JP2001269187A

JP2001269187A - 遺伝病を検出するための熱安定リガーゼによるｄｎａ増幅系

Info

Publication number: JP2001269187A
Application number: JP2001060432A
Authority: JP
Inventors: Francis Barany; フランシス・バーラーニイ; John Zebala; ジョン・ジイバラ; Deborah A Nickerson; デバラ・エー・ニッカーソン; Jr Robert J Kaiser; ロバート・ジェー・カイザー・ジュニア; Leroy Hood; ラロイ・フッド
Original assignee: California Institute of Technology CalTech; Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: California Institute of Technology CalTech; Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1990-05-03
Filing date: 2001-03-05
Publication date: 2001-10-02
Also published as: JPH05508764A; EP0528882A1; EP1507000B1; WO1991017239A1; EP0528882B1; DE69133582T2; ATE459709T1; EP0528882A4; EP1507000A2; DE69133582D1; DK0528882T3; ES2294777T3; EP1507000A3; JP3889807B2; DE69133629D1; ATE375392T1; JP2004089204A

Abstract

(57)【要約】【課題】種々の核酸試料中で、ヌクレオチドの特異的
な配列、より詳細にはそれらの試料中に１つだけの核酸
塩基対の変化、即ち、欠失、挿入、または転移を含んで
いる核酸配列の標準配列との違いを特徴とするＤＮＡ配
列を含んでいるヌクレオチドの特異的な配列を検出す
る。【解決手段】この発明は、サーマス・アクアチカスＨ
Ｂ８株からの好熱性ＤＮＡリガーゼの遺伝子およびその
発現によって得られるリガーゼを使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】２０００以上の疾患が、子孫に影響を生じ
るリスクが数学的に予測できる遺伝子の一カ所だけの欠
損として確認された。ヒトにおけるこれらの疾患には、
ハンチントン舞踏病、膵膿疱性繊維症、α１−アンチト
リプシン欠乏症、筋ジストロフィー、ハンター症候群、
レッシュ・ナイハン症候群、ダウン症候群、テイ・サッ
クス病、血友病、フェニルケトン尿症、サラセミア、お
よび鎌状赤血球貧血等が含まれる。

【０００２】これらの核酸塩基対の１カ所だけの変化、
欠失、挿入、転位、またはその他の突然変異を直接検出
するため、３種の重要な技術が最近開発された。しかし
これらの技術のうちの２つは自動化が容易にできなかっ
た。そのような技術の第１は、患者の臨床試料に変異が
存在し、または存在しないことを、サザン・ブロットを
用いる患者のＤＮＡの制限消化の分析によって検出する
方法である［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー、９８巻、５０３頁（１９７５年）参照］。しか
しサザン・ブロット手法は、例えばα１−アンチトリプ
シン欠乏症のように、変異が制限部位を変化させない遺
伝病には使用できない。第２の手法は、変異部位をとり
巻く正常な配列と相補的な約１９塩基対のオリゴヌクレ
オチドの合成を含んだＤＮＡプローブの使用による方法
である。プローブを標識し、プローブが正常な遺伝子へ
は安定にハイブリッド形成するが、塩基対の１カ所だけ
のミスマッチをもつ変異遺伝子へはハイブリッド形成し
ない水準でハイブリダイゼーションの緊縮を起こすこと
によって、変異遺伝子から正常遺伝子を区別するのに使
用する［プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、
８０巻、２７８頁（１９８３年）参照］。最初の方法
は、さらにオリゴヌクレオチドを固定化し、標識したＰ
ＣＲ増幅試料でプローブすることによって修飾された。
この修飾では、固定化したオリゴヌクレオチドへ試料を
ハイブリッド形成し、ついで上述のようなハイブリダイ
ゼーションの緊縮を起こすことによってこれを洗い落と
す［プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８６
巻、６２３０頁（１９８９年）参照］。また蛍光ＰＣＲ
プライマーを使用して１カ所だけの変異または対立遺伝
子を特異的に増幅する別の方法が開発された［プロシー
ディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８６巻、９１７８
頁（１９８９年）参照］。この方法では生産物をスピン
カラムまたはゲル電気泳動によって、プライマーから分
離する必要があり、したがって大規模な自動化へ移すこ
とができない。第３の手法は、試料核酸が正確な標的配
列を含んでいる場合だけ、診断プローブが、隣接プロー
ブへの共有結合を実質上維持する条件下で、診断プロー
ブおよび隣接プローブの両者の存在を利用する方法であ
る。さらに診断オリゴヌクレオチドプローブは、手法の
効率を増大する手段として（例えばストレプトアビジン
によって）捕獲される「フック」（例えばビオチン化し
たオリゴヌクレオチド）を含み、隣接プローブは検出し
得る部分または標識を含み得る［サイエンス、２４１
巻、１０７７頁（１９８８年）、および米国特許第４８
８３７５０号参照］。

【０００３】必ずしも常に必要とは限らないが、ＤＮＡ
中の１カ所だけの塩基対変異を検出するには、普通、Ｄ
ＮＡ試料物質量を増加（即ち、増幅）する技術が役立
つ。核酸の増幅を実施する多くの技術がある。とりわ
け、（１）Ｔａｑポリメラーゼを使用して、温度循環装
置で２０〜３０反応サイクルを実施し、およそ数時間で
１個のコピーからＤＮＡを１００万倍に増幅することが
できるポリメラーゼ連鎖反応［サイエンス、２３９巻、
４８７頁（１９８８年）、および米国特許第４６８３１
９５号、同第４６８３２０２号、同第４８００１５９号
参照］、（２）自立的配列複製または３ＳＲは、３７℃
の等温条件下で逆転写酵素Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼお
よびＲＮアーゼＨを使用して、１時間を超えない時間
で、１個のコピーからＤＮＡまたはＲＮＡを１０００万
倍に増幅することができる［プロシーディングズ・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・
オブ・ザ・ＵＳＡ、８７巻、１８７４頁（１９９０
年）］、（３）Ｑβレプリカーゼは特別な３００ｂｐの
認識配列を含んだ数千のＲＮＡ分子を３０分間で１０億
倍に複製することができる。それ以外の技術も利用で
き、その一つとして、この発明でクローン化した好熱性
リガーゼによるリガーゼ連鎖反応を以下に説明する。

【０００４】この発明を利用して診断し得る各種の疾患
に加え、臨床試料中の原因微生物の特異的なＤＮＡ配列
特性の存在によって、多くの感染疾患を診断することが
できる。これらは細菌、ウイルス、および寄生虫等であ
る。そのような方法では、感染患者から得られる試料中
に比較的少数の病原微生物が存在し得るが、これらの微
生物から抽出したＤＮＡは、試料中の全ＤＮＡのごく小
部分を構成するに過ぎない。しかし疑わしい病原菌に特
異的な配列を固定化し検出する前に、ＤＮＡ試料のハイ
ブリダイゼーションによって特異的に増幅することは、
在来の方法の感度および特異性を著しく改善するはずで
ある。しかもそのような分析が、本来、感度の低い非放
射性検出手法を用いて少量の試料で実施しなければなら
ない場合、または放射性手法を採用するが、迅速な検出
が望ましい場合、増幅は特に有用である。

【０００５】このような手法を利用し得るが、一ケ所だ
けの塩基対の突然変異を検出するには他の技術の探索が
続けられる。サーマス・アクアチカスに由来する好熱性
ＤＮＡリガーゼを利用するリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）
またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によって標的ＤＮＡ
配列を検出するＤＮＡ増幅および／または検出であるこ
の発明は、継続しつつある労作の一部である。ＤＮＡ増
幅のためにエシェリキア・コリまたはＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを利用する他の技術も試みられたが、これらは、こ
の発明のリガーゼ連鎖反応では起こり得ない条件である
高水準のバックグラウンド「ノイズ」（１０サイクルに
達するまでに）のため、許容し得ないことが判明した。

【０００６】またＤＮＡ増幅および／または検出に特異
的なリガーゼの利用が試みられた。例えば７５サイクル
を用い、各サイクル毎に使用したＴ４ＤＮＡリガーゼ
をさらに補給し、５０００００コピーで出発して９５時
間でＤＮＡを増幅できるリガーゼ増幅反応が報告された
［ジーン、７６巻、２４５頁（１９８９年）参照］。し
かしこの報告の技術は緩慢であり、各段階のあとでＴ４
リガーゼの追加を要するので、この両者の必要性は、報
告された技術の自動化を受け入れ難くする。この発明の
リガーゼ連鎖反応は、３０サイクルを用いて２００コピ
ーから３時間でＤＮＡの増幅ができ、各サイクルのあと
でリガーゼの追加を必要としない。

【０００７】以下のこの発明の説明を通じて、この技術
分野の特別な術語を使用する。説明する内容に関して誤
解を避けるため、また説明した内容に関して明瞭な理解
を提供するため、以下の定義を用いる。

【０００８】「増幅」とは、特定の核酸断片のコピー数
を酵素連鎖反応（ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖
反応、または自立的配列複製のような）、またはその断
片をクローン化したベクターの複製の何れかによって増
加することを表わす。

【０００９】「平滑末端ライゲーション」とは完全に平
滑である（即ち、付着末端突出部をもたない）ＤＮＡの
２つの末端の共有結合的な連結法をいう。

【００１０】「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」
の語は互換的に用い得、そのような記載はすべて子孫を
含む。したがって「形質転換体」または「形質転換細
胞」の語は、伝達数に無関係に初代対象細胞およびそれ
に由来する培養を含む。またすべての子孫は意図的また
は偶発的な突然変異のためＤＮＡ含量が正確に同一では
あり得ないことはいうまでもない。ただしもとの形質転
換細胞でスクリーニングしたのと同一の機能を有するす
べての変異体子孫を包含する。

【００１１】「クローン」とは、共通の祖先から無性的
に由来した遺伝子的に同一である分子、細胞、または微
生物群をいう。「クローニング」とはそのような同一で
ある分子、細胞、または微生物を増殖させる操作であ
る。組換えＤＮＡ技術により、個々の遺伝子をクローン
化することが可能となる。これを「分子クローニング」
という。

【００１２】「共有結合的な付着」とは、２つの物質間
の共有化学結合を生成することをいう。

【００１３】「サイクル」とはＤＮＡの１回の融解およ
び冷却操作をいう。例えば９４℃のような非常な高温で
は、実質上すべての２本鎖ＤＮＡ（鎖長に関係なく）は
巻き戻され融解する。相補的なオリゴヌクレオチドの存
在で温度を冷却すると（４５〜６５℃へ）、巻き戻され
融解したＤＮＡのもとの正しい配列へハイブリッド形成
することができる。融解し、相補的なオリゴヌクレオチ
ドの存在で冷却したＤＮＡは、次のＤＮＡリガーゼ反応
の基質となる（「Ｔｍ」の項を参照）。

【００１４】「診断部分」とは、存在し、または存在し
ないことを検出すべきヌクレオチドの変化を含む標的配
列部分をいう。「隣接部分」とは、診断に選ばれた配列
部分のヌクレオチド配列の連続部分であるＤＮＡの配列
を表わす。連続はどちらの方向をも含み得る。

【００１５】その末端の一方に標的配列が存在し、また
は存在しないことを鑑別するヌクレオチド（複数もあ
り）を含んでいなければならないことを除き、診断部分
を含んだ選ばれたオリゴヌクレオチドの正確な位置が任
意であることは下記の説明から明らかであろう。即ち、
隣接部分を含むオリゴヌクレオチドは、診断部分を含ん
だこの任意に選ばれたオリゴヌクレオチドの配列に連続
しており、したがって診断ヌクレオチド（複数もあり）
は２つのオリゴヌクレオチドの接続箇所にある。「エン
ドヌクレアーゼ」とは、分子内の部位でＤＮＡを切断す
る酵素（例えば制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮアーゼ
Ｉ）をいう。

【００１６】「発現系」とは、所望の暗号配列および制
御配列で形質転換した宿主が暗号化したタンパク質を生
産できるような態様で、これらの配列を実施可能な連鎖
で含んでいるＤＮＡ配列をいう。形質転換を実施するた
め、発現系をベクター上に含み得、あるいはまた形質転
換したベクターＤＮＡを宿主染色体へ組込み得る。「遺
伝子」とは、回収可能な生物活性を有するポリペプチド
または前駆物質を暗号化しているＤＮＡ配列をいう。こ
のポリペプチドは完全鎖長の遺伝子配列で暗号化でき、
あるいは酵素活性を保有している限り、暗号配列の任意
の部分で暗号化できる。

【００１７】「遺伝子ライブラリー」または「ライブラ
リー」とは、与えられた種の完全なゲノムを実質上包含
する無作為にクローン化された断片のコレクションをい
う。またこの語はクローンバンクまたはショットガンコ
レクションを表わすのにも用いる。

【００１８】「ゲノム」とは生物の全体のＤＮＡをい
う。「フック」とは、フックを「補捉する」ことによっ
て、この修飾を含んでいるプローブを迅速、かつ都合よ
く単離することができるプローブの修飾をいう。フック
と補捉手段との相互作用は、例えば共有結合、または十
分な親和性を有するリガンド／受容体結合であり得る。
そのようなフックは、抗体によって回収できる抗原、ア
ビジンまたはストレプトアビジンによって回収できるビ
オチン、相補的な核酸、またはＤＮＡ結合タンパク質
（リブレッサー）によって回収できる特異的なＤＮＡ配
列、および他の好適な反応基によって回収できる特異的
な反応性化学官能基等である。

【００１９】プローブおよび変性融解したＤＮＡの記載
に関連して用いられる「ハイブリダイゼーション」およ
び「結合」の語は互換的に用いられる。変性したＤＮＡ
へハイブリッド形成し、または結合させたプローブは、
ポリヌクレオチド中で相補的な配列へ対合させ、または
「凝集」させた塩基である。特定のプローブが、ポリヌ
クレオチドと対合させた塩基、または凝集させた塩基を
保有しているかいないかは、相補性の度合、プローブの
鎖長、および結合条件の緊縮度によって決まる。緊縮度
が高ければ高いほど、相補性の度合は高く、そして／ま
たはプローブは長くなければならない。

【００２０】「クレノー断片」とは、ＤＮＡポリメラー
ゼＩの部分的タンパク質分解消化によって得られた７６
０００ダルトンのポリペプチドをいう。この酵素は、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩの５'→３'ポリメラーゼおよび３'
→５'エキソヌクレアーゼ活性を有するが、５'→３'エ
キソヌクレアーゼ活性を有していない。

【００２１】「標識」とは、未標識核酸の存在で、標識
した核酸を同定できるようにプローブ核酸へ修飾を加え
ることをいう。最も普通には１またはそれ以上の元素を
放射性同位元素で置き換えることをいう。しかし同位元
素の替わりに、例えば共有的に付着させた発色団、蛍光
部分、酵素、抗原、特異的反応性を有する基、化学発光
部分、および電気化学的に検出し得る部分のような他の
標識で置き換え得る。

【００２２】「リガーゼ」とは、２本鎖ＤＮＡ中の１本
鎖切断部位でリン酸ジエステル結合の生成を触媒する酵
素をいう。またリガーゼ酵素は２本鎖ＤＮＡの共有結
合、即ち、平滑末端を平滑末端へ、または１つの付着末
端をもう１つの付着末端へ共有結合するのを触媒する。

【００２３】「リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）」とは、オ
リゴヌクレオチドライゲーション生産物の増幅を表わ
す。例えば１サイクルのＤＮＡ生産物が次のサイクルの
ＤＮＡ基質となることができるようにオリゴヌクレオチ
ドを設計すると、そのようなサイクルを反復することに
よってＤＮＡの指数的増幅（「連鎖反応」）が起こる。
好熱性リガーゼ酵素は、多くのＤＮＡ融解および冷却サ
イクルの間、活性を保存することができるから、単一の
反応容器中で、オリゴヌクレオチドライゲーション生産
物を増幅する多くの熱反応サイクルを行なうＤＮＡ増幅
を迅速に自動的に起こすことができる。

【００２４】「リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）」とは、特
異的な配列を検出するため、好熱性リガーゼの助けを借
りる直線的な生産物増幅による隣接した２つのオリゴヌ
クレオチドの使用を表わす。

【００２５】「リガーゼＤＮＡ配列」とは、この発明の
好熱性リガーゼのためのサーマス・アクアチカスＨＢ８
中のＤＮＡ配列をいう。この配列はリガーゼタンパク質
のアミノ末端で下記の核酸配列を含む。

【表６】

【表７】これに対応するアミノ酸は下記の配列である。

【表８】

【表９】

【表１０】

【００２６】「連結（ライゲーション）する」とは、ポ
リヌクレオチド配列同士を互いに共有結合的に付着させ
て単一の配列を生成することをいう。標準的にはこの反
応は一方の配列の５'末端と他方の配列の３'末端との間
で、リン酸ジエステル結合の生成を触媒するリガーゼで
処理することによって実施される。ただしこの発明の説
明に関連して「連結（ライゲーション）する」の用語
は、そのような配列を、例えば化学的手段によって共有
結合的に付着させるその他の方法をも包含して使用され
る。「共有結合的に付着させる」および「連結（ライゲ
ーション）する」の語は互換的に用いられ得る。

【００２７】「ニック閉環活性」とはＤＮＡの隣接する
鎖同士の共有結合をいう。この活性は開環状ＤＮＡ(Ｏ
ＣＤＮＡ)を共有結合的に転換して、閉環状ＤＮＡ(ＣＣ
ＣＤＮＡ)へ閉環し、試料ＤＮＡが、臭化エチジウム染
色したアガロースゲル上を移動する速度を測定すること
によるリガーゼ活性の検定に使用される（ＯＣＤＮＡは
ＣＣＣＤＮＡより一層遅く移動する）。

【００２８】「オリゴヌクレオチド」とは、２種または
それ以上、好ましくは３種以上のデオキシリボヌクレオ
チドまたはリボヌクレオチドを含む分子をいう。その正
確な大きさはオリゴヌクレオチドの究極的な機能または
その使用によって左右される。オリゴヌクレオチドは合
成的に、またはクローニングによって誘導され得る。

【００２９】「実施可能に連結した」とは、構成要素の
正常な機能が実施できるように並べて配置することをい
う。即ち、制御配列へ「実施可能に連結した」暗号配列
とは暗号配列が制御配列の制御下に発現できる配置であ
ることを表わす。

【００３０】「過剰生産株」とは、特定の酵素または化
学物質を過剰に生産するように誘導し得る細菌またはそ
の他の宿主細胞株をいう。

【００３１】「ポリメラーゼ」とは、デオキシリボヌク
レオチドをＤＮＡへ組立てる反応を触媒する酵素をい
う。

【００３２】「ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」と
は、相手の鎖へハイブリッド形成し、標的ＤＮＡ内で、
対象領域に隣接する２つのオリゴヌクレオチド・プライ
マーを利用することによる特異的なＤＮＡ断片の指数的
増幅に関する特許方法（米国特許第４６８３２０２号お
よび同第４６８３１９５号）をいう。この方法は、鋳型
変性、プライマー・アニーリング、およびＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼによってアニールさせたプライマーの伸
長を含むサイクルを反復する一連の系からなる。

【００３３】「プローブ」とは、変性した核酸内のプロ
ーブされるべき配列と十分に相補的である（その鎖長に
関連して）ように設計され、選ばれた緊縮条件下で、こ
れへ結合させるオリゴヌクレオチドをいう。「隣接プロ
ーブ」とは、隣接部分と相補的であるプローブを表わ
す。「診断プローブ」とは、診断部分と相補的であるプ
ローブを表わす。「標的プローブ」とは、標的配列と相
補的であり、診断プローブおよび隣接プローブを共有結
合的に付着させる（ライゲーションする）ことによって
作られるプローブをいう。

【００３４】「リポーター基」とは、特定の部分の存在
を知らせる基をいう（「標識」の項を参照）。

【００３５】「制限エンドヌクレアーゼ」とは、分子の
内側にある特異的な配列を認識することによってＤＮＡ
を切断し、その結果、認識配列の内部または外側の何れ
かの部位でＤＮＡの両方の鎖をともに切断する酵素をい
う。

【００３６】「粘着末端ライゲーション」とは、必ずし
もそれだけに限らないが、通常、１〜５ヌクレオチドの
鎖長である５'または３'の１本鎖突出部を相補的に含ん
でいるＤＮＡの２つの末端の共有結合をいう。

【００３７】「緊縮」とは、２本鎖ＤＮＡが、それを構
成する１本鎖へ解離を起こすように核酸に加える条件の
組合せをいう。これらは、特に極端なｐＨ、高温、塩濃
度である。「高度緊縮」とは、標準的なサザン・ハイブ
リダイゼーション・プロトコール［ジャーナル・オブ・
モレキュラー・バイオロジー、９８巻、５０３頁（１９
７５年）の報告のような］のもとにオリゴヌクレオチド
・プローブ、またはそれとごく近縁の配列を使用して非
反復配列を検出するのに十分な条件、具体的にはハイブ
リダイゼーションおよび洗浄条件をいう。

【００３８】「Ｔｍ」とは、ＤＮＡの２つの相補鎖が巻
き戻され、分離される温度を表わす。これは１本鎖ＤＮ
Ａの鎖長およびその塩基組成の関数である。短い断片で
は、Ｔｍの近似値（℃）は４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）
に等しい。例えば５Ｇ、７Ｃ、５Ａおよび４Ｔの塩基を
有するオリゴヌクレオチドでは、４（５＋７）＋２（５
＋４）の温度、即ち６６℃である。

【００３９】「標的配列」とは、検出を所望する配列が
存在し、または存在しない核酸配列をいう。この発明の
方法の好ましい適用の説明に関連して用いる場合、この
語は鎌状赤血球貧血のような遺伝病に関連する遺伝子中
のコード領域の一部を構成する配列である。そのような
多くの疾患では、遺伝子異常の存在は暗号配列の僅かな
変化を特徴とする。最も多いのは、正常な個体では遺伝
的「欠損」を有する個体に存在する対応する配列と１ヌ
クレオチドが異なる配列を有する。この発明の方法では
正常な配列、または変化した配列のどちらでも、標的配
列として使用できる。

【００４０】「好熱性酵素」とは、５０〜９０℃の高温
で作用する酵素をいう。これらの酵素の幾つかは、通常
の酵素では変性され、したがって不活性となる９４〜１
００℃の温度に短時間露出しても生存し得る。

【００４１】「熱安定リガーゼ」とは、熱に安定であ
り、耐熱性であり、５０〜９０℃の高温で、隣接するオ
リゴヌクレオチドのライゲーションを好適な態様で触媒
（促進）し、標的核酸鎖と相補的な生産物を生成する酵
素をいう。一般にこの酵素は、１ヌクレオチドの５'末
端を活性化して、これを隣接するＤＮＡ分子の３'鎖へ
結合させる。ただしほかのメカニズムを用いて隣接する
オリゴヌクレオチドを共有結合的に付着させる熱安定酵
素もあり得る。熱安定リガーゼは、５０〜９０℃の高温
で、適当な条件下に、ＤＮＡ内の「ニック」閉環、およ
び粘着末端および平滑末端ライゲーションのように多数
の異なった核酸基質を共有結合的に連結することができ
る。

【００４２】この発明の熱安定酵素は、増幅反応に有効
であるという唯一の基準を満たさなければならない。即
ち、この酵素は、２本鎖核酸の変性を実施するのに必要
な時間、上昇温度を加えても不可逆的に変性（不活性
化）されてはならない。これに関連して用いられる「不
可逆的な変性」の語は、永久的な完全な酵素活性の喪失
をもたらす操作を意味する。変性に必要な加熱条件は、
例えば緩衝塩濃度および変性される核酸の鎖長およびヌ
クレオチド組成によって定まるが、標準的には短いオリ
ゴヌクレオチドでは約８５℃、主として温度および核酸
鎖長によって定まる時間では約１０５℃の範囲で、短い
オリゴヌクレオチドで標準的に約０.２５分間、長いＤ
ＮＡ片では４.０分間である。一層高温でも、緩衝塩濃
度および／または核酸のＧＣ構成を増大させることによ
って耐えられ得る。好ましくは酵素は、約９０〜１００
℃でも不可逆的に変性されない。この発明の熱安定酵素
は、酵素が機能する最適温度を有しており、その温度は
約４５℃以上、恐らくは５０〜９０℃、最適には６０〜
８０℃である。

【００４３】遺伝病における１カ所だけの塩基対配列の
違いを検出するための好熱性リガーゼによるＤＮＡ増幅
方法において、好熱性リガーゼ配列のクローニング、お
よびこの酵素の使用に関して、さらに徹底的に完全な理
解を得るため、以下に図面および実施例を挙げて説明す
る。これらは単にこの発明を説明するためのものであっ
て、この発明の範囲を制限する目的をもつものではな
い。

【００４４】第１図はプラスミドｐＤＺ１およびｐＤＺ
７を図示したものである。第２図はこの発明のリガーゼ
連鎖反応（ＬＣＲ）のフローチャートを示す。第３図
は、この発明のＬＤＲおよびＬＣＲ増幅条件下における
サーマス・アクアチカスの好熱性リガーゼの特異性を説
明するオートラジオグラムである。第４図は、さまざま
な標的濃度におけるＬＣＲ増幅を説明するオートラジオ
グラムである。第５図は、ヒトゲノムＤＮＡを使用した
βグロビン対立遺伝子の検出を説明するオートラジオグ
ラムである。第６図は、この発明によるオリゴヌクレオ
チド定量に基づくエリザ（ＥＬＩＳＡ）の概略図であ
る。第７図は、この発明による熱安定リガーゼのＳＤＳ
−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動のさまざまな
精製段階における写真による説明である。第８図は、こ
の発明による熱安定リガーゼのＳＤＳ−１０％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動のさまざまな精製段階における
第２の写真による説明である。第９図は、この発明によ
って調製した３種のクローンを図示したものである。

【００４５】第７図で、レーンＡおよびＧはマーカータ
ンパク質を表わす（分子量はkdで示す）。Ｂは誘導後の
全細胞、Ｃは音波処理後の粗上清、Ｄは熱処理後、プー
ルしたＤＥＡＥ流動を示し、ＥおよびＦはホスホセルロ
ース・クロマトグラフィー後の画分２３および２４を示
す。第８図で、レーンＡおよびＨはマーカータンパク質
を表わす（分子量はkdで示す）。Ｂは誘導後の全細胞、
Ｃは音波処理後の粗上清、Ｄは熱処理後、プールしたＤ
ＥＡＥ流動を示し、Ｅはホスホセルロース・クロマトグ
ラフィー後の画分２３、ＦはＮＡＤの存在なしでリガー
ゼ緩衝液中でニック処理したＤＮＡとインキュベートし
た画分２３、Ｇはニック処理したＤＮＡの存在なしでリ
ガーゼ緩衝液中でＮＡＤとインキュベートした画分２３
を示す。第８図で、高分子量側のリガーゼ（約８１kd）
はアデニル化された形であるが、低分子量側のリガーゼ
（約７８kd）はアデニル化されない形である。

【００４６】第１図に示したプラスミドを、ブダペスト
条約の寄託規則に基づき収集機関へ寄託して受入れられ
た。プラスミドｐＤＺ１は宿主細菌（エシェリキア・コ
リＡＫ５３株）へ組込み、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションへ寄託して、ＡＴＣＣ６８３０７の
収集番号が与えられた。プラスミドｐＤＺ７は宿主細菌
（エシェリキア・コリＡＫ５３株）へ組込み、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションへ寄託して、Ａ
ＴＣＣ６８３０８の収集番号が与えられた。

【００４７】ほかの方法も用い得るが、一般にこの発明
による好熱性リガーゼの生産は、標準的に下記の手順を
含む組換え手段によって行なわれ得る。

【００４８】まず成熟（ここで用いたこの用語はすべて
の突然変異タンパク質を含む）酵素を暗号化し、または
制御された条件下で、その活性を破壊されない追加的な
配列または切断可能な追加的な配列へ融合し、活性タン
パク質を生じる好熱性リガーゼの融合体を暗号化してい
るＤＮＡを得る。その配列がイントロンによって中断さ
れないなら、この配列は任意の宿主で発現するのに好適
である。ただし配列は切断および回収可能な形であるべ
きである。ＰＣＲ手法を用いて、例えば酵素を暗号化し
ている大部分のＤＮＡ配列を増幅し得、したがって「切
断」した形で回収し得る。

【００４９】ついで切断し、または回収した暗号配列を
複製可能な発現ベクター内の好適な制御配列とともに実
施可能な連鎖で配置し、これを使用して好適な宿主を形
質転換する。ついで形質転換した宿主を好適な条件下で
培養して組換え体好熱性リガーゼの生産を実施し、リガ
ーゼを単離し、既知の手段により精製する。

【００５０】上記の手順は、それぞれ種々の態様で達成
され得る。例えば所望の暗号配列をゲノム断片から入手
し得、好適な宿主でこれを直接使用し得る。好適なレプ
リコンおよび制御配列を使用して多くの宿主で実施可能
な発現ベクターのための組立て物を作成する。普通では
入手し得なくても、好適なベクターへ挿入し、切断可能
な遺伝子を提供し得るように好適な制限部位を暗号配列
の末端へ付加し得る。

【００５１】制御配列、発現ベクター、および形質転換
の方法は、遺伝子を発現するのに使用する宿主細胞の種
類によって変わる。一般に細菌宿主が最も効果的で、組
換えタンパク質の生産に都合がよく、したがってこの発
明の好熱性リガーゼの発現に好ましい。ただし酵母、植
物、昆虫、または哺乳動物細胞のようなその他の宿主
も、都合がよければ同様に使用し得る。この発明の目的
には、ある宿主細胞の供給源は、任意の他の入手可能で
好適な宿主細胞の供給源と対応物であるとみなし得る。

【００５２】

【実施例】実施例１サーマス・アクアチカスＨＢ８株の増殖およびＤＮＡの
単離サーマス・サーモフィラスＨＢ８株（ＡＴＣＣＮo.２
７６３４）からＤＮＡを単離した。この株は最近サーマ
ス・アクアチカスＨＢ８株と再分類された［アーカイブ
・オブ・マイクロバイオロジー、１１７巻、１８９頁
（１９７８年）参照］。

【００５３】温浴振とう器でＴＡＢブロス（１リットル
辺り、バクト[商標]−トリプトン５ｇ、酵母抽出物３
ｇ、ＮaＣl ２ｇ、デキストロース１ｇ含有、ＮaＯＨで
ｐＨ７.２〜７.５に調節）［ニュークレイック・アシッ
ズ・リサーチ、６７９５〜６８０４頁（１９８１年）参
照］中で細胞を７５℃で１夜増殖し、遠心によって回収
し、８００mlの培地から３.１ｇ（湿潤重量）を得た。
細胞を５０ｍＭＥＤＴＡおよび卵白リゾチーム１５mlを
含有する５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８.０）１５mlに
再浮遊させた。１０％（重量／容量）ドデシル硫酸ナト
リウム２mlを添加し、３７℃で１５分間インキュベート
し、−５０℃で凍結、３７℃で融解するサイクルを２回
反復することにより、再浮遊細胞を溶解した。水溶液を
等容量の水性フェノール（あらかじめホウ酸ナトリウム
でｐＨ７.５に平衡化）、ついでフェノール／クロロホ
ルム、最後にクロロホルムで逐次抽出した

【００５４】核酸を９５％エタノール２容量と混合し、
−５０℃へ１５分間冷却し、遠心によってペレット化す
ることによりこれを沈殿させた。上清を除き、ペレット
を乾燥したのち、核酸をＴＥ緩衝液［１ｍＭＥＤＴＡ
を含有する１０ｍＭトリスＨＣl(ｐＨ８.０)］１mlへ再
浮遊させた。浮遊液各１mlにＲＮアーゼＡ１００μgを
添加することにより、ＲＮＡを消化し、混合物を３７℃
で１時間インキュベートした。３Ｍ酢酸ナトリウム１／
１０容量および１００％エタノール３容量の添加によ
り、ＤＮＡを沈殿させ、−５０℃で１５分間冷却し、遠
心によってペレット化し、７０％エタノールで洗浄し、
最後に２mg／mlの最終濃度でＴＥ緩衝液に再浮遊させ
た。

【００５５】上記の実施例で利用したＤＮＡはサーマス
・アクアチカスから単離したが、生じたこの発明に必要
な性質を有する好熱性リガーゼは、他のサーマス種、ま
たはその他の好熱性細菌、ファージ、またはウイルスか
ら単離したＤＮＡを最初の供給源としてもよい。

【００５６】サーマス・アクアチカスＨＢ８株から単離
したＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼＴaqＩ（その認
識配列はＴＣＧＡ）またはＥcoＲＩ（その認識配列はＧ
ＡＡＴＴＣ）によって切断できない。ある配列を切断で
きないことは、アデニン残基のＮ６位における保護メチ
ル化のためである［Ｈ.Ｏ.スミスおよびＳ.Ｖ.ケリー、
「ＤＮＡ・メチレーション、バイオケミストリー・アン
ド・バイオロジカル・シグニフィカンス」、レージン、
シーダーおよびリグズ編、３９〜７１頁、スプリング・
フェアラグ社、ニューヨーク（１９８７年）参照］。こ
れまでの研究者らは、Ｇ−６ＭｅＡＮＴＣおよびＣＴＧ
Ｃ−６ＭｅＡＧの形のアデニンメチル化ＤＮＡを制限す
るｍｒｒと呼ばれる遺伝子があることを報告している
［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１６９巻、３
２４３頁（１９８７年）参照］。ＴaqＩ制限エンドヌク
レアーゼおよびメチラーゼのクローニングにおいて、数
種のエシェリキア・コリ株が、本来（ただし間違っ
て）、ｍrr遺伝子による影響であるＴＣＧＡメチル化Ｄ
ＮＡを制限することが判っている［ジーン、５６巻、１
３頁（１９８７年）、およびニュークレイック・アシツ
ズ・リサーチ、１５巻、９７８１頁（１９８７年）参
照］。最近、コーネル・ユニバーシティー・メジカル・
カレッジで行なわれた研究で、ＴＣＧＡメチル化ＤＮＡ
を制限するタンパク質を暗号化したｍrr以外にも、追加
的な遺伝子が存在することが明らかになった。簡単に説
明すると、ｍrr遺伝子を破壊するＴn５（Ｋｍ^Ｒ）トラ
ンスポゾンを含んでいる株［ジャーナル・オブ・バクテ
リオロジー、１６９巻、３２４３頁（１９８７年）参
照］をエシェリキア・コリの数種の株へのＫｍ^Ｒマーカ
ー導入に使用すると、生じた株はｍrr⁻（ｍrrタンパク
質欠損）遺伝子型へ転換した［Ｊ.Ｈ.ミラー、「エキス
ペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティック
ス」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー、２０１〜２０５頁（１９７２年）］。これらの形質
導入株は何れもＴａｑメチラーゼ遺伝子に抵抗できな
く、ＴＣＧＡメチル化ＤＮＡの制限に関わる第２の遺伝
子があることを示している。即ち、この発明の構成に第
１に必要な必要条件の一つ（この発明以前には明らかで
なかった）は、ＴＣＧＡメチル化ＤＮＡを強く制限しな
いエシェリキア・コリ株の選択であった。

【００５７】この発明では、Ｔaqメチラーゼ遺伝子に抵
抗でき、Ｔn１０（Ｔc^Ｒ）トランスポゾンを含んでいる
エシェリキア・コリのＲＲＩ株の誘導体をligts７株
［Ｎ３０９８、ウイルソンおよびマーレイ、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（１９７９年）、
およびジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー、７７巻、５３１頁（１９７３年）参照］へ導入し、
エシェリキア・コリＡＫ７６株を作り出した。この株を
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションへ寄託
し、ＡＴＣＣ５５０３２の収集番号が与えられた。この
株は温度感受性リガーゼ遺伝子を含んでおり、したがっ
て４２℃で発育できない。この株はＴaqメチラーゼ遺伝
子、およびその他のメチル化ＤＮＡ、特にサーマス・ア
クアチカスから単離したＤＮＡに抵抗できる。またこの
株は温度感受性リガーゼ遺伝子をもっているから、４２
℃での増殖について選別することにより、機能的なサー
マス・アクアチカス・リガーゼ遺伝子のクローニングの
ための宿主として使用することができた。

【００５８】サーマス・アクアチカス・リガーゼ遺伝子
のクローニングは、ウイルソンおよびマーレイが報告し
たのと類似の陽性選択手法に基づいて実施した。その方
法は好適なベクターへ挿入したサーマス・アクアチカス
ＤＮＡのライブラリーを組立てることである。ついでこ
れらのライブラリーを、サーマス・アクアチカスＤＮＡ
のメチル化を制限しないＡＫ７６株のようなligts７エ
シェリキア・コリ株へ形質転換により導入した。ついで
これらの細胞を非許容温度（即ち、４２℃）で発育させ
た。任意の生存株は、（i）lig＋表現型への復帰変異
株、（ii）欠損エシェリキア・コリ・リガーゼ遺伝子生
産物の発現を増大させる第２の部位復帰変異株、（ii
i）欠損エシェリキア・コリ・リガーゼ遺伝子生産物の
発現を増大させるサーマス・アクアチカスＤＮＡのクロ
ーン片、または（iv）サーマス・アクアチカス・リガー
ゼ遺伝子を含んでいるサーマス・アクアチカスＤＮＡの
クローン片であり得る。

【００５９】所望の最後の別法を実施するには、（i）
全体のリガーゼ遺伝子をクローン化し、（ii）エシェリ
キア・コリでサーマス・アクアチカス・リガーゼを発現
する機能のため、内在性の制御配列、または外来性ベク
ター制御配列の何れかをアミノ末端へ十分に近接させ、
リガーゼ遺伝子をエシェリキア・コリ内で適切に発現で
きる正しい方向でクローン化し、（iii）サーマス・ア
クアチカス・リボソーム結合部位がエシェリキア・コリ
で作動し、（iv）サーマス・アクアチカス・リガーゼが
４２℃でも十分に活性で、合成量が、エシェリキア・コ
リ内で他の操作で妨害されず、リガーゼ機能を十分に補
足できることが必要である。

【００６０】この発明で使用する好適なライブラリーの
組立てには、所望の制御配列を含んでいる通常のベクタ
ー、標準的な制限エンドヌクレレアーゼ、およびライゲ
ーション技術を利用する。精製したプラスミドＤＮＡ、
サーマス・アクアチカスＤＮＡ配列、またはこの発明で
使用するために合成したオリゴヌクレオチドを切断し、
作り替え、通常の技術により、所望の形で再びライゲー
ションする。

【００６１】この発明で使用する好適なベクターの選択
は、これまでに存在し、使用された多数のベクターのう
ちから１つのベクターを単に選別するだけのことではな
い。ｐＵＣプラスミドの高コピー数の誘導体［例えば
Ｃ.ヤニッシュ・ペロンら、ジーン、３３巻、１０３頁
（１９８５年）、またはＪ.ビエイラら、ジーン、１９
巻、２５９頁（１９８２年）参照］は４２℃で発育させ
ると、実際には若干不安定である。ｐＢＲ３２２の誘導
体ｐＦＢ１、２、１３、１４、および１５［Ｆ.バラニ
ー、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８２
巻、４２０２頁（１９８５年）参照］のような低コピー
数のプラスミドはリガーゼ欠損を補足するのに十分な酵
素を生産し得ない。この発明を構成するため、３組の異
なったベクターを使用して１８組の異なったライブラリ
ーを組立てた。その他のベクターも利用し得るが、ベク
ターｐＴＺ１８Ｒ［Ｄ.Ａ.ミードら、プロテイン・エン
ジニアリング、１巻、６７頁（１９８６年）参照］から
効果的なクローンが誘導された。

【００６２】一般に当業界で広く知られている条件下
で、これらの商業的に入手可能な制限酵素の製造業者が
規定している個々の指示にしたがい、下記の実施例で一
層詳細に説明したように、好適な制限酵素でＤＮＡを処
理することにより部位特異的なＤＮＡ切断を実施する。
一般に緩衝液約２０μl中で酵素２〜１０単位によりプ
ラスミドまたはＤＮＡ配列約１μgを切断する。時間お
よび温度の両者の変化には耐えられるが、約３７℃で約
１〜２時間のインキュベーション時間が好ましい。各イ
ンキュベーションののち、フェノール／クロロホルムで
抽出することによってタンパク質を除去し、さらに抽出
を実施し得る。エタノール沈殿によって核酸を回収す
る。所望により標準的な手法を使用するポリアクリルア
ミドまたはアガロースゲル電気泳動によって、切断した
断片のサイズ分離を実施し得る。

【００６３】実施例２部位特異的切断商業的に入手可能な制限エンドヌクレアーゼを使用し
て、標準的な緩衝液中でプラスミドおよびサーマス・ア
クアチカスＤＮＡの両者の部位特異的切断を実施した。

【００６４】一般に好適な制限エンドヌクレアーゼ２０
〜１００単位を添加し、混合物を３７℃で１〜２時間イ
ンキュベートすることにより、プラスミドまたはサーマ
ス・アクアチカスＤＮＡ約１０μgを緩衝液１００μl中
で切断した。

【００６５】各インキュベーションののち、タンパク質
をフェノール（２×）、ｎ−ブタノール（２×）で逐次
抽出することによって除去し、エタノール沈殿により核
酸を回収した。

【００６６】所望の暗号配列および制御配列を含んでい
る好適なベクターの組立てには、通常のライゲーション
および制限技術を用いる。簡単に説明すると、単離した
プラスミド、ＤＮＡ配列、または合成したオリゴヌクレ
オチドを切断し、作り替え、所望の形で再びライゲーシ
ョンする。

【００６７】実施例２で概略を説明した方法で用いる特
異的なライブラリーの切断に利用する制限エンドヌクレ
アーゼは、ＢamＨＩ、ＳacＩ、ＫpnＩ（Ａsp７１８）、
ＰstＩ、ＨindIII、およびＳmaＩであるが、ただし他の
エンドヌクレアーゼ、または例えばＳauIIIＡによる部
分消化も使用できる。アデノシンメチル化のために、共
通的に利用される制限エンドヌクレアーゼＥcoＲＩ、Ｓ
alＩ、またはＸhoＩは、サーマス・アクアチカスＨＢ８
株からのＤＮＡがこれらの酵素によって切断できなかっ
たので使用しなかった。

【００６８】実施例２で概略を説明した方法によって得
られた５'突出部を含んだ制限断片は、４種のデオキシ
ヌクレオチド三リン酸の存在で、５０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７.６）［５０ｍＭＮacl、１０ｍＭＭgＣl_２、
１０ｍＭＤＴＴおよび５０〜１００ｍＭデオキシヌク
レオチド三リン酸含有］中、３７℃で約１５〜３０分間
のインキュベーション時間を用いて、ＤＮＡポリメラー
ゼＩラージ（クレノー断片）処理により平滑末端化し得
る。クレノー断片は５'粘着末端で作用する。３'突出部
が生じたら、緑豆ヌクレアーゼで切取って修復する。ク
レノーで処理したのち、混合物をフェノール／クロロホ
ルムで抽出し、エタノールで沈殿させる。ついで好適な
条件下にＳ１ヌクレアーゼで処理すると、任意の１本鎖
部分の加水分解を生じる。これらの通常の操作は任意の
断片をベクター内の部位（平滑末端）へクローニングす
るのに使用し得る。

【００６９】実施例３ベクター組立てベクター組立てでは、直線化したベクターをホスファタ
ーゼ酵素（別法として別の近似した制限エンドヌクレア
ーゼ）で普通に処理し、挿入ＤＮＡの存在なしでベクタ
ーが再循環するのを防ぐ。例えばＢamＨＩ（５'突出
部）またはＳacＩ（３'突出部）ＤＮＡ（９μg）の試料
を、５０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）［１０
ｍＭＭgＣl_２および６ｍＭメルカプトエタノール含
有］１５０μl中、Ｎa＋の存在でウシ小腸アルカリホス
ファターゼ（ＣＩＡＰ、２２単位）で、３７℃、１５分
間処理し、ついで５０℃で３０分間インキュベートし
て、５'または３'突出部の何れかからリン酸基を除い
た。別法として１０ｍＭトリスＨＣl １５０μl溶液
中、細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ、１０単
位）をＮa^＋およびＭｇ^＋＋の存在で使用し、６０℃で
約１時間インキュベートしてもよい。ついでＥＤＴＡお
よびＥＧＴＡを添加して２価カチオンをキレートし、６
５℃で１５分間加熱することにより、ＣＩＡＰを変性し
得る。ＣＩＡＰまたはＢＡＰのどちらのタンパク質で
も、フェノール（２×）、ｎ−ブタノール（２×）で逐
次抽出し、エタノール沈殿により核酸を抽出する。

【００７０】挿入体ＤＮＡの存在または存在なしで、ベ
クターを再連結したときに生じる形質転換体数を比較す
ることにより、ホスファターゼ段階の効果を検定する。
挿入体ＤＮＡが存在すると、形質転換体が１０〜１００
倍多い標準的な結果により、ベクターＤＮＡが適正にホ
スファターゼ処理されたことが判る。

【００７１】実施例４ライゲーション前記のようにして作成した直線化し、ホスファターゼ処
理したベクター１〜２μgを使用して３０〜１００μl容
量でライゲーションを実施した。５０ｍＭトリスＨＣl
緩衝液（ｐＨ８.０）［１０ｍＭＭgＣl_２、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、１ｍＭＡＴＰ、６ｍＭメルカプトエタノール、
およびＴ４リガーゼ３〜７（ワイス）単位含有］中で、
サーマス・アクアチカスＤＮＡ２〜４μgを４℃または
１５℃の何れかで１夜インキュベートすることにより、
制限エンドヌクレアーゼで切断し、ベクターと同一の末
端を生じた。ライゲーションしたのち、ＥＤＴＡを加え
て溶液を６５℃で１５分間加熱することにより、Ｔ４リ
ガーゼを不活性化し、エタノール沈殿によって核酸を回
収した。

【００７２】ライゲーション混合物を通常の形質転換方
法によってエシェリキア・コリＲＲ１株、ＡＫ５３株、
またはＡＫ７６株（最後の株はlig＋表現型の迅速陽性
選別に好適である）のような好適な宿主へ導入した［ハ
ナハン、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー、１６６巻、３２４３頁（１９８７年）参照］。アン
ピシリン（または使用したプラスミドによって、テトラ
サイクリンまたはカナマイシンのような他の薬剤）を含
有するプレート上に植付けることにより、形質転換体を
選別した。ｌｉｇ^＋表現型陽性の選別にはＡＫ７６形質
転換体を０.２％マルトース、０.２mg／ml ＩＰＴＧ（l
acプロモーターを誘導する）、５０μg／mlアンピシリ
ン（プラスミド含有細胞を選別する）を含有するＳＯＢ
プレート（加圧前にＮａＯＨでｐＨ７.５に調節し、つ
いで１ＭＭgＳＯ４２０mlを添加した蒸留水１リット
ル中、バクト(商標)−トリプトン２０ｇ、バクト(商標)
−酵母抽出物５ｇ、ＮaＣl ０.５ｇ、バクト(商標)−寒
天１６ｇ含有溶液を加圧滅菌して調製）上に植付け、４
２℃〜４２.５℃で１夜増殖させた。

【００７３】ライブラリーのサイズは約５０００〜２７
０００クローンであった。細菌染色体が約２０００〜４
０００キロ塩基を含んでおり、平均挿入体が５〜１０kb
である全般的判定が得られれば、数組のライブラリーが
重複したクローンを含んでいることが判る。

【００７４】通常の手法を用いて６組のライブラリーか
ら混合プラスミド生産物を作成し［メソッズ・イン・エ
ンジモロジー、１００巻、２４３頁（１９８３年）参
照］、これを新たなＡＫ７６細胞へ導入した。各ライブ
ラリーから形質転換体を６枚のＳＯＢプレートへ植付け
（各プレートは３００００〜７００００個のクローンを
接種された）、４２℃でインキュベートした。１組のラ
イブラリーは１プレート当たり極めて小型のコロニー１
１〜１９個を生じた。残りのライブラリーはときおり大
型のコロニーを生じた。

【００７５】個々のクローンを拾い、通常の技術を用い
てプラスミドＤＮＡを作成し［アナリティカル・バイオ
ケミストリー、１１４巻、１９３頁（１９８１年）参
照］、制限消化によって分析した。１２個の小型のコロ
ニーはいずれもpＴＺ１８ＲのＢamＨＩ部位内にクロー
ン化した２個のＢamＨＩ断片（それぞれ１.８および２.
１kb）を含む６.８kbのプラスミドを生産した。ｐＤＺ
１と命名したそのようなプラスミドの１つを第１図に示
した。もとのライブラリー（５２００クローン）から逆
算して、すべてのpＤＺ１プラスミドは単一のクローン
に由来したと考えられる。大型のコロニーはもとのベク
ターのサイズに近似したプラスミドを含んでいた。した
がってこれらの大型のコロニーは、恐らく単にアンピシ
リン耐性を付与するなんらかのプラスミドを含む染色体
ligts７遺伝子の復帰変位体であろう。

【００７６】プラスミドpＤＺ１をＡＫ７６細胞へ再び
形質転換し、実施例４で報告したようにマルトース、Ｉ
ＰＴＧ、およびアンピシリンを含有するＳＯＢプレート
上で４２℃で選別して、再び小型のコロニーを得た。ア
ンピシリンを含有するトリプトン酵母寒天上に新しい形
質転換体を植付けると、コロニーを生じなかった。この
結果は、プラスミド樹立中にlacフロモーターを誘導す
ることが、遺伝的欠損を補足するサーマス・アクアチカ
ス・リガーゼの十分量の生産に必要であることを示唆し
ている。プラスミドがＡＫ７６細胞で樹立したら、その
ようなクローンをアンピシリン含有トリプトン酵母寒天
上へ画線接種し、４２℃で増殖させると、極めて小型の
コロニーが得られる。

【００７７】pＤＺ１をＢamＨＩで消化し、これを再ラ
イゲーションすると、断片が混乱する。そのようなライ
ゲーション混合物をＡＫ７６へ形質転換し、３７℃（即
ち、非選択条件下）で接種し、４２℃（即ち、選択条件
下）で接種したものと比較すると、非選択条件下の方が
１０００倍多いコロニーを生産した。初めのｐＤＺ１プ
ラスミドでは、選択条件下より非選択条件下の方が僅か
に２倍だけ多いコロニーを生産した。この知見は、両断
片の存在およびそれらをクローン化する方向が、サーマ
ス・アクアチカス・リガーゼの適切な発現に必要である
ことを強く示唆している。

【００７８】pＤＺ１は数ケ所のＳacＩおよびＳmaＩ部
位を含んでいるが、ＰstＩ、ＫpnＩまたはＨindIII部位
はただ１ケ所（ベクター誘導）しか含んでいない。即
ち、多数のリガーゼのクローンがＰstＩ、ＫpnＩまたは
ＨindIII消化ライブラリーから単離されたであろうと予
想された。しかしＢamＨＩ部分消化ライブラリーからは
１個のリガーゼのクローンしか誘導されなかった。なぜ
このことが起こるのかは明らかでないが、考えられる一
つの説明として、他のクローンは、プラスミド樹立中に
十分なリガーゼタンパク質を発現するリガーゼ遺伝子の
開始点と十分に近接したlacプロモーター制御要素を保
有していなかったと推測される。

【００７９】上記のこの発明のサーマス・アクアチカス
・リガーゼのクローニングによって、当業者は追加的な
研究により、原核、古細菌、真核、またはファージ起原
の何れであれ、任意の好熱性または熱安定リガーゼをク
ローン化することができるであろう。したがってそのよ
うなリガーゼのクローニングはこの発明の範囲に包含さ
れる。

【００８０】そのようなクローニングへの追加的な研究
は、例えば、（i）サーマス・アクアチカスＤＮＡをｒ
ｅｄ−λベクターへクローニングし、ＡＫ７６のような
ｌｉｇｔｓ７株で３９℃でプラークを生成する組換えフ
ァージλの生産能についてスクリーニングする［主とし
てジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、１
３２巻、４７１頁（１９７９年）に全般的に報告された
ように］、（ii）リガーゼ遺伝子の部分を発現するλｇ
ｔ１１ファージの利用、ついで精製したサーマス・アク
アチカス・リガーゼに対して発生させた抗体でスクリー
ニングし、陽性のλｇｔ１１クローンを使用して、他の
プラスミドまたはファージ・ライブラリーへハイブリッ
ド形成することにより、主としてサーマス・アクアチカ
ス・ポリメラーゼのクローニングで報告したように完全
鎖長の遺伝子を同定し得る［ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー、２６４巻、６４２７頁（１９
８９年）参照］、（iii）リガーゼＤＮＡ配列に基づい
て、ハイブリッド形成し、多くの種で、他の熱安定リガ
ーゼを暗号化した配列を同定し、検索することを助ける
プローブを作成できる。したがってサーマス・アクアチ
カス・リガーゼから少なくとも５個のアミノ酸を暗号化
したＤＮＡの部分を、ＰＣＲ手法を用いて複製し、増幅
することができ、変性した形、即ち１本鎖の形をプロー
ブとして使用して、好熱性または熱安定リガーゼを暗号
化した追加的なＤＮＡを検索し得る。別法として少なく
とも５個のアミノ酸を暗号化しているオリゴヌクレオチ
ド・プローブを合成し、これらを使用して、好熱性また
は熱安定リガーゼを暗号化した追加的なＤＮＡを検索し
得る。

【００８１】少なくとも５個のアミノ酸を暗号化してい
るＤＮＡの１部の選別は、オリゴヌクレオチドがゲノム
内で唯一の相補的な配列を見出すためにもつべき統計的
に最小の鎖長以上である１５個の核酸塩基を含んでいる
部分に基づいている。ただしそれよりも僅かに小さい
（エシェリキア・コリにおける最小数は例えば１２個で
あり、４個のアミノ酸の暗号化を許容し得る最小の部分
を示している）か、または大きい（一層高等な動物での
最小数は１９個程度であり、少なくとも７個のアミノ酸
を暗号化している部分が必要であり得ることを示してい
る）［オリゴヌクレオチズ：アンチセンス・インヒビタ
ーズ・オブ・ジーン・エキスプレッション、１２巻、１
３７〜１４０頁、マックミラン・プレス社、ロンドン
（１９８９年）参照］部分が、類似の結果を得るのに使
用され得る。ただし種間に対応する部分でヌクレオチド
配列間に明瞭な対合はあり得ないから、約１５個のヌク
レオチドを含んでいるオリゴマーは、偽陽性をなくすの
に十分な緊縮条件下でハイブリダイゼーションを達成す
るための好ましい最小単位である。５個のアミノ酸を暗
号化している配列であれば、そのようなプローブ生成の
ために十分な情報を供給し得るであろう。

【００８２】これを例示すれば、サーマス・アクアチカ
ス・リガーゼとエシェリキア・コリのアミノ酸配列を比
較すると、アミノ酸３４−４０（Ａｓｐ-Ａｌａ-Ｇｌｕ
-Ｔｙｒ-Ａｓｐ-Ａｒｇ-Ｌｅｕ）の間に統計的に許容し
得る水準で同一性が見出される。好ましい６アミノ酸配
列を使用し、ＧＡ(Ｃ／Ｔ)-ＧＣ(Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ)-ＧＡ
(Ｇ／Ａ)-ＴＡ(Ｃ／Ｔ)-ＧＡ(Ｃ／Ｔ)-(Ｃ／Ａ)Ｇ(Ｇ／
Ａ／Ｔ／Ｃ)-(Ｃ／Ｔ)Ｔの形の縮重プローブを上記のリ
ガーゼの確認および検索に使用できた。この発明のサー
モフィラス・リガーゼとエシェリキア・コリ・リガーゼ
の間の配列同一性の区域は、下記の位置でアミノ酸を含
んでいる。

【００８３】アミノ酸位置連続的なアミノ酸の同一性３４〜４０７５７〜６１５１３７〜１４２６１６８〜１７５８１９９〜２１０１２２１２〜２１９８３０８〜３１２５３３３〜３３９７４８５〜４９０６４９２〜４９６５５１３〜５１７５６２０〜６２４５

【００８４】総合的に、この発明のリガーゼに含まれて
いる６７６個のアミノ酸のうちで、サーモフィラス・リ
ガーゼおよびエシェリキア・コリ・リガーゼの百分率類
似性は６６％であり、百分率同一性は４７％である。

【００８５】クローン化し、適切な方向をもった遺伝子
からの過剰生産株の組立ては、技術上、通常の方法を用
いることにより達成され得る。そのような組立ての一般
的な原理は、遺伝子の効果的な転写および翻訳に影響を
与えることができる配列を遺伝子の開始コドンに極めて
近接して配置することである。遺伝子を作動させるため
効果的に使用された多くのプロモーターシステム（リボ
ソーム結合部位［プロシーディングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・
ＵＳＡ、７８巻、５５４３頁（１９８１年）］を含む）
があり、例えばlacプロモーター、trpプロモーター［ジ
ーン、２０巻、２３１頁(１９８２年）]、λファージＰ
Ｌプロモーター［ネーチャー、２９２巻、１２８頁（１
９８１年)］、tac融合プロモーター［プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８０巻、２１頁(１９８３
年)］、およびＴ７ファージ・プロモータープロシーデ
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、８２巻、１０７４頁
（１９８５年）］等がある。

【００８６】プラスミドpＤＺ１は、開始ベクターに存
在するlacおよびＴ７プラスミドの両者から下流でサー
マス・アクアチカス・リガーゼ遺伝子を含んでいる。Ｂ
al３１［ニュークレイック・アシッズ・リサーチ、５
巻、１４４５頁（１９７８年）参照］およびＥxoIIIお
よび緑豆またはＳ１ヌクレアーゼ［メソッズ・イン・エ
ンジモロジー、１５５巻、１５６頁（１９８７年）参
照］を含み、プロモーターおよび遺伝子間の過剰のＤＮ
Ａ配列を除去する幾つかの方法がある。しかしこの例の
場合は、サーマス・アクアチカス・リサーチ遺伝子のア
ミノ末端を２つのプロモーターへさらに接近させるた
め、実施例Ｖで報告したようにさらに一層簡単な方法を
使用した。

【００８７】実施例５ (プロモーターおよび遺伝子間からの過剰なＤＮＡの除
去)プラスミドpＤＺ１を制限エンドヌクレアーゼＨinＰ
Ｉ(ＧＣＧＣ)により不規則に線形化し、クレノウまた
は別法としてＣviＪＩ(ＰuＧＣＰy)により平滑末端化
した［「ＤＮＡ・アンド・プロテイン・エンジニアリン
グ・テクニクス」１:２９(１９８８)参照]。

【００８８】ＤＮＡをフェノール(２x)、n−ブタノール
(２x)による連続抽出により精製し、核酸をエタノール
沈澱により回収した。次いで、これらの不規則に線形化
されたプラスミドを、２つのプロモーターの下流にある
ポリリンカー部位を直接開裂するＡsp７１８により処理
し、クレノウにより平滑末端化した。生成したフラグメ
ントを低融点アガロース中での電気泳動により分離し、
連続したスライス(完全長線形および漸進的に小さくな
るＤＮＡフラグメント)を切り取り、ＤＮＡを回収し
た。続いてＤＮＡフラグメントを平滑末端ライゲーショ
ンにより再び環状にした。これは、１０ミリモルのＭg
Ｃl_２、１ミリモルのＥＤＴＡ、１ミリモルのＡＴＰ、
６ミリモルのメルカプトエタノールおよび３〜７バイス
単位のＴ４リガーゼを含む５０ミリモルのトリスＨＣl
(pＨ８.０)緩衝液１００μl中４℃で一夜のインキュベ
ーションを要した。ライゲーション後、ＥＤＴＡを加
え、Ｔリガーゼを加熱(６５℃で１５分間)により不活化
し、核酸をエタノール沈澱により回収した。

【００８９】製造されたライゲーション混合物を、慣用
的技術を用いてＡＫ７６細胞へ導入し、前述の麦芽糖、
ＩＰＴＧおよびアンピシリンを含むＳＯＢプレート上４
２℃でlig＋表現型を選択した。

【００９０】先の試験結果に基づくと、プロモーターお
よびテルムス・アクアティクス・リガーゼ遺伝子の出発
点間に欠失を含むプラスミドは、これらの条件下で生存
能力を付与することが予想される。ベクター(プロモー
ター領域)またはリガーゼ遺伝子の本質的部分を欠失す
ると、当然生存能力は付与されない。従って、個々のク
ローンを抜粋し、慣用的方法［「アナリティカル・バイ
オケミストリー」、１１４:１９３(１９８１)参照]を用
いてプラスミドＤＮＡを製造し、制限消化により分析し
た。この試験結果から、プラスミドpＤＺ２、pＤＺ３、
pＤＺ６およびpＤＺ７は、１.８kbのＢamＨＩフラグメ
ントを欠き、代わりに各々１.３、１.４、１.２または
１.２kbのフラグメントを含むことが見出された。これ
らのプラスミドは全て、適切な平滑末端充填およびライ
ゲーションから予想される通りＡsp７１８部位を再作製
した。慣用的技術[「ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ」、１３:１１０３(１９８５)、および「プロテイン・
エンジニアリング」、１:６４(１９８６)参照]を用いて
これらのプラスミドから１本鎖ＤＮＡを製造し、普遍的
「リバースプライマー」オリゴヌクレオチド５'d(ＡＧＣ
ＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡ)３'およ
びＴ７ＤＮＡポリメラーゼ［「プロシーディングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ」、８４:４７６７(１９８７)参照]を用いてこれらの
配列決定をした。

【００９１】ＤＮＡ配列の分析結果は２つのＡＴＧ開始
コドンを示しており、第１の転写解読枠は長さ３コドン
であり、第２のリガーゼＤＮＡ配列は長い解読枠を与え
ている。第１図と結びつけると、プラスミドpＤＺ６お
よびpＤＺ７に由来するこの配列(部分的リガーゼＤＮＡ
配列を含む)は次の通りである。

【表１１】

【表１２】本発明の熱安定リガーゼの核酸配列は下記アミノ酸配列
に対応する。

【表１３】

【表１４】

【００９２】この転写解読枠(耐熱性リガーゼ)の最初の
６０アミノ酸の翻訳は、エシェリヒア・コリ・リガーゼ
に対して５０％を越える相同性を示すことから(「モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス」、２
０４:１(１９８６)参照)、この長い転写解読枠はテルム
ス・アクアティクス遺伝子の開始を表すことが示唆され
る。ＢamＨＩフラグメントによる遺伝子結果から、この
リガーゼのサイズは４００ないし１１００アミノ酸長で
あるという結論に到達し得る。精製蛋白質は、約７９０
００の分子量を有することが報告されており［「ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、２５９:
１００４１(１９８４)参照]、これは本発明において見
出された遺伝子結果の限界内に含まれる。クローンpＤ
Ｚ７が機能的テルムス・アクアティクス・リガーゼを生
産し(すなわち、それが遺伝子を完全な状態でコードす
る)、アミノ末端のＤＮＡ配列が与えられると、文献に
記載された手動的またはオートメーション化された方法
を用いて[例えば、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ」、８４:
４７６７(１９８７)、「プロシーディングス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ」、
８６:４０７６(１９８９)、「サイエンス」、２３９:４８
７(１９８７)、「ネイチャー」、３２１:６７４(１９８
６)、「バイオテクニクス」、８:１８４(１９９０)、「プ
ロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ス
テーツ・オブ・アメリカ」、８５:５６１０(１９８８)、
および「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイ
テッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、８５:９４３６
(１９８８)参照]、遺伝子の全ＤＮＡ配列が決定され
た。

【００９３】バイオテクノロジー研究における熟練者で
あれば誰でも知っている方法を用いて、プラスミドpＤ
Ｚ２、pＤＺ３、pＤＺ６またはpＤＺ７を使用すること
により、さらに別の過剰生産性ベクターが構築され得
る。この場合、上記のプロモーターおよびリボソーム結
合部位の使用が含まれ得る。例えば、プラスミドpＤＺ
７(第１図参照)では、その特有のＡsp７１８部位が線形
化され得、テルムス・アクアティクス・リガーゼ遺伝子
の正面の過剰ヌクレオチドは、上記のＢal３１またはＥ
xoIIIおよびムング・ビーンの組み合わせまたはＳ１ヌ
クレアーゼの使用によりＡＴＧ開始コドン近くでトリミ
ングされ得る。次いで、これは、同様の方法で生成され
た天然機能付与性配列(プロモーターおよび翻訳開始配
列)へ、またはこの目的のために製造された合成機能付
与性配列により平滑末端ライゲーションされ得る。さら
に、テルムス・アクアティクス遺伝子に対して外部また
は内部にある配列を修飾することにより、転写または翻
訳を阻止し得る潜在的ＲＮＡ構造が除去され得る。これ
らの方法は、可溶性エシェリヒア・コリ蛋白質の３０％
を越える割合にまで耐熱性制限エンドヌクレアーゼＴaq
Ｉの過剰生産に作用することが先に報告されている[「ジ
ーン」、６５:１６６(１９８８)参照]。別法として、合
成オリゴヌクレオチドは、テルムス・アクアティクス・
リガーゼ遺伝子の開始点が、ＰＣＲ方法を用いて機能付
与性配列へ直接融合される形で合成され得る[例えば、
「バイオテクニクス」、８:１７８(１９９０)、「ジー
ン」、７７:５１(１９８９)、および「ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ」、１７:７２３(１９８９)参照]。

【００９４】先行配列から、アミノ酸残基３１−３３を
コードするヌクレオチドに対応するＢgl II部位の存在
することが判る。この情報により、最適なシャイン-ダ
ルガノ配列を伴う強力なプロモーターは、ＰＣＲを用い
てこの遺伝子の正面に挿入され得る。２つの小さな注意
点:(１)全遺伝子(３kb、高いＧＣ含有率)をＰＣＲコピ
ーする試みは必ずしも成功するわけではなかったこと、
および(２)プラスミドpＤＺ７は、リガーゼ遺伝子内に
一つずつ、２つのＢamＨＩおよびＢglＩＩ部位を有して
いたことを考慮する必要がある。

【００９５】プラスミドpＤＺ７をＢamＨＩおよびＢglI
Iにより部分消化し、正確なサイズの小さい方の線形フ
ラグメントを電気泳動により完全長線形フラグメントか
ら分離し、切り取り、前記と同様に精製した。ＢamＨＩ
およびＢglＩＩは同じオーバーハング(５'ＧＡＴＣ)を
製造するため、線形フラグメントはＴ４リガーゼにより
再び環状にされ、形質転換によりエシェリヒア・コリ株
ＡＫ５３へ導入され得た。幾つかのクローンでは０.５k
bのＢamＨＩ／ＢglIIフラグメントを欠失した結果、５.
７kbのプラスミドが生成され、その一クローンはpＤＺ
１２と命名された。合成オリゴヌクレオチド＃６６、＃
７８、＃８５および＃９４を合成し、ＰＣＲを用いて、
リガーゼ遺伝子の出発点に対しphoＡプロモーター[プラ
スミドpＦＢＴ６４から、「ジーン」、５６:１３(１９８
７)参照]およびリボソーム結合性配列を融合させた[「バ
イオテクニクス」、８:１７８(１９９０)、「ジーン」、７
７:５１(１９８９)、「ジーン」、７７:６１(１９８９)、
および「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」、１７:７
２３(１９８９)参照]。これらのクローンは図９に描か
れており、次の通りである。

【００９６】＃６６１９量体;ＰvuII部位〜Ｔ７プロ
モーターないしphoＡプロモーター、プラスミドpＦＢＴ
６４の上部鎖(Ｔaqlエンドヌクレアーゼ遺伝子の指示): 5' CTG GCT TAT CGA AAT TAA T 3'

【００９７】＃７８３２量体;テルムス・リガーゼ遺
伝子の出発点に相補的な５'末端、phoＡプロモーターの
シャイン-ダルガノ側に相補的な３'末端、プラスミドp
ＦＢＴ６４の下部鎖: 5' CCA GGG TCA TTT TAT TTT CTC CAT GTA CAA AT 3'

【００９８】＃８５３３量体;phoＡプロモーターのシ
ャイン-ダルガノ側に相補的な５'末端、テルムス・リガ
ーゼ遺伝子の出発点に相補的な３'末端、プラスミドpＤ
Ｚ７の上部鎖(リガーゼ遺伝子の指示): 5' CAT GGA GAA AAT AAA ATG ACC CTG GAA GAG GCG 3'

【００９９】＃９４１８量体;リガーゼ遺伝子のアミ
ノ酸残基４０〜３５の非翻訳鎖に対応するプラスミドp
ＤＺ７の下部鎖、アミノ酸残基３３〜３１にあるＢglII
部位の下流: 5' AAG CCG GTC GTA CTC GGC 3'

【０１００】簡単に述べると、これは、単一反応管中、
４００ngのプライマー＃６６および＃７８を、１００μ
lのＰＣＲ緩衝液中dＡＴＰ、cＣＴＰ、cＧＴＰおよびd
ＴＴＰを各々５０マイクロモル、および２.５単位のＡm
plitaqを含む２００ngのＰstＩ／ＰvuII消化pＦＢＴ６
４に加え、製造者(シータス、エモリービル、カリフォ
ルニア)のプロトコールに従い９４℃で１分間、５５℃
で２分間、７２℃で３分間１サイクル当たり３秒伸ばし
ながら２５サイクル循環させることにより行なわれた。
第２の反応管は、同じ反応緩衝液および酵素中、４００
ngのプライマー＃８５および＃９４、２００ngのＥcoＲ
Ｉ／ＢamＨＩ消化pＤＺ７を含んでおり、これを上記と
同様にインキュベーションした。これらの反応の生成物
は、ゲル電気泳動で分析された通り正確な長さであるこ
とが示された。第３の反応管は、各生成物から２μl、
同じ反応緩衝液および酵素中４００ngのプライマー＃６
６および＃９４を含んでおり、これを上記と同様にイン
キュベーションした。２生成物間の重複部分が組み合わ
せた長さの融合生成物のＰＣＲ合成を可能にするように
プライマーを設計した。生成したフラグメントをフェノ
ール、n−ブタノールおよびエタノールで抽出し、沈澱
によりＴaqポリメラーゼを除去した。ＰＣＲフラグメン
ト生成物を、上記と同様ＢglIIおよびＥcoＲＩで処理
し、低融点アガロース中で電気泳動させ、精製した。同
時に、pＤＺ１２からの２.７kbＰstＩ-ＢglIIリガーゼ
遺伝子含有フラグメントおよびpＦＢＴ６４からの２.４
kbＰstＩ-ＥcoＲＩ β−ラクタマーゼ遺伝子および開始
点含有フラグメントを精製した。３フラグメントを全て
３方向ライゲーションで合わせ、形質転換によりエシェ
リヒア・コリ株ＡＫ５３へ導入した。幾つかのクローン
は、phoＡプロモーター制御下でリガーゼを過剰生産す
る５.５kbプラスミドを含んでいた。それらのうちの一
プラスミドをpＤＺ１３と命名した。

【０１０１】可溶性エシェリヒア・コリ蛋白質の３０％
を越える割合に達する耐熱性制限エンドヌクレアーゼＴ
aqlの過剰生産において報告された試験では［「ジー
ン」、６５:１６６(１９８８)参照]、β−ラクタマーゼ
遺伝子を逆にすることにより、phoＡプロモーターとは
反対方向で転写が行なわれる場合、エンドヌクレアーゼ
収率は幾分優れていることが認められた。本発明に従い
リガーゼ遺伝子を伴う類似構造を作製するため、プラス
ミドpＦＢＬＴ６９(逆配向でβ−ラクタマーゼを含む)
からの２.３kbＰstＩ-ＰvuIIフラグメントを、プラスミ
ドpＤＺ１３の３.２kbＰstＩ-ＰvuIIリガーゼ遺伝子含
有フラグメントにライゲーションした。このライゲーシ
ョン混合物をエシェリヒア・コリ株ＡＫ５３へ形質転換
し、幾つかの形質転換体を制限消化物により分析する
と、β−ラクタマーゼ遺伝子の配向が確認された。それ
らのうちの一クローンをpＤＺ１５と命名した。pＤＺ１
５におけるリガーゼの生産性は、pＤＺ１３と比べて少
しも優れていない場合でも、同程度には良好である。リ
ガーゼ酵素はプロテアーゼに対して幾分感受性を示すと
思われるため、誘導後細胞を９時間だけ生長させるべき
である。リガーゼ遺伝子の蛋白質加水分解生成物はまだ
熱安定性リガーゼ活性を有し得る(これはＴaqポリメラ
ーゼに関して立証された)。

【０１０２】耐熱性蛋白質は、実質的に修飾され、依然
として本発明での使用に充分な活性を保持し得る。例え
ば、Ｔaqポリメラーゼのアミノ末端における暗号化配列
の約３分の１の欠失により、ポリメラーゼ活性で活性を
示す遺伝子産物が生成されることが示された［「ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー」、２６４:
６４２７(１９８９)参照]。別法として、アミノ酸をア
ミノ末端(＋７)、カルボキシ末端(＋３８)または内部の
ある位置(＋２から＋３４まで)に付加した場合、別の耐
熱性蛋白質、制限エンドヌクレアーゼＴaqlは、本質的
に充分な活性を保持することが示された［「ジーン」、６
５:１６６(１９８８)参照]。すなわち、翻訳中に配列へ
組み込まれたアミノ酸の欠失、n−末端付加、c−末端付
加、内部付加もしくは重複または改変による一次構造の
修飾は、蛋白質の活性または熱安定性を破壊することな
く行なわれ得る。さらに、これらの配列をコードするＤ
ＮＡの利用可能性により、コドン配列を修飾して同じく
リガーゼ活性を有する突然変異蛋白質形態を生成させる
機会が提供される。それらの置換または他の改変の結
果、本発明の範囲内に含まれるＤＮＡによりコードされ
るアミノ酸配列を有する新規蛋白質が生成される。

【０１０３】また、他のライゲーション蛋白質は、これ
らの実施例で立証されている通り本発明方法により分離
され得る。異なるセルラインは、本発明の製造法で使用
されるテルムス・アクアティクスＨＢ８株から分離され
たものとは異なる物理特性を有するリガーゼを製造する
ものと予想され得る。さらに、酵素またはその前駆体が
遺伝子的多形性または細胞仲介による修飾を呈すること
から変形が存在し得る。さらに、そうして分離されたリ
ガーゼのアミノ酸配列は、遺伝子技術により修飾され、
改変された生物活性および特性を有するリガーゼを製造
し得る。次いで、生成したＤＮＡ配列は、テルムス・ア
クアティクスＨＢ８リガーゼと実質的に同じアミノ酸配
列を有するが、それより高または低レベルの活性を呈す
る蛋白質をコードし得る可能性がある。それらのライゲ
ーション蛋白質もまた当然本発明の範囲内に含まれるも
のと考えるべきである。

【０１０４】実施例６ (リガーゼ酵素の精製)プラスミドpＤＺ６およびpＧＰ１
−２(ラムダＰLプロモーターの後ろにＴ７ＲＮＡポリメ
ラーゼ遺伝子を含み、温度感受性ラムダ・レプレッサー
Ｃ１５８７の制御下にある)［「プロシーディングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリ
カ」、８２:１０７４(１９８５)およびアメリカ合衆国特
許４７９５６９９参照]を含むエシェリヒア・コリ細胞
ＡＫ５３を、両プラスミドの持続を確実にするため５０
μg／mlのアンピシリンおよび５０μg／mlのカナマイシ
ンを含むＴＹプレートにおいて３２℃で一夜生長させ
た。新鮮なコロニーを、pＨ７.６で６gのＮaＣl、２５g
のバクト(商標)トリプトン、７.５gの酵母抽出物、１g
のグルコース、１.６gのカゼインアミノ酸加水分解物、
５０μg／mlのカナマイシンおよび５０μg／mlのアンピ
シリンを含む５０ミリモルのトリスＨＣl緩衝液１リッ
トルに再懸濁し、２００rpmで振動している２リットル
のフラスコ中３２℃で生長させた。Ｏ.Ｄ.(光学密度)５
５０が０.８ないし１.０間に到達すると、細胞を３０〜
４０分間４２℃にシフトすることにより、Ｔ７ポリメ
ラーゼの合成を誘導した。メタノールに溶かした２０mg
／mlのリファンピシン５mlを加えて最終濃度を１００μ
g／mlにすることにより、エシェリヒア・コリ蛋白質の
それ以上の合成を阻止した。これらの条件下では、Ｔ７
プロモーターの後ろの遺伝子のみが当然転写され、従
って翻訳される。細胞を４２℃でさらに５時間インキュ
ベーションした。

【０１０５】別法として、プラスミドpＤＺ１５(phoＡ
プロモーター制御下にあるリガーゼ)を含むエシェリヒ
ア・コリ細胞ＡＫ５３を、５０μg／mlのアンピシリン
を含有するＴＹプレートにおいて３７℃で一夜生長させ
た。新鮮なコロニーを、５０μg／mlのアンピシリンを
含む強化ブロス５０mlに再懸濁し、Ｇ７６ベンチトップ
シェーカー中２００rpmで振動している５００mlのフラ
スコにおいて３７℃で生長させた。Ｏ.Ｄ.５００が０.
６５ないし０.８５に達すると、２０mlを０.２ミリモル
Ｋ２ＨＰＯ４含有ＭＯＰＳ培地[「ジャーナル・オブ・バ
クテリオロジー」、１１９:７３６(１９７４)参照]１リ
ットル中へ希釈することにより、phoＡプロモーターを
誘導した。細胞を、さらに９時間Ｇ２５フロアシェーカ
ー中２００rpmで振動している２リットルのフラスコに
おいて３７℃で生長させた。

【０１０６】インキュベーション後、細胞を氷中で冷や
し、遠心分離(５０００rpmで１５分間)により採取し、
２０mlの水に再懸濁し、３５mlの遠心分離管に移し、再
遠心分離(７０００rpmで６分間)し、蛋白質分離の準備
ができるまで沈澱物を凍結させた。解凍後、沈澱物を、
１０ミリモルの２−メルカプトエタノールおよび０.１
５ミリモルのＰＭＳＦを含む緩衝液Ａ(pＨ７.６で１ミ
リモルのＥＤＴＡを含む２０ミリモルのトリスＨＣl緩
衝液)２０mlに再懸濁した。音波処理（４℃５０％パワ
ーで５×１分間）後、溶液を３９０００×gで６０分間
の遠心分離にかけた。

【０１０７】９２５００ダルトンの分子量と定められた
ホスホリラーゼＢ標準と比較すると、この酵素は７５０
００〜８５０００ダルトンの推定分子量を有していた。

【０１０８】別法として、pＤＺ１５誘導細胞２リット
ルを、上記と同様に採取し、音波処理し、屑を遠心分離
により一掃した。

【０１０９】上清(４０ml)を３００ミリモルのＫＣlに
加え、５mlＤＥＡＥセファセル・カラムに通し、０.３
モルＫＣl含有緩衝液Ａ７０mlを用いて外来ＤＮＡを除
去した。リガーゼ含有フロースルー・フラクションを合
わせ、６５℃で２０分間処理することにより、エンドま
たはエキソヌクレアーゼを含む多くのエシェリヒア・コ
リ酵素の不可逆的熱変性を誘発した。次いで、変性した
蛋白質を１５分間３９０００×gの遠心分離により除去
し、室温で３０分間等容量の飽和(ＮＨ４)２ＳＯ４を加
えることによりリガーゼ酵素を上清から沈澱させた。臨
床用遠心機中８０００rpmでの遠心分離により硫酸アン
モニウム沈澱物を回収し、４mlの蒸留水に再懸濁した。
試料を緩衝液Ａ、次いで５０ミリモルＫＣl含有緩衝液
Ａに対して透析した。透析された蛋白質溶液を、５０ミ
リモルＫＣl含有緩衝液Ａで平衡状態にした４０mlホス
ホセルロース・カラムに適用した。同緩衝液８０mlによ
り洗浄後、緩衝液Ａ中ＫＣl(０.０５〜０.５モル)の１
２０ml一次勾配によりカラムを溶離した。酵素は、０.
２５〜０.３５モルのＫＣlからより鋭いピークとして溶
離した。この蛋白質は、見かけ上の分子量約８１０００
(アデニル化形態)および７８０００(非アデニル化形態)
の２つの帯として移動し、ＳＤＳ−１０％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動でのモニターによると純度約９８−
９９％である。６５℃で３０分間ＮＡＤ不含有(非アデ
ニル化形態が生じる)のニックさけ精液ＤＮＡ２５μgを
含むリガーゼ緩衝液、または１０ミリモルのＮＡＤを含
む(アデニル化形態が生じる)リガーゼ緩衝液中１５０μ
gの蛋白質をインキュベーションすることにより、これ
ら２形態は互いに変換され得る。１ミリモルのＥＤＴ
Ａ、２ミリモルのジチオトレイトール(ＤＴＴ)および２
００μg／mlの牛血清アルブミン(フラクション５)を含
む１００％グリセリン中２０ミリモルのトリスＨＣl(p
Ｈ８.０)等容量を加え(最終グリセリン濃度は５０％で
ある)、酵素を−７０℃または−２０℃で貯蔵した。２
リットルの細胞から、１マイクロリットル当たり６２５
ニック・クロージング単位で、１６mlの貯蔵緩衝液中６
mgのリガーゼの最終収量が得られた。これは、合計１０
００００００単位の酵素、および１６６６６６７単位／
mgの比活性に対応する。

【０１１０】耐熱性蛋白質は、それらの中温性対応物質
よりも疎水性が幾分高くなる傾向を示すことが知られて
いるため、非イオン性デタージェントまたは他の安定剤
の添加は、長期貯蔵に有用であり得る。従って、貯蔵緩
衝液は、追加成分、例えばグリセリン(５０％)、しょ糖
(２５％)、プロテアーゼ阻害剤(０.５−１.０ミリモル
のＰＭＳＦ、１０-７モルのペプスタチンＡ)、塩(ＫＣ
l、好ましくは１００−５００ミリモル)、ＥＤＴＡ(０.
１−１.０ミリモル)、牛血清アルブミン(１００−５０
０μ／ml)、ゼラチン、ジチオトレイトール(１−１０ミ
リモル)およびメルカプトエタノール(１−１０ミリモ
ル)を含み得る。さらに、貯蔵緩衝液は少なくとも１種
の非イオン性ポリマー性デタージェントを含むのが好ま
しい。それらのデタージェントを一部列挙した場合、エ
トキシル化脂肪族アルコールエーテルおよびラウリルエ
ーテル類、エトキシル化アルキルフェノール類、ポリエ
チレングリコールモノオレエート化合物、さらに特定す
ればトリトンＸ−１００、ＮＰ−４０およびトウィーン
２０が０.１−０.５％容量／容量で含まれる。

【０１１１】リガーゼ活性について検定するためには、
基質の溶融温度(Ｔm)により歪曲されない方法を使用す
ることが重要である。例えば、４塩基突出末端ライゲー
ションは、Ｔ４リガーゼに最適な温度(３７℃である)よ
りもかなり低く、確実には耐熱性リガーゼの最適温度よ
りも下の低温、例えば４℃で最も有効である。一貫性を
示すべき一検定方法は、環状プラスミドがデオキシリボ
ヌクレアーゼＩにより幾つかの箇所で不規則にニックさ
れるニック-クロージング検定である。リガーゼがこれ
らの全ニックを閉じ、共有結合的閉環状ＤＮＡを生成さ
せる能力は、臭化エチジウム含有アガロースゲル中での
電気泳動によって開環状ＤＮＡからニック環状を分離す
ることにより検定され得る。例えば、プラスミドpＵＣ
４ＫＩＸＸの共有結合的閉環状形態［「ジーン」、３７:
１１１(１９８５)参照]は、同緩衝液中１５０Ｖで１.５
時間実施された、０.２モルのグリシンＮaＯＨ、pＨ８.
５、０.１ミリモルのＥＤＴＡおよび１μg／mlの臭化エ
チジウムを含む１％アガロースゲル電気泳動において線
形態よりも迅速に、そしてニック形態よりもかなり迅速
に移動する。

【０１１２】実施例７（好熱性リガーゼ分析）ニックをもつｐＵＣ４ＫＩＸＸ
ＤＮＡを、１０ｍＭＭgＣl_２、１ｍＭＥＤＴＡおよ
び６ｍＭメルカプトエタノールを含む５０ｍＭトリスＨ
Ｃl ｐＨ８.０緩衝液５０μl中ＤＮＡ５μgに希釈直後
の１μl／ｍｌＤＮアーゼ３μlを加えて製造した。混
合物を室温で５分間インキュベートし、ＤＮアーゼは６
５℃１０分間の熱で失活させ、試料を使用するまで−２
０℃で凍結し保管した。それらの条件下、ＤＮＡの約９
０％は、ニックをもつ環状であり、約５％は直線状およ
び５％は共有結合で閉じた環状であった。

【０１１３】上記で製造した好熱性リガーゼを、５０ｍ
ＭＫＣl、１０ｍＭＭgＣl_２、１ｍＭＥＤＴＡ、１０
ｍＭＮＡＤ、１０ｍＭジチオスレイトールを含む２０
ｍＭトリスＨＣlｐＨ７.６緩衝液２０μl中に入れたニ
ックをもつｐＵＣ４ＫＩＸＸ０.５μgにリガーゼの段階
希釈を加え、鉱油１滴で液面を覆い、６５℃１５分間イ
ンキュベートして分析した。対照として、Ｔ４リガーゼ
を１０ｍＭＭgＣl _２、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＡＴ
Ｐ、６ｍＭメルカプトエタノールを含む５０ｍＭトリ
スＨＣｌｐＨ８.０緩衝液０.５μgにリガーゼの段階希
釈を加え、３７℃１５分間インキュベートして分析し
た。

【０１１４】反応を０.２ＭＥＤＴＡ、５０％グリセリ
ン、１％ＳＤＳおよび０.１％ブロムフェノールブルー
を含む４μl終止緩衝液を加えて終結させ、生成物を上
記のゲル電気泳動法により分析した。

【０１１５】リガーゼの１ニッククロージングユニット
を、緩衝液および時間についての上記の実施例の記載の
条件下でニックをもつｐＵＣ４ＫＩＸＸＤＮＡ０.５μ
gを環化するが別のリガーゼの添加がさらにＤＮＡを環
化しないリガーゼの量と定義する。

【０１１６】最縮小製造法として、プラスミドpＤＺ１
５（phoＡプロモーター制御下、とあるリガーゼ）を含
むエシエリキア・コリ細胞ＡＫ５３を５０μg／ｍｌで
アンピシリンを含むＴＹプレート上で一夜３７℃で発育
させた。新鮮なコロニーを５０μg／ｍｌアンピシリン
を含む強化ブイヨン５ｍｌ中に懸濁し、成育させた。
Ｏ.Ｄ.５５０が０.６５〜０.８５に達したとき、０.１
２ｍｌを０.２ｍＭＫ２ＨＰＯ４を含むＭＯＰＳ培地６
ｍｌ中に希釈し、ｐｈｏＡプロモーターを誘発した。細
胞を一夜３７℃でインキュベートした（インキュベーシ
ョン延長後に起こる蛋白分解に注意し、誘発された細胞
が成育し過ぎないようにする）。細胞を１.５ml超遠心
分離管中に採取し、１ｍＭＥＤＴＡおよび１０ｍＭ２
−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭトリスＨＣｌｐ
Ｈ７.６緩衝液０.３ｍｌ中で懸濁し、２×１０秒音波処
理した。遠心分離（１２０００ｒｐｍ／分）により破片
を除去した後、上清を６５℃２０分間処理し、エンドヌ
クレアーゼおよびエキソヌクレアーゼを含む複数のエシ
エリキア・コリ酵素を非可逆的に熱変性した。熱変性残
分を遠心分離により除去し、上清を上記と同様に分析し
た。上清１ｍｌは約６２５ニッククロージングユニット
の活性を含有した。

【０１１７】上記の実施例に記載のＴ．アクアティクス
リガーゼ製品および市販品のＴ４リガーゼは約１２５ニ
ッククロージングユニット／ｍｌを含むことを示した。
従って、本発明の製造法は、Ｔ．アクアティクスを過剰
に製造するエシエリキア・コリ１ｌから、約１００００
０（８００×１２５）ニッククロージングユニットの酵
素を精製した。

【０１１８】上記により製造された好熱性リガーゼは、
ＤＮＡを増幅すると共にＤＮＡ配列中単一塩基置換を識
別する分析法として特に有効である多くの有益な性質を
有する。それらに使用される本リガーゼの唯一最も重要
な性質は、リガーゼが熱変性／再生サイクルを反復する
間活性を維持するので、リガーゼを繰返し添加する必要
がなくＤＮＡ増幅をもたらすということである。さら
に、本発明のリガーゼはＴｍ温度６５℃でまたはその付
近で複合ゲノムにおいて独自性を確かにするのに十分な
長さのオリゴヌクレオチドを連結し、また正確に相補的
なオリゴヌクレオチド配列と単一塩基ミスマッチオリゴ
ヌクレオチド配列を正確に識別する。

【０１１９】リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）と称する好熱
姓リガーゼＤＮＡ配列のクローニングの結果として発展
した２つの製造のより簡便な方法において、２種のオリ
ゴヌクレオチドプローブを１方の３'末端が他方の５'末
端にすぐに隣接するように熱変性ＤＮＡにハイブリダイ
ズする。各々がヒトゲノム中その独特な位置に選択的に
ハイブリダイズするように十分に長いオリゴヌクレオチ
ドが選択される。好熱性リガーゼは、連結のヌクレオチ
ドが標的に対して完全に相補的であるならばついで２種
のオリゴヌクレオチド間で共有結合のリン酸二エステル
結合を形成する。ニッククロージング反応の特異性は、
それらの標的の２種のオリゴヌクレオチドのＴｍまたは
その付近で連結することにより著しく増大する。即ち、
連結点での単一塩基ミスマッチが不完全な二重らせんを
形成するだけでなく、比較的高い温度でのハイブリッド
を不安定にする。従って、好熱性リガーゼは、正確な塩
基対を作ったオリゴヌクレオチドを有効に連結し、不完
全マッチ配列の存在下でほぼ０のバックグランド連結を
与える。ＬＤＲを使用すると、連結反応で得られた化合
物の量は反復される熱サイクルにより直線的に増加し得
る。

【０１２０】本発明の好熱性リガーゼ連鎖反応におい
て、両鎖は共にハイブリダイゼーションの標的として役
立つ。反対鎖に相補的な２種のオリゴヌクオチドを更に
使用すると、１サイクルの連結生成物は、第２図におい
て一般的に示されるように連結の次ぎのサイクルの標的
となる。各隣接オリゴヌクレオチド対において、特徴的
なヌクレオチドは連結点の３'末端側にある。従って、
相補的なオリゴヌクオチドが異常な標的独立連結をする
ことはＴｍ付近の温度の使用、および単一塩基３'突出
部の有利なまたは乏しい連結効果を利用することにより
回避される。連結鎖反応をすると、熱サイクルの反復に
より生成物を指数的に増加し得る。

【０１２１】好熱性リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）の能力
を試験するために、ヒトβグロビンをコード化する遺伝
子を初期モデル系として選択し、本発明の技術を試験し
た。従来の研究から、正常β^Ａ対立遺伝子と鎌状β^Ｓ遺
伝子はβグロビン遺伝子の６番目のコドンにおいて２番
目のヌクレオチド１個がＡ→Ｔに塩基転換し、第１表に
記載のヘモグロビリンβ鎖中グルタミン酸残基がバリン
へ変化した点で異なることが明らかにされている。第１表：

【表１５】下記の第１表のつづきにおいて、それらの慣用される
５'→３'配向で上記の部分に掲げるオリゴヌクレオチド
の配列を示す。

【表１６】

【０１２２】各対立遺伝子にユニークな３'ヌクレオチ
ドを含むオリゴヌクレオチドを、５'末端の長さが異な
るように合成した（第１表、参照）。不変系である^３２
Ｐ放射能標識化隣接オリゴヌクレオチドへ連結すると、
個々の生成物をポリアクリルアミド変性ゲルで分離し、
オートラジオグラフィーで検出することができた。オー
トラジオグラフィーによる最初の発見に基づき、対立遺
伝子特異性オリゴヌクレオチドを捕獲のために５'ビオ
チニル化し、変異系オリゴヌクレオチドをジゴキシゲニ
ンで３'に継いだ自動、非放射性検出反応法を使用して
配列分析を行った。ついでアルカリホスファターゼに抱
合された抗ジゴキゲニンおよび酵素の比色法基質を使用
してＥＬＩＳＡ型式で視覚化した。

【０１２３】第１表に記載のように、ヌクレオチド配列
およびβ^Ａおよびβ^Ｓグロビン遺伝子を検出するのに使
用される対応するオリゴヌクレオチドの翻訳された配列
を記載する。オリゴヌクレオチド１０１および１０４は
β^Ａ標的を検出し、同時に１０２および１０５は、標識
化オリゴヌクレオチド１０７および１０４にそれぞれ連
結すると、β^Ｓ標的を検出する。オリゴヌクレオチド１
０３および１０６は、β^Ａまたはβ^Ｓグロビン遺伝子標
的をそれぞれ使用してＧ：ＴまたはＧ：ＡおよびＣ：Ａ
またはＣ：Ｔのミスマッチ連結の効率を分析するために
設計された。種々の生成物を変性したポリアクリルアミ
ドゲルで分離したとき、様々な生成物を容易に識別させ
るためにオリゴヌクレオチドは僅かに長さを変えて設計
された。標的配列に非相補的な末端は「リポーターグル
ープ」であると考え得ることができる。従って、オリゴ
ヌクレオチド１０７へのオリゴヌクレオチド１０１、１
０２または１０３の連結は、それぞれ４５、４７または
４９ヌクレオチドの長さを与える。相補鎖ではオリゴヌ
クレオチド１０９へのオリゴヌクレオチド１０４、１０
５または１０６の連結は、それぞれ４６、４８または５
０のヌクレオチドの長さを与える。オリゴヌクレオチド
は計算Ｔｍ値が連結温度と同じかまたはそれより僅かに
高い６６〜７０℃になるように設計された。

【０１２４】連結生成物を検出するために、オリゴヌク
レオチド１０７および１０９は、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼを使用して^３２Ｐおよび以下の実施例に記載の
ように−^３２Ｐで５'末端を標識した。

【０１２５】実施例８（放射性標識化）オリゴヌクレオチド１０７（０.１μ
g）を２０ｍＭトリシン、１０ｍＭＭgＣl_２、０.５ｍ
ＭＥＤＴＡ、５ｍＭジチオスレイオトール、および［
^３２Ｐ］ＡＴＰを含むｐＨ８.０の３０ｍＭトリスＨＣ
ｌ緩衝液２０μl中Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１５
ユニットを加えて５'末端に標識した。３７℃で４５分
間インキュベーション後、非標識化ＡＴＰを１ｍＭに加
えて、インキュベーションをさらに２分間３７℃で行っ
た。反応は０.５ＭＥＤＴＡ０.５μlを加えて終結し、
キナーゼを６５℃１０分間熱不活化した。取り込まれな
い^３２Ｐ標識をＴＥ緩衝液でまえもって平衡化しセファ
デックスＧ−２５でクロマトグラフにかけて除去した。
特異的活性はオリゴヌクレオチド７×１０^８〜１０×１
０^８ｃｐｍ／μgの範囲であった。

【０１２６】相補的対ミスマッチ標的に対する本発明の
Ｔ．アクアチクス好熱性リガーゼ特異性をＬＤＲおよび
ＬＣＲ両条件で比較した（第３図および以下の第ＩＩ
図、参照）。ＬＤＲ系において、２種の隣接したオリゴ
ヌクレオチドを変性標的ＤＮＡおよびリガーゼとインキ
ュベートし、そこで非標識化オリゴヌクレオチドの最終
ヌクレオチドを標的ＤＮＡに対して相補性またはミスマ
ッチした。オリゴヌクレオチドを末端の長さが僅かに異
なるように設計し、様々な生成物の識別を容易にさせ、
変性ゲルで分離できるようにした。従って、以前に開示
されたように、標識化オリゴヌクレオチド１０７に対す
るオリゴヌクレオチド１０１（β^Ａ対立遺伝子）、１０
２（β^Ｓ）または１０３の連結は各々４５、４７または
４９ヌクレオチドの長さを与える。相補的な鎖におい
て、標識化オリゴヌクレオチド１０９に対するオリゴヌ
クレオチド１０４（β^Ａ対立遺伝子）、１０５（β^Ｓ）
または１０６の連結は各々４６、４８または５０ヌクレ
オチドの長さを与える。オリゴヌクレオチドを連結温度
またはそれより僅かに高い６６℃〜７０℃の計算Ｔｍ値
をもつように設計した。従って、完全な相補性（Ａ：
Ｔ）で標的ＤＮＡにハイブリダイズする２種のオリゴヌ
クレオチドの連結の特異性は、各々可能なミスマッチ
（Ａ：Ａ、Ｔ：Ｔ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｔ、Ｃ：Ａ、または
Ｃ：Ｔ）と直接的に比較され得た。β^Ａまたはβ^Ｓグロ
ビン遺伝子標的の存在下におけるそれらのオリゴヌクレ
オチドの連結の特異性を測定する方法を以下の実施例と
同様に決定した。

【０１２７】実施例９（好熱性リガーゼの特異性の測定）標識化オリゴヌクレ
オチド（２０００００ｃｐｍ；０.２８ｎｇ；４０フェ
ムトモル）および非標識化オリゴヌクレトチド（２７ｎ
ｇ；４０フェムトモル）をｐＨ７.６で１００ｍＭＫＣ
l、１０ｍＭＭgＣl_２、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＮ
ＡＤ、１０ｍＭジチオスレイトール、４μgサケ精子Ｄ
ＮＡ、および好熱性リガーゼ１５ニッククロージングユ
ニットを含む２０ｍＭトリスＨＣl緩衝液１０μl中標的
ＤＮＡの存在下に、鉱油１滴で液面を覆ってインキュベ
ートした。反応物を９４℃１分間、ついで４分間インキ
ュベートし、このサイクルを５〜３０回反復した。反応
をＥＤＴＡ（１０ｍＭ)、キシレンシアノール（０.２
％)およびブロモフェノールブルー（０.２％）を含むギ
酸８μlを加えて終結した。試料(４μl）をゲルに入れ
る(４００００cpm／lane）前に煮沸させて熱変性した。

【０１２８】生成物を、試料を８グループに分け、ゲル
中で移動させ、ついで次ぎのセットを入れるという電気
泳動により分離し、それによって第３図のオートラジオ
グラムの右側のややゆっくりとした移動性のバンドが明
らかになった。電気泳動はｐＨ８.９の１００ｍＭトリ
スホウ酸緩衝液および１ｍＭＥＤＴＡ中７Ｍ尿素を含
む１０％ポリアクルリルアミドゲル中２時間６０Ｗの一
定電力で行った。

【０１２９】１０分間１０％酢酸に浸し、ついで５分間
水に浸して尿素を除去後、ゲルをワットマン紙３ｍＭで
乾燥し、一夜−７０℃でコダックＸＡＲ−５フィルムで
（デュポンクロネック照明と増強スリーンを使用または
使用しないで）オートラジオグラムにかけた。２０サイ
クルからのバンドをゲルから切除し、放射能を分析し
た。結果を第２表に示す。

【０１３０】第２表実施例９および第３図に記載された２０サイクルＬＤＲ
および３０サイクルＬＣＲ実験からの相補性およびミス
マッチＬＤＲおよびＬＣＲバンドの定量は、ゲルから切
除し、放射能を分析した。生成物のパーセント＝生成物
バンドｃｐｍ／出発オリゴヌクレオチドバンドｃｐｍ。
ミスマッチ／相補性パーセント＝ミスマッチオリゴヌク
レオチドバンドｃｐｍ／同じ標的ＤＮＡを使用したとき
の相補性オリゴヌクレオチドバンドｃｐｍであり、ノイ
ズ／シグナル比の示標を与える。ＬＤＲ増幅は６×１０
^８標的分子または１フェムトモルを使用して行った；Ｌ
ＣＲ増幅は６×１０^６標的分子または１０アトモルを使
用して行った。

【表１７】

【０１３１】このように、ＬＤＲ検定において、好熱性
Ｔ．アクアティクスリガーゼが、全ての可能な不適正塩
基対に対する不適正オリゴヌクレオチド配列から相補的
配列を判別することが示された。競合的及び個別的ライ
ゲーション実験（相異なる塩濃度において）の両方にお
いて、最低の場合の不適正ライゲーションは１.５ない
し１.０％（第２表、Ｇ：Ｔ及びＴ：Ｔを参照された
い）、一方他の場合は０．４％ないし＜０．１％（第２
表、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｔ、Ｇ：Ａ及びＣ：Ａ）の生成物が相
補的塩基対（Ａ：Ｔ）と共に形成された。これは大腸菌
の中温生物Ｔ４リガーゼ［ジーン７６巻２４５頁（１９
８９）参照］についての報告（放射活性検出を使用）よ
り実質上良好である。

【０１３２】一連のＬＣＲ増幅／検出実験において、２
つの隣接するオリゴヌクレオチドを、変性した標的ＤＮ
Ａ及びリガーゼ、並びに相補的な組のオリゴヌクレオチ
ドとインキュベートした。これらの条件の下では、非標
識診断オリゴヌクレオチドの３'ヌクレオチドは、標的
ＤＮＡと相補的または不適合のいずれかであるが、標識
されていない対応物とは常に相補的である（即ち１０１
及び１０４に対するＡ：Ｔ、１０２及び１０５に対する
Ｔ：Ａ、並びに１０３及び１０６に対するＧ：Ｃ）。し
たがって、不適正オリゴヌクレオチドの最初の「正しく
ない」ライゲーションは、正しいライゲーションと同じ
効率で順次増幅される。試料は、非標識オリゴヌクレオ
チドの対（β^Ａ対立遺伝子特異的１０１及び１０４、β
^Ｓ対立遺伝子特異的１０２及び１０５、または１０３及
び１０６）を、標識オリゴヌクレオチドの相補的且つ隣
接する対、１０７及び１０９と共に含んでいた。これら
の標識及び非標識オリゴヌクレオチドを、リガーゼ及び
１０アットモルの標的ＤＮＡ（ＬＤＲに対するより１０
０倍少ない標的ＤＮＡ）の存在下で実施例９のように２
０または３０サイクルインキュベートした。得られたバ
ンドを第３図の左部分及び第２表の下半分に示す。

【０１３３】第３図及び第２表でわかるように、本発明
に係る好熱性リガーゼは、ＬＣＲ検定における全ての可
能な不適正塩基対に対する不適正オリゴヌクレオチド配
列から相補的配列を判別することができた。競合及び個
々のライゲーション実験の両方において、より悪い場合
の不適正ライゲーションは１．３％ないし０．６％
（Ｇ：Ｔ、Ｃ：Ａ及びＡ：Ａ、Ｔ：Ｔ）、一方他の場合
は＜０．２％（Ｔ：Ｔ、Ａ：Ａ及びＧ：Ａ、Ｃ：Ｔ）の
生成物が相補的塩基対（Ａ：Ｔ、Ｔ：Ａ）と共に形成さ
れた。このように、本発明に係る好熱性リガーゼを用い
るＬＣＲは、高い信号−雑音比で単一の塩基不適合を増
幅し且つ検出できる唯一の方法である［ゲノミクス第４
巻５６０頁（１９８９）参照］。したがって、ＬＣＲを
利用することにより、β^Ａ及びβ^Ｓ間に存在するような
単一の塩基不適合間の差異を検出することができ、ま
た、この検定の結果を正常な、キャリアの、または罹患
している患者の診断として使用することができる。

【０１３４】ＫＣｌ１００ｍＭの代わりに１５０ｍＭを
含む緩衝液を使用して上記一連の実験全体を反復する
と、結果は第３図及び第２表に作表されたものと本質的
に同一であって、ＬＤＲに対する不適正オリゴヌクレオ
チドのライゲーションは正確に相補的な生成物の０．６
％ないし＜０.３％の範囲、ＬＣＲに対しては１.７％な
いし＜０.３％の範囲であった。このように、適合及び
不適合オリゴヌクレオチド間の鋭敏な判別は、塩の条件
に決定的に依存する訳ではないように思われる。

【０１３５】別法として、ホスファターゼに基づく別の
方法を使用することもできる。ＬＣＲまたはＬＤＲ反応
は、鉱油の下で１０μl容で実施できる。ここに細菌性
アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）０．５単位を含有す
る１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７.６）５０μl及び１０
ｍＭＭgＣl_２を加え、６５℃で２時間インキュベーシ
ョンを続けた(リガーゼ酵素はこの条件下で死滅しない
ことに留意されたい)。共有結合で連結されるようにな
ったオリゴヌクレオチドの５'末端の標識はもはやＢＡ
Ｐに対する感受性を持たない。担体としての１０ｍｇ／
ｍｌの超音波処理鮭精子ＤＮＡ２０μlの添加によりラ
イゲーション産物を一燐酸塩から分離し、５０％ＴＣＡ
２０μlで沈澱化する。１２０００ｒｐｍで５分間遠心
した後上清を除去すると、ペレット対ペレット＋上清の
割合は、形成された生成物の百分率を与える。同様の検
定をＴａｑＩエンドヌクレアーゼを用いて使用すると、
正及び負の対照に対する実験誤差は１−２％前後であ
る。

【０１３６】本発明に係る好熱性リガーゼの使用によ
り、中温生物のリガーゼに対して求められる塩及び酵素
の濃度の注意深い滴定の必要性が回避できる。この一連
の実験からのデータを以下の第３表に示す。

【０１３７】第３表実施例９に記載され第３図に示される２０サイクルのＬ
ＤＲ及び３０サイクルのＬＣＲ実験からの、ＫＣｌ濃度
１００及び１５０ｍＭにおける相補的及び不適正ＬＤＲ
及びＬＣＲバンドの定量。ＬＤＲ増幅は６ｘ１０^８標的
分子または１フェムトモルを用いて実施した。ＬＣＲ増
幅は６ｘ１０^６標的分子または１０アットモルを用いて
実施した。不適正／相補的は、雑音対信号比の指標を与
える。

【表１８】

【０１３８】ＬＣＲ及びＬＤＲの特異性を、同一の標識
オリゴヌクレオチドに対するライゲーションについての
直接的競合においてβ^Ａ及びβ^Ｓ特異的両ヌクレオチド
を使用して試験した。１フェムトモルないし１アットモ
ルの範囲の標的ＤＮＡ（β^Ａ、β^Ｓ、及びβ^Ａ及びβ^Ｓ
の等モル比物）を使用する時、好熱性リガーゼは各場合
において正しい生成物を特異的に形成し、ただ一つの標
的対立遺伝子が存在する場合はバックグラウンドである
正しくないライゲーション生成物は観察されなかっ
た。）しかしながら、β^Ｓ特異的生成物の形成効率はβ
^Ａ生成物の形成より幾分低く、２０サイクルの増幅の
後、放射活性用に切り取った生成物を検定することによ
り定量したこのβ^Ｓ特異的生成物はβ^Ａ特異的生成物の
およそ三分の一であった。よって、各々の標的配列の対
立遺伝子の相対的初期濃度を定量するために、二つのオ
リゴヌクレオチドを区別をつけて標識する（例えば蛍光
原子団を用いて）、直接的競合検定は、各々の対立遺伝
子を注意深く滴定する必要がある。

【０１３９】さらに、アットモル以下の量の標的ＤＮＡ
を用いるＬＣＲＤＮＡ増幅の特異性を調べた。管当り
１００アットモル（６ｘ１０^７分子）から１分子以下ま
での範囲の標的ＤＮＡの存在下におけるＬＣＲＤＮＡ
増幅の程度を調べた。反応物を２０または３０サイクル
インキュベートし、生成物を第４図および以下の第４表
に示されるように分離、定量した。

【０１４０】第４表ＬＣＲ増幅の定量。３０サイクルのＬＣＲ実験からのバ
ンドをゲルから切り取り、放射活性について検定した。
標的が高濃度の場合、ＤＮＡ増幅は２０サイクル後に本
質上完結した。ゲルのこの部分から３０サイクルのバン
ドをやや不正確に切り取ったことが、おそらく１００％
を超える生成物形成値の原因である。生成物形成の百分
率＝生成物のバンドにおけるｃｐｍ／出発オリゴヌクレ
オチドのバンドにおけるｃｐｍ。増幅＝形成された生成
物の分子の数／標的分子の数。

【表１９】

【０１４１】第４図に示されるように、標的の不在下で
は、担体の鮭精子ＤＮＡ（４μg）が存在する場合、バ
ックグラウンドの信号は検出されなかった。最初の標的
濃度が高い場合ＤＮＡ増幅は２０サイクル後に本質上完
結したが、最初の標的濃度が低い場合には、実質的によ
り多くの生成物が、さらなる増幅サイクルで形成され
る。これらの条件の下では、最初の標的ＤＮＡ２００分
子が３０サイクル後に容易に検出できるであろう。

【０１４２】この酵素の熱安定性は第４図で容易に明ら
かとなっている。２０サイクル後に形成された生成物の
量を３０サイクル後に形成された量と比較することによ
り、低濃度の標的ＤＮＡの下では、追加の生成物がより
多いサイクルの後に形成されることが明らかである（特
に２ｘ１０^４ないし２ｘ１０^２標的ＤＮＡ分子）。換言
すると、この酵素は９４℃１分間に続く６５℃４分間を
２０サイクル行なった後にも尚活性を有している。

【０１４３】このようにＴ．アクアティクスリガーゼ
は、ＤＮＡを変性させる温度、即ち約１０５℃で約０．
２５分間ないし約４分間の範囲に繰り返し暴露させた
後、約５０℃ないし約８５℃の範囲の温度において、相
補的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズした二つの隣接するオリ
ゴヌクレオチド間のホスホジエステル結合の形成を触媒
する能力を保持している。

【０１４４】故に、ＬＣＲを用いる既知のヌクレオチド
配列の核酸被験物質の特異的増幅は、（１）標的配列の
核酸に対し相補的且つモル過剰であって、その隣接する
オリゴヌクレオチドの連結部において該標的配列核酸と
の不適合が無い、二つの隣接するオリゴヌクレオチド；
（２）標的配列の核酸に対し相補的且つモル過剰であっ
て、この隣接するオリゴヌクレオチドの第二組の連結部
において該標的配列核酸との不適合が無い、第一組の隣
接するオリゴヌクレオチドに相補的な第二組の隣接する
オリゴヌクレオチド；（３）約５０℃ないし約１０５℃
の温度に付す時、不可逆的な変性をせず、その触媒能を
失わない熱安定性リガーゼ；及び、（４）ＤＮＡを変性
させる第一の温度（約９０℃ないし約１０５℃の範囲）
及びハイブリダイゼーション／ライゲーションをさせる
第二の温度（約５０℃ないし約８５℃）からなる反復す
る温度サイクルにこのリガーゼ混合物を付すこと、を必
要とする。上記のβ^Ａグロビン対立遺伝子の増幅の場
合、構成因子は、（１）オリゴヌクレオチド１０１及び
１０７；（２）オリゴヌクレオチド１０４及び１０９；
（３）Ｔ．アクアティクスリガーゼ；及び（４）９４℃
１分間、続いて６５℃４分間の温度サイクル３０回、で
あった。

【０１４５】第４図において、４５及び４６ヌクレオチ
ドのバンドはコード化及び相補的β^Ａグロビンオリゴヌ
クレオチドのライゲーション産物に対応している。より
低い分子量の産物は、最初のライゲーション反応に存在
する除去オリゴヌクレオチドのライゲーションに相当す
る。試料は８個の群でロードしたため、オートラジオグ
ラムの右側はゆっくりとした移動が現われている。

【０１４６】リガーゼが相補的及び不適正オリゴヌクレ
オチドを判別する能力をさらに試験するため、Ｇ−Ｔ及
びＣ−Ａ不適合を与えるオリゴヌクレオチドの存在下及
び不在下で、以下の実施例に従ってＬＣＲ実験を実施し
たが、この実施例はＤＮＡ増幅を示すのみならず実施例
９に見いだされる酵素の熱安定性を支持するものであ
る。

【０１４７】実施例１０実験の一組は非標識１０１及び１０４オリゴヌクレオチ
ド各４０ｆモルを含み、第二組はさらに４０ｆモルの非
標識１０３及び１０６オリゴヌクレオチドを有してい
た。どちらの組も標識１０７及び１０９各４０ｆモルを
含んでいた。標識されたオリゴヌクレオチド（２０００
００ｃｐｍ；２８ｎｇ；４０ｆモル）及び非標識オリゴ
ヌクレオチド（．２７ｎｇ；４０ｆモル）を、標的ＤＮ
Ａ、即ち１００アットモル（６ｘ１０^７分子）ないし
０．０１アットモル（６ｘ１０^３分子）の範囲のＴａｑ
Ｉ消化β^Ａまたはβ^Ｓグロビンプラスミドの存在下でイ
ンキュベートした。インキュベーションは、１００ｍＭ
ＭgＣl_２、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＮＡＤ、１
０ｍＭジチオトレイトール、４μgの鮭精子ＤＮＡ、及
び１５ニック閉鎖単位のＴ．アクアティクスリガーゼを
含む２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）１０μl中で
実施し、鉱油一滴で覆った。反応物は９４℃で１分間、
次に６５℃で４分間インキュベートし、このサイクルを
２０または３０回反復した。

【０１４８】得られた試料を電気泳動し、クロネックス
強化スクリーンを用いて一夜ゲルオートラジオグラフィ
ーに付し、バンドを計数した。オートラジオグラフィー
処理したゲルからのバンドを図４に示し、ＬＣＲ増幅の
定量を以下の第Ｖ表に作表した。第５表

【表２０】高い標的濃度においては、充分な不適正生成物が産生、
視覚化され（図４のように）、不適正生成物の量は相補
的生成物の１．８％ないし０．５％の範囲である。過剰
の不適正標的ＤＮＡの使用（β^Ａグロビンの代わりに管
当り６ｘ１０^７分子のβ^ＳグロビンＤＮＡ）はわずか
２．１％及び１．５％の生成物を与えるのみであった。
同じ量の生成物が、３０００ないし１００００倍少ない
相補的標的ＤＮＡを使用する時に形成され得る。これに
基づくと、正しく対になったライゲーション生成物から
の信号は、競合または個別的ＬＣＲライゲーション条件
の下では不適正生成物の５０ないし５００倍大きい。

【０１４９】低い標的濃度においては、ＤＮＡ増幅の程
度は３．７ｘ１０^４ないし１．７ｘ１０^５の範囲であっ
た（第４表及び第５表参照）。ライゲーションの効率が
各サイクルで同一であると仮定すると、サイクル当りの
平均増幅は４０及び５０％の間である。

【０１５０】無論、サイクル当りの効率は、緩衝剤の条
件、酵素濃度、または温度サイクルの回数及び温度を変
えることにより向上させ得る可能性があり、これらは全
て当業者の能力の範囲内にある。例えば、好熱性リガー
ゼ（及び他のリガーゼ）のライゲーション効率が、ＮＨ
_４Ｃｌ、ＨＥＰＥＳ、スペルミジンのようなポリアミン
類、またはポリエチレングリコールの使用といったよう
な緩衝剤の組成を変えることにより向上させ得るという
ことが示されている［ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー２５９巻１００４１頁（１９８４）、
及びジャーナル・オブ・バイオケミストリー１００巻１
２３頁（１９８６）参照］。現在使用されている緩衝剤
中の各成分の量を変え、そして１またはそれ以上の成分
を補足しまたは上に列挙した化学的及び生物学的成分
（但しこれらに限定されない）と交換する事は、当業者
にとっては容易なＬＣＲ改良方法の一つである。さらに
当業者はサイクル回数及び温度を容易に変えることがで
きる。例えば、後の時点において、存在する標的の大多
数は前のＬＣＲ反応からのオリゴヌクレオチド生成物で
ある。これらのオリゴヌクレオチドは短く（好ましくは
４０ないし６０量体であるがこれに限定されない）、よ
り速やかに融解し、より迅速な循環を可能とする。本発
明において、成功したリガーゼ鎖反応は、９４℃０．５
分間、続いて６５℃２分間の循環条件下で（好ましいリ
ガーゼ鎖反応条件では９４℃で１分間の半分の時間、そ
して６５℃で４分間の循環時間）３０及び４０サイクル
で完了した。ライゲーション温度及びＤＮＡ変性温度は
共に実際の程度、持続時間、及び反復されるサイクルの
回数の点で変えることができる。最適の条件は、完全に
相補的な標的ＤＮＡの存在下で形成される生成物の量を
最大とし、一方不適正な標的ＤＮＡの存在下または相補
的標的ＤＮＡの不在下で形成される正しくない生成物の
量を最小としなくてはならない。

【０１５１】これらの発見を利用して、臨床上の試料中
の特異的オリゴヌクレオチド配列を検出する方法が開発
された。試料の供給源は核酸を含む任意の材料または物
質であってよい。この核酸は天然に存在する核酸である
必要はなく、化学的、酵素的、または生物学的手段によ
り合成されることができ、また、天然に存在するプリン
類及びピリミジン類以外を有することができる。臨床的
試料の供給源は細胞または非細胞であってよく、また、
血液、血清、血漿、乳汁、便、膿、掻爬組織、洗液、尿
等のような生理学的媒質から導かれ得る。さらに、この
試料は、新生物細胞、リンパ球（例えばＴ細胞またはＢ
細胞、単球、好中球等）のような一組のまたは１サブセ
ットの細胞に関連していてよく；ウイルス、細菌、マイ
コプラズマ、真菌、原生動物等を含む病原体を包含し；
構造物等、またはメッセンジャーＲＮＡ、トランスファ
ーＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ、ウイルス等のようなＲＮ
Ａを含み得；そして構造遺伝子、非翻訳領域、調節領
域、イントロン、エクソン等を含み得る。加えて、この
検出は非常に様々な目的、例えば植物または動物種にお
ける可能性あるまたは実際の病態の診断、並びに病原体
の組（セット）またはサブセットの検出、遺伝子工学の
監視等のような目的のためのものであり得る。このよう
な本発明が使用できる（そして前もってＰＣＲ増幅を行
なう必要の無い、血液試料からの直接的ＬＣＲ対立遺伝
子検出の実行可能性を明白に証明している）一つの方法
は、例えば、ヒトゲノムＤＮＡにおけるβグロビン対立
遺伝子の検出において具現される。高レベルのＤＮＡ増
幅に基づき、正常（β^Ａβ^Ａ）、キャリア（β
^Ａβ^Ｓ）、及び鎌状赤血球（β^Ｓβ^Ｓ）のヒトから採集
した血液からＤＮＡの対立遺伝子特異的ＬＣＲ検出を調
べ、これをより詳細に以下の実施例に記載する。

【０１５２】実施例１１（ヒトゲノムＤＮＡにおけるβグロビン対立遺伝子の検
出）全血０．５ｍｌからヒトゲノムＤＮＡを単離した
［ＰＣＲテクノロジー、Ｈ．Ａ.アーリッヒ編、ストッ
クトン・プレス(１９８９)、３６頁参照]。全血(０.５
ｍl）を同容量のリシス緩衝液（１０ｍＭトリスＨＣ
ｌ、ｐＨ７.６、５ｍＭＭgＣl_２及び０．３２Ｍシュ
クロース含有）と混合した。短時間の遠心（エッペンド
ルフ卓上遠心機中１２０００ｒｐｍで１分間）の後、上
清０.１５ないし０.２ｍｌ及びゆるくペレット化した核
を残して上清を極めて注意深く除去した。このペレット
を、さらに０．５ｍｌのリシス緩衝液中に攪拌しつつ再
懸濁し、上記のように核をペレット化し、上清を除去し
た。この工程を、上清が透明または僅かに桃色となるま
で３回または４回繰り返した。最後の上清を除いた後
（やはり約０．１５ないし０．２ｍｌを残す）、非イオ
ン性洗浄剤を含むＬＣＲＤＮＡ緩衝液０．２５ｍｌ
（２ｍＭＥＤＴＡ及び非イオン性洗浄剤ＮＰ４０及び
トゥイーン２０各０．４５％を含有する２０ｍＭトリス
ＨＣｌ、ｐＨ７．６）を加えた。過剰のＲＮＡがあれば
それを４ｍｇ／ｍｌの熱処理ＲＮアーゼＡ２μlの添加
により３７℃で１５分間消化した。蛋白があればそれを
１０ｍｇ／ｍｌの新たに作成したプロテイナーゼＫ５μ
lの添加及び５０℃で１ないし２時間のインキュベーシ
ョンによって消化した。プロテイナーゼＫ及びＲＮアー
ゼＡをフェノール、フェノール／クロロホルム、クロロ
ホルム、ｎ−ブタノール（２ｘ）による連続的抽出によ
り除去し、エタノールを用いた沈澱化により核酸を回収
した。試料はＬＣＲ検定への使用前に５分間煮沸した。

【０１５３】単離された各々のヒトゲノムＤＮＡを二つ
の反応混合物、即ち一方は正常なβ^Ａ対立遺伝子の存在
を試験し、二つ目は鎌状β^Ｓ対立遺伝子の存在を試験す
る反応混合物中で試験した。第一の反応混合物は、β^Ａ
試験オリゴヌクレオチド１０１及び１０４（各々０．２
７ｎｇまたは４０ｆモル）、標識されたオリゴヌクレオ
チド（１０７及び１０９；２０００００ｃｐｍ（各々
０．２８ｎｇまたは４０ｆモル）、１００ｍＭＫＣ
ｌ、１０ｍＭＭgＣl_２、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ
ＮＡＤ、１０ｍＭジチオトレイトール、及び１５ニッ
ク閉鎖単位のＴ．アクアティクスリガーゼを含有する２
０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）１０μlに入
れたゲノムＤＮＡ（血液１０μl、または約６ｘ１０^４
の凝集させた細胞に相当）を含み、鉱油一滴で覆った。
第二の反応混合物は、β^Ｓ試験オリゴヌクレオチド１０
２及び１０５（各々０．２７ｎｇまたは４０ｆモル）、
標識されたオリゴヌクレオチド１０７及び１０９（２０
００００ｃｐｍまたは各々０．２８ｎｇまたは４０ｆモ
ル）、１００ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭgＣl_２、１ｍ
ＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＮＡＤ、１０ｍＭジチオトレ
イトール、及び１５ニック閉鎖単位のＴ．アクアティク
スリガーゼを含有する２０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ７．６）１０μlに入れたゲノムＤＮＡ（血液１０μ
l、または約６ｘ１０^４の凝集させた細胞に相当）を含
み、鉱油一滴で覆った。

【０１５４】両反応混合物を９４℃で１分間、次いで６
５℃で４分間インキュベートし、このサイクルを２０な
いし３０回反復した。ＥＤＴＡ（１０mM）、キシレンシ
アノール（０.２％）、及びブロムフェノールブルー
（０.２％）を含有するホルムアミド８μlの添加により
反応を停止させた。

【０１５５】試料（４μl）はロード（４００００ｃｐ
ｍ／列）前に３分間煮沸することにより変性させた。電
気泳動を、１００mMトリスほう酸（ｐＨ８.９）の緩衝
液中７Ｍ尿素及び１mM ＥＤＴＡを含む１０％ポリアク
リルアミドゲルにおいて、６０ワットの一定電力で２時
間行なった。尿素を除去（１０％酢酸に１０分間浸漬
し、次いで水に５分間浸漬）した後、ゲルをファットマ
ンの３mM濾紙上で乾燥し、デュポン・クロネックス強化
スクリーンを用いてコダックＸＡＲ−５フィルム上で−
７０℃で一夜オートラジオグラフィーに付した。ヌクレ
オチド４５及び４６、または４７及び４８のライゲーシ
ョン生成物が、それぞれβ^Ａまたはβ^Ｓグロビン遺伝子
の存在を示す。プラスミド由来の標的ＤＮＡについて言
及したように、ライゲーション（故に検出）の効率は、
β^Ａ特異的オリゴヌクレオチドよりβ^Ｓの方が幾分低
い。

【０１５６】第５図は、前述の実施例に従って作成され
たヒトゲノムＤＮＡ中のβグロビン対立遺伝子の検出を
示すオートラジオグラムである。ヌクレオチド４５及び
４６、または４７及び４８のライゲーション生成物は各
々β^Ａまたはβ^Ｓグロビン遺伝子の存在を表わす。この
ように、血液１０μlに相当する標的ＤＮＡにより、対
立遺伝子特異的ＬＣＲを用いてβ^Ａ及びβ^Ｓ対立遺伝子
が容易に検出できる。

【０１５７】故に、既知の正常なヌクレオチド配列を有
する、及び該配列中の少なくとも一つの標的ヌクレオチ
ド位置に既知の変異を有する可能性のある、生物学的に
誘導された核酸被験物質の検出の成功は、（１）互いに
相補的であり、標的配列の核酸に対し相補的である二組
の隣接するオリゴヌクレオチドを含む第一の反応混合物
（ここで、その隣接するオリゴヌクレオチドの結合部に
おいて、変異標的配列核酸に対しては少なくとも一つの
不適正塩基対があるが、正常な標的配列核酸にはな
い）；（２）互いに相補的であり、標的配列の核酸に対
し相補的である二組の隣接するオリゴヌクレオチドを含
む第二の反応混合物（ここで、その隣接するオリゴヌク
レオチドの結合部において、正常な標的配列ＤＮＡに対
しては少なくとも一つの不適正塩基対があるが、変異標
的配列核酸にはない）；（３）約５０℃ないし約１０５
℃の温度に付す時に不可逆的に変性せずその酵素的能力
を失わない熱安定性リガーゼ；及び（４）これらのリガ
ーゼ混合物を、ＤＮＡを変性させる第一の温度（約９０
℃ないし約１０５℃の範囲）、及びハイブリダイゼーシ
ョン／ライゲーションを可能にする第二の温度（約５０
℃ないし約８５℃の範囲）（これは各反応混合物中の隣
接するオリゴヌクレオチドが或いは共有結合により連結
するようにもさせ得る）からなる反復する温度サイクル
に付す事；（５）被験物質及び結合していない被験オリ
ゴヌクレオチドがあればそれを、共有結合により結合し
たオリゴヌクレオチド生成物（もし形成されていれば）
から分離する事；及び（６）各反応混合物中の共有結合
により結合したオリゴヌクレオチドの存在または不在を
検出する事（それにより、第一の反応混合物中の共有結
合により結合したオリゴヌクレオチド生成物の存在は正
常な標的配列の存在を表わし、そして第二の反応混合物
中の共有結合により結合したオリゴヌクレオチド生成物
の存在は変異標的配列の存在を表わす）を必要とする。
上に述べたβ^Ａ及びβ ^Ｓグロビン対立遺伝子の検出にお
いて、構成成分は、（１）オリゴヌクレオチド１０１、
１０４、１０７及び１０９；（２）オリゴヌクレオチド
１０２、１０５、１０７及び１０９；（３）Ｔ．アクア
ティクスリガーゼ；（４）９４℃１分間、続いて６５℃
４分間の３０温度サイクル；（５）４５％ホルムアミド
中で煮沸することによる核酸の変性及び配列決定用ゲル
上に分離する事；及び（６）ゲルのオートラジオグラフ
ィーである。

【０１５８】この事は、ＰＣＲ増幅を必要としない本発
明による血液試料からの直接的ＬＣＲ対立遺伝子検出の
実行可能性を明確に立証するものである。

【０１５９】プラスミド由来の標的ＤＮＡについて述べ
たように、ライゲーションの効率（及び、故に検出）は
β^Ａ特異的オリゴヌクレオチドよりβ^Ｓに対する方が幾
分低い。３０サイクルの増幅の後、放射活性用に切り取
った生成物の検定により定量されたβ^Ｓ特異的生成物は
β^Ａ特異的生成物のおよそ三分の一であった。この相違
は、ライゲーション連結部における正確なヌクレオチド
配列の作用であるか、またはＬＣＲ実験に用いられた特
定のオリゴヌクレオチド（異なった５'尾を有する）の
作用であり得る。しかしながら、それでも尚本発明は、
二つのオリゴヌクレオチドが区別されて標識されている
（例えば蛍光原子団によって、またはこの場合は異なっ
た長さの尾によって）場合の、反応混合物中のいずれか
の対立遺伝子の存在または不在を決定するための直接的
競合検定を可能にする。一般化した形式において、本発
明に係る方法は、隣接するオリゴヌクレオチドの連結部
において少なくとも一つの不適正塩基対を変異標的配列
核酸に対して含むが正常な標的配列核酸に対しては含ま
ないオリゴヌクレオチドの組を、一組の標識により標識
し、そして、隣接するオリゴヌクレオチドの連結部にお
いて少なくとも一つの不適正塩基対を正常な標的配列核
酸に対して含むが変異標的配列核酸に対しては含まない
オリゴヌクレオチドを、別の標識により標識する場合、
同一容器内の二つの対立遺伝子の検定を可能にする。

【０１６０】比較し得る非放射活性検定においては、第
６図に示されるように、最小限二つのオリゴヌクレオチ
ドプローブを合成し、ライゲーション検定の特定の機能
のために修飾する。一つのプローブは、ライゲーション
に従うオリゴヌクレオチドの捕捉を可能にするフックを
含んでいる。このようなフックの一例はビオチンであ
り、これは適当な支持体に結合したアビジンまたはスト
レプトアビジンにより捕捉されることができる。他のプ
ローブはリポーター基を有する。放射性同位体または非
放射活性の両方の様々なリポーター基が入手でき、且つ
発蛍光団または発光原子団のように本発明に係る検定に
使用することができるが、現在好ましいリポーターはＥ
ＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定）に参加し得るリポー
ターである。より詳細には、第６図が、ビオチニル化さ
れた（Ｂ）及びジゴキシゲニン標識された（Ｄ）オリゴ
ヌクレオチドがリガーゼ（矢印）の存在下でＤＮＡ標的
とハイブリダイズする、ＥＬＩＳＡを基礎とするオリゴ
ヌクレオチドライゲーション検定の概略化した図式を示
している。ビオチニル化されたオリゴヌクレオチドは、
微量定量プレートのウェル内部に被覆されたストレプト
アビジン（ＳＡ）上に捕捉される。このウェルを洗浄し
て非結合オリゴヌクレオチドを除去し、アルカリホスフ
ァターゼ（ＡＰ）に結合させた抗ジゴキシゲニン抗体
（Ｄ）をウェルに加える。インキュベーション及び洗浄
サイクルの後、アルカリホスファターゼ基質（Ｓ）を加
え、ジゴキシゲニンを着色生成物の生成により検出す
る。

【０１６１】本発明に係る非放射標識検定は、幾つかの
工程、即ち（１）ＤＮＡ標的の調製；（２）修飾オリゴ
ヌクレオチドプローブの変性及びハイブリダイゼーショ
ン；（３）ライゲーション；（４）ビオチニル化プロー
ブの捕捉；（５）遊離の非ビオチニル化オリゴヌクレオ
チド及び標的を除去するための洗浄；（６）アルカリホ
スファターゼに結合させた抗ジゴキシゲニン抗体の添
加；（７）結合していない抗体を除去するための洗浄；
（８）アルカリホスファターゼ基質の添加；及び（９）
分光光度法による分析、から成り立っている。以下のフ
ローチャートに、本発明に係る非放射標識検定を実施す
る一般的手順（これは改良バイオメック１０００ワーク
ステーション機器上で自動化されている）を詳説する：増幅された標的ＤＮＡＴ４リガーゼ検出Ｔａｑリガーゼ検出０.３ＮＮaＯＨ４５μl ０.１ＮＫＯＨ４５μl の添加により残留するＴａｑポリメラーゼを変性０.３ＮＨＣl４５μl ０.１ＮＨＣl４５μl の添加により標的ＤＮＡを再生微量定量プレートにウェル当り１０μlの増幅された標的を分注ＤＮＡ標的にビオチニル化及びリポーターオリゴヌクレオチドを添加 (１０μlの２ｘライゲーションミックス中各オリゴヌクレオチド２００ｆモル) ライゲーションミックス：ライゲーションミックス：ビオチニル化オリゴ200ｆモルビオチニル化オリゴ200ｆモルリポーターオリゴ200ｆモルリポーターオリゴ200ｆモル 100mMトリスＨＣl、ｐＨ７.５ 100mMトリスＨＣl、ｐＨ７.５ 20mM ＭgＣl_２ 20mM ＭgＣl_２ 10mM ＤＴＴ 10mM ＤＴＴ 2mM ＡＴＰ 2mM ＡＴＰ 2mMスペルミジン 2mMスペルミジン 50％ホルムアミド 2mM ＮＡＤ 100mM ＫＣl Ｔaqリガーゼ９３℃で２分間標的オリゴヌクレオチドミックスを変性室温に冷却し、６０−６８℃に冷却し１５分間ライゲ 200mM ＮaＣl ーション（変性及びライゲーション工 50mMトリスＨＣl、ｐＨ７．５呈を反復して増幅） 10mM ＭgＣl_２ 5mM ＤＴＴ 1mM ＡＴＰ 1mMスペルミジン中のＴ４リガーゼ５μlを添加室温（２５℃）で１５分間ライゲーションライゲーション反応を停止し、０.３ＮＮaＯＨ１０μ
lの添加により生成物を変性３Ｍ酢酸ナトリウム４μlの添加により反応物を中和反応物をアビジン被覆しブロックした微量定量プレート
に移す（アビジン被覆 − ＰＢＳ（ｐＨ７.０）６０μl
中アビジン６０μg／ウェルを３７℃で６０分間；ブロ
ッキング − アビジンをプレートから除去し、１００mM
トリスＨＣl、１５０mM ＮaＣl、０.０５％トゥイー
ン、０.５％ドライミルク、及び１００μg／ｍｌの鮭精
子ＤＮＡ２００μl／ウェルを添加) 室温で３０分間ビオチニル化オリゴヌクレオチドを捕捉結合していないオリゴヌクレオチド及び標的を除去する
ために、（１）０.０５％トゥイーン中１５０mM ＮaＣ
l中１００mMトリスＨＣl（ｐＨ７.５）;（２）０.０５
％トゥイーン中０.０１ＮＮaＯＨ；及び（３）０.０
５％トゥイーン中１５０mM ＮａＣl中１００mMトリス
ＨＣl（ｐＨ７.５）でプレートを洗浄リポーターオリゴヌクレオチドにアルカリホスファター
ゼ結合抗体を添加；１００mMトリスＨＣl（ｐＨ７.
５）、１５０mM ＮａＣl、０.５％ドライミルク及び
０.０５％トゥイーン中３０μl／ウェル抗体をリポーターに結合させるためプレートを室温で３
０分間インキュベーションプレートを０.０５％トゥイーン中１００mMトリスＨＣl
（ｐＨ７.５）、１５０mM ＮaＣlで洗浄して非結合抗
体を除去基質を添加適当な比色、化学ルミネセンス、または蛍光産物につい
てプレートを読み取る

【０１６２】この検定を開始するのに必要なゲノム配列
は、ＬＣＲ、３ＳＲ、及びＰＣＲを含む幾つかの異なっ
た方法によって増幅することができる。本発明者等は、
ＰＣＲ増幅を使用して、以下の第６表に列挙される訴訟
検定のプライマーのためのＤＮＡ標的を取得した。第６表

【表２１】

【０１６３】ＤＮＡ５μl（ゲノムＤＮＡについては２
ｎｇ／μlまたはこれに代わる供給源からの処理試料５
μl）を、０．０５Ｕ／μlのＴａｑポリメラーゼ、５０
mM ＫＣｌ、２５mMトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．
３）、１０mM ＭgＣl_２、２００μg／ｍｌのゼラチ
ン、０．１％トリトンＸ−１００、及び各々１．５mMの
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含有する
ＰＣＲ緩衝液中で、増幅すべきＤＮＡ領域に特異的な一
対のプライマーオリゴヌクレオチド（各々０．５μＭ）
と混合することにより、ＤＮＡ増幅を実施した。この試
料を軽鉱油６０μlで覆い、９３℃で５分間標的を変性
させ、そして９３℃２０秒間、５５℃４０秒間、及び７
２℃１分間より成るサイクルに４０回付した。温度循環
に続き、この試料を１０分間７２℃に付してＤＮＡ試料
の伸長を完結させた。

【０１６４】オリゴヌクレオチドをこのライゲーション
検定における特定の機能のために合成し修飾する。この
検定は最小限二つの修飾オリゴヌクレオチドを必要とす
る。一方のオリゴヌクレオチドは、ライゲーションに従
うオリゴヌクレオチドの捕捉を可能にするフックを有す
る。この一例は、ストレプトアビジンまたはアビジン支
持体上に捕捉され得るビオチニル化オリゴヌクレオチド
である。他方のオリゴヌクレオチドはリポーター基を有
し、これは、発蛍光団リポーターの場合、異なった発光
スペクトルを有する多数のリポーターを容易に単一の検
定に組み入れることができる。

【０１６５】ＥＬＩＳＡを基礎とする系のためには、遺
伝子の対立遺伝子型を判別するプローブを５'ビオチン
基をもって合成する。リポータープローブは酵素的また
は化学的に５'−ホスホリル化し、ハプテンジゴキシゲ
ニンによって標識する。オリゴヌクレオチド５００ｐＭ
を、１０mMカコジル酸カリウム（ｐＨ７．０）、１mMＣ
ｏＣｌ２、０．１mM ＤＴＴ、５ｎＭジゴキシゲニンｄ
ＵＴＰ、０．０５μＭｄＡＴＰ、及び酵素ターミナル
トランスフェラーゼ１００単位（総容量２０μl）中で
３７℃で１時間テーリングする事により、ハプテンをリ
ポータープローブの３'末端に付加する。標識後、３Ｍ
酢酸ナトリウム２μl及び酵母ｔ−ＲＮＡ（１ｍｇ／ｍ
ｌ）１μl及び９５％エタノール６０μlを加える。オリ
ゴヌクレオチドを４℃で５分間沈澱化し、次いで６５０
０ｘｇで５分間の遠心によって集める。ペレットを蒸留
水２０μlに再懸濁し、この工程を反復する。この沈澱
化は、結合していない過剰のジゴキシゲニンを標識され
たプローブから除去する。３種の病理学的状態について
の対立遺伝子を判別するオリゴヌクレオチドの例を以下
の第７表に示す。

【０１６６】第７表

【表２２】

【０１６７】前記のフローチャートに含まれる手順を使
用して幾つかの実験を実施し、発色の後４９０ｍＮの波
長においてデータを分光光度的に得た。このような試験
についての典型的な結果を以下の第８表に作表した。第８表

【表２３】

【０１６８】Ｔ４またはＴａｑリガーゼのいずれかにつ
いて比較可能な検出レベルが得られた。さらに、他の幾
つかの疾病関連多形性について幾つかのライゲーション
反応を実施し、同様の結果を得た。加えて、ヒトＴ細胞
レセプター座における８つの異なった多形性を調べ、類
似の検出結果を得た。故に本発明は、単一の塩基の置
換、ＤＮＡ欠失または挿入、またはＤＮＡ翻訳からなる
ＤＮＡ多形性の分析に一般に適用可能であると思われ
る。

【０１６９】さらに、幾つかのアルカリホスファターゼ
基質が、感受性化学ルミネセント基質（１０アットモル
検出）を含む本発明のＥｌＩＳＡ検定に使用できる。こ
の検定のフォーマットは、適当な微量定量フォーマット
において読み取ることのできる、発蛍光団のような他の
リポーターフォーマットに対して容易に適合する。適当
な発蛍光団フォーマットを組み入れることにより、例え
ばライゲーションによる複合分析が可能となる。この計
画において、異なった対立遺伝子及び／または異なった
遺伝子を判別するオリゴヌクレオチドが単一の検定で評
価できる。さらに、直列のライゲーション検定（鎖状態
のオリゴヌクレオチドのライゲーション）を、主要組織
適合複合体遺伝子に存在するような間隔の密なＤＮＡ多
形性の評価に使用することもまた可能である。特に上に
述べた検定に対するこのような修飾は、充分本発明の範
囲内にあると考えられる。

【０１７０】本発明は、広範囲のＤＮＡ診断スクリーニ
ングに使用できる。例えば、係るＤＮＡ診断スクリーニ
ングは以下の要約に従ったスクリーニングを包含し得る
が、本発明の範囲をこれに限定する事を意図する訳では
ない：Ａ．伝染性疾患１．ウイルス疾患：ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ、
ＣＭＶ、肝炎（非Ａ、非Ｂ） (i)血液及び組織スクリーニング (ii)迅速な同定 (iii)過去の暴露から慢性の感染を識別 (iv)混合感染中の耐性菌株を識別２．細菌疾患：マイコバクテリア、梅毒、クラミジア、
レジオネラ、カンピロバクター、ニューモノシティス、
リステリア、ライム、癩 (i)ゆっくりと増殖する微生物の迅速な同定 (ii)免疫不全患者の同定 (iii)食物汚染の試験３．寄生虫疾患：マラリア、トリパノソーム、リーシュ
マニア (i)「第三世界」の血液疾患の迅速な同定 (ii)旅行者及び軍隊のスクリーニングＢ．遺伝疾患１．単対立遺伝子疾患：嚢胞性線維症、デュシェン筋ジ
ストロフィー、鎌状赤血球貧血、β−地中海貧血、血友
病Ａ、ゴーシェー、テイサックス、アルスハイマー、神
経線維腫症２．癌：網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、大腸癌、乳
癌、腫瘍遺伝子、腫瘍抑制因子３．複対立遺伝子疾患：冠動脈心疾患、糖尿病、高血
圧、精神分裂病、躁鬱病、アルコール中毒 (i)疾病素因 (ii)予防的医薬、運動、食餌 (iii)遺伝的スクリーニングおよびカウンセリング (iv)遺伝子治療Ｃ．遺伝学的同定１．人間：ＨＬＡ分類、法医学 (i)組織移植 (ii)遺伝子連鎖分析 (iii)ヒトゲノムプログラム (iv)行方不明の子供の肯定的同定２．動物：馬、乳牛、畜牛、家庭の愛玩動物 (i)純粋な遺伝的形質 (ii)血統の確認 (iii)動物の肯定的同定３．植物：種 (i)遺伝的多様性の保証 (ii)干ばつ及び病気に対する耐性種の同定

【０１７１】このように本発明者等は本発明の好ましい
態様を説明及び記載してきたが、この発明は変化及び修
飾を施すことができ、故に本発明者等は開示された正確
な用語に制限されることを望まず、本発明を様々な用途
及び条件に適合させるためになされるこのような変化お
よび変更を利用することを望むということが理解される
べきである。したがってこのような変化および変更は、
正しくは同等物の範囲全体の中にあるよう、そして故に
以下の請求項の範囲内にあるよう、意図されている。

【０１７２】本発明の属する、または本発明が最も密接
に関連する分野における通常の知識を有するいかなる者
も本発明を作成及び使用できるよう、本発明及び方法及
びこれを作成及び使用する工程を、このように完全な、
明快な、簡潔な且つ正確な用語で記載してきたが、

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図はプラスミドｐＤＺ１およびｐＤＺ７
を図示したものである。

【図２】第２図はこの発明のリガーゼ連鎖反応（ＬＣ
Ｒ）のフローチャートを示す。

【図３】第３図は、この発明のＬＤＲおよびＬＣＲ増
幅条件下におけるサーマス・アクアチカスの好熱性リガ
ーゼの特異性を説明するオートラジオグラムである。

【図４】第４図は、さまざまな標的濃度におけるＬＣ
Ｒ増幅を説明するオートラジオグラムである。

【図５】第５図は、ヒトゲノムＤＮＡを使用したβグ
ロビン対立遺伝子の検出を説明するオートラジオグラム
である。

【図６】第６図は、この発明によるオリゴヌクレオチ
ド定量に基づくエリザ（ＥＬＩＳＡ）の概略図である。

【図７】第７図は、この発明による熱安定リガーゼの
ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動のさま
ざまな精製段階における写真による説明である。

【図８】第８図は、この発明による熱安定リガーゼの
ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動のさま
ざまな精製段階における第２の写真による説明である。

【図９】第９図は、この発明によって調製した３種の
クローンを図示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (71)出願人 399129696 カリフォルニア・インスティテュート・オブ・テクノロジーＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡＩＮＳＴＩＴＵＴＥＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹアメリカ合衆国91125カリフォルニア州パサディナ、イースト・カリフォルニア・ブールバード1200番 (72)発明者フランシス・バーラーニイアメリカ合衆国10000ニューヨーク、ニューヨーク、ヨーク・アベニュー1161番 (72)発明者ジョン・ジイバラアメリカ合衆国10000ニューヨーク、ニューヨーク、イースト・セブンティス・ストリート420番 (72)発明者デバラ・エー・ニッカーソンアメリカ合衆国91106カリフォルニア、パサディーナ、サン・パスカル・ストリート 975番 (72)発明者ロバート・ジェー・カイザー・ジュニアアメリカ合衆国91206カリフォルニア、グレンデール、モンテレイ・ロード897番 (72)発明者ラロイ・フッドアメリカ合衆国91106カリフォルニア、パサディーナ、イースト・カリフォルニア 1453番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＡＴＣＣ５５０３２と命名された細胞系
ＡＫ７６。
【請求項２】ｐＤＺ１から選ばれ、ＡＴＣＣ６８３０
７と命名されたプラスミド、およびｐＤＺ７から選ば
れ、ＡＴＣＣ６８３０８と命名されたプラスミド。
【請求項３】本質的に好熱性サーマス・アクアチカス
ＨＢ８株リガーゼ酵素を暗号化しているＤＮＡ配列を含
むそのような配列へ高度緊縮下にハイブリッド形成す
る、単離され精製されたＤＮＡ断片または核酸配列。
【請求項４】核酸配列【表１】【表２】を有する熱安定リガーゼを暗号化している部分配列を含
む、そのような断片へ高度緊縮下にハイブリッド形成す
る、単離され精製されたＤＮＡ断片または核酸配列。
【請求項５】 (１)サーマス・アクアチカスＨＢ８リガ
ーゼ、(２)サーマス・アクアチカスＨＢ８リガーゼ中の
６連続アミノ酸残基に対応する少なくとも６連続アミノ
酸残基を有する熱安定リガーゼ、および(３)リガーゼま
たはその断片のアミノ酸配列中で、アミノ酸残基を挿入
し、置換し、または欠失したサーマス・アクアチカスＨ
Ｂ８リガーゼまたはその断片のリガーゼ活性を有する変
異体を含んだ群から選ばれた、熱安定リガーゼを暗号化
しているＤＮＡ配列を含んでいる発現ベクター。
【請求項６】約５０℃〜約８５℃の温度で２本鎖ＤＮ
Ａ中の１本鎖切断部位でリン酸ジエステル結合の生成を
触媒し、９０℃〜約１０５℃の温度へ上昇しても、不可
逆的に変性されず、その触媒能を失わない単離され精製
されたポリペプチド。
【請求項７】アミノ酸配列【表３】【表４】【表５】を有する単離され精製されたポリペプチド。
【請求項８】ポリペプチドが、約５０℃〜約８５℃の
温度で２本鎖ＤＮＡ中の１本鎖切断部位でリン酸ジエス
テル結合の生成を触媒し、約９０℃〜約１０５℃の温度
で処理しても、不可逆的に変性されず、その触媒能を失
わないサーマス・アクアチカス・リガーゼの発現を暗号
化しているベクターで形質転換された組換え体生物から
単離され精製されたポリペプチド。
【請求項９】約５０℃〜約８５℃の温度で、ＤＮＡの
相補鎖へハイブリッド形成された２つの隣接オリゴヌク
レオチド間でリン酸ジエステルの生成を触媒する、単離
され精製されたリガーゼ。
【請求項１０】約５０℃〜約８５℃の温度で相補的な
ＤＮＡの標的配列へ２つの隣接オリゴヌクレオチドをハ
イブリダイズするライゲーションを触媒し、そのライゲ
ーションで生成した生産物が隣接オリゴヌクレオチドの
接合部で１つの塩基ミスマッチがある場合の約５０〜約
５００倍以上である単離され精製されたリガーゼ。
【請求項１１】約０.２５分間〜約４分間、約９０℃
〜約１０５℃の温度へ反復して予熱したのち、約５０℃
〜約８５℃の温度でＤＮＡの相補鎖へハイブリッド形成
された２つの隣接オリゴヌクレオチドの間でリン酸ジエ
ステルの生成を触媒する触媒能を保有する単離され精製
されたリガーゼ。
【請求項１２】約５０℃〜約８５℃の温度でＤＮＡの
相補鎖へハイブリッド形成された２つの隣接オリゴヌク
レオチドの間でリン酸ジエステルの生成を触媒する触媒
能を保有し、約０.２５分間〜約４分間、約９０℃〜約
１０５℃の温度へ反復して予熱したのち、そのライゲー
ションで生成した生産物が隣接オリゴヌクレオチドの接
合部で１つの塩基ミスマッチがある場合の約５０〜約５
００倍以上である単離され精製されたリガーゼ。