DE69133582T2

DE69133582T2 - Ein system der dna amplifikation zur detektion genetischer erkrankungen durch eine thermostabile ligase

Info

Publication number: DE69133582T2
Application number: DE69133582T
Authority: DE
Inventors: Francis New York BARANY; John New York ZEBALA; Deborah A. Pasadena NICKERSON; Robert J. Glendale KAISER; Leroy Pasadena HOOD
Original assignee: California Institute of Technology CalTech; Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: California Institute of Technology CalTech; Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1990-05-03
Filing date: 1991-04-29
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2011-04-30
Also published as: JPH05508764A; ATE375392T1; ES2294777T3; EP1507000B1; WO1991017239A1; JP3889807B2; DE69133629D1; EP0528882B1; ATE459709T1; JP2004089204A; DK0528882T3; EP0528882A1; JP2001269187A; EP0528882A4; EP1507000A2; EP1507000A3; DE69133582D1

Description

Mehr als 2.000 Leiden sind als Einzelgendefekte ermittelt worden, bei denen das Risiko, einen erkrankten Nachkommen zu zeugen, mathematisch vorausberechnet werden kann. Zu diesen Leiden gehören beim Menschen die Huntingtonsche Chorea, die Zystofibrose der Bauchspeicheldrüse, der Alpha-1-Antitrypsinmangel, die Muskeldystrophie, das Huntersche Syndrom, das Lesch-Nyhan-Syndrom, das Down-Syndrom, die Tay-Sachssche Krankheit, die Bluterkrankheit, die Phenylketonurie, die Thalassämie und die Sichelzellenanämie.
In letzter Zeit sind drei wichtige Verfahren für den direkten Nachweis dieser Veränderungen, Auslassungen bzw. Deletionen, Einfügungen bzw. Insertionen, Translokationen oder anderer Mutationen einzelner Nukleinsäurebasenpaare entwickelt worden. Zwei dieser Verfahren können aber nicht ohne weiteres automatisiert werden. Bei dem ersten dieser Verfahren wird das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der Mutation in der einem Patienten entnommenen klinischen Probe durch die Analyse eines DNA-Restriktionsverdaus eines Patienten unter Verwendung des Southern-Blotting-Verfahrens [siehe Journal of Molecular Biology 98: 503 (1975)] nachgewiesen. Jedoch das Southern-Blotting-Verfahren kann nicht für Erbkrankheiten verwendet werden, bei denen die Mutation einen Restriktionsort nicht verändert, wie z. B. beim Alpha-1-Antitrypsinmangel. Das zweite Verfahren besteht in der Verwendung von DNA-Sonden, bei dem die Synthese eines Oligonukleotids von ungefähr 19 Basenpaaren erfolgt, das der normalen DNA-Sequenz rund um die Mutationsstelle komplementär ist. Die Sonde wird markiert und verwendet, um normale Gene von mutierten Genen durch die Erhöhung der Stringenz der Hybridisierung auf ein Niveau zu unterscheiden, auf dem die Sonde sich in beständiger Weise zu dem normalen Gen hybridisiert, aber nicht zu dem mutierten Gen, bei dem es eine einzelne Basenpaarfehlpaarung aufweist [siehe Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 278 (1983)]. Das ursprüngliche Verfahren ist durch die Immobilisierung des Oligonukleotids und das Sondenprüfverfahren mit einer markierten und mittels einer PCR amplifizierten Probe modifiziert worden. Bei dieser Modifizierung darf die Probe zu einem immobilisierten Oligonukleotid hybridisieren und wird dann durch die Erhöhung der Stringenz der Hybridisierung ausgewaschen, wie oben beschrieben [siehe Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230 (1989)]. Es sind aber auch andere Verfahren entwickelt worden, die fluoreszierende PCR-Primer nutzen, um speziell nur eine Mutation oder ein Allel zu amplifizieren [siehe Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9178 (1989)]. Dieses Verfahren verlangt die Trennung der Produkte von den Primern durch Zentrifugenröhrchen oder Gelelektrophorese und ist daher für eine Automatisierung im großen Maßstab nicht anwendbar. Das dritte Verfahren nutzt das Vorhandensein sowohl von Diagnosesonden als auch von angrenzenden Sonden unter Bedingungen, bei denen die Diagnosesonde in erheblichem Maße kovalent an die angrenzende Sonde nur in dem Falle gebunden bleibt, wenn die Nukleinsäure der Probe die exakte Zielsequenz enthält. Außerdem kann die diagnostische Oligonukleotidsonde einen „Haken" enthalten (z. B. ein biotinyliertes Oligonukleotid), der (z. B. durch Streptavidin) als ein Mittel zur Erhöhung der Wirksamkeit des Verfahrens eingefangen wird. Und die angrenzende Sonde kann eine nachweisbare Hälfte (von zwei Teilen) oder einen nachweisbaren Marker enthalten [siehe Science 241: 1077 (1988) und das US-Patent 4.883.750 ].
Obwohl es nicht immer erforderlich ist, gehen dem Nachweis von Mutationen eines einzelnen Basenpaares in der DNA gewöhnlich Verfahren zur Erhöhung oder Vergrößerung der Menge des DNA-Probenmaterials voraus. Dafür gibt es eine Reihe von Verfahren zur Durchführung der Vermehrung der Nukleinsäure, zu denen folgende gehören: (1) die Polymerase-Kettenreaktion, die im Verlauf weniger Stunden eine einzige Kopie millionenfach vervielfältigen kann, indem die Taq-Polymerase zur Anwendung kommt und 20 bis 30 Reaktionszyklen in einem Temperaturzyklusgerät durchgeführt werden [siehe Science 239: 487 (1988) und die US-Patente 4.683.195 , 4.683.202 und 4.800.159 ]; (2) eine sich selbst unterhaltende Sequenzreplikation oder 3SR kann die DNA oder RNA aus einer einzigen Kopie in weniger als einer Stunde zehnmillionenfach vervielfältigen, und zwar unter Verwendung einer reversen Transkriptase, T7 RNA-Polymerase und RNase H unter isothermischen Bedingungen bei 37°C [siehe Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874 (1990)]; und (3) die Q Beta Replikase kann einige tausend RNA-Moleküle, die eine spezielle 300 bp Erkennungssequenz enthalten, in 30 Minuten billionenfach replizieren. Es stehen auch noch weitere Verfahren zur Verfügung und von einem dieser Verfahren, der Ligase-Kettenreaktion, wird in der nun folgenden Beschreibung der klonierten thermophilen Ligase die Rede sein.
Außer verschiedenen Erbkrankheiten, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung diagnostiziert werden können, können auch verschiedene Infektionskrankheiten in einer klinischen Probe bei Vorliegen einer spezifischen DNA-Sequenz diagnostiziert werden, die charakteristisch für verursachende Mikroorganismen ist. Zu ihnen gehören Bakterien, Viren und Parasiten. Bei solchen Verfahren kann eine relativ kleine Anzahl von pathogenen Organismen in einer klinischen Probe von einem infizierten Patienten vorhanden sein und die aus diesen Organismen gewonnene DNA kann möglicherweise nur einen sehr kleinen Teil der gesamten DNA in der Probe bilden. Aber die spezifische Vermehrung der verdächtigen krankheitserregerspezifischen Sequenzen vor der Immobilisierung und vor dem Nachweis durch die Hybridisierung der DNA-Proben sollten die Empfindlichkeit und Spezifität der traditionellen Verfahren bedeutend verbessern. Außerdem ist die Vermehrung besonders dann von Nutzen, wenn eine solche Analyse mit einer kleinen Probe durchzuführen ist, und zwar unter Verwendung nichtradioaktiver Nachweisverfahren, die von Natur aus unempfindlich sein können, oder wo zwar radioaktive Verfahren zum Einsatz kommen, aber ein schneller Nachweis erwünscht ist.
Obwohl solche Verfahren wie diese zur Verfügung stehen, geht die Suche nach anderen Verfahren zur Bestimmung von Mutationen einzelner Basenpaare weiter. Die vorliegende Erfindung, d. h. die DNA-Amplifikation durch eine Ligase-Kettenreaktion (LCR) unter Verwendung der thermophilen DNA-Ligase aus Thermus aquaticus zum Nachweis einer DNA-Zielsequenz, ist Teil dieser fortgesetzten Anstrengungen.
Obwohl auch andere Verfahren unter Verwendung von E. coli oder T4 DNA-Ligase zur DNA-Amplifikation versucht worden sind, hat man festgestellt, dass diese Verfahren wegen eines hohen "Hintergrundgeräuschpegels" (nach bereits zehn Zyklen) inakzeptabel sind. Das ist ein Umstand, der gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Ligase-Kettenreaktion nicht auftritt.
Die DNA-Amplifikation und/oder der DNA-Nachweis ist auch unter Verwendung spezifischer Ligasen versucht worden. So z. B. ist von einer Ligase-Amplifikationsreaktion berichtet worden [siehe Gene 76: 245 (1989)], die die DNA beginnend mit 500.000 Kopien in 95 Stunden vermehren kann, indem 75 Zyklen durchgeführt wurden und die T4 DNA-Ligase, die nach jedem Zyklus verbraucht war, wieder aufgefüllt wurde. Allerdings ist dieses gemeldete Verfahren langsam und erfordert bei jedem Schritt die Zuführung frischer T4 Ligase, wobei beide Voraussetzungen dieses gemeldete Verfahren für die Automatisierung inakzeptabel machen. Die Ligase-Kettenreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Amplifikation der DNA aus 200 Kopien in 3 Stunden im Verlauf von 30 Zyklen und verlangt keine Ligasezufuhr nach jedem Zyklus.
In der gesamten folgenden Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird die für das technische Gebiet spezifische Terminologie verwendet. Um jegliche Missverständnisse in Bezug auf die erwähnten Begriffe zu vermeiden, und um dem Leser ein klares Verständnis der Beschreibung zu ermöglichen, werden die folgenden Definitionen verwendet werden:

"Amplifikation" bezieht sich auf die Erhöhung der Anzahl der Kopien eines bestimmten Nukleinsäurefragments, die sich entweder aus einer enzymatischen Kettenreaktion (wie z. B. einer Polymerase-Kettenreaktion, einer Ligase-Kettenreaktion oder einer Sequenz-Selbstreplikation) oder aus der Replikation des Vektors, in den es kloniert worden ist, ergibt.
"Ligation glatter Enden" [Blunt-End-Ligation] bezieht sich auf die kovalente Verknüpfung zweier Enden der DNA, die vollständig glatt sind, d. h. sie haben keine Überhänge der kohäsiven Enden.
Die Begriffe "Zelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" können austauschbar verwendet werden und alle diese Bezeichnungen schließen entsprechende Ableitungen ein. Folglich umfassen die Wörter "Transformante" oder "transformierte Zelle" auch die daraus abgeleiteten Primärsubjektzellen und -kulturen, und zwar ungeachtet der Anzahl der Übertragungen. Es versteht sich auch von selbst, dass alle Ableitungen beim DNA-Gehalt auf Grund absichtlicher oder unabsichtlicher Mutationen nicht genau identisch miteinander sind. Es gehören jedoch alle mutierten Ableitungen mit der gleichen Funktionalität dazu, nach der in der ursprünglich transformierten Zelle gesucht wurde.
"Klon" bezieht sich auf eine Gruppe genetisch identischer Moleküle, Zellen oder Organismen, die ohne geschlechtlichen Prozess von einem gemeinsamen Vorfahren abstammen. "Klonierung" ist der Prozess der Vermehrung derartiger identischer Moleküle, Zellen oder Organismen. DNA-Rekombinationstechniken ermöglichen die Klonierung einzelner Gene; so etwas wird als "molekulare Klonierung" bezeichnet.
"Kovalentes Anheften" bezieht sich auf die Bildung einer kovalenten chemischen Bindung zwischen zwei Substanzen.
"Zyklus" bezieht sich auf einen einzelnen Schmelz- und Abkühlungsvorgang der DNA. So z. B. entwinden sich und schmelzen alle doppelsträngigen DNA (unabhängig von der Länge) bei solchen sehr hohen Temperaturen, wie z. B. 94°C. Wenn man die Temperatur (auf 45–65°C) in Gegenwart von komplementären Oligonukleotiden abkühlt, können sie zu den korrekten Sequenzen der entwundenen, geschmolzenen DNA hybridisieren. Die DNA, die in Gegenwart komplementärer Oligonukleotide geschmolzen und abgekühlt worden ist, ist jetzt ein Substrat für die DNA-Ligasereaktion. Siehe "T_m".
"Diagnostischer Abschnitt" bezieht sich auf jenen Abschnitt der Zielsequenz, der die Nukleotidveränderung enthält, deren Vorhandensein oder Nichtvorhandensein nachzuweisen ist. "Angrenzender Abschnitt" bezieht sich auf eine Sequenz der DNA, die eine Fortsetzung der Nukleotidsequenz jenes Abschnitts der Sequenz ist, der als diagnostischer Abschnitt ausgewählt worden ist. Die Fortsetzung kann in beiden Richtungen erfolgen.

Ausgehend von der folgenden Beschreibung wird man erkennen, dass die genaue Position des ausgewählten Oligonukleotids, das den diagnostischen Abschnitt enthält, willkürlich ist, mit Ausnahme der Bedingung, dass sie das Nukleotid (die Nukleotide) enthalten muss, das (die) das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der Zielsequenz an einem seiner Enden unterscheiden muss (müssen). Somit setzt das Oligonukleotid, das den angrenzenden Abschnitt enthält, die Sequenz dieses willkürlich ausgewählten Oligonukleotids fort, das den diagnostischen Abschnitt enthält, so dass sich das diagnostische Nukleotid (die diagnostischen Nukleotide) an der Verknüpfungsstelle der beiden Oligonukleotide befindet (befinden).

"Endonuklease" bezieht sich auf ein Enzym (z. B. Restriktionsendonuklease, DNase I), das die DNA an bestimmten Stellen innerhalb des Moleküls schneidet.
"Expressionssystem" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die eine erwünschte Kodierungssequenz und Kontrollsequenz bei durchführbarer Kopplung auf eine solche Art und Weise enthalten, dass mit diesen Sequenzen transformierte Wirtsorganismen in der Lage sind, die kodierten Proteine zu produzieren. Um eine Transformation zu bewirken, kann das Expressionssystem in einen Vektor einbezogen werden oder die transformierte Vektor-DNA kann auch in das Wirtschromosom eingebaut werden.
"Gen" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die ein wieder gewinnbares, biologisch aktives Polypeptid oder einen Vorläufer kodiert. Das Polypeptid kann durch eine vollständige Gensequenz oder irgendeinen Abschnitt der kodierenden Sequenz kodiert werden, solange die enzymatische Aktivität bewahrt wird.
"Genbibliothek" oder "Bibliothek" bezieht sich auf eine Sammlung zufällig klonierter Fragmente, die im Wesentlichen das gesamte Genom einer bestimmten Spezies umfassen. Man bezeichnet das auch als Klonbank oder Shotgun-Sammlung.
"Genom" bezieht sich auf die gesamte DNA eines Organismus.
"Haken" meint die Modifizierung einer Sonde, die den Nutzer in die Lage versetzt, schnell und zweckmäßig die diese Modifizierung enthaltenden Sonden durch das "Einfangen" des Hakens zu isolieren. Das Zusammenwirken zwischen Haken und Fangmechanismus kann z. B. eine kovalente Bindung oder eine Liganden/Rezeptor-Bindung von ausreichender Affinität sein. Derartige Haken können Antigene enthalten, die durch Antikörper zurückgewonnen werden können, aber auch Biotin, das durch Avidin oder Streptavidin zurückgewonnen werden kann, spezifische DNA-Sequenzen, die durch komplementäre Nukleinsäure zurückgewonnen werden können, oder DNA-Bindungsproteine (Repressoren) und spezifische reaktionsfähige chemische Funktionalitäten enthalten, die durch andere geeignete reaktionsfähige Gruppen zurückgewonnen werden können.
"Hybridisierung" und "Bindung" im Kontext mit Sonden und denaturierter, geschmolzener DNA können austauschbar verwendet werden. Sonden, die hybridisiert oder an denaturierte DNA gebunden werden, weisen eine Basenpaarung auf oder werden zu komplementären Sequenzen im Polynukleotid "aggregiert". Ob eine bestimmte Sonde die Basenpaarung behält oder mit dem Polynukleotid aggregiert bleibt oder nicht, hängt vom Grad der Komplementarität, der Länge der Sonde und der Stringenz der Bindungsbedingungen ab. Je höher die Stringenz, umso höher muss der Grad der Komplementarität und/oder umso länger muss die Sonde sein.
"Klenow-Fragment" bezeichnet ein 76.000 Dalton großes Polypeptid, das durch partielle proteolytische Verdauung von DNA-Polymerase I gewonnen wird. Dieses Enzym verfügt über die 5'→3' Polymerase- und 3'→5' Exonuklease-Aktivitäten, aber nicht über die 5'→3' Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase I.
"Marker" bezieht sich auf eine Veränderung an der Sonden-Nukleinsäure, die den Nutzer befähigt, die markierte Nukleinsäure in Gegenwart von unmarkierter Nukleinsäure zu bestimmen. Ganz allgemein ausgedrückt, ist das die Substitution eines Atoms oder mehrerer Atome mit radioaktiven Isotopen. Aber auch andere Marker können als Ersatz für die Isotopen dienen, wie z. B. kovalent gebundene Chromophoren, fluoreszierende Komponenten, Enzyme, Antigene, Gruppen mit spezifischer Reaktionsfähigkeit, chemilumineszierende Komponenten und elektrochemisch bestimmbare Komponenten.
"Ligase" bezeichnet ein Enzym, das die Bildung einer Phosphodiesterbindung am Ort eines Einzelstrangbruches in einer doppelsträngigen DNA katalysiert. Das Ligaseenzym katalysiert auch die kovalente Bindung einer doppelsträngigen DNA; glattes Ende an glattes Ende oder ein kohäsives Ende an ein anderes komplementäres kohäsives Ende.
"Ligase-Kettenreaktion (LCR = Ligase Chain Reaction)" bezieht sich auf die Amplifikation eines Oligonukleotidligationsproduktes. Wenn z. B. Oligonukleotide synthetisiert werden, so dass die DNA-Produkte eines Zyklus die DNA-Substrate des nächsten Zyklus werden können, wird die Wiederholung solcher Zyklen eine exponentielle Amplifikation der DNA hervorrufen (eine "Kettenreaktion"). Da ein thermophiles Ligase-Enzym in der Lage ist, während vieler DNA-Schmelz- und Abkühlzyklen aktiv zu bleiben, ermöglicht das einer DNA-Amplifikation, in einem einzelnen Reaktionsgefäß schnell und automatisch vonstatten zu gehen, und zwar in Abhängigkeit von vielen thermischen Zyklen, in denen das Oligonukleotidligationsprodukt amplifiziert wird.
"Ligase-Nachweisreaktion (LDR = Ligase Detection Reaction)" bezieht sich auf die Verwendung zweier benachbarter Oligonukleotide für den Nachweis spezifischer Sequenzen mit Hilfe einer thermophilen Ligase mit linearer Produktamplifikation.
"Ligase-DNA-Sequenz" bezieht sich auf die DNA-Sequenz in Thermus aquaticus HB8 für die thermophile Ligase, die am Amino-Terminus des Ligaseproteins die folgende Nukleinsäuresequenz aufweist.

Die entsprechenden Aminosäuren sind:

"Ligieren" bezieht sich auf das Anheften von Polynukleotidsequenzen, um eine einzige Sequenz zu bilden. Das erfolgt in typischen Fällen durch die Behandlung mit einer Ligase, die die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen dem 5'-Ende einer Sequenz und dem 3'-Ende der anderen Sequenz katalysiert. Aber im Kontext der Erfindung ist beabsichtigt, dass der Begriff "Ligieren" auch andere Verfahren zum kovalenten Anheften solcher Sequenzen umfasst, z. B. durch chemische Mittel. Die Begriffe "kovalentes Anheften" und "Ligieren" können auch austauschbar verwendet werden.
Die "Einzelstrangbruch-Schließaktivität" bezieht sich auf die kovalente Bindung benachbarter DNA-Stränge. Sie kann zur Anwendung kommen, um eine Prüfung auf Ligaseaktivität durchzuführen, und zwar anhand der Umwandlung einer offenen, ringförmigen DNA (OCDNA) in eine ringförmige, doppelsträngige DNA (CCCDNA) und mit Hilfe der Bestimmung der Geschwindigkeit, mit der die als Testmaterial dienende DNA auf einem mit Ethidiumbromid angefärbten Agarose-Gel wandert (OCDNA wandert langsamer als CCCDNA).
"Oligonukleotid" bezieht sich auf ein Molekül, das zwei oder mehrere Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide aufweist, und zwar vorzugsweise mehr als drei. Seine genaue Größe wird von der eigentlichen Funktion oder Verwendung des Oligonukleotids abhängen. Das Oligonukleotid kann synthetisch oder durch Klonierung hergestellt werden.
"Funktionsfähig verbunden" bezieht sich auf eine Aneinanderlagerung, so dass die normale Funktion der Komponenten erfüllt werden kann. Folglich bezieht sich eine zur Steuerung der Sequenzen "funktionsfähig verbundene" Kodierungssequenz auf eine Konfiguration, in der die Kodierungssequenzen unter der Kontrolle der Steuersequenzen exprimiert werden können.
"Bakterienstamm mit Überproduktion" bezieht sich auf einen Bakterienstamm oder auf eine andere Wirtszelle, die dazu gebracht werden kann, ein bestimmtes Enzym oder eine chemische Substanz in überschüssiger Menge zu erzeugen.
"Polymerase" bezieht sich auf Enzyme, die die Zusammensetzung der Desoxyribonukleotiden zur DNA katalysieren.
"Polymerase-Kettenreaktion (PCR = Polymerase Chain Reaction)" bezieht sich auf einen patentierten Prozess (beschrieben in den US-Patenten 4.683.202 und 4.683.195 ) für die exponentielle Amplifikation eines spezifischen DNA-Fragments durch die Nutzung von zwei Oligonukleotidprimern, die zu entgegengesetzten Strängen hybridisieren und den interessanten Bereich in einer Target-DNA flankieren. Der Prozess besteht aus einer sich wiederholenden Reihe von Zyklen, die eine Matrizendenaturierung, das Aufschmelzen eines Primers und die Verlängerung der aufgeschmolzenen Primer durch Taq-DNA-Polymerase umfassen.
"Sonde" bezieht sich auf ein Oligonukleotid, das zu einer Sequenz in einer zu sondierenden (in Bezug auf ihre Länge), denaturierten Nukleinsäure ausreichend komplementär sein soll, um unter ausgewählten Stringenzbedingungen gebunden zu werden. "Angrenzende Sonde" beschreibt eine Sonde, die zu einem angrenzenden Abschnitt komplementär ist. "Diagnosesonde" beschreibt eine Sonde, die zu einem diagnostischen Abschnitt komplementär ist. "Zielsonde" beschreibt eine Sonde, die zur Zielsequenz komplementär ist und dadurch hergestellt wird, dass die Diagnosesonde und die angrenzende Sonde kovalent miteinander verknüpft (ligiert) werden.
"Reportergruppe" bezieht sich auf eine Gruppe, die das Vorhandensein einer bestimmten Hälfte (von zwei Teilen) erkennen lässt (siehe "Marker").
"Restriktionsendonukleasen" bezieht sich auf jene Enzyme, die die DNA schneiden, indem sie spezifische Sequenzen im Inneren des Moleküls erkennen und anschließend die DNA in beide Stränge schneiden, und zwar an Stellen, die entweder innerhalb oder außerhalb der Erkennungssequenz liegen.
"Ligation klebriger Enden" bezieht sich auf die kovalente Bindung zweier Enden der DNA, die komplementäre 5'- oder 3'-Einzelstrangüberhänge enthalten, die gewöhnlich – unter anderem – eine Länge von einem bis fünf Nukleotiden aufweisen.
"Stringenz" bezieht sich auf die Kombination von Bedingungen, denen die Nukleinsäuren unterworfen sind, die die doppelsträngige DNA dazu bringen, sich in die Einzelstränge der Bestandteile aufzuspalten. Zu diesen Bedingungen gehören: pH-Extremwerte, hohe Temperatur und Salzkonzentration. "Hohe Stringenz" bezieht sich auf die Bedingungen, speziell Hybridisierung und Waschen, die für den Nachweis nur einmal vorhandener Sequenzen unter Verwendung einer Oligonukleotidsonde oder einer eng verwandten Sequenz gemäß den standardisierten Southern-Hybridisierungsprotokollen ausreichend sind [wie in J. Mol. Biol. 98: 503 (1975) beschrieben].
"T_m" bezieht sich auf die Temperatur, bei der sich zwei komplementäre DNA-Stränge entwinden und trennen. Das ist eine Funktion der einzelsträngigen DNA-Länge und ihrer Grundzusammensetzung – für kleine Fragmente ist ein Näherungswert von T_m in °C gleich 4(G + C) + 2(A + T). So z. B. hat ein Oligonukleotid, das 5G, 7C, 5A und 4T-Basen aufweist, eine Temperatur von 4(5 + 7) + 2(5 + 4) oder 66°C.
"Zielsequenz" bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, deren Vorhandensein oder Nichtvorhandensein nachgewiesen werden soll. Im Zusammenhang mit einer bevorzugten Anwendung des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist es eine Sequenz, die Teil einer kodierenden Region in einem Gen ist, das mit einer Erbkrankheit in Zusammenhang steht, wie z. B. der Sichelzellenanämie. Bei vielen derartigen Krankheiten wird das Vorhandensein der genetischen Anomalie durch kleine Veränderungen in der kodierenden Sequenz gekennzeichnet. Am häufigsten kommt es vor, dass normale Individuen Sequenzen aufweisen, die sich durch ein Nukleotid von den entsprechenden Sequenzen unterscheiden, die bei Individuen mit diesem genetischen "Defizit" auftreten. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann entweder die normale oder die veränderte Sequenz als Zielsequenz verwendet werden.
"Thermophiles Enzym" bezieht sich auf ein Enzym, das bei hohen Temperaturen von 50° bis 90°C funktioniert; manche können über eine kurze Dauer Temperaturen von 94° bis 100°C überstehen, bei denen normale Enzyme denaturieren und somit inaktiv werden.
"Thermostabile Ligase" bezieht sich auf ein Enzym, das hitzestabil und hitzebeständig ist sowie bei hohen Temperaturen von 50° bis 90°C die Ligation benachbarter Oligonukleotide in der richtigen Art und Weise katalysiert (erleichtert), um ein Produkt zu bilden, das zum Zielstrang der Nukleinsäure komplementär ist. Im Allgemeinen aktiviert das Enzym das 5'-Ende eines Oligonukleotids und verbindet es mit dem 3'-Strang eines benachbarten DNA-Moleküls. Es kann aber thermostabile Enzyme geben, die andere Mechanismen nutzen, um benachbarte Oligonukleotide kovalent zu binden. Thermostabile Ligase kann unter den richtigen Bedingungen eine Anzahl unterschiedlicher Nukleinsäuresubstrate bei hohen Temperaturen von 50° bis 90°C kovalent binden, wie z. B. die Schließung von "Nicks" [Einzelstrangbrüchen] in der DNA und Ligationen klebriger Enden und glatter Enden.

Das in der vorliegenden Erfindung zur Anwendung kommende thermostabile Enzym muss ein einziges Kriterium erfüllen, nämlich für die Amplifikationsreaktion wirksam zu sein, d. h. das Enzym darf nicht irreversibel denaturiert (inaktiviert) werden, wenn es den erhöhten Temperaturen in dem Zeitraum ausgesetzt wird, der für das Bewirken der Denaturierung doppelsträngiger Nukleinsäuren erforderlich ist. Mit "irreversibler Denaturierung" ist in diesem Zusammenhang ein Prozess gemeint, der einen dauerhaften und vollständigen Verlust der enzymatischen Aktivität verursacht. Die für die Denaturierung erforderlichen Erwärmungsbedingungen werden z. B. von der Puffersalzkonzentration sowie von der Länge und Nukleotidzusammensetzung der zu denaturierenden Nukleinsäuren abhängen. Sie reichen aber in typischen Fällen von ungefähr 85°C für kürzere Oligonukleotide bis zu ungefähr 105°C für eine Zeit, die hauptsächlich von der Temperatur und Nukleinsäurelänge abhängt. Normalerweise reicht diese Zeitspanne von ungefähr 0,25 Minuten für kürzere Oligonukleotide bis zu 4,0 Minuten für längere DNA-Stücke. Höhere Temperaturen können toleriert werden, wenn die Puffersalzkonzentration und/oder GC-Zusammensetzung der Nukleinsäure erhöht wird. Vorzugsweise wird das Enzym bei ungefähr 90° bis 100°C nicht irreversibel denaturiert. Das bei der vorliegenden Erfindung zur Anwendung kommende thermostabile Enzym hat eine optimale Temperatur für seine Funktionsfähigkeit, die höher als ungefähr 45°C ist, wahrscheinlich aber zwischen 50° und 90°C und im optimalen Fall zwischen 60° und 80°C liegt.
Ein gründlicheres und vollständigeres Verständnis der Klonierung der thermophilen Ligasesequenz und der Verwendung dieses Enzyms bei dem durch die thermophile Ligase vermittelten DNA-Amplifikationsverfahren zum Nachweis von Differenzen in einzelnen Basenpaarsequenzen bei Erbkrankheiten kann durch Bezugnahme auf die folgenden Figuren und Beispiele erreicht werden, die hier lediglich zur Veranschaulichung präsentiert werden und weder mit der Absicht noch mit der Erwägung verbunden sind, den Schutzumfang der beanspruchten Erfindung einzuschränken.
Unter spezieller Bezugnahme auf die Figuren
ist 1 eine anschauliche Darstellung der Plasmide pDZ1 und pDZ7;
ist 2 ein Funktionsschema der Ligase-Kettenreaktion (LCR) gemäß der vorliegenden Erfindung;
ist 3 ein Autoradiogramm, das die Spezifität der thermophilen Ligase aus T. aquaticus unter den Amplifikationsbedingungen sowohl der LDR als auch der LCR zeigt;
ist 4 ein Autoradiogramm, das die LCR-Amplifikation bei unterschiedlichen Zielkonzentrationen zeigt;
ist 5 ein Autoradiogramm, das den Nachweis der β-Globin-Allele unter Verwendung von DNA aus dem menschlichen Genom führt;
ist 6 ein Überblick über einen Oligonukleotidligationsassay auf der Basis eines enzymgekoppelten Immunnachweises [ELISA];
ist 7 eine fotografische Darstellung der SDS-10%-Polyacrylamidgel-Elektrophorese der thermostabilen Ligase auf unterschiedlichen Reinigungsstufen;
ist 8 eine zweite fotografische Darstellung der SDS-10%-Polyacrylamidgel-Elektrophorese der thermostabilen Ligase auf unterschiedlichen Reinigungsstufen;
ist 9 eine anschauliche Darstellung von drei Klonen, die bei der vorliegenden Erfindung Verwendung finden.
In der 7 stellen die Bahnen A und G Markerproteine dar (die relativen Molekülmassen werden in kd angegeben); B stellt ganze Zellen nach der Induktion dar; C stellt unbehandelte Überstände nach Ultraschallbehandlung dar; D stellt einen in einem Pool zusammengefassten DEAE-Durchfluss nach der Wärmebehandlung dar und E und F stellen die Fraktionen 23 und 24 nach der Phosphozellulose-Chromatografie dar. In der 8 stellen die Bahnen A und H Markerproteine dar (die relativen Molekülmassen werden in kd angegeben); B stellt ganze Zellen nach der Induktion dar; C stellt unbehandelte Überstände nach der Ultraschallbehandlung dar; D stellt einen in einem Pool zusammengefassten DEAE-Durchfluss nach der Wärmebehandlung dar; E stellt die Fraktion 23 nach der Phosphozellulose-Chromatografie dar; F stellt die Fraktion 23 dar, die bei Abwesenheit von NAD in einem Ligasepuffer mit einer DNA inkubiert wurde, die einen Einzelstrangbruch aufweist; und G stellt die Fraktion 23 dar, die mit NAD in einem Ligasepuffer bei Abwesenheit einer DNA inkubiert wurde, die einen Einzelstrangbruch aufweist. In der 8 ist die eine höhere relative Molekülmasse aufweisende Ligase (annähernd 81 kd) die adenylierte Form, während die eine geringere relative Molekülmasse aufweisende Ligase (annähernd 78 kd) nicht adenyliert ist.
Die in der 1 dargestellten Plasmide sind bei einer Sammelstelle gemäß den Hinterlegungsregeln des Budapester Vertrages hinterlegt und von ihr angenommen worden. Das Plasmid pDZ1 ist in ein Wirtsbakterium (E. coli Stamm AK53) eingebaut, bei der American Type Culture Collection [Amerikanische Typus-Kultursammlung] hinterlegt und mit der Sammlungsnummer ATCC Nr. 68307 versehen worden. Das Plasmid pDZ7 ist in ein Wirtsbakterium (E. coli Stamm AK53) eingebaut, bei der American Type Culture Collection hinterlegt und mit der Sammlungsnummer ATCC Nr. 68308 versehen worden.
Obwohl auch andere Verfahren verwendet werden können, erfolgt die Herstellung der thermophilen Ligase im Allgemeinen durch rekombinante Mittel, zu denen in typischen Fällen folgende Mittel gehören:
Erstens wird eine DNA gewonnen, die das voll entwickelte (so wie dieser Begriff im vorliegenden Text gebraucht wird, umfasst er alle mutierten Proteine) Enzym oder eine Fusion der thermophilen Ligase zu einer zusätzlichen Sequenz kodiert, die ihre Aktivität nicht zerstört, oder zu einer zusätzlichen Sequenz, die unter kontrollierten Bedingungen spaltbar ist, um ein aktives Protein zu ergeben. Wenn die Sequenz von Introns nicht unterbrochen wird, ist sie für die Expression in jedem Wirtsorganismus geeignet. Allerdings sollte sich die Sequenz in einer ausschneidbaren und zurückgewinnbaren Form befinden. Bei Einsatz der PCR-Technik z. B. können die meisten DNA-Sequenzen, die Enzyme kodieren, amplifiziert und daher auch in einer "ausgeschnittenen" Form zurückgewonnen werden.
Die ausgeschnittene oder zurückgewonnene kodierende Sequenz wird dann in eine funktionsfähige Bindung mit geeigneten Steuerungssequenzen in einem replizierbaren Expressionsvektor platziert, der zur Transformation eines geeigneten Wirtes genutzt wird. Der transformierte Wirt wird dann unter geeigneten Bedingungen kultiviert, um die Herstellung der rekombinanten thermophilen Ligase zu bewirken, und die Ligase wird mit Hilfe bekannter Mittel isoliert und gereinigt.
Jedes der oben genannten Verfahren kann auf vielfältige Weise durchgeführt werden. So z. B. können die gewünschten kodierenden Sequenzen aus Genomfragmenten gewonnen und direkt in entsprechenden Wirten verwendet werden; die Konstruktionen für Expressionsvektoren, die in einer Vielzahl von Wirten funktionsfähig sind, werden unter Verwendung passender Replikons und Steuerungssequenzen angefertigt. Und geeignete Restriktionsstellen können, wenn sie normalerweise nicht verfügbar sind, den Enden der kodierenden Sequenz hinzugefügt werden, um so ein ausschneidbares Gen für den Einbau in den entsprechenden Vektor zur Verfügung zu stellen.
Die Steuerungssequenzen, Expressionsvektoren und Transformationsverfahren hängen vom Typ der Wirtszelle ab, die für die Expression des Gens verwendet wird. Im Allgemeinen sind bakterielle Wirtszellen die wirksamsten und günstigsten für die Herstellung rekombinanter Proteine und werden deshalb für die Expression der thermophilen Ligase bevorzugt. Aber solche anderen Wirtszellen, wie z. B. Hefe-, Pflanzen- und Insekten- oder Säugetierzellen, können auch verwendet werden, falls sie geeignet sind. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung gilt eine Quelle für Wirtszellen als gleichwertig mit jeder anderen vorhandenen und geeigneten Wirtszellenquelle.
BEISPIEL I
(Wachstum des T. aquaticus Stamms HB8 und Isolierung von DNA)
Aus dem Thermus thermophilus-Stamm HB8 (ATCC Nr. 27634) wurde DNA isoliert. Dieser Stamm ist vor kurzem als Thermus aquaticus Stamm HB8 neu klassifiziert worden [siehe Arch. Microbiol. 117: 189 (1978)].
Die Zellen ließ man über Nacht bei 75°C in einem Wasserbadschüttler in einer auf einen pH-Wert von 7,2–7,5 mit NaOH eingestellten TAB-Nährlösung wachsen [siehe Nuc. Acids Res., S. 6795–6804 (1981)] (die pro Liter 5 g Bacto^TM-trypton, 3 g Hefeextrakt, 2 g NaCl und 1 g Dextrose enthielt) und sie wurden durch Zentrifugierung geerntet, und zwar mit einer Ausbeute von 3,1 g Nassgewicht aus 800 ml der Medien. Die Zellen wurden in 15 ml des 50 mM Tris-Puffer mit pH 8,0 resuspendiert, der 50 mM EDTA und 15 mg Eiweißlysozym enthielt. Die resuspendierten Zellen wurden durch Zugabe von 2 ml des 10% (Gewicht(Volumen) Natriumdodecylsulfats lysiert, anschließend durchliefen sie eine Inkubationszeit von 15 Minuten bei 37°C sowie zwei wiederholte Gefrierzyklen bei –50°C und Auftauzyklen bei 37°C. Die wässrige Lösung wurde nacheinander mit gleichen Mengen wässrigen Phenols extrahiert (das vorher mit Natriumtetraborat auf den pH-Wert 7,5 eingestellt wurde), gefolgt von Phenol/Chloroform und schließlich Chloroform.
Die Nukleinsäuren wurden durch Vermischung mit 2 Volumen 95-prozentigen Ethanols und Abkühlung auf –50°C im Verlauf von 15 Min. ausgefällt und dann durch Zentrifugierung pelletiert. Nach Entfernung des Überstands und Trocknung des Pellets wurden die Nukleinsäuren in einem 1 ml starken TE-Puffer (10 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 8,0 bei einem Gehalt von 1 mM EDTA) resuspendiert. Die RNA wurde durch Zugabe von 100 μg RNase A auf jedes ml der Suspension verdaut und die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die DNA wurde durch Zugabe von einem Zehntel Vol. von 3 M Natriumacetat und 3 Volumen 100-prozentigen Ethanols (15 Minuten lang auf –50°C abgekühlt) ausgefällt, durch Zentrifugierung pelletiert, mit 70-prozentigem Ethanol gewaschen und schließlich im TE-Puffer bei einer letztendlichen Konzentration von 2 mg/ml resuspendiert.
Obwohl die in dem oben genannten Beispiel verwendete DNA aus Thermus aquaticus isoliert wurde, kann die sich daraus ergebende thermophile Ligase, die für die vorliegende Erfindung die erforderlichen Eigenschaften aufweist, als ihre Ausgangsquelle eine DNA haben, die aus anderen Thermus-Spezies oder anderen thermophilen Bakterien, Phagen oder Viren isoliert wurde.
Die aus dem T. aquaticus-Stamm HB8 isolierte DNA kann durch die Restriktionsendonukleasen Taq I (deren Erkennungssequenz TCGA ist) oder EcoRI (deren Erkennungssequenz GAATTC ist) nicht aufgespalten werden. Die Unfähigkeit, bestimmte Sequenzen aufzuspalten, ist eine Folge der Schutzmethylierung [siehe H. O. Smith und S. V. Kelly, DNA-Methylierung: Biochemie und Biologische Signifikanz, Herausgeber Razin, Cedar und Riggs, S. 39–71, Springer-Verlag Inc., New York (1987)] an der Position N6 der Adeninreste. Frühere Untersuchungen [siehe J. Bact. 169: 3243 (1987)] haben gezeigt, dass es da ein mit mrr bezeichnetes Gen gibt, das die adenin-methylierte DNA mit der Form G-6MeANTC und CTHC-6MeAG restriktiert. Bei der Klonierung der Taq I Restriktionsendonuklease und Methylase wurde festgestellt, dass verschiedene E. coli-Stämme die TCGA-methylierte DNA restriktieren. Das ist ein Effekt, der ursprünglich (aber fälschlicherweise) dem mrr-Gen zugeschrieben wurde [siehe Gene 56: 13 (1987) und Nuc. Acid Res. 15: 9781 (1987)]. Vor kurzem am Medizinischen College der Cornell Universität durchgeführte Arbeiten haben das Vorhandensein eines weiteren Gens außer mrr bewiesen, das ein Protein kodiert, welches die TCGA-methylierte DNA restriktiert. Kurz gesagt, die Stämme, die ein Tn5 (Km^R) Transposon enthalten, das das mrr Gen zerteilt, wurden [siehe J. Bact. 169: 3243 (1987)] für die Transduktion der Km^R-Marker [laut J. H. Miller in Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 201–205 (1972)] zu verschiedenen Stämmen der Escherichia coli verwendet, die zu Stammumwandlungen zu einem mrr – (defektes mrr Protein) führten. Keiner dieser transduzierten Stämme konnte das Taq-Methylase-Gen tolerieren, was darauf hinweist, dass es da ein zweites Gen gibt, welches für die Restriktion der TCGA-methylierten DNA verantwortlich ist. Somit war es für die Bewerkstelligung der vorliegenden Erfindung eines der ersten notwendigen Erfordernisse (das vor der vorliegenden Erfindung nicht ersichtlich gewesen ist), einen E. coli Stamm auszuwählen, der die TCGA-methylierte DNA nicht stark restriktieren würde.
Bei der vorliegenden Erfindung wurde ein Abkömmling des RRI-Stammes der E. coli Bakterien, der das Taq-Methylase-Gen tolerieren könnte, und der ein Tn10 (Tc^R) Transposon enthielt, zu einem ligts7-Stamm transduziert [N3098, siehe Wilson und Murray, J. Mol. Biol. (1979) und J. Mol. Biol. 77: 531 (1973)], um den E. coli-Stamm AK76 zu schaffen. Dieser Stamm ist in der American Type Culture Collection hinterlegt und mit der Sammlungsnummer ATCC Nr. 55032 versehen worden. Dieser Stamm enthält ein temperaturempfindliches Ligasegen, so dass der Stamm bei 42°C nicht mehr wachsen kann. Dieser Stamm kann das Taq-Methylase-Gen und andere methylierte DNA tolerieren, besonders die aus T. aquaticus isolierte DNA. Da sie auch ein temperaturempfindliches Ligasegen besitzt, könnte sie durch Selektion als Wirtszelle für die Klonierung eines funktionellen Ligasegens aus T. aquaticus für das Wachstum bei 42°C verwendet werden.
Die Klonierung des Ligasegens aus T. aquaticus stützte sich auf ein positives Selektionsschema, das dem durch Wilson und Murray beschriebenen ähnelt. Die Herangehensweise bestand darin, Bibliotheken für die DNA aus T. aquaticus aufzubauen, die durch Insertion in einen geeigneten Vektor eingefügt wird. Diese Bibliotheken wurden dann per Transformation in einen ligts7-E. coli-Stamm eingeführt, der die methylierte DNA aus T. aquaticus nicht restriktiert, wie z. B. den Stamm AK76. Diese Zellen ließ man dann bei einer Temperatur wachsen, die keine Virusvermehrung zulässt, d. h. bei 42°C. Zu den überlebenden Organismen könnten gehören: (i) Rückmutanten zu einem lig+-Phänotyp; (ii) allosterische Rückmutanten, die die Expression des defekten E. coli-Ligasegenprodukts steigern; (iii) ein kloniertes Stück der DNA aus T. aquaticus, das die Expression des defekten E. coli-Ligasegenproduktes steigert; oder (iv) ein kloniertes Stück der DNA aus T. aquaticus, das das Ligasegen aus T. aquaticus enthält.
Für die gewünschte letzte Alternative zu dieser Arbeit ist es erforderlich, dass (i) das gesamte Ligasegen kloniert wird; (ii) dass sich entweder die endogenen Steuerungssequenzen für die Expressionsfunktion der Ligase aus T. aquaticus bei den E. coli oder die exogenen Vektorsteuerungssequenzen nahe genug am Aminoende befinden und das Ligasegen in der richtigen Ausrichtung kloniert wird, um Raum für die richtige Expression in den E. coli zu lassen; (iii) dass die T. aquaticus-Ribosomen-Bindungsstelle bei den E. coli funktioniert; und (iv) dass die T. aquaticus-Ligase bei 42°C aktiv genug ist und die synthetisierte Menge ausreicht, um die Ligasefunktion bei den E. coli zu komplementieren, ohne andere Prozesse zu stören.
Der Aufbau geeigneter Bibliotheken zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung nutzte herkömmliche Vektoren mit den gewünschten Steuerungssequenzen sowie standardmäßige Restriktionsendonuklease und Ligationstechniken. Gereinigte Plasmid-DNA, DNA-Sequenzen aus T. aquaticus oder synthetisierte Oligonukleotide zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung wurden aufgespalten, zugeschnitten und in der gewünschten Form auch durch herkömmliche Techniken erneut ligiert.
Die Auswahl eines geeigneten Vektors zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung ist mehr als eine bloße Frage der Auswahl eines Vektors unter den vielen Vektoren, die gegenwärtig vorhanden sind und in der Vergangenheit verwendet worden sind. Derivate der pUC-Plasmide mit einer hohen Kopienummer [siehe z. B. C. Yanisch-Peron et al., Gene 33: 103 (1985) oder J. Vieira et al., Gene 19: 259 (1982)] sind tatsächlich etwas instabil, wenn man sie bei 42°C wachsen lässt. Solche Plasmide mit niedriger Kopienummer, wie z. B. die pBR322-Derivate pFBI 1, 2, 13, 14 und 15 [siehe F. Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4202 (1985)] können nicht genug Enzym produzieren, um den Ligase-Defekt zu komplementieren. Bei der Arbeit an der vorliegenden Erfindung wurden 18 unterschiedliche Bibliotheken unter Verwendung von 3 unterschiedlichen Vektoren-Sätzen geschaffen. Das erfolgreiche Klon wurde von dem Vektor pTZ18R abgeleitet [siehe D. A. Mead et al., Protein Engineering 1: 67 (1986)], obwohl andere Vektoren auch verwendbar sein können.
Im Allgemeinen erfolgt die ortsspezifische DNA-Aufspaltung, die im folgenden Beispiel noch genauer beschrieben wird, durch die Behandlung der DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym unter Bedingungen, die in Fachkreisen allgemein bekannt sind, und deren Einzelheiten durch die Hersteller dieser im Handel erhältlichen Restriktionsenzyme genau angegeben werden. Im Allgemeinen wird ungefähr 1 μg Plasmid oder DNA-Sequenz durch zwei oder zehn Enzymeinheiten in ungefähr 20 μl Pufferlösung aufgespalten. Am besten sind Inkubationszeiten von ungefähr einer Stunde oder zwei Stunden, obwohl Schwankungen sowohl bei der Zeit als auch bei der Temperatur toleriert werden können. Nach jeder Inkubation wird das Protein durch eine Extraktion mit Phenol bzw. Chloroform entfernt, an die sich eine weitere Extraktion anschließen kann. Die Nukleinsäuren werden durch Ausfällung mit Ethanol zurückgewonnen. Falls gewünscht, können mit standardisierten Techniken Trennungen der gespaltenen Fragmente nach Größe durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese oder Agarose-Gel-Elektrophorese durchgeführt werden.
BEISPIEL II
(ortsspezifische Spaltung)
Die ortsspezifische Spaltung sowohl des Plasmids als auch der DNA aus T. aquaticus erfolgte unter Verwendung von im Handel erhältlichen Restriktionsendonukleasen in Standardpuffern.
Im Allgemeinen wurden ungefähr 10 μg Plasmid oder DNA des T. aquaticus in 100 μl Pufferlösung durch Zugabe von 20 bis 100 Einheiten (units) der entsprechenden Restriktionsendonuklease gespalten. Und die Inkubation der Mischung erfolgte bei 37°C in einem Zeitraum von 1 bis 2 Stunden.
Nach jeder Inkubation wurde das Protein durch sequentielle Extraktionen mit Phenol (2 ×), n-Butanol (2 ×) entfernt und die Nukleinsäure wurde durch Ausfällung mit Ethanol zurückgewonnen.
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die die gewünschten Kodierungs- und Steuerungssequenzen enthalten, nutzt konventionelle Ligations- und Restriktionstechniken. Kurz gesagt, isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonukleotide werden gespalten, zugeschnitten und erneut in der gewünschten Form ligiert.
Die Restriktionsendonukleasen, die für die Spaltung der spezifischen, entsprechend dem im Beispiel II umrissenen Verfahren genutzten Bibliotheken verwendet werden, waren BamHI, SacI, KpnI (Asp718), PstI, HindIII und SmaI. Aber auch andere Endonukleasen oder partielle Verdauungen mit SauIIIA z. B. könnten verwendet worden sein. Wegen der Adenosin-Methylierung wurden die allgemein verwendeten Restriktionsendonukleasen EcoRI, SalI oder XhoI nicht genutzt, da die DNA vom T. aquaticus-Stamm HB8 durch diese Enzyme nicht gespalten werden konnte.
Die sich aus dem im Beispiel II beschriebenen Verfahren ergebenden Restriktionsfragmente, die 5'-Überhänge enthalten, können dadurch glatte Enden erhalten, dass man sie mit dem großen Abschnitt der DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) bei Vorhandensein der vier Desoxynukleotidtriphosphate auffüllt, und zwar in Inkubationszeiten von ungefähr 15 bis 30 Minuten bei 37°C in einem 50 mM Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 7,6 der 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT und 50–100 μM Desoxynukleotidtriphosphate enthält. Das Klenow-Fragment wird an den klebrigen 5'-Enden eine Auffüllung vornehmen. Wenn 3'-Überhänge erzeugt werden, können sie mit Mungbohnen-Nuklease zurückgekaut werden. Nach der Behandlung mit dem Klenow- Fragment wird das Gemisch mit Phenol bzw. Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Eine anschließende Behandlung unter geeigneten Bedingungen mit S1-Nuklease führt zur Hydrolyse jedes Einzelstrangabschnittes. Diese herkömmlichen Verfahren können für das Klonieren jedes Fragments zu einem Mutationsort (mit einem glatten Ende) innerhalb des Vektors genutzt werden.
BEISPIEL III
(Vektorkonstruktion)
Bei Vektorkonstruktionen wird der linearisierte Vektor im Allgemeinen mit einem Phosphatase-Enzym behandelt (oder aber auch mit einer zweiten, in der Nähe befindlichen Restriktionsendonuklease), um eine Rezirkularisierung des Vektors beim Fehlen einer Insert-DNA zu verhindern. So z. B. kann eine Probe der BamHI (5'-Überhang) – oder SacI (3'-Überhang) – DNA (9 μg) in 150 μl 50 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 der 10 mM MgCl₂ und 6 mM Mercaptoethanol enthält, bei Vorhandensein von Na⁺ mit kalbsdarmalkalischer Phosphatase (Calf Intestine Alkaline Phosphatase, CIAP, 22 Einheiten) bei 37°C 15 Minuten lang behandelt werden, woran sich eine Inkubationszeit von 30 Min. bei 50°C anschließt, um Phosphatgruppen entweder aus 5'- oder 3'-Überhängen zu entfernen. Aber auch Bakterielle Alkalische Phosphatase (BAP, 10 Einheiten) kann in 150 μl von 10 ml Tris-HCl bei Vorhandensein von Na+ und Mg++ zur Anwendung kommen und bei 60°C eine Inkubationszeit von ungefähr 1 Stunde durchlaufen. Die CIAP kann anschließend denaturiert werden, und zwar durch die Zugabe von Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) und Ethylenglykol-di-(β-Aminoethylether)N',N',N'-Tetraessigsäure (EGTA), um bivalente Kationen in einem Chelat zu binden, und durch eine 15 Minuten lange Erhitzung auf 65°C. Dann wird entweder das CIAP-Protein oder das BAP-Protein durch sequentielle Extraktionen mit Phenol (2 ×), n-Butanol (2 ×) und Nukleinsäure entfernt, die durch Ausfällung mit Ethanol zurückgewonnen wird.
Die Wirksamkeit des Phosphataseschrittes wird durch den Vergleich der Anzahl der erzeugten Transformanten geprüft, wenn der Vektor in Abwesenheit oder Anwesenheit einer Insert-DNA erneut ligiert wird. Typische Ergebnisse aus weiteren 10- bis 100-fachen Transformationen bei Anwesenheit einer Insert-DNA sind ein Hinweis darauf, dass die Vektor-DNA richtig phosphatisiert worden ist.
BEISPIEL IV
(Ligationen)
Ligationen wurden in Mengen von 30–100 μl unter Verwendung eines linearisierten und phosphatasierten Vektors von 1–2 μg durchgeführt, der wie vorher beschrieben hergestellt wird. Eine Menge von 2–4 μg DNA aus T. aquaticus wird mit einer Restriktionsendonuklease geschnitten, die die gleichen Enden wie der Vektor in einem 50 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 erzeugt und 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM ATP, 6 mM Mercaptoethanol und 3 bis 7 (Weiss) Einheiten der T4-Ligase enthält, und zwar durch Inkubation entweder bei 4° oder bei 15°C über Nacht. Nach der Ligation wurde EDTA hinzugefügt, die T4-Ligase inaktivierte durch Erhitzung der Lösung auf 65°C im Verlauf von 15 Minuten und die Nukleinsäuren wurden durch Ethanolausfällung zurückgewonnen.
Ligationsgemische wurden in einen geeigneten Wirtsorganismus eingeführt, wie z. B. in die E. coli-Stämme RR1, AK53 oder AK76, wobei der letztgenannte für eine sofortige positive Selektion des Phänotyps lig+ mittels herkömmlicher Transformationsverfahren geeignet ist [siehe Hanahan, J. Mol. Biol. 166: 3243 (1987)]. Die Transformanten wurden durch Auftragung auf ampicillinhaltige Platten selektiert (Ampicillin oder andere Wirkstoffe, wie z. B. Tetracyclin oder Kanamycin in Abhängigkeit vom verwendeten Plasmid). Für die positive Selektion des Phänotyps lig+ wurden AK76-Transformanten auf SOB-Platten aufgetragen (die durch die Autoklavieren von 20 g Bacto^TM-trypton, 5 g Bacto^TM-Hefeextrakt, 0,5 g NaCl, 16 g Bacto^TM-agar in 1 Liter destillierten Wassers, das vor dem Autoklavieren auf einen pH-Wert von 7,5 mit NaOH eingestellt wird, danach durch die Zugabe von 20 ml 1 M MgSO₄ hergestellt werden), die 0,2% Maltose, 0,2 mg/ml IPTG (zur Induzierung des lac-Promoters) und 50 μg/ml Ampicillin (zur Selektion der plasmidhaltigen Zellen) enthalten, und die man über Nacht bei 42°C bis 42,5°C wachsen lässt.
Die Bibliotheken reichten der Größe nach von ungefähr 5.000 bis 27.000 Klone. Angesichts der allgemeinen Schätzung, dass das bakterielle Chromosom ungefähr 2.000 bis 4.000 Kilobasen enthält und die durchschnittliche Insert-DNA aus 5 bis 10 kb besteht, war es klar, dass mehrere Bibliotheken redundante Klone enthielten.
Gemischte Plasmidpräparate wurden aus sechs Bibliotheken unter Verwendung herkömmlicher Techniken hergestellt [siehe Methods Enzymol. 100: 243 (1983)] und in frische AK76-Zellen eingeführt. Transformanten aus jeder Bibliothek wurden auf 6 SOB-Platten (jede Platte kann zwischen 30.000 und 70.000 Klone aufnehmen) ausplattiert und bei 42°C inkubiert. Eine Bibliothek produzierte 11 bis 19 äußerst kleine Kolonien pro Platte; die übrigen Bibliotheken produzierten eine gelegentliche große Kolonie.
Einzelne Klone wurden gepickt, Plasmid-DNA wurde unter Verwendung herkömmlicher Techniken präpariert [siehe Anal. Biochem. 114: 193 (1981)] und durch RestriktionsVerdau analysiert. Alle 12 kleinen Klone produzierten ein 6,8 kb großes Plasmid, das zwei BamHI-Fragmente (jeweils 1,8 und 2,1 kb) enthielt, die innerhalb des BamHI-Ortes von pTZ18R kloniert wurden. Ein derartiges Plasmid ist pDZ1 genannt worden, wie in der 1 dargestellt ist. Durch Rückrechnung zur ursprünglichen Bibliothek (mit 5.200 Klonen) hat es den Anschein, dass alle pDZ1-Plasmide von einem einzigen Klon abstammen. Die großen Kolonien enthielten Plasmide, die der Größe des ursprünglichen Vektors nahe kommen. Aus diesem Grunde sind diese großen Kolonien wahrscheinlich Rückmutanten des chromosomalen Gens ligts7, das irgendein Plasmid ausschließlich zur Erlangung einer Ampicillinresistenz enthielt.
Die Rücktransformation des Plasmids pDZ1 zu AK76-Zellen und Selektion bei 42°C auf SOB-Platten, die Maltose, IPTG und Ampicillin enthalten, wie im Beispiel IV beschrieben, ergaben wiederum kleine Kolonien. Das Ausplattieren frischer Transformanten auf ein ampicillinhaltiges Trypton-Hefe-Agar führte nicht zur Produktion von Kolonien. Dieses Ergebnis legt die Schlussfolgerung nahe, das die Induktion des lac-Promoters während der Plasmidfeststelllung für die Produktion ausreichender Mengen der Ligase aus T. aquaticus erforderlich ist, um den genetischen Defekt zu komplementieren. Sobald das Plasmid in AK76-Zellen festgestellt worden ist, werden solche Klone äußerst kleine Kolonien ergeben, wenn sie auf der Agarplatte ausgestrichen werden und die Möglichkeit erhalten, auf ampicillinhaltigen Trypton-Hefe-Platten bei 42°C zu wachsen.
Der Verdau von pDZ1 mit BamHI, gefolgt von einer erneuten Ligation, würde die Fragmente untereinander vermischen. Die Transformation eines solchen Ligationsgemisches zu AK76, gefolgt von einer Plattierung bei 37°C, d. h. unter nichtselektiven Bedingungen, verglichen mit der Plattierung bei 42°C, d. h. unter selektiven Bedingungen, ergab 1.000-fach mehr Kolonien unter nichtselektiven Bedingungen. Das Ausgangsplasmid pDZ1 ergab nur zweimal mehr Kolonien unter nichtselektiven Bedingungen als unter selektiven Bedingungen. Dieses Untersuchungsergebnis legt in starkem Maße die Schlussfolgerung nahe, dass das Vorhandensein beider Fragmente und die Ausrichtung ihrer Klonierung für die richtige Expression der Ligase aus T. aquaticus erforderlich sind.
Obwohl pDZ1 mehrere SacI and SmaI-Stellen aufweist, enthält es nur eine einzige (vom Vektor abgeleitete) PstI, KpnI oder HindIII-Stelle. Folglich könnte man erwarten, dass eine Reihe von Ligase-Klonen aus den PstI, KpnI oder HindIII-Verdaubibliotheken isoliert worden wäre. Jedoch der einzige Ligase-Klon wurde aus der partiellen BamHI-Verdaubibliothek gewonnen. Obwohl nicht klar ist, warum das geschehen ist, besteht eine denkbare Erklärung darin, dass andere Klone das lac-Promoter-Kontrollelement nicht nahe genug an den Startpunkt des Ligasegens herangebracht haben, um das Ligaseprotein während der Plasmidetablierung ausreichend zu exprimieren.
Die oben beschriebene Klonierung der Ligase aus T. aquaticus wird nun die Fachleute befähigen, durch weitere Verfahren jede thermophile oder thermostabile Ligase zu klonieren, und zwar unabhängig davon, ob die Ligase ihren Ursprung aus Prokaryoten, Archaebakterien, Eukaryoten oder Phagen hat.
Zu solchen weiteren Verfahren für die Klonierung können z. B. gehören: (i) die Klonierung der DNA aus T. aquaticus zu einem Rot-Lambda-Vektor und das Screening nach der Fähigkeit rekombinanter Lambda-Phagen, bei 39°C in einem solchen ligts7-Stamm, wie z. B. AK76, Plaques zu bilden [wie im Wesentlichen in J. Mol. Biol. 132: 471 beschrieben (1979)]; (ii) die Verwendung der Lambda-gt11-Phage zur Exprimierung von Abschnitten des Ligasegens und anschließend das Screening mit Antikörpern, die zur Reinigung der Ligase aus T. aquaticus gezüchtet wurden, – das positive Lambda-gt11-Klon kann dann dafür verwendet werden, das Gen in voller Länge durch Hybridisierung zu anderen Plasmid- oder Phagenbibliotheken zu ermitteln, wie im Wesentlichen bei der Klonierung der Polymerase aus T. aquaticus beschrieben [siehe J. Biol. Chem. 264: 6427 (1989)]; (iii) ausgehend von der Ligase-DNA-Sequenz können Sonden hergestellt werden, die zu anderen Sequenzen hybridisieren würden, die eine thermostabile Ligase kodieren, und deshalb auch bei einer Vielzahl von Spezies bei der Ermittlung und Wiedergewinnung dieser Sequenzen helfen würden. Folglich können DNA-Abschnitte, die mindestens fünf Aminosäuren aus der Ligase des T. aquaticus kodieren, repliziert oder unter Verwendung von PCR-Techniken amplifiziert werden. Und die denaturierten oder einzelsträngigen Formen können als Sonden verwendet werden, um weitere DNAs wiederzugewinnen, die eine thermophile oder thermostabile Ligase kodieren. Aber auch Oligodesoxyribonukleotid-Sonden können synthetisiert werden, die mindestens fünf Aminosäuren kodieren. Und diese können dafür eingesetzt werden, um weitere DNAs wiederzugewinnen, die eine thermophile oder thermostabile Ligase kodieren.
Die Selektion eines Abschnittes einer DNA, die mindestens fünf Aminosäuren kodiert, stützt sich auf den Abschnitt, der fünfzehn Nukleinsäurebasen enthält, was mehr als die statistische Mindestlänge ist, die ein Oligonukleotid haben sollte, um eine einzige komplementäre Sequenz in einem Genom zu finden. Jedoch Abschnitte, die etwas kleiner sind (z. B. die minimale Anzahl von 12 in E. coli weist darauf hin, dass ein Abschnitt, der genauso klein wie jener Abschnitt ist, der vier Aminosäuren kodiert, akzeptabel sein kann) oder größer sind (die minimale Anzahl für höhere Tiere beträgt bis zu 19, was darauf hinweist, dass ein Abschnitt erforderlich sein kann, der mindestens sieben Aminosäuren kodiert) [siehe Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression, Bd. 12, S. 137–140, Macmillan Press Ltd., London (1989)] können für die Erzielung ähnlicher Ergebnisse verwendet werden. Da es aber möglicherweise keine genaue Übereinstimmung zwischen der Nukleotidsequenz in den entsprechenden Abschnitten zwischen den Spezies gibt, sind Oligomere, die annähernd 15 Nukleotide enthalten, ein bevorzugtes Minimum, um eine Hybridisierung unter Bedingungen einer ausreichenden Stringenz zu erreichen, um falsche Positive zu eliminieren. Die Sequenz, die 5 Aminosäuren kodiert, würde Informationen liefern, die für die Erzeugung solcher Sonden ausreichen.

Anhand eines Beispiels lässt ein Vergleich der Ligase aus T. aquaticus und Aminosäuresequenzen aus E. coli eine Identität zwischen den Aminosäuren 34–40 (Asp-Ala-Glu-Tyr-Asp-Arg-Leu) auf einem statistisch akzeptablen Niveau erkennen. Unter Verwendung der bevorzugten Sequenz von sechs Aminosäuren könnte eine degenerierte Sonde der Form GA(C/T)-GC(G/A/T/C)-GA(G/A)-TA(C/T)-GA(C/T)-(C/A)G(G/A/T/C)-(C/T)T dafür verwendet werden, um eine der beiden oben genannten Ligasen zu ermitteln und wiederzugewinnen. Die Bereiche der Sequenzidentitäten zwischen der Ligase aus Thermophilus gemäß der vorliegenden Erfindung und der Ligase aus E. coli umfassen die Aminosäuren an den folgenden Positionen:

Aminosäurepositionen	Aufeinanderfolgende identische Bereiche
34 bis 40	7
57 bis 61	5
137 bis 142	6
168 bis 175	8
199 bis 210	12
212 bis 219	8
308 bis 312	5
333 bis 339	7
485 bis 490	6
492 bis 496	5
513 bis 517	5
620 bis 624	5

Von den insgesamt 676 Aminosäuren, die in der Ligase aus Thermophilus enthalten sind, beträgt die prozentuale Ähnlichkeit zwischen der Ligase aus Thermophilus und der Ligase aus E. coli 66%; die prozentuale Identität beträgt 47%.
Die Konstruktion eines Stamms mit Überproduktion aus einem klonierten und richtig ausgerichteten Gen kann durch die Anwendung von Verfahren erreicht werden, die auf diesem Fachgebiet normalerweise üblich sind. Das allgemeine Prinzip einer solchen Konstruktion besteht darin, eine Aktivierungssequenz in unmittelbare Nähe zum Startkodon des Gens zu bringen, um eine wirksame Transkription und Translation jenes Gens zu bewirken. Es gibt viele Promoter-Systeme (einschließlich einer Ribosomen-Bindungsstelle [siehe Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 5543 (1981)], die mit Erfolg dafür verwendet worden sind, Gene einzuschalten, zu denen auch der lac-Promoter, der trp-Promoter [siehe Gene 20: 231 (1982)], der Promoter der Lambda-Phage P_L [siehe Nature 292: 128 (1981)], der tac-Fusionspromoter [siehe Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21 (1983)] und die T7-Phagenpromoter [siehe Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1074 (1985)] gehören.
Das Plasmid pDZ1 enthält das Ligasegen aus T. aquaticus stromabwärts sowohl von den lac- als auch von den T7-Promotern, die im Startvektor vorhanden sind. Es gibt verschiedene Verfahren für die Entfernung überschüssiger DNA-Sequenzen aus dem Bereich zwischen den Promotern und dem Gen, einschließlich der Verwendung von Ba131 [siehe Nucl. Acids Res. 5: 1445 (1978)] und von ExoIII und Mung-Bohnen- oder S₁-Nuklease [siehe Meth. Enzymol. 155: 156 (1987)]. Aber ein etwas einfacheres Verfahren als das im Beispiel IV beschriebene wurde dafür benutzt, um das Aminoende des Ligasegens aus T. aquaticus näher an die beiden Promoter im vorliegenden Falle heranzubringen.
BEISPIEL V
(Entfernung überschüssiger DNA aus dem Bereich zwischen Promoter und Gen)
Das Plasmid pDZ1 wurde mit der Restriktionsendonuklease HinPI (G CGC) zufällig linearisiert und mit einem Klenow-Fragment oder aber auch mit CviJI (PuG Cpy) [siehe DNA and Protein Engineering Techniques 1: 29 (1988)] mit einem glatten Ende versehen.
Die DNA wurde durch sequentielle Extraktionen mit Phenol (2 ×) und n-Butanol (2 ×) gereinigt und die Nukleinsäure durch Ausfällung mit Ethanol zurückgewonnen. Diese zufällig linearisierten Plasmide wurden dann mit Asp718 behandelt, das die Polylinker-Stelle unmittelbar stromabwärts der beiden Promoter spaltet, und durch das Klenow-Fragment mit einem glatten Ende versehen. Die sich daraus ergebenden Fragmente wurden durch Elektrophorese in niedrig schmelzender Agarose getrennt, sequentielle Scheiben (einschließlich linearer und fortschreitend kleinerer DNA-Fragmente mit voller Länge) wurden ausgeschnitten und die DNA zurückgewonnen. Die DNA-Fragmente wurden anschließend durch Ligation der glatten Enden (Blunt-End-Ligation) rezirkularisiert. Das war mit einer über Nacht ablaufenden Inkubation bei 4°C in 100 μl eines 50 mM Tris-HCl-Puffers mit einem pH-Wert von 8,0 verbunden, der 10 mMgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM ATP, 6 mM Mercaptoethanol und 3 bis 7 Weiss-Einheiten der T4-Ligase enthält. Nach den Ligationen wurde EDTA hinzugefügt, die T4-Ligase durch Wärme (15 Min. lang bei 65°C) inaktiviert und die Nukleinsäuren durch Ausfällung mit Ethanol zurückgewonnen.
Die präparierten Ligationsgemische wurden unter Verwendung herkömmlicher Techniken in die AK76-Zellen eingeführt und der Phänotyp lig+ wurde bei 42°C auf SOB-Platten selektiert, die Maltose, IPTG und Ampicillin enthalten, wie vorher schon beschrieben.
Ausgehend von den Ergebnissen der bisherigen Arbeit könnte man erwarten, dass die Plasmide, die Deletionen zwischen den Promotern und dem Startpunkt des Ligasegens aus T. aquaticus enthalten, unter diesen Bedingungen eine Lebens- bzw. Vermehrungsfähigkeit verleihen würden. Jedoch Deletionen des Vektors (Promoterregionen) oder eines essentiellen Abschnitts des Ligasegens sollten nicht zu solch einer Vermehrungsfähigkeit führen. Aus diesem Grunde wurden einzelne Klone gepickt, die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung herkömmlicher Verfahren präpariert [siehe Anal. Biochem. 114: 193 (1981)] und durch Restriktionsverdau analysiert. Die Ergebnisse aus diesem Test zeigten, dass es den Plasmiden pDZ2, pDZ3, pDZ6 und pDZ7 am Fragment BamHI mit 1,8 kb mangelte, und dass sie stattdessen ein Fragment mit 1,3, 1,4, 1,2 bzw. 1,2 kb enthielten. All diese Plasmide erschufen die Stelle Asp718 neu, so wie man das bei den richtigen Auffüllreaktionen und Ligationen glatter Enden erwarten würde. Aus diesen Plasmiden wurde unter Anwendung herkömmlicher Verfahren [siehe Nucl. Acids Research 13: 1103 (1985) und Protein Engineering 1: 64 (1986)] einsträngige DNA präpariert und diese wurden sequenziert unter Verwendung des als "Reverse Primer" dienenden, universellen Oligonukleotids 5'd(AGCGGATAACAATTTCACACAGGA) 3' und der T7-DNA-Polymerase [siehe Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4767 (1987)].
Die Analyse der DNA-Sequenz lässt zwei ATG-Startkodons erkennen, wobei das erste offene Leseraster drei Kodons lang ist und das zweite, die Ligase-DNA-Sequenz, ein langes Leseraster ergibt. Im Zusammenhang mit der 1 ist diese von den Plasmiden pDZ6 und pDZ7 abgeleitete Sequenz (einschließlich der partiellen Ligase-DNA-Sequenz) eine thermophile Ligase.
Die Nukleinsäuresequenz für die bei der vorliegenden Erfindung verwendete thermophile Ligase entspricht der folgenden Aminosäuresequenz:
Die Translation der ersten 60 Aminosäuren dieses offenen Leserasters (der thermophilen Ligase) weist eine Homologie zur Ligase aus E. coli auf, die besser als 50% ist [siehe Mol. Gen. Genet. 204: 1 (1986)], was die Schlussfolgerung nahe legt, dass dieses lange Leseraster den Anfang des Gens aus T. aquaticus darstellt. Aus den genetischen Ergebnissen bei den BamHI-Fragmenten kann man die Schlussfolgerung ziehen, dass sich die Größe dieser Ligase über eine Länge von 400 bis 1.100 Aminosäuren erstreckt. Das gereinigte Protein soll eine relative Molekülmasse von ungefähr 79.000 haben [siehe J. Biol. Chem. 259: 1004 (1984)], die in den Grenzen der genetischen Ergebnisse liegt, die für die vorliegende Erfindung festgestellt wurden. Angesichts der Tatsache, dass das Klon pDZ7 funktionelle Ligase aus T. aquaticus produziert (d. h. es kodiert das Gen in seiner Gesamtheit), und in Anbetracht der DNA-Sequenz des Aminoendes wurde die gesamte DNA-Sequenz des Gens unter Verwendung entweder manueller oder automatisierter Verfahren bestimmt, wie in der Literatur beschrieben [siehe z. B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4767 (1987); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4076 (1989); Science 239: 487 (1987); Nature 321: 674 (1986); Biotechniques 8: 184 (1990); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5610 (1988) und Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9436 (1988)].
Die Plasmide pDZ2, pDZ3, pDZ6 oder pDZ7 können dafür verwendet werden, weitere Überproduktionsvektoren zu konstruieren, und zwar unter Anwendung von Verfahren, die den Fachleuten für biotechnische Untersuchungen wohlbekannt sind. Dazu kann die Verwendung von Promotern und Ribosomen-Bindungsstellen gehören, wie oben beschrieben. So z. B. kann das Plasmid pDZ7 (siehe 1) an seiner nur einmal vorkommenden Stelle Asp718 linearisiert werden und überschüssige Nukleotiden können vor dem Ligasegen aus T. aquaticus nahe am ATG-Startkodon durch die Verwendung von Bal31 oder einer Kombination aus ExoIII und Mung-Bohnen- oder S₁-Nuklease zurechtgestutzt werden, wie es oben schon beschrieben wurde. Das kann dann mit einem glatten Ende an eine natürliche aktivierende Sequenz (eine Promoter- und Translationsstartsequenz) ligiert werden, die auf ähnliche Weise oder durch eine für diesen Zweck hergestellte, synthetische, aktivierende Sequenz erzeugt wird. Außerdem können Sequenzen, die in einem externen oder internen Verhältnis zu dem Gen aus T. aquaticus stehen, modifiziert werden, um potenzielle RNA-Strukturen zu entfernen, die die Transkription oder Translation hemmen können. Diese Verfahren sollen früher eine Überproduktion der thermophilen Restriktionsendonuklease Taq I hervorgerufen haben, die größer als 30% der löslichen E. coli-Proteine war [siehe Gene 65: 166 (1988)]. Aber auch synthetische Oligonukleotide können synthetisiert werden, so dass der Anfang des Ligasegens aus T. aquaticus direkt mit einer aktivierenden Sequenz unter Verwendung von PCR-Verfahren fusioniert [siehe z. B. Biotechniques 8: 178 (1990); Gene 77: 51 (1989) und Nucl. Acids Res. 17: 723 (1989)].
Aus den vorhergehenden Sequenzen ist ersichtlich, dass es da eine Bgl II-Stelle gibt, die den Nukleotiden entspricht, die die Aminosäurereste 31–33 kodieren. Mit dieser Information könnte ein starker Promoter mit einer optimalen Shine-Dalgarno-Sequenz vor dieses Gen eingebaut werden, und zwar unter Nutzung einer PCR. Zwei kleinere Warnungen sollten beachtet werden: (1) Versuche, das gesamte Gen (3 kb, hoher Guanin-Cytosin-Gehalt) mit einer PCR zu kopieren, waren nicht immer erfolgreich. Und (2) das Plasmid pDZ7 hatte zwei Bam HI und Bgl II-Stellen, je eine innerhalb des Ligasegens.
Das Plasmid pDZ7 wurde teilweise sowohl mit Bam HI als auch mit Bgl II verdaut, das kleinere lineare Fragment mit der korrekten Größe wurde von dem sich über die volle Länge erstreckenden, linearen Fragment durch Elektrophorese getrennt, ausgeschnitten und – wie schon früher beschrieben – gereinigt. Da Bam HI und Bgl II den gleichen Überhang (5' GATC) produzieren, könnte das lineare Fragment mit T4-Ligase rezirkularisiert und per Transformation in den E. coli-Stamm AK53 eingeführt werden. Verschiedene Klone hatten das 0,5 kb große BamHI bzw. Bgl II-Fragment deletiert, das zu einem Plasmid von 5,7 kb führt, und ein derartiger Klon wurde als pDZ12 bezeichnet. Die synthetischen Oligonukleotide Nr. 66, Nr. 78, Nr. 85 und Nr. 94 wurden synthetisiert, um der Fusion des phoA-Promoters [aus dem Plasmid pFBT64; siehe Gene 56: 13 (1987)] und der Ribosomen-Bindungssequenz zum Startpunkt des Ligasegens unter Verwendung einer PCR Rechnung zu tragen [siehe Biotechniques 8: 178 (1990); Gene 77: 51 (1989); Gene 77: 61 (1989) und Nucl. Acids Res. 17: 723 (1989)]. Diese in der 9 anschaulich dargestellten Klone sind folgende:

Nr. 66 19 mer; Pvu II-Stelle zum T7-Promoter über phoA-Promoter, oberer Strang des Plasmids pFBT64 (Richtung des TaqI-Endonuklease-Gens);
Nr. 78 32 mer; 5'-Ende komplementär zum Anfang des Ligasegens aus Thermus; 3'-Ende komplementär zur Shine-Dalgarno-Seite des phoA-Promoters, unterer Strang des Plasmids pFBT64:
Nr. 85 33 mer; 5'-Ende komplementär zur Shine-Dalgarno-Seite des phoA-Promoters; 3'-Ende komplementär zum Startpunkt des Ligasegens aus Thermus, Oberstrang des Plasmids pDZ7 (Richtung des Ligasegens);
Nr. 94 18 mer; unterer Strang des Plasmids pDZ7, der dem nicht translatierten Strang der Aminosäurereste 40 bis 35 des Ligasegens entspricht, stromabwärts von der Bgl II-Stelle an den Aminosäureresten 33 bis 31:

Kurz gesagt, das erfolgte in einem einzigen Reaktionsgefäß, in dem 400 ng der Primer Nr. 66 und Nr. 78 einer Menge von 200 ng Pst I bzw. Pvu II-verdauten pFBT64 hinzugefügt wurden, das je 50 μmol des dATP, cCTP, cGTP und dTTP sowie 2,5 Einheiten Amplitaq in 100 μl eines PCR-Puffers enthielt, und Zyklen mit einer Dauer von 1 Min. bei 94°C, von 2 Min. bei 55°C, von 3 Min. bei 72°C mit einer Verlängerung von 3 Sekunden pro Zyklus im Verlauf von 25 Zyklen gemäß dem Protokoll des Herstellers (Cetus, Emeryville, Kalifornien) durchliefen. Ein zweites Reaktionsgefäß enthielt 400 ng der Primer Nr. 85 und Nr. 94, 200 ng von mit Eco RI bzw. Bam HI verdautem pDZ7 im gleichen Reaktionspuffer und Enzym und durchlief die gleiche, oben angegebene Inkubationszeit. Es wurde nachgewiesen, dass die Produkte dieser Reaktionen die korrekte Länge hatten, wie durch die Analyse mit der Gel-Elektrophorese festgestellt wurde. Ein drittes Reaktionsgefäß enthielt 2 μl von jedem Produkt, 400 ng der Primer Nr. 66 und Nr. 94 im gleichen Reaktionspuffer und Enzym und durchlief die oben angegebene Inkubationszeit. Die Primer wurden so konstruiert, dass eine Überlappung zwischen den beiden Produkten einer PCR-Synthese des über die kombinierte Länge verschmolzenen Produktes Rechnung tragen würde. Das daraus hervorgegangene Fragment wurde mit Phenol, n-Butanol und Ethanol extrahiert, das ausgefällt wurde, um die Taq-Polymerase zu entfernen. Das Produkt-PCR-Fragment wurde mit Bgl II und Eco RI behandelt, in niedrig schmelzender Agarose elektrophoretisch aufgetrennt und – wie oben beschrieben – gereinigt. In der Zwischenzeit wurden das 2,7 kb große Ligasegen Pst I – Bgl II, das ein Fragment des pDZ12 enthielt, sowie das 2,4 kb große PstI-Eco RI B-Lactamasegen und das den Startpunkt enthaltende Fragment aus dem Plasmid pFBT64 gereinigt. Alle drei Fragmente wurden in einer Dreiwege-Ligation zusammengeführt und per Transformation in den E. coli-Stamm AK53 eingeführt. Mehrere Klone enthielten ein 5,5 kb großes Plasmid, das eine Überproduktion von Ligase unter der Steuerung eines phoA-Promoters zu verzeichnen hatte. Ein derartiges Plasmid ist als pDZ13 bezeichnet worden.
In veröffentlichten Untersuchungen über die Überproduktion der thermophilen Restriktionsendonuklease Taq 1, die größer als 30% der löslichen E. coli-Proteine war [siehe Gene 65: 166 (1988)] wurde darüber informiert, dass die Endonuklease-Ausbeuten etwas besser waren, wenn das β-Lactamasegen umgekehrt wurde und daher die Transkription in der dem phoA-Promoter entgegengesetzten Richtung erfolgte. Um eine ähnliche Konstruktion mit dem in der vorliegenden Erfindung verwendeten Ligasegen zustande zu bringen, wurde das 2,3 kb große Pst I-Pvu II-Fragment aus dem Plasmid pFBLT69, (das die B-Lactamase in umgekehrter Ausrichtung enthält) an das 3,2 kb große Pst I-Pvu II-Ligasgen ligiert, das ein Fragment des Plasmids pDZ13 enthält. Das Ligationsgemisch wurde in den E. coli-Stamm AK53 transformiert und verschiedene Transformanten wurden durch Restriktionsverdaue analysiert, um die Ausrichtung des B-Lactamasegens zu bestätigen. Ein solcher Klon ist als pDZ15 bezeichnet worden. Die Ligaseproduktion im pDZ15 ist genauso gut, wenn nicht sogar etwas besser als im pDZ13. Das Ligaseenzym scheint etwas empfindlich gegenüber Proteasen zu sein und die Zellen sollten nach der Induktion nicht länger als 9 Stunden wachsen. Proteolytische Produkte des Ligasegens können noch immer eine thermostabile Ligaseaktivität aufweisen (das ist bei der Taq-Polymerase bewiesen worden).
Thermophile Proteine können erheblich modifiziert werden und behalten immer noch eine ausreichende Aktivität für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung. So z. B. ist bewiesen worden, dass die Deletion von ungefähr einem Drittel der kodierenden Sequenz am Aminoende der Taq-Polymerase immer noch ein Genprodukt produziert, das bei der Polymeraseaktivität aktiv ist [siehe J. Biol. Chem. 264: 6427 (1989)]. Aber auch bei einem anderen thermophilen Protein, der Restriktionsendonuklease Taq I, wurde der Nachweis erbracht, dass es im Wesentlichen die volle Aktivität beibehält, wenn Aminosäuren dem Aminoende (+7), dem Carboxy-Terminus (+38) oder an bestimmten Positionen im Inneren (von +2 bis +34) [siehe Gene 65: 166 (1988)] hinzugefügt wurden. Folglich kann eine Modifizierung der Primärstruktur durch Deletion, n-Terminus-Addition, c-Terminus-Addition, interne Addition oder Duplikation oder Veränderung der während der Translation in die Sequenz eingebauten Aminosäuren erfolgen, ohne die Aktivität oder thermostabile Beschaffenheit des Proteins zu zerstören. Außerdem gewährleistet die DNA, die diese Sequenzen kodiert, die Möglichkeit, die Kodonsequenz zu modifizieren, um so mutierte Proteinformen zu erzeugen, die auch eine Ligaseaktivität aufweisen. Solche Substitutionen oder andere Veränderungen führen zu neuartigen Proteinen.
Man wird auch zu würdigen wissen, dass andere ligierende Proteine durch den Prozess isoliert werden können, wie in diesen Beispielen veranschaulicht worden ist. Man kann erwarten, dass unterschiedliche Zelllinien Ligasen produzieren, die andere physikalische Eigenschaften aufweisen als jene Ligase, die die aus dem HB8-Stamm des T. aquaticus isoliert worden ist, der bei der vorliegenden Erfindung verwendet wurde. Außerdem können infolge genetischer Polymorphismen oder zellvermittelter Modifikationen des Enzyms oder seiner Vorläufer Variationen existieren. Außerdem kann die Aminosäuresequenz einer so isolierten Ligase durch genetische Techniken modifiziert werden, um Ligasen mit veränderten biologischen Aktivitäten und Eigenschaften zu produzieren. Die daraus hervorgehende DNA-Sequenz kann dann in der Lage sein, ein Protein zu kodieren, das im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz hat wie die HB8-Ligase aus T. aquaticus, aber ein höheres oder niedrigeres Aktivitätsniveau aufweist.
BEISPIEL VI
(Reinigung des Ligaseenzyms)
Die Zellen des E. coli-Stamms AK53, die die Plasmide pDZ6 und pGP1-2 enthalten (die das RNA-Polymerasegen T7 hinter dem Lambda-P_L-Promoter und unter Kontrolle des temperaturempfindlichen Lambda-Repressors C₁₅₈₇ enthalten) [siehe Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1074 (1985) und das US-Patent 4.795.699 ] lässt man über Nacht bei 32°C auf TY-Platten wachsen, die Ampicillin zu 50 μg/ml und Kanamycin zu 50 μg/ml enthalten, um die Erhaltung beider Plasmide zu gewährleisten. Frische Kolonien wurden in 1 Liter eines sterilen 50 mM Tris-HCl-Puffers bei einem pH-Wert von 7,6 resuspendiert, der 6 g NaCl, 25 g Bacto^TM-trypton, 7,5 g Hefeextrakt, 1 g Glukose, 1,6 g Caseinaminosäure-Hydrolysat, 50 μg/ml Kanamycin und 50 μg/ml Ampicillin enthielt. Und man ließ sie bei 32°C in einem Zweiliter-Kolben wachsen, der mit 200 U/min geschüttelt wurde. Als die optische Dichte (O. D. 550) Werte zwischen 0,8 und 1,0 erreichte, wurde die Synthese der T7-Polymerase dadurch induziert, dass die Zellen für 30–40 Minuten einer Temperatur von 42°C ausgesetzt wurden. Eine weitere Synthese der E. coli-Proteine wurde durch die Zufuhr von 5 ml aus einer Menge von 20 mg/ml Rifampicin gehemmt, das in Methanol bis zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml aufgelöst wurde Unter diesen Bedingungen sollten nur Gene hinter dem T7-Promoter transkribiert und daher translatiert werden. Die Zellen durchliefen eine Inkubationszeit von weiteren 5 Stunden bei 42°C.
Aber auch die E. coli-Zellen des Stamms AK53, die die Plasmide pDZ15 enthalten (Ligase unter Kontrolle des phoA-Promoters), ließ man über Nacht bei 37°C auf TY-Platten wachsen, die 50 μg/ml Ampicillin enthalten. Frische Kolonien wurden in 50 ml einer angereicherten Nährlösung resuspendiert, die 50 μg/ml Ampicillin enthielt, und man ließ sie bei 37°C in einem 500 ml Kolben wachsen, der die Kultur mit 200 U/min in einem G76-Tischschüttelapparat schüttelte. Als die optische Dichte (O. D. 500) Werte zwischen 0,65 und 0,85 erreichte, wurden 20 ml in einem (1) Liter MOPS-Medium verdünnt, das 0,2 mM K₂HPO₄ enthielt [siehe J. Bacteriology 119: 736 (1974)], um den phoA-Promoter zu induzieren. Die Zellen ließ man bei 37°C in einem Zweiliter-Kolben wachsen, der die Kultur in einem G25-Fußbodenschüttelapparat weitere 9 Stunden lang bei 200 U/min schüttelte.
Im Anschluss an die Inkubation wurden die Zellen in Eis abgekühlt, durch Zentrifugierung geerntet (15 Minuten lang bei 5.000 U/min), in 20 ml Wasser resuspendiert, in Zentrifugenbecher für 35 ml übertragen, erneut zentrifugiert (6 Minuten lang bei 7.000 U/min) und das Pellet wurde solange eingefroren, bis es für die Proteinisolierung bereit war. Nach dem Auftauen wurde das Pellet in 20 ml des Puffers A (20 mM Tris-HCl-Puffer bei einem pH-Wert von 7,6 mit einem Gehalt von 1 mM EDTA) resuspendiert, der 10 mM 2-Mercaptoethanol und 0,15 mM PMSF enthielt. Nach der Behandlung mit Ultraschall (5 × 1 Min. mit 50% Energie bei 4°C), wurde die Lösung 60 Minuten lang bei 39.000 × g zentrifugiert.
Das Enzym hat eine geschätzte relative Molekülmasse von 75.000 bis 85.000 Dalton, wenn man es mit dem B-Standard einer Phosphorylase vergleicht, dem eine relative Molekülmasse von 92.500 Dalton zugewiesen ist.
Als Alternative wurden 2 Liter der mit pDZ15 induzierten Zellen geerntet und mit Ultraschall behandelt. Die Trümmer wurden dann durch Zentrifugierung – wie oben beschrieben – beseitigt.
Den Überstand (40 ml) brachte man in 300 mM KCl ein und ließ ihn durch eine 5 ml DEAE-Sephacel-Säule hindurchlaufen, um fremde DNA unter Verwendung eines 70 ml-Puffers A mit einem Gehalt von 0,3 M KCl zu entfernen. Die Durchflussfraktionen, die die Ligase enthalten, wurden vereinigt und 20 Minuten lang bei 65°C behandelt, um viele Enzyme aus E. coli, einschließlich der Endo- oder Exonukleasen, einer irreversiblen Hitzedenaturierung zu unterziehen. Die denaturierten Proteine wurden dann durch Zentrifugierung 15 Minuten lang bei 39.000 × g entfernt und das Ligase-Enzym wurde aus dem Überstand ausgefällt, und zwar durch die Zugabe einer gleichen Menge gesättigter (NH₄)₂SO₄ bei Zimmertemperatur im Verlauf von 30 Minuten. Das Ammoniumsulfat-Präzipitat wurde durch Zentrifugierung mit 8.000 U/min in einer klinischen Zentrifuge geerntet und in 4 ml destillierten Wassers resuspendiert. Die Proben wurden gegen einen Puffer A dialysiert, gefolgt von einem Puffer A mit einem Gehalt von 50 mM KCl. Die dialysierte Proteinlösung wurde auf eine 40 ml-Phosphozellulose-Säule aufgebracht, die mit Puffer A, der 50 mM KCl enthielt, äquilibriert wurde. Nach dem Waschen mit 80 ml des gleichen Puffers wurde die Säule mit einem 120 ml linearen KCl-Gradienten (0,05 bis 0,5 mM) im Puffer A eluiert. Das Enzym eluierte als ein spitzer Peak bei 0,25 bis 0,35 M KCl. Das Protein wandert mit zwei Banden mit einer scheinbaren Molekülmasse von ca. 81.000 (adenylierte Form) und 78.000 (nicht adenylierte Form) und ist zu ungefähr 98–99% rein, wie durch die SDS-10%-Polyacrylamidgel-Elektrophorese beobachtet wurde. Man kann eine Umwandlung zwischen den beiden Formen erzielen, indem man 150 μg Protein für 30 Minuten bei 65°C entweder in einem Ligasepuffer, der 25 μg Lachssperma-DNA mit Einzelstrangbruch ohne NAD enthält (was zur nicht adenylierten Form führt), oder in einem Ligasepuffer mit 10 mM NAD- (was zur adenylierten Form führt) inkubiert. Eine gleiche Menge von 20 mM Tris-HCl mit einem pH-Wert von 8,0 in 100-prozentigem Glycerol, das 1 mM EDTA, 2 mM Dithiothreitol (DTT) und 200 μg/ml Rinderserumalbumin (Fraktion V) enthält, wird hinzugefügt (die Endkonzentration des Glycerols beträgt 50%) und das Enzym wird bei entweder –70°C oder bei –20°C aufbewahrt. Aus Zellen in einer Menge von 2 Liter erhält man eine Endausbeute von 6 mg Ligase in einem 16 ml umfassenden Speicherpuffer bei 625 Einheiten zur Schließung eines Einzelstrangbruches pro Mikroliter. Das entspricht einer Gesamtmenge von 10.000.000 Enzymeinheiten und einer spezifischen Aktivität von 1.666.667 Einheiten pro mg.
Da bekannt ist, dass thermophile Proteine dazu tendieren, etwas hydrophober zu sein als ihre mesophilen Counterparts kann die Zugabe nichtionischer Detergensen oder anderer Stabilisierungsmittel bei einer langzeitigen Aufbewahrung von Nutzen sein. Die Aufbewahrungspuffer können deshalb solche zusätzlichen Komponenten enthalten, wie z. B. Glycerol (50%), Saccharose (25%), Protease-Inhibitoren (0,5–1,0 mM PMSF, 10^–7 M Pepstatin A), Salz (KCl, vorzugsweise bei 100–500 mM), EDTA (0,1–1,0 mM), Rinderserumalbumin (100–500 μg/ml), Gelatine, Dithiothreitol (1–10 mM) und Mercaptethanol (1–10 mM). Außerdem ist es besser, dass der Aufbewahrungspuffer mindestens ein nichtionisches, polymerisches Detergens enthält. Eine teilweise Auflistung solcher Detergentia würde auch ethoxylierte, fetthaltige Alkoholether und Laurylether, ethoxylierte Alkylphenole, Polyethylenglykol-Monoolenatverbindungen und insbesondere Triton X-100, NP-40 und Tween 20 bei 0,1–0,5-prozentigem Vol/Vol enthalten.
Um einen Test auf Ligaseaktivität durchführen zu können, kommt es darauf an, ein Verfahren anzuwenden, das nicht durch die Schmelztemperatur (T_m) der Substrate verzerrt wird. So z. B. ist eine Ligation kohäsiver Enden von 4 Basen am wirksamsten bei einer solch niedrigen Temperatur, wie z. B. 4°C, weit unterhalb des Temperaturoptimums für die T4-Ligase (die bei 37°C liegt) und gewiss unterhalb des Temperaturoptimums einer thermophilen Ligase. Ein Testverfahren, das konsistent sein sollte, ist der Einzelstrangbruchschließungstest, bei dem eine ringförmige Plasmid-DNA an verschiedenen Stellen zufällig Einzelstrangbrüche aufweist, und zwar durch DNaseI. Die Fähigkeit der DNA zur Schließung all dieser Einzelstrangbrüche und zur Erzeugung ringförmiger, doppelsträngiger DNA kann dadurch geprüft werden, dass der einen Einzelstrangbruch aufweisende Ring von der offenen ringförmigen DNA getrennt wird, und zwar mittels Elektrophorese in einem Agarose-Gel, das Ethidiumbromid enthält. So z. B. wandert die ringförmige, doppelsträngige Form des Plasmids pUC4KIXX [siehe Gene 37: 111 (1985)] schneller als die lineare Form und beträchtlich schneller als die Form mit Einzelstrangbruch auf einem 1-prozentigen Agarose-Gel, das 0,2 M Glycin NaOH mit pH-Wert 8,5, 0,1 mM EDTA und 1 μg/ml Ethidiumbromid enthält und bei 150 V für 1,5 Stunden im gleichen Puffer aktiv ist.
BEISPIEL VII
(Thermophiler Ligase-Assay)
Die einen Einzelstrangbruch aufweisende pUC4KIXX DNA wurde durch die Zugabe von 3 μl frisch verdünnter 1 μg/ml DNaseI zu 5 μg DNA in 50 μl des 50 mM Tris-HCl-Puffers mit einem pH-Wert von 8,0 erzeugt, der 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA und 6 mM Mercaptoethanol enthält. Dieses Gemisch wurde bei Zimmertemperatur 5 Minuten lang inkubiert, die DNase durch Hitze bei 65°C im Verlauf von 10 Minuten zerstört und die Probe bis zur Verwendung bei –20°C eingefroren und aufbewahrt. Unter diesen Bedingungen befanden sich ungefähr 90% der DNA in der ringförmigen Form mit Einzelstrangbruch, während ungefähr 5% in der linearen Form und 5% in der ringförmigen, doppelsträngigen Form vorlagen.
Die wie oben präparierte thermophile Ligase wurde geprüft, und zwar durch die Zugabe serieller Verdünnungen der Ligase zu einer Menge von 0,5 μg der pUC4KIXX DNA mit Einzelstrangbruch in 20 μl 20 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,6, der 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 10 mM NAD und 10 mM Dithiothreitol enthält, mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet wird und eine Inkubationszeit von 15 Minuten bei 65°C durchläuft. Zur Kontrolle wurde die T4-Ligase geprüft, und zwar durch die Zugabe serieller Verdünnungen der Ligase zu 5 μg der pUC4KIXX DNA mit Einzelstrangbruch in 20 μl 50 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 8,0, der 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM ATP und 6 mM Mercaptoethanol enthält und eine Inkubationszeit von 15 Minuten bei 37°C durchläuft.
Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 4 μl eines Stopppuffers, der 0,2 M EDTA, 50% Glycerol, 1% SDS und 0,1% Bromphenolblau enthielt, beendet und die Produkte wurden – wie oben beschrieben – durch eine Gel-Elektrophorese analysiert.
Eine Ligaseeinheit zur Schließung eines Einzelstrangbruches wird als die Ligasemenge definiert, die 0,5 μg der pUC4KIXX DNA mit Einzelstrangbruch unter den im vorhergehenden Beispiel dargelegten Puffer- und Zeitbedingungen zirkularisiert, so dass durch die Zugabe weiterer Ligase keine zusätzliche DNA zirkularisiert wird.
Als minimales Präparationsverfahren lässt man E. coli-Zellen AK53, die die Plasmide pDZ15 (Ligase unter phoA-Promoterkontrolle) enthalten, über Nacht bei 37°C auf TY-Platten wachsen, die 50 μg/ml Ampicillin enthalten. Frische Kolonien wurden in 5 ml einer angereicherten Nährlösung resuspendiert, die 50 μg/ml Ampicillin enthielt, und man ließ sie bei 37°C wachsen. Als die optische Dichte (O. D. 500) Werte zwischen 0,65 und 0,85 erreichte, wurden 0,12 ml in 6 ml eines MOPS-Mediums verdünnt, das 0,2 mM K₂HPO₄ enthielt, um den phoA-Promoter zu induzieren. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C inkubiert (nach lang andauernder Inkubation kommt es zu einer gewissen Proteolyse, so dass bei der Überwucherung induzierter Zellen zur Vorsicht geraten wird). Die Zellen wurden in Mikrozentrifugengläsern mit einem Volumen von 1,5 ml geerntet, dann in 0,3 ml 20 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,6 resuspendiert, die 1 mM EDTA und 10 mM 2-Mercaptoethanol enthält, und 2 × für 10 Sekunden mit Ultraschall behandelt. Nach dem Entfernen der Trümmer durch Zentrifugierung (12.000 U/min für 2 Min.) wurde der Überstand 20 Minuten lang bei 65°C behandelt, um viele E. coli-Enzyme, einschließlich der Endo- und Exonukleasen [siehe Gene 56: 13 (1987)], irreversibel durch Wärme zu denaturieren. Die denaturierten Trümmer wurden durch Zentrifugierung entfernt und der Überstand wurde – wie oben beschrieben – auf ihren Gehalt überprüft. Ein Mikroliter dieses Überstands enthielt annähernd 625 Aktivitätseinheiten zur Schließung von Einzelstrangbrüchen.
Bei der in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Präparation von Ligase aus T. aquaticus sowie bei der im Handel erhältlichen T4-Ligase wurde nachgewiesen, dass sie ungefähr 125 Einheiten zur Schließung von Einzelstrangbrüchen pro Mikroliter enthalten. Somit hat der Prozess aus 1 Liter E. coli-Zellen, die eine Überproduktion von Ligase aus T. aquaticus aufweisen, ungefähr (800 × 125) 100.000 Enzymeinheiten zur Schließung von Einzelstrangbrüchen gereinigt.
Die gemäß der vorhergehenden Beschreibung präparierte thermophile Ligase besitzt eine Reihe wertvoller Eigenschaften, die sie besonders als Assay nützlich erscheinen lässt, das sowohl DNA amplifiziert als auch ermöglicht, einen einzelnen Basenaustausch in einer DNA-Sequenz zu erkennen. Die wichtigste und einzige Eigenschaft dieser Ligase, die diesen Verwendungen Rechnung trägt, besteht darin, dass die Ligase sich während wiederholter Zyklen zur thermischen Denaturierung bzw. Renaturierung ihre Aktivität bewahrt und somit der Amplifikation der DNA Rechnung trägt, ohne eine wiederholte Zugabe von Ligase erforderlich zu machen. Außerdem wird die in der vorliegenden Erfindung verwendete Ligase Oligonukleotide mit einer Länge ligieren, die ausreicht, um ihre Einmaligkeit in komplexen Genomen bei oder nahe der Temperatur T_m von 65°C zu sichern, und sie wird auch genau zwischen exakt komplementären Oligonukleotidsequenzen und solchen Oligonukleotidsequenzen unterscheiden, die in Bezug auf eine einzelne Base fehlerhaft gepaart sind.
Bei dem einfacheren der beiden Verfahren, die im Ergebnis der Klonierung der thermophilen Ligase-DNA-Sequenz entwickelt worden sind und als Ligase-Nachweisreaktion (LDR) bezeichnet werden, wird es zwei Oligonukleotid-Sonden ermöglicht, zu einer denaturierten DNA zu hybridisieren, so dass sich das 3'-Ende einer Sonde in unmittelbarer Nachbarschaft zum 5'-Ende der anderen Sonde befindet. Die Oligonukleotide werden so ausgewählt, dass sie lang genug (20 bis 25 Nukleotide) sind, damit jedes vorwiegend zu seiner einmaligen Position im menschlichen Genom hybridisieren wird. Eine thermophile Ligase kann dann eine kovalente Phosphodiesterbindung zwischen den beiden Oligonukleotiden bilden, vorausgesetzt, dass die Nukleotide an der Verknüpfungsstelle vollkommen komplementär zum Ziel sind. Die Spezifität dieser Einzelstrangbruch-Schließungsreaktion wird besonders auf Grund der Durchführung der Ligation bei oder nahe der T_m der beiden für ihr Ziel bestimmten Oligonukleotide gesteigert. So bildet eine einzelne Basenfehlpaarung an der Verknüpfungsstelle nicht nur eine unvollkommene Doppelhelix, sondern destabilisiert auch das Hybrid bei höherer Temperatur. Folglich wird die thermophile Ligase die Oligonukleotide mit korrekter Basenpaarung effizient verbinden und in Gegenwart der unvollkommen gepaarten Sequenzen fast keine Hintergrundligation ergeben. Bei Anwendung der LDR kann die bei der Ligationsreaktion gewonnene Produktmenge durch wiederholten Ablauf des thermischen Zyklus in linearer Weise erhöht werden.
Bei der thermophilen Ligase-Kettenreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung dienen beide Stränge als Ziele für die Oligonukleotidhybridisierung. Durch die Verwendung von zwei weiteren Oligonukleotiden, die komplementär zum gegenüberliegenden Strang sind, werden die Ligationsprodukte des einen Zyklus zu Zielen für den nächsten Zyklus der Ligation, wie im Allgemeinen in der 2 anschaulich dargestellt ist. Für jedes benachbarte Oligonukleotidpaar befindet sich das Diagnosenukleotid auf der 3'-Seite der Verknüpfungsstelle. So wird eine anomale, zielunabhängige Ligation komplementärer Oligonukleotide durch die Anwendung von nahe bei T_m liegenden Temperaturen und durch die Ausnutzung der schlechten Ligationswirksamkeit der Einzelbasen-3'-Überhänge vermieden. Bei Anwendung der Ligase-Kettenreaktion kann die Produktmenge auf exponentielle Weise durch einen wiederholten Ablauf des thermischen Zyklus erhöht werden.
Um das Potenzial der thermophilen Ligase-Kettenreaktion (LCR) zu testen, wurde das Gen, das das menschliche β-Globin kodiert, als Anfangsmodellsystem ausgewählt, um das der vorliegenden Erfindung zu Grunde liegende Verfahren zu testen. Die bisherige Arbeit hat ergeben, dass sich das normale β^S-Allel und das Sichel-β^S-Allel durch eine einzige A→T-Transversion des zweiten Nukleotids im sechsten Kodon des β-Globin-Gens unterscheiden, wobei ein Glutaminsäurerest sich zu einem Valin in der Hämoglobin-B-Kette gemäß der folgenden Tabelle I umwandelt: TABELLE I
In der folgenden Fortsetzung der Tabelle I werden die Oligonukleotidsequenzen dargestellt, die im vorangehenden Abschnitt in ihrer konventionellen 5' → 3' Ausrichtung aufgelistet wurden:
Die Oligonukleotide, die das 3'-Nukleotid enthalten, das einmalig für jedes Allel ist, wurden mit 5'-Enden unterschiedlicher Länge (siehe Tabelle I) synthetisiert. Bei der Ligation an das invariante ³²P radioaktiv markierte, benachbarte Oligonukleotid konnten die einzelnen Produkte auf einem Polyacrylamid-Denaturierungsgel getrennt und durch Autoradiografie nachgewiesen werden. Gestützt auf diese anfänglichen Prüfergebnisse bei der Autoradiografie wurden die anschließenden Assays unter Verwendung eines automatisierten, nicht radioaktiven Nachweisschemas vorgeformt, in dem die allelspezifischen Oligonukleotide für das Einfangen mit 5'-Biotin markiert wurden und den invarianten Oligonukleotiden ein 3'-Ende mit Digoxigenin angehängt wurde. Die Markierung wurde dann in einem ELISA-Format unter Verwendung des mit alkalischer Phosphatase zusammengefügten Antidigoxigenins und eines kolorimetrischen Substrats für das Enzym sichtbar gemacht.
Wie in der Tabelle I dargestellt ist, werden dort die Nukleotidsequenz und die entsprechende translatierte Sequenz der beim Nachweis der β^A- und β^S-Globingene verwendeten Oligonukleotide veranschaulicht. Die Oligonukleotide 101 und 104 bestimmen das β^A-Target, während die Oligonukleotide 102 und 105 das β^S-Target bestimmen, wenn sie an die markierten Oligonukleotide 107 bzw. 104 ligiert werden. Die Oligonukleotide 103 und 106 wurden dafür vorgesehen, die Wirksamkeit der Ligation der G:T oder G:A und C:A oder C:T Fehlpaarungen unter Verwendung der β^A- bzw. β^S-Globin-Gentargets zu prüfen. Die Oligonukleotide wurden mit Enden von etwas unterschiedlicher Länge konstruiert, um die Unterscheidung verschiedener Produkte zu erleichtern, wenn sie auf einem Polyacrylamid-Denaturierungsgel getrennt werden. Die Enden, die nicht komplementär zur Zielsequenz waren, können als "Reportergruppen" für die einzelne Sequenz angesehen werden. Folglich ergibt die Ligation der Oligonukleotide 101, 102 oder 103 bis 107 Längen von jeweils 45, 47 oder 49 Nukleotiden. Für den komplementären Strang ergibt die Ligation der Oligonukleotide 104, 105 oder 106 bis 109 Längen von jeweils 46, 48 oder 50 Nukleotiden. Die Oligonukleotide wurden auch dafür vorgesehen, berechnete T_m-Werte von 66 bis 70°C aufzuweisen, was gerade bei oder etwas über der Ligationstemperatur liegt.
Um die Ligationsprodukte nachzuweisen, wurden die Oligonukleotide 107 und 109 mit ³²P unter Verwendung der T4-Polynukleotidkinase und ^–32p gemäß dem folgenden Beispiel mit einem 5'-Ende markiert.
BEISPIEL VIII
(Radioaktive Markierung)
Das Oligonukleotid 107 (0,1 μg) wurde mit einem 5'-Ende in 20 μl eines 30 mM Tris-HCl-Puffers mit einem pH-Wert von 8,0, der 20 mM Tricine, 10 mM MgCl₂, 0,5 mM EDTA, 5 mM Dithiothreitol und 400 μCi der [³²p]ATP enthielt, durch Zugabe von 15 Einheiten der T4 Polynukleotidkinase markiert. Nach einer Inkubationszeit von 45 Minuten bei 37°C wurde unmarkiertes ATP einer Menge von 1 mM hinzugefügt und die Inkubation wurde weitere 2 Minuten bei 37°C fortgesetzt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 0,5 μl 0,5 M EDTA abgeschlossen und die Kinase wurde durch Wärme bei 65°C 10 Minuten inaktiviert. Die nicht inkorporierte ³²P-Markierung wurde durch Chromatografie mit Sephadex G-25 entfernt, das mit einem TE-Puffer vorher ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die spezifische Aktivität reichte von 7 × 10⁸ bis 10 × 10⁸ cpm/pg des Oligonukleotids.
Die Spezifität der thermophilen Ligase aus T. aquaticus für ein komplementäres Ziel im Verhältnis zu einem Target mit Fehlpaarung wurde sowohl unter LDR- als auch LCR-Bedingungen verglichen (siehe 3 und die folgende Tabelle II). In der LDR-Reihe wurden zwei benachbarte Oligonukleotide mit denaturierter Target-DNA und Ligase inkubiert, wobei das letzte Nukleotid des unmarkierten Oligonukleotids entweder komplementiert wurde oder bei der Target–DNA eine Fehlpaarung hervorrief. Die Oligonukleotide wurden mit Enden von geringfügig unterschiedlicher Länge konzipiert, um die Unterscheidung verschiedener Produkte zu erleichtern, indem man ihnen ermöglichte, auf einem Denaturierungsgel getrennt zu werden. Folglich ergibt – wie schon vorher offenbart wurde – die Ligation des Oligonukleotids 101 (β^A-Allel), 102 (β^S-Allel) oder 103 mit dem markierten 107 jeweils Längen von 45, 47 oder 49 Nukleotiden. Für den komplementären Strang ergibt die Ligation der Oligonukleotide 104 (β^A-Allel), 105 (β^S-Allel) oder 106 mit dem markierten 109 jeweils Längen von 46, 48 oder 50 Nukleotiden. Die Oligonukleotiden wurden auch so konzipiert, dass sie berechnete T_m-Werte von 66°C bis 70°C aufweisen, d. h. gerade bei oder etwas über der Ligationstemperatur. So konnte die Spezifität der beiden ligierenden Oligonukleotide, die zur Target-DNA mit perfekter Komplementarität (A:T) hybridisiert worden waren, direkt mit jeder möglichen Fehlpaarung (A:A, T:T, G:A, G:T, C:A oder C:T) verglichen werden. Die Methodik zur Bestimmung der Spezifität der Ligation dieser Oligonukleotide in Gegenwart eines β^A- oder β^S-Globin-Gen-Targets wurde genauso wie im folgenden Beispiel bestimmt:
BEISPIEL IX
(Bestimmung der Spezifität thermophiler Ligase)
Ein markiertes Oligonukleotid (200.000 cpm; 0,28 ng; 40 fmol) und ein unmarkiertes Oligonukleotid (27 ng; 40 fmol) wurde in Gegenwart einer Target-DNA (1 fmol = 6 × 10⁸ Moleküle Taq I verdautes β^A- oder β^S-Globin-Plasmid) in 10 μl eines 20 mM Tris-HCl-Puffers mit einem pH-Wert von 7,6 und mit einem Gehalt von 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 10 mM NAD, 10 mM Dithiothreitol, 4 μg DNA aus Lachssperma und 15 Einheiten der thermophilen Ligase zur Schließung von Einzelstrangbrüchen inkubiert und mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet. Die Reaktionen durchliefen eine Inkubationszeit von 1 Minute bei 94°C und danach 4 Minuten bei 65°C. Und dieser Zyklus wurde 5 bis 30 Mal wiederholt. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 8 μl Formamid abgeschlossen, das EDTA (10 mM), Xylen-Cyanol (0,2%) und Bromphenolblau (0,2%) enthielt. Die Proben (4 μl) wurden durch 3-minütiges Kochen denaturiert, bevor sie ins Gel aufgenommen wurden (40.000 cpm/pro Bahn).
Die Produkte wurden durch eine Elektrophorese getrennt, bei der die Proben in Achtergruppen geladen und in das Gel eingeführt werden und dann der nächste Satz geladen wird, wodurch der etwas langsameren Mobilität der Banden auf der rechten Seite des Autoradiogramms der 3 Rechnung getragen wird. Die Elektrophorese erfolgte in einem 10-prozentigen Polyacrylamid-Gel, das 7 M Harnstoff in einem Puffer von 100 mM Tris-Borat mit einem pH-Wert von 8,9 und 1 mM EDTA enthielt, und zwar 2 Stunden lang bei einer konstanten Leistung von 60 W.
Nach der Entfernung des Harnstoffes durch 10-minütiges Einweichen in 10-prozentiger Essigsäure, woran sich ein zweites fünfminütiges Einweichen in Wasser anschloss, wurden die Gele auf 3 mm starkem Whatman-Papier getrocknet und über Nacht bei –70°C auf einem XAR-5-Film der Firma Kodak autoradiografiert (mit oder ohne Du Pont Cronex-Belichtung plus Verstärkerschirm). Banden aus 20 Zyklen wurden aus den Gels ausgeschnitten und auf Radioaktivität geprüft. Die Ergebnisse werden in der Tabelle II aufgeführt.
TABELLE II

Mengenbestimmung der komplementären und fehlgepaarten LDR- und LCR-Banden aus Experimenten mit 20 LDR-Zyklen und 30 LCR-Zyklen, die im Beispiel IX beschrieben und in der 3 dargestellt wurden. Sie wurden aus den Gelen ausgeschnitten und auf Radioaktivität geprüft. Prozentualer Anteil des gebildeten Produkts = cpm in Produktbanden/cpm im Ausgangsoligonukleotidband. Prozentualer Anteil der fehlgepaarten bzw. komplementären Banden = cpm in der Bande der fehlgepaarten Oligonukleotide/cpm in der Bande der komplementären Oligonukleotide unter Verwendung der gleichen Target-DNA und Anzeige des Rausch-Signal-Verhältnisses. Die LDR-Amplifizierung erfolgte unter Verwendung von 6 × 10⁸ Target-Molekülen oder 1 Femtomol; die LCR-Amplifizierung erfolgte unter Verwendung von 6 × 10⁶ Target-Molekülen oder 10 Attomol.

LDR	Oligobase:Targetbase	Gebildetes Produkt (in %)	Fehlgepaart/komplementär (in %)
	A:T	21,5
	T:A	13,2
	T:A	17,9
	A:T	12,4
	A:A	<0,1	<0,4
	T:T	0,12	0,7
	T:T	0,16	1,0
	A:A	<0,1	<0,4
	G:T	0,30	1,4
	C:T	<0,1	<0,4
	G:A	<0,1	<0,4
	C:A	<0,1	<0,4
LCR
	A:T, T:A	41,4
	T:A, A:T	10,4
	A:A, T:T	0,45	1,1
	T:T, A:A	<0,05	<0,2
LCR
	G:T, C:A	0,51	1,3
	G:A, C:T	<0,05	<0,2

Somit wurde der Nachweis erbracht, dass die thermophile Ligase aus T. aquaticus komplementäre von fehlgepaarten Oligonukleotidsequenzen bei allen möglichen fehlgepaarten Basenpaaren in LDR-Assays unterscheidet. Sowohl unter den Bedingungen von Vergleichsversuchen als auch unter den Bedingungen einzelner Ligationsversuche (mit wechselnden Salzkonzentrationen) machten die Fehlpaarungsligationen im ungünstigsten Falle 1,5 bis 1% aus (siehe Tabelle II, G:T und T:T), während andere 0,4% bis <0,1% der Produkte ausmachten (siehe Tabelle II, A:A, C:T, G:A und C:A), die mit komplementären Basenpaaren (A:T) gebildet worden waren. Das ist erheblich besser als das, was (unter Verwendung des radioaktiven Nachweises) über die mesophile T4-Ligase aus E. coli [siehe Gene 76: 245 (1989)] berichtet wurde.
In der Amplifizierungs- bzw. Nachweisversuchsreihe mittels LCR wurden zwei benachbarte Oligonukleotide mit denaturierter Target-DNA und Ligase sowie mit dem komplementären Oligonukleotidensatz inkubiert. Unter diesen Bedingungen kam es entweder zu einer Komplementierung oder zu einer Fehlpaarung der Target-DNA durch das 3'-Nukleotid des unmarkierten Diagnose-Oligonukleotids, aber sein unmarkierter Counterpart komplementierte immer, d. h. A:T für 101 und 104, T:A für 102 und 105 sowie G:C für 103 und 106. Somit würde eine anfängliche "inkorrekte" Ligation eines fehlgepaarten Oligonukleotids später mit der gleichen Wirksamkeit amplifiziert werden wie eine korrekte Ligation. Die Proben enthielten Paare unmarkierter Oligonukleotide (β^A-allelspezifische 101 und 104, β^S-allelspezifische 102 und 105 oder 103 und 106) mit den komplementären und benachbarten Paaren markierter Oligonukleotide 107 und 109. Diese markierten und unmarkierten Oligonukleotide wurden in Gegenwart von Ligase und 10 Attomol der Target-DNA (100-fach weniger Target-DNA als für die LDR) in 20 oder 30 Zyklen wie im Beispiel IX inkubiert. Die daraus hervorgehenden Banden werden im linken Teil der 3 und in der unteren Hälfte der Tabelle II dargestellt.
Wie in der 3 und Tabelle II zu sehen ist, war die thermophile Ligase in der Lage, komplementäre Oligonukleotidsequenzen von fehlgepaarten Oligonukleotidsequenzen bei allen möglichen fehlgepaarten Basenpaaren in LCR-Assays zu unterscheiden. Sowohl unter den Bedingungen von Vergleichsversuchen als auch unter den Bedingungen einzelner Ligationsversuche machten im ungünstigsten Falle die Fehlpaarungsligationen 1,3% bis 0,6% aus (G:T, C:A und A:A, T:T), während andere <0,2% (T:T, A:A und G:A, C:T) der Produkte ausmachten, die mit komplementären Basenpaaren (A:T, T:A) gebildet worden waren. Die LCR unter Verwendung thermophiler Ligase ist somit das einzige Verfahren, das einzelne Basenfehlpaarungen mit hohen Signal-Rausch-Verhältnissen [siehe Genomics 4: 560 (1989)] sowohl amplifizieren als auch nachweisen kann. Also kann man, wenn man die LCR anwendet, den Unterschied zwischen einer solchen einzelnen Basenfehlpaarung feststellen, wie sie zwischen β^A und β^S vorkommt, und die Ergebnisse dieses Assays kann man als diagnostisches Mittel für den normalen Menschen, den Überträger oder den erkrankten Patienten nutzen.
Als der gesamte Komplex der oben beschriebenen Experimente unter Verwendung eines Puffers wiederholt wurde, der 150 mM statt 100 mM KCl enthielt, waren die Ergebnisse im Wesentlichen die gleichen wie in der 3 und die in der Tabelle II aufgeführten, wobei die Ligation der Fehlpaarungsoligonukleotide bei der LDR von 0,6% bis <0,3% und bei der LCR von 1,7% bis <0,3% der genau komplementären Produkte reicht. Folglich scheint die einwandfreie Unterscheidung zwischen übereinstimmend gepaarten und fehlgepaarten Oligonukleotiden nicht in entscheidendem Maße von den Salzbedingungen abhängig zu sein.
Es kann aber auch ein anderes, auf Phosphatase gestütztes Verfahren genutzt werden. Die Ligase-Kettenreaktion oder Ligase-Nachweisreaktion kann in einem Volumen von 10 μl unter Mineralöl erfolgen. Dem werden 50 μl eines 10 mM Tris-HCl-Puffers mit einem pH-Wert von 7,6 hinzugefügt, der 0,5 Einheiten bakterieller, alkalischer Phosphatase (BAP) und 10 mM MgCl₂ enthält, und die Inkubationszeit dauert 2 Stunden bei 65°C (es ist darauf zu achten, dass das Ligaseenzym unter diesen Bedingungen nicht zerstört wird). Der 5'-Ende-Marker auf einem kovalent gebundenen Oligonukleotid ist für BAP nicht mehr empfänglich. Das ligierte Produkt wird vom Monophosphat durch Zugabe von 20 μl der 10 mg/ml DNA des mit Ultraschall behandelten Lachsspermas als Träger getrennt und mit 20 μl einer 50-prozentgen Trichloressigsäure (TCA) ausgefällt. Nach 5-minütiger Zentrifugierung mit 12.000 U/min wird der Überstand entfernt und das Verhältnis von Pellet zu Pellet + Überstand ergibt den prozentualen Anteil des gebildeten Produktes. Ein ähnlicher Assay ist mit der Taq I-Endonuklease verwendet worden und der Versuchsfehler für positive und negative Kontrollen beträgt ungefähr 1–2%.

Die Verwendung der thermophilen Ligase macht es unnötig, sowohl die Salzkonzentration als auch die Enzymkonzentration sorgfältig zu titrieren, wie es bei mesophilen Ligasen verlangt wird. Die Daten aus dieser Versuchsreihe ist in der folgenden Tabelle III aufgeführt. TABELLE III Mengenbestimmung komplementärer und fehlgepaarter LDR- und LCR-Banden bei 100 und 150 mM KCl-Konzentrationen aus Experimenten mit 20 LDR-Zyklen und 30 LCR-Zyklen, die im Beispiel IX beschrieben und in der Fig. 3 anschaulich dargestellt wurden. Die LDR-Amplifizierung erfolgte unter Verwendung von 6 × 10⁸ Target-Molekülen oder 1 Femtomol; Die LCR-Amplifizierung erfolgte unter Verwendung von 6 × 10⁶ Target-Molekülen oder 10 Attomoln. Die fehlgepaarten bzw. komplementären lassen das Rausch-Signal-Verhältnis deutlich erkennen.

LDR	Oligobase: Targetbase	Gebildetes Produkt (in %)	Fehlgepaarte/komplementäre (in %)
		[KCl] (mM)	[KCl] (mM)
		100	150	100	150
	A:T	21,5	23,2
	T:A	13,2	17,2
		100	150	100	150
	T:A	17,9	12,8
	A:T	12,4	11,7
	A:A	<0,1	<0,2	<0,4	<0,3
	T:T	0,12	0,21	0,7	0,3
	T:T	0,16	0,30	1,0	0,6
	A:A	<0,1	<0,2	<0,4	<0,3
	G:T	0,30	0,25	1,4	0,4
	C:T	<0,1	<0,2	<0,4	<0,3
	G:A	<0,1	0,25	<0,4	0,4
	C:A	<0,1	0,20	<0,4	0,3
LCR
	A:T, T:A	41,4	14,2
	T:A, A:T	10,4	18,5
	A:A, T:T	0,45	0,09	1,1	0,6
	T:T, A:A	<0,05	<0,05	<0,2	0,3
	G:T, C:A	0,51	0,24	1,3	1,7
	G:A, C:T	<0,05	<0,1	<0,2	<0,7

Die Spezifität der LCR und LDR wurde unter Verwendung von sowohl β^A- als auch β^S-spezifischen Oligonukleotiden im direkten Vergleich bei der Ligation mit den invarianten, markierten Oligonukleotiden getestet. Unter Verwendung einer Target-DNA (β^A β^S und eine äquimolares Verhältnis von β^A und β^S), die von 1 Femtomol bis zu 1 Attomol reicht, bildete die thermophile Ligase in jedem Fall speziell das korrekte Produkt (die korrekten Produkte); vor diesem Hintergrund wurde kein fehlerhaftes Ligationsprodukt festgestellt, wenn nur ein Target-Allel vorhanden war. Allerdings ist die Wirksamkeit der Bildung β^S-spezifischer etwas geringer als bei der Bildung der β^A-spezifischen Produkte. Und nach 20 Amplifizierungszyklen machten die β^S-spezifischen Produkte ungefähr ein Drittel der β^A- spezifischen Produkte aus, wie durch die Untersuchung ausgeschnittener Produkte auf Radioaktivität quantitativ bestimmt wurde. Deshalb macht ein direkter Konkurrenztest, in dem zwei Oligonukleotide auf unterschiedliche Weise markiert werden (z. B. mit fluoreszierenden Gruppen), um die relativen Anfangskonzentrationen jedes Zielsequenz-Allels quantitativ zu bestimmen, sorgfältige Titrationen für jedes Allel erforderlich.

Die Spezifität der LCR-Amplifizierung der DNA mit subAttomoln Mengen einer Target-DNA wurde auch geprüft. Der Grad der LCR-Amplifizierung der DNA wurde in Gegenwart einer Target-DNA bestimmt, die von 100 Attomol (6 × 10⁷ Molekülen) bis zu weniger als einem Molekül pro Reaktionsgefäß reicht. Die Reaktionen durchliefen eine Inkubationszeit von 20 oder 30 Zyklen und die Produkte wurden so getrennt und quantitativ bestimmt, wie es in der 4 und in der folgenden Tabelle IV dargestellt ist. TABELLE IV Mengenbestimmung der LCR-Amplifizierung. Banden aus LCR-Versuchen mit 30 Zyklen wurden aus den Gelen ausgeschnitten und auf Radioaktivität untersucht. Bei höherer Targetkonzentration war die DNA-Amplifikation nach 20 Zyklen im Wesentlichen fertig; eine etwas ungenaue Ausschneidung der 30 Zyklen umfassenden Banden aus diesem Abschnitt des Gels erklärt wahrscheinlich, dass die Werte für das gebildete Produkt über 100% hinausgehen. Der prozentuale Anteil des gebildeten Produkts = cpm im Produktband/cpm in der Startbande des Oligonukleotids; Amplifizierung = Anzahl der gebildeten Produktmoleküle/Anzahl der Zielmoleküle

Zielmoleküle	Gebildetes Produkt (in %)	Amplifizierung
6 × 10⁷	134
2 × 10⁷	96
6 × 10⁶	107
2 × 10⁶	78
6 × 10⁵	85
2 × 10⁵	48	5,8 × 10⁴
6 × 10⁴	25	1,0 × 10⁵
2 × 10⁴	4,5	5,4 × 10⁴
6 × 10³	2,3	9,2 × 10⁴
2 × 10³	0,36	4,3 × 10⁴
6 × 10²	0,18	7,2 × 10⁴
2 × 10²	0,14	1,7 × 10⁵
60	<0,05
20	<0,05
6	<0,05
2	<0,05
0	<0,05

Bei Abwesenheit eines Targets wurde kein Hintergrundsignal festgestellt, wenn die Träger-DNA aus Lachssperma (4 μg) vorhanden war, wie in der 4 zu sehen ist. Bei höheren anfänglichen Targetkonzentrationen war die DNA-Amplifikation im Wesentlichen nach 20 Zyklen beendet, während bei geringeren anfänglichen Targetkonzentrationen mit zusätzlichen Amplifikationszyklen erheblich mehr Produkte gebildet werden. Unter diesen Bedingungen könnten 200 Moleküle der anfänglichen Target-DNA nach 30 Zyklen ohne weiteres nachgewiesen werden.
Die thermostabile Beschaffenheit des Enzyms ist in der 4 ohne weiteres sichtbar. Durch Vergleich der Menge des nach 20 Zyklen gebildeten Produkts mit dem nach 30 Zyklen gebildeten Produkt wird ersichtlich, dass bei den niedrigeren Konzentrationen der Target-DNA nach weiteren Zyklen (siehe besonders die 2 × 10⁴ bis 2 × 10² Moleküle der Target-DNA) ein zusätzliches Produkt gebildet wird. Mit anderen Worten, das Enzym besitzt immer noch Aktivität nach 20 Zyklen bei 94°C für 1 Minute, gefolgt von 65°C für 4 Minuten.
Folglich behält die Ligase aus T. aquaticus die Fähigkeit, die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen zwei benachbarten Oligonukleotiden zu katalysieren, die bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 50°C bis ungefähr 85°C zu einem komplementären DNA-Strang hybridisiert werden, nachdem man ihn wiederholt Temperaturen ausgesetzt hat, bei denen DNA denaturiert wird, nämlich ungefähr 0,25 bis ungefähr 4 Minuten lang im Bereich von ungefähr 105°C.
Daher macht die spezifische Amplifikation einer Nukleinsäure-Testsubstanz mit einer bekannten Nukleotidsequenz unter Verwendung einer LCR Folgendes erforderlich: (1) zwei benachbarte Oligonukleotide, die komplementär zur Zielsequenz der Nukleinsäure sind und einen molaren Überschuss der Zielsequenz der Nukleinsäure haben sowie keine Fehlpaarung zur Zielsequenz der Nukleinsäure an der Verknüpfungsstelle der benachbarten Oligonukleotide aufweisen; (2) ein zweiter Satz benachbarter Oligonukleotide, die komplementär zu dem ersten Satz benachbarter Oligonukleotide sind, sowie komplementär zur Zielsequenz der Nukleinsäure sind und einen molaren Überschuss der Zielsequenz der Nukleinsäure haben sowie keine Fehlpaarung zur Zielsequenz der Nukleinsäure an der Verknüpfungsstelle dieses zweiten Satzes benachbarter Oligonukleotide aufweisen; (3) eine thermostabile Ligase, die nicht irreversibel denaturiert ist und ihre katalytische Fähigkeit nicht verliert, wenn sie Temperaturen von ungefähr 50°C bis ungefähr 105°C ausgesetzt wird; und (4) dieses Ligasegemisch wird wiederholten Temperaturzyklen ausgesetzt, zu denen eine erste Temperatur zählt, um die DNA zu denaturieren (in einem Bereich von ungefähr 90°C bis ungefähr 105°C), sowie eine zweite Temperatur gehört, um einer Hybridisierung bzw. Ligation (in einem Bereich von ungefähr 50°C bis ungefähr 85°C) Rechnung zu tragen. Bei der Amplifikation des oben beschriebenen β^A-Globin-Allels waren die Bestandteile: (1) die Oligonukleotide 101 und 107; (2) die Oligonukleotide 104 und 109; (3) die Ligase aus T. aquaticus und (4) 30 einminütige Temperaturzyklen bei 94°C, danach 4 Minuten bei 65°C.
In der 4 entsprechen die Banden von 45 und 46 Nukleotiden den Ligationsprodukten der kodierenden und komplementären β^A-Globin-Oligonukleotide. Produkte mit einer geringeren relativen Molekülmasse entsprechen der Ligation der bei der anfänglichen Ligationsreaktion vorhandenen Deletions-Oligonukleotide. Da die Proben in Achtergruppen geladen werden, ergibt die rechte Seite des Autoradiogramms den Anschein einer langsameren Migration.
Um die Fähigkeit der Ligase zur Unterscheidung zwischen komplementären und fehlgepaarten Oligonukleotiden weiter zu testen, wurde ein LCR-Experiment in Anwesenheit und in Abwesenheit von Oligonukleotiden durchgeführt, das zu G-T und C-A Fehlpaarungen entsprechend dem folgenden Beispiel führen würde, das nicht nur die DNA-Amplifikation zeigt, sondern auch die thermostabile Beschaffenheit des im Beispiel IX aufgefundenen Enzyms unterstützt.
BEISPIEL X
Ein Satz von Experimenten enthielt je 40 Femtomol der unmarkierten Oligonukleotide 101 und 104, während der zweite Satz zusätzlich 40 Femtomol der unmarkierten Oligonukleotide 103 und 106 aufwies. Beide Sätze enthielten je 40 Femtomol der markierten Oligonukleotide 107 und 109. Die markierten Oligonukleotide (200.000 cpm; 28 ng; 40 Femtomol) und die unmarkierten Oligonukleotide (.27 ng; 40 Femtomol) wurden bei Anwesenheit einer Target-DNA inkubiert, die von 100 Attomol (6 × 10⁷ Moleküle) bis 0,01 Attomol (6 × 10³ Moleküle) eines durch Taq/verdauten β^A- oder β^S-Globin-Plasmids reicht. Die Inkubation erfolgte in 20 μl eines 20 mM Tris-HCl-Puffers mit einem pH-Wert von 7,6, der 100 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 10 mM NAD, 10 mM Dithiothreitol, 4 μg DNA aus Lachssperma und 15 Einheiten der Ligase aus T. aquaticus zur Schließung von Einzelstrangbrüchen enthielt, und wurde mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet. Die Reaktionen durchliefen eine Inkubationszeit von 1 Minute bei 94°C, danach 4 Minuten bei 65°C. Und dieser Zyklus wurde 20 oder 30 Mal wiederholt.

Die sich daraus ergebenden Proben wurden einer Elektrophorese unterzogen und über Nacht mit Hilfe eines Cronex-Verstärkerschirms in Gel autoradiografiert. Und die Banden wurden gezählt. Die Banden aus dem autoradiografierten Gel werden in der 4 dargestellt und die Mengenangaben der LCR-Amplifikation werden in der folgenden Tabelle V aufgeführt. TABELLE V Mengenbestimmung der LCR-Amplifikation bei Anwesenheit und Abwesenheit von fehlgepaarten Konkurrenzmolekülen.

Komplementäre Oligonukleotide (101, 104) (A:T, T:A)			Komplementäre & fehlgepaarte Oligonukleotide (101, 104 & 103, 106) (A:T, T:A & G:T, C:A)
Target-Moleküle	Gebildetes Produkt	Amplifikation	Gebildetes Produkt	Amplifikation	fehlgepaarte/komplementäre
6 × 10⁷(β^A)	114		93		1,0
2 × 10⁷	93		95		1,8
6 × 10⁶	102		93		0,5
2 × 10⁶	90		67		0,5
6 × 10⁵	51		46
2 × 10⁵	31	3,7 × 10⁴	23	2,8 × 10⁴
6 × 10⁴	17	6,8 × 10⁴	9,3	3,7 × 10⁴
2 × 10⁴	8,6	1,0 × 10⁵	2,9	3,5 × 10⁴
6 × 10³	3,2	1,3 × 10⁵	0,8	3,4 × 10⁴
0	<0,1		<0,1
6 × 10⁷(β^S)	2,1		1,5

Bei hohen Targetkonzentrationen wurden genug fehlgepaarte Produkte erzeugt, um sichtbar gemacht zu werden (wie in 4), wobei die Menge der fehlgepaarten Produkte 1,8% bis 0,5% des komplementären Produkts ausmachte. Die Verwendung eines Überschusses an fehlgepaarter Target-DNA (β^S- statt β^A-Globin-DNA bei 6 × 10⁷ Molekülen pro Becher) machte nur 2,1% und 1,5% des Produktes aus. Die gleiche Menge des Produktes kann gebildet werden, wenn man drei- bis zehntausendfach weniger komplementäre Target-DNA verwendet. Ausgehend davon kann man sagen, dass das Signal von korrekt gepaarten Ligationsprodukten 50 bis 500-fach höher ist als von fehlgepaarten Produkten unter Konkurrenzbedingungen oder individuellen Bedingungen einer LCR-Ligation.
Bei geringen Targetkonzentrationen reichte der Grad der DNA-Amplifikation von 3,7 × 10⁴ bis 1,7 × 10⁵ (siehe die Tabellen IV und V). Wenn man von der Annahme ausgeht, dass die Effizienz der Ligation in jedem Zyklus gleich ist, beträgt die durchschnittliche Amplifikation pro Zyklus zwischen 40 und 50%.
Die Effizienz pro Zyklus könnte selbstverständlich potenziell erhöht werden, indem man die Pufferbedingungen, Enzymbedingungen oder die Ablaufzeiten der thermischen Zyklen und Temperaturen verändert, was alles im Bereich der Möglichkeiten von Fachleuten liegt. Es ist z. B. bewiesen worden, dass die Effizienz der Ligation thermophiler Ligase (und anderer Ligasen) durch eine Veränderung der Pufferzusammensetzung verbessert werden kann, wie z. B. durch die Verwendung von NH₄Cl, HEPES, solche Polyamine, wie z. B. Spermidin, oder Polyethylenglycol [siehe J. Biol. Chem. 259: 10041 (1984) und J. Biochem. 100: 123 (1986)]. Zu den Methoden für eine Verbesserung der LCR, die für Fachleute einfach verständlich sind, gehören das Variieren der Mengen jeder Komponente in dem gegenwärtig benutzten Puffer sowie entweder das Ergänzen oder das Austauschen einer Komponente oder mehrerer Komponenten u. a. mit den oben aufgeführten chemischen und biologischen Komponenten. Ein Fachmann kann auch ohne weiteres die Ablaufzeiten der Zyklen und die Temperaturen variieren. So z. B. sind zu späteren Zeitpunkten die meisten vorhandenen Targets Oligonukleotid-Produkte aus einer früheren LCR-Reaktion. Diese Oligonukleotide sind kurz (vorzugsweise 40–60 monomere Einheiten, aber nicht darauf beschränkt) und sie können schneller geschmolzen werden, was einen schnelleren Ablauf der Zyklen ermöglicht. Bei der vorliegenden Erfindung sind erfolgreiche Ligase-Kettenreaktionen in 30 und 40 Zyklen vollendet worden, und zwar unter Zyklusablaufbedingungen bei 94°C bei einer Dauer von 0,5 Minuten, danach bei 65°C bei einer Dauer von 2 Minuten (die Zykluszeit für die bevorzugten Bedingungen der Ligase-Kettenreaktion betrug eine halbe Minute bei 94°C und 4 Minuten bei 65°C). Sowohl die Ligationstemperatur als auch die DNA-Denaturierungstemperaturen können in Bezug auf die tatsächliche Gradangabe, Dauer und Anzahl der wiederholten Zyklen variiert werden. Optimale Bedingungen müssen die Menge des in Anwesenheit einer perfekt komplementären Target-DNA gebildeten Produkts maximieren, während sich die Menge des fehlerhaften Produktes, das in Anwesenheit einer fehlgepaarten Target-DNA oder in Abwesenheit einer komplementären Target-DNA gebildet wurde, auf ein Minimum reduziert.
Durch die Nutzung dieser Versuchsergebnisse wurde ein Verfahren für den Nachweis spezifischer Sequenzen von Oligonukleotiden in klinischen Proben entwickelt. Die Probe kann aus jedem Material oder jeder Substanz stammen, die Nukleinsäure enthält. Die Nukleinsäure muss keine in der Natur vorkommende Nukleinsäure sein, sondern kann durch chemische, enzymatische oder biologische Mittel synthetisiert worden sein und kann auch noch andere Purine und Pyrimidine aufweisen als jene, die in der Natur vorkommen. Die klinische Probe kann zellulärer oder azellulärer Herkunft sein und kann aus solchen physiologischen Stoffen stammen, wie Blut, Serum, Plasma, Muttermilch, Stuhl, Eiter, abgeschabtes Gewebematerial, Waschflüssigkeit, Urin oder dergleichen. Außerdem kann die Probe mit einer bestimmten Menge oder Teilmenge von Zellen zusammenhängen, wie z. B. geschwulstbildenden Zellen, Lymphozyten (z. B. T-Zellen oder B-Zellen, Monozyten, neutrophilen Leukozyten etc.). Sie kann auch Krankheitserreger aufweisen, zu denen Viren, Bakterien, Mycoplasmen, Pilze, Protozoen etc. zählen. Sie kann auch solche Konstrukte etc. oder RNA enthalten, wie z. B. Messenger-RNA, Transfer-RNA, ribosomale RNA, Viren oder dergleichen. Und sie kann Strukturgene, nicht translatierte Regionen, Regulationsregionen, Introns, Exons oder dergleichen aufweisen. Außerdem kann der Nachweis für vielfältige Zwecke erfolgen, wie z. B. für die Diagnose eines potenziellen oder tatsächlichen Krankheitszustandes bei Pflanzen- oder Tierspezies, sowie für den Nachweis von Gruppen oder Untergruppen von Krankheitserregern, für die Überwachung einer genetischen Manipulation oder dergleichen.
Eines dieser Verfahren, für das die vorliegende Erfindung genutzt werden kann (und das die Machbarkeit eines Allelnachweises aus Blutproben mit Hilfe der direkten LCR eindeutig beweist, ohne dass vorher eine PCR-Amplifikation durchgeführt werden muss), ist z. B. im Nachweis von β-Globin-Allelen in humangenomischer DNA verkörpert. Gestützt auf das hohe Niveau der DNA-Amplifikation wurde der allelspezifische LCR-Nachweis der DNA anhand von Blut untersucht, das normalen Personen (β^Aβ^A), Keimüberträgern (β^Aβ^S) und Patienten mit Sichelzellenanämie (β^Sβ^S) abgenommen wurde, wie im folgenden Beispiel noch ausführlicher beschrieben werden wird:
BEISPIEL XI
(Nachweis von β-Globin-Allelen in humangenomischer DNA)
Humangenomische DNA wurde aus 0,5 ml Vollblut isoliert [siehe PCR Technology, Herausgeber H. A. Erlich, Stockton Press (1989), S. 36]. Vollblut (0,5 ml) wurde mit der gleichen Menge eines Lysierungspuffers gemischt (10 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,6, der 5 mM MgCl₂ und 0,32 M Saccharose enthielt). Nach kurzer Zentrifugierung (1 Min. bei 12.000 U/min in einer Tischzentrifuge von Eppendorf) wurde der Überstand sehr vorsichtig entfernt, wobei 0,15 bis 0,2 ml Überstand und locker pelletierte Zellkerne übrig blieben. Das Pellet wurde durch Vortexen in weiteren 0,5 ml Lysierungspuffer resuspendiert. Die pelletierten Zellkerne und der Überstand wurden – wie oben beschrieben – entfernt. Dieser Schritt wurde drei- oder viermal solange wiederholt, bis der Überstand klar oder nur noch kaum rosafarben war. Nach der Entfernung des letzten Überstands (wieder blieben ungefähr 0,5 bis 0,2 ml übrig) wurden 0,25 ml eines nichtionische Tenside enthaltenden LCR-DNA-Puffers hinzugefügt (und zwar 20 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,6, der 2 mM EDTA und je 0,45% der nichtionischen Tenside NP40 und Tween 20 enthielt). Die gesamte überschüssige RNA wurde durch die Zugabe von 2 μl der 4 mg/ml wärmebehandelten RNase A 15 Minuten lang bei 37°C verdaut. Alle Proteine wurden durch die Zugabe von 5 μl der 10 mg/ml frisch hergestellten Proteinase K und durch eine 1 bis 2 Stunden dauernde Inkubation bei 50°C verdaut. Die Proteinase K und die RNase A wurden durch sequentielle Extraktionen mit Phenol, Phenol/Chloroform, Chloroform, n-Butanol (2 ×) und Nukleinsäure entfernt, die durch Ausfällung mit Ethanol zurückgewonnen wurde. Die Proben wurden vor ihrer Verwendung in LCR-Assays 5 Minuten lang gekocht.
Jede isolierte humangenomische DNA wurde in zwei Reaktionsgemischen getestet, wobei der erste Test dem Nachweis des normalen β^A-Allels und der zweite Test dem Nachweis des Sichelzellen-β^S-Allels diente. Das erste Reaktionsgemisch enthielt die β^A-Test-Oligonukleotide 101 und 104 (je 0,27 ng oder 40 Femtomol), die markierten Oligonukleotide 107 und 109 (je 200.000 cpm oder 0,28 ng oder 40 Femtomol), genomische DNA (die 10 μl Blut oder ungefähr 6 × 10⁴ zellkernhaltigen Zellen entspricht) in 10 μl 20 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,6, der 100 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 10 mM NAD, 10 mM Dithiothreitol und 15 nick-closing Einheiten (Einheiten zur Schließung von Einzelstrangbrüchen) der Ligase aus T. aquaticus enthielt und mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet wurde. Das zweite Reaktionsgemisch enthielt die β^S-Test-Oligonukleotide 102 und 105 (je 0,27 ng oder 40 Femtomol), die markierten Oligonukleotide 107 und 109 (je 200.000 cpm oder 0,28 ng oder 40 Femtomol), genomische DNA, die 10 μl Blut oder ungefähr 6 × 10⁴ zellkernhaltigen Zellen entspricht, in 10 μl des 20 mM Tris-HCl-Puffers mit pH 7,6, der 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 10 mM NAD, 10 mM Dithiothreitol und 15 nick-closing Einheiten der Ligase aus T. aquaticus enthielt und mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet wurde.
Beide Reaktionsgemische durchliefen eine Inkubationszeit von 1 Minute bei 94°C und danach eine Inkubationszeit von 4 Minuten bei 65°C. Und dieser Zyklus wurde 20 bis 30 Mal wiederholt. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 8 μl Formamid beendet, das EDTA (10 mM), Xylen-Cyanol (0,2%) und Bromphenolblau (0,2%) enthielt.
Die Proben (4 μl) wurden vor der Beladung (40.000 cpm pro Bahn) durch dreiminütiges Kochen denaturiert. Die Elektrophorese erfolgte in einem 10-prozentigen Polyacrylamidgel, das 7 M Harnstoff enthielt, in einem Puffer aus 100 mM Tris-Borat mit einem pH-Wert von 8,9 und 1 mM EDTA für 2 Stunden bei 60 Watt konstanter Leistung. Nach der Entfernung des Harnstoffes (10-minütiges Einweichen in 10-prozentiger Essigsäure, danach 5-minütiges Einweichen in H₂O) wurden die Gele dann auf 3-mm starkem Whatman-Papier getrocknet und über Nacht bei –70°C auf einem XAR-5-Film der Firma Kodak mit einem Cronex-Verstärkungsschirm von DuPont autoradiografiert. Die Ligationsprodukte von 45 und 46 bzw. 47 und 48 Nukleotiden zeigen die Anwesenheit des β^A- bzw. des β^S-Globingens an. Wie bei der aus Plasmid gewonnenen Target-DNA festgestellt wurde, ist die Effizienz der Ligation (und daher auch des Nachweises) bei den β^S- spezifischen Oligonukleotiden etwas geringer als bei den β^A-spezifischen Oligonukleotiden.
Die 5 ist ein Autoradiogramm, das den Nachweis von B-Globin-Allelen in humangenomischer DNA zeigt, die entsprechend dem Verfahrensbeispiel hergestellt wurde. Die Ligationsprodukte von 45 und 46 bzw. 47 und 48 Nukleotiden zeigen das Vorhandensein des β^A- bzw. des β^S-Globingens an. Somit könnten mit einer Target-DNA, die 10 μl Blut entspricht, β^A- und β^S-Allele ohne weiteres unter Verwendung einer allelspezifischen LCR nachgewiesen werden.
Deshalb macht der erfolgreiche Nachweis einer Testsubstanz aus einer biologisch gewonnenen Nukleinsäure, die eine bekannte normale Nukleotidsequenz und eine bekannte mögliche Mutation an mindestens einer Position des Targetnukleotids in der Sequenz aufweist, Folgendes erforderlich: (1) ein erstes Reaktionsgemisch mit zwei Sätzen benachbarter Oligonukleotide, die zueinander und zur Zielsequenz der Nukleinsäure komplementär sind, in der es mindestens ein fehlerhaft gepaartes Basenpaar zu der mutierten Zielsequenz der Nukleinsäure gibt, aber nicht zu der normalen Zielsequenz der Nukleinsäure an der Verknüpfungsstelle der benachbarten Oligonukleotide; (2) ein zweites Reaktionsgemisch mit zwei Sätzen benachbarter Oligonukleotide, die zueinander und zur Zielsequenz der Nukleinsäure komplementär sind, in der es mindestens ein fehlerhaft gepaartes Basenpaar zu der normalen Zielsequenz der DNA gibt, aber nicht zu der mutierten Zielsequenz der Nukleinsäure an der Verknüpfungsstelle der benachbarten Oligonukleotide; (3) eine thermostabile Ligase, die nicht irreversibel denaturiert wird und nicht ihre katalytische Fähigkeit verliert, wenn sie Temperaturen im Bereich von ungefähr 50°C bis ungefähr 105°C ausgesetzt ist; (4) das Aussetzen dieser Ligasegemische einem sich wiederholenden Temperaturzyklus, der sowohl eine erste Temperatur umfasst, um die DNA zu denaturieren (in einem Bereich von ungefähr 90°C bis ungefähr 105°C), als auch eine zweite Temperatur umfasst, um der Hybridisierung bzw. Ligation (im Bereich von ungefähr 50°C bis ungefähr 85°C) Rechnung zu tragen [das ermöglicht es auch den benachbarten Oligonukleotiden in jedem Reaktionsgemisch, möglicherweise kovalent gebunden zu werden]; (5) das Trennen der Testsubstanz und aller ungebundenen Testoligonukleotide vom kovalent gebundenen Oligonukleotidprodukt (falls gebildet); und (6) der Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit kovalent gebundener Oligonukleotide in jedem Reaktionsgemisch, wodurch das Vorhandensein eines kovalent gebundenen Oligonukleotidproduktes im ersten Reaktionsgemisch das Vorhandensein einer normalen Zielsequenz und das Vorhandensein eines kovalent gebundenen Oligonukleotidproduktes im zweiten Reaktionsgemisch das Vorhandensein einer mutierten Zielsequenz anzeigen. Beim Nachweis der oben beschriebenen β^A- und β^S-Globin-Allelen waren die folgenden Bestandteile bzw. Einzelschritte erforderlich: (1) die Oligonukleotide 101, 104, 107 und 109; (2) die Oligonukleotide 102, 105, 107 und 109; (3) Ligase aus T. aquaticus; (4) 30 Temperaturzyklen bei 94° für 1 Minute und dann bei 65°C für 4 Minuten; (5) das Denaturieren von Nukleinsäuren durch Kochen in 45-prozentigem Formamid und das Trennen auf einem Sequenzierungsgel; und (6) das Autoradiografieren des Gels.
Das beweist klar und deutlich die Durchführbarkeit des Alleinachweises durch eine direkte LCR aus Blutproben gemäß der vorliegenden Erfindung, ohne eine PCR-Amplifikation durchführen zu müssen.
Wie bei der aus Plasmid gewonnenen Target-DNA festgestellt wurde, ist die Effizienz der Ligation (und daher auch des Nachweises) bei den β^S-spezifischen Oligonukleotiden etwas geringer als bei den β^A-spezifischen Oligonukleotiden. Nach 30 Amplifikationszyklen machten die β^S-spezifischen Produkte ungefähr ein Drittel der β^A-spezifischen Produkte aus, wie durch Prüfung der ausgeschnittenen Produkte auf Radioaktivität quantitativ bestimmt wurde. Diese Unterschiede können eine Funktion der genauen Nukleotidsequenz an der Ligationsverknüpfungsstelle oder der einzelnen, in den LCR-Experimenten verwendeten Oligonukleotide (mit unterschiedlichen 5'-Schwänzen) sein. Aber die vorliegende Erfindung zieht noch eine direkte Konkurrenzprüfung in Betracht, bei der zwei Oligonukleotide unterschiedlich markiert werden (z. B. mit fluoreszierenden Gruppen oder – wie in diesem Falle – mit Schwänzen unterschiedlicher Länge), um das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein eines der beiden Allele im Reaktionsgemisch festzustellen. In der verallgemeinerten Form ermöglicht einem das erfindungsgemäße Verfahren, zwei Allele im gleichen Gefäß zu prüfen, vorausgesetzt, dass die Oligonukleotidsätze mit einem Markersatz markiert sind, welche mindestens ein zur Nukleinsäure der mutierten Zielsequenz fehlerhaft gepaartes Basenpaar enthalten, aber nicht zur Nukleinsäure der normalen Zielsequenz an der Verknüpfungsstelle der benachbarten Oligonukleotide, und dass die Oligonukleotide, welche mindestens ein zur Nukleinsäure der normalen Zielsequenz fehlerhaft gepaartes Basenpaar enthalten, aber nicht zur Nukleinsäure der mutierten Zielsequenz an der Verknüpfungsstelle der benachbarten Oligonukleotide, mit einem anderen Marker markiert sind.
Bei einem vergleichbaren nichtradioaktivem Assay, wie es in der 6 dargestellt ist, werden mindestens zwei Oligonukleotidsonden synthetisiert und für besondere Funktionen in dem Ligationsassay modifiziert. Die eine Sonde enthält einen Haken, der das Einfangen des Oligonukleotids im Anschluss an die Ligation gestattet. Ein Beispiel für einen derartigen Haken ist Biotin, das durch Streptavidin oder Avidin eingefangen werden kann, das an entsprechende Träger gebunden ist. Die andere Sonde weist eine Reportergruppe auf. Obwohl eine Vielzahl von Reportergruppen, und zwar sowohl radioisotopische als auch nichtradioaktive, zur Verfügung steht und bei der erfindungsgemäßen Prüfung verwendet werden kann, wie z. B. Fluoreszenz oder Lumineszenz verursachende Molekülanteile, ist der gegenwärtig bevorzugte Reporter derjenige, der an einem ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay = enzymgekoppelter Immunnachweis) teilnehmen kann. Genauer gesagt, die 6 stellt die Prinzipskizze eines Oligonukleotid-Ligationsassays auf der Grundlage eines ELISA dar, bei dem biotinylierte (B) und mit Digoxigenin (D) markierte Oligonukleotide mit einem DNA-Target in Anwesenheit von Ligase (Pfeil) hybridisiert werden. Die biotinylierten Oligonukleotide werden von Streptavidin (SA) eingefangen, das die Vertiefungen (wells) auf Mikrotiterplatten beschichtet. Die Vertiefungen werden gewaschen, um ungebundene Oligonukleotide zu entfernen, und mit alkalischer Phosphatase (AP) konjugierte Anti-Digoxigenin-Antikörper (D) werden in diese Vertiefungen hinzugegeben. Im Anschluss an die Inkubation und den Waschzyklus wird alkalisches Phosphatase-Substrat (S) hinzugegeben und Digoxigenin wird durch die Produktion eines Farbproduktes nachgewiesen.

Das nichtradioaktiv markierte Assay kann aus mehreren Einzelschritten bestehen: (1) Präparierung des DNA-Targets; (2) Denaturierung und Hybridisierung der modifizierten Oligonukleotidsonden; (3) Ligation; (4) Einfangen der biotinylierten Sonde; (5) Waschung, um freie, nicht biotinylierte Oligonukleotide und das Target zu entfernen; (6) Zugabe von mit alkalischer Phosphatase konjugierten Anti-Digoxigenin-Antikörpern; (7) Waschung, um einen ungebundenen Antikörper zu entfernen; (8) Zugabe alkalischen Phospatase-Substrats und (9) spektralphotometrische Analyse. Das folgende Ablaufdiagramm schildert genau das allgemeine Verfahren (das in einem modifizierten Biomek 1000 Arbeitsplatzgerät automatisiert ist), mit dem man ein nichtradioaktiv markiertes Assay durchführen kann:

Amplifizierte Target-DNA
T4-Ligasenachweis	Taq-Ligasenachweis
Denaturiere die restliche Taq-Polymerase durch Zugabe von:
45 μl von 0,3 N NaOH	45 μl von 0,1 N KOH
Renaturiere die Target-DNA durch Zugabe von:
45 μl von 0,3 N HCl	45 μl von 0,1 N HCl

Verteile das amplifizierte Target auf Mikrotiterplatten mit 10 μl pro Vertiefung.
Gib biotinylierte Oligonukleotide und Reporter-Oligonukleotide den DNA-Targets hinzu (200 Femtomol je Oligonukleotid in 10 μl eines 2 × Ligationsgemisches).

Ligationsgemisch:	Ligationsgemisch:
200 Femtomol biotinylierter Oligonukleotide	200 Femtomol biotinylierter Oligonukleotide
200 Femtomol Reporter-Oligonukleotide	200 Femtomol Reporter-Oligonukleotide
100 mM Tris-HCl, pH 7,5	100 mM Tris-HCl, pH 7,5
20 mM MgCl₂	20 mM MgCl₂
10 mM DTT	10 mM DTT
2 mM ATP	2 mM ATP
2 mM Spermidin	2 mM Spermidin
50% Formamid	2 mM NAD
	100 mM KCl
	Taq Ligase

Denaturiere das Target-Oligonukleotidgemisch bei 93°C im Verlauf von 2 Minuten.

Kühle auf Raumtemperatur und füge 5 μl T4 Ligase hinzu in:	Kühle auf 60–68°C und ligiere 15 Minuten lang (wiederhole den Denaturierungs- und Ligationsschritt, um zu amplifizieren).
200 mM NaCl
50 mM Tris-HCl, pH 7,5
10 mM MgCl₂
5 mM DTT
1 mM ATP
1 mM Spermidin

Ligiere 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (25°C).
Stoppe die Ligationsreaktion und denaturiere die Produkte durch Zugabe von 10 μl von 0,3 N NaOH. Neutralisiere die Reaktionen durch Zugabe von 4 μl von 3 M Natriumazetat.
Übertrage die Reaktionen auf eine mit Avidin beschichtete und blockierte Mikrotiterplatte (Avidinbeschichtung – 60 μg Avidin pro Vertiefung in 60 μl von PBS, pH 7,0 für 60 Minuten bei 37°C; Blockierung – entferne Avidin von der Platte und gib 200 μl pro Vertiefung von 100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,05% Tween, 0,5% Milchpulver und 100 μg/ml Lachssperma-DNA hinzu). Fange biotinyliertes Oligonukleotid ein, bei Zimmertemperatur und für die Dauer von 30 Minuten.
Denaturiere im Verlauf von 2 Minuten das Target-Oligonukleotidgemisch bei 93°C.
Wasche die Platte, um ungebundene Oligonukleotide und Targets zu entfernen, mit (1) 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, in 150 mM NaCl in 0,05% Tween; (2) 0,01 N NaOH in 0,05% Tween; und (3) 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, in 150 mM NaCl in 0,05% Tween.
Gib einen mit alkalischer Phosphatase konjugierten Antikörper zum Reporter-Oligonukleotid hinzu; 30 μl pro Vertiefung in 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% Milchpulver und 0,05% Tween.
Lass die Platten eine Inkubationszeit von 30 Minuten bei Zimmertemperatur durchlaufen, damit sich der Antikörper an den Reporter binden kann.
Wasche die Platte mit 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl in 0,05% Tween, um ungebundenen Antikörper zu entfernen.

Gib Substrat hinzu.

Überprüfe Platte auf entsprechendes kolorimetrisches, chemilumineszierendes oder fluoreszierendes Produkt.

Die für den Beginn dieses Assays erforderlichen genomischen Sequenzen können durch eine Reihe unterschiedlicher Verfahren amplifiziert werden, zu denen auch die LCR, 3SR und PCR zählen. Wir haben die PCR-Amplifikation verwendet, um die DNA-Targets zu gewinnen, die auf der folgenden Tabelle VI für Ligationsassay-Primer aufgelistet sind: TABELLE VI (Sequenzen der Amplifikationsprimer-Sätze)
Die DNA-Amplifikation erfolgte unter Verwendung von 5 μl DNA (2 ng/μl für genomische DNA oder 5 μl von einem behandelten Material aus einer alternativen Quelle), gemischt mit einem Paar von Primer-Oligonukleotiden (je 0,5 μM), die für den DNA-Bereich spezifisch sind, der in einem PCR-Puffer zu amplifizieren ist, der 0,05 U/μl der Taq-Polymerase, 50 mM KCl, 25 mM Tris-HCl Puffer mit einem pH-Wert von 8,3, 10 mM MgCl₂, 200 μg/ml Gelatine, 0,1% Triton X-100 und je 1,5 mM von dATP, dCTP, dGTP und dTTP enthält. Die Probe wurde mit 60 μl leichten Mineralöls überschichtet, für 5 Minuten Target bei 93°C denaturiert und 40 Zyklen unterzogen, die aus 20 Sekunden bei 93°C, 40 Sekunden bei 55°C und 1 Minute bei 72°C bestanden. Nach dem Ablauf der Temperaturzyklen wurde die Probe 10 Minuten lang einer Temperatur von 72°C ausgesetzt, um die Verlängerung der DNA-Probe zu vollenden.
Die Oligonukleotide werden synthetisiert und hinsichtlich besonderer Funktionen in dem Ligationsassay modifiziert. Das Assay erfordert ein Minimum von zwei modifizierten Oligonukleotiden. Ein Oligonukleotid hat einen Haken, der das Einfangen des Oligonukleotids nach der Ligation gestattet. Ein Beispiel dafür ist ein biotinyliertes Oligonukleotid, das auf Streptavidin- oder Avidin-Trägermaterial eingefangen werden kann. Das andere Oligonukleotid hat eine Reportergruppe, die, im Falle eines Fluorophor-Reporters oder multipler Reporter mit unterschiedlichen Emissionsspektren, ohne weiteres in ein einziges Assay eingebaut werden könnte.
Bei einem auf ELISA beruhenden System werden die Sonden, die allelische Formen eines Gens unterscheiden, mit einer 5'-Biotingruppe synthetisiert. Die Reportersonden werden enzymatisch oder chemisch 5'-phosphoryliert und mit Hapten-Digoxigenin markiert. Das Hapten wird dem 3'-Ende der Reportersonde hinzugefügt, und zwar durch das Enden-Ansynthetisieren von 500 pM Oligonukleotid bei 37°C für 1 Stunde in 10 mM Kalium-Kakodylat mit einem pH-Wert von 7,0, in 1 mM CoCl₂, 0,1 mM DTT, 5 nM Digoxigenin dUTP, 0,05 μM dATP und 100 Einheiten der enzym-terminalen Transferase in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Nach der Markierung werden 2 μl von 3 M Natriumazetat und 1 μl der Hefe-t-RNA (1 mg/ml) und 60 μl 95-prozentigen Ethanols hinzugegeben. Das Oligonukleotid wird 5 Minuten lang bei 4°C ausgefällt und dann durch Zentrifugierung bei 6500 × g im Verlauf von 5 Minuten gesammelt. Das Pellet wird in 20 μl destillierten Wassers resuspendiert und der Prozess wird wiederholt. Diese Ausfällung entfernt nicht konjugiertes, überschüssiges Digoxigenin aus der markierten Sonde. Ein Beispiel für Oligonukleotide, die Allele für drei krankhafte Zustände unterscheiden, wird in der folgenden Tabelle VII dargestellt: TABELLE VII (Sequenzen der Beispiel-Oligonukleotide für einen ELISA-Nachweis)

Unter Nutzung des im vorhergehenden Ablaufschema dargestellten Verfahrens wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt und nach der Farbentwicklung wurden Daten spektrometrisch auf einer Wellenlänge von 490 nm gewonnen. Typische Ergebnisse solcher Tests sind in der folgenden Tabelle VIII aufgeführt: TABELLE VIII (spektrometrische Daten aus automatisierten Ligationsreaktionen unter Verwendung von Taq-Ligase)

			Ligationsprimermischung
Amplifiziertes genomisches DNA-Target aus:			B1 + L	B2 + L
β-Globin
	β^A	1,27 ± 0,06	0,01 ± 0,01
	β^S	0,04 ± 0,03	1,85 ± 0,03
Alpha₁-Antitrypsin
	M	1,85 ± 0,15	0,03 ± 0,01
	Z	0,03 ± 0,03	1,47 ± 0,07
Mukoviszidose
	non-508	1,33 ± 0,20	0,02 ± 0,01
	508	0,01 ± 0,01	1,66 ± 0,16

Entweder mit T4 oder mit Taq-Ligase wurden vergleichbare Nachweisgrenzen erreicht. Außerdem ist eine Reihe von Ligationsreaktionen für einige andere krankheitsbedingte Polymorphismen mit vergleichbaren Ergebnissen durchgeführt worden. Weiterhin sind noch acht unterschiedliche Polymorphismen an den Rezeptororten menschlicher T-Zellen mit ähnlichen Nachweisergebnissen untersucht worden. Die vorliegende Erfindung scheint deshalb generell bei der Analyse von DNA-Polymorphismen anwendbar zu sein, die aus einzelnen Basenaustauschen, DNA-Deletionen oder Insertionen oder DNA-Translationen bestehen.
Außerdem kann eine Reihe alkalischer Phosphatase-Substrate im ELISA-Assay verwendet werden, einschließlich empfindlicher chemilumineszierender Substrate (10 Attomol Nachweis). Das Format des Assays wird ohne weiteres an andere Reporterfomate angepasst, wie z. B. an Fluorophore, die in dem entsprechenden Mikrotitrationsformat abgelesen werden können. Der Einbau des entsprechenden Fluorophorformats würde z. B. eine Multiplexanalyse durch Ligation ermöglichen. Bei dieser Anordnung könnten Oligonukleotide, die unterschiedliche Allele und/oder unterschiedliche Gene erkennen, in einem einzigen Assay bewertet werden. Außerdem ist es auch möglich, dass Tandem-Ligationsassays (Ligation von Oligonukleotiden in Ketten) zur Anwendung kommen könnten, um solche eng stehenden DNA-Polymorphismen einzuschätzen, wie z. B. diejenigen, die in den komplexen Haupthistokompatibilitätsgenen existieren. Derartige Modifikationen bei dem oben beschriebenen Assay werden als Modifikationen angesehen, die durchaus im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen.
Die vorliegende Erfindung kann in einem breiten Spektrum des DNA-Diagnose-Screenings Anwendung finden. So z. B. können diese DNA-Diagnose-Screenings, ohne den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einschränken zu wollen, entsprechend der nachstehenden Übersicht folgende Bereiche umfassen:
A – INFEKTIONSKRANKHEITEN

1. Viruserkrankungen: HIV, EBV, HPV, HSV, CMV, Hepatitis (Non-A, Non-B)
(i) Blut- und Gewebeuntersuchung
(ii) Schnellidentifizierung
(iii) Unterscheidung einer chronischen Infektion von einer früheren Gefährdung durch eine Infektion
(iv) Unterscheidung resistenter Stämme bei einer Mischinfektion.
2. Bakterielle Erkrankungen: Mykobakterien, Syphilis, Clamydia, Legionellen, Campylobacter, Pneumonocystis, Lysteria, Lyme, Lepra
(i) Schnelle Identifizierung langsam wachsender Mikroben
(ii) Identifizierung bei Patienten mit Immundefekten
(iii) Überprüfung von Nahrungsmitteln auf Kontamination.
3. Parasitenkrankheiten: Malaria, Trypanosomen, Leishmania
(i) Schnelle Ermittlung von Bluterkrankungen der „dritten Welt"
(ii) Reihenuntersuchung von Reisenden und Angehörigen der Streitkräfte.

B – ERBKRANKHEITEN

1. Einzelallelerkrankungen: Mukoviszidose, Duchennesche Muskelatrophie, Sichelzellenanämie, β-Thalassämie, Hämophilie A, Gauchersche Krankheit, Tay-Sachs-Syndrom, Alzheimersche Krankheit, Neurofibromatose
2. Krebserkrankungen: Retinoblastom, Wilms-Tumor, Dickdarm- und Brustkrebs Krebsgene, Tumorsuppressionsgene
3. Mehrfachallelerkrankungen: Herzkranzgefäßkrankheiten, Diabetes, Bluthochdruck, Schizophrenie, Manisch-depressive Erkrankungen, Alkoholmissbrauch
(i) Prädisposition für eine Krankheit
(ii) Präventive Medizin, Bewegung, Diät
(iii) Untersuchung und Beratung wegen erblich bedingter Erkrankungen
(iv) Gentherapie

C – GENETISCHE IDENTIFIZIERUNG

1. Menschen: HLA-Typisierung, Kriminaltechnik, Gerichtsmedizin
(i) Gewebetransplantation
(ii) Genetische Kopplungsanalyse
(iii) Programm zur Erforschung des menschlichen Genoms
(iv) Positive Identifizierung vermisster Kinder
2. Tiere: Pferde, Milchkühe, Rindvieh, Haustiere
(i) Reine genetische Merkmale
(ii) Bestätigung von Zuchtlinien
(iii) Positive Identifizierung von Tieren
3. Pflanzen: Saatgutbestand
(i) Sicherung der genetischen Artenvielfalt
(ii) Ermittlung von gegen Trockenheit und Krankheiten resistenten Stämmen.

Wir haben somit unsere Erfindung sowie die Art und Weise und den Prozess, um diese Erfindung zu machen und zu nutzen, mit derartig vollständigen, klaren, prägnanten und exakten Begriffen beschrieben, damit jeder Fachmann, für den sie von Bedeutung ist, oder mit dessen Arbeitsgebiet sie am nächsten verbunden ist, dadurch befähigt wird, selbige nachzuvollziehen und zu nutzen.

Claims

Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure-Testsubstanz mit einer bekannten ersten Nukleotidsequenz und einer bekannten zweiten Nukleotidsequenz, die komplementär sind und zusammen getrennte Stränge eines doppelsträngigen DNA-Moleküls ausbilden, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen einer Probe, welche die Testsubstanz enthält; Bereitstellen eines ersten Oligonukleotid-Satzes aus mindestens zwei Oligonukleotiden, die für eine Ligation miteinander an einer ersten Ligationsverknüpfungsstelle und für eine Hybridisierung ohne Fehlpaarung an der ersten Ligationsverknüpfungsstelle mit der ersten Nukleotidsequenz geeignet sind, wobei die mindestens zwei Oligonukleotide einander benachbart mit der ersten Nukleotidsequenz hybridisieren und eine Hybridisierungstemperatur von ca. 50°C bis 85°C aufweisen; Bereitstellen eines zweiten Oligonukleotid-Satzes aus mindestens zwei Oligonukleotiden, die für eine Ligation miteinander an einer zweiten Ligationsverknüpfungsstelle und für eine Hybridisierung ohne Fehlpaarung an der zweiten Ligationsverknüpfungsstelle mit der zweiten Nukleotidsequenz geeignet sind, wobei die mindestens zwei Oligonukleotide des zweiten Oligonukleotid-Satzes einander benachbart mit der zweiten Nukleotidsequenz hybridisieren und eine Hybridisierungstemperatur von ca. 50 bis 85°C aufweisen; Bereitstellen einer thermostabilen Ligase, die nicht irreversibel denaturiert wird und ihre katalytische Aktivität verliert, wenn sie Temperaturen im Bereich von ca. 50°C bis 105°C ausgesetzt wird; Vermischen der Probe, des ersten und zweiten Oligonukleotid-Satzes und der thermostabilen Ligase, um ein Amplifikationsgemisch auszubilden; und Behandeln des Amplifikationsgemisches, indem es einer Reihe von Zyklen ausgesetzt wird, die umfassen: eine Denaturierungsbehandlung, wobei der ligierte erste und zweite Oligonukleotid-Satz von der ersten Nukleotidsequenz bzw. der zweiten Nukleotidsequenz abgetrennt werden, und eine thermische Hybridisierungsbehandlung bei einer Temperatur von 50–85°C, wobei der erste Oligonukleotid-Satz mit der ersten Nukleotidsequenz hybridisiert und seine Oligonukleotide miteinander ligieren, der zweite Oligonukleotid-Satz mit der zweiten Nukleotidsequenz hybridisiert und seine Oligonukleotide miteinander ligieren, um die erste und zweite Nukleotidsequenz in der DNA exponentiell zu amplifizieren, wobei die mindestens zwei Oligonukleotide des zweiten Oligonukleotid-Satzes komplementär zu den mindestens zwei Oligonukleotiden des ersten Oligonukleotid-Satzes sind, wobei ein Oligonukleotid aus dem ersten Oligonukleotid-Satz ein Oligonukleotid aus dem zweiten Oligonukleotid-Satz mit einem 3'-Überhang aus einer einzigen Base komplementiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Denaturierungsbehandlung bei einer Temperatur von ca. 90°C bis 105°C erfolgt.
Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei die Reihe von Zyklen die erste und zweite Nukleotidsequenz um das ca. 50- bis ca. 500-fache dessen verstärkt, was der Fall wäre, wenn an der ersten Ligationsverknüpfungsstelle eine einzige Basenfehlpaarung vorhanden wäre.
Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei die Denaturierungsbehandlung eine Dauer von ca. 0,25 Minuten bis ca. 4,0 Minuten aufweist.
Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei der erste Oligonukleotid-Satz in molarem Überschuss gegenüber der ersten Nukleotidsequenz vorhanden ist.
Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei die Ligase aus Thermus aquaticus isoliert ist.
Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, ferner umfassend: Auffinden der ersten und/oder zweiten Nukleotidsequenz.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Auffinden umfasst: Einfangen eines an mindestens einem der Oligonukleotide des ersten Oligonukleotid-Satzes und/oder des zweiten Oligonukleotid-Satzes angebrachten Hakens, wobei der Haken ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Biotin und DNA-bindenden Proteinen.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Auffinden umfasst: Auffinden einer an mindestens einem der Oligonukleotide des ersten Oligonukleotid-Satzes und/oder mindestens einem der Oligonukleotide des zweiten Oligonukleotid-Satzes angebrachten Markierung, wobei die Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Chromophoren, fluoreszierenden Komponenten, Enzymen, Antigenen, chemilumineszierenden Komponenten und elektrochemischen Nachweiskomponenten.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Auffinden umfasst: Abtrennen von Produkten der Reihe von Zyklen durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese.
Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei die Oligonukleotide des ersten und zweiten Oligonukleotid-Satzes Desoxyribonukleinsäuren sind.
Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei der hybridisierende Abschnitt mindestens eines der Oligonukleotide des ersten und/oder zweiten Oligonukleotid-Satzes 20 bis 25 Nukleotide lang ist.
Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei die Oligonukleotide des ersten und zweiten Oligonukleotid-Satzes jeweils T_m-Werte von 66 bis 70°C aufweisen.
Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei das Amplifikationsgemisch ferner eine Träger-DNA einschließt.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Träger-DNA Lachssperma-DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend: Bereitstellen eines weiteren Oligonukleotid-Satzes aus mindestens zwei Nukleotiden, die für eine Ligation miteinander und für eine Hybridisierung ohne Fehlpaarung mit einer mutierten Zielsequenz der ersten Nukleotidsequenz mit einer bekannten Mutation, jedoch nicht mit der normalen Form der ersten Nukleotidsequenz geeignet sind; Vermischen der Probe, des weiteren Oligonukleotid-Satzes und der Ligase, um ein zweites Amplifikationsgemisch auszubilden; Behandeln des zweiten Amplifikationsgemisches, indem es mindestens einem Temperaturzyklus ausgesetzt wird, der eine erste Temperatur von ca. 90°C bis ca. 105°C und eine zweite Temperatur von ca. 50°C bis ca. 85°C umfasst, wobei der weitere Oligonukleotid-Satz mit der defekten Form der ersten Nukleotidsequenz hybridisiert und seine Oligonukleotide miteinander ligieren; und Nachweisen des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins von ligiertem Oligonukleotid-Produkt im Amplifikationsgemisch und im zweiten Amplifikationsgemisch, wobei das Vorhandensein eines solchen Produkts im Amplifikationsgemisch das Vorhandensein der ersten Nukleotidsequenz in der Probe anzeigt und das Vorhandensein eines solchen Produkts im zweiten Amplifikationsgemisch das Vorhandensein von mutierter Zielsequenz der ersten Nukleotidsequenz in der Probe anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Ligase aus Thermus aquaticus isoliert ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei der genetische Defekt ein einziger Unterschied in der Basenpaarsequenz der Nukleinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei der genetische Defekt eine Nukleinsäure-Auslassung ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei der genetische Defekt eine Nukleinsäure-Einfügung ist.