directo de DEAE agrupado después de tratamiento térmico; E
representa la fracción 23 después de cromatografía con
fosfocelulosa; F representa la fracción 23 incubada con DNA mellado
en tampón de ligasa en ausencia de NAD, y G representa la fracción
23 incubada con NAD en tampón de ligasa en ausencia de DNA mellado.
En Fig. 8, la ligasa de peso molecular más alto (aproximadamente 81
kd) es la forma adenilada, mientras que la ligasa de peso molecular
más bajo (aproximadamente 78 kd), no está adenilada.
Los plásmidos representados en Fig. 1 han sido
depositados en, y aceptados por, una agencia de colección bajo las
reglas de depósito del Tratado de Budapest. El plásmido pDZ1 se ha
incorporado en una bacteria hospedadora (E. coli, cepa
AK53), depositada en la American Type Culture Collection, y ha
recibido el número de recepción ATCC No. 68307. El plásmido pDZ7 se
ha incorporado en una bacteria hospedadora (E. coli, cepa
AK53), depositada en la American Type Culture Collection, y ha
recibido el número de recepción ATCC No. 68308.
Si bien pueden utilizarse otros métodos, por lo
general, la producción de la ligasa termófila se realizará por
medios recombinantes que implican típicamente lo siguiente:
En primer lugar, se obtiene un DNA que codifica
la enzima madura (tal como se utiliza en esta memoria, el término
incluye todas las muteínas) o una fusión de la ligasa termófila a
una secuencia adicional que no destruye su actividad o a una
secuencia adicional que puede escindirse en condiciones controladas
para producir una proteína activa. Si la secuencia está
interrumpida por intrones, la misma es adecuada para expresión en
cualquier hospedador. No obstante, la secuencia debería encontrarse
en una forma escindible y recuperable. Utilizando la tecnología
PCR, por ejemplo, la mayoría de las secuencias de DNA que codifican
enzimas pueden amplificarse y recuperarse por tanto en una forma
"escindida".
La secuencia codificante escindida o recuperada
se pone luego en unión operativa con secuencias de control
adecuadas en un vector de expresión replicable que se utiliza para
transformar un hospedador adecuado. EL hospedador transformado se
cultiva luego en condiciones adecuadas para efectuar la producción
de la ligasa termófila recombinante, y la ligasa se aísla y
purifica por medios conocidos.
Cada uno de los procedimientos anteriores puede
realizarse de una diversidad de maneras. Por ejemplo, las
secuencias codificantes deseadas pueden obtenerse a partir de
fragmentos genómicos y utilizarse directamente en hospedadores
apropiados; las construcciones para vectores de expresión operativos
en una diversidad de hospedadores se realizan utilizando replicones
y secuencias de control apropiados(as); y los sitios de
restricción adecuados pueden, si no están disponibles normalmente,
añadirse a los extremos de la secuencia codificante a fin de
proporcionar un gen escindible para inserción en el vector
apropiado.
Las secuencias de control, los vectores de
expresión, y los métodos de transformación dependen del tipo de
célula hospedadora utilizado para expresar el gen. Generalmente, los
hospedadores bacterianos son los más eficientes y convenientes para
la producción de proteínas recombinantes y por consiguiente se
prefieren para la expresión de la ligasa termófila. No obstante,
otros hospedadores tales como células de levadura, planta, insecto
o mamífero pueden ser utilizados también si es conveniente. Para los
propósitos de la presente invención, se considera que una fuente de
la célula hospedadora es equivalente a cualquier otra fuente de
célula hospedadora disponible y adecuada.
Se aisló DNA de la cepa HB8 de Thermus
thermofilus (ATCC No. 27634). Esta cepa ha sido reclasificada
recientemente como cepa HB8 de Thermus aquaticus [véase
Arch. Microbiol 117:189 (1978)].
Las células se cultivaron durante una noche a
75ºC en una máquina de sacudidas en baño de agua con caldo TAB
[véase Nuc. Acids Res., páginas 6795-6804 (1981)]
(que contiene por litro 5 g de triptona Bacto^{TM}, 3 g de
extracto de levadura, 2 g de NaCl, y 1 g de dextrosa) ajustado a pH
7,2-7,5 con NaOH, y se recogieron por
centrifugación para dar 3,1 g de peso húmedo a partir de 800 ml de
medio. Las células se resuspendieron en 15 ml de tampón Tris 50 mM
de pH 8,0 que contenía EDTA 50 mM y 15 mg de lisozima de clara de
huevo. Las células resuspendidas se lisaron por adición de 2 ml de
dodecilsulfato de sodio al 10% (peso/volumen) seguido por
incubación a 37ºC durante 15 minutos y 2 ciclos repetidos de
congelación a -50ºC, y descongelación a 37ºC. La solución acuosa se
extrajo secuencialmente con volúmenes iguales de fenol acuoso
(preequilibrado a pH 7,5 con borato de sodio), seguido por
fenol/cloroformo, y finalmente cloroformo.
Los ácidos nucleicos se precipitaron por mezcla
con dos volúmenes de etanol al 95%, enfriamiento a -50ºC durante 15
min, y se redujeron a un sedimento por centrifugación. Después de
retirada del sobrenadante y secado del sedimento, los ácidos
nucleicos se resuspendieron en 1 ml de tampón TE (Tris HCl 10 mM, pH
8,0, que contenía EDTA 1 mM). Se digirió el RNA por adición de 100
\mug de RNasa A a cada ml de suspensión, y la mixtura se incubó a
37ºC durante 1 h. Se precipitó el DNA por adición de un volumen 10
veces menor de acetato de sodio 3 M y 3 vol. de etanol de 100%, se
enfrió a -50ºC durante 15 min, se redujo a un sedimento por
centrifugación, se lavó con etanol de 70%, y finalmente se
resuspendió en tampón DE a una concentración final de 2 mg/ml.
Aunque el DNA utilizado en el ejemplo dado
anteriormente se aisló a partir de Thermus aquaticus, la
ligasa termófila resultante que tenía las propiedades necesarias
para la presente invención puede tener como su fuente inicial DNA
aislado de otras especies de Thermus u otras bacterias, fagos
o virus termófilos.
El DNA aislado de la cepa HBB de T.
aquaticus no puede ser escindido por las endonucleasas de
restricción Taq I (cuya secuencia de reconocimiento es TCGA)
o Eco RI (cuya secuencia de reconocimiento es GAATTC). La
imposibilidad de escindir ciertas secuencias es consecuencia de la
metilación protectora [véase H.O. Smith y S.V. Kelly, DNA
Methylation: Biochemistry and Biological Significance, compiladores
Razin, Cedar y Riggs, p. 39-71,
Springer-Verlag Inc., Nueva York (1987)] en la
posición N6 de los residuos adenina. Investigadores anteriores
[véase J. Bact. 169: 3243 (1987)] han demostrado que existe un gen,
denominado mrr, que restringe el DNA metilado en adenina de
la forma G-6MeANTC y CTGC-6MeAG. En
la clonación de la endonucleasa de restricción Taq I y
metilasa, se encontró que varias cepas de E. coli restringen
el DNA metilado en TCGA, un efecto atribuido originalmente (pero
incorrectamente) al gen mrr [véase Gene 56:13 (1987) y Nuc.
Acids Res. 15:9781 (1987)]. Trabajos recientes realizados en el
Cornell University Medical College ha demostrado la presencia de un
gen adicional, aparte de mrr, que codifica una proteína que
restringe el DNA metilado en TCGA. Resumidamente, se utilizaron
cepas que contenían un transposón Tn5 (Km^{R}) que interrumpe el
gen mrr [véase J. Bact. 169: 3243 (1987)] para la transducción [de
acuerdo con J.H. Miller en Experiments in Molecular Genetics, Cold
Spring Harbor Laboratory, pp 201-205 (1972)] del
marcador Km^{R} en varias cepas de Escherichia coli que
dieron como resultado la conversión de la cepa a un genotipo
mrr -(proteína deficiente en mrr). Ninguna de estas cepas
transducidas podía tolerar el gen de la metilasa Taq, lo que
indicaba que existe un segundo gen responsable de la restricción
del DNA metilado en TCGA. Así pues, uno de los primeros requisitos
necesarios (que antes de la presente invención no se habían
considerado evidentes), para la fabricación de la presente
invención fue la selección de una cepa de E. coli que no
debería restringir acusadamente el DNA metilado en TCGA.
En la presente invención, un derivado de la cepa
RRI de E. coli que podía tolerar el gen de la metilasa
Taq y que contenía un transposón Tn10 (Tc^{R}) se transdujo
a una cepa ligts7 [N3098, véase Wilson y Murray, J. Mol.
Biol. (1979) y J. Mol. Biol. 77:531 (1973)] para crear la cepa de
E. coli AK76. Esta cepa ha sido depositada en la American
Type Culture Collection, y le ha sido otorgado el número de
recepción ATCC No. 55032. Esta cepa contiene un gen de ligasa
sensible a la temperatura, tal que a 42ºC la cepa no puede
desarrollarse. Esta cepa puede tolerar el gen de la metilasa
Taq, y otro DNA metilado, especialmente el DNA aislado de
T. aquaticus. Dado que la misma tiene también un gen de
ligasa sensible a la temperatura, podría utilizarse como hospedador
para la clonación de un gen funcional de ligasa de T.
aquaticus por selección para crecimiento a 42ºC.
La clonación del gen de ligasa de T.
aquaticus se basó en un esquema positivo de selección similar al
descrito por Wilson y Murray. El enfoque consistió en construir
genotecas de DNA de T. aquaticus insertadas en un vector
adecuado. Estas genotecas se introdujeron luego por transformación
en una cepa de E. coli ligts7 que no restringía el
DNA de T. aquaticus metilado, tal como la cepa AK76. Estas
células se cultivaron luego a la temperatura no permisiva, es decir
a 42ºC. Cualesquiera supervivientes podrían ser (i) reversores a
un fenotipo lig+; (ii) reversores de segundo sitio que
aumentan la expresión del producto del gen de ligasa de E.
coli defectuoso; (iii) un fragmento clonado de DNA de T.
aquaticus que aumenta la expresión del producto del gen de
ligasa de E. coli defectuoso; o (iv) un fragmento clonado de
DNA de T. aquaticus que contiene el gen de la ligasa de
T. aquaticus.
Para que funcione la última alternativa deseada,
es necesario que (i) se clone el gen de ligasa entero; (ii) que o
bien las secuencias de control endógenas para la expresión de la
ligasa de T. aquaticus funcionen en E. coli, o que
secuencias exógenas de control de vector estén suficientemente
próximas al termino amino y el gen de ligasa se clone en la
orientación correcta para permitir la expresión apropiada en E.
coli; (iii) el sitio de fijación de ribosoma de T.
aquaticus funcione en E. coli; y (iv) que la ligasa de
T. aquaticus sea suficientemente activa a 42ºC, y la cantidad
sintetizada sea suficiente para complementar la función de ligasa
en E. coli sin interferir con otros procesos.
La construcción de las genotecas adecuadas
utilizadas en la presente invención empleó vectores convencionales
que contenían secuencias de control deseadas, así como endonucleasas
de restricción y técnicas de ligación estándar. El DNA plasmídico
purificado, las secuencias de DNA de T. aquaticus, o los
oligonucleótidos sintetizados para uso en la presente invención, se
escindieron, adaptaron, y religaron en la forma deseada, asimismo
por técnicas convencionales.
La selección de un vector adecuado para uso en
la presente invención es más que una mera materia de selección de
un vector entre los muchos que existen y han sido utilizados en el
pasado. Los derivados de alto número de copias de plásmidos pUC
[véase por ejemplo, C. Yanisch-Peron et al.,
Gene 33:103 (1985), o J. Vieira et al., Gene 19:259 (1982)]
son realmente un tanto inestables cuando se cultivan a 42ºC. Los
plásmidos de número de copias bajo tales como los derivados de
pBR322 pFBI 1, 2, 13, 14 y 15 [véase F. Barany, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 82:4202 (1985)] pueden no producir suficiente enzima para
complementar el defecto de ligasa. En la realización de la presente
invención, se construyeron 18 genotecas diferentes utilizando 3
series diferentes de vectores. El clon satisfactorio se derivó del
vector pTZ18R [véase D.A. Mead et al., Protein Engineering
1:67 (1986)], aunque pueden utilizarse también otros vectores.
Generalmente, la escisión de DNA específica
orientada, como se describe más particularmente en el ejemplo que
sigue, se realiza por tratamiento del DNA con una enzima de
restricción adecuada en condiciones que están incluidas
generalmente en la técnica, y cuyas particularidades son
especificadas por los fabricantes de estas enzimas de restricción
disponibles comercialmente. En general, aproximadamente 1 \mug de
plásmido o secuencia de DNA es escindido por 2 a 10 unidades de
enzima en aproximadamente 20 \mul de solución tampón. Se prefieren
tiempos de incubación de aproximadamente 1 a 2 horas a
aproximadamente 37ºC, aunque pueden tolerarse variaciones tanto en
el tiempo como en la temperatura. Después de cada incubación, se
retira la proteína por extracción con fenol/cloroformo, y puede
efectuarse a continuación una extracción adicional. Los ácidos
nucleicos se recuperan por precipitación con etanol. Si se desea,
pueden realizarse separaciones por tamaño de los fragmentos
escindidos por electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa,
utilizando técnicas estándar.
Se realizó la escisión orientada tanto de DNA
plasmídico como de DNA de T. aquaticus utilizando
endonucleasas de restricción disponibles comercialmente en tampones
estándar.
En general, se escindieron aproximadamente 10
\mug de DNA de plásmido o de T. aquaticus en 100 \mul de
solución tampón por la adición de 20 a 100 unidades de la
endonucleasa de restricción apropiada, e incubación de la mixtura a
37ºC durante 1 a 2 h.
Después de cada incubación, se retiró la
proteína por extracciones secuenciales con fenol (2x),
n-butanol (2x), y el ácido nucleico se recuperó por
precipitación con etanol.
La construcción de vectores adecuados que
contenían las secuencias deseadas de codificación y control emplea
técnicas convencionales de ligación y restricción. Resumidamente,
plásmidos aislados, secuencias de DNA, u oligonucleótidos
sintetizados se escinden, adaptan, y religan en la forma
deseada.
Las endonucleasas de restricción utilizadas para
escisión de las genotecas específicas utilizadas de acuerdo con el
procedimiento reseñado en el Ejemplo II eran Bam HI,
SacI, KpnI (Asp718), Pst I,
HindIII, y SmaI; sin embargo, podrían haber sido
utilizadas otras endonucleasas u otros materiales parcialmente
digeridos con Sau IIIA, por ejemplo. Debido a la metilación
de adenosina, no se utilizaron las endonucleasas de restricción
Eco RI, SalI o XhoI utilizadas comúnmente, dado
que el DNA de la cepa HB8 de T. aquaticus no podría ser
escindido por estas enzimas.
Los fragmentos de restricción resultantes del
procedimiento reseñado en el Ejemplo II que contienen salientes 5'
pueden hacerse romos en los extremos por rellenado con
DNA-polimerasa I grande (fragmento Klenow) en
presencia de los cuatro
desoxinucleótido-trifosfatos utilizando tiempos de
incubación de aproximadamente 15 a 30 minutos a 37ºC en tampón Tris
50 mM de pH 7,6 que contiene NaCl 50 mM, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10
mM, y desoxinucleótido-trifosfatos
50-100 \muM. El fragmento Klenow rellenará los
extremos cohesivos 5'. Si se generan salientes 3', los mismos
pueden masticarse de nuevo con nucleasa de haba mung. Después de
tratamiento con Klenow, la mixtura se extrae con fenol/cloroformo y
se precipita con etanol. El tratamiento subsiguiente en condiciones
apropiadas con nucleasa S1 da como resultado la hidrólisis de
cualquier porción monocatenaria. Estos procedimientos convencionales
pueden utilizarse para clonación de cualquier fragmento en un sitio
(extremo romo) dentro del vector.
\vskip1.000000\baselineskip
En las construcciones de vectores, el vector
linealizado se trata comúnmente con una enzima fosfatasa (o
alternativamente con una segunda endonucleasa de restricción
próxima) para prevenir la recircularización del vector en ausencia
de DNA insertado. Por ejemplo, una muestra de DNA de Bam HI
(saliente 5') o SacI (saliente 3') (9 \mug) en 150 \mul
de tampón Tris.HCl 50 mM a pH 8,0 y que contiene MgCl_{2} 10 mM y
mercaptoetanol 6 mM en presencia de Na^{+} puede tratarse con
fosfatasa alcalina de intestino de ternero (CIAP, 22 unidades) a
37ºC durante 15 min, seguido por incubación a 50ºC durante 30 min
para eliminar los grupos fosfato de los salientes 5' o 3'.
Alternativamente, puede utilizarse fosfatasa alcalina bacteriana
(BAP, 10 unidades) en 150 \mul de Tris.HCl 10 mM en presencia de
Na^{+} y Mg^{++} e incubarse a 60ºC durante aproximadamente 1
hora. Subsiguientemente puede desnaturalizarse CIAP por la adición
de EDTA y EGTA para formar quelatos con los cationes bivalentes, y
calentamiento a 65ºC durante 15 min. La proteína CIAP o BAP se
separa luego por extracciones secuenciales con fenol (2x),
n-butanol (2x), y el ácido nucleico se recupera por
precipitación con etanol.
La eficacia del paso de fosfatasa se ensaya por
comparación del número de transformantes generados cuando el vector
se religa en ausencia o presencia de DNA insertado. Resultados
típicos de 10 a 100 veces más transformaciones cuando está presente
DNA insertado son indicativos de que el DNA vector ha sido tratado
adecuadamente con la fosfatasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron ligaciones en volúmenes de
30-100 \mul utilizando 1-2 \mug
de vector linealizado y tratado con fosfatasa producido como se ha
descrito previamente. Se cortaron 2-4 \mug de DNA
de T. aquaticus con una endonucleasa de restricción que
generaba los mismos extremos que el vector, en tampón Tris HCl 50
mM a pH 8,0 y que contenía MgCl_{2} 10 mM, EDTA 1 mM, ATP 1 mM,
mercaptoetanol 6 mM y de 3 a 7 unidades (Weiss) de ligasa T4, por
incubación a 4 ó 15ºC durante una noche. Después de la ligación, se
añadió EDTA, se desactivó la ligasa T4 por calentamiento de la
solución a 65ºC durante 15 min, y se recuperaron los ácidos
nucleicos por precipitación con etanol.
Se introdujeron las mixturas de ligación en un
hospedador adecuado tal como cepas de E. coli RR1, AK53 o
AK76 - la última adecuada para selección inmediata positiva del
fenotipo lig^{+} - por procedimientos de transformación
convencionales [véase Hanahan, J. Mol. Biol. 166:3243 (1987)]. Los
transformantes se seleccionaron por extensión en placas que
contenían ampicilina (u otros fármacos tales como tetraciclina o
kanamicina, dependiendo del plásmido utilizado). Para selección
positiva del fenotipo lig^{+}, se extendieron transformantes AK76
en placas SOB (preparadas por tratamiento en autoclave de 20 g de
triptona Bacto^{TM}, 5 g de extracto de levadura Bacto^{TM},
0,5 g de NaCl, 16 g de agar Bacto^{TM} en 1 litro de agua
destilada ajustada a pH 7,5 con NaOH antes del tratamiento en
autoclave, añadiendo después 20 ml de MgSO_{4} 1 M) que contenía
0,2% de maltosa, 0,2 mg/ml de IPTG (para inducir el promotor lac),
y 50 \mug/ml de ampicilina (para seleccionar las células que
contenían plásmido), y se dejaron crecer durante una noche a 42ºC
hasta 42,5ºC.
Las genotecas variaban en tamaño desde
aproximadamente 5.000 a 27.000 clones. Dada la estimación general de
que el cromosoma bacteriano contiene aproximadamente 2.000 a 4.000
kilobases, y que la inserción media estaba constituida por 5 a 10
kb, era evidente que varias genotecas contenían clones
redundantes.
Se realizaron preparaciones mixtas de plásmidos
a partir de 6 genotecas utilizando técnicas convencionales [véase
Methods Enzymol. 100:243 (1983)], y se introdujeron en células AK76
recientes. Se extendieron transformantes de cada genoteca sobre 6
placas SOB (cada placa recibió entre 30.000 y 70.000 clones) y se
incubaron a 42ºC. Una genoteca produjo de 11 a 19 colonias
excesivamente pequeñas por placa; las genotecas restantes produjeron
una gran colonia ocasional.
Se seleccionaron clones individuales, se preparó
DNA plasmídico utilizando técnicas convencionales [véase Anal.
Biochem. 114:193 (1981)], y se analizaron por digestión de
restricción. La totalidad de los 12 pequeños clones produjeron un
plásmido de 6,8 kb que contenía dos fragmentos Bam HI (1,8 y
2,1 kb respectivamente) clonados dentro del sitio Bam HI de
pTZ18R. Un plásmido de este tipo ha sido designado pDZ1 como se
representa en la Figura 1. Por cálculo de retroceso a la genoteca
original (de 5200 clones), parece ser que la totalidad de los
plásmidos pDZ1 se derivaban de un único clon. Las colonias grandes
contenían plásmidos próximos al tamaño del vector original. Por
dicha razón, estas colonias grandes son probablemente reversores del
gen cromosómico ligts7 que contenía cualquier plásmido
exclusivamente para conferir resistencia a la ampicilina.
La retransformación del plásmido pDZ1 en células
AK76, y selección a 42ºC sobre placas SOB que contenían maltosa,
IPTG, y ampicilina como se describe en el Ejemplo IV, produjo de
nuevo colonias pequeñas. La escisión en placas de transformantes
nuevos sobre agar triptona-levadura que contenía
ampicilina no produjo colonias. Este resultado sugiere que la
inducción del promotor lac durante el establecimiento del plásmido
es necesaria para producción de cantidades suficientes de ligasa de
T. aquaticus para complementar el defecto genético. Una vez
que el plásmido ha llegado a establecerse en las células AK76,
tales clones darán colonias excesivamente pequeñas cuando se
cultivan en bandas y se dejan crecer sobre placas
triptona-levadura que contienen ampicilina a
42ºC.
La digestión de pDZ1 con Bam HI, seguida
por religación enmarañaría los fragmentos. La transformación de una
mezcla de ligación de este tipo en AK76, seguida por escisión en
placas a 37ºC, es decir en condiciones no selectivas, comparadas
con la extensión en placas a 42ºC, es decir en condiciones
selectivas, produjo 1000 veces más colonias en condiciones no
selectivas. El plásmido inicial pDZ1 produjo solamente dos veces más
colonias en condiciones no selectivas que en condiciones
selectivas. Este descubrimiento sugiere fuertemente que la
presencia de ambos fragmentos, y la orientación en que están
clonados los mismos, es necesaria para la expresión apropiada de la
ligasa de T. aquaticus.
Aunque pDZ1 contiene varios sitios SacI y
SmaI, el mismo contiene un solo sitio (derivado de vector)
Pst I, KpnI, o HindIII. Así pues, habría sido
de esperar que se hubieran aislado varios clones de ligasa de las
genotecas de digestión con Pst I, KpnI, o
HindIII. Sin embargo, el único clon de ligasa se derivaba de
la genoteca parcial digerida con Bam HI. Aunque no está
claro por qué sucedía esto, una posible explicación es que otros
clones no llevaban el elemento controlador del promotor lac
suficientemente cerca del comienzo del gen de ligasa para expresar
adecuadamente la proteína ligasa durante el establecimiento del
plásmido.
La clonación de la ligasa de T. aquaticus
como se ha descrito arriba permitirá ahora a los expertos en la
técnica clonar cualquier ligasa termófila o termoestable, sea de
origen procariota, arqueobacteriano, eucariota o de fago por
enfoques adicionales.
Tales enfoques adicionales para clonación pueden
incluir, por ejemplo, (i) clonación de DNA de T. aquaticus
en un vector rojo-lambda y escrutinio respecto a la
aptitud del fago recombinante lambda para formar placas a 39ºC en
una cepa ligts7 tal como AK76 [esencialmente como se describe
en líneas generales en J. Mol. Biol. 132:471 (1979)]; (ii) uso del
fago lambda gt11 para expresar porciones del gen de ligasa, y
escrutinio subsiguiente con anticuerpos generados para producir
ligasa de T. aquaticus - el clon gt11 positivo lambda puede
utilizarse luego para identificar el gen de longitud total por
hibridación a otras genotecas de plásmido o de fago, esencialmente
como se describe en la clonación de la polimerasa de T.
aquaticus [véase J. Biol. Chem. 264:6427 (1989)]; 90 [sic]
(iii) basándose en la secuencia de DNA-ligasa,
pueden producirse sondas que se hibridarían y por consiguiente
contribuirían a identificar y recuperar otras secuencias
codificantes termoestables de ligasa en una diversidad de especies.
De acuerdo con ello, porciones del DNA que codifican al menos 5
aminoácidos de ligasa de T. aquaticus pueden replicarse, o
amplificarse utilizando técnicas de PCR, y las formas
desnaturalizadas o monocatenarias pueden utilizarse como sondas
para recuperar DNAs adicionales que codifiquen una ligasa termófila
o termoestable. Alternativamente, pueden sintetizarse sondas de
oligodesoxirribonucleótidos que codifican al menos 5 aminoácidos, y
pueden utilizarse éstas para recuperar DNAs adicionales que
codifican una ligasa termófila o termoestable.
La selección de una porción de DNA codificante
de al menos 5 aminoácidos está basada en la porción que contiene 15
bases de ácido nucleico que es mayor que la longitud mínima
estadística que debería tener un oligonucleótido a fin de encontrar
una sola secuencia complementaria en un genoma. Sin embargo, pueden
utilizarse porciones ligeramente más pequeñas (el número mínimo en
E. coli, por ejemplo, es 12, lo que indica que puede ser
aceptable una porción tan pequeña como la que codifica 4
aminoácidos) o mayor (el número mínimo para animales superiores es
tan alto como 19, lo que indica que puede ser necesaria una porción
que codifique al menos 7 aminoácidos puede ser necesaria) [véase
Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, vol. 12,
páginas 137-140, Macmillan Press Ltd., Londres
(1989)] para obtener resultados similares. No obstante, dado que
puede no haber una coincidencia exacta entre la secuencia de
nucleótidos en las porciones correspondientes entre diferentes
especies, los oligómeros que contienen aproximadamente 15
nucleótidos son un mínimo preferido a fin de conseguir la
hibridación en condiciones de severidad suficiente para eliminar
resultados positivos falsos; la secuencia que codifica 5
aminoácidos podría suministrar información suficiente para la
generación de dichas sondas.
A modo de ejemplo, una comparación de las
secuencias de aminoácidos de la ligasa de T. aquaticus y de
E. coli revela una identidad entre los aminoácidos
34-40
(Asp-Ala-Glu-Tyr-Asp-Arg-Leu)
a niveles estadísticamente aceptables. La utilización de la
secuencia de 6 aminoácidos preferida, una sonda degenerada de la
forma
GA(C/T)-GC(G/A/T/C)-GA(G/A)-TA(C/T)-GA(C/T)-(C/A)G-(G/A/T/C)-(C/T)T
podría utilizarse para identificar y recuperar cualquiera de las
ligasas anteriores. Las áreas de identidades de secuencia entre la
ligasa de thermofilus de acuerdo con la presente invención y
la ligasa de E. coli incluyen los aminoácidos en las
posiciones siguientes:
Globalmente, de los 676 aminoácidos contenidos
en la ligasa de thermofilus, el porcentaje de semejanza
entre la ligasa de thermofilus y la ligasa de E. coli
es 66%; el porcentaje de identidad es 47%.
La construcción de una cepa superproductora a
partir de un gen clonado y orientado adecuadamente puede realizarse
utilizando procedimientos que son convencionales en la técnica. El
principio general de dicha construcción consiste en poner una
secuencia permisiva en proximidad estrecha al codón inicial del gen
para afectar a la transcripción y traducción eficientes de dicho
gen. Existen muchos sistemas promotores (con inclusión de un sitio
de fijación de ribosoma [véase Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543
(1981)]) que se han utilizado con éxito para activar genes, con
inclusión del promotor lac, el promotor trp [véase Gene 20:231
(1982)], el promotor del fago lambda P_{L} [véase Nature 292:128
(1981)], el promotor de fusión tac [véase Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 80:21 (1983)], y los promotores del fago T7 [véase Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 82:1074 (1985)].
El plásmido pDZ1 contiene el gen de la ligasa de
T. aquaticus aguas abajo de ambos promotores lac y T7
presentes en el vector de partida. Existen varios métodos para
eliminar secuencias de DNA en exceso de entre los promotores y el
gen, que incluyen el uso de Ba131 [véase Nucl. Acids Res. 5:1445
(1978)] y ExoIII y Nucleasa de Haba Mung o S_{1} [véase
Meth. Enzymol. 155:156 (1987)]. No obstante, se utilizó un método
algo más simple, como se describe en el Ejemplo V para llevar el
término amino del gen de la ligasa de T. aquaticus más cerca
de los dos promotores en el ejemplo presente.
Se linealizó aleatoriamente el plásmido pBZ1 con
la endonucleasa de restricción HinPI (G CGC) y se hizo romo
en los extremos con Klenow o alternativamente con CviJI (PuG
CPy) [véase DNA and Protein Engineering Techniques 1:29
(1988)].
Se purificó DNA por extracciones secuenciales
con fenol (2x), n-butanol (2x), y el ácido nucleico
se recuperó por precipitación con etanol. Estos plásmidos
linealizados aleatoriamente se trataron luego con Asp718 que
escinde el sitio del polienlazador inmediatamente aguas abajo de los
dos promotores, y se hicieron romos en los extremos con Klenow. Los
fragmentos resultantes se separaron por electroforesis en gel de
agarosa de punto de fusión bajo, se cortaron rodajas secuenciales
(con inclusión de fragmentos de DNA lineales de longitud total y
progresivamente más pequeños), y se recuperó el DNA. Los fragmentos
de DNA se recircularizaron subsiguientemente por ligación de los
extremos romos. Esto implicó incubación durante una noche a 4ºC en
100 \mul de tampón Tris HCl 50 mM de pH 8,0 que contenía
MgCl_{2} 10 mM, EDTA 1 mM, ATP 1 mM, mercaptoetanol 6 mM, y de 3 a
7 unidades Weiss de ligasa T4. Después de las ligaciones, se añadió
EDTA, se desactivó la ligasa T4 por calentamiento (durante 15 min a
65ºC), y se recuperaron los ácidos nucleicos por precipitación con
etanol.
Las mezclas de ligación preparadas se
introdujeron en células AK76 utilizando técnicas convencionales, y
se seleccionó el fenotipo lig^{+} a 42ºC en placas SOB que
contenían maltosa, IPTG, y ampicilina como se ha descrito
previamente.
Basándose en trabajo previo, podría esperarse
que los plásmidos que contienen deleciones entre los promotores y
el inicio del gen de ligasa de T. aquaticus confirieran
viabilidad en estas condiciones. Las deleciones del vector
(regiones promotoras), o de una porción esencial del gen de ligasa
no deberían conferir viabilidad. Por esta razón, se seleccionaron
clones individuales, se preparó DNA plasmídico utilizando métodos
convencionales [véase Anal. Biochem. 114:193 (1981)], y se analizó
por digestión de restricción. Los resultados de este ensayo
permitieron descubrir que los plásmidos pDZ2, pDZ3, pDZ6 y pDZ7
carecían del fragmento de 1,8 kb Bam HI, y contenían en su
lugar un fragmento de 1,3, 1,4, 1,2, ó 1,2 kb, respectivamente.
Todos estos plásmidos recreaban el sitio Asp718 como sería de
esperar con rellenos y ligaciones de extremos romos
apropiados(as). Se preparó DNA monocatenario a partir de
estos plásmidos utilizando técnicas convencionales [véase Nucl.
Acids Research 13:1103 (1985), y Protein Engineering 1:64 (1986)],
y se secuenciaron éstos utilizando el oligonucleótido "iniciador
inverso" universal 5'd(AGCGGATAACAATTTCACACAGGA) 3' y
DNA-polimerasa T7 [véase Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:4767 (1987)].
El análisis de la secuencia de DNA revela dos
codones inicial ATG, teniendo el primer marco de lectura abierto
tres codones de longitud y el segundo, la secuencia de
DNA-ligasa, que da un marco de lectura largo. En
conjunto, con la Figura 1, esta secuencia (con inclusión de la
secuencia parcial de DNA-ligasa) derivada de los
plásmidos pDZ6 y pDZ7 es
ligasa
termófila.
La secuencia de ácido nucleico para la ligasa
termófila utilizada en la presente invención corresponde a la
secuencia de aminoácidos:
La traducción de los 60 primeros aminoácidos de
este marco de lectura abierto (la ligasa termófila) muestra una
homología mejor que 50% con la ligasa de E. coli [véase Mol.
Gen. Genet. 204:1 (1986)] lo que sugiere que este largo marco de
lectura abierto representa el inicio del gen de T. aquaticus.
A partir de los resultados genéticos obtenidos con los fragmentos
Bam HI, puede llegarse a la conclusión de que el tamaño de
esta ligasa está comprendido entre 400 y 1100 aminoácidos de
longitud. Se ha comunicado que la proteína purificada tiene un peso
molecular de aproximadamente 79.000 [véase J. Biol. Chem. 259:10041
(1984)] que está comprendido dentro de los límites de los
resultados genéticos encontrados para la presente invención. Dado
que el clon pDZ7 produce ligasa funcional de T. aquaticus (es
decir que codifica el gen en su totalidad), y dada la secuencia de
DNA del término amino, se determinó la secuencia entera de DNA del
gen utilizando métodos manuales o automáticos como se describe en
la bibliografía [véase, por ejemplo, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:4767
(1989); Proc. Natl. Acad. Sci. 86:4076 (1989); Science 239:487
(1987); Nature 321:674 (1986); Biotechniques 8:184 (1990); Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:5610 (1988); y Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:9436 (1988)].
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los plásmidos pDZ2, pDZ3, pDZ6 o pDZ7 pueden
utilizarse para construir vectores de superproducción adicionales,
utilizando métodos comunes para los expertos en estudios de
biotecnología. Esto puede incluir la utilización de promotores y
sitios de fijación de ribosoma como se ha descrito arriba. Por
ejemplo, el plásmido pDZ7 (véase la Figura 1) puede linealizarse en
su único sitio Asp718, y los nucleótidos en exceso frente al
gen de ligasa de T. aquaticus puedenrecortarse próximos al
codón inicial ATG mediante el uso de Bal31 o una combinación de
ExoIII y Nucleasa de Haba Mung o S_{1} como se ha descrito
arriba. Éste puede hacerse luego romo en los extremos y ligarse a
una secuencia permisiva natural (una secuencia promotora y de
comienzo de la traducción) generada de manera similar, o por una
secuencia permisiva sintética fabricada para este propósito.
Adicionalmente, secuencias externas o internas al gen de T.
aquaticus pueden modificarse para eliminar estructuras
potenciales de RNA que puedan inhibir la transcripción o la
traducción. Se ha comunicado previamente que estos métodos afectan
a la superproducción de la endonucleasa de restricción termófila
Taq I hasta más de 30% de proteínas solubles de E.
coli [véase Gene 65:186 (1988)]. Alternativamente, pueden
sintetizarse oligonucleótidos sintéticos tales que el comienzo del
gen de la ligasa de T. aquaticus está fusionado directamente
a una secuencia permisiva utilizando métodos de PCR [véase, por
ejemplo, Biotechniques 8:178 (1990); Gene 77:51 (1989); y Nucl.
Acids Res. 17:723 (1989)].
A partir de las secuencias que anteceden, puede
verse que existe un sitio Bgl II que corresponde a los
nucleótidos que codifican los residuos de amino-ácidos
31-33. Con esta información, podría insertarse un
promotor fuerte con una secuencia Shine-Dalgarno
óptima frente a este gen utilizando PCR. Es necesario considerar dos
cautelas menores: (1) los intentos para copiar por PCR el gen
entero (3 kb, alto contenido en GC) no siempre fueron fructuosos, y
(2) el plásmido pDZ7 tenía dos sitios Bam HI y Bgl II,
cada uno de ellos dentro del gen de ligasa.
El plásmido pDZ7 se digirió parcialmente a la
vez con Bam HI y Bgl II, el fragmento lineal correcto
de menor tamaño se separó del lineal de longitud total por
electroforesis, se escindió, y se purificó como se ha descrito
previamente. Dado que Bam HI y Bgl II producen el
mismo saliente (5' GATC), el fragmento lineal podría
recircularizarse con ligasa T4, e introducirse en la cepa AK53 de
E. coli por transformación. Varios clones tenían el
fragmento de 0,5 kb Bam HI/Bgl II delecionado, dando como
resultado un plásmido de 5,7 kb, y uno de dichos clones se designó
pDZ12. Se sintetizaron los oligonucleótidos sintéticos #66, #78,
#85, y #94, para permitir la fusión del promotor pho A [a
partir del plásmido pFBT64; véase Gene 56:13 (1987)] y la secuencia
de fijación de ribosoma al comienzo del gen de ligasa utilizando PCR
[véase Biotechniques 8:178 (1990); Gene 77:51 (1989); Gene 77:61
(1989) y Nucl. Acids Res. 17:723 (1989)]. Estos clones se
representan en Fig. 9, y son:
- #66 19-mero; sitio Pvu II hasta el promotor T7 pasando por el promotor pho A, cadena superior del plásmido pFBT64 (dirección del gen de endonucleasa Taq I):
- 5' CTG GCT TAT CGA AAT TAA T 3'
- #78 32-mero; extremo 5' complementario al inicio del gen de ligasa Thermus; extremo 3' complementario al lado Shine-Dalgarno del promotor pho A, cadena inferior del plásmido pFBT64:
- 5' CGA GGG TCA TTT TAT TTT CTC CAT GTA CAA AT 3'
- #85 33-mero; extremo 5' complementario al lado Shine-Dalgarno del promotor pho A; extremo 3' complementario al inicio del gen de ligasa thermus, cadena superior del plásmido pDZ7 (dirección del gen de ligasa):
- 5' CAT GGA GAA AAT AAA ATG ACC CTG GAA GAG GCG 3'
- #94 18-mero; cadena inferior del plásmido pDZ7 correspondiente a la cadena no traducida de los residuos de aminoácidos 40 a 35 del gen de ligasa, aguas abajo del sitio Bgl II en los residuos de aminoácidos 33 a 31:
- 5' AAG CCG GTC GTA CTC GGC 3'
Resumidamente, esto se realizó en un solo tubo
de reacción en el cual se añadieron 400 ng de los iniciadores #66 y
#78 a 200 ng de pFBT64 digerido con pst I/Pvu II que
contenía 50 \mumoles de dATP, cCTP, cGTP y dDTP cada uno, y 2,5
unidades de Amplitaq en 100 \mul de tampón PCR y se
sometieron a ciclos de 94ºC durante 1 min, 55ºC durante 2 min, y
72ºC durante 3 min con 3 s de extensión por ciclo durante 25 ciclos
de acuerdo con el protocolo del fabricante (Cetus, Emeryville,
California). Un segundo tubo de reacción contenía 400 ng de los
iniciadores #85 y #94, 200 ng de pDZ7 digerido con Eco
RI/Bam HI, en el mismo tampón de reacción y la misma enzima,
y se incubó como anteriormente. Se demostró que los productos de
estas reacciones tenían la longitud correcta y se analizaron por
electroforesis en gel. Un tercer tubo de reacción contenía 2 \mul
de cada producto, 400 ng de los iniciadores #66 y #94 en el mismo
tampón de reacción y la misma enzima y se incubó como
anteriormente. Se diseñaron iniciadores de tal modo que el
solapamiento entre los dos productos permitiera la síntesis por PCR
del producto fusionado de longitud combinada. El fragmento
resultante se extrajo con fenol y n-butanol, y se
precipitó con etanol para eliminar la polimerasa Taq. El
fragmento PCR producido se trató con Bgl II y Eco RI,
se sometió a electroforesis en agarosa de punto de fusión bajo, y se
purificó como se ha descrito arriba. Entretanto, se purificaron el
fragmento que contenía el gen de ligasa de 2,7 kb Pst
I-Bgl II procedente de pDZ12 y el fragmento de 2,4 kb que
contenía el gen de B-lactamasa Pst
I-Eco RI y el origen procedente de pFBT64. Los tres
fragmentos se combinaron en una ligación de 3 vías y se
introdujeron en la cepa AK53 de E. coli por transformación.
Varios clones contenían un plásmido de 5,5 kb que era
superproductor de ligasa bajo el control del promotor pho A.
Uno de tales plásmidos ha sido designado pDZ13.
En estudios publicados sobre la superproducción
de la endonucleasa de restricción termófila Taq I hasta más
de 30% de proteínas solubles de E. coli [véase Gene 85:166
(1988)], se indicó que los rendimientos de endonucleasa eran algo
mejores si se invertía el gen de \beta-lactamasa,
y se transcribía por tanto en la dirección opuesta al promotor
pho A. Para realizar una construcción similar con el gen de
ligasa utilizado en la presente invención, el fragmento de 2,3 kb
Pst I-Pvu II del plásmido pFBLT69 (que contiene el
gen de B-lactamasa en orientación inversa) se ligó
al fragmento de 3,2 kb Pst I-Pvu II que contenía el
gen de ligasa del plásmido pDZ13. La mezcla de ligación se
transformó en la cepa AK53 de E. coli, y se analizaron
varios transformantes por digestiones de restricción a fin de
confirmar la orientación del gen de B-lactamasa.
Uno de tales clones ha sido designado pDZ15. La producción de ligasa
en pDZ15 es tan buena como, si no ligeramente mejor que, pDZ13. La
enzima ligasa parece ser algo sensible a las proteasas, y las
células deberían cultivarse durante no más de 9 horas después de la
inducción. Los productos proteolíticos del gen de ligasa pueden
tener todavía actividad de ligasa termoestable (esto ha sido
demostrado para la polimerasa Taq).
Las proteínas termófilas pueden estar
sustancialmente modificadas y retener todavía actividad suficiente
para uso en la presente invención. Por ejemplo, se ha demostrado
que la deleción de aproximadamente un tercio de la secuencia
codificante en el término amino de la polimerasa Taq permite
obtener todavía un producto génico que es activo en cuanto a la
actividad de polimerasa [véase J. Biol. Chem. 264:6427 (1989)].
Alternativamente, se ha demostrado que otra proteína termófila, la
endonucleasa de restricción Taq I, retiene esencialmente
actividad plena cuando se añadieron aminoácidos al término amino
(+7), al término carboxi (+38), o en ciertas posiciones internas
(desde +2 a +34) [véase Gene 75:166 (1988)]. Así pues, la
modificación de la estructura primaria por deleción, adición al
término N, adición al término C, adición interna o duplicación, o
alteración de los aminoácidos incorporados en la secuencia durante
la traducción puede hacerse sin destruir la actividad o la
naturaleza termoestable de la proteína. Adicionalmente, la
disponibilidad de DNA codificante de estas secuencias proporciona
la oportunidad de modificar la secuencia de codones a fin de generar
formas de muteína que tienen también actividad de ligasa. Tales
sustituciones u otras alteraciones dan como resultado nuevas
proteínas.
Se apreciará también que otras proteínas
ligantes pueden aislarse por el proceso que se ilustra en estos
ejemplos. Puede esperarse que líneas de células diferentes
produzcan ligasas que tengan propiedades físicas diferentes a la
aislada de la cepa HB8 de T. aquaticus utilizada en la
realización de la presente invención. Adicionalmente, pueden
existir variaciones debidas a polimorfismos genéticos o
modificaciones mediadas por células de la enzima o sus precursores.
Además, la secuencia de aminoácidos de una ligasa así aislada puede
modificarse por técnicas genéticas para producir ligasas con
actividades y propiedades biológicas alteradas. La secuencia de DNA
resultante puede ser capaz entonces de codificar una proteína que
tenga sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la
ligasa HB8 de T. aquaticus, pero exhibiendo un nivel de
actividad mayor o menor.
Células AK53 de E. coli que contenían
los plásmidos pDZ6 y pGP1-2 (que contiene el gen de
RNA-polimerasa T7 detrás del promotor lambda
P_{L} y bajo control del represor lambda sensible a la temperatura
C_{1587}) [véase Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1074 (1985) y la
patente de Estados Unidos 4795699], se cultivaron durante una noche
a 32ºC en placas TY que contenían ampicilina a 50 \mug/ml y
kanamicina a 50 \mug/ml para asegurar el mantenimiento de ambos
plásmidos. Las colonias nuevas se resuspendieron en 1 litro de
tampón Tris HCl estéril 50 mM a pH 7,6 y que contenía 6 g de NaCl,
25 g de triptona Bacto^{TM}, 7,5 g de extracto de levadura, 1 g
de glucosa, 1,6 g de hidrolizado de aminoácidos de caseína, 50
\mug/ml de kanamicina, y 50 \mug/ml de ampicilina, y se
cultivaron a 32ºC en un matraz de 2 litros que se agitaba a 200 rpm.
Cuando la D.O. a 550 alcanzó entre 0,8 y 1,0, se indujo la síntesis
de la polimerasa T7 por cambio de las células a 42ºC durante 30 a
40 minutos. La síntesis ulterior de proteínas de E. coli se
inhibió por la adición de 5 ml de rifampicina de 20 mg/ml disuelta
en metanol hasta una concentración final de 100 \mug/ml. En estas
condiciones, únicamente los genes situados tras el promotor T7
deberían transcribirse y por tanto traducirse. Las células se
incubaron durante 5 horas más a 42ºC.
Alternativamente, células AK53 de E. coli
que contenían los plásmidos pDZ15 (ligasa bajo control del
promotor pho A) se cultivaron durante una noche a 37ºC en
placas TY que contenían ampicilina a 50 \mug/ml. Las colonias
nuevas se resuspendieron en 50 ml de caldo reforzado que contenía 50
\mug/ml de ampicilina y se cultivaron a 37ºC en un matraz de 500
ml que se agitaba a 200 rpm en un agitador de sacudidas de sobremesa
G76. Cuando la D.O._{500} alcanzó un valor comprendido entre 0,65
y 0,85, se diluyeron 20 ml en 1 litro de medio MOPS que contenía
K_{2}HPO_{4} 0,2 mM [véase J. Bacteriology 119:736 (1974)] para
inducir el promotor pho A. Las células se cultivaron a 37ºC
en un matraz de 2 litros que se agitaba a 200 rpm en un agitador de
sacudidas de suelo G25 durante 9 horas más.
Después de la incubación, las células se
enfriaron en hielo, se cosecharon por centrifugación (5.000 rpm
durante 15 min), se resuspendieron en 20 ml de agua, se
transfirieron a tubos de centrífuga de 35 ml, se recentrifugaron
(7.000 rpm durante 6 min), y el sedimento se congeló hasta que
estuvo listo para aislamiento de proteínas. Después de la
descongelación, se resuspendió el sedimento en 20 ml de tampón A
(tampón Tris HCl 20 mM a pH 7,6 que contenía EDTA 1 mM) que
contenía 2-mercaptoetanol 10 mM y PMSF 0,15 mM.
Después de sonicación (5 x 1 min a potencia 50% a 4ºC), la solución
se centrifugó a 39.000 x g durante 60 min.
La enzima tiene un peso molecular estimado de
75.000 a 85.000 daltons cuando se compara con un patrón de
fosforilasa B que tiene asignado un peso molecular de 92.500
daltons.
Alternativamente, se cosecharon 2 litros de
células inducidas con pDZ15, se sometieron a sonicación, y los
residuos se aclararon por centrifugación como se ha descrito
arriba.
El sobrenadante (40 ml) se llevó a KCl 300 mM y
se pasó a través de una columna de DEAE-sephacel de
5 ml para eliminar el DNA extraño utilizando 70 ml de tampón A que
contenía KCl 0,3 mM. Las fracciones de paso directo que contenían
la ligasa se combinaron, y se trataron a 65ºC durante 20 minutos
para desnaturalizar irreversiblemente por calentamiento muchas
enzimas de E. coli que incluían endo o exonucleasas. Las
proteínas desnaturalizadas se eliminaron luego por centrifugación a
39.000 x g durante 15 minutos, y la enzima ligasa precipitó del
sobrenadante por adición de un volumen igual de
(NH_{4})_{2}SO_{4} saturado a la temperatura ambiente
durante 30 minutos. El precipitado de sulfato de amonio se recogió
por centrifugación a 8.000 rpm en una centrífuga clínica, y se
resuspendió en 4 ml de agua destilada. Las muestras se dializaron
contra tampón A, seguido por tampón A que contenía KCl 50 mM. La
solución de proteínas dializada se aplicó a una columna de 40 ml de
fosfocelulosa equilibrada con tampón A que contenía KCl 50 mM.
Después de lavar con 80 ml del mismo tampón, la columna se eluyó
con un gradiente lineal de 120 ml de KCl (0,05 a 0,5 M) en tampón A.
La enzima se eluyó como un pico más nítido a partir de KCl 0,25 a
0,35 M. La proteína migra como dos bandas de peso molecular aparente
aproximadamente 81.000 (forma adenilada) y 78.000 (forma no
adenilada) y tiene una pureza de aproximadamente
98-99% como se monitorizó por electroforesis en gel
de SDS-10% poliacrilamida. Es posible convertir
entre las dos formas por incubación de 150 \mug de proteína en
tampón de ligasa que contiene 25 \mug de DNA de esperma de salmón
mellado sin NAD (dando como resultado la forma no adenilada); o en
tampón de ligasa con NAD 10 mM (dando como resultado la forma
adenilada) durante 30 min a 65ºC. Se añade un volumen igual de
Tris.HCl 20 mM de pH 8,0 en glicerol 100% que contiene EDTA 1 mM,
ditiotreitol (DTT) 2 mM, y 200 \mug/ml de Seroalbúmina Bovina
(Fracción V) (la concentración final de glicerol es 50%), y se
guarda la enzima a -70ºC o -20ºC. A partir de 2 litros de células
[sic], un rendimiento final de 60 mg de ligasa en 16 ml de tampón de
almacenamiento, a 625 unidades de cierre de mella por microlitro.
Esto corresponde a un total de 10.000.000 de unidades de enzima, y
una actividad específica de 1.666.667 unidades/mg.
Dado que se sabe que las proteínas termófilas
tienden a ser algo más hidrófobas que sus equivalentes mesófilos,
la adición de detergentes no iónicos u otros agentes estabilizadores
puede favorecer el almacenamiento a largo plazo. Los tampones de
almacenamiento pueden incluir por tanto componentes adicionales
tales como glicerol (50%), sacarosa (25%), inhibidores de proteasas
(PMSF 0,5-1,0 mM, pepstatina A 10^{-7} M), sal
(KCl, preferiblemente a 100-500 mM), EDTA
(0,1-1,0 mM), seroalbúmina bovina
(100-500 \mug/ml), gelatina, ditiotreitol
(1-10 mM), y mercaptoetanol (1-10
mM). Adicionalmente, es preferible que el tampón de almacenamiento
contenga al menos un detergente polímero no iónico. Una lista
parcial de tales detergentes incluiría éteres y lauril-éteres de
alcoholes grasos etoxilados, alquil-fenoles
etoxilados, compuestos de monooleato de polietilenglicol, y más
particularmente Triton X-1200,
NP-40, y Tween 20 a 0,1-0,5%
vol/vol.
Para ensayar la actividad de ligasa, es
importante utilizar un método que no esté sesgado por la temperatura
de fusión (T_{m}) de los sustratos. Por ejemplo, una ligación de
4 bases con extremos cohesivos es sumamente eficiente a temperatura
baja tal como 4ºC, muy por debajo de la temperatura óptima para la
ligasa T4 (que es 37ºC), y ciertamente inferior a la temperatura
óptima de una ligasa termófila. Un método de ensayo que debería ser
consistente es el ensayo de cierre de mella, en el cual DNA
plasmídico circular se mella aleatoriamente en varios puntos, por
medio de DNasaI. La aptitud de la ligasa para cerrar todas estas
mellas y generar DNA circular cerrado covalentemente puede
ensayarse por separación del DNA circular mellado del DNA circular
abierto por electroforesis en un gel de agarosa que contiene
bromuro de etidio. Por ejemplo, la forma circular cerrada
covalentemente del plásmido pUC4KIXX [véase Gene 37:111 (1985)]
migra más rápidamente que la forma lineal, y con rapidez
considerablemente mayor que la forma mellada en un gel de agarosa al
1% que contiene glicina.NaOH 0,2 M de pH 8,5, EDTA 0,1 mM, y 1
\mug/ml de bromuro de etidio y pasa a 150 V durante 1,5 h en el
mismo tampón.
Se generó DNA mellado de pUC4KIXX por adición de
3 \mul de DNasaI de concentración 1 \mug/ml recién diluida a 5
\mug de DNA en 50 \mul de Tris.HCl 50 mM de pH 8,0, que contenía
MgCl_{2} 10 mM, EDTA 1 mM, y mercaptoetanol 6 mM. La mixtura se
incubó a temperatura ambiente durante 5 min, se destruyó la DNasa
por calentamiento a 65ºC durante 10 min, y la muestra se guardó
hasta su utilización por congelación a -20ºC. En estas condiciones,
aproximadamente 90% de DNA se encontraba en la forma circular
mellada, con aproximadamente 5% en la forma lineal y 5% en la forma
circular cerrada covalentemente.
La ligasa termófila preparada como anteriormente
se ensayó por adición de diluciones seriadas de ligasa a 0,5 \mug
de pUC4KIXX mellado en 20 \mul de tampón Tris.HCl 20 mM de pH 7,6
que contenía KCl 50 mM, MgCl_{2} 10 mM, EDTA 1 mM, NAD 10 mM,
ditiotreitol 10 mM, que se cubrió con una gota de aceite mineral, y
se incubó a 65ºC durante 15 min. Como control, se ensayó ligasa T4
por adición de diluciones seriadas de ligasa a 0,5 \mug de
pUC4KIXX mellado en 20 \mul de tampón Tris.HCl 50 mM de pH 8,0 que
contenía MgCl_{2} 10 mM, EDTA 1 mM, ATP 1 mM, mercaptoetanol 6
mM, e incubación a 37ºC durante 15 min.
Las reacciones se terminaron por adición de 4
\mul de tampón de parada que contenía EDTA 0,2 M, 50% de glicerol,
1% de SDS y 0,1% de azul de bromofenol, y los productos se
analizaron por electroforesis en gel como se ha descrito
arriba.
Una unidad de cierre de mella de ligasa se
define como la cantidad de ligasa que circulariza 0,5 \mug de DNA
de pUC4KIXX mellado en las condiciones de tampón y tiempo que se
indican en el ejemplo anterior, de tal modo que la adición de más
ligasa no circulariza DNA adicional.
Como un procedimiento de minipreparación, se
cultivaron células AK53 de E. coli que contenían plásmidos
pDZ15 (ligasa bajo control del promotor pho A) durante una
noche a 37ºC en placas TY que contenían ampicilina a 50 \mug/ml.
Las colonias nuevas se resuspendieron en 5 ml de caldo reforzado que
contenía 50 \mug/ml de ampicilina, y se cultivaron a 37ºC. Cuando
la D.O._{550} alcanzó un valor comprendido entre 0,65 y 0,85, se
diluyeron 0,12 ml en 6 ml de medio MOPS que contenía
K_{2}HPO_{4} 0,2 mM para inducir el promotor pho A. Las
células se incubaron durante una noche a 37ºC (ocurre algo de
proteólisis después de incubación prolongada, por lo que se
aconseja precaución en el sobrecultivo de las células inducidas).
Las células se cosecharon en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, se
resuspendieron en 0,3 ml de Tris.HCl 20 mM de pH 7,6 que contenía
EDTA 1 mM y 2-mercaptoetanol 10 mM, y se sometieron
a sonicación durante 2 x 10 segundos. Después de aclarar los
residuos por centrifugación (12.000 rpm durante 2 min), el
sobrenadante se trató a 65ºC durante 20 min para desnaturalizar
irreversiblemente por calentamiento muchas enzimas de E. coli
con inclusión de las endo- y exonucleasas [véase Gene, 56:13
(1987)]. Los residuos desnaturalizados se eliminaron por
centrifugación y el sobrenadante se ensayó como se ha descrito
arriba. Un microlitro de este sobrenadante contenía aproximadamente
625 unidades de actividad de cierre de mella.
Se demostró que La preparación de ligasa de
T. aquaticus descrita en los ejemplos anteriores, así como
ligasa T4 disponible comercialmente, contiene aproximadamente 125
unidades de cierre de mella por microlitro. Así, a partir de 1
litro de células de E. coli superproductoras de ligasa de
T. aquaticus, el proceso ha purificado aproximadamente (800
x 125) 100.000 unidades de cierre de mella de enzima.
La ligasa termófila preparada de acuerdo con la
descripción anterior tiene varias propiedades valiosas que la hacen
especialmente útil como ensayo que a la vez amplifica el DNA y
permite que el mismo discrimine una sustitución de una sola base en
una secuencia de DNA. La propiedad singular más importante de esta
ligasa que permite estos usos es que la ligasa retiene su actividad
durante ciclos térmicos repetidos de
desnaturalización/renaturalización, permitiendo con ello la
amplificación del DNA sin necesitar adición repetida de ligasa.
Además, la ligasa utilizada en la presente invención ligará
oligonucleótidos de una longitud que es suficiente para asegurar su
singularidad en genomas complejos a o cerca de las temperaturas
T_{m} de 65ºC, y discriminará también con exactitud entre
secuencias de oligonucleótidos exactamente complementarias y
desapareadas en una sola base.
En el más simple de los dos procedimientos
desarrollados como resultado de la clonación de la secuencia de
DNA-ligasa termófila, denominado reacción de
detección de ligasa (LDR), se deja que dos sondas oligonucleotídicas
se hibriden a DNA desnaturalizado de tal modo que el extremo 3' de
una esté situado inmediatamente adyacente al extremo 5' de la otra.
Los oligonucleótidos se seleccionan de modo que sean suficientemente
largos (20 a 25 nucleótidos) a fin de que cada uno se hibride
preferentemente a su posición singular en el genoma humano. Una
ligasa termófila puede formar luego un enlace covalente fosfodiéster
entre los dos oligonucleótidos, con tal que los nucleótidos
situados en la unión sean perfectamente complementarios a la diana.
La especificidad de esta reacción de cierre de mella se mejora
particularmente en virtud de la realización de la ligación a o
cerca de la T_{m} de los dos oligonucleótidos a su diana. Así
pues, un único desapareamiento de una sola base en la unión no sólo
forma una doble hélice imperfecta, sino que desestabiliza además el
híbrido a la temperatura más alta. Por consiguiente, la ligasa
termófila enlazará eficientemente los oligonucleótidos correctamente
apareados en bases y dará una ligación con ruido de fondo
aproximadamente cero en presencia de las secuencias apareadas
imperfectamente. Utilizando LDR, la cantidad de producto ob-
tenida en la reacción de ligación puede incrementarse de manera lineal por sometimiento repetido a ciclos térmicos.
tenida en la reacción de ligación puede incrementarse de manera lineal por sometimiento repetido a ciclos térmicos.
En la reacción en cadena de la ligasa termófila
de acuerdo con la presente invención, ambas cadenas sirven como
dianas para la hibridación de oligonucleótidos. Por utilización de
dos oligonucleótidos adicionales complementarios a la cadena
opuesta, los productos de ligación de un ciclo se convierten en las
dianas para el ciclo de ligación siguiente como se representa en
líneas generales en la Figura 2. Para cada par de oligonucleótidos
adyacentes, el nucleótido de diagnóstico se encuentra en el lado 3'
de la unión. De este modo, se evita la ligación aberrante
independiente de la diana de oligonucleótidos complementarios
mediante el uso de temperaturas próximas a la T_{m}, y
aprovechando también la ventaja de la pobre eficiencia de ligación
de los salientes 3' de una sola base. Utilizando la reacción en
cadena de ligasa, la cantidad de producto puede incrementarse de
manera exponencial por sometimiento repetido a ciclos térmicos.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Con objeto de ensayar el potencial de la
reacción en cadena de la ligasa termófila (LCR), se seleccionó el
gen que codifica la globina \beta humana como sistema modelo
inicial para ensayar la técnica de la presente invención. El
trabajo previo ha determinado que el alelo normal \beta^{A} y el
alelo falciforme \beta^{S} difieren en una sola transversión A
\rightarrow T del segundo nucleótido en el sexto codón del gen de
\beta-globina, cambiando un residuo de ácido
glutámico a una valina en la cadena de la hemoglobina B de acuerdo
con la Tabla I siguiente:
En la continuación de la Tabla I que sigue, se
presentan las secuencias de oligonucleótidos enumeradas en la
porción anterior en su orientación convencional 5' \rightarrow
3':
Se sintetizaron oligonucleótidos que contenían
el oligonucleótido 3' exclusivo de cada alelo con colas 5' de
longitud diferente (véase Tabla I). Después de ligación al
oligonucleótido adyacente invariante radiomarcado con ^{32}P, los
productos individuales pudieron separarse en un gel de
poliacrilamida desnaturalizante y detectarse por autorradiografía.
Basándose en estos hallazgos iniciales con autorradiografía, se
realizaron ensayos subsiguientes utilizando un esquema de detección
automático, no radioactivo en el cual los oligonucleótidos
alelo-específicos estaban biotinilados en 5' para
captura, y los oligonucleótidos invariantes estaban provistos de
colas 3' con digoxigenina. El marcador se visualizó luego en un
formato ELISA utilizando anti-digoxigenina
conjugada con fosfatasa alcalina, y un sustrato colorimétrico para
la enzima.
Como se muestra en la Tabla I, se representan la
secuencia de nucleótidos y la secuencia traducida correspondiente
de los oligonucleótidos utilizada en la detección de los genes de
globina \beta^{A} y \beta^{S}. Los oligonucleótidos 101 y
104 detectan la diana \beta^{A}, mientras que 102 y 105 detectan
la diana \beta^{S} cuando se ligan a los oligonucleótidos
marcados 107 y 104, respectivamente. Los oligonucleótidos 103 y 106
se diseñaron para ensayar la eficiencia de ligación de los
desapareamientos G:T o G:A y C:A o C:T, utilizando dianas de los
genes de \beta^{A} o \beta^{S}, respectivamente. Los
oligonucleótidos se diseñaron con colas de longitud ligeramente
diferente para facilitar la discriminación de diversos productos
cuando se separan en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Las
colas que no eran complementarias a la secuencia diana pueden
considerarse como "grupos informadores" para la secuencia
individual. Por consiguiente, la ligación de los oligonucleótidos
101, 102, ó 103 a 107 proporciona longitudes de 45, 47, ó 49
nucleótidos, respectivamente. Para la cadena complementaria, la
ligación de los oligonucleótidos 104, 105, ó 106 a 109 proporciona
longitudes de 46, 48, 50 nucleótidos, respectivamente. Los
oligonucleótidos se diseñaron también para tener valores Tm
calculados de 66 a 70ºC, valor que coincide exactamente con la
temperatura de ligación o es ligeramente superior a ésta.
Con objeto de detectar los productos de
ligación, los oligonucleótidos 107 y 109 se marcaron en el extremo
5' con ^{32}P utilizando polinucleótido-quinasa T4
y -^{32}P de acuerdo con el ejemplo siguiente.
El oligonucleótido 107 (0,1 \mug) se marcó en
el extremo 5' en 20 \mul de tampón Tris.HCl 30 mM a pH 8,0 que
contenía Tricina 20 mM, MgCl_{2} 10 mM, EDTA 0,5 mM, ditiotreitol
5 mM, y 400 \muCi de [^{32}P]ATP, por adición de 15
unidades de polinucleótido-quinasa T4. Después de
incubación a 37ºC durante 45 min, se añadió ATP sin marcar hasta 1
mM, y se continuó la incubación durante 2 min adicionales a 37ºC. La
reacción se terminó por adición de 0,5 \mul de EDTA 0,5 M, y
quinasa desactivada por calentamiento a 65ºC durante 10 min. El
marcador ^{32}P no incorporado se eliminó por cromatografía con
Sephadex G-25 pre-equilibrada con
tampón TE. La actividad específica estaba comprendida entre 7 x
10^{8} y 10 x 10^{8} cpm/pg de oligonucleótido.
La especificidad de la ligasa termófila de T.
aquaticus para la diana complementaria frente a la diana
desapareada se comparó tanto en condiciones LDR como en condiciones
LCR (véase la Figura 3 y la Tabla II siguiente). En la serie LDR,
se incubaron dos oligonucleótidos adyacentes con DNA diana
desnaturalizada y ligasa, donde el último nucleótido del
oligonucleótido sin marcar era complementario o estaba desapareado
respecto al DNA diana. Los oligonucleótidos se diseñaron con colas
de longitud ligeramente diferente para facilitar la discriminación
de diversos productos dejando que los mismos se separaran en un gel
desnaturalizante. Por consiguiente, como se ha descrito arriba, la
ligación del oligonucleótido 101 (alelo \beta^{A}), 102 (alelo
\beta^{S}), o 103 a 107 marcado proporciona longitudes de 45,
47 ó 49 nucleótidos, respectivamente. Para la cadena complementaria,
la ligación de los oligonucleótidos 104 (alelo \beta^{A}), 105
(alelo \beta^{S}), o 106 a 109 marcado proporciona longitudes
de 46, 48 ó 50 nucleótidos, respectivamente. Los oligonucleótidos se
diseñaron también de manera que tuvieran valores T_{m} calculados
de 66ºC a 70ºC, valor que es exactamente igual o ligeramente
superior a la temperatura de ligación. Así pues, la especificidad de
ligación de dos oligonucleótidos hibridados al DNA diana con
complementariedad perfecta (A:T) pudo compararse directamente para
cada posible desapareamiento (A:A, T:T, G:A, G:T, C:A, o C:T). La
metodología para determinar la especificidad de ligación de estos
oligonucleótidos en presencia de la diana del gen de globina
\beta^{A} o \beta^{S} se determinó como en el ejemplo
siguiente:
Se incubaron un oligonucleótido marcado (200.000
cpm; 0,28 ng; 40 fmoles) y un oligonucleótido sin marcar (0.27 ng;
40 fmoles) en presencia de DNA diana (1 fmol = 6 x 10^{8}
moléculas de plásmido de globina \beta^{A}- o \beta^{S}
digeridas con Taq I) en 10 \mul de tampón Tris.HCl 20 mM a
pH 7,6 y que contenía KCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM, EDTA 1 mM, NAD
10 mM, ditiotreitol 10 mM, 4 \mug de DNA de esperma de salmón, y
15 unidades de cierre de mella de la ligasa termófila, y se
cubrieron con una gota de aceite mineral. Las reacciones se
incubaron a 94ºC durante 1 min seguido por 65ºC durante 4 min, y se
repitió este ciclo entre 5 y 30 veces. Las reacciones se terminaron
por adición de 8 \mul de formamida que contenía EDTA (10 mM),
xileno-cianol (0,2%), y azul de bromofenol (0,2%).
Las muestras (4 \mul) se desnaturalizaron por ebullición durante
3 min antes de ser cargadas (40.000 cpm/pista) en el gel.
Los productos se separaron por electroforesis,
en la cual las muestras se cargaron en grupos de 8, se pasaron a
través del gel, y a continuación se cargó la serie siguiente, dando
cuenta con ello de la movilidad ligeramente más lenta de las bandas
en el lado derecho del autorradiograma de la Figura 3. La
electroforesis se realizó en un gel de poliacrilamida al 10% que
contenía urea 7 M en un tampón de Tris.borato 100 mM de pH 8,9 y
EDTA 1 mM, durante 2 horas a potencia constante de 60 W.
Después de eliminar la urea por impregnación
durante 10 min en ácido acético al 10% seguida por una segunda
impregnación de 5 min en agua, se secaron los geles sobre papel
Whatman de 3 mm y se sometieron a autorradiografía durante una
noche a -70ºC en película Kodak XAR-5 (con o sin
iluminación Du Pont Cronex más pantalla intensificadora). Las
bandas de 20 ciclos se escindieron de los geles y se ensayaron
respecto a radiactividad. Los resultados se dan en la Tabla II.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Así pues, se demostró que la ligasa termófila de
T. aquaticus discrimina las secuencias de oligonucleótidos
complementarias de las desapareadas para todos los pares de bases
desapareados posibles en los ensayos LDR. En experimentos tanto de
competición como de ligación individual (para concentraciones de sal
variables), las ligaciones desapareadas en el caso peor eran 1,5 a
1,0% (véase Tabla II, G:T y T:T), mientras que otras eran 0,4% a
< 0,1% (véase Tabla II, A:A, C:T, G:A y C:A) de los productos
formados con pares de bases complementarias (A:T). Esto es
sustancialmente mejor que lo publicado (utilizando detección
radiactiva) para la ligasa mesófila T4 de E. coli [véase
Gene 76:245 (1989)].
En la serie de experimentos de
amplificación/detección por LCR, se incubaron dos oligonucleótidos
adyacentes con DNA diana desnaturalizado y ligasa, y con la serie
complementaria de oligonucleótidos. En estas condiciones, el
nucleótido 3' del oligonucleótido diagnóstico sin marcar, o bien era
complementario o estaba desapareado respecto al DNA diana, pero era
siempre complementario a su equivalente sin marcar, es decir A:T
para 101 y 104, T:A para 102 y 105, y G:C para 103 y 106. Así pues,
una ligación inicial "incorrecta" de un oligonucleótido
desapareado podría amplificarse subsiguientemente con la misma
eficiencia que una ligación correcta. Las muestras contenían pares
de oligonucleótidos sin marcar (\beta^{A}
alelo-específico 101 y 104, \beta^{S}
alelo-específico 102 y 105, o 103 y 106) con los
pares complementarios y adyacentes de oligonucleótidos marcados, 107
y 109. Estos oligonucleótidos marcados y sin marcar se incubaron en
presencia de ligasa y 10 attomoles de DNA diana (100 veces menos
DNA diana que en el caso de la LDR) durante 20 ó 30 ciclos como en
el Ejemplo IX. Las bandas resultantes se representan en la porción
izquierda de la Figura 3 y la mitad inferior de la Tabla II.
Como puede verse en la Figura 3 y la Tabla II,
la ligasa termófila era capaz de discriminar las secuencias de
oligonucleótidos complementarias de las desapareadas para todos los
pares de bases desapareados posibles en los ensayos LCR. Tanto en
experimentos de competición como en los de ligación individual, las
ligaciones desapareadas eran en el peor caso de 1,3% a 0,6% (G:T,
C:A y A:A, T:T), mientras que otras eran < 0,2% (T:T, A:A y G:A,
C:T) de los productos formados con pares de bases complementarios
(A:T, T:A). La LCR, utilizando ligasa termófila, es por tanto el
único método que puede a la vez amplificar y detectar
desapareamientos de una sola base con altas relaciones de señal a
ruido [véase Genomics 4:560 (1989)]. Así pues, por utilización de
LCR es posible detectar la diferencia entre un desapareamiento de
una sola base tal como ocurre entre \beta^{A} y \beta^{S},
y utilizar los resultados de este ensayo como diagnóstico para el
paciente normal, el portador, o el enfermo.
Cuando la serie entera de experimentos arriba
descritos se repitió utilizando tampón que contenía KCl 150 mM en
lugar de 100 mM, los resultados fueron esencialmente los mismos que
en la Figura 3 y los recogidos en la Tabla II, estando comprendida
la ligación de los oligonucleótidos desapareados para la LDR entre
0,6% y < 0,3%, y para la LCR entre 1,7% y < 0,3% de los
productos exactamente complementarios. Así pues, la discriminación
exquisita entre oligonucleótidos apareados y desapareados parece no
depender críticamente de las condiciones de sal.
Alternativamente, puede utilizarse también un
procedimiento diferente basado en fosfatasa. La reacción LCR o LDR
puede realizarse en un volumen de 10 \mul bajo aceite mineral. Se
añaden a éste 50 \mul de Tris.HCl 10 mM de pH 7,6 que contiene
0,5 unidades de fosfatasa bacteriana alcalina (BAP), y MgCl_{2} 10
mM, y se continúa la incubación a 65ºC durante 2 horas (téngase en
cuenta que la enzima ligasa no se destruye en estas condiciones).
El marcador del extremo 5' en un oligonucleótido que se ha enlazado
covalentemente ya no es sensible a BAP. El producto ligado se
separa del monofosfato por adición de 20 \mul de DNA de esperma de
salmón tratado por ultrasonidos, de concentración 10 mg/ml como
portador y se precipita con 20 \mul de TCA al 50%. Después de
centrifugación durante 5 min a 12.000 rpm, se retira el
sobrenadante, y la relación de sedimento a sedimento + sobrenadante
da el porcentaje de producto formado. Un ensayo similar ha sido
utilizado con endonucleasa Taq I, y el error experimental
para los controles positivo y negativo es aproximadamente de
1-2%.
El uso de la ligasa termófila hace innecesario
titular cuidadosamente tanto la concentración de sal como la
concentración de enzima que se requieren para las ligasas mesófilas.
Los datos de esta serie de experimentos se recogen en la Tabla III
siguiente:
Se ensayó la especificidad de LCR y LDR
utilizando ambos oligonucleótidos específicos \beta^{A} y
\beta^{S} en competición directa para ligación a los
oligonucleótidos invariantes marcados. Utilizando DNA diana
(\beta^{A} \beta^{S}, y una relación equimolar de
\beta^{A} y \beta^{S}) comprendido entre 1 femtomol y 1
attomol, la ligasa termófila formaba específicamente el producto o
productos correctos en cada caso; no se observó producto de
ligación incorrecto de ruido de fondo alguno cuando estaba presente
únicamente un alelo diana). Sin embargo, la eficiencia de formación
de los productos específicos \beta^{S} es algo menor que la
formación de los productos \beta^{A}, y después de 20 ciclos de
amplificación, los productos específicos \beta^{S} eran
aproximadamente un tercio de los productos específicos \beta^{A}
como se cuantificó por ensayo de los productos escindidos respecto
a radioactividad. Por tanto, un ensayo de competición directa, en
el cual dos oligonucleótidos se marcan de modo diferente (por
ejemplo con grupos fluorescentes) para cuantificar las
concentraciones iniciales relativas de cada alelo de secuencia diana
requerirá titulaciones cuidadosas para cada alelo.
Se examinó también la especificidad de la
amplificación de DNA por LCR con cantidades inferiores al attomol
de DNA diana. La extensión de la amplificación de DNA por LCR se
determinó en presencia de DNA diana comprendido entre 100 attomoles
(6 x 10^{7} moléculas) hasta menos de una molécula por tubo. Las
reacciones se incubaron durante 20 ó 30 ciclos, y los productos se
separaron y cuantificaron como se representa en la Figura 4 y la
Tabla IV siguiente.
En ausencia de diana, no se detectó señal alguna
de ruido de fondo cuando estaba presente DNA de esperma de salmón
(4 \mug) como se ve en la Figura 4. Para concentraciones iniciales
de diana mayores, la amplificación del DNA era esencialmente
completa después de 20 ciclos, mientras que para concentraciones
iniciales de diana inferiores se forma sustancialmente más producto
con ciclos de amplificación adicionales. En estas condiciones, 200
moléculas de DNA diana inicial pudieron detectarse fácilmente
después de 30 ciclos.
La naturaleza termoestable de la enzima es
claramente evidente en la Figura 4. Por comparación de la cantidad
de producto formada después de 20 ciclos con la formada después de
30 ciclos, es evidente que para las concentraciones de DNA diana
inferiores se forma producto adicional después de más ciclos (véase
especialmente 2 x 10^{4} a 2 x 10^{2} moléculas de DNA diana).
Dicho de otro modo, la enzima tiene todavía actividad después de 20
ciclos de 94ºC durante 1 minuto seguidos por 65ºC durante 4
minutos.
Así pues, la ligasa de T. aquaticus
retiene la capacidad para catalizar la formación de un enlace
fosfodiéster entre dos oligonucleótidos adyacentes hibridados a una
cadena complementaria de DNA a una temperatura comprendida en el
intervalo de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 85ºC después de
exposición repetida a temperaturas que desnaturalizan el DNA, a
saber en el campo de aproximadamente 105ºC durante aproximadamente
0,25 minutos a aproximadamente 4 minutos.
Por tanto, la amplificación específica de una
sustancia de ensayo de ácido nucleico de secuencia de nucleótidos
conocida utilizando LCR requiere: (1) dos oligonucleótidos
adyacentes complementarios al y en exceso molar del ácido nucleico
de la secuencia diana, y que no tengan desapareamiento alguno con el
ácido nucleico de la secuencia diana en la unión de los
oligonucleótidos adyacentes; (2) una segunda serie de
oligonucleótidos adyacentes complementarios a la primera serie de
oligonucleótidos adyacentes, complementarios al y en exceso molar
del ácido nucleico de la secuencia diana, y que no tengan
desapareamiento alguno con el ácido nucleico de la secuencia diana
en la unión de esta segunda serie de oligonucleótidos adyacentes;
(3) una ligasa termoestable que no se desnaturaliza de modo
irreversible y pierde su aptitud catalítica cuando se somete a
temperaturas comprendidas entre aproximadamente 50ºC y
aproximadamente 105ºC; y (4) someter esta mixtura de ligasa a ciclos
de temperatura repetidos que comprenden una primera temperatura
para desnaturalizar el DNA (en un intervalo de aproximadamente 90ºC
a aproximadamente 105ºC), y una segunda temperatura para permitir la
hibridación/ligación (en un intervalo de aproximadamente 50ºC a
aproximadamente 85ºC). En la amplificación del alelo de globina
\beta^{A} arriba descrita, los componentes eran (1) los
oligonucleótidos 101 y 107; (2) los oligonucleótidos 104 y 109; (3)
ligasa de T. aquaticus; y (4) 30 ciclos de temperatura de
94ºC durante 1 minuto seguidos por 65ºC durante 4 minutos.
En la figura 4, bandas de 45 y 46 nucleótidos
corresponden a productos de ligación de los oligonucleótidos de
globina \beta^{A} codificantes y complementarios. Los productos
de peso molecular inferior corresponden a la ligación de
oligonucleótidos de deleción presentes en la reacción de ligación
inicial. Dado que las muestras se cargaron en grupos de 8, el lado
de la derecha del autorradiograma proporciona el aspecto de una
migración más lenta.
Para ensayar adicionalmente la aptitud de la
ligasa para discriminar entre oligonucleótidos complementarios y
desapareados, se llevó a cabo un experimento LCR en presencia y
ausencia de oligonucleótidos que podrían dar desapareamientos G:T y
C:A de acuerdo con el ejemplo siguiente, que no sólo muestra
amplificación del DNA, sino que respalda también la naturaleza
termoestable de la enzima encontrada en el Ejemplo IX.
Una serie de experimentos contenían 40 fmoles
cada uno de los oligonucleótidos 101 y 104 sin marcar, mientras que
la segunda serie tenía además 40 fmoles de los oligonucleótidos 103
y 106 sin marcar. Ambas series contenían 40 fmoles cada una de 107
y 109 marcados. Los oligonucleótidos marcados (200.000 cpm; 0,28 ng,
40 fmoles) y los oligonucleótidos sin marcar (0,27 ng, 40 fmoles)
se incubaron en presencia de DNA diana, comprendido entre 100
attomoles (6 x 10^{7} moléculas) y 0,01 attomoles (6 x 10^{3}
moléculas) del plásmido de globina \beta^{A} o \beta^{S}
digerido con Taq I. La incubación se realizó en 10 \mul de
tampón Tris.HCl 20 mM de pH 7,6 que contenía MgCl_{2} 100 mM,
EDTA 1 mM, NAD 10 mM, ditiotreitol 10 mM, DNA de esperma de salmón
4 \mug, y 15 unidades de cierre de mella de ligasa de T.
aquaticus, y se cubrió con una gota de aceite mineral. Las
reacciones se incubaron a 94ºC durante 1 min seguidos por 65ºC
durante 4 min, y este ciclo se repitió 20 ó 30 veces.
Las muestras resultantes se sometieron a
electroforesis, se autorradiografiaron en gel durante una noche con
ayuda de un filtro intensificador Cronex y se contaron las bandas.
Las bandas del gel autrorradiografiado se representan en la Figura
4, y la cuantificación de la amplificación por LCR se recoge en la
Tabla V siguiente.
A concentraciones diana elevadas de diana, se
producía suficiente producto desapareado para ser visualizado (como
en la Figura 4), variando la cantidad de producto desapareado desde
1,8% a 0,5% del producto complementario. El uso de un exceso de DNA
diana desapareado (DNA de globina \beta^{S} en lugar de
\beta^{A} a 6 x 10^{7} moléculas por tubo) daba únicamente
2,1% y 1,5% de producto. La misma cantidad de producto puede
formarse cuando se utiliza una cantidad de DNA diana complementario
de 3 a 10.000 veces menor. Basándose en esto, la señal de los
productos de ligación apareados correctamente es 50 a 500 veces
mayor que los productos desapareados en las condiciones de ligación
LCR competitivas o individuales.
Para concentraciones de diana bajas, la
extensión de la amplificación del DNA comprendía desde 3,7 x
10^{4} a 1,7 x 10^{5} (véanse las Tablas IV y V). Suponiendo
que la eficiencia de ligación es la misma en cada ciclo, la
amplificación media por ciclo está comprendida entre 40 y 50%.
La eficiencia por ciclo podría, por supuesto,
mejorarse potencialmente por alteración de las condiciones de
tampón, la concentración de enzima, los tiempos de ciclo térmico y
las temperaturas - todo ello dentro de las capacidades de los
expertos en la técnica. Por ejemplo, se ha demostrado que la
eficiencia de ligación de ligasa termófila (y otras ligasas) puede
mejorarse por alteración de las composiciones tampón, por ejemplo
utilizando NH_{4}Cl, HEPES, poliaminas tales como espermidina, o
polietilenglicoles [véase J. Biol. Chem. 259:10041 (1984), y J.
Biochem. 100:123 (1986)]. La variación de las cantidades de cada
componente en el tampón utilizado actualmente y la complementación
o el intercambiando de uno o más componentes con, pero sin carácter
limitante, los componentes químicos y biológicos arriba enumerados,
se encuentran entre los métodos de mejora de la LCR que son
directos para los expertos en la técnica. Asimismo, es posible
variar fácilmente los tiempos y las temperaturas de los ciclos. Por
ejemplo, en los últimos momentos, la mayor parte de la diana
presente es producto oligonucleotídico de una reacción LCR previa.
Estos oligonucleótidos son cortos (preferiblemente, pero sin
carácter limitante, 40-60-meros) y
pueden fundir más rápidamente, permitiendo un sometimiento a ciclos
más rápido. En la presente invención, las reacciones en cadena de
ligasa satisfactorias se han completado durante 30 y 40 ciclos en
condiciones de sometimiento a ciclos de 94ºC durante 0,5 minutos
seguido por 65ºC durante 2 minutos (la mitad de tiempo del tiempo
de ciclo de 1 minuto a 94ºC y 4 minutos a 65ºC de tiempo de ciclo
para las condiciones de la reacción en cadena de ligasa preferidas).
Tanto la temperatura de ligación como las temperaturas de
desnaturalización del DNA pueden modificarse con respecto al grado
real, la duración, y el número de ciclos repetidos. Las condiciones
óptimas deben maximizar la cantidad de producto formada en
presencia de DNA diana perfectamente complementario, mientras que
minimizan la cantidad de producto incorrecto formado en presencia
de DNA diana desapareado o en ausencia de DNA diana
complementario.
Utilizando estos descubrimientos, se desarrolló
un método para la detección de secuencias específicas de
oligonucleótidos en muestras clínicas. La fuente de la muestra puede
ser cualquier material o sustancia que comprenda ácido nucleico. El
ácido nucleico no precisa ser un ácido nucleico existente
naturalmente, sino que puede sintetizarse por medios químicos,
enzimáticos o biológicos y puede tener otras purinas y pirimidinas
distintas de las existentes naturalmente. La fuente de la muestra
clínica puede ser celular o no celular, y puede derivarse de medios
fisiológicos tales como sangre, suero, plasma, leche de mama, heces,
pus, raspaduras de tejidos, lavados, orina, o análogos.
Adicionalmente, la muestra puede estar asociada con un conjunto o
subconjunto de células, tales como células neoplásticas, linfocitos
(por ejemplo, células T o células B, monocitos, neutrófilos, etc);
puede incluir patógenos con inclusión de virus, bacterias,
micoplasma, hongos, protozoos, etc.; puede incluir construcciones,
etc. o RNA, tal como RNA mensajero, RNA de transferencia, RNA
ribosómico, virus, o análogos; la detección puede hacerse para una
diversidad de propósitos tales como, por ejemplo, el diagnóstico de
un estado de enfermedad potencial o real en especies vegetales o
animales, así como la detección de conjuntos o subconjuntos de
patógenos, la monitorización de ingeniería genética, o análogos.
Un método de este tipo para el cual puede
utilizarse la presente invención (y que demuestra claramente la
viabilidad de la detección alélica directa por LCR de muestras de
sangre sin necesidad de amplificación previa por PCR) se
materializa, por ejemplo, en la detección de alelos de
\beta-globina en DNA genómico humano. Basándose
en el alto nivel de amplificación del DNA, la detección de DNA
alelo-específica por LCR se examinó a partir de
sangre recogida de individuos normales (\beta^{A}
\beta^{A}), portadores (\beta^{A}\beta^{S}), e
individuos que contenían células falciformes
(\beta^{S}\beta^{S}) como se describe con mayor detalle en
el ejemplo siguiente:
Se aisló DNA genómico humano a partir de 0,5 ml
de sangre entera [véase PCR Technology, compilador H.A. Erlich,
Stockton Press (1989), p. 36]. La sangre entera (0,5 ml) se mezcló
con un volumen igual de tampón de lisis (Tris.HCl 10 mM, pH 7,6,
que contenía MgCl_{2} 5 mM y sacarosa 0,32 M). Después de una
breve centrifugación (1 min a 12.000 rpm en una centrífuga de
sobremesa Eppendorf), el sobrenadante se separó con gran cuidado,
dejando 0,15 a 0,2 ml de sobrenadante y núcleos reducidos a un
sedimento sin cohesión. El sedimento se suspendió de nuevo con
agitación turbulenta en 0,5 ml adicionales de tampón de lisis, se
redujeron los núcleos a un sedimento y se eliminó el sobrenadante
como anteriormente. Este paso se repitió tres o cuatro veces hasta
que el sobrenadante era de color claro o sólo ligeramente rosado.
Después de la eliminación del sobrenadante final (dejando de nuevo
aproximadamente 0,15 a 0,2 ml), se añadieron 0,25 ml de tampón de
DNA LCR que contenía detergentes no iónicos (Tris.HCl 20 mM, pH
7,6, que contenía EDTA 2 mM y 0,45% de cada uno de los detergentes
no iónicos LP40 y Tween 20). Se digirió cualquier exceso de RNA por
adición de 2 \mul de RNasaA de concentración 4 mg/ml tratada
térmicamente durante 15 min a 37ºC. Todas las proteínas se
digirieron por adición de 5 \mul de Proteinasa K obtenida
recientemente de concentración 10 mg/ml e incubación a 50ºC durante
1 a 2 horas. Las proteínas K y la RNasaA se separaron por
extracciones secuenciales con fenol, fenol/cloroformo, cloroformo,
n-butanol (2X) y el ácido nucleico se recuperó por
precipitación con etanol. las muestras se hirvieron durante 5 min
antes de ser utilizadas en los ensayos LCR.
Cada DNA genómico humano aislado se ensayó en
dos mezclas de reacción, ensayando la primera respecto a la
presencia del alelo normal \beta^{A}, y ensayando la segunda en
cuanto a la presencia del alelo sicida \beta^{S}. La primera
mixtura de reacción contenía los oligonucleótidos de ensayo
\beta^{A} 101 y 104 (0,27 ng o 40 fmoles de cada uno),
oligonucleótidos marcados (107 y 109; 200.000 cpm (0,28 ng o 40
fmoles de cada uno)), DNA genómico (correspondiente a 10 \mul de
sangre, o aproximadamente 6 x 10^{4} células nucleadas) en 10
\mul de tampón Tris.HCl 20 mM, pH 7,6, que contenía KCl 100 mM,
MgCl_{2} 10 mM, EDTA 1 mM, NAD 10 mM, ditiotreitol 10 mM, y 15
unidades de cierre de la mella de ligasa de T. aquaticus, y
se cubrió con una gota de aceite mineral. La segunda mixtura de
reacción contenía los oligonucleótidos de ensayo de \beta^{S}
102 y 105 (0,27 ng o 40 fmoles de cada uno), oligonucleótidos
marcados 107 y 109 (200.000 cpm o 0,28 ng o 40 fmoles de cada uno),
DNA genómico correspondiente a 10 \mul de sangre o aproximadamente
6 x 10^{4} células nucleadas) en 10 \mul de tampón
Tris-Cl 20 mM, pH 7,6, y que contenía KCl 100 nM,
MgCl_{2} 10 nM, EDTA 1 mM, NAD 10 nM, ditiotreitol 10 mM, y 15
unidades de cierre de la mella de ligasa de T. aquaticus, y
se cubrió con una gota de aceite mineral.
Ambas mixturas de reacción se incubaron a 94ºC
durante 1 min seguido por 65ºC durante 4 min, y este ciclo se
repitió 20 a 20 veces. Las reacciones se terminaron por la adición
de 8 \mul de formamida que contenía EDTA (10 mM),
xileno-cianol (0,2%) y azul de bromofenol
(0,2%).
Las muestras (4 \mul) se desnaturalizaron por
ebullición durante 3 min antes de la carga (40.000 cpm/pista). La
electroforesis se realizó en un gel de poliacrilamida al 10% que
contenía urea 7M en un tampón de Tris-borato 100 mM
a pH 8,9 y EDTA 1 mM, durante 2 horas a una potencia constante de 60
vatios. Después de eliminar la urea (10 min de impregnación en
ácido acético al 10%, seguido por 5 min de impregnación en agua).
Los geles se secaron luego sobre papel Whatman de 3 mm y se
autorradiografiaron durante una noche a -70ºC en película Kodak
XAR-5 con un filtro intensificador DuPont Cronex.
Los productos de ligación de 45 y 46, o 47 y 48 nucleótidos indican
la presencia del gen de globina \beta^{A} o \beta^{S},
respectivamente. Como se ha indicado con el DNA diana derivado del
plásmido, la eficiencia de ligación (y por tanto de detección) es
algo menor para los oligonucleótidos específicos \beta^{S} que
los específicos de \beta^{A}.
La Figura 5 es un autorradiograma que muestra la
detección de alelos de B-globina en DNA genómico
humano producidos de acuerdo con el Ejemplo anterior. Los productos
de ligación de 45 y 46, o 47 y 48 nucleótidos indican la presencia
del gen de globina \beta^{A} o \beta^{S}, respectivamente.
Así pues, con DNA diana correspondiente a 10 \mul de sangre,
pudieron detectarse fácilmente los alelos \beta^{A} y
\beta^{S} utilizando LCR específica de alelos.
Por tanto, la detección con éxito de una
sustancia de ensayo de ácido nucleico derivada biológicamente, que
tiene una secuencia de nucleótidos normal conocida y una posible
mutación conocida en al menos una posición de nucleótidos diana en
la secuencia, requiere (1) una primera mixtura de reacción que
comprende dos series de oligonucleótidos adyacentes complementarias
una a otra, complementarias al ácido nucleico de la secuencia
diana, en donde existe al menos un par de bases desapareado respecto
al ácido nucleico de la secuencia mutante diana, pero no al ácido
nucleico de la secuencia diana normal en la unión de los
oligonucleótidos adyacentes; (2) una segunda mixtura de reacción
que comprende dos series de oligonucleótidos adyacentes
complementarios uno a otro, complementarios respecto al ácido
nucleico de la secuencia diana, en donde existe al menos un par de
bases desapareado respecto al DNA de la secuencia diana normal, pero
no para el ácido nucleico de la secuencia mutante diana en la unión
de los oligonucleótidos adyacentes; (3) una ligasa termoestable que
no llega a desnaturalizarse irreversiblemente y perder su capacidad
catalítica cuando se somete a temperaturas de aproximadamente 50% a
aproximadamente 105ºC; (4) someter estas mixturas de ligasa a ciclos
de temperatura repetidos que comprenden una primera temperatura
para desnaturalizar el DNA (en un intervalo de aproximadamente 90ºC
a aproximadamente 105ºC), y una segunda temperatura para permitir la
hibridación/ligación (en el intervalo de aproximadamente 50ºC a
aproximadamente 85ºC) - esto permite también que los
oligonucleótidos adyacentes en cada mixtura de reacción lleguen a
enlazarse si es posible por enlaces covalentes; (5) separar la
sustancia de ensayo y cualesquiera oligonucleótidos de ensayo no
enlazados del producto oligonucleotídico enlazado covalentemente
(si se ha formado); y (6) detectar la presencia o ausencia de
oligonucleótidos enlazados covalentemente en cada mixtura de
reacción con lo cual la presencia del producto oligonucleotídico
enlazado covalentemente en la primera mixtura de reacción indica la
presencia de secuencia diana normal y la presencia de producto
oligonucleótido enlazado covalentemente en la segunda mixtura de
reacción indica la presencia de secuencia mutante diana. En la
detección de los alelos de globina B^{A} y \beta^{S} arriba
descritos, los componentes eran (1) los oligonucleótidos 101, 104,
107 y 109; (2) los oligonucleótidos 102, 105, 107 y 109; (3) ligasa
de T. aquaticus; (4) 30 ciclos de temperatura de 94ºC
durante 1 minuto seguidos por 65ºC durante 4 minutos; (5)
desnaturalización de los ácidos nucleicos por ebullición en
formamida al 45% y separación en un gel de secuenciación; y (6)
obtención de la autorradiografía del gel.
Esto demuestra claramente la viabilidad de la
detección alélica directa por LCR de muestras de sangre de acuerdo
con la presente invención sin la necesidad de amplificación por
PCR.
Como se ha indicado con el DNA diana derivado de
plásmido, la eficiencia de ligación (y por tanto de detección) es
algo menor para los oligonucleótidos específicos \beta^{S} que
para los \beta^{A}. Después de 30 ciclos de amplificación, los
productos específicos de \beta^{S} eran aproximadamente un
tercio de los productos específicos de \beta^{A}, como se
cuantificó por ensayo de los productos escindidos en cuanto a
radioactividad. Estas diferencias pueden ser función de la secuencia
exacta de nucleótidos en la unión de ligación, de los
oligonucleótidos particulares (con colas 5' diferentes) utilizados
en los experimentos LCR. Sin embargo, la presente invención permite
todavía un ensayo de competición directo en donde dos
oligonucleótidos se marcan diferencialmente (por ejemplo con grupos
fluorescentes o, en este caso, con colas de longitud diferente)
para determinar la presencia o ausencia de cualquier alelo en una
mezcla de reacción. En la forma generalizada, el método de acuerdo
con la presente invención permite ensayar dos alelos en el mismo
recipiente, con tal que las series de oligonucleótidos que
contienen al menos un par de bases apareado desapareado respecto al
ácido nucleico de la secuencia diana mutante, pero no al ácido
nucleido de la secuencia diana normal en la unión de los
oligonucleótidos adyacentes, estén marcadas con una serie de
marcadores, y los oligonucleótidos que contienen al menos un par de
bases desapareado respecto al ácido nucleico de la secuencia diana
normal, pero no al ácido nucleico de la secuencia diana mutante en
la unión de los oligonucleótidos adyacentes, estén marcados con un
marcador diferente.
En un ensayo no radiactivo comparable, como se
representa en la Figura 6, un mínimo de dos sondas
oligonucleotídicas se sintetizan y se modifican respecto a
funciones particulares en el ensayo de ligación. Una sonda contiene
un gancho que permite la captura del oligonucleótido después de la
ligación. Un ejemplo de un gancho de este tipo es biotina, que
puede ser capturada por estreptavidina o avidina fijadas a soportes
apropiados. La otra sonda tiene un grupo informador. Aunque están
disponibles una diversidad de grupos informadores, tanto
radioisotópicos como no radioactivos, y pueden utilizarse con el
ensayo de acuerdo con la presente invención, tales como fluoróforos
o restos luminiscentes, el informador preferido actualmente es uno
que puede participar en un ELISA (ensayo de inmunosorbente unido a
enzima). De modo más específico, la Figura 6 representa un diagrama
esquemático de un ensayo de ligación de oligonucleótidos basado en
ELISA en el cual oligonucleótidos biotinilados (B) y marcados con
digoxigenina (D) se hibridan con una diana de DNA en presencia de
ligasa (flecha). Los oligonucleótidos biotinilados se capturan en
estreptavidina (SA) aplicada en forma de capa en los pocillos de
placas de microtitulación. Los pocillos se lavan para eliminar los
oligonucleótidos no fijados, y se añaden a los pocillos anticuerpos
anti-digoxigenina (D) conjugados a fosfatasa
alcalina (AP). Después de un ciclo de incubación y lavado, se añade
sustrato de fosfatasa alcalina (S), y se detecta la digoxigenina por
la producción de un producto coloreado.
El ensayo marcado de modo no radiactivo puede
consistir en varios pasos: (1) preparación de la diana de DNA; (2)
desnaturalización e hibridación de las sondas polinucleotídicas
modificadas; (3) ligación; (4) captura de la sonda biotinilada; (5)
lavado para eliminar los oligonucleótidos no biotinilados libres y
la diana; (6) adición de anticuerpos
anti-digoxigenina conjugados a fosfatasa alcalina;
(7) lavado para eliminar el anticuerpo no fijado; (8) adición de
sustrato de fosfatasa alcalina; y (9) análisis espectrofotométrico.
El diagrama de flujo siguiente detalla el procedimiento general
(que se ha automatizado en un ordenador Biomek 1000 modificado) por
el cual puede conducirse un ensayo no radiomarcado:
DNA diana amplificado
- Detección de ligasa T4
- Detección de ligasa Taq
Desnaturalización de la polimerasa Taq
residual por adición de:
- 45 \mul de NaOH 0,3N
- 45 \mul de KOH 0,1 N
Renaturalización del DNA diana por adición
de:
- 45 \mul de HCl 0,3 N
- 45 \mul de HCl 0,1 N
\vskip1.000000\baselineskip
Se añaden oligonucleótidos biotinilados e
informadores a dianas de DNA (200 fmoles de cada oligonucleótido en
10 \mul de mezcla de ligación 2X)
- Mezcla de ligación:
- Mezcla de ligación:
- 200 fmoles de oligo biotinilado
- 200 fmoles de oligo biotinilado
- 200 fmoles de oligo informador
- 200 fmoles de oligo informador
- Tris.HCl 100 mM, pH 7,5
- Tris.HCl 100 mM, pH 7,5
- MgCl_{2} 20 mM
- MgCl_{2} 20 mM
- DTT 10 mM
- DTT 10 mM
- ATP 2 mM
- ATP 2 mM
- Espermidina 2 mM
- Espermidina 2 mM
- Formamida al 50%
- NAD 2 mM
- \quad
- KCl 100 mM
- \quad
- Ligasa Taq
\vskip1.000000\baselineskip
- Enfriar a la temperatura ambiente y añadir 5 \mul de ligasa T4 en NaCl 200 mM
- Enfriar a 60-68ºC y ligar durante 15 minutos (repetir los pasos de desnaturalización y ligación para amplificar)
Tris.HCl 50 mM, pH 7,5
MgCl_{2} 10 mM
DTT 5 mM
ATP 1 mM
Espermidina 1 mM
\vskip1.000000\baselineskip
Ligar a la temperatura ambiente (25ºC) durante
15 minutos
Parar la reacción de ligación y desnaturalizar
los productos por adición de 10 \mul de NaOH 0,3M. Neutralizar
las reacciones por adición de 4 \mul de acetato de sodio 3M.
Transferir las reacciones a una placa de
microtitulación recubierta con avidina y bloqueada (recubrimiento
de avidina - 60 \mug de avidina/pocillo en 60 \mul de PBS, pH
7,0 durante 60 min a 37ºC; bloqueo - eliminar la avidina de la
placa y añadir 200 \mul/pocillo de Tris.HCl 100 mM, NaCl 150 mM,
0,05% de Tween, 0,25% de leche desecada, y 100 \mug/ml de DNA de
esperma de salmón). Capturar el oligonucleótido biotinilado a la
temperatura ambiente durante 30 minutos.
Desnaturalizar la mezcla de oligonucleótidos
diana a 93ºC durante 2 minutos
Lavar la placa para eliminar oligonucleótidos y
dianas no fijados con (1) Tris.HCl 100 mM, pH 7,5, en NaCl 150 mM
en 0,05% de Tween; (2) NaOH 0,01 N en 0,05% de Tween; y (3) Tris.HCl
100 mM, pH 7,5 en NaCl 150 mM en 0,05% de Tween.
Añadir anticuerpo conjugado a fosfatasa alcalina
al oligonucleótido informador; 30 \mul por pocillo en Tris.HCl
100 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,5% de leche desecada y 0,05% de
Tween.
Incubar las placas durante 30 min a la
temperatura ambiente para fijación del anticuerpo al informador
Lavar la placa con Tris.HCl 100 mM, pH 7,5, NaCl
150 mM en 0,05% de Tween para eliminar el anticuerpo no fijado.
Añadir el sustrato.
Leer la placa respecto a producto colorimétrico,
quimioluminiscente, o fluorescente apropiado.
Las secuencias genómicas requeridas para iniciar
este ensayo pueden amplificarse por cierto número de métodos
diferentes, que incluyen LCR, 3SR, y PCR. Los autores de la
invención han utilizado amplificación por PCR para obtener las
dianas de DNA enumeradas en la Tabla VI siguiente para iniciadores
de ensayo de litigación:
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación del DNA se realizó utilizando 5
\mul de DNA (2 ng/\mul para DNA genómico o 5 \mul de material
tratado procedente de una fuente alternativa) se mezclan con un par
de oligonucleótidos iniciadores (0,5 \mul de cada uno)
específicos para la región de DNA a amplificar en un tampón PCR que
contiene 0,05 U/\mul de polimerasa Taq, KCl 50 mM, tampón
Tris.HCl 25 mM a pH 8,3, MgCl_{2} 10 mM, 200 \mug/ml de
gelatina, 0,1% de triton X-100, y 1,5 mM de cada uno
de dATP, dCTP, dGTP y dTTP. La muestra se cubrió con 60 \mul de
aceite mineral ligero, se desnaturalizó a 93ºC durante 5 min la
diana, y se sometió a 40 ciclos constituidos por 20 s a 93ºC, 40 s
a 55ºC, y 1 min a 72ºC. Después del sometimiento a ciclos térmicos,
la muestra se sometió durante 10 min a 72ºC para completar la
extensión de la muestra de DNA.
Se sintetizan oligonucleótidos y se modifican
para funciones particulares en el ensayo de ligación. El ensayo
requiere un mínimo de dos oligonucleótidos modificados. Un
oligonucleótido tiene un gancho que permite la captura del
oligonucleótido después de la ligación. Un ejemplo de éste es un
oligonucleótido biotinilado que puede ser capturado en soportes de
estreptavidina o avidina. El otro oligonucleótido tiene un grupo
informador que, en el caso de un informador fluoróforo, podrían
incorporarse fácilmente informadores múltiples con espectros de
emisión diferentes en un solo ensayo.
Para un sistema basado en ELISA, se sintetizan
sondas que discriminan formas alélicas de un gen con un grupo
biotina 5'. Las sondas informadoras se fosforilan en 5' enzimática o
químicamente y se marcan con el hapteno digoxigenina. Se añade el
hapteno al extremo 3' de la sonda informadora por adición de 500 pM
de colas del oligonucleótido a 37ºC durante 1 hora en cacodilato de
potasio 10 mM, pH 7,0, CoCl_{2} 1 mM, DTT 0,1 mM, 5 nM de
digoxigenina-dUTP, 0,05 \muM de dATP, y 100
unidades de la enzima terminal transferasa en un volumen total de
20 \mul. Después de la marcación, se añaden 2 \mul de acetato de
sodio 3M y 1 \mul de t-RNA de levadura (1 mg/ml)
y 60 \mul de etanol al 95%. El oligonucleótido se precipita a 4ºC
durante 5 min y se recoge luego por centrifugación a 6500 x g
durante 5 minutos. El sedimento se resuspende en 20 \mul de agua
destilada y se repite el proceso. Esta precipitación separa el
exceso de digoxigenina no conjugada de la sonda marcada. Ejemplos
de oligonucleótidos que discriminan alelos para 3 estados
patológicos se dan en la Tabla VII siguiente:
\global\parskip0.900000\baselineskip
Utilizando el procedimiento contenido en el
diagrama de flujo previo, se realizaron cierto número de
experimentos y, después del desarrollo del color, se obtuvieron
datos espectrofotométricamente a una longitud de onda de 490 mN
[sic]. Los resultados típicos para tales ensayos se han recogido en
la Tabla VIII siguiente:
Se alcanzaron niveles de detección comparables
con ligasa T4 o Taq. Adicionalmente, se han realizado cierto número
de reacciones de ligación para varias otros polimorfismos asociados
a enfermedades con resultados comparables. Adicionalmente, se han
examinado ocho polimorfismos diferentes en los loci receptores de
células T humanas, con resultados de detección similares. La
presente invención, por tanto, parece ser de aplicación general en
el análisis de polimorfismos de DNA constituidos por sustituciones
de bases simples, deleción o inserciones de DNA, o traducciones de
DNA.
Adicionalmente, cierto número de sustratos de
fosfatasa alcalina puede emplearse en el ensayo ELISA, con inclusión
de sustratos quimioluminiscentes sensibles (detección de 10
attomoles). El formato del ensayo se adapta fácilmente a otros
formatos informadores tales como fluoróforos que pueden leerse en el
formato de microtitulación apropiado. La incorporación del formato
fluoróforo apropiado podría permitir, por ejemplo, análisis
múltiples por ligación. En este esquema, podrían evaluarse en un
solo ensayo oligonucleótidos que discriminan alelos diferentes y/o
genes diferentes. Adicionalmente, es también posible que pudieran
emplearse ensayos de ligación en tándem (ligación de
oligonucleótidos en cadenas) para evaluar polimorfismos de DNA
espaciados estrechamente tales como los que existen en los genes
del complejo principal de histocompatibilidad. Se considera que
tales modificaciones del ensayo representado específicamente arriba
están perfectamente dentro del alcance de la presente invención.
La presente invención puede utilizarse en una
gran diversidad de escrutinios de diagnóstico de DNA. Por ejemplo,
y sin pretender limitar el alcance de la presente invención,
evaluaciones de diagnóstico de DNA de este tipo pueden incluir
aquéllas que están de acuerdo con el sumario siguiente:
- 1.
- Enfermedades virales: HIV, EBV, HPV, HSV, CMV, Hepatitis (no A, no B)
- (i)
- evaluación de sangre y tejidos
- (ii)
- identificación rápida
- (iii)
- diferenciación entre infección crónica y una exposición pasada
- (iv)
- distinción de cepas resistentes en infección mixta
- 2.
- Enfermedades bacterianas: Microbacterias, Sífilis, Clamidia, Legionella, Campilobacter; Pneumocistis, Listeria, Lyme, Lepra
- (i)
- identificación rápida de microbios de crecimiento lento
- (ii)
- identificación de pacientes inmunodeficientes
- (iii)
- ensayo de alimentos respecto a contaminación
- 3.
- Enfermedades Parasitarias: Malaria, Tripanosomas, Leishmania
- (i)
- identificación rápida de enfermedades de la sangre "tercermundistas"
- (ii)
- rastreo de viajeros y fuerzas armadas
- 1.
- Enfermedades de un Solo Alelo: Fibrosis quística, Distrofia muscular de Duchenne, Anemia de células falciformes, \beta-talasemia, Hemofilia A, Gaucher, Tay-Sachs, Alzheimer y Neurofibromatosis
- 2.
- Cáncer: retinoblastoma, tumor de Wilms, colon, mama, oncogenes, supresores de tumores
- 3.
- Enfermedades de alelos múltiples: enfermedad cardíaca coronaria, diabetes, presión sanguínea elevada, esquizofrenia, maníaco-depresión, y abuso del alcohol
- (i)
- predisposición a la enfermedad
- (ii)
- medicina preventiva, ejercicio, dieta
- (iii)
- rastreo genético y asesoramiento
- (iv)
- terapia génica
- 1.
- Humanos: tipificación HLA, medicina forense
- (i)
- trasplante de tejidos
- (ii)
- análisis de enlaces genéticos
- (iii)
- programa de genoma humano
- (iv)
- identificación positiva de niños desaparecidos
- 2.
- Animales: caballos, vacas lecheras, ganado bovino, mascotas domésticas
- (i)
- características genéticas puras
- (ii)
- confirmación del linaje de reproducción
- (iii)
- identificación positiva de animales
- 3.
- Plantas: stock de semillas
- (i)
- aseguramiento de la diversidad genética
- (ii)
- identificación de las cepas resistentes a sequía y enfermedad
Una vez descrita la presente invención, y la
manera y un proceso de realización y utilización de ella en términos
tan completos, claros, concisos y exactos a fin de permitir a
cualquier persona experta en la técnica a la que se refiere la
misma realizar y utilizar la invención, o con la cual está más
íntimamente conectada.
Claims (20)
-
\global\parskip0.950000\baselineskip
1. Un método para amplificar una sustancia de ensayo de ácido nucleico que tiene una primera secuencia de nucleótidos conocida y una segunda secuencia de nucleótidos conocida que son complementarias y forman juntas cadenas separadas de una molécula de DNA bicatenario, comprendiendo el método:- proporcionar una muestra que contiene la sustancia de ensayo;
- proporcionar una primera serie de oligonucleótidos de al menos dos oligonucleótidos adecuados para ligación mutua en una primera unión de ligación y para hibridación sin desapareamiento en la primera unión de ligación a la primera secuencia de nucleótidos, en donde los al menos dos oligonucleótidos se hibridan adyacentemente uno a otro en la primera secuencia de nucleótidos y tienen una temperatura de hibridación de aproximadamente 50ºC a 85ºC;
- proporcionar una segunda serie de oligonucleótidos de al menos dos oligonucleótidos adecuados para ligación mutua en una segunda unión de ligación y para hibridación sin desapareamiento en la segunda unión de ligación a la segunda secuencia de nucleótidos, en donde los al menos dos oligonucleótidos de la segunda serie de oligonucleótidos se hibridan adyacentemente uno a otro en la segunda secuencia de nucleótidos y tienen una temperatura de hibridación de aproximadamente 50 a 85ºC;
- proporcionar una ligasa termoestable que no llega a desnaturalizarse irreversiblemente y perder su actividad catalítica cuando se somete a temperaturas comprendidas entre aproximadamente 50ºC y 105ºC;
- mezclar la muestra, las series de oligonucleótidos primera y segunda, y la ligasa termoestable para formar una mixtura de amplificación; y
- someter la mixtura de amplificación a una serie de ciclos que comprenden un tratamiento de desnaturalización en donde las series de primeros y segundos oligonucleótidos ligadas están separadas de la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos, respectivamente, y un tratamiento térmico de hibridación a una temperatura de 50-85ºC, en donde la primera serie de oligonucleótidos se hibrida a la primera secuencia de nucleótidos, y sus oligonucleótidos se ligan uno a otro, la segunda serie de oligonucleótidos se hibrida a la segunda secuencia de nucleótidos y sus oligonucleótidos se ligan uno a otro, para amplificar exponencialmente las secuencias de nucleótidos primera y segunda en el DNA,
en donde los al menos dos oligonucleótidos de la segunda serie de oligonucleótidos son complementarios a los al menos dos oligonucleótidos de la primera serie de oligonucleótidos, complementando un oligonucleótido de la primera serie de oligonucleótidos un oligonucleótido de la segunda serie de oligonucleótidos con un saliente 3' de una sola base. - 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho tratamiento de desnaturalización se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 90ºC a 105ºC.
- 3. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde dicha serie de ciclos amplifica las secuencias de nucleótidos primera y segunda aproximadamente 50 a aproximadamente 500 veces más que lo que ocurriría si estuviera presente un solo desapareamiento de bases en la primera unión de ligación.
- 4. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el tratamiento de desnaturalización tiene una duración de aproximadamente 0,25 minutos a aproximadamente 4,0 minutos.
- 5. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la primera serie de oligonucleótidos se encuentra en un exceso molar respecto a la primera secuencia de nucleótidos.
- 6. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la ligasa se aísla de Thermus aquaticus.
- 7. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende adicionalmente:
- detectar las secuencias de nucleótidos primera y/o segunda.
- 8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha detección comprende:
- capturar un gancho unido a al menos uno de los oligonucleótidos de la primera serie de oligonucleótidos y/o la segunda serie de oligonucleótidos, seleccionándose el gancho del grupo constituido por antígenos, biotina, y proteínas de fijación de DNA.
- 9. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual dicha detección comprende:
- detectar un marcador unido a al menos uno de los oligonucleótidos de la primera serie de oligonucleótidos y/o al menos uno de los oligonucleótidos de la segunda serie de oligonucleótidos, seleccionándose el marcador del grupo constituido por cromóforos, restos fluorescentes, enzimas, antígenos, restos quimioluminiscentes, y restos de detección electroquímicos.
- 10. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual dicha detección comprende:separar los productos de dicha serie de ciclos por electroforesis en gel de poliacrilamida.
- 11. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el cual los oligonucleótidos de las series de oligonucleótidos primera y segunda son ácidos desoxirribonucleicos.
- 12. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el cual la porción de hibridación de al menos uno de los oligonucleótidos de las series de oligonucleótidos primera y/o segunda tienen una longitud de 20 a 25 nucleótidos.
- 13. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el cual los oligonucleótidos de las series de oligonucleótidos primera y segunda tienen cada uno valores T_{m} de 66 a 70ºC.
- 14. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en el cual la mixtura de amplificación incluye adicionalmente una DNA portador.
- 15. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, en el cual el DNA portador es DNA de esperma de salmón.
- 16. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente
- proporcionar una serie de oligonucleótidos adicional de al menos dos nucleótidos adecuada para ligación mutua y para hibridación sin desapareamientos a una secuencia diana mutante de la primera secuencia de nucleótidos que tiene una mutación conocida, pero no a la forma normal de la primera secuencia de nucleótidos;
- mezclar la muestra, la serie de oligonucleótidos adicional y la ligasa para formar una segunda mixtura de amplificación; someter la segunda mixtura de amplificación a al menos un ciclo de temperatura que comprende una primera temperatura de aproximadamente 90ºC a aproximadamente 105ºC y una segunda temperatura de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 85ºC, en donde la serie de oligonucleótidos adicional se hibrida a la forma defectuosa de la primera secuencia de nucleótidos y sus oligonucleótidos se ligan uno a otro, y detectar la presencia o ausencia del producto oligonucleotídico ligado en la mixtura de amplificación y la segunda mixtura de amplificación, en donde la presencia de tal producto en la mixtura de amplificación indica la presencia en la muestra de la primera secuencia de nucleótidos, y la presencia de dicho producto en la segunda mixtura de amplificación indica la presencia en la muestra de la secuencia diana mutante de la primera secuencia de nucleótidos.
- 17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la ligasa se aísla de Thermus aquaticus.
- 18. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en el cual el defecto genético es una diferencia de secuencia de un solo par de bases de ácido nucleico.
- 19. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en el cual el defecto genético es una deleción de ácido nucleico.
- 20. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en el cual el defecto genético es una inserción de ácido nucleico.
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