DE68926038T3

DE68926038T3 - Gereinigtes thermostabiles enzym

Info

Publication number: DE68926038T3
Application number: DE68926038T
Authority: DE
Inventors: David H. Oakland GELFAND; Susanne El Cerrito STOFFEL; Frances C. Oakland LAWYER; Randall K. Richmond SAIKI
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1988-01-12
Filing date: 1989-01-12
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2009-01-13
Also published as: SG46657A1; WO1989006691A3; DE68926038T2; IL88923A; IE890068L; EP0395736B2; IE72180B1; DE68926038D1; JPH03502165A; IL88923A0; EP0395736A1; CA1341143C; EP0395736B1; HK166096A; ATE135741T1; WO1989006691A2; JP2511548B2; ZA89262B; AU3062989A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz, die eine hitzestabile DNA-Polymerase aus einer Thermus-Spezies codiert.
Zur Isolierung von DNA-Polymerasen aus mesophilen Mikroorganismen, wie z.B. E. coli, sind umfangreiche Forschungsarbeiten durchgeführt worden. Vgl. beispielsweise Bessman et al., J. Biol. Chem., 233 (1957),171-177, sowie Buttin und Kornberg, J. Biol. Chem., 241 (1966), 5419-5427.
Im Gegensatz dazu sind relativ wenige Untersuchungen zur Isolierung und Aufreinigung von DNA-Polymerasen aus thermophilen Mikroorganismen, wie z.B. Thermus aquaticus, durchgeführt worden. Kaledin et al., Biokhymiya, 45 (1980), 644-651, offenbaren ein aus sechs Schritten bestehendes Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung einer DNA-Polymerase aus Zellen des T. aquaticus-Stammes YT1. Diese Schritte umfassen die Isolierung eines Rohextrakts, DEAE-Cellulose-Chromatographie, Fraktionierung auf Hydroxyapatit, Fraktionierung auf DEAE-Cellulose und Chromatographie auf Cellulose, an die einzelsträngige DNA gebunden ist. Die vereinigten Fraktionen aus jeder Reinigungsstufe wurden dabei nicht auf Verunreinigung durch Endo- und Exonuclease(n) untersucht. Das Molekulargewicht des gereinigten Enzyms wurde mit 62 000 Dalton pro Monomer-Einheit angegeben.
Ein zweites Aufreinigungsprotokoll für eine T. aquaticus-Polymerase ist von A. Chien et al., J. Bacteriol., 127 (1976), 1550-1557 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird der Rohextrakt auf eine DEAE-Sephadex-Säule aufgetragen. Die dialysierten vereinigten Fraktionen werden dann einer Behandlung auf einer Phosphocellulose-Säule unterworfen. Die vereinigten Fraktionen werden dialysiert und zur Verhinderung eines Aktivitätsverlustes der Polymerase wird Rinderserumalbumin (BSA) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wird auf eine DNA-Cellulose-Säule aufgetragen. Das aus der Säule gewonnene vereinigte Material wird dialysiert. Eine Untersuchung mittels Gelfiltration ergab ein Molekulargewicht von etwa 63 000 Dalton. Mit Hilfe einer Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation wurde ein Molekulargewicht von etwa 68 000 Dalton ermittelt.
Die Verwendung eines hitzestabilen Enzyms zur Amplifikation bereits vorhandener Nucleinsäuresequenzen in Mengen, die im Vergleich zur ursprünglich vorhandenen Menge groß sind, ist im US-Patent 4,683,195 vorgeschlagen worden. Bei dem Verfahren, das Denaturierung, Synthese von Matrizensträngen und Hybridisierung umfaßt, werden Primer, Nucleosidtriphosphate und eine Polymerase verwendet. Das Verlängerungsprodukt von jedem Primer wird dann zur Matrize für die weitere Herstellung der gewünschten Nucleinsäuresequenz. Das Patent offenbart, daß die verwendete Polymerase nicht nach jedem Denaturierungsschritt zugegeben werden muß, wenn sie ein hitzestabiles Enzym ist, da die Hitze ihre Aktivität nicht zerstört. Zur Verwendung einer gereinigten hitzestabilen DNA-Polymerase werden keine weiteren Vorteile oder Details beschrieben. New England Biolabs hat überdies eine T. aquaticus-Polymerase auf den Markt gebracht, wobei man sich jedoch nicht bewußt war, daß die Polymerase-Aktivität in einem Aufbewahrungspuffer, der keine nichtionischen Detergenzien enthielt, mit der Zeit erheblich abnahm.
Somit besteht auf diesem Gebiet ein Bedarf an der Herstellung eines gereinigten, stabilen und hitzestabilen Enzyms, das zur Verbesserung des vorstehend beschriebenen Amplifikationsverfahrens für Nucleinsäuren verwendet werden kann.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz bereit, die eine hitzestabile DNA-Polymerase codiert und eine Nucleotid-Sequenz aufweist, die die in 1 angegebene Aminosäuresequenz codiert. Diese DNA-Sequenz stellt ein Mittel zur Herstellung des erfindungsgemäßen hitzestabilen Enzyms bereit. Außer dem Gen, das das etwa 86 000 – 95 000 Dalton große Enzym codiert, werden auch Abkömmlinge des Gens bereitgestellt, die aktive DNA-Polymerasen codieren. Das durch eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz exprimierte hitzestabile Enzym katalysiert die Verknüpfung von Nucleosidtriphosphaten, wobei ein zu einem Nucleinsäure-Matrizenstrang komplementärer Nucleinsäurestrang gebildet wird. Das von dieser DNA-Sequenz exprimierte gereinigte Enzym kann in einer Temperaturzyklen unterworfenen Amplifikationsreaktion verwendet werden, wobei aus einer bestimmten Nucleinsäuresequenz Nucleinsäuresequenzen in Mengen produziert werden, die im Vergleich zur ursprünglich vorhandenen Menge groß sind, so daß sie leicht manipuliert und/oder analysiert werden können.
Schließlich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Aufreinigung der erfindungsgemäßen hitzestabilen Polymerase bereit, das die Behandlung eines die hitzestabile Polymerase enthaltenden wäßrigen Gemischs mit einem Chromatographieträger für hydrophobe Wechselwirkungen unter hydrophobe Wechselwirkungen fördernden Bedingungen umfaßt und die Flution der gebundenen hitzestabilen Polymerase vom Träger mit einem Lösungsmittel, das hydrophobe Wechselwirkungen abschwächt.
Das mittels DNA-Rekombinationsverfahren hergestellte Enzym bietet eine viel größere Spezifität als das Klenow-Fragment, das bei Verwendung in der Temperaturzyklen unterworfenen Amplifikationsreaktion nicht hitzestabil ist. Außerdem zeigt das mittels Rekombinationsverfahren hergestellte Enzym die entsprechende Aktivität, die erwartet wird, wenn im Inkubationsgemisch mit der DNA-Matrize TTP oder andere Nucleosidtriphosphate fehlen. Das erfindungsgemäße Enzym besitzt außerdem ein breiteres pH-Profil als das in der Literatur beschriebene hitzestabile Enzym aus Thermus aquaticus, wobei es bei einem pH-Wert von 6,4 mehr als 50% der Aktivität besitzt, die bei einem pH-Wert von 8 gefunden wird.
1 stellt die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz der Taq-Polymerase dar. Die Aminosäuresequenz, die dem primären Translationsprodukt entspricht, ist mit 1 – 832 numeriert.
2 stellt eine Restriktionskarte des Plasmides pFC83 dar, das die ∼ 4,5 kb große HindIII-Insertion aus T. aquaticus-DNA enthält, die in Plasmid BSM13+ subcloniert wurde.
3 stellt eine Restriktionskarte des Plasmides pFC85 dar, das die ∼ 2,68 kb große HindIII-Asp718-Insertion aus T. aquaticus-DNA enthält, die in Plasmid BSM13+ subcloniert wurde.
Die hier verwendeten Begriffe "Zelle", "Zellinie" und "Zellkultur" sind untereinander austauschbar, wobei alle Bezeichnungen auch die Nachkommenschaft umfassen. Die Begriffe "Transformanten" oder "transformierte Zellen" umfassen daher die zuerst transformierten Zellen und die davon abstammenden Kulturen, ungeachtet der Anzahl der Zellpassagen. Aufgrund gezielt hervorgerufener oder nichtbeabsichtigter Mutationen ist es selbstverständlich, daß nicht alle Nachkommen im DNA-Gehalt absolut identisch sein müssen. Die Erfindung schließt auch mutierte Nachkommen mit den gleichen funktionellen Merkmalen, auf die hin die ursprünglich transformierten Zellen untersucht wurden, ein.
Der Begriff "Kontrollsequenz" betrifft DNA-Sequenzen, die benötigt werden, um eine damit funktionell verbundene codierende Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus zu exprimieren. Für Prokaryonten geeignete Kontrollsequenzen umfassen beispielsweise einen Promotor, gegebenenfalls eine Operator-Sequenz, eine Ribosomenbindungsstelle und möglicherweise weitere, bislang wenig verstandene Sequenzen. Es ist bekannt, daß eukaryontische Zellen Promotoren, Polyadenylierungssignale und "Enhancer" verwenden.
Der Begriff "Expressionssystem" betrifft DNA-Sequenzen, die eine gewünschte codierende Sequenz in funktioneller Verbindung mit Kontrollsequenzen enthalten, so daß mit diesen Sequenzen transformierte Wirte die codierten Proteine produzieren können. Zur Durchführung der Transformation kann das Expressionssystem auf einem Vektor enthalten sein; die relevante DNA kann jedoch auch in das Wirts-Chromosom integriert werden.
Der hier verwendete Begriff "Gen" betrifft eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid oder einen Vorläufer codiert, das/der gewonnen werden kann und biologische Aktivität besitzt. Das Polypeptid kann durch eine Gensequenz mit voller Länge oder durch einen beliebigen Teil der codierenden Sequenz codiert werden, sofern die enzymatische Aktivität erhalten bleibt.
In einer Ausführungsform der Erfindung codiert die DNA-Sequenz eine Polymerase mit einer Aminosäuresequenz, die

(a) der 832 Aminosäuren aufweisenden Sequenz von 1,
(b) den Aminosäureresten 4 bis 832 von 1, oder
(c) den Aminosäureresten 290 bis 832 von 1 entspricht.

Aus praktischen Gründen wird die Aminosäuresequenz dieser Taq-Polymerase als Bezugspunkt verwendet. Andere Formen des hitzestabilen Enzyms werden unter Bezugsnahme auf die in 1 gezeigte Sequenz gekennzeichnet. Da der Methioninrest in N-terminaler Position vorhanden sein oder fehlen kann, umfaßt die Erfindung in allen Fällen, in denen das hitzestabile Enzym in Bakterien produziert wird, beide Formen.
"Funktionell verbunden" betrifft das Nebeneinanderliegen von zwei Bestandteilen auf solche Weise, daß diese normal funktionieren können. Eine mit einer Kontrollsequenz "funktionell verbundene" codierende Sequenz betrifft daher eine Anordnung, bei der die codierenden Sequenzen unter der Kontrolle der Kontrollsequenzen exprimiert werden können.
Der Begriff "Gemisch", sofern er im Zusammenhang mit Gemischen steht, die Taq-Polymerase enthalten, betrifft eine Ansammlung von Substanzen, welche Taq-Polymerase, aber auch alternative Proteine umfaßt. Falls die Taq-Polymerase aus rekombinanten Wirtszellen stammt, sind die anderen Proteine normalerweise Proteine, die mit dem Wirt assoziiert sind. Wenn der Wirt ein Bakterium ist, sind die Proteinverunreinigungen natürlich bakterielle Proteine.
"Nichtionische polymerische Detergenzien" betreffen oberflächenaktive Mittel, die keine Ionenladung besitzen und für die erfindungsgemäßen Zwecke dadurch charakterisiert sind, daß sie das erfindungsgemäße Enzym in einem pH-Bereich von etwa 3,5 bis etwa 9,5, vorzugsweise von 4 bis 8,5 stabilisieren können.
Der hier verwendete Begriff "Oligonucleotid" definiert ein Molekül, das zwei oder mehr, vorzugsweise mehr als drei Desoxyribonucleotide oder Ribonucleotide umfaßt. Seine genaue Größe hängt von vielen Faktoren ab, die ihrerseits von der endgültigen Funktion oder Verwendung des Oligonucleotids abhängen. Das Oligonucleotid kann synthetisch oder durch Clonierung erhalten werden.
Der hier verwendete Begriff "Primer" betrifft ein Oligonucleotid, gleichgültig, ob es natürlicherweise vorkommt, wie z.B. in einer gereinigten Restriktionsspaltung, oder synthetisch hergestellt wurde, welches als Synthesestartpunkt wirken kann, wenn es sich unter Bedingungen befindet, unter denen die Synthese eines zu einem Nucleinsäurestrang komplementären Primer-Verlängerungsprodukts eingeleitet wird, d.h. in Gegenwart von vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten und des hitzestabilen Enzyms in einem geeigneten Puffer ("Puffer" umfaßt den pH-Wert, die Ionenstärke, Cofaktoren usw.) bei einer geeigneten Temperatur. Für die Taq-Polymerase enthält der hier verwendete Puffer vorzugsweise 1,5 – 2 mM eines Magnesiumsalzes, vorzugsweise MgCl₂, jeweils 150 – 200 μM der einzelnen Nucleotide und jeweils 1 μM der einzelnen Primer, zusammen mit vorzugsweise 50 mM KCl, 10 mM Tris-Puffer, pH-Wert 8 – 8,4, und 100 μg/ml Gelatine.
Für maximale Effizienz der Amplifikation ist der Primer vorzugsweise einzelsträngig, er kann jedoch in einer anderen Ausführungsform doppelsträngig sein. Falls der Primer doppelsträngig ist, werden vor seiner Verwendung zur Herstellung von Verlängerungsprodukten zuerst seine Stränge getrennt. Vorzugsweise ist der Primer ein Oligodesoxyribonucleotid. Der Primer muß hinreichend lang sein, damit die Synthese von Verlängerungsprodukten in Gegenwart des hitzestabilen Enzyms initiiert wird. Die genaue Länge der Primer hängt von vielen Faktoren ab, die Temperatur, deren Herkunft und den Verwendungszweck des Verfahrens umfassen. Z.B. enthält der Oligodesoxyribonucleotid-Primer typischerweise 15 – 25 Nucleotide, obwohl es auch mehr oder weniger sein können, je nachdem, wie komplex die Zielsequenz ist. Kurze Primermoleküle benötigen zur Bildung ausreichend stabiler Hybridkomplexe mit der Matritze im allgemeinen tiefere Temperaturen.
Die hier verwendeten Primer werden so ausgewählt, daß sie zu den unterschiedlichen Strängen jeder zu amplifizierenden spezifischen Sequenz "im wesentlichen" komplementär sind. Das bedeutet, daß die Primer zur Hybridisierung mit ihren entsprechenden Strängen ausreichend komplementär sein müssen. Die Seguenz des Primers muß deshalb nicht die genaue Sequenz der Matritze widerspiegeln. Beispielsweise kann an das 5'-Ende des Primers ein nicht-komplementäres Nucleotidfragment angeknüpft werden, wobei die restliche Primersequenz komplementär zum Strang ist. In einer anderen Ausführungsform können nicht-komplementäre Basen oder längere Sequenzen über den Primer hinweg verteilt werden, vorausgesetzt, daß die Primer-Sequenz zu der zu amplifizierenden Strangsequenz ausreichend komplementär ist, damit es zu einer Hybridisierung und dadurch zur Bildung einer Matrize für die Synthese des Verlängerungsprodukts vom anderen Primer kommt. Für Nachweiszwecke, insbesondere bei Verwendung markierter sequenzspezifischer Sonden, sind die Primer jedoch typischerweise exakt komplementär. Dadurch werden die besten Ergebnisse erzielt.
Die hier verwendeten Begriffe "Restriktionsendonucleasen" und "Restriktionsenzyme" betreffen bakterielle Enzyme, wobei jedes davon doppelsträngige DNA an einer spezifischen Nucleotidsequenz oder in der Nähe davon spaltet.
Der hier verwendete Begriff "hitzestabiles Enzym" betrifft ein Enzym, daß gegen Hitze stabil und widerstandsfähig ist und die Kombination von Nucleotiden in geeigneter Weise katalysiert (ermöglicht), wodurch Primer-Verlängerungsprodukte gebildet werden, die zu jedem Nucleinsäurestrang komplementär sind. Die Synthese wird im allgemeinen am 3'-Ende eines jeden Primers initiiert und entlang des Matrizenstranges in 5'-Richtung fortgeführt, bis es zum Syntheseabbruch kommt, wobei Moleküle unterschiedlicher Länge hergestellt werden. Es kann jedoch ein hitzestabiles Enzym geben, welches die Synthese am 5'-Ende initiiert und diese in die andere Richtung fortführt, wobei der vorstehend beschriebene Mechanismus verwendet wird.
Damit es in der Amplifikationsumsetzung wirksam ist, muß das erfindungsgemäße Enzym ein einziges Kriterium erfüllen. Das Enzym darf nämlich nicht irreversibel denaturiert (inaktiviert) werden, wenn es während einer zur Denaturierung doppelsträngiger Nucleinsäuren erforderlichen Zeitspanne erhöhten Temperaturen unterworfen wird. Eine irreversible Denaturierung für die erfindungsgemäßen Zwecke betrifft den anhaltenden und vollständigen Verlust der Enzymaktivität. Die zur Denaturierung von Nucleinsäuren erforderlichen Wärmebedingungen hängen z.B. von der Salzkonzentration und Zusammensetzung des Puffers sowie der Länge und Nucleotidzusammensetzung der zu denaturierenden Nucleinsäuren ab. Über einen Zeitraum, der hauptsächlich von der Temperatur sowie der Nucleinsäurelänge abhängt und typischerweise etwa 0,5 bis vier Minuten lang ist, liegen die Temperaturen typischerweise im Bereich von etwa 90°C bis etwa 105°C. Höhere Temperaturen können mit zunehmender Salzkonzentration des Puffers und/oder GC-Zusammensetzung der Nucleinsäure toleriert werden. Bei einer Temperatur von etwa 90°C – 100°C wird das Enzym vorzugsweise nicht irreversibel denaturiert.
Das vorliegende hitzestabile Enzym besitzt für seine Funktionen eine optimale Temperatur, die höher als etwa 40°C ist. Bei Temperaturen unter 40°C wird die Hybridisierung des Primers mit der Matrize gefördert, obwohl je nach (1) Konzentration und Zusammensetzung der Salze sowie (2) der Zusammensetzung und Länge der Primer eine Hybridisierung auch bei höheren Temperaturen (z.B. bei 45°C – 70°C ) stattfinden kann. Je höher das Temperaturoptimum für das Enzym liegt, umso spezifischer und/oder selektiver verläuft der durch die Primer gesteuerte Verlängerungsprozeß. Enzyme, die bei einer Temperatur unterhalb 40°C, z.B. bei 37°C, aktiv sind, gehören jedoch auch zum Schutzumfang der Erfindung, vorausgesetzt, daß sie hitzestabil sind. Vorzugsweise liegt die optimale Temperatur in einem Bereich von etwa 50°C bis 90°C, besonders bevorzugt bei 60°C bis 80°C.
Die DNA-Sequenz, die das vorliegende hitzestabile Enzym codiert, kann aus einer beliebigen Quelle gewonnen werden. Beispiele für Enzyme, die in der Literatur als hitzeresistent beschrieben sind, umfassen hitzestabile Polymerasen, wie z.B. Polymerasen, die aus den thermophilen Bakterien Thermus flavus, Thermus ruber, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus (das ein etwas niedrigeres Temperaturoptimum als die anderen aufgeführten Bakterien besitzt), Thermus aquaticus, Thermus lacteus, Thermus rubens und Methanothermus fervidus extrahiert wurden. Hitzestabile Polymerasen wurden außerdem aus thermophilen Archaebakterien isoliert, die Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus acidocaldarius, Thermoplasma acidophilum, Methanobacterium thermoautotrophicum und Desulfurococcus mobilis umfassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die DNA-Sequenz, die die hitzestabile DNA-Polymerase codiert, aus Thermus aquaticus isoliert. Verschiedene Stämme davon sind von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, erhältlich. Die Stämme sind von T. D. Brock, J. Bact., 98 (1969), 289-297, sowie von T. Oshima, Arch. Microbiol., 117 (1978), 189-196, beschrieben. Ein bevorzugter Stamm ist der Stamm YT-1.
Die erfindungsgemäße DNA-Sequenz ermöglicht die rekombinante Herstellung der hitzestabilen DNA-Polymerase. Die vollständige codierende Sequenz für die Thermus aquaticus (Taq)-Polymerase kann aus dem Bakteriophagen CH35:Taq#4-2 aus einem etwa 3,5 Kilobasen (kb) großen BglII-Asp718-Restriktionsfragment (partielle Spaltung) gewonnen werden, das in einem ∼18 kb großen genomischen DNA-Insertionsfragment enthalten ist. Der Bakteriophage wurde am 3. Juni 1987 bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer 40,336. In einer anderen Ausführungsform kann das Gen konstruiert werden, indem ein aus dem Plasmid pFC83 (ATCC 67,422, am 29.Mai 1987 hinterlegt) isoliertes, ∼730 bp großes BglII-HindIII-Restriktionsfragment mit einem aus dem Plasmid pFC85 (ATCC 67,421, am 29.Mai 1987 hinterlegt) isolierten, ∼2,68 kb großen HindIII-Asp718-Restriktionsfragment ligiert wird. Das pFC83-Restriktionsfragment umfaßt das Amino-Ende des Taq-Polymerase-Gens, während das pFC85-Restriktionsfragment das Carboxyl-Ende umfaßt. Die Ligierung dieser beiden Fragmente in einen entsprechend gespaltenen Vektor mit geeigneten Kontrollsequenzen führt daher zur Translation einer Taq-Polymerase voller Länge.
Wie vorstehend angegeben, ist die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz eines bevorzugten hitzestabilen Enzyms in 1 dargestellt. Ebenso wie bei der vorstehend beschriebenen N-terminalen Deletion ist festgestellt worden, daß zur Gewinnung eines biologisch aktiven Genprodukts mit DNA-Polymerase-Aktivität nicht die gesamte codierende Sequenz des Taq-Polymerase-Gens erforderlich ist. Amino-terminale Deletionen, bei denen etwa ein Drittel der codierenden Sequenz fehlt, haben zur Produktion eines Genprodukts geführt, das in Polymerase-Tests sehr aktiv ist.
Außer den N-terminalen Deletionen können einzelne Aminosäurereste in der die Taq-Polymerase umfassenden Peptidkette durch Oxydation, Reduktion oder andere Verfahren zur Derivatbildung modifiziert werden. Das Protein kann gespalten werden, wobei Fragmente erhalten werden, die die Aktivität beibehalten. Proteine mit solchen Veränderungen, die die Aktivität nicht zerstören, liegen trotzdem innerhalb der vorstehend angegebenen Definition. Die vorliegende Erfindung umfaßt ausdrücklich diese veränderten Proteine.
Die Primärstruktur selbst kann durch Deletion, Hinzufügen oder Änderung der während der Translation in die Sequenz eingebauten Aminosäuren modifiziert werden, ohne daß die bei hohen Temperaturen gezeigte Aktivität der DNA-Polymerase zerstört wird. Solche Substitutionen oder andere Änderungen führen zu Proteinen mit einer Aminosäuresequenz, die durch DNA codiert wird, die zum Schutzumfang der vorliegenden Erfindung gehört.
Zur Gewinnung einer geeigneten codierenden Sequenz wurde wie nachstehend beschrieben polyclonales Antiserum aus Kaninchen, die mit der gereinigten, 86 000 – 95 000 Dalton großen, erfindungsgemäßen Polymerase immunisiert worden waren, als Sonde zum Screening einer Expressionsgenbank verwendet, die durch partielle Spaltung genomischer Thermus aquaticus-DNA konstruiert worden war. Die clonierte genomische Sequenz kann als Fusionspolypeptid, direkt unter Verwendung ihrer eigenen Kontrollsequenzen oder mit Hilfe von Konstruktionen unter Verwendung von Kontrollsequenzen, die für einen bestimmten, zur Enzymexpression verwendeten Wirt geeignet sind, exprimiert werden.
Die Verfügbarkeit von DNA, die diese Sequenzen codiert, bietet natürlich die Möglichkeit zur Modifikation der Codonsequenz, um Muteinformen (mutierte Proteine) zu erzeugen, die auch DNA-Polymerase-Aktivität besitzen.
Mit Hilfe dieser Mittel kann die vollständige codierende Sequenz der Taq-DNA-Polymerase bereitgestellt werden. Mit der Sequenz können Expressionsvektoren konstruiert werden, die in vielen Wirtssystemen anwendbar sind, wodurch die codierende Sequenz exprimiert werden kann. Teile der die Taq-Polymerase codierenden Sequenz lassen sich bei einer Vielzahl von Arten als Sonden zur Gewinnung anderer Sequenzen, die eine hitzestabile Polymerase codieren, verwenden. Zur Gewinnung zusätzlicher DNAs, die eine hitzestabile Polymerase codieren, können dementsprechend Teile der genomischen DNA, die mindestens vier bis sechs Aminosäuren codieren, in E. coli repliziert und in denaturierter Form als Sonden verwendet werden oder es können Oligodesoxyribonucleotid-Sonden synthetisiert werden, die mindestens vier bis sechs Aminosäuren codieren. Da es zwischen der Nucleotidsequenz der Thermus aquaticus-Form und den entsprechenden Sequenzteilen anderer Arten keine genaue Übereinstimmung geben muß, sind wahrscheinlich etwa 12-18 Nucleotide enthaltende Oligomere (die den aus vier bis sechs Aminosäuren bestehenden Peptidabschnitt codieren) erforderlich, um unter den Bedingungen einer ausreichenden Stringenz eine Hybridisierung unter Ausschluß falscher positiver Clone zu erhalten. Sechs Aminosäuren codierende Sequenzen enthalten für solche Sonden ausreichend Information.
Im allgemeinen umfaßt die Herstellung einer rekombinanten Form der Taq-Polymerase typischerweise folgende Schritte:
Zuerst wird eine DNA gewonnen, die entweder das reife Enzym (der hier verwendete Begriff umfaßt alle Muteine) oder ein Fusionsprodukt der Taq-Polymerase mit einer zusätzlichen Sequenz codiert, welche die Polymerase-Aktivität nicht zerstört, bzw. mit einer zusätzlichen Sequenz, die unter kontrollierten Bedingungen (wie z.B. Behandlung mit einer Peptidase) abgespalten werden kann, wodurch ein aktives Protein erhalten wird. Wenn die Sequenz nicht durch Introns unterbrochen ist, läßt sie sich in jedem Wirtsorganismus exprimieren. Diese Sequenz sollte eine Form aufweisen, in der sie ausgeschnitten und gewonnen werden kann.
Die ausgeschnittene oder gewonnene codierende Sequenz wird dann vorzugsweise in einem replizierbaren Expressionsvektor mit geeigneten Kontrollsequenzen funktionell verbunden. Der Vektor wird zur Transformation eines geeigneten Wirtes verwendet. Der transformierte Wirt wird unter vorteilhaften Bedingungen gezüchtet, damit die Produktion der rekombinanten Taq-Polymerase erfolgen kann. Gegebenenfalls wird die Taq-Polymerase entweder aus dem Medium oder den Zellen isoliert; in einigen Fällen, d.h. falls einige Verunreinigungen nicht stören, sind Aufbereitung und Reinigung des Proteins nicht notwendig.
Für jeden vorstehend beschriebenen Schritt gibt es verschiedene Ausführungsformen. Die gewünschten codierende Sequenzen können beispielsweise aus genomischen Fragmenten gewonnen und in geeigneten Wirten direkt verwendet werden. Expressionsvektor-Konstrukte, die in vielen Wirten funktionieren, werden wie nachstehend dargelegt unter Verwendung geeigneter Replikons und Kontrollsequenzen hergestellt. Damit ein ausschneidbares Gen zur Insertion in die Vektoren bereitgestellt werden kann, können geeignete Restriktionsstellen an die Enden der codierenden Sequenz angefügt werden, falls sie normalerweise nicht vorhanden sind.
Kontrollsequenzen, Expressionsvektoren und Transformationsverfahren hängen vom Typ der zur Genexpression verwendeten Wirtszelle ab. Im allgemeinen lassen sich Zellen von Prokaryonten, Hefen, Insekten oder Säugern als Wirte verwenden. Zur Herstellung rekombinanter Proteine sind prokaryontische Wirte im allgemeinen am wirksamsten und zweckmäßigsten. Deshalb werden sie zur Expression der Taq-Polymerase bevorzugt.
Im besonderen Fall der Taq-Polymerase gibt es Anhaltspunkte dafür, daß sowohl unter den Bedingungen der Rekombinationsverfahren als auch unter nativen Bedingungen große Deletionen am N-Terminus des Proteins auftreten können und daß die DNA-Polymerase-Aktivität des Proteins trotzdem beibehalten wird. Es scheint, daß die früher isolierten nativen Proteine wahrscheinlich das Ergebnis eines proteolytischen Abbaus sind und nicht auf die Translation eines verkürzten Gens zurückgehen. Das vom verkürzten Gen des Plasmids pFC85 produzierte Mutein ist jedoch in DNA-Polymerase-Tests genauso aktiv wie das Protein, das von der DNA-Sequenz voller Länge codiert wird. Seitdem klar ist, daß bestimmte N-terminal verkürzte Polymeraseformen aktiv sind, können die zur Polymerase-Expression verwendeten Gen-Konstrukte auch die entsprechend verkürzten Formen der codierenden Sequenz umfassen.
Als prokaryontische Wirte werden am häufigsten verschiedene E. coli-Stämme verwendet. Andere mikrobielle Stämme, beispielsweise Bacillus-Arten wie Bacillus subtilis, verschiedene Pseudomonas-Arten oder andere Bakterienstämme, können jedoch auch verwendet werden. Bei diesen prokaryontischen Systemen werden Plasmidvektoren verwendet, die Replikationsstartpunkte und Kontrollsequenzen enthalten, welche aus einer mit dem verwendeten Wirt verträglichen Art stammen. Z.B. wird E. coli typischerweise mit Abkömmlingen des Plasmids pBR322 transformiert, das von Bolivar et al., Gene, 2 (1977), 95, aus einer E. coli-Art isoliert wurde. pBR322 enthält Gene für Ampicillin- sowie Tetracyclin-Resistenz und stellt daher zusätzliche Marker bereit, die bei der Konstruktion des gewünschten Vektors entweder erhalten oder zerstört werden können. In der vorliegenden Erfindung werden häufig verwendete prokaryontische Kontrollsequenzen so definiert, daß sie Promotoren zur Transkriptionsinitiation, gegebenenfalls einschließlich eines Operators, sowie Sequenzen mit Ribosomenbindungsstellen umfassen. Sie umfassen häufig verwendete Promotoren, wie z.B. die Promotorsysteme des beta-Lactamase (Penicillinase)- und Lactose (lac)-Gens (Chang et al., Nature, 198 (1977), 1056), des Tryptophan (trp)-Gens (Goeddel al., Nucleic Acids Res., 8 (1980), 4057) sowie den vom Phagen lambda abstammenden P_L-Promotor (Shimatake et al., Nature, 292 (1981), 128) und die Ribosomenbindungsstelle vom N-Gen. Die beiden letzteren Sequenzen sind als übertragbare Kontroll-Kassette nutzbar gemacht worden (wie in dem am 8. Dezember 1987 erteilten US-Patent 4,711,845 dargelegt), wobei diese als erste DNA-Sequenz den P_L-Promotor umfaßt, der mit einer der Ribosomenbindungsstelle des N-Gens (N_RBS) entsprechenden zweiten Sequenz funktionell verbunden ist, wobei sich diese Sequenzen stromaufwärts einer dritten DNA-Sequenz mit mindestens einer Restriktionsstelle befinden, welche die Spaltung innerhalb einer aus sechs bp bestehenden, am 3'-Ende der N_RBS-Sequenz gelegenen Sequenz gestattet. Das Phosphatase A (phoA)-System, das von Chang et al. in der am 8. Oktober 1986 veröffentlichten Europäischen Patentveröffentlichung EP-196 864 beschrieben und dem gleichen Rechtsnachfolger als Patent übertragen wurde, wobei der Inhalt des Patents durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen wurde, läßt sich ebenfalls verwenden. Es können jedoch alle verfügbaren Promotorsysteme verwendet werden, die mit Prokaryonten kompatibel sind.
Außer Bakterien können Eukaryonten, wie z.B. Hefen, als Wirte verwendet werden. Laborstämme der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae werden am häufigsten verwendet, obwohl eine Anzahl anderer Stämme allgemein verfügbar ist. Obwohl als Beispiel häufig Vektoren dienen, die den 2-Micron-Replikationsstartpunkt enthalten (Broach, J. R., Meth. Enz., 101 (1983), 307), sind auch andere zur Expression in Hefen geeignete Plasmidvektoren bekannt (vgl. beispielsweise Stinchcomb et al., Nature, 282 (1979), 39; Tschempe et al., Gene, 10 (1980), 157, und Clarke, L., et al., Meth. Enz., 101 (1983), 300). Kontrollsequenzen für Hefevektoren umfassen die Promotoren zur Synthese glycolytischer Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7 (1968), 149, und Holland et al., Biotechnology, 17 (1978), 4900).
Weitere auf dem Fachgebiet bekannte Promotoren umfassen den Promotor der 3-Phosphogylyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255 (1980), 2073) und die Promotoren für andere glycolytische Enzyme, wie z.B. Glyceraldehyd-3- phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Weitere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil besitzen, daß die Transkription durch die Wachstumsbedingungen kontrolliert wird, sind die Promotorbereiche für die Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, die saure Phosphatase, im Zusammenhang mit dem Stickstoff-Stoffwechsel stehende abbauende Enzyme sowie Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind (Holland, vorstehend).
Oft sind Terminationssequenzen am 3'-Ende der codierenden Sequenzen erwünscht. Man findet diese Terminationssequenzen im nichttranslatierten 3'-Bereich, der sich an die codierenden Sequenzen von Genen anschließt, die aus Hefen stammen. Viele der beschriebenen Vektoren enthalten Kontrollsequenzen, die entweder aus dem das Enolase-Gen enthaltenden Plasmid peno46 (Holland, M. J., et al., J. Biol. Chem., 256 (1981), 1385) oder vom LEU2-Gen gewonnen werden, das aus YEp13 erhalten wird (Broach, J., et al., Gene, 8 (1978), 121). Dennoch ist jeder beliebige Vektor geeignet, der einen mit Hefe verträglichen Promotor, Replikationsstartpunkt und andere Kontrollsequenzen enthält.
Es besteht natürlich die Möglichkeit, Polypeptide codierende Gene in Wirtszellkulturen zu exprimieren, die von mehrzelligen eukaryontischen Organismen abstammen. Vgl. beispielsweise Tissue Culture, Herausgeber Cruz und Patterson, (1973), Academic Press. Nützliche Wirtszellinien umfassen die Maus-Myelomzellinien N51, VERO, HeLa-Zellen sowie Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO). Expressionsvektoren für diese Zellen umfassen normalerweise Promotoren und Kontrollzellen, die mit Säugerzellen kompatibel sind, wie beispielsweise die häufig verwendeten frühen und späten Promotoren vom Affen-Virus 40 (SV 40) (Fiers et al., Nature, 273 (1978), 113) oder andere virale Promotoren, wie z.B. Promotoren, die vom Polyoma-Virus, Adenovirus 2, Rinder-Papillomvirus ("bovine papilloma virus") oder von Vogel-Sarcomviren ("avian sarcoma viruses") abstammen, sowie Promotoren von Immunglobulin- und Hitzeschock-Genen. Ein DNA-Expressionssystem in Säugerzellen unter Verwendung von BVP als Vektor ist im US-Patent 4,419,446 offenbart. Eine Modifikation dieses Systems ist im US-Patent 4,601,978 beschrieben. Allgemeine Aspekte der Zelltransformation von Säuger-Wirtssystemen sind von Axel im US- Patent 4,399,216 beschrieben worden. Es hat sich nun gezeigt, daß zur Optimierung der Expression auch "Enhancer"-Bereiche wichtig sind. Diese stellen im allgemeinen Sequenzen dar, die stromaufwärts vom Promotorbereich gefunden werden. Im Bedarfsfall können Replikationsstartpunkte aus viralen Quellen gewonnen werden. In Eukaryonten erfolgt jedoch allgemein die DNA-Replikation durch eine Integration in das Chromosom.
Als Wirte sind jetzt auch pflanzliche Zellen verfügbar. Kontrollsequenzen, die mit pflanzlichen Zellen verträglich sind, wie z.B. der Promotor des Nopalinsynthase-Gens und Polyadenylierungs-Signalsequenzen (Depicker, A., et al., J. Mol. Appl. Gen., 1 (1982), 561), sind verfügbar.
Außerdem sind vor kurzem Expressionssysteme unter Verwendung von Insektenzellen beschrieben worden, wobei von Baculovirus-Vektoren stammende Kontrollsysteme verwendet werden (Miller, D. W. et al., in: Genetic Engineering, Herausgeber Setlow, J. K., et al., Bd. 8 (1986), Seiten 277-297, Plenum Publishing). Auch diese Systeme können erfolgreich zur Herstellung der Taq-Polymerase verwendet werden.
Je nachdem, welche Wirtszelle verwendet wird, erfolgt die Transformation unter Verwendung von Standardverfahren, die für solche Zellen geeignet sind. Bei Prokaryonten oder anderen Zellen, die starke Zellwandbarrieren enthalten, wird das von Cohen, S. N., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69 (1972), 2110, beschriebene Calciumchlorid-Behandlungsverfahren verwendet. Bei bestimmten Pflanzenzellen wird eine Infektion mit Agrobacterium tumefaciens (Shaw, C. H. et al., Gene, 23 (1983), 315) verwendet. Bei Säugerzellen ohne derartige Zellwände wird das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham und van der Eb, Virology, 52 (1978), 546, bevorzugt. Transformationen von Hefezellen werden nach dem Verfahren von Van Solingen, P., et al., J. Bact., 130 (1977), 946, und Hsiao, C. L, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76 (1979), 3829, durchgeführt.
Zur Isolierung von DNA, die die gewünschten Proteine codiert, wie z.B. die Taq-Polymerase codierende DNA, wird die folgende Strategie unter Verwendung des Bakteriophagenvektors lambda gt11 angewandt. Indem durch vollständige Spaltung von Thermus aquaticus-DNA erzeugte AluI-Fragmente mit flankierenden EcoRI-Enden in die EcoRI-Restriktionsstelle des Phagen lambda gt11 inseriert werden, kann eine Genbank konstruiert werden (Young und Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80 (1983), 1194-1198). Da sich die im Phagen nur einmal vorhandene EcoRI-Restriktionsstelle am Carboxyl-Terminus des β-Galactosidase-Gens befindet, wird die inserierte DNA (im richtigen Leseraster und in richtiger Orientierung) unter der Kontrolle des Promotors/Operators des Lactose-Operons als Fusionsprotein mit der β-Galactosidase exprimiert.
Die genomische Expressionsgenbank wird dann unter Verwendung des Antikörper-Plaquehybridisierungsverfahrens abgesucht. Bei einer als "Epitop-Selektion" bezeichneten modifizierten Variante des Verfahrens wird ein gegen die phagencodierte Fusionsprotein-Sequenz gerichtetes Antiserum verwendet, um den Nachweis der durch Hybridisierung identifizierten Plaques zu bestätigen. Zum Nachweis von Phagen, die DNA-Abschnitte enthalten, welche Antigen-Determinanten des Proteins codieren, kann die rekombinante Phagen enthaltende Genbank daher mit Antikörpern abgesucht werden, die die 86 000 – 90 000 Dalton große Taq-Polymerase erkennen.
Unter Verwendung eines gegen die Taq-Polymerase gerichteten Gesamt-Kaninchen-Antiserums werden etwa 2 × 10⁵ rekombinante Phagen abgesucht. Bei diesem ersten Screening werden positive Signale nachgewiesen. Aus zur Verwendung vorgesehenen Plaques, die mit dem Präimmunserum nicht reagieren konnten, wird/werden ein oder mehr Phage(n) aufgereinigt, mit Immunserum zur Reaktion gebracht und genauer analysiert. Zur Untersuchung der von den rekombinanten Phagen produzierten Fusionsproteine werden im Wirt Y1089 Phagen-Lysogene hergestellt. Nach Induzierung der Lysogene und gelelektrophoretischer Analyse der erhaltenen Proteine wird jedes Lysogen daraufhin untersucht, ob es ein neues Protein produziert, das in anderen Lysogenen nicht gefunden wird, oder ob doppelte Sequenzen erhalten werden. Phagen mit positiven Signalen werden abgenommen. Im vorliegenden Fall wurde ein positiver Plaque zur weiteren Identifizierung abgenommen und zur Reinigung des rekombinanten Clons in niedrigeren Phagenpartikel-Konzentrationen erneut ausplattiert. Die gereinigten Clone wurden durch Spaltung mit dem EcoRI-Restriktionsenzym auf die Größe ihrer Insertionen hin untersucht. Aus den isolierten DNA-Insertionssequenzen können dann Sonden hergestellt, in geeigneter Weise markiert und bei üblichen Kolonie- oder Plaque-Hybridisierungsuntersuchungen verwendet werden, wie in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982), beschrieben, wobei der Inhalt davon durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen ist.
Die markierte Sonde wurde zum Screening einer zweiten genomischen Genbank verwendet, die mit dem Bakteriophagen Charon-35 konstruiert worden war (Wilhelmine A. M. et al., Gene, 26 (1983), 171-179). Die Genbank wurde hergestellt, indem genomische Thermus aquaticus-DNA mit Sau3A partiell gespalten wurde und die nach ihrer Größe fraktionierten Fragmente (15 – 20 kb) in die BamHI-Restriktionsstelle des Phagen Charon-35 cloniert wurden. Die Sonde wurde zur Isolierung von Phagen verwendet, die Taq-Polymerase codierende DNA enthielten. Es wurde festgestellt, daß einer der erhaltenen Phagen, der als CH35:Taq#4-2 bezeichnet wurde, die vollständige Gensequenz enthielt. Es wurden auch partielle Sequenzen isoliert, die Teile des Proteins codieren.
Zur Konstruktion geeigneter Vektoren, die die gewünschte codierende Sequenz sowie Kontrollsequenzen enthalten, werden auf dem Fachgebiet allgemein bekannte Standardverfahren für Ligierung und Restriktion angewendet. Isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonucleotide werden gespalten, passend zurechtgeschnitten und in der gewünschten Form erneut ligiert.
Unter Bedingungen, die auf dem Fachgebiet im allgemeinen bekannt sind, wird eine ortsspezifische DNA-Spaltung durch Behandlung mit einem geeigneten Restriktionsenzym (oder -enzymen) durchgeführt, wobei genaue Einzelheiten von den Herstellern der im Handel erhältlichen Restriktionsenzyme angegeben sind. Vgl. beispielsweise den Produktkatalog von New England Biolabs. Im allgemeinen wird etwa 1 μg der Plasmid- oder DNA-Sequenz mit einer Einheit des Enzyms in etwa 20 μl Pufferlösung gespalten. In den vorliegenden Beispielen wird typischerweise ein Überschuß eines Restriktionsenzyms verwendet, um eine vollständige Spaltung des DNA-Substrats zu sichern. Die Inkubation erfolgt etwa ein bis zwei Stunden bei etwa 37°C, wobei Abweichungen toleriert werden können. Nach jeder Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol/Chloroform entfernt, worauf eine Ether-Extraktion folgen kann. Die Nucleinsäure wird aus den wäßrigen Fraktionen durch Ethanolpräzipitation gewonnen. Falls gewünscht, können die gespaltenen Fragmente mit Hilfe einer Polyacrylamid- oder Agarose- Gelelektrophorese entsprechend ihrer Größe getrennt werden, wobei Standardverfahren verwendet werden. Eine allgemeine Beschreibung der Trennungsverfahren entsprechend der Größe findet sich in Methods in Enzymology, 65 (1980), 499-560.
Durch Restriktionsenzyme gespaltene Fragmente können mit glatten Enden versehen werden, indem sie mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I aus E. coli (Klenow-Fragment) in Gegenwart der vier Desoxynucleosidtriphosphate (dNTPs) etwa 15 bis 25 Minuten bei 20°C bis 25°C in 50 mM Tris, pH-Wert 7,6, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT und 50 -100 μM dNTPs behandelt werden. Durch das Klenow-Fragment werden kohäsive 5'-Enden aufgefüllt, überhängende 3'-Enden werden jedoch selbst in Gegenwart der vier dNTPs abgebaut. Falls gewünscht, kann im Rahmen der von der Natur der kohäsiven Enden bestimmten Beschränkungen eine selektive Reparatur durchgeführt werden, indem nur ein dNTP oder ausgewählte dNTPs zugegeben werden. Nach Behandlung mit dem Klenow-Fragment wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Eine Behandlung mit S1-Nuclease führt unter geeigneten Bedingungen zur Hydrolyse aller einzelsträngigen Bereiche.
Unter Verwendung des Verfahrens von Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc., 103 (1981), 3185-3191) oder automatisierter Syntheseverfahren können synthetische Oligonucleotide hergestellt werden. Vor der Anlagerung an die Matrize oder zur Markierung werden Einzelstränge mit einem Überschuß an Kinase behandelt, wobei für 1 nM Substrat beispielsweise etwa 10 Einheiten Polynucleotikinase in Gegenwart von 50 mM Tris, pH-Wert 7,6, 10 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol und 1-2 mM ATP verwendet werden. Falls die Kinasebehandlung zur Markierung von Sonden dient, enthält ATP gamma-³²P mit hoher spezifischer Aktivität.
Ligierungen werden in einem Volumen von 15-30 μl unter den folgenden Standardbedingungen und Temperaturen durchgeführt: 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 33 μg/ml BSA, 10 mM – 50 mM NaCl und entweder 40 μM ATP, 0,01 – 0,02 (Weiss)-Einheiten T4-DNA-Ligase bei 0°C (zur Ligierung kohäsiver Enden) oder 1 mM ATP, 0,3 – 0,6 (Weiss)-Einheiten T4-DNA-Ligase bei 14°C (zur Ligierung glatter Enden). Intermolekulare Ligierungen von kohäsiven Enden werden meistens bei Konzentrationen der Gesamt-DNA von 33-100 μg/ml durchgeführt (Gesamtkonzentration der DNA-Enden 5 – 100 nM). Intermolekulare Ligierungen von glatten Enden (meistens unter Verwendung eines 10-30fachen molaren Überschusses der Linker) werden bei einer Gesamtkonzentration der DNA-Enden von 1 μM durchgeführt.
Bei der Vektorkonstruktion unter Verwendung von "Vektorfragmenten" wird das Vektorfragment gewöhnlich mit der bakteriellen alkalischen Phosphatase (BAP) behandelt, um den am 5'-Ende befindichen Phosphatrest zu entfernen und damit die Religierung des Vektors zu verhindern. BAP-Spaltungen werden bei einem pH-Wert von 8 in etwa 150 mM Tris in Gegenwart von Na⁺- und Mg⁺²-Ionen etwa eine Stunde bei 60°C durchgeführt, wobei 1 Einheit BAP pro mg Vektor verwendet wird. Zur Gewinnung der Nucleinsäurefragmente wird die Präparation mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. In einer anderen Ausführungsform kann eine Religierung von Vektoren verhindert werden, indem diese durch eine zusätzliche Restriktionsenzym-Spaltung der nichtgewünschten Fragmente doppelt gespalten werden.
Bei Teilen von Vektoren, die aus cDNA oder genomischer DNA stammen und bei denen Sequenzmodifikationen erforderlich sind, wird eine ortsspezifische, durch Primer gesteuerte Mutagenese durchgeführt. Dieses inzwischen etablierte Standardverfahren wird unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotid-Primers durchgeführt. Bis auf eine begrenzte Anzahl von Basenfehlpaarungen, welche die gewünschte Mutation darstellen, ist der Primer zu einer einzelsträngigen Phagen-DNA, die mutiert werden soll, komplementär. Kurz zusammengefaßt wird das synthetische Oligonucleotid als Primer zur Steuerung der Synthese eines zum Phagen komplementären Stranges verwendet. Die erhaltene doppelsträngige DNA wird in ein Wirtsbakterium transformiert, das die Phagenvermehrung unterstützt. Kulturen der transformierten Bakterien werden in Weichagar ausplattiert, wodurch bei Phagen enthaltenden Einzelzellen die Plaquebildung ermöglicht wird.
50% der neu gebildeten Plaques enthalten theoretisch einen Phagen, dessen Einzelstrang in mutierter Form vorliegt; 50% enthalten die ursprüngliche Sequenz. Die Plaques werden auf Nitrocellulose-Filter übertragen. Davon gewonnene "Filterabzüge" werden mit einem Kinase- behandelten synthetischen Primer bei einer Temperatur hybridisiert, die bei genauer Basenpaarung eine Hybridisierung gestattet, bei der jedoch Basenfehlpaarungen mit dem ursprünglichen Strang eine Hybridisierung verhindern. Plaques, die mit der Sonde hybridisieren, werden dann abgenommen und gezüchtet. Daraus wird dann die DNA gewonnen.
Bei den nachstehend beschriebenen Konstrukten wurde die Richtigkeit der Ligierungen zur Plasmidkonstruktion bestätigt, indem das Ligierungsgemisch zuerst in den E. coli-Stamm MM294 oder andere geeignete Wirte transformiert wurde. Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, werden Transformanten aufgrund von Resistenzen gegen Ampicillin, Tetracyclin oder andere Antibiotika bzw. unter Verwendung anderer Marker selektiert, je nach Art der Plasmidkonstruktion. Aus den Transformanten werden Plasmide nach dem Verfahren von Clewell, D. B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 62 (1969), 1159, gegebenenfalls nach Amplifikation durch Chloramphenicol präpariert (Clewell, D. B., J. Bacteriol., 110 (1972), 667). Die isolierte DNA wird durch Restriktionsspaltungen untersucht und/oder mit Hilfe des Didesoxynucleotid-Verfahrens von Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 74 (1977), 5463, das von Messing et al., Nucleic Acids Res., 9 (1981), 309, weiter beschrieben ist, bzw. des Verfahrens von Maxam et al., Methods in Enzymology, 65 (1980), 499, sequenziert.
Zur Clonierung und Expression wurden in der vorliegenden Erfindung die folgenden Wirtsstämme verwendet:
Als Wirt zum Clonieren und Sequenzieren sowie zur Expression der Konstrukte unter Kontrolle der meisten bakteriellen Promotoren wurde der E. coli-Stamm MM294 verwendet, der von dem E. coli Genetic Stock Center unter der Nr. GCSC #6135 erhalten wurde. Zur Expression unter der Kontrolle des P_LN_RBS-Promotors kann der für den Phagen lambda lysogene E. coli K12-Stamm MC1000, N₇N₅₃cI857 SusP₈₀, ATCC 39531 verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung wurden der am 7. April 1987 am ATCC hinterlegte E. coli-Stamm DG116 (ATCC 53606) und der am 29. März 1985 am ATCC hinterlegte E. coli-Stamm KB2 (ATCC 53075) verwendet.
Für rekombinante M13-Phagen werden E. coli-Stämme verwendet, die einer Phageninfektion zugänglich sind, wie z.B. der E. coli K12-Stamm DG98. Der Stamm DG98 ist am 13. Juli 1984 beim ATCC hinterlegt worden und hat die Hinterlegungsnummer 39768.
Eine Expression in Säugerzellen kann in COS-7-, COS-A2-, CV-1- und Maus-Zellen erreicht werden, während zur Expression in Insektenzellen Spodoptera frugipeida verwendet wird.
Die erfindungsgemäße hitzestabile Polymerase kann nicht nur mit Hilfe der bislang beschriebenen Reinigungsverfahren, sondern auch unter Verwendung einer auf hydrophoben Wechselwirkungen basierenden Chromatographie aufgereinigt werden. Eine auf hydrophoben Wechselwirkungen basierende Chromatographie ist ein Trennverfahren, bei dem Stoffe aufgrund unterschiedlich starker hydrophober Wechselwirkungen mit einem hydrophobe Reste enthaltenden ungeladenen Bettmaterial getrennt werden. Typischerweise wird die Säule zuerst unter Bedingungen, die eine hydrophobe Bindung begünstigen, z.B. hohe Ionenstärke, äquilibriert. Zur Elution der Probe kann ein abnehmender Salzgradient verwendet werden.
Erfindungsgemäß wird das wäßrige Gemisch (das entweder die native oder die rekombinante Polymerase enthält) auf eine Säule geladen, die ein relativ stark hydrophobes Gel enthält, wie z.B. Phenyl-Sepharose (Pharmacia) oder Phenyl-TSK (Toyo Soda). Zur Förderung hydrophober Wechselwirkungen mit einer Phenyl-Sepharose-Säule wird ein Lösungsmittel verwendet, das beispielsweise 0,2 M oder mehr Ammoniumsulfat enthält, wobei 0,2 M bevorzugt werden. Die Säule und die Probe werden so auf 0,2 M Ammoniumsulfat in einem aus 50 mM Tris – 1 mM EDTA bestehenden Puffer eingestellt. Die Probe wird dann auf die Säule aufgetragen. Die Säule wird mit dem 0,2 M Ammoniumsulfat enthaltenden Puffer gewaschen. Das Enzym kann dann mit Lösungsmitteln eluiert werden, die hydrophobe Wechselwirkungen abschwächen, wie z.B. abnehmende Salzgradienten, Ethylen- bzw. Propylenglykol oder Harnstoff. Für die rekombinante Taq-Polymerase umfaßt eine bevorzugte Ausführungsform das Waschen der Säule nacheinander mit Tris-EDTA-Puffer und 20% Ethylenglykol enthaltendem Tris-EDTA-Puffer. Die Taq-Polymerase wird anschließend mit einem Gradienten von 0 M – 4 M Harnstoff in Tris-EDTA-Ethylenglykol-Puffer von der Säule eluiert.
Für eine langfristige Stabilität muß das erfindungsgemäße Enzym in einem Puffer aufbewahrt werden, der ein oder mehrere nichtionische polymere Detergenzien enthält. Im allgemeinen handelt es sich dabei um Detergenzien, die ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 100 bis 250 000 Dalton, vorzugsweise etwa 4000 bis 200 000 Dalton besitzen und die das Enzym in einem pH-Bereich von etwa 3, 5 bis etwa 9,5, vorzugsweise von etwa 4 bis 8,5 stabilisieren. Beispiele für diese Detergenzien umfassen die Detergenzien, die angeführt sind in "Emulsifiers & Detergents" von McCutcheon, Ausgabe für Nordamerika (1983), Seiten 295-298, veröffentlicht von McCutcheon Division of MC Publishing Co., 175 Rock Road, Glen Rock, NJ (USA), wobei die gesamte Offenbarung davon durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen ist. Die Detergenzien sind vorzugsweise ausgewählt aus ethoxylierten Fettalkoholethern und Laurylethern, ethoxylierten Alkylphenolen, Octylphenoxy-polyethoxyethanol-Verbindungen, modifizierten oxyethylierten und/oder oxypropylierten geradkettigen Alkoholen, Polyethylenglykolmonooleat-Verbindungen, Polysorbat-Verbindungen und Phenol-Fettalkoholethern. Tween 20 (ICI Americas Inc., Wilmington, DE) ein polyoxyethyliertes (20) Sorbitanmonolaurat, und Iconol NP-40 (BASF Wyandotte Corp. Parsippany, NJ), ein ethoxyliertes Alkylphenol (nonyl), sind besonders bevorzugt.
Das erfindungsgemäße hitzestabile Enzym kann für beliebige Zwecke verwendet werden, für die ein solches Enzym notwendig oder erwünscht ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das vorliegende Enzym in dem nachstehend dargelegten Amplifikationsprotokoll eingesetzt.
Das Amplifikationsprotokoll unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms kann das Verfahren zur Amplifikation bereits vorhandener Nucleinsäuren sein, das in dem am 28. Juli 1987 erteilten US-Patent 4,683,202 offenbart und beansprucht ist, wobei die Offenbarung durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen ist. Das erfindungsgemäße Enzym wird jedoch vorzugsweise im nachstehend offenbarten Amplifikationsverfahren verwendet.
Insbesondere umfaßt das Amplifikationsverfahren die Amplifikation von mindestens einer spezifischen Nucleinsäuresequenz, die in einer Nucleinsäure oder einem Nucleinsäuregemisch enthalten ist, wobei die Nucleinsäure aus zwei getrennten komplementären Strängen gleicher oder ungleicher Länge besteht, falls sie doppelsträngig ist. Das Verfahren umfaßt:

(a) Inkontaktbringen von jedem Nucleinsäurestrang mit vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten und einem Oligonucleotid-Primer für jede verschiedene spezifische Sequenz, die amplifiziert werden soll, wobei jeder Primer so ausgewählt ist, daß er zu den verschiedenen Strängen jeder spezifischen Sequenz im wesentlichen komplementär ist, so daß das synthetisierte Verlängerungsprodukt eines Primers als Matrize zur Synthese des Verlängerungsprodukts des anderen Primers dienen kann, wenn es von seinem komplementären Strang getrennt ist, und wobei das Inkontaktbringen bei einer Temperatur stattfindet, die die Hybridisierung von jedem Primer mit seinem komplementären Nucleinsäurestrang fördert;
(b) Inkontaktbringen von jedem Nucleinsäurestrang mit einer DNA-Polymerase von Thermus aquaticus gleichzeitig mit Schritt (a) oder danach, die die Kombination der Nucleosidtriphosphate zur Bildung der Primer-Verlängerungsprodukte ermöglicht, die zu jedem Strang jeder Nucleinsäure komplementär sind;
(c) Halten des Gemisches aus Schritt (b) bei einer wirksamen Temperatur für eine wirksame Zeit, um die Enzymaktivität zu fördern und für jede verschiedene Sequenz, die amplifiziert werden soll, ein Verlängerungsprodukt von jedem Primer zu synthetisieren, das zu jedem Nucleinsäure-Matrizenstrang komplementär ist, wobei die Temperatur dabei nicht so hoch sein darf, daß das Verlängerungsprodukt von seinem komplementären Matrizenstrang getrennt wird;
(d) Erhitzen des Gemisches aus Schritt (c) für eine wirksame Zeit bei einer wirksamen Temperatur zur Trennung der Primer-Verlängerungsprodukte von den Matrizen, an denen sie zur Herstellung einzelsträngiger Moleküle synthetisiert wurden, wobei die Temperatur dabei nicht so hoch sein darf, daß das Enzym irreversibel denaturiert wird;
(e) Abkühlen des Gemisches aus Schritt (d) auf eine wirkame Temperatur für eine wirksame Zeit, um die Hybridisierung von jedem Primer mit jedem in Schritt (d) produzierten einzelsträngigen Molekül zu fördern; und
(f) Halten des Gemisches aus Schritt (e) bei einer wirksamen Temperatur für eine wirksame Zeit, um die Enzymaktivität zu fördern und für jede verschiedene Sequenz, die amplifiziert werden soll, ein Verlängerungsprodukt von jedem Primer zu synthetisieren, das zu jedem in Schritt (d) produzierten Nucleinsäure-Matrizenstrang komplementär ist, wobei die Temperatur dabei nicht so hoch sein darf, daß die Verlängerungsprodukte von ihren komplementären Matrizensträngen getrennt werden, und wobei die wirksamen Zeiten und Temperaturen in den Schritten (e) und (f) übereinstimmen (die Schritte (e) und (f) werden gleichzeitig durchgeführt) oder verschieden sein können.

Die Schritte (d) – (f) können so oft wiederholt werden, bis das gewünschte Ausmaß der Sequenzamplifikation erreicht ist.
Das Amplifikationsverfahren läßt sich nicht nur zur Herstellung großer Mengen einer bereits vorhandenen, vollständig bekannten Nucleinsäuresequenz verwenden, sondern auch zur Herstellung von Nucleinsäuresequenzen, von denen bekannt ist, daß sie vorhanden sind, die jedoch nicht vollständig aufgeklärt sind. In jedem Fall muß eine Kopie der zu amplifizierenden Sequenz als Ausgangsmaterial verfügbar sein, obwohl diese nicht in reiner Form oder als diskretes Molekül vorliegen muß.
Im allgemeinen umfaßt das Amplifikationsverfahren eine Kettenreaktion zur Herstellung mindestens einer spezifischen Nucleinsäure in Mengen, die sich bezogen auf die durchgeführten Reaktionsschritte exponentiell erhöhen, vorausgesetzt, daß (a) die Enden der erforderlichen Sequenz hinreichend genau bekannt sind, damit Oligodesoxyribonucleotide synthetisiert werden können, die mit der Sequenz hybridisieren, und (b) eine kleine Menge der Sequenz zur Initiierung der Kettenreaktion verfügbar ist. Das Produkt der Kettenreaktion ist eine diskrete doppelsträngige Nucleinsäure, deren Termini den Enden der verwendeten spezifischen Primer entsprechen.
Als Ausgangsnucleinsäure(n) kann jede beliebige Nucleinsäuresequenz in gereinigter oder ungereinigter Form verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie die spezifische Nucleinsäuresequenz enthält oder im Verdacht steht, diese zu enthalten. In diesem Verfahren kann daher beispielsweise eine DNA oder RNA, einschließlich Messenger-RNA, verwendet werden, wobei die DNA oder RNA einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann. Außerdem kann ein DNA-RNA-Hybridmolekül verwendet werden, das einen DNA- und einen RNA-Strang enthält. Ein Gemisch aus den vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren oder Nucleinsäuren, die vorher durch die vorliegende Amplifikationsreaktion hergestellt wurden, wobei die gleichen oder unterschiedliche Primer verwendet werden können, können ebenfalls verwendet werden. Die spezifische Nucleinsäuresequenz, die amplifiziert werden soll, kann auch nur ein Teil eines größeren Moleküls sein oder anfangs als diskretes Molekül vorliegen, so daß durch die spezifische Sequenz die vollständige Nucleinsäure gebildet wird.
Es ist nicht notwendig, daß die zu amplifizierende Sequenz am Anfang in reiner Form vorliegt. Sie kann eine kleine Fraktion eines komplexen Gemisches sein, wie z.B. ein Teil des beta-Globin-Gens, das in menschlicher Gesamt-DNA enthalten ist (wie in Saiki et al., Science, 230 (1985), 1530-1534, veranschaulicht), oder ein Teil einer Nucleinsäuresequenz eines bestimmten Mikroorganismus sein, der in einer bestimmten biologischen Probe selbst nur eine sehr kleine Fraktion darstellt. Die Ausgangs-Nucleinsäuresequenz kann mehr als eine gewünschte spezifische Nucleinsäuresequenz enthalten, wobei diese gleich oder unterschiedlich sein können. Deshalb läßt sich das Amplifikationsverfahren nicht nur zur Herstellung einer spezifischen Nucleinsäuresequenz in großen Mengen verwenden, sondern auch zur gleichzeitigen Amplifikation von mehreren verschiedenen spezifischen Nucleinsäuresequenzen, die sich auf dem gleichen oder auf verschiedenen Nucleinsäuremolekül(en) befinden.
Die Nucleinsäure(n) kann/können aus beliebigen Quellen gewonnen werden, beispielsweise aus Plasmiden, wie z.B. pBR322, aus clonierter DNA oder RNA bzw. aus in der Natur vorkommender DNA oder RNA beliebiger Herkunft, wobei Bakterien, Hefen, Viren, Organellen und höhere Organismen, wie z.B. Pflanzen oder Tiere, eingeschlossen sind. Mittels einer Vielzahl von Verfahren, wie z.B. den von Maniatis et al., vorstehend, S. 280-281, beschriebenen Verfahren, können DNA oder RNA aus Blut, Gewebematerialien, wie z.B. Chorionzotten, oder Amnionzellen extrahiert werden.
Bei Verwendung von Sonden, die für eine Sequenz spezisch sind, die zuerst amplifiziert und anschließend nachgewiesen wird, können die Zellen ohne Nucleinsäure-Extraktion direkt verwendet werden, wenn sie in einem hypotonischen Puffer suspendiert und dann solange auf etwa 90°C -100°C erhitzt werden, bis eine Zellyse stattfindet und sich die intrazellulären Bestandteile auflösen. Im allgemeinen dauert das 1 bis 15 Minuten. Nach dem Hitzeschritt können die zur Amplifikation benötigten Reagenzien den lysierten Zellen direkt zugesetzt werden.
Mit Hilfe des Amplifikationsverfahrens kann jede beliebige Nucleinsäuresequenz hergestellt werden. Es ist lediglich nötig, daß eine ausreichende Anzahl von Basen an beiden Enden der Sequenz hinreichend genau bekannt ist, damit zwei Oligonucleotid-Primer hergestellt werden können, die mit verschiedenen Strängen der gewünschten Sequenz und an relevanten Positionen der Sequenz derart hybridisieren, daß das von einem Primer synthetisierte Verlängerungsprodukt nach Trennung von seiner Matrize (Komplement) selbst als Matrize zur Verlängerung des anderen Primers dienen kann, wobei eine Nucleinsäuresequenz definierter Länge gebildet wird. Je mehr über die Basen an beiden Enden der Sequenz bekannt ist, umso spezifischer können die Primer für die Ziel-Nucleinsäuresequenz sein und umso größer ist daher die Effizienz des Verfahrens.
Selbstverständlich kann der hier verwendete Begriff "Primer" mehr als einen Primer umfassen, insbesondere dann, wenn die Informationen bezüglich der terminalen Sequenzen) des zu amplifizierenden Fragments nicht eindeutig sind. Falls beispielsweise eine Nucleinsäuresequenz aus einer Proteinsequenz abgeleitet worden ist, wird für jeden Strang eine Kollektion von Primern verwendet, die Sequenzen enthält, die entsprechend der Degeneration des genetischen Codes alle möglichen Codonvariationen umfassen. Ein Primer aus dieser Primergruppe ist dann zum Terminus der gewünschten Sequenz, die amplifiziert werden soll, homolog.
Die Oligonucleotid-Primer können unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens hergestellt werden, wie z.B. den vorstehend beschriebenen Phosphotriester- oder Phosphodiester-Verfahren bzw. automatisierten Ausführungsformen davon. Bei einer solchen automatisierten Ausführungsform werden Diethylphosphoramidite als Ausgangsmaterial verwendet, wobei diese wie von Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22 (1981), 1859-1862, beschrieben synthetisiert werden können. Ein Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden an einem modifizierten festen Träger ist im US-Patent 4,458,066 beschrieben. Die Verwendung eines Primers, der aus einer biologischen Quelle isoliert wurde (wie z.B. aus einer Spaltung mit Restriktionsendonucleasen), ist ebenfalls möglich.
Die spezifische Nucleinsäuresequenz wird unter Verwendung der Nucleinsäure hergestellt, die diese Sequenz als Matrize enthält. Der erste Schritt umfaßt das Inkontaktbringen eines jeden Nucleinsäurestrangs mit den vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten und einem Oligonucleotid-Primer für jede verschiedene Nucleinsäuresequenz, die amplifiziert oder nachgewiesen werden soll. Die Nucleosidtriphosphate sind dATP, dCTP, dGTP und TTP, falls die Nucleinsäuren, die amplifiziert oder nachgewiesen werden sollen, DNAs sind.
Die Nucleinsäurestränge werden als Matrize zur Synthese weiterer Nucleinsäurestränge verwendet. Die Synthese kann unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens durchgeführt werden. Die Synthese erfolgt im allgemeinen in einer gepufferten wäßrigen Lösung, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7-9, am meisten bevorzugt bei einem pH-Wert von etwa 8. Vorzugsweise wird dem Puffer, der die getrennten Matrizenstränge enthält, ein molarer Überschuß der zwei Oligonucleotid-Primer zugegeben (das Verhältnis Primer:Matrize beträgt für eine clonierte Nucleinsäure meistens etwa 1000:1 und für eine genomische Nucleinsäure meistens etwa 10⁸:1). Selbstverständlich muß bei Verwendung des vorliegenden Verfahrens für diagnostische Anwendungen die Menge des komplementären Stranges nicht bekannt sein, so daß die auf die Menge des komplementären Stranges bezogene Primer-Menge nicht mit Sicherheit bestimmt werden kann. In der Praxis wird die zugegebene Primer-Menge gegenüber der Menge des komplementären Stranges (Matrize) dennoch als molarer Überschuß vorliegen, wenn die zu amplifizierende Sequenz in einem Gemisch komplexer langkettiger Nucleinsäurestränge enthalten ist. Zur Erhöhung der Effizienz des Verfahrens wird ein großer molarer Überschuß bevorzugt.
Die Konzentration der Nucleosidtriphosphate im Amplifikationspuffer liegt vorzugsweise bei jeweils 150 – 200 μM. Zur Erhöhung der Effizienz und Spezifität der Reaktion ist MgCl₂ im Puffer in einer Konzentration von 1,5-2 mM vorhanden.
Wie die erhaltene Lösung danach behandelt wird, hängt davon ab, ob die Nucleinsäuren, die amplifiziert oder nachgewiesen werden sollen, doppel- oder einzelsträngig sind. Falls die Nucleinsäuren einzelsträngig sind, entfällt der Denaturierungsschritt und das Reaktionsgemisch wird auf einer Temperatur gehalten, welche die Hybridisierung des Primers mit seiner komplementären Zielsequenz (Matrize) fördert. Im allgemeinen liegt diese Temperatur im Bereich von etwa 35°C bis 65°C oder mehr, vorzugsweise bei etwa 37°C-60°C, wobei die wirksame Zeit im allgemeinen eine halbe bis fünf Minute(n), vorzugsweise eine bis drei Minute(n) beträgt. Für die Taq-Polymerase und 15-mer Primer werden zur Erhöhung der Spezifität der Primerhybridisierung vorzugsweise Temperaturen von 45°C-58°C verwendet. Kürzere Primer erfordern niedrigere Temperaturen.
Für eine ursprünglich einzelsträngige Nucleinsäure kann der komplementäre Strang durch Zugabe von ein oder zwei Oligonucleotid-Primern synthetisiert werden. Bei Zugabe eines einzelnen geeigneten Primers wird ein Primer-Verlängerungsprodukt in Gegenwart des Primers, der DNA-Polymerase von Thermus aquaticus und der Nucleosidtriphosphate synthetisiert. Das Produkt ist zur einzelsträngigen Nucleinsäure teilweise komplementär und hybridisiert mit dem Nucleinsäurestrang, wobei ein Doppelstrang mit Strängen unterschiedlicher Länge gebildet wird, der wie vorstehend beschrieben in Einzelstränge getrennt werden kann, wodurch zwei getrennte komplementäre Einzelstränge erhalten werden. In einer anderen Ausführungsform können der einzelsträngigen Nucleinsäure zwei geeignete Primer zur Durchführung der Reaktion zugegeben werden.
Falls die Nucleinsäure zwei Stränge enthält, ist die Trennung der Nucleinsäurestränge vor ihrer Verwendung als Matrize notwendig. Die Strangtrennung wird mit Hilfe eines beliebigen geeigneten Denaturierungsverfahrens, beispielsweise durch physikalische, chemische oder enzymatische Mittel, erreicht. Ein bevorzugtes physikalisches Verfahren zur Trennung von Nucleinsäuresträngen umfaßt das Erhitzen der Nucleinsäure bis zu ihrer vollständigen (>99%) Denaturierung. Eine typische Hitzedenaturierung umfaßt Temperaturen im Bereich von etwa 90°C bis 105°C, wobei die dafür benötigte Zeit etwa 0,5 bis 5 Minuten beträgt. Vorzugsweise liegt die wirksame Denaturierungstemperatur bei 90°C bis 100°C, wobei die erforderliche Zeit 0,5 bis 3 Minuten beträgt. Eine Strangtrennung kann auch durch ein Enzym aus der Enzymklasse der Helicasen oder durch das Enzym RecA ausgelöst werden, das Helicase-Aktivität besitzt und von dem bekannt ist, das es in Gegenwart von riboATP DNA denaturiert. Geeignete Reaktionsbedingungen zur Trennung von Nucleinsäuresträngen durch Helicasen sind von Kuhn, B., Abdel-Monem, M. und Hoffmann-Berling, H., CSH-Quantitative Biology, 43 (1978), 63-67, beschrieben. Ein Überblick über Verfahren zur Verwendung von RecA findet sich in C. Radding, Ann. Rev. Genetics, 16 (1982), 405-437. Durch die Denaturierung werden zwei getrennte komplementäre Stränge gleicher oder ungleicher Länge erhalten.
Wenn die doppelsträngige Nucleinsäure durch Hitze denaturiert ist, läßt man das Reaktionsgemisch auf eine Temperatur abkühlen, welche die Hybridisierung eines jeden vorhandenen Primers mit seiner komplementären Zielsequenz (Matrize) fördert. In Abhängigkeit von den Reagenzien liegt diese Temperatur meistens bei etwa 35°C bis 65°C oder mehr, vorzugsweise bei 37°C – 60°C, wobei diese Temperatur für eine wirksame Zeitspanne gehalten wird, im allgemeinen 0,5 bis 5 Minuten, vorzugsweise 1 – 3 Minuten. In der Praxis wird die Temperatur einfach von etwa 95°C auf mindestens 37°C herabgesetzt, für die Taq-Polymerase vorzugsweise auf etwa 45°C – 58°C. Bei einer Temperatur in diesem Bereich erfolgt dann eine Hybridisierung.
Die Zugabe der Thermus aquaticus-DNA-Polymerase kann beim Denaturierungsschritt erfolgen oder während die Temperatur herabgesetzt wird bzw. bereits einen Bereich erreicht hat, der die Hybridisierung fördert, gleichgültig, ob die Nucleinsäure einzel- oder doppelsträngig ist. Das Reaktionsgemisch wird danach auf eine Temperatur erhitzt, die die Enzymaktivität fördert oder optimiert, d.h. eine ausreichend hohe Temperatur, welche die Enzymaktivität so erhöhen kann, daß die Synthese der Primer-Verlängerungsprodukte der mit den Matrizen hybridisierten Primer möglich ist. Die Temperatur muß zur Synthese des Verlängerungsproduktes eines jeden Primers, das zu jeder Nucleinsäure-Matritze komplementär ist, ausreichend hoch sein, darf aber auch nicht so hoch sein, daß die Verlängerungsprodukte von ihren komplementären Matrizen getrennt werden (d.h, die Temperatur liegt im allgemeinen unter etwa 80°C – 90°C).
Die wirksame Temperatur für die Synthesereaktion liegt im allgemeinen bei 40°C bis 80°C, vorzugsweise bei 50°C – 75°C, je nachdem, welche Enzymtypen und welcher) Nucleinsäuretyp(en) verwendet werden. Bei Verwendung einer Thermus aquaticus-DNA-Polymerase ist ein Temperaturbereich von etwa 65°C – 75°C besonders bevorzugt. Die zur Synthese benötigte Zeitspanne liegt im Bereich von etwa 0,5 bis 40 Minuten oder mehr und hängt hauptsächlich von der Temperatur, der Länge der Nucleinsäure, dem Enzym und der Komplexität des Nucleinsäuregemisches ab. Eine Zeitspanne von ein bis drei Minuten ist bevorzugt. Wenn die Nucleinsäure länger ist, ist im allgemeinen auch eine längere Zeitspanne erforderlich. Die Gegenwart von Dimethylsulfoxid (DMSO) ist nicht nötig und wird auch nicht empfohlen, da festgestellt wurde, daß DMSO die Aktivität des Taq-Polymerase-Enzyms hemmt.
Der neu synthetisierte Strang und sein komplementärer Nucleinsäurestrang bilden ein doppelsträngiges Molekül, das in den folgenden Verfahrensschritten verwendet wird. Im nächsten Schritt werden die Stränge des doppelsträngigen Moleküls durch Hitzedenaturierung bei einer Temperatur getrennt, die die Denaturierung des Moleküls bewirkt, die aber nicht so hoch ist, daß das hitzestabile Enzym vollständig und irreversibel denaturiert oder inaktiviert wird. In Abhängigkeit vom Enzymtyp und der Länge der Nucleinsäure liegt diese Temperatur im allgemeinen im Bereich von etwa 90°C bis 105°C, besonders bevorzugt bei 90°C – 100°C. In Abhängigkeit hauptsächlich von der Temperatur und der Länge der Nucleinsäure liegt die Denaturierungszeit typischerweise zwischen 0,5 bis vier Minuten.
Danach wird die Temperatur soweit verringert, daß eine Hybridisierung des Primers mit seinem im vorherigen Schritt hergestellten, komplementären einzelsträngigen Molekül (Matrize) gefördert wird. Diese Temperatur ist vorstehend beschrieben.
Nach diesem Hybridisierungsschritt oder statt des Hybridisierungsschrittes (oder gleichzeitig damit) wird die Temperatur auf einen Wert eingestellt, der die Aktivität des hitzestabilen Enzyms wirksam fördert, wodurch die Synthese eines Primer-Verlängerungsproduktes unter Verwendung des im vorangegangenen Schritt neu synthetisierten Stranges als Matrize ermöglicht wird. Wieder darf wie vorstehend beschrieben die Temperatur nicht so hoch sein, daß eine Trennung des Verlängerungsproduktes von seiner Matrize (Denaturierung) erfolgt (meistens 0,5 bis 40 Minuten bei 40°C bis 80°C, vorzugsweise ein – drei Minuten bei 50°C bis 70°C). Da während dieses Schrittes eine Hybridisierung erfolgen kann, ist nach der Denaturierung keine Abkühlung wie vorher erforderlich. Falls diese verschiedene Schritte gleichzeitig ausgeführt werden, liegt die bevorzugte Temperatur im Bereich von 50°C – 70°C.
Die Schritte des Erhitzens und Abkühlens zur Strangtrennung, Hybridisierung und Synthese der Verlängerungsprodukte können so oft wiederholt werden, wie zur Herstellung der gewünschten Menge der spezifischen Nucleinsäuresequenz erforderlich ist, je nachdem, wie diese letzendlich verwendet werden soll. Nur die Mengen der vorhandenen Primer, des hitzestabilen Enzyms und der Nucleosidtriphosphate stellen eine Beschränkung dar. Die Schritte werden vorzugsweise mindestens zweimal wiederholt. Bei Verwendung zum Nachweis hängt die Anzahl der Zyklen beispielsweise von der Natur der Probe ab. Falls die zu amplifizierende Probe in reiner Form vorliegt, werden z.B. weniger Zyklen benötigt. Falls die Probe ein komplexes Nucleinsäuregemisch darstellt, werden mehr Zyklen benötigt, um das Signal für seinen Nachweis ausreichend zu amplifizieren. Zur allgemeinen Amplifikation für Nachweiszwecke wird das Verfahren vorzugsweise mindestens 20mal wiederholt.
Bei der nachstehend beschriebenen Verwendung von markierten sequenzspezifischen Sonden werden die Schritte vorzugsweise mindestens fünfmal wiederholt. Bei Verwendung dieser Sonden für menschliche genomische DNA wird das Verfahren vorzugsweise 15 – 30mal wiederholt, damit die Sequenz zum Erhalt eines deutlich nachweisbaren Signals ausreichend amplifiziert wird, d.h. damit Hintergrundssignale den Nachweis nicht stören.
Wie nachstehend genauer beschrieben, reichert sich die Menge der hergestellten spezifischen Nucleinsäuresequenz in exponentieller Weise an.
Nach der anfänglichen Zugabe müssen Nucleotide, Primer oder das hitzestabile Enzym nicht weiter zugesetzt werden, vorausgesetzt, daß das Enzym nicht denaturiert oder irreversibel inaktiviert worden ist. In diesem Fall ist die Zugabe des Enzyms nach jedem Denaturierungsschritt erforderlich. Eine ergänzende Zugabe dieser Substanzen bei jedem Schritt hat jedoch keine negative Auswirkung auf die Reaktion.
Wenn die Herstellung von mehr als einer spezifischen Nucleinsäuresequenz aus der ersten Nucleinsäure oder dem ersten Nucleinsäuregemisch gewünscht wird, wird eine geeignete Anzahl verschiedener Oligonucleotid-Primer verwendet. Beispielsweise werden vier Primer verwendet, wenn zwei verschiedene spezifische Nucleinsäuresequenzen hergestellt werden sollen. Zwei Primer besitzen für die eine spezifische Nucleinsäuresequenz Spezifität, während die anderen zwei Primer für die zweite spezifische Nucleinsäuresequenz Spezifität besitzen. Auf diese Weise kann mit Hilfe des vorliegenden Verfahrens jede der beiden verschiedenen spezifischen Sequenzen in exponentiell zunehmenden Mengen hergestellt werden.
Nach einer zur Herstellung der gewünschten Menge der spezifischen Nucleinsäuresequenz hinreichend langen Zeitspanne kann die Reaktion durch Inaktivierung des Enzyms auf eine bekannte Art (z.B. durch Zugabe von EDTA, Phenol, SDS oder CHCl₃) oder durch Trennung der Reaktionsbestandteile beendet werden.
Das Amplifikationsverfahren kann kontinuierlich ausgeführt werden. In einer Ausführungsform wird in einem automatisierten Verfahren das Reaktionsgemisch Temperaturzyklen mit einer programmierten Temperatur unterworfen, die für eine bestimmte Zeit auf einem bestimmten Wert gehalten wird.
Ein für diesen Zweck geeignetes Instrument verwendet ein computergesteuertes System zur Beförderung von Flüssigkeiten, wodurch ein Enzym, das bei einer kontrollierten Temperatur in einem ersten Behälter aufbewahrt wird, in einer Flüssigkeit in einen zweiten Behälter überführt wird, dessen Temperatur durch den Computer so kontrolliert wird, daß diese an ein bestimmtes Inkubationsprofil angepaßt ist. Im zweiten Behälter werden die zu amplifizierende(n) Nucleinsäure(n) sowie die Nucleosidtriphosphate und Primer aufbewahrt. Der Computer umfaßt eine Schnittstelle, über die der Anwender Verfahrensparameter zur Kontrolle der Merkmale der verschiedenen Sequenzamplifikationschritte eingeben kann, wie z.B. Zeitdauer und Temperaturen der Inkubation, die Menge des zu überführenden Enzyms, usw.
Ein bevorzugtes verwendbares Gerät führt die Temperaturzyklen ohne Flüssigkeitsbeförderungsystem durch, da das Enzym nicht bei jedem Zyklus zugeführt werden muß. Ein solches Gerät ist in der am 9. September 1987 veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 236,069 ausführlicher beschrieben, wobei deren Inhalt durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen ist. Kurz gesagt besteht das Gerät aus den folgenden Systemen:

1. Ein wärmeleitender Behälter zur Aufnahme einer bestimmten Anzahl von Teströhrchen, vorzugsweise 500 μl-Röhrchen, die das aus Nucleosidtriphosphaten, Primern, Nucleinsäuresequenzen und einem Enzym bestehende Reaktionsgemisch enthalten.
2. Eine Vorrichtung, die den wärmeleitenden Behälter erhitzt, abkühlt sowie über oder unter Raumtemperatur hält. Diese Vorrichtung besitzt ein Eingabegerät zum Empfang von Signalen, wodurch kontrolliert werden kann, bei welcher Temperatur oder auf welche Temperatur der Behälter erhitzt, abgekühlt oder gehalten wird. (Dabei kann es sich um Peltier-Wärmepumpen, die von Materials Electronics Products Corporation, Trenton, NJ, erhältlich sind, oder einen Wasserwärmeaustauscher handeln.)
3. Ein Computer (z.B. eine Mikroprozessor-Kontrolleinheit), der mit dem Eingabegerät der vorstehend beschriebenen Vorrichtung verbunden ist, zur Erzeugung von Signalen, welche die Reihenfolge der Amplifikationschritte, Temperaturen, Temperaturveränderungen und Zeitdauer automatisch kontrollieren.

Ein typisches Amplifikationsprotokoll für doppelsträngige DNA, welche die gewünschte Sequenz [S] enthält, die die komplementären Stränge [S⁺] und [S^–] umfaßt, ist wie folgt. Im Verlauf des ersten Zyklus und aller nachfolgenden Reaktionszyklen wird durch die Verlängerung eines jeden Oligonucleotid-Primers an der ursprünglichen Matrize ein neues einzelsträngiges DNA-Molekül unbestimmter Länge erzeugt, das mit nur einem der Primer endet. Diese nachstehend als "lange Produkte" bezeichneten Produkte reichern sich linear an, d.h. die nach einer beliebigen Anzahl von Zyklen vorhandene Menge verhält sich zur Anzahl der Zyklen proportional.
Im Verlauf der späteren Zyklen dienen die so hergestellten langen Produkte als Matrizen für jeweils einen der beiden Oligonucleotid-Primer und erzeugen Moleküle mit der gewünschten Sequenz [S⁺] oder [S^–]. Diese Moleküle dienen ebenfalls als Matrizen für jeweils einen der beiden Oligonucleotid-Primer, wodurch weitere [S⁺]- und [S^–]-Moleküle erzeugt werden. Auf diese Weise wird eine Kettenreaktion aufrechterhalten, die zu einer Anreicherung von [S] führt, die auf die Anzahl der Zyklen bezogen exponentiell verläuft.
Nebenprodukte, die durch nicht beabsichtigte Oligonucleotid-Hybridisierungen gebildet werden, sind nicht autokatalytisch (außer in seltenen Fällen) und reichern sich daher linear an. Jeder Strang, der mit der Oligonucleotid-Sequenz eines Primers und der komplementären Sequenz des anderen Primers endet, stellt die spezifische Nucleinsäuresequenz [S] dar, deren Produktion erwünscht ist.
Da die ursprüngliche Nucleinsäure nicht repliziert wird, bleibt ihre Menge während des gesamten Verfahrens konstant. Die Menge der langen Produkte erhöht sich linear, da sie nur von der ursprünglichen Nucleinsäure ausgehend erzeugt werden. Die Menge der spezifischen Sequenz wächst exponentiell. Daher wird die spezifische Sequenz zur vorherrschenden Molekülart. Das wird in der folgenden Tabelle veranschaulicht, welche die nach n Zyklen theoretisch vorhandenen relativen Mengen der Molekülarten zeigt, wobei in jedem Zyklus eine 100%-ige Effizienz vorausgesetzt wird:
Anzahl der Doppelstränge nach 0 bis n Zyklen
Bei Verwendung einer einzelsträngige Nucleinsäure als Matrize wird pro Zyklus nur ein langes Produkt gebildet.
Zur Erzielung einer größeren Spezifität der Reaktion kann eine in einer bestimmten Sequenz vorhandene Teilsequenz nach einer bestimmten Anzahl von Amplifikationszyklen amplifiziert werden, indem nach mindestens einem Amplifikationszyklus ein Satz von Primer zugegeben wird, die zu internen (nicht an den Enden befindlichen) Sequenzen der zu amplifizierenden Sequenz komplementär sind. Diese Primer können in jeder Stufe zugesetzt werden. Durch diese Primer wird ein verkürztes amplifiziertes Fragment bereitgestellt. In einer anderen Ausführungsform wird ein längeres Fragment unter Verwendung von Primern mit nicht-komplementären Enden hergestellt, die jedoch mit den zuvor zur Amplifikation verwendeten Primern etwas überlappen.
Das vorliegende Verfahren kann verwendet werden, um eine bestimmte Nucleinsäuresequenz zur Insertion in einen geeigneten Expressionsvektor zu clonieren. Zur Herstellung des Genproduktes der Sequenz mit Hilfe von Standard-Verfahren der DNA-Rekombinationstechnologie kann der Vektor dann zur Transformation eines geeigneten Wirtsorganismus verwendet werden. Diese Clonierung kann eine direkte Ligierung in einen Vektor durch Ligierung von glatten Enden oder die Verwendung von Restriktionsenzymen zur Spaltung von Restriktionsstellen, die in den Primern enthalten sind, umfassen.
Das Amplifikationsverfahren kann außerdem zur in vitro-Mutagenese verwendet werden. Die Oligodesoxyribonucleotid-Primer müssen zu der DNA-Sequenz, die amplifiziert werden soll, nicht exakt komplementär sein. Es ist nur erforderlich, daß sie mit der Sequenz, die durch das hitzestabile Enzym verlängert werden soll, ausreichend gut hybridisieren können. Die Produkte einer Amplifikationsreaktion, bei der zur ursprünglichen Matrize nicht exakt komplementäre Primer verwendet wurden, enthalten die Sequenz des Primers und nicht die der Matrize, wodurch eine in vitro-Mutation eingeführt wird. In weiteren Zyklen wird diese Mutation ohne Beeinträchtigung effizient amplifiziert, da keine weiteren Basenfehlpaarungen des Primers vorliegen. Die so hergestellte Mutante kann durch Standardverfahren der Molekularbiologie in einen geeigneten Vektor inseriert werden. Sie kann diesem Vektor Mutanteneigenschaften, wie z.B. das Potential zur Produktion eines veränderten Proteins, verleihen.
Unter Verwendung unterschiedlicher Primer kann das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung einer veränderten DNA-Sequenz mit der modifizierten DNA wiederholt werden, um weitere Sequenzveränderungen herbeizuführen. Auf diese Weise kann allmählich eine Reihe mutierter Sequenzen hergestellt werden, wobei sich jede neue Sequenzmutation von der vorherigen nur unwesentlich, von der ursprünglichen Ausgangs-DNA-Sequenz jedoch zunehmend unterscheidet. Auf diese Weise können letztendlich Veränderungen erzeugt werden, die in einem einzigen Schritt nicht realisierbar wären, da ein Primer mit geringer Komplementarität gegenüber der Matrizensequenz nicht funktionieren kann.
Der Primer kann außerdem eine nicht-komplementäre Sequenz als Teil seiner Sequenz enthalten, vorausgesetzt, daß ein ausreichender Teil des Primers eine Sequenz enthält, die komplementär zum Strang ist, der amplifiziert werden soll. An das 5'-Ende eines der beiden Primer kann beispielsweise eine zur Matrizensequenz nicht komplementäre Nucleotidsequenz (wie z.B. ein Promotor, ein Linker, eine codierende Sequenz usw.) angeheftet und dadurch an das amplifizierte Produkt angehängt werden. Nach Zugabe des Verlängerungsprimers werden ausreichend viele Zyklen durchgeführt, um die gewünschte Menge der die nicht-komplementäre Nucleotidinsertion enthaltenden neuen Matrize herzustellen. Unter Verwendung eines einfachen Verfahrens wird so die Herstellung großer Mengen der vereinigten Fragmente in einer relativ kurzen Zeitspanne ermöglicht (z.B. zwei Stunden oder weniger).
Das vorliegende Verfahren kann auch verwendet werden, um spezifische Nucleinsäuresequenzen nachzuweisen und/oder zu charakterisieren, die im Zusammenhang mit infektiösen Krankheiten, genetischen Störungen oder zellulären Erkrankungen, beispielsweise Krebs, stehen, wie z.B. Oncogene. Eine Amplifikation ist dann zweckmäßig, wenn die zur Analyse verfügbare Menge der Nucleinsäure sehr klein ist, wie z.B. bei der pränatalen Diagnose von Sichelzellenanämie unter Verwendung von DNA, die aus foetalen Zellen gewonnen wurde. Eine Amplifikation ist besonders nützlich, wenn eine kleine Probe mit nichtradioaktiven Nachweisverfahren, die von Natur aus nicht sensitiv sind, analysiert werden muß oder wenn radioaktive Nachweisverfahren verwendet werden, jedoch ein schneller Nachweis erwünscht ist.
Für Zwecke der vorliegenden Erfindung können genetische Krankeiten spezifische Deletionen und/oder Mutationen in genomischer DNA aus einem beliebigen Organismus umfassen, wie z.B. Sichelzellenanämie, zystische Fibrose, alpha-Thalassämie, beta-Thalassämie und dergleichen. Sichelzellenanämie kann ohne weiteres über Oligomer-Restriktionsanalyse nachgewiesen werden, wie in der am 11. Dezember 1985 veröffentlichten Patentanmeldung EP-0 164 054 beschrieben, oder über eine RFLP-ähnliche Analyse nach Amplifikation der geeigneten DNA-Sequenz mit Hilfe des Amplifikationsverfahrens. Alpha-Thalassämie kann durch die Abwesenheit einer Sequenz nachgewiesen werden, während sich beta-Thalassämie durch das Vorhandensein einer polymorphen Restriktionsstelle, die mit einer die Krankheit verursachenden Mutation eng gekoppelt ist, nachweisen läßt.
Alle diese genetischen Krankheiten können nachgewiesen werden, indem eine geeignete Sequenz amplifiziert und durch Southern-Blot-Hybridisierung ohne Verwendung radioaktiver Sonden analysiert wird. Bei einem solchen Verfahren wird z.B. eine kleine Probe einer beispielsweise aus Fruchtwasser stammenden DNA, die nur eine sehr kleine Menge der gewünschten Sequenz enthält, amplifiziert, dann mit einem Restriktionsenzym gespalten und über das Southern-Blot-Verfahren analysiert. Die große Menge des amplifizierten Signals ermöglicht die Verwendung von nichtradioaktiven Sonden.
In einer anderen Ausführungsform kann eine kleine DNA-Probe amplifiziert werden, bis eine zweckmäßige Produktmenge hergestellt wurde. Danach wird ein weiterer Zyklus der Verlängerungsreaktion durchgeführt, wobei leicht nachweisbare Nucleotid-Derivate (wie z.B. ³²P-markierte oder Biotin-markierte Nucleosidtriphosphate) direkt in das letzte DNA-Produkt eingebaut werden, das dann durch Restriktion und elektrophoretische Trennung oder ein anderes geeignetes Verfahren analysiert werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Nucleinsäure vor Amplifikation einer bestimmten Restriktionsendonuclease ausgesetzt werden. Da eine gespaltene Sequenz nicht amplifiziert werden kann, bedeutet das Erscheinen eines amplifizierten Fragments trotz vorheriger Spaltung der DNA-Probe, daß in der amplifizierten Sequenz eine Restriktionsstelle für die Endonuclease fehlt. Mit Hilfe eines geeigneten Verfahrens kann die Gegenwart oder Abwesenheit einer amplifizierten Sequenz nachgewiesen werden.
In der vorstehend zitierten Veröffentlichung von Saiki et al. in Science ist eine praktische Anwendung des Amplifikationsverfahrens genauer beschrieben, nämlich zur Erleichterung des Nachweises von Sichelzellenanämie mit Hilfe des Oligomer-Restriktionsverfahrens, das in der Patentanmeldung EP-0 164 054, vorstehend, und von Saiki et al., Bio/Technology, 3 (1985), S. 1008-1012, beschrieben ist. In dieser Science-Veröffentlichung ist ein bestimmtes Amplifikationsprotokoll unter Verwendung eines Abschnittes des beta-Globin-Gens erläutert.
Das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren kann auch zum direkten Nachweis von einzelnen Nucleotidveränderungen in einer Nucleinsäuresequenz (wie z.B. genomischer DNA) unter Verwendung sequenzspezifischer Oligonucleotide angewendet werden, wie in der am 16. September 1987 veröffentlichten Patentanmeldung EP-0 237 362 ausführlicher beschrieben. Diese Offenbarung ist durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen.
Kurz zusammengefaßt wird bei diesem Verfahren die amplifizierte Probe auf eine Reihe von Membranen direkt aufgetüpfelt. Jede Membran wird mit einer markierten unterschiedlichen sequenzspezifischen Oligonucleotid-Sonde hybridisiert. Nach Hybridisierung wird die Probe abgewaschen und die Markierung nachgewiesen. Dieses Verfahren läßt sich besonders zum Nachweis von DNA-Polymorphismen verwenden.
In klinischen Proben können verschiedene Infektionskrankheiten durch die Gegenwart spezifischer DNA-Sequenzen, die für die mikrobiellen Erreger charakteristisch sind, diagnostiziert werden. Die Mikroorganismen umfassen Bakterien, wie z.B. Salmonella, Chlamydia und Neisseria; Viren, wie z.B. die Hepatitis-Viren, und Parasiten, wie z.B. das für Malaria verantwortliche Plasmodium. Die an Falkow et al. am 13. Mai 1986 erteilte "U.S. Patent Reexamination Certificate" B1 4,358,535 beschreibt die Verwendung spezifischer DNA-Hybridisierungssonden zur Diagnose von Infektions krankeiten. In der klinischen Probe eines infizierten Patienten ist vielleicht nur eine relativ kleine Zahl pathogener Organismen vorhanden und die daraus extrahierte DNA bildet vielleicht nur eine sehr kleine Fraktion der in dieser Probe vorhandenen Gesamt-DNA. Eine spezifische Amplifikation der verdächtigen pathogenspezifischen Sequenzen vor Immobilisierung und Nachweis durch Hybridisierung der DNA-Proben kann die Empfindlichkeit und Spezifität der üblichen Verfahren erheblich verbessern.
Eine routinemäßige klinische Verwendung von DNA-Sonden zur Diagnose von Infektionskrankheiten würde beträchtlich vereinfacht, wenn wie von Ward in EP-0 063 879 beschrieben nichtradioaktiv markierte Sonden eingesetzt würden. Bei diesem Verfahren werden Biotin enthaltende DNA-Sonden durch chromogene Enzyme nachgewiesen, die an Avidin oder biotinspezifische Antikörper gebunden sind. Dieser Nachweistyp ist einfach, aber relativ unempfindlich. Die Kombination von einer spezifischen DNA-Amplifikation durch das erfindungsgemäße Verfahren mit der Verwendung stabil markierter Sonden kann die erforderliche einfache Handhabung und Empfindlichkeit schaffen, damit sich die Verfahren von Falkow und Ward als klinisches Routineverfahren verwenden lassen.
Eine spezifische Verwendung der Amplifikationstechnik zum Nachweis oder zur Kontrolle des AIDS-Virus ist in der am 22. Juli 1987 veröffentlichten Patentanmeldung EP-0 229 701 beschrieben, wobei diese Offenbarung durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen ist. Kurz zusammengefaßt werden bei dem Amplifikations- und Nachweisverfahren Primer und Sonden verwendet, die für die Amplifikation bzw. den Nachweis von Nucleinsäuresequenzen konstruiert wurden, die unter den Nucleinsäuren von AIDS-Viren im wesentlichen konserviert sind, und die für Nucleinsäuren in AIDS-Viren spezifisch sind. Die nachzuweisende Sequenz muß daher ausreichend komplementär zu den Nucleinsäuren in AIDS-Viren sein, damit eine Polymerisation, vorzugsweise bei Raumtemperatur, in Gegenwart des Enzyms und der Nucleosidtriphosphate initiiert wird.
Bei einem bevorzugten Amplifikationsverfahren werden markierte Primer verwendet. Die Markierung im amplifizierten Produkt kann verwendet werden, um das Produkt zum späteren Nachweis "einzufangen" oder zu immobilisieren (z.B. ergeben biotinylierte Amplifikationsprimer markierte Produkte, die durch ihre Wechselwirkung mit Avidin oder Streptavidin "eingefangen" werden können). Wie in den vorstehend erwähnten Amplifikationsprotokollen gezeigt, wird bei der Herstellung der gewünschten spezifischen Nucleinsäuresequenz das Verlängerungsprodukt eines markierten Primers zur Matrize, wenn es an den anderen Primer hybridisiert ist, und umgekehrt. Das Verfahren wird so oft wiederholt, wie es zur Herstellung der gewünschten Menge der Sequenz erforderlich ist. Beispiele für besonders bevorzugte Reagenzien, die als Markierung verwendet werden können, sind im US-Patent 4,582,789, bereitgestellt, wobei die Offenbarung davon durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen ist.
Das Amplifikationsverfahren kann außerdem verwendet werden, um ausreichende DNA-Mengen eines als Einzelkopie vorkommenden menschlichen Gens herzustellen, so daß zur direkten DNA-Diagnose ein Nachweis durch eine einfache unspezifische DNA-Anfärbung, wie z.B. Ethidiumbromid, erfolgen kann.
Außer zum Nachweis von Infektionskrankheiten und pathologischen Abnormitäten im Genom von Organismen kann das Amplifikationsverfahren auch zum Nachweis von DNA-Polymorphismen verwendet werden, die nicht mit pathologischen Zuständen im Zusammenhang stehen.
Zusammengefaßt stellt das Amplifikationsverfahren ein Verfahren zur Amplifikation einer oder mehrerer spezifischer Nucleinsäuresequenzen unter Verwendung einer Kettenreaktion und eines hitzestabilen Enzyms dar, wobei in dieser Reaktion Primer-Verlängerungsprodukte hergestellt werden, die anschließend als Matrizen für weitere Primer-Verlängerungsreaktionen dienen. Das Verfahren läßt sich insbesondere zum Nachweis von Nucleinsäuresequenzen verwenden, die anfangs nur in sehr kleinen Mengen vorhanden sind.
Die folgenden Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung und sollen in keinster Weise den Schutzumfang der Patentansprüche beschränken. Soweit nicht anders angegeben, sind in den Beispielen alle Prozentangaben auf das Gewicht bezogen, sofern es sich um Feststoffe handelt, und auf das Volumen, sofern es sich um Flüssigkeiten handelt. Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.
BEISPIEL I
A. Synthese der Primer
Die folgenden zwei Oligonucleotid-Primer wurden mit Hilfe des nachstehend beschriebenen Verfahrens hergestellt:
5'-ACACAACTGTGTTCAC7AGC-3' (PCO3)
5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3' (PCO4)
Die beiden 20-mer Primer hybridisieren an entgegengesetzte Stränge der genomischen DNA, wobei ihre 5'-Enden einen Abstand von 110 Basenpaaren haben.

1. Automatisierte Syntheseverfahren: Die nach Beaucage und Caruthers (Tetrahedron Letters, 22 (1981), 1859-1862) synthetisierten Diethylphosphoramidite wurden unter Verwendung der Vorrichtung SAM-1 von Biosearch nacheinander an einen Glasträger mit kontrolliertem Porendurchmesser, der Nucleosid-derivatisiert worden war, kondensiert. Das Verfahren umfaßte die Abspaltung von Tritylgruppen mit Trichloressigsäure in Dichlormethan, Kondensation unter Verwendung von Benzotriazol als aktivierendem Protonendonor sowie "capping" mit Acetanhydrid und Dimethylaminopyridin in Tetrahydrofuran und Pyridin. Die Zeit für einen Zyklus betrug etwa 30 Minuten. Bei jedem Schritt waren die Ausbeuten im Prinzip quantitativ und wurden bestimmt, indem der während der Detritylierung freigesetzte Dimethoxytritylalkohol gesammelt und spektroskopisch untersucht wurde.
2. Verfahren zur Schutzgruppenentfernung und Aufreinigung der Oligodesoxyribonucleotide: Der feste Träger wurde aus der Säule entfernt und in einem verschlossenen Röhrchen mit 1 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid vier Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Der Träger wurde danach mittels Filtration entfernt. Die Lösung, die die teilweise geschützten Oligodesoxyribonucleotide enthielt, wurde fünf Stunden bei 55°C gehalten. Ammoniak wurde entfernt und der Rückstand auf ein präparatives Polyacrylamid-Gel aufgetragen. Bei 30 Volt/cm wurde eine 90-minütige Elektrophorese durchgeführt. Danach wurde die das Produkt enthaltende Bande mittels der Schattenbildung auf einer fluoreszierenden Platte bei UV-Bestrahlung nachgewiesen. Die Bande wurde ausgeschnitten und mit 1 ml destillierten Wasser über Nacht bei 4°C eluiert. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Altech-RP18-Säule aufgetragen und mit einem 7-13%-igen Acetonitrilgradienten in 1%-igem Ammoniumacetat-Puffer bei einem pH-Wert von 6,0 eluiert. Die Elution wurde durch Messung der UV-Extinktion bei 260 nm überwacht. Geeignete Fraktionen wurden gesammelt, durch UV-Extinktion in einem festgelegten Volumen quantitativ bestimmt und in einer Vakuumzentrifuge bei Raumtemperatur zur Trockene eingedampft.
3. Charakterisierung der Oligodesoxyribonucleotide: Aliquots der gereinigten Oligonucleotide wurden mit Polynucleotidkinase und gamma-³²P-ATP ³²P-markiert. Die markierten Verbindungen wurden auf einem 14-20%-igen Polyacrylamid-Gel einer 45-minütigen Elektrophorese bei 50 Volt/cm unterworfen und dann mittels Autoradiographie untersucht. Durch dieses Verfahren wurde das Molekulargewicht überprüft. Die Basenzusammensetzung wurde bestimmt, indem die Oligodesoxyribonucleotide unter Verwendung von Schlangengift ("venom")-Diesterase und bakterieller alkalischer Phosphatase zu Nucleosiden gespalten wurden. Anschließend wurden die erhaltenen Nucleoside unter Verwendung einer Umkehrphasen-HPLC-Säule sowie einer mobilen Phase aus 10% Acetonitril und 1% Ammoniumacetat aufgetrennt und quantitativ bestimmt.

B. Isolierung menschlicher genomischer DNA aus einer Zellinie
Aus der T-Zellinie Molt 4, die für das normale β-Globin-Gen homozygot ist und aus der Human Genetic Mutant Cell Depository, Camden, NJ, unter der Nummer GM2219C erhältlich ist, wurde hochmolekulare genomische DNA isoliert, wobei im wesentlichen das Verfahren von Maniatis et al., vorstehend, S. 280-281, verwendet wurde.
C. Aufreinigung einer Polymerase aus Thermus aquaticus
Der Thermus aquaticus-Stamm YT1, der ohne Beschränkungen von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, unter der Nummer ATCC 25,104 erhältlich ist, wurde in Flaschen im folgenden Medium ezüchtet:

Natriumcitrat 1 mM

Kaliumphosphat, pH 7,9 5 mM

Ammoniumchlorid 10 mM

Magnesiumsulfat 0,2 mM

Calciumchlorid 0,1 mM

Natriumchlorid 1 g/l

Hefeextrakt 1 g/l

Trypton 1 g/l

Glucose 2 g/l

Eisen(II)-sulfat 0,01 mM

(Der pH-Wert wurde vor dem Autoklavieren auf 8,0 eingestellt.)

Aus einer Anzuchtkultur, die im vorstehenden Medium über Nacht bei 70°C gezüchtet worden war, wurde ein 10 l-Fermentor beimpft. Aus der Anzuchtflasche wurde ein Volumen von insgesamt 600 ml zur Beimpfung von 10 l des gleichen Mediums verwendet. Mit Ammoniumhydroxid wurde der pH-Wert bei 8,0 gehalten, bei 40% gelöstem Sauerstoff, einer Temperatur von 70°C und einer Rührgeschwindigkeit von 400 Upm.
Nach der Zellzüchtung wurden die Zellen gereinigt, wobei in den ersten fünf Schritten das Protokoll von Kaledin et al., vorstehend, (mit geringfügigen Modifikationen) und im sechsten Schritt ein anderes Protokoll verwendet wurde. Alle sechs Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Die Geschwindigkeit der Fraktionierung an den Säulen betrug 0, 5 Säulen/Stunde, die Volumina der Gradienten während der Elution beliefen sich auf 10 Säulenvolumen. Eine andere bevorzugte Ausführungsform des Aufreinigungsprotokolls wird nachstehend in Beispiel XIII bereitgestellt.
Kurz zusammengefaßt wurde die vorstehende T. aquaticus-Zellkultur nach neun Stunden Züchtung in der späten logarithmischen Phase bei einer Zelldichte von 1,4 g Trockengewicht/l durch Zentrifugation geerntet. Zwanzig Gramm Zellen wurden in 80 ml Puffer resuspendiert, der aus 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, und 0,1 mM EDTA bestand. Die Zellen wurden lysiert und das Lysat wurde zwei Stunden bei 4°C in einem TI-45-Rotor von Beckman bei 35 000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt (Fraktion A). Die
Proteinfraktion, die mit Ammoniumsulfat bei einer Sättigung zwischen 45% und 75% präzipitiert worden war, wurde in einem Puffer gelöst, der aus 0,2 M Kaliumphosphat-Puffer, pH-Wert 6,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 5% Glycerin bestand, und schließlich gegen den gleichen Puffer dialysiert, wobei Fraktion B erhalten wurde.
Fraktion B wurde auf eine 2,2 × 30 cm große DEAE-Cellulose-Säule aufgetragen, die mit dem vorstehend beschriebenen Puffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit dem gleichen Puffer gewaschen und es wurden das Protein enthaltende Fraktionen gesammelt (durch Extinktion bei 280 nm bestimmt). Die vereinigten Proteinfraktionen wurden gegen einen zweiten Puffer dialysiert, der 0.01 M Kaliumphosphat-Puffer, pH-Wert 7,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 5% Glycerin enthielt, wobei Fraktion C erhalten wurde.
Fraktion C wurde auf eine 2,6 × 21 cm große Hydroxylapatit-Säule aufgetragen, die mit dem zweiten Puffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann gewaschen und das Enzym mit einem linearen Gradienten von 0,01-0,5 M Kaliumphosphat-Puffer, pH-Wert 7,5, eluiert, der 10 mM 2-Mercaptoethanol und 5% Glycerin enthielt. Fraktionen, die DNA-Polymerase-Aktivität enthielten (90 – 180 mM Kaliumphosphat), wurden vereinigt, unter Verwendung einer Amicon-Rührzelle und einer YM10-Membran vierfach konzentriert und gegen den zweiten Puffer dialysiert, wobei Fraktion D erhalten wurde.
Fraktion D wurde auf eine 1,6 × 28 cm große DEAE-Cellulose-Säule aufgetragen, die vorher mit dem zweiten Puffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde gewaschen und die Polymerase mit einem linearen Gradienten von 0,01 – 0,5 M Kaliumphosphat im zweiten Puffer eluiert. Die Fraktionen wurden auf Verunreinigungen durch Endonuclease(n) und Exonuclease(n) hin untersucht, indem Molekulargewichtsveränderungen von Phagen λ-DNA oder supergeknäulter Plasmid-DNA nach Inkubation mit einem Überschuß an DNA-Polymerase (für Endonucleasen) sowie Behandlung mit einem Restriktionsenzym, das die DNA in mehrere Fragmente spaltet (für Exonucleasen), elektrophoretisch nachgewiesen wurden. Nur die DNA-Polymerase-Fraktionen (65 – 95 mM Kaliumphosphat) mit geringfügigen Nucleaseverunreinigungen wurden vereinigt. Den vereinigten Fraktionen wurde autoklavierte Gelatine in einer Menge von 250 μg/ml zugesetzt. Durch eine Dialyse gegen den zweiten Puffer wurde Fraktion E erhalten.
Fraktion E wurde auf eine Phophocellulose-Säule aufgetragen und mit einem 100 ml-Gradienten eluiert (0,01 – 0,4 M KCl-Gradient in 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5). Die Fraktionen wurden wie vorstehend beschrieben auf Verunreinigungen durch Endo-/Exonuclease(n) sowie auf Polymerase- Aktivität (mit Hilfe des Verfahrens von Kaledin et al.) untersucht und dann vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden gegen den zweiten Puffer dialysiert und dann durch Dialyse gegen 50%-iges Glycerin sowie den zweiten Puffer konzentriert.
Das Molekulargewicht der Polymerase wurde mit Hilfe einer SDS-PAGE-Analyse bestimmt. Als Markerproteine (Standardproteine mit niedrigem Molekulargewicht von Bio-Rad) dienten Phosphorylase B (92 500), Rinder-Serumalbumin (66 200), Ovalbumin (45 000), Kohlensäureanhydrase ("carbonic anhydrase") (31 000), Sojabohnen-Trypsininhibitor (21 500) und Lysozym (14 400).
Vorläufige Daten deuten an, daß die Polymerase ein Molekulargewicht von etwa 86 000 – 90 000 Dalton besitzt und nicht 62 000 – 63 000 Dalton, wie in der Literatur berichtet (z.B. von Kaledin et al.).
Die Polymerase wurde in 50 μl eines Gemischs inkubiert, das 25 mM Tris-HCl, pH-Wert entweder 6,4 oder 8,0, sowie 0,1 M KCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM 2-Mercaptoethanol, jeweils 10 nmol dGTP, dATP und TTP, 0,5 μCi (³H)-dCTP, 8 μg "aktivierte" Kalbsthymus-DNA und 0,5 – 5 Einheiten Polymerase enthielt. "Aktivierte" DNA ist ein natives Präparat einer DNA, die mit DNase I partiell hydrolysiert wurde, bis 5% DNA säurelöslich waren. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei 70°C durchgeführt und durch Zugabe von 50 μl einer gesättigten wäßrigen Natriumpyrophosphat-Lösung, die 0,125 M EDTA-Na₂ enthielt, beendet. Die weitere Behandlung der Proben und die Aktivitätsbestimmung wurden durchgeführt, wie von Kaledin et al., vorstehend, beschrieben.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Polymerase bei einem pH-Wert von 6,4 etwas mehr als die Hälfte der bei einem pH-Wert von 8,0 gefundenen Aktivität besitzt. Im Gegensatz dazu stellten Kaledin et al. fest, daß das von ihnen beschriebene Enzym bei einem pH-Wert von etwa 7,0 8% der bei einem pH-Wert von 8,0 gefundenen Aktivität besitzt. Das pH-Profil des erfindungsgemäßen hitzestabilen Enzyms ist daher breiter als das pH-Profil des Enzyms von Kaledin et al.
Wenn man schließlich aus einem Reaktionsgemisch zur DNA-Polymerase-Analyse nur ein oder auch mehrere Nucleosidtriphosphat(e) entfernte, konnte man bei Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms wenn überhaupt, nur eine sehr geringe Aktivität feststellen. Diese Aktivität stimmte mit dem erwarteten Wert überein und zeigte, daß das Enzym mit hoher Genauigkeit arbeitet. Bei Verwendung des Enzyms von Kaledin et al. (vorstehend) stimmt im Gegensatz dazu die beobachtete Aktivität nicht mit dem erwarteten Wert überein, was andeutet, daß Nucleosidtriphosphat(e) falsch eingebaut werden.
D. Amplifikationsreaktion
Ein Mikrogramm der vorstehend beschriebenen genomischen DNA wurde in einem wäßrigen Reaktionsgemisch mit einem Anfangsvolumen von 100 μl gelöst, das 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol, 200 μg/ml Gelatine, 1 μM Primer PCO3, 1 μM Primer PCO4, 1,5 mM ATP, 1,5 mM dCTP, 1,5 mM dGTP und 1,5 mM TTP enthielt. Zur Denaturierung der genomischen DNA wurde die Probe 10 Minuten auf 98°C erhitzt und danach auf Raumtemperatur abgekühlt. Dem Reaktionsgemisch wurden vier Mikroliter Thermus aquaticus-Polymerase zugegeben. Danach wurde das Gemisch mit 100 μl Mineralöl überschichtet. Die Probe wurde dann in den Aluminiumheizblock des vorstehend beschriebenen Gerätes mit Flüssigkeitsbeförderungs- und Heizsystem gegeben.
In diesem Gerät wurde die DNA-Probe 20 Amplifikationszyklen unterzogen, wobei der folgende Programmzyklus wiederholt wurde:

1) Erhitzen im Heizblock von 37°C auf 98°C über eine Zeitspanne von 2,5 Minuten; und
2) Abkühlen von 98°C auf 37°C über eine Zeitspanne von drei Minuten zur Hybridisierung der Primer mit der DNA.

Nach dem letzten Zyklus wurde die Probe zur Beendigung der letzten Verlängerungsreaktion weitere 10 Minuten bei 55°C inkubiert.
E. Synthese und Phosphorylierung von Oligodesoxyribonucleotid-Sonden
Es wurde eine als RS24 bezeichnete markierte DNA-Sonde mit der folgenden Sequenz hergestellt:
5'-*CCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAG-3' (RS24)
wobei * die Markierung zeigt. Die Sonde hat eine Länge von 40 Basen, ist zum normalen Allel des beta-Globin-Gens (beta^A) komplementär und reicht vom vierten bis siebzehnten Codon des Gens. Eine schematische Darstellung der Primer und der Sonden ist nachstehend gezeigt:
Die Sonde wurde nach den in Teil I von Beispiel I beschriebenen Verfahren synthetisiert. Die Sonde wurde markiert, indem 20 pmol Sonde mit 4 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (New England Biolabs) und etwa 40 pmol gamma-³²P-ATP (New England Biolabs, etwa 7000 Ci/mmol) in 40 μl Reaktionsgemisch, das 70 mM Tris-Puffer (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 1,5 mM Spermidin und 10 mM Dithiothreitol enthielt, 60 Minuten bei 37°C in Kontakt gebracht wurden. Danach wurde das Gesamtvolumen mit 25 mM EDTA auf ein Volumen von 100 μl eingestellt. Die Sonde wurde nach dem Verfahren von Maniatis et al., Molecular Cloning, (1982), 466-467, über eine 1 ml Bio-Gel-P4-Dialyse-Säule zum Zentrifugieren (Bio-Rad) aufgereinigt, die mit Tris-EDTA (TE)-Puffer (10 mM Tris-Puffer, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) äquilibriert worden war. Eine Präzipitation des Produkts mit Trichloressigsäure (TCA) ergab, daß die spezifische Aktivität von RS24 4,3 μCi/pmol betrug und ihre Endkonzentration 0,118 pmol/μl war.
F. Dot-Blot-Hybridisierungen
Vier Mikroliter der amplifizierten Probe aus Abschnitt IV und 5,6 μl von geeigneten Verdünnungen einer das beta-Globin-Gen enthaltenden Plasmid-DNA, wobei diese so berechnet waren, daß sie Amplifikationseffizienzen von 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% und 100% entsprachen, wurden mit 200 μl 0,4 N NaOH, 25 mM EDTA verdünnt und auf Genatran 45-Nylonfilter (Plasco) aufgetropft. Die Filter wurden zuerst mit Wasser befeuchtet und dann in eine Bio-Dot-Vorrichtung zur Dot-Blot-Herstellung (Bio-Rad, Richmond, CA) gegeben, der die Filter fixiert. Dann wurden die Proben aufgetragen und jeder Filter in der Halterung wurde mit 0,1 ml 20 × SSPE (3,6 M NaCl, 200 mM NaH₂PO₄, 20 mM EDTA) gespült, wie von Reed und Mann, Nucleic Acids Research, 13 (1985), 7202-7221, offenbart. Danach wurden die Filter entfernt, in 20 × SSPE gespült und 30 Minuten bei 80°C in einem Vakuumofen mit Hitze behandelt.
Nach dieser Hitzebehandlung wurde jeder Filter mit 16 ml Hybridisierungslösung in Kontakt gebracht, die aus 3 × SSPE, 5 × Denhardt-Lösung (1 x = 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Ficoll, 0,02% Rinder- Serumalbumin, 0,2 mM Tris, 0,2 mM EDTA, pH 8,0), 0,5% SDS und 30% Formamid bestand, und dann zwei Stunden bei 42°C inkubiert. Danach wurden der Hybridisierungslösung 2 pmol der RS24-Sonde zugesetzt und die Filter wurden zwei Minuten bei 42°C inkubiert.
Zum Schluß wurde jeder hybridisierte Filter zweimal mit 100 ml 2 × SSPE und 0,1% SDS 10 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Dann wurden die Filter einmal mit 100 ml 2 × SSPE, 0,1% SDS 10 Minuten bei 60°C behandelt.
Jeder Filter wurde danach einer Autoradiographie unterzogen, wobei die Signale ohne weiteres nach zwei Stunden sichtbar waren.
G. Autoradiogramm-Auswertung
Die Autoradiogramme der Dot-Blot-Hybridisierungen wurden nach zwei Stunden analysiert. Wie von Saiki et al., Science, vorstehend, beschrieben, wurde die Intensität der Signale mit einer Standard-Verdünnungsreihe verglichen, die ein aus Fragmenten einer HaeIII/MaeI-Spaltung von pBR: beta^A erneut zusammengefügtes beta-Globin-Gen enthielt, wobei beta^A das Wildtyp-Allel darstellt. Eine Analyse des Reaktionsproduktes ergab, daß die Amplifikationseffizienz insgesamt etwa 95% betrug, was einer 630 000fachen Zunahme der beta-Globin-Zielsequenz entspricht.
BEISPIEL II
A. Amplifikationsreaktion
Zwei Proben mi jeweils 1 μg genomischer DNA, die wie in Beispiel I beschrieben aus der Zellinie Molt 4 extrahiert worden war, wurden jeweils in 100 μl Reaktionsgemisch verdünnt, das 50 mM KCl, 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 1 μM PCO3-Primer, 1 μM PCO4Primer, 200 μg/ml Gelatine, 10% Dimethylsulfoxid (bezogen auf das Volumen) sowie jeweils 1,5 mM dATP, dCTP, dGTP und TTP enthielt. Nach 10-minütigem Erhitzen bei 98°C zur Denaturierung der genomischen DNA wurden die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt. Jeder Probe wurden 4 μl der in Beispiel I beschriebenen Thermus aquaticus-Polymerase zugesetzt. Zur Verhinderung von Kondensation sowie Verlusten durch Verdunstung wurden die Proben mit Mineralöl überschichtet.
Eine Probe wurde in den Heizblock des in Beispiel I beschriebenen Gerätes gegeben und 25 Amplifikationszyklen unterworfen, wobei der folgende Programmzyklus wiederholt wurde:

(1) Erhitzen von 37°C auf 93°C über eine Zeitspanne von 2,5 Minuten;
(2) Abkühlen von 93°C auf 37°C über eine Zeitspanne von drei Minuten zur Hybridisierung der Primer mit der DNA; und
(3) Zweiminütiges Halten der Temperatur bei 37°C.

Nach dem letzten Zyklus wurde die Probe zur Beendigung der letzten Verlängerungsreaktion weitere 10 Minuten bei 60°C inkubiert.
Die zweite Probe wurde in den wärmeleitenden Behälter eines Gerätes gegeben, das in EP-0 0236 069, vorstehend, genauer beschrieben ist. Der wärmeleitende Behälter ist an Peltier-Wärmepumpen, die die Temperaturen erhöhen oder senken, und eine Mikroprozessor-Kontrolleinheit angeschlossen, die die Reihenfolge der Amplifikationsschritte, Temperaturwerte, Temperaturveränderungen und Zeitdauer der einzelnen Temperaturschritte automatisch steuert.
Die zweite Probe wurde 25 Amplifikationszyklen unterworfen, wobei der folgende Programmzyklus wiederholt wurde:

(1) Erhitzen von 37°C auf 95°C über eine Zeitspanne von drei Minuten;
(2) Halten der Temperatur für 0,5 Minuten bei 95°C zur Denaturierung;
(3) Einminütiges Abkühlen von 95°C auf 37°C; und
(4) Einminütiges Halten der Temperatur bei 37°C.

B. Analyse
Zur Analyse wurden zwei Tests, eine Dot-Blot-Hybridisierung und eine Agarose-Gelelektrophorese, durchgeführt.
Zur Dot-Blot-Analyse wurde eine als RS18 bezeichnete markierte DNA-Sonde mit der folgenden Sequenz hergestellt:
5'-*CTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3' (RS18)
wobei * die Markierung zeigt. Die Sonde ist 19 Basen lang, ist zum normalen Allel des beta-Globin-Gens (beta^A) komplementär und reicht vom vierten bis siebzehnten Codon des Gens. Die schematische Darstellung von Primern und Sonden ist nachstehend gezeigt:
Die Sonde wurde nach den in Abschnitt I von Beispiel I beschriebenen Verfahren synthetisiert. Die Sonde wurde markiert, indem 10 pmol davon mit 4 Einheiten T4-Polynucleotidkinase (New England Biolabs) und etwa 40 pmol gamma-³²P-ATP (New England Biolabs, etwa 7000 Ci/mmol) in 40 μl Reaktionsgemisch, das 70 mM Tris-Puffer (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 1,5 mM Spermidin und 10 mM Dithiothreitol enthielt, 60 Minuten bei 37°C in Kontakt gebracht wurden. Das Gesamtvolumen wurde dann mit 25 mM EDTA auf ein Volumen von 100 μl eingestellt. Nach dem Verfahren von Maniatis et al., vorstehend, S. 466-467, wurde die markierte Sonde über eine 1 ml Bio-Gel-P-4-Dialyse-Säule zum Zentrifugieren (BioRad) aufgereinigt, die mit Tris-EDTA (TE)-Puffer (10 mM Tris-HCl-Puffer, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) äquilibriert worden war. Eine Präzipitation des Produkts mit Trichloressigsäure ergab, daß die spezifische Aktivität von RS18 4,6 μCi/pmol betrug und ihre Endkonzentration 0,114 pmol/μl war.
Fünf Mikroliter der amplifizierten Probe aus Abschnitt I sowie einer Probe, die wie vorstehend beschrieben amplifiziert worden war, außer daß statt des hitzestabilen Enzyms das Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I verwendet worden war, wurden jeweils mit 195 μl 0,4 N NaOH, 25 mM EDTA verdünnt und auf zwei Replika-Filter (Genatran 45-Nylonfilter, Plasco) aufgetropft. Dabei wurden die Filter zuerst mit Wasser befeuchtet und dann in eine Bio-Dot-Vorrichtung zur Dot-Blot-Herstellung (Bio-Rad, Richmond, CA) gegeben, die die Filter fixiert. Dann wurden die Proben aufgetragen und jeder Filter in der Halterung wurde mit 0,4 ml 20 × SSPE (3,6 M NaCl, 200 mM NaH₂PO₄, 20 mM EDTA) gespült, wie von Reed und Mann, vorstehend, offenbart. Danach wurden die Filter entfernt, in 20 × SSPE gespült und 30 Minuten bei 80°C in einem Vakuumofen mit Hitze behandelt.
Nach der Hitzebehandlung wurde jeder Filter mit 6 ml Hybridisierungslösung in Kontakt gebracht, die aus 5 × SSPE, 5 × Denhardt-Lösung (1 x = 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Ficoll, 0,02% Rinder-Serumalbumin, 0,2 mM Tris, 0,2 mM EDTA, pH 8,0) sowie 0,5% SDS bestand, und 60 Minuten bei 55°C inkubiert. Danach wurden der Hybridisierungslösung 5 μl RS18-Sonde zugesetzt und die Filter 60 Minuten bei 55°C inkubiert.
Zum Schluß wurde jeder hybridisierte Filter zweimal mit 100 ml 2 × SSPE und 0,1% SDS 10 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Dann wurden die Filter erneut zweimal mit 100 ml 5 × SSPE, 0,1% SDS bei 60°C behandelt, und zwar 1) eine Minute lang bzw. 2) drei Minuten lang.
Jeder Filter wurde danach einer Autoradiographie unterzogen, wobei die Signale ohne weiteres nach 90 Minuten sichtbar waren.
Zur Agarosegel-Analyse wurden 5 μl jeder Amplifikationsreaktion auf ein Gel aus 4% NuSieve/0,5% Agarose in 1 × TBE-Puffer (0,089 M Tris, 0,089 M Borsäure und 2 mM EDTA) aufgetragen. Bei 100V wurde eine 60-minütige Elektrophorese durchgeführt. Nach Anfärben mit Ethidiumbromid wurde DNA mittels UV-Fluoreszenz sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse zeigen, daß die in Beispiel I und in diesem Beispiel verwendeten Geräte gleichermaßen wirksam bei der DNA-Amplifikation waren, wobei sowohl diskrete, deutlich ausgeprägte, 110 bp große Banden gleich hoher Intensität, die der gewünschten Sequenz entsprachen, als auch einige andere diskrete Banden viel geringerer Intensität zu sehen waren. Im Gegensatz dazu wurde mit dem Amplifikationsverfahren, bei dem das Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase verwendet wurde und bei dem nach jedem Zyklus eine Zuführung von Reagenzien erfolgte, ein DNA-Schmier erhalten, der aus einer unspezifischen Amplifikation vieler nichtverwandter DNA-Sequenzen resultierte.
Es läßt sich erwarten, daß bei der Auswertung der HLA-DQ, DR- und DP-Bereiche ähnliche Verbesserungen in der Amplifikation und im Nachweis erreicht werden können.
Wenn bei den vorstehenden Experimenten der Amplifikations-Reaktionspuffer 2 mM MgCl₂ statt 10 mM MgCl₂ und jeweils 150-200 μM jedes einzelnen Nucleotids statt jeweils 1,5 mM enthält und wenn während der Amplifikation die niedrige Temperatur von 37°C auf 45°C-58°C angehoben wird, kann eine bessere Spezifität und Effizienz der Amplifikation erreicht werden.
Es hat sich auch herausgestellt, daß DMSO zur Amplifikation weder notwendig noch vorzuziehen ist.
BEISPIEL III
Amplifikation und Clonierung
Zur Amplifikation eines 119 Basenpaar-Fragments des menschlichen beta-Globin-Gens wurden jeweils insgesamt 1 Mikrogramm menschlicher genomischer DNA, die entweder aus der Zellinie Molt 4 oder aus der Zellinie GM2064 (die eine homozygote Deletion des beta- und delta-Hämoglobin-Bereichs enthält und von der Human Genetic Mutant Cell Depository, Camden, NJ, erhältlich ist) isoliert worden war, wie vorstehend beschrieben in 100 μl Reaktionsgemisch amplifiziert, das 50 mM KCl, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 200 μg/ml Gelatine, 5 mM 2-Mercaptoethanol, jeweils 1,5 mM dATP, dCTP, TTP und dGTP sowie jeweils 1 μM der folgenden Primer enthielt:
5'-CTTCTGcagCAACTGTGTTCACTAGC-3' (GH18)
5'-CACaAgCTTCATCCACGTTCACC-3' (GH19)
wobei Kleinbuchstaben fehlende Übereinstimmung zur Wildtyp-Sequenz bedeuten, die zur Erzeugung von Restriktionsstellen dienen. GH18 ist ein Oligonucleotid mit 26 Basen, das zum negativen Strang komplementär ist und eine interne PstI-Restriktionsstelle enthält. GH19 ist ein Oligonucleotid mit 29 Basen, das zum Plus-Strang komplementär ist und eine interne HindIII-Erkennungsstelle enthält. Die Primer wurden ausgewählt, indem zuerst die Genbereiche auf Homologie zu PstI- und HindIII-Restriktionsstellen untersucht wurden. Die Primer wurden dann wie in Beispiel I beschrieben hergestellt.
Die vorstehenden Reaktionsgemische wurden 10 Minuten bei 95°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Jedem Reaktionsgemisch wurden insgesamt 4 μl der in Beispiel I beschriebenen Polymerase zugesetzt. Danach wurde jedes Gemisch mit Mineralöl überschichtet. Die Reaktionsgemische wurden 30 Amplifikationszyklen mit dem folgenden Programm unterworfen:
2,5 min Erhitzen von 37°C auf 98°C
3 min Abkühlen von 98°C auf 37°C
2 min Halten von 37°C.
Nach dem letzten Zyklus wurden die Reaktionsgemische zur Beendigung der letzten Verlängerung 20 Minuten bei 65°C inkubiert. Das Mineralöl wurde mit Chloroform extrahiert und die Gemische wurden bei –20°C aufbewahrt.
Zusammen mit 0,5 μg DNA des Clonierungsvektors M13mp10, der von Boehringer-Mannheim allgemein erhältlich ist, wurden insgesamt 10 μl amplifiziertes Produkt 90 Minuten bei 37°C in 50 μl Reaktionsgemisch gespalten, das 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 20 Einheiten PstI und 26 Einheiten HindIII enthielt. Die Reaktion wurde durch Einfrieren bei –20°C beendet. Das Volumen wurde mit TE-Puffer auf 110 μl eingestellt und auf eine 1 ml-BioGel P-4-Dialysesäule zum Zentrifugieren aufgetragen (100 μl). Es wurde eine 0,1 ml-Fraktion gesammelt und mit Ethanol präzipitiert.
(An dieser Stelle wurde bemerkt, daß in der GM2064-Probe ein Amplifikationsprodukt des beta-Globin-Gens enthalten war. Durch nachfolgende Experimente wurde festgestellt, daß die Primer, entweder GH18 oder GH19, der Ursprung der Verunreinigung sind. Da für die Primer keine andere Quelle verfügbar war, wurde das Experiment unter der Voraussetzung fortgesetzt, daß einige clonierte Sequenzen aus der DNA-Verunreinigung in den Primern abstammen können.)
Das Ethanolpräzipitat wurde in 15 μl Wasser resuspendiert und dann auf ein Volumen von 20 μl eingestellt. Das erhaltene Reaktionsgemisch enthielt 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 0, 5 mM ATP, 10 mM Dithiothreitol und 400 Einheiten Ligase. Das Gemisch wurde drei Stunden bei 16°C inkubiert.
Kompetente Zellen des E. coli-Stamms JM103, der von BRL, Bethesda, MD allgemein erhältlich ist, wurden mit zehn Mikroliter Molt 4-DNA enthaltendem Ligierungsgemisch transformiert. Bei der Transformation des Stammes wurde nach dem von Messing, J., Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA, Herausgeber A. Walton, (1981), 143-163, Elsevier, Amsterdam, beschriebenen Verfahren gearbeitet. Insgesamt wurden 651 farblose Plaques erhalten (und keine blauen Plaques). Davon besaßen 119 eine Insertion des (+)-Stranges (18%) und 19 eine Insertion des (–)-Stranges (3%). Das stellt eine fast 20fache Steigerung gegenüber dem Prozentsatz von beta-Globin-positiven Plaques unter den Primer-positiven Plaques dar, der mit dem Amplifikationsverfahren unter Verwendung des Klenow-Fragments der E. coli- Polymerase I erzielt wurde. Bei diesem Verfahren wurde die Reaktion zwei Minuten bei 25°C durchgeführt und danach wurden die einzelnen Schritte, d.h. zweiminütiges Erhitzen auf 100°C, Abkühlen, Zugabe des Klenow-Fragments und Reaktion, neunmal wiederholt. Diese Ergebnisse zeigen die verbesserte Spezifität des Amplifikationsverfahrens durch Verwendung des vorliegenden hitzestabilen Enzyms.
In einem späteren Clonierungsexperiment mit GM2064 und den verunreinigten Primern besaßen 43 von 510 farblosen Plaques (8%) eine Insertion des (+)-Stranges. Das zeigt, daß etwa die Hälfte der 119 Clone, die von Molt 4-DNA erhalten worden waren, die kontaminierende Sequenz enthalten.
Zehn der den (+)-Strang enthaltenden Clone, die von Molt 4-DNA erhalten worden waren, wurden sequenziert. Fünf Clone wiesen die normale Wildtyp-Sequenz auf und fünf Clone hatten eine Einzelbasenmutation an der dritten Position des zweiten Codons im Gen, die zu einem Austausch von C durch T führte (CAC durch CAT ersetzt). Aus dem Experiment mit GM20b4-DNA wurden vier die Sequenz der Verunreinigung enthaltende Clone sequenziert, wobei alle vier die normale Sequenz enthielten.
Modifizierte Primer, die Restriktionsstellen enthalten, können unter Verwendung des vorstehenden Verfahrens auch zur Amplifikation, Clonierung und teilweisen Sequenzierung des menschlichen N-ras-Oncogens sowie zur Clonierung von Sequenzabschnitten der HLA-DQ alpha-, DQ-beta- und DR-beta-Gene genutzt werden.
Die Spezifität und Effizienz der Amplifikationsumsetzung können wiederum erhöht werden, wenn die Konzentrationen von MgCl₂ und der Nucleotide auf 2 mM bzw. 150-200 μM verringert werden und die tiefste Temperatur des Zyklus von 37°C auf 45°C – 58°C erhöht wird.
BEISPIEL IV
Gen-Gewinnung
A. IDENTIFIZIERUNG EINER SONDE FÜR DIE DNA-SEQUENZ DES TAQ-POLYMERASE-GENS
Eine für die DNA-Sequenz des Taq-Polymerase-Gens spezifische Sonde wurde nach einem immunologischen Screening einer lambda gt11-Expressionsgenbank erhalten. T. aquaticus-DNA wurde mit AluI vollständig gespalten, mit EcoRI-Restriktionsstellen enthaltenden, 12-mer Linkern (CCGGAATTCCGG, New England Biolabs) ligiert, mit EcoRI gespalten und mit dephosphorylierter lambda gt11-DNA (Promega Biotech) ligiert, die mit EcoRI-gespalten worden war. Die ligierte DNA wurde verpackt (Gigapack Plus, Stratagene) und in den E. coli K12-Stamm Y1090 transfiziert (von R. Young zur Verfügung gestellt).
Die ursprüngliche Genbank aus 2 × 10⁵ Plaques wurde mit einem 1:2000 verdünnten polyclonalen Kaninchen-Antiserum gegen gereinigte Taq-Polymerase abgesucht (vgl. Beispiele I und XIII) (Young, R.A. und Davis, R. W., Science, 222 (1983), 778-782). Zur Verwendung vorgesehene Plaques wurden bei einer Grenzverdünnung erneut ausplattiert und abgesucht, bis sie in homogener Form vorlagen (∼3 Wiederholungen). Aus solchen Plaques, die mit Prä-Immunserum nicht reagierten, wurden Phagen isoliert und mit Immunserum zur Reaktion gebracht.
Mit den zur Verwendung vorgesehenen Phagen wurde der E. coli K12-Stamm Y1089 (von R. Young zur Verfügung gestellt) lysogenisiert. Die Lysogene wurden auf Produktion eines durch IPTG induzierbaren Fusionsproteins (größer als beta-Galactosidase) untersucht, das mit dem gegen die Taq-Polymerase gerichteten Antiserum reagierte. An einem Festträger immobilisierte und entsprechend der Größe fraktionierte Fusionsproteine wurden zur Affinitätsreinigung epitopspezifischer Antikörper aus dem polyclonalen Gesamt-Antiserum verwendet (Goldstein, L. S. B. et al., J. Cell Biol., 102 (1986), 2076-2087).
Die "herausgefischten", epitopselektierten Antikörper wurden ihrerseits in einer Western-Blot-Analyse verwendet, um lambda gt11-Phagen zu identifizieren, die eindeutig Taq-Polymerase-spezifische DNA-Sequenzen codieren. Aus dem gegen die Taq-Polymerase gerichteten polyclonalen Gesamt- Kaninchen-Antiserum konnten mit einem als lambda gt11:1 bezeichneten lambda gt11-Phagen Antikörper spezifisch selektiert werden, die sowohl mit gereinigter Taq-Polymerase als auch mit Taq-Polymerase enthaltenden Rohextrakt-Fraktionen eindeutig reagierten. Der Phage lambda gt11:1 wurde weiter untersucht.
Zur Erzeugung einer Taq-Polymerase-spezifischen Sonde wurde das mit EcoRI-Linkern versehene, ∼115 bp große AluI-Fragment aus Thermus aquaticus-DNA markiert (Maniatis et al., vorstehend). Die Sonde wurde bei Southern-Blot-Analysen und zum Screening einer Zufalls-Genbank aus genomischer T. aquaticus-DNA verwendet.
B. KONSTRUKTION UND SCREENING EINER GENOMISCHEN ZUFALLS-GENBANK VON THERMUS AQUATICUS
Die kohäsiven Enden des lambda-Phagen Charon 35 (Wilhelmine, A. M. et al., vorstehend) wurden aneinandergelagert und ligiert. Danach wurde der Phage mit BamHI vollstänig gespalten. Die aneinandergelagerten Arme wurden von den "Stuffer"-Fragmenten durch Kaliumacetat-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation getrennt (Maniatis et al., vorstehend). T. aquaticus-DNA wurde mit Sau3A partiell gespalten. Durch Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation wurde eine Fraktion mit 15 – 20 kb großen Fragmenten aufgereinigt. Durch Ligierung von Zielfragmenten und Vektor-DNA-Fragmenten bei einem Molverhältnis von 1:1 wurde eine genomische Zufalls-Genbank konstruiert. Die DNA wurde verpackt und in die E. coli K12-Stämme LE392 oder K802 transfiziert. Eine Genbank mit ursprünglich > 20 000 Phagen, wobei > 99% rekombinante DNA enthielten, wurde im E. coli K12-Stamm LE392 amplifiziert.
Die CH35-Phagen-Genbank mit genomischer Taq-DNA wurde mit der radioaktiv markierten EcoRI-Insertion des Phagen gt11:1 abgesucht (Maniatis et al., vorstehend). Spezifisch hybridisierende Phagenplaques wurden gereinigt und weiter untersucht. Aus einem als Ch35::4-2 bezeichneten Phagen wurden nach HindIII-Spaltung vier oder mehr T. aquaticus-DNA-Fragmente freigesetzt (∼8,0 kb, 4,5 kb, 0,8 kb, 0,58 kb).
Die vier HindIII-DNA-Fragmente von T. aquaticus wurden jeweils mit dem Plasmid BSM13+ (3,2 kb, Vector Cloning Systems, San Diego), das vorher mit HindIII-gespalten worden war, ligiert und nach Transformation des E. coli K12-Stammes DG98 jeweils cloniert.
Aus dem Plasmid pFC82 (11,2 kb) wurde das ∼8,0 kb große HindIII-DNA-Fragment von Ch35::4-2 isoliert, während das 4,5 große HindIII-DNA-Fragment von Ch35::4-2 aus dem Plasmid pFC83 (7,7 kb) isoliert wurde.
Es konnte gezeigt werden, daß der pFC82 enthaltende E. coli-Stamm DG98 bei hoher Temperatur eine hitzestabile DNA-Polymerase-Aktivität enthält (Tabelle 1). Außerdem synthetisieren diese Zellen ein neues Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ∼60 kd, das mit der Taq-DNA-Polymerase immunologisch verwandt ist.
Der die Taq-Polymerase codierende Bereich des 8,0 kb großen HindIII-DNA-Fragments wurde in der Nähe des lac-Promotors im 2,68 kb großen HindIII-Asp718-Bereich des 8,0 kb großen HindIII-Fragments lokalisiert. Dieser Bereich wurde subcloniert, wobei das Plasmid pFC85 erhalten wurde (6,0 kb). Nach Induktion mit IPTG synthetisierten E. coli DG98-Zellen, die das Plasmid pFC85 enthielten, bis zu 100mal mehr mit der Taq-Polymerase verwandte, hitzestabile Aktivität als der Ausgangs-Elternclon (pFC82/DG98) (Tabelle 1). Obwohl pFC85 enthaltende Zellen eine signifikante Menge einer aktiven hitzestabilen DNA-Polymerase synthetisieren, wird nur ein Teil der Taq-pol-DNA-Sequenz translatiert, wodurch es zu einer Anreicherung eines ∼60 kd großen, mit der Taq-Polymerase verwandten Polypeptids kommt. TABELLE 1 Expression einer aktiven hitzestabilen DNA-Polymerase in E. coli^#

# Die Zellen wurden bis zur späten logarithmischen Phase gezüchtet (+/– IPTG, 10 mM), geerntet, mit Ultraschall behandelt, 20 Minuten bei 75°C erhitzt, zentrifugiert und der gereinigte Überstand wurde bei 70°C auf DNA-Polymerase hin untersucht.
* 1 Einheit = 1 nM dCTP wird in 30 Minuten eingebaut.

BEISPIEL V
Expression der Taq-Polymerase
Das erfindungsgemäße Gen kann mit Hilfe vieler bakterieller Expressionsvektoren exprimiert werden, z.B. mit den Vektoren DG141 (ATCC 39588) und pP_LN_RBSATG, die im US-Patent 4,711,845 offenbart sind. Der Inhalt des Patents ist durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen. Diese beiden Wirtsvektoren sind pBR322-Abkömmlinge, die entweder eine Sequenz besitzen, die den Promotor-Operator-Bereich und die Ribosomenbindungsstelle des Tryptophan-Gens in funktioneller Verbindung mit dem ATG-Startcodon enthält (DG141), oder eine Sequenz, die den lambda-P_L-Promotor und die Ribosomenbindungsstelle des N-Gens in funktioneller Verbindung mit dem ATG-Startcodon enthält (pP_LN_RBSATG). Beide Wirtsvektoren können mit SacI gespalten und mit Hilfe des Klenow-Fragments oder der S1-Nuclease mit glatten Enden versehen werden, um eine zweckmäßige Restriktionsstelle zur späteren Insertion des Taq-Polymerase-Gens zu konstruieren.
Aus den in den Plasmiden pFC83 und pFC85 subclonierten DNA-Insertionsfragmenten wurde ein Taq-Polymerase-Gen voller Länge wie folgt konstruiert. Der Vektor BSM13+ (im Handel von Vector Cloning Systems, San Diego, CA, erhältlich) wurde an der nur einmal vorhandenen HindIII-Restriktionsstelle gespalten, mit Klenow-Fragment und dNTPs aufgefüllt, mit T4-DNA-Ligase an den BglII-Octadesoxyribonucleotid-Linker 5'-CAGATCTG-3' (New England Biolabs) ligiert und in den E. coli-Stamm DG98 transformiert. Aus Amp^R lacZalpha⁺- Transformanten wurden Plasmide isoliert. Einer der Clone wurde mit den Restriktionsenzymen BglII und Asp718 gespalten. Das erhaltene große Vektorfragment wurde mittels Gelelektrophorese gereinigt.
Im nächsten Schritt wurde das Plasmid pFC83 mit BglII und HindIII gespalten, danach wurde das ∼730 Basenpaare große Fragment isoliert. Das Plasmid pFC85 wurde mit HindIII und Asp718 gespalten. Das ∼2,68 kb große Fragment wurde isoliert und mit dem ∼730 Basenpaar großen BglII-HindIII-Fragment von pFC83 und dem BglII-Asp718-Vektorfragment von BSM13+ in einer Drei-Fragmente-Ligierung verknüpft. Mit dem Ligierungsgemisch wurde der E. coli-Stamm DG98 (ATCC 39,768, am 13. Juli 1984 hinterlegt) transformiert. Von den Transformanten wurden Amp^R-Kolonien selektiert und daraus ein ∼6,75 Kilobasen großes Plasmid isoliert (pLSG1). Mit Isopropyl-beta-D-thiogalactosid (IPTG) induzierte DG98-Zellen, die pLSG1 enthielten, synthetisierten eine Taq-DNA-Polymerase, deren Größe vom nativen, aus T. aquaticus isolierten Enzym nicht zu unterscheiden war.
Es wurde eine Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese (vgl. Zoller und Smith, Nuc. Acids Res., 10 (1982), 6487-6500) durchgeführt, um gleichzeitig 1) eine SphI-Restriktionsstelle in die Codons 3 bis 5 der Sequenz des Taq-Polymerase-Gens (vgl. 1, Nucleotide 8-13) einzuführen, 2) den A/T-Gehalt von vier der ersten sieben Codons zu erhöhen, ohne die codierten Aminosäuren (in den Codons 2-7 in 1) zu verändern, und 3) 170 Nucleotide der lacZ-DNA und T. aquaticus-DNA zu entfernen, die sich in 5'-Position zum Startcodon des DNA-Polymerase-Gens befinden.
pLSGl/DG98-Zellen wurden mit dem Bakteriophagen R408 (Russel, M. et al., Gene, 45 (1986), 333-338) infiziert. Der Phage wurde zur Steuerung der Synthese der einzelsträngigen (ss) DNA-Form (plus-Strang) von pLSG1 verwendet. Gereinigte pLSG1-ssDNA wurde mit gereinigten BglII-Vektorfragmenten von BSM13+, die mit PvuII gespalten worden waren, und dem mutagenen 47-mer Oligonucleotid DG26 (5'-CCCTTGGGCTCAAAAAGTGGAAGCATGCCTCTCATAGCTGTT'T CCTG-3') zusammengelagert. Nach Verlängerung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli, Transformation von DG98-Zellen und Selektion von Amp^R-Transformanten wurden die Zellen mit DG26 abgesucht, das am 5'-Ende ³²P-markiert worden war. Hybridisierende Kolonien wurden auf den Verlust der BglII-Restriktionsstelle, die Deletion von etwa 170 Basenpaaren der lacZ:T. aquaticus-DNA und die Einführung einer nur einmal vorhandenen SphI-Restriktionsstelle untersucht. Eine als pLSG2 bezeichnete Kolonie wurde sequenziert. Es zeigte sich, daß sie die gewünschte Sequenz enthielt.
pLSG1-Sequenz:
pLSG2-Sequenz:
Zur Einführung einer einzigen BglII-Restriktionsstelle in das Plasmid pLSG2 direkt im Anschluß an das TGA-Stoppcodon des Taq-Polymerase-Gens (im Anschluß an das Nucleotid 2499 in 1) wurde eine Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese durchgeführt. Wie vorstehend wurde der Bakteriophage R408 zur Erzeugung der einzelsträngigen (plus)-Form des Plasmids pLSG2 verwendet. Gereinigte pLSG2-ssDNA wurde an das gereinigte BglII-Vektorfragment von BSM13+, das mit PvuII gespalten worden war, und das mutagene 29-mer Oligonucleotid SC107 (5'-GCATGGGGTGGTAGATCTCACTCCTTGGC-3') angelagert. Nach Verlängerung durch das Klenow-Fragment (jeweils 50 mM jeden dNTPs), Transformation von DG98-Zellen und Selektion von Amp^R-Transformanten wurden die Kolonien mit SC107 abgesucht, das am 5'-Ende ³²P-markiert worden war. Hybridisierende Kolonien wurden daraufhin untersucht, ob sie eine nur einmal vorhandene BglII-Restriktionsstelle erworben hatten.
Eine als pSYC1578 bezeichnete Kolonie wurde sequenziert. Es zeigte sich, daß sie die gewünschte Sequenz enthielt.
pLSG2-Sequenz:

... GCC AAG GAG TGA TAC CAC CCC ATG C ...

SYC1578-Sequenz:
BEISPIEL VI
Konstruktion der Expressionsvektoren pDG160 undpDG161
Aus bereits beschriebenen Plasmiden und aus den aus einem synthetischen Oligonucleotid bestehenden doppelsträngigen Linkern DG31 und DG32 wurde ein Col E1 cop^ts-Vektor mit dem Amp^R- oder Tet^R-lambdaP_L-Promotor, der Ribosomenbindungsstelle des N-Gens, einem Polylinker und BT cry PRE (BT) (positives retrovirales Regulationselement, das im US-Patent 4,666,848, erteilt am 19. Mai 1987, beschrieben ist) konstruiert. Der doppelsträngige Linker DG31/32 enthält am 5'-Ende ein kohäsives HindIII-Ende. Daran schließen sich SacI-, NcoI-, KpnI/Asp718- und XmaI/SmaI-Erkennungsstellen sowie am 3'-Ende ein kohäsives BamHI-Ende an.
A. Konstruktion des Amp^R-Plasmids pDG160
Das Plasmid pFC54.t, ein im US-Patent 4,666,848, vorstehend, beschriebenes und 5,96 kb großes Plasmid, wurde mit HindIII und BamHI gespalten. Das isolierte Vektorfragment wurde mit einem 5fachen molaren Überschuß des nichtphosphorylierten und hybridisierten doppelsträngigen Linkers DG31/32 ligiert. Nach Ligierung wurde die DNA mit XbaI (zur Inaktivierung des vom Eltern-Vektor IL-2 abstammenden DNA-Fragments) gespalten. Damit wurde der E. coli K12-Stamm DG116 transformiert. Dem Stamm wurde dadurch Ampicillin-Resistenz verliehen. Mittels Restriktionsenzymspaltung wurden die Kolonien auf Verlust der des-ala-ser¹²⁵-IL 2-Mutein-Sequenz und Erhalt der DG31/32-Polylinkersequenz hin untersucht. Die Sequenzierung des Polylinker-Bereichs bei einer als pDG160 bezeichneten Kolonie zeigte, daß diese die Polylinker-DNA-Sequenz enthielt.
B. Konstruktion des Tet^R-Plasmids pDG161
Das Plasmid pAW740CHB (ATCC 67 605), aus dem ein durch Beseitigung der BamHI- und HindIII-Restriktionsstellen modifiziertes Tetracyclin-Resistenzgen stammt und das auf einem Col E1 cop^ts-Vektor den lambda P_L-Promotor, die Ribosomenbindungsstelle des N-Gens sowie cry PRE enthält, wurde vollständig mit HindIII und BamHI gespalten. Mittels Agarosegel-Flektrophorese wurde das 4,19 kb große Vektorfragment isoliert. Das gereinigte DNA-Vektorfragment wurde mit einem 5fachen molaren Überschuß des nichtphosphorylierten, aneinandergelagerten, doppelsträngigen Linkers DG31/32 ligiert. Mit einem Teil der DNA wurde der E. coli K12-Stamm DG116 transformiert. Tet^R-Kolonien wurden auf das Vorhandensein von 4,2 kb großen Plasmiden hin abgesucht. Mit Hilfe von Restriktionsenzymspaltung wurden mehrere Kolonien weiter untersucht. Ihr Polylinkerbereich wurde durch das Sanger-Verfahren sequenziert. Eine der Kolonien mit der gewünschten Sequenz wurde als pDG161 bezeichnet.
BEISPIEL VII
A. Konstruktion eines cop^ts-Expressionsvektors mit dem Amp^R-P_L-Promotor, der Ribosomenbindungsstelle des N-Gens (N_RBS), der Taq-Polymerase (832) und BT cry PRE
Die Plasmide pSYC1578 und pFC54.t wurden verwendet, um die vom Plasmid pSYC1578 codierte mutierte Taq-Polymerase-Sequenz voller Länge (832 Aminosäuren) unter der Kontrolle des lambda P_L-Promotors und der Ribosomenbindungsstelle des N-Gens zu exprimieren. Das Plasmid pSYC1578 wurde mit SphI und BglII gespalten. Das erhaltene, etwa 2,5 kb große Taq-Polymerase-Genfragment wurde durch Agarose-Gelektrophorese und Elektroelution gereinigt. Das Plasmid pFC54.t wurde mit HindIII und BamHI vollständig gespalten. Das Vektorfragment wurde durch Agarose-Gelektrophorese gereinigt. Dann wurden die Oligodesoxyribonucleotide DG27 (5'-AGCTTATGAGAGGCATG-3') und DG28 (5'-CCTCTCATA-3') synthetisiert und aneinandergelagert. Das gereinigte pFC54.t-Fragment (0,085 pmol), das gereinigte Taq-Polymerase-Genfragment (0,25 pmol) und der hybridisierte, nichtphosphorylierte, doppelsträngige Adapter DG27/28 (0,43 pmol) wurden in einem Volumen von 30 μl vereinigt und dann bei 14°C miteinander ligiert. Ein Teil der ligierten DNA wurde zur Inaktivierung der in den Proben vorhandenen DNA-Ligase auf 75°C erhitzt (15 Minuten) und dann zur Linerisierung (Inaktivierung) von IL-2-Mutein enthaltenden Ligierungsprodukten mit XbaI behandelt. Mit der ligierten und gespaltenen DNA (etwa 100 ng) wurde der E. coli K12-Stamm DG116 transformiert. Dem Stamm wurde dadurch Ampicillin-Resistenz verliehen. Amp^R-Kolonien wurden auf das Vorhandensein eines etwa 8 kb großen Plasmids hin abgesucht, das mit HindIII (612 bp + 7410 bp), EcoRI (3250 bp + 4781 bp), SphI (8031 bp), Asp718 (8031 bp), BamHI (8031 bp) und PvuII (4090 bp + 3477 bp + 464 bp) die erwarteten Spaltprodukte ergab. Verschiedene aus positiven Kolonien isolierte Plasmide wurden an der in 5'-Position befindlichen lambda P_L:TaqPol-Verbindungsstelle und der in 3'-Position befindlichen TaqPol:BT-Verbindungsstelle einer DNA-Sequenzanalyse unterworfen. Eine Kolonie wurde mit einem gegen die Taq-Polymerase gerichteten Antikörper auf Synthese eines etwa 90 kd großen immunreaktiven Antigens hin untersucht. Von einer bei 30°C inkubierten Kulturschale wurden Einzelkolonien auf eine Kulturschale übertragen, die zwei Stunden bei 41°C inkubiert wurde. Sowohl von der bei 30°C inkubierten Platte als auch von der bei 41°C inkubierten Platte wurden die Kolonien mit einem Zahnstocher abgekratzt, in SDS-Beladungspuffer gekocht und einer SDS-PAGE unterworfen. Die aufgetrennten Proteine wurden auf Nitrocellulose-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit einem gegen die Taq-Polymerase gerichteten polyclonalen Antikörper in einer Verdünnung von 1:6000 inkubiert und dann mit einem gegen Kaninchen-Antikörper gerichteten Ziegen-HRP-Konjugat entwickelt. Bei allen untersuchten Kolonien wurde ein durch Temperatur induzierbares, etwa 90 kd großes, mit der Taq-Polymerase verwandtes Protein nachgewiesen. Eines der verschiedenen Plasmide, die die Synthese der Taq-Polymerase in E. coli steuerten und die erwartete DNA-Sequenz enthielten, wurde als pLSG5 bezeichnet.
B. Konstruktion eines cop^ts-Expressionsvektors mit dem Tet^R-P_L-Promotor, der Ribosomenbindungsstelle des N-Gens (N_RBS), der Taq-Polymerase (832) und BT cry PRE
Die Plasmide pSYC1578 und pAW740CHB wurden verwendet, um in einem Tet^R-Vektor die vom Plasmid pSYC1578 codierte mutierte Taq-Polymerase-Sequenz voller Länge (832 Aminosäuren) unter der Kontrolle des lambda P_L-Promotors und der Ribosomenbindungsstelle des N-Gens zu exprimieren. Das Plasmid pSYC1578 wurde mit SphI und BglII gespalten. Das erhaltene, etwa 2,5 kb große Fragment mit dem Taq-Polymerase-Gen wurde durch Agarose-Gelektrophorese und Elektroelution gereinigt. Das Plasmid pAW740CHB wurde mit HindIII und BamHI vollständig gespalten. Das erhaltene, etwa 4,19 kb große Vektorfragment wurde durch Agarose-Gelektrophorese und Elektroelution gereinigt. Dann wurden die synthetischen Oligonucleotide DG27 und DG28 (vorstehend beschrieben) miteinander hybridisiert. Das gereinigte pAW740CHB-Vektorfragment (0,12 pmol) wurde mit dem gereinigten Taq-Polymerase-Genfragment (0,24 pmol) und dem hybridisierten, nichtphosphorylierten, doppelsträngigen DG27/28-Adapter (0,24 pmol) in einem Volumen von 30 μl bei 14°C ligiert. Mit einem Teil der ligierten DNA (100 ng) wurde der E. coli K12-Stamm DG116 transformiert. Dem Stamm wurde dadurch Tetracyclin-Resistenz verliehen. Tet^R-Kolonien wurden auf das Vorhandensein eines etwa 6,7 kb großen Plasmids hin abgesucht, das mit HindIII (621 bp + 6074 bp), EcoRI (3445 bp + 3250 bp), Asp718 (6695 bp), SphI (3445 bp + 3250 bp), BamHI (6695 bp) und PvuII (3477 bp + 2754 bp + 464 bp) die erwarteten Spaltprodukte ergab. Verschiedene Plasmide wurden an der in 5'-Position befindlichen lambda P_L:TaqPol-Verbindungsstelle und der in 3'-Position befindlichen TaqPol:BT-Verbindungsstelle einer DNA-Sequenzanalyse unterworfen. In Frage kommende Kolonien wurden auch wie vorstehend beschrieben mit Hilfe des Immun-Blot-Verfahrens an Einzelkolonien auf die temparaturinduzierbare Synthese der Taq-Polymerase untersucht. Eines der Plasmide, das die Synthese der Taq-Polymerase in E. coli steuerte und die erwartete DNA-Sequenz enthielt, wurde als pLSG6 bezeichnet.
BEISPIEL VIII
Konstruktion einer Met4 (Δ3)-Form der Taq-Polymerase mit 829 Aminosäuren
Das vorhergesagte vierte Codon der nativen Taq-Polymerase steuert während der Translation den Einbau eines Methioninrestes (vgl. die vorstehenden 5'-terminalen Sequenzen von pLSG1 und pLSG2). Die Plasmide pSYC1578 und pDG161 wurden verwendet, um eine weitere mutierte Form des Taq-Polymerase-Gens zu gewinnen, die die Synthese eines primären Translationsproduktes mit 829 Aminosäuren codiert. Das Plasmid pSYC1578 wurde mit SphI gespalten. Zur Entfernung des aus vier Basen bestehenden kohäsiven 3'-Endes und zur Erzeugung eines glatten Endes mit der Sequenz CTT (Leucin, 5. Codon) wurde das gespaltene Plasmid mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I in Gegenwart von dGTP behandelt. Nach Inaktivieren der DNA-Polymerase und Konzentrieren der Probe wurde die DNA mit BglII gespalten. Das erhaltene, etwa 2,5 kb große Taq-Polymerase-Genfragment wurde mittels Agarose-Gelektrophorese und Elektroelution gereinigt. Das Plasmid pDG161 wurde mit SacI vollständig gespalten. Zur Entfernung des aus vier Basen bestehenden kohäsiven 3'-Endes und zur Erzeugung eines doppelsträngigen glatten Endes, das mit der Sequenz ATG endet, erfolgte danach eine Behandlung mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I in Gegenwart von dGTP. Nach Inaktivierung der Polymerase wurde die Probe mit BamHI gespalten.
Das gespaltene Plasmid pDG161 (0,146 pmol) und das gereinigte Taq-Polymerase-Fragment (0,295 pmol) wurden in einer Konzentration von 30 μg/ml über Nacht unter Bedingungen ligiert, die zur Ligierung kohäsiver Enden geeignet sind. Die teilweise ligierte DNA-Probe (BamHI/BglII-Enden) wurde auf eine Konzentration von 15 μg/ml verdünnt und fünf Stunden unter zur Ligierung glatter Enden geeigneten Bedingungen ligiert. Die DNA-Ligase wurde inaktiviert (75°C, 10 Minuten). Zur Linearisierung von Ligierungsprodukten, die die Polylinker-Sequenz von pDG161 enthielten, wurde die Probe mit NcoI gespalten. Mit sechzig Nanogramm der ligierten und gespaltenen DNA wurde der E. coli K12-Stamm DG116 transformiert. Dem Stamm wurde dadurch Tetracyclin-Resistenz verliehen. Tet^R-Kolonien wurden auf das Vorhandensein eines etwa 6,7 kb großen Plasmids hin abgesucht, das mit HindIII (612 bp + 6074 bp), EcoRI (3445 bp + 3241 bp) und SphI (6686 bp) die erwarteten Spaltprodukte ergab. Die Kolonien wurden auch wie vorstehend beschrieben mit Hilfe des Immun-Blot-Verfahrens an Einzelkolonien auf die temparaturinduzierbare Synthese eines etwa 90 kd großen, mit der Taq-Polymerase verwandten Polypeptids untersucht. Ein als pLSG7 bezeichnetes Plasmid, das die Synthese des mit Taq-Polymerase verwandten Polypeptids steuerte, wurde an der in 5'-Position befindlichen lambda P_L:Taq-Polymerase-Verbindungsstelle und der in 3'-Position befindlichen Taq-Polymerase:BT-Verbindungsstelle unter Verwendung des Sanger-Verfahrens einer Sequenzanalyse unterworfen. Durch die DNA-Sequenzanalyse an der 5'-Verbindungsstelle wurden die Ergebnisse der Restriktionsenzymanalyse (Verlust einer SphI-Restriktionsstelle sowie Vorhandensein eines 612 bp großen HindIII-Fragments, das etwas kleiner als das 621 bp große HindIII-Fragment in pLSG6 ist) bestätigt und die Bildung eines modifizierten Plasmids gezeigt, das eine aus 829 Aminosäuren bestehende Form der Taq-Polymerase codiert.
BEISPIEL IX
Konstruktion einer Met289 (Δ289)-Form der Taq-Polymerase mit 544 Aminosäuren
Während der Aufreinigung der nativen Taq-Polymerase (Beispiel XIII) wurde eine veränderte Form der Taq-Polymerase gewonnen, die den matrizenabhängigen Einbau der dNTPs bei 70°C katalysierte. Diese veränderte Form der Taq-Polymerase war zu der in Beispiel XIII beschriebenen, etwa 90 kd großen Form immunologisch verwandt, besaß aber ein geringeres Molekulargewicht. Aufgrund seiner Wanderung in einer SDS-PAGE im Vergleich zu BSA und Ovalbumin wurde das relative Molekulargewicht dieser Form mit etwa 61 kd bestimmt. Die veränderte Enzymform ist in sorgfältig hergestellten Rohextrakten von Thermus aquaticus-Zellen nicht vorhanden, wie durch Western-Blot-Analyse nach SDS-PAGE oder in situ-Bestimmung der DNA-Polymerase-Aktivität (Spanos, A. und Hubscher, U., Meth. Enz., 91 (1983), 263-277) nach SDS-PAGE festgestellt wurde. Bei dieser Form scheint es sich um ein proteolytisches Artefakt zu handeln, das während der Bearbeitung der Probe entsteht. Die Proteinform geringeren Molekulargewichts wurde zur Homogenität aufgereinigt und in einer automatischen ABI-Gasphasen-Sequenziervorrichtung einer N-terminalen Sequenzbestimmung unterworfen. Ein Vergleich der erhaltenen N-terminalen Sequenz mit der vorhergesagten Aminosäuresequenz des Taq-Polymerase-Gens (vgl. 1) zeigt, daß die verkürzte Form aus einer proteolytischen Spaltung zwischen glu₂₈₉ und ser₂₉₀ resultierte.
Die Plasmide pFC54.t und pSYC1578 sowie die komplementären synthetischen Oligonucleotide DG29 (5'-AGCTTATGTCTCCAAAAGCT-3') und DG30 (5'-AGCTTTTGGAGACATA-3') wurden verwendet, um eine weitere verkürzte Form des Taq-Polymerase-Gens zu gewinnen, das die Synthese eines primären Translationsprodukts mit 544 Aminosäuren steuert. Das Plasmid pFC54.t wurde mit HindIII und BamHI vollständig gespalten. Das Plasmid pSYC1578 wurde mit BstXI gespalten. Zur Entfernung des aus vier Nucleotiden bestehenden kohäsiven 3'-Endes und zur Erzeugung eines glatten doppelsträngigen Endes, das mit der Sequenz CTG endet und in der Taq-Polymerase-Sequenz den Aminosäurest leu₂₉₄ codiert (vgl. pLSG1, Nucleotid 880), wurde das gespaltene Plasmid mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I in Gegenwart aller vier dNTPs behandelt. Danach wurde die DNA-Probe mit BglII vollständig gespalten. Das erhaltene, etwa 1,6 kb große BstXI (aufgefüllt)/BglII-Genfragment der Taq-Polymerase wurde mittels Agarose-Gelektrophorese und Elektroelution gereinigt. Das gespaltene Plasmid pFC54.t (0,1 pmol) wurde mit dem Taq-Polymerase-Genfragment (0,3 pmol) und dem aneinandergelagerten, nichtphosphorylierten, doppelsträngigen Adapter DG29/DG30 (0,5 pmol) in einer Konzentration von 30 μg/ml über Nacht bei 15°C ligiert, wobei zur Ligierung kohäsiver Enden geeignete Bedingungen verwendet wurden. Die DNA wurde auf etwa 10 Mikrogramm pro ml verdünnt und die Ligierung wurde unter Bedingungen, die zur Ligierung glatter Enden geeignet waren, fortgesetzt. Zur Linearisierung (Inaktivierung) IL-2-Mutein codierender Ligierungsprodukte wurde die ligierte DNA mit XbaI gespalten. Mit 80 Nanogramm der ligierten und gespaltenen DNA wurde der E. coli K12-Stamm DG116 transformiert. Dem Stamm wurde dadurch Ampicillin-Resistenz verliehen. Amp^R-Kolonien wurden auf das Vorhandensein eines etwa 7,17 kb großen Plasmids hin abgesucht, das mit EcoRI (4781 bp + 2386 bp), PstI (4138 bp + 3029 bp), ApaI (7167 bp) und HindIII/PstI (3400 bp + 3029 bp + 738 bp) die erwarteten Spaltprodukte ergab. Diese Plasmide enthaltende E.coli-Kolonien wurden wie vorstehend beschrieben mit Hilfe des Immun-Blot-Verfahrens für Einzelkolonien auf die temparaturinduzierbare Synthese eines etwa 61 kd großen, mit der Taq-Polymerase verwandten Polypeptids untersucht. Die Plasmide wurden außerdem an der in 5'-Position befindlichen lambda P_L-Promotor:Taq-DNA-Verbindungsstelle und der in 3'-Position befindlichen Taq-DNA:BT cry PRE-Verbindungsstelle einer DNA-Sequenzbestimmung unterworfen. Eines der Plasmide, die die gewünschte DNA-Sequenz enthielten und die Synthese des temperaturinduzierbaren, 61 kd großen, mit Taq-Polymerase verwandten Polypeptids steuerten, wurde als pLSG8 bezeichnet.
Ein weiteres verkürztes Taq-Polymerase-Gen, das auf dem ∼2,68 kb großen HindIII-Asp718-Fragment von Plasmid pFC85 enthalten ist, kann beispielsweise unter Verwendung des Plasmids pP_LN_RBSATG exprimiert werden, indem die Amino-terminal gelegene HindIII-Restriktionsstelle des Taq-pol-Gens mit einem ATG-Startcodon funktionell verbunden wird. Das Fusionsprodukt ergibt nach Expression eine verkürzte, ∼70 000 – 72 000 Dalton große Polymerase.
Diese speziifische Konstruktion kann durch Spaltung des Plasmids pFC85 mit HindIII und Behandlung mit dem Klenow-Fragment in Gegenwart von dATP sowie dGTP hergestellt werden. Das erhaltene Fragment wird zur Entfernung einzelsträngiger Verlängerungen weiter mit der Nuclease S1 behandelt. Die erhaltene DNA wird mit Asp718 gespalten und mit dem Klenow-Fragment in Gegenwart aller vier dNTPs behandelt. Das gewonnene Fragment kann unter Verwendung von T4-DNA-Ligase an das dephosphorylierte Plasmid pP_LN_RBSATG ligiert werden, das vorher mit SacI gespalten und zur Konstruktion eines ATG enthaltenden glatten Endes mit dem Klenow-Fragment in Gegenwart von dGTP behandelt worden war. Mit dem Ligierungsgemisch kann dann E. coli DG116 transformiert werden. Transformanten werden auf Taq-Polymerase-Produktion abgesucht. Eine Expression kann durch Western-Immunblot-Analyse und Aktivitätsanalyse bestätigt werden.
BEISPIEL X
Konstruktion eines cop^ts-Expressionsvektors mit dem Amp^R-trp-Promotor/Operator, einer trpL-Ribosomenbindungsstelle, der Taq-Polymerase (832) und BT cry PRE
Die Plasmide pLSG5 und pFC52 wurden verwendet, um den Promotor/Operator des trp-Operons von E. coli zu ersetzen. Das Plasmid pFC52 war die Quelle für den trp-Promotor, cop^ts und Ampicillin-Resistenz. Zur Bereitstellung eines identischen Fragments kann jedoch auch das Plasmid pCS4 verwendet werden, das im US-Patent 4,711,845, vorstehend, beschrieben ist. Die Offenbarung davon ist durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen. Das Plasmid pLSG5 wurde mit SphI vollständig gespalten. SphI wurde inaktiviert (70°C, 10 Minuten) und die gespaltene DNA über Nacht bei 15°C mit einem Überschuß des aneinandergelagerten, nichtphosphorylierten, doppelsträngigen Adapters DG27/28 (vgl. vorstehend) ligiert. Die T4-DNA-Ligase wurde inaktiviert (70°C, 10 Minuten) und danach die DNA vollständig mit MluI gespalten. Die DNA-Probe wurde nacheinander mit Phenol und Ether extrahiert, dann mit Ethanol präzipitiert und schließlich in 10 mM Tris-Chlorid, pH-Wert 8, 1 mM EDTA resuspendiert. Das Plasmid pFC52 (oder pCS4) wurde mit MluI vollständig gespalten und dann wie vorstehend mit Phenol sowie Ether extrahiert und konzentriert. Die DNA-Probe wurde mit HindIII vollständig gespalten. HindIII wurde inaktiviert (75°C, 15 Minuten). Die pLSG5- und pFC52-Proben wurden über Nacht im gleichen molaren Verhältnis bei einer Konzentration von 30 μl/ml ligiert, wobei für kohäsive Enden geeignete Bedingungen verwendet wurden. Die T4-DNA-Ligase wurde inaktiviert (70°C, 10 Minuten). Zur Linearisierung (Inaktivierung) von IL-2 codierenden Ligierungsprodukten (ein unerwünschtes, 1,65 kb großes HindIII/MluI-Fragment aus pFC52) wurde die ligierte DNA mit XbaI gespalten. Mit 30 Nanogramm der ligierten DNA wurde der E. coli K12-Stamm DG116 transformiert, wodurch er gegen Ampicillin resistent wurde. Amp^R-Kolonien wurden auf das Vorhandensein eines etwa 7,78 kb großen Plasmids hin abgesucht, das mit EcoRI (4781 bp + 3002 bp), SphI (7783 bp), HindIII (7162 bp + 621 bp), ClaI ((7783 bp), und ClaI/MluI (3905 bp + 3878 bp) die erwarteten Spaltprodukte ergab. Kolonien, die diese Plasmide enthielten, wurden weiter mit Hilfe des SDS-PAGE-Immunblot-Verfahrens für Einzelkolonien auf Expression eines etwa 90 kd großen, mit der Taq-Polymerase verwandten Proteins untersucht (wie vorstehend). Plasmide aus zwei entsprechenden Kolonien mit den gewünschten Eigenschaften wurden in den E. coli K12-Stamm KB2 (ATCC-Nr. 53075) transformiert.
Mit Hilfe des Western-Immunblot-Verfahren wurde gezeigt, daß bei Tryptophanmangel beide Plasmide in beiden Wirten die Synthese eines etwa 90 kd großen, mit der Taq-Polymerase verwandten Proteins induzierten. Proteine aus vollständigen Zellextrakten wurden durch SDS-PAGE fraktioniert und anschließend mit Comassie-Blau angefärbt. Dadurch wurde gezeigt, daß die Expression der trp-Promotor/Taq-Polymerase-Plasmide im E. coli K12-Stamm KB2 zu einer signifikant höheren Anreicherung der Taq-Polymerase führte als im E. coli K12-Stamm DG116. Eines der Plasmide wurde als pLSG10 bezeichnet.
BEISPIEL XI
Synthese einer aktiven rekombinanten Taq-DNA-Polymerase in E. coli
E. coli K12-Stämme (DG116), die die Plasmide pDG160, pLSG5 oder pLSG6 enthielten, wurden bei 32°C in Bonner-Vogel-Minimalmedium gezüchtet, das 0,5 % Glucose, 10 μg/ml Thiamin, 0,25% (Gew./Vol.) Casamino-Säuren von Difco und je nach Bedarf Ampicillin (100 μg/ml) oder Tetracyclin (10 μg/ml) enthielt. Die Zellen wurden bis zu einer OD₆₀₀ von etwa 0,8 gezüchtet. Zur gleichzeitigen Derepression des lambda P_L-Promotors (Inaktivierung des cI₈₅₇-Repressors) und Erhöhung der Kopienzahl des Col E1 cop_ts-Plasmidvektors wurden die Zellen bei 37°C weitergezüchtet. Nach sechs bis neun Stunden Züchtung bei 37°C wurden Zellaliquots geerntet. Die Zellen wurden zentrifugiert und die Pellets bei –70°C aufbewahrt.
In einer anderen Ausführungsform wurde der E. coli K12-Stamm KB2, der das Plasmid pLSG10 enthielt, acht Stunden bei 32°C in Bonner-Vogel-Minimalmedium, das 0,5 % Glucose, 5 μg/ml Tryptophan, 10 μg/ml Thiamin, 0,25% Casamino-Säuren von Difco und 100 μg/ml Ampicillin enthielt, bis zu einer OD₆₀₀ von 3,0 gezüchtet. Die Zellen wurden wie vorstehend beschrieben geerntet.
Die Zellpellets wurden in einer Konzentration von etwa 62,5 OD₆₀₀/ml (∼150 – 160 μg Gesamtprotein/ml) in 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA, 2,4 mM PMSF und 0,5 μg/ml Leupeptin resuspendiert und danach durch Ultraschallbehandlung lysiert. Aliquots der mit Ultraschall behandelten Extrakte wurden einer SDS-PAGE unterworfen. Eine Analyse erfolgte durch Anfärben mit Coomassie-Blau und einen Western-Immunblot mit einem gegen die Taq-Polymerase gerichteten polyclonalen Kaninchen-Antikörper. Außerdem wurden Teile der Extrakte bei hoher Temperatur (74°C) in einem DNA-Polymerase-Test (vgl.das nachstehende Beispiel XIII) untersucht.
Der Western-Immunblot zeigte in induzierten Stämmen, die die Plasmide pLSG5, 6 und 10 enthielten, eine deutliche Induktion und Synthese eines etwa 94 kd großen, Taq-Polymerase-verwandten Polypeptids. Durch Anfärben von durch SDS-PAGE aufgetrennten Gesamt-Zellproteinen mit Coomassie-Blau wurde gezeigt, daß bei den induzierten Stämmen ein neues vorherrschendes Protein mit einem Molekulargewicht von ∼94 kd vorhanden war. Schließlich bestätigten die bei hohen Temperaturen durchgeführten Aktivitäts-Tests die deutliche Synthese von rekombinanter Taq-DNA-Polymerase in diesen E. coli-Stämmen (vgl. nachstehende Tabelle).

* 1 Einheit = insgesamt 10 nmol Nucleotid werden in 30 Minuten bei 74°C eingebaut

BEISPIEL XII
Aufreinigung der rekombinanten Taq-DNA-Polymerase
Der das Plasmid pLSG5 enthaltende E. coli-Stamm DG116 wurde in einem 10 l-Fermentor gezüchtet. Das Medium bestand aus 10 mM (NH₄)₂SO₄, 25 mM KH₂PO₄, 4 mM Na₃-Citrat, 400 μM FeCl₃, 28 μM ZnCl₂, 34 μM CoCl₂, 33 μM NaMoO₄, 27 μM CaC1₂, 30 μM CuCl₂ und 32 μM H₃BO₃. Das Medium wurde mit 15 mM NaOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und sterilisiert. Die folgenden sterilen Bestandteile wurden zugegeben: 20 mg/ml Thiamin-HCl, 3 mM MgSO₄, 10 g/l Glucose und 12,5 mg/l Ampicillin. Der pH-Wert wurde auf 6,8 eingestellt und unter Verwendung von NH₄ OH bei diesem Wert gehalten. Zur Aufrechterhaltung der Glucosekonzentration und einer Luftsättigung von 40% wurde der Kultur durch automatische Erhöhung der Upm (von 350 auf 1000) und der Luftzufuhr (von 2 l/min auf 5 l/min) Glucose zusammen mit den benötigten Alkali-Ionen zugeführt. Nach Bedarf wurde die Schaumbildung unter Verwendung von Polypropylenglykol kontrolliert.
Der Fermentor wurde mit Zellen beimpft. Die Züchtung erfolgte bis zu einer OD₆₈₀ = 5,0 g (14,25 Stunden). Die Temperatur wurde zur Induktion der Synthese der rekombinanten Taq-Polymerase auf 37°C erhöht und die Züchtung fünf Stunden lang bis zu einer OD₆₈₀ = 16,5 weitergeführt.
Soweit nicht anders angegeben, wurden alle Reinigungsschritte bei 4°C durchgeführt. Zwanzig Gramm (Naßgewicht) eingefrorene induzierte Zellen des das Plasmid pLSG5 enthaltenden E.coli K12-Stamms DG116 wurden in 3 Volumina 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA, 3 mM PMSF und 0,64 μg/ml Leupeptin aufgetaut und dann in einer French-Press-Vorrichtung bei 20 000 psi aufgeschlossen. Das Lysat wurde mit zusätzlichem Puffer auf das 5,5fache Zellvolumen eingestellt und zur Verminderung der Viskosität mit Ultraschall behandelt (4 × 30 Sekunden) (Fraktion I). Das Gesamtzell-Rohlysat wurde auf 0,2 M (NH₄)₂SO₄ (26,43 g/l) eingestellt und 15 Minuten bei 20 000 × g zentrifugiert. Der Überstand (Fraktion II) wurde auf 75°C erhitzt (in einem Wasserbad mit 100°C) und zur Denaturierung der Proteine des E.coli-Wirts 15 Minuten bei 72°C – 75°C gehalten. Durch Schwenken in einem Eiswasserbad wurde die Probe schnell auf 4°C abgekühlt. Nach 20minütigem Halten bei 0°C wurde die Probe zum Sedimentieren der denaturierten Proteine 15 Minuten bei 20 000 × g zentrifugiert. Der Überstand (Fraktion III) wurde mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/Stunde auf eine 6 ml Phenyl-Sepharose-C1-4B-Säule (Pharmacia) aufgetragen, die vorher mit 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA (Puffer A), enthaltend 0,2 M (NH₄)₂SO₄, äquilibriert worden war. Zur Entfernung von Nucleinsäuren und aller Proteine außer der Taq-Polymerase wurde die Säule nacheinander mit 1) dem gleichen Puffer, b) Puffer A und c) 20% Ethylenglykol enthaltendem Puffer gewaschen, wobei jeweils 3-10 Säulenvolumina verwendet wurden. Mit 60 ml eines linearen Gradienten von 0 M – 4 M Harnstoff in 20% Ethylenglykol enthaltendem Puffer A wurde die Taq-Polymerase-Aktivität eluiert. Die aktiven Fraktionen (∼2 M Harnstoff) wurden vereinigt (Fraktion IV) und mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Stunde auf eine 12 ml (1,5 × 6,0 cm)-Heparin-Sepharose CL-6B-Säule (Pharmacia) aufgetragen, die mit 50 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,2% Tween 20 (Puffer B), enthaltend 0,1 M KCl, äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 0,15 M KCl enthaltendem Puffer B gewaschen, wobei 2 Säulenvolumina verwendet wurden. Die Taq-Polymerase wurde mit 120 ml eines linearen Gradienten von 0,15 M – 0,65 M KCl in Puffer B eluiert. Die Taq-Polymerase eluierte bei einer OD₂₈₀ als einzelner Peak. Dieser Aktivitätspeak ergab sich bei ∼0,29 M KCl.
Durch SDS-PAGE und Anfärben mit Coomassie-Blau wurde gezeigt, daß das gereinigte rekombinante Taq-Polymerase-Protein und das gereinigte native Taq-Polymerase-Protein die gleiche Wanderungsgeschwindigkeit besitzen. Die gereinigten Taq-Polymerase-Proteine wandern etwas schneller als die gereinigte Phosphorylase B (Pharmacia), was mit einem aus der DNA-Sequenz (von pLSG5) vorhergesagten Molekulargewicht von 93920 Dalton übereinstimmt.
Die Peak-Aktivitäts-Fraktionen wurden vereinigt. Ein Teil wurde einer N-terminalen Aminosäuresequenz-Bestimmung in einer Gasphasen-Sequenziervorrichtung von Applied Biosystems unterworfen. Im Gegensatz zur nativen Taq-Polymerase, die ein blockiertes Amino-Ende besaß, konnte die gereinigte rekombinante Taq-Polymerase sequenziert werden. Durch die bei den einzelnen Zyklen erhaltenen Ausbeuten wurde gezeigt, daß die Sequenz der rekombinanten Taq-Polymerase mit der Sequenz übereinstimmte, die für den Amino-Terminus der vom Plasmid pLSG5 codierten Taq-Polymerase vorhergesagt worden war.
Mit der vom Plasmid pLSG5 codierten Taq-Polymerase, die wie vorstehend beschrieben aufgereinigt worden war, konnte eine menschliche "Einzelkopie"-Sequenz amplifiziert werden. Bei einer unteren Temperaturgrenze von 55°C, einer Temperatur von 72°C zur Verlängerung, einer oberen Temperaturgrenze von 94°C und einer 2-2,5minütigen Zeitdauer für jeden Zyklus zeigte sich, daß die native Taq-Polymerase und das rekombinante Protein in einer Konzentration von 1-2 Einheiten/100 μl PCR-Gemisch vergleichbare Ausbeuten erbrachten und vergleichbar effizient waren.
BEISPIEL XIII Aufreinigung
Die hitzestabile Polymerase kann direkt aus einer Thermus aquaticus-Kultur, wobei nach dem nachstehend offenbarten Verfahren gearbeitet wird, oder in einer anderen Ausführungsform aus einer Bakterienkultur aufgereinigt werden, die das mit Hilfe rekombinanter Verfahren produzierte Enzym enthält, wobei nur geringfügige Modifikationen bei der Herstellung des Rohextraktes erforderlich sind.
Nach Ernte mittels Zentrifugation wurden 60 Gramm Zellen in 75 ml Puffer resuspendiert, der aus 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, und 1mM EDTA bestand. Die Zellen wurden in einer French-Press-Vorrichtung bei 14 000 – 16 000 PSI lysiert. Danach wurden weitere vier Volumina (300 ml) Tris-EDTA-Puffer zugesetzt. Puffer A wurde zugesetzt (Endkonzentrationen: 5mM beta-Mercaptoethanol sowie jeweils 0,5% NP-40 und Tween 20 (Vol./Vol.)) und die Lösung wurde unter Kühlung gründlich mit Ultraschall behandelt. Die erhaltene homogene Suspension wurde weiter mit Puffer A verdünnt, so daß das Endvolumen das etwa 7,8-fache des ursprünglichen Zellgewichts betrug. Die Suspension wurde als Fraktion I bezeichnet.
Die Aktivität der Polymerase in Fraktion I und später erhaltenen Fraktionen wurde in einem 50 μl-Gemisch bestimmt, das 0,025 M TAPS-HCl, pH-Wert 9,4 (20°C), 0,002 M MgCl₂, 0,05 M KCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol, jeweils 0,2 mM dGTP, dATP und TTP, 0,1 mM dCTP [alpha-³²P, 0,05 Ci/mM], 12,5 μg "aktivierte" Lachs-Sperma-DNA und 0,01 – 0,2 Einheiten Polymerase (in 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM KCl, 1 mg/ml autoklavierter Gelatine, 0,5% NP-40, 0,05% Tween 20 und 1 mM 2-Mercaptoethanol verdünnt) enthielt. Eine Einheit bedeutet, daß 10 nM Produkt in 30 Minuten synthetisiert werden. "Aktivierte" DNA ist ein natives DNA-Präparat nach teilweiser Hydrolyse mit DNase I solange bis 5% der DNA in eine säurelösliche Fraktion überführt sind. Die Reaktion wurde 10 Minuten bei 74°C durchgeführt. Danach wurden bei 0°C 40 μl Reaktionsgemisch in 1,0 ml 50 μg/ml Träger-DNA in 2 mM EDTA überführt. Eine Lösung aus 20% TCA und 2% Natriumpyrophosphat wurde in gleicher Menge (1,0 ml) zugegeben. Nach 15 – 20 Minuten bei 0°C wurden die Proben durch Whatman GF/C-Filterscheiben gefiltert. Das Filtrat wurde zuerst mit einer kalten Lösung aus 5% TCA und 1 % Natriumpyrophosphat und dann mit kaltem 95%-igem Ethanol gründlich gewaschen. Danach wurden die Proben getrocknet und die Radioaktivität bestimmt.
Fraktion I wurde zwei Stunden bei 2°C in einem TI 45-Rotor von Beckman bei 35 000 Upm zentrifugiert. Der gewonnene Überstand wurde als Fraktion II bezeichnet.
Die Taq-Polymerase-Aktivität wurde mit Polymin P (BRL, Gaithersburg, MD) (10% Gew./Vol., auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und autoklaviert) präzipitiert. Zuvor war die für eine 90 – 95%-ige Präzipitation der Aktivität erforderliche kleinste Polymin P-Menge bestimmt worden, wobei es sich herausstellte, daß diese Menge im allgemeinen zwischen 0,25% und 0,3% des Endvolumens liegt.
Unter Rühren bei 0°C wurde Fraktion II eine geeignete Polymin P-Menge langsam über einen Zeitraum von 15 Minuten zugesetzt. Die Lösung wurde 20 Minuten bei 2°C bei 13 000 Upm in einem JA14-Rotor von Beckman zentrifugiert. Der Überstand wurde auf Aktivität hin untersucht. Das Pellet wurde in 1/5 Volumen 0,5 × Puffer A (mit Wasser 1:2 verdünnt) resupendiert. Die Suspension wurde erneut zentrifugiert und das Pellet wurde in 1/4 Volumen Puffer A, der 0,4 M KCl enthielt, resuspendiert. Die Suspension wurde gründlich homogenisiert und über Nacht bei 4°C stehengelassen. Das Homogenat wurde wie vorstehend zentrifugiert. Der gewonnene Überstand wurde als Fraktion III bezeichnet.
Die Proteinfraktion wurde durch "Präzipitation" mit Ammoniumsulfat bei einer Sättigungskonzentration von 75% gewonnen, zentrifugiert (bei 27 000 Upm, SW27-Rotor, 30 Minuten) und die aufschwimmende Schicht wurde in 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 1 mM EDTA, resuspendiert. Diese Schritte wurden wiederholt. Die Proteinsuspension wurde gründlich gegen 80 mM KCl enthaltenden P-Zellpuffer (20 mM KPO₄, pH-Wert 7,5, 0,5 mM EDTA, 5 mM beta-Mercaptoethanol, 5% (Gew./Vol.) Glycerin, jeweils 0,5% (Vol./Vol.) NP-40 und Tween 20) dialysiert.
Das Dialysat wurde in eine Zentrifugenflasche überführt. In die Flasche wurden auch alle Proteine aus den Schläuchen gegeben, die durch Spülen mit 80 mM KCl enthaltendem P-Zellpuffer gewonnen worden waren. Bei 20 000 × g wurde eine Zentrifugation durchgeführt, wobei die Zeitdauer auf 15 Minuten beschränkt wurde. Es wurde der Überstand gewonnen. Alle Pelletreste wurden gewaschen, mit P-Zellpuffer und 80 mM KCl extrahiert und erneut zentrifugiert. Die Überstände wurden vereinigt, wobei Fraktion IV gebildet wurde.
Fraktion IV wurde auf eine 2,2 × 22 cm Phosphocellulose-Säule aufgetragen, die mit 80 mM KCl enthaltendem P-Zellpuffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen (2,5-3 Säulenvolumen) und das Protein wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 80 mM bis 400 mM KCl in P-Zellpuffer eluiert. DNA-Polymerase-Aktivität enthaltende Fraktionen (∼0,18 – 0,20 M KCl) wurden vereinigt und mit einer Amicon-Rührzelle sowie einer YM30-Membran 3-4fach konzentriert. Die Zelle wurde mit P-Zellpuffer ohne KCl gespült und die erhaltene Lösung wurde der konzentrierten Fraktion (Endvolumen auf 0,15 M KCl eingestellt) zugegeben, wobei Fraktion V gebildet wurde.
Fraktion V wurde auf eine 5 ml Heparin-Sepharose-CL-6B-Säule (Pharmacia) aufgetragen, die mit P-Zellpuffer und 0,15 M KCl äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 0,15 M KCl-Puffer (3 – 4 Säulenvolumen) gewaschen. Das Protein wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0,15 bis 0,65 M KCl in P-Zellpuffer eluiert. Zur SDS-PAGE-Analyse wurde eine 1:10 Verdünnung mit einem Verdünnungsmittel ohne Gelatine hergestellt. Zur Verwendung in Enzymtests wurde anschließend eine 1:20 Verdünnung mit einem 1 mg/ml Gelatine enthaltenden Verdünnungsmittel hergestellt. Die Aktivität enthaltenden Fraktionen (die bei ∼0,3 M KCl eluieren) wurden an einer supergeknäulten DNA-Matrize auf spezifische und nichtspezifische Endonucleasen/Topoisomerasen hin untersucht, indem eine Veränderung der Molekulargewichts supergeknäulter Plasmid-DNA nach Inkubation mit einem Überschuß an DNA-Polymerase elektrophoretisch nachgewiesen wurde. Eine Verunreinigung durch Exonucleasen wurde nach Inkubation mit kleinen linearen DNA-Fragmenten nachgewiesen. Es stellte sich heraus, daß die Hauptbande in den Peak-Fraktionen ein Protein von ∼88 – 92 kd war. Die als Fraktion VI bezeichneten vereinigten Hauptbanden besaßen die höchste Polymerase-Aktivität bei einer nur geringen nachweisbaren Endonuclease-Aktivität, wenn sie 30 Minuten bei 55°C mit ∼3 bis 5 Polymerase-Einheiten/600 ng DNA untersucht wurden.
Fraktion VI wurde gegen 10 mM KPO₄, pH-Wert 7,5, 5 mM beta-Mercaptoethanol, 5% Glycerin, 0,2% NP-40 und 0,2% Tween 20 (HA-Puffer) dialysiert. Die dialysierte Probe wurde auf eine 3 ml Hydroxylapatit-Säule aufgetragen. Das Enzym wurde mit einem linearen Gradienten von 10 mM bis 250 mM KPO₄, pH-Wert 7,5, in HA-Puffer eluiert. Die Elution der DNA-Polymerase-Aktivität begann bei 75 mM KPO₄, wobei der Peak bei 100 mM KPO₄ lag. Die aktiven Peak-Fraktionen wurden in einer 1:100 – 1:300 Verdünnung getestet. Wie im vorherigen Chromatographie-Schritt wurde zur SDS-PAGE-Analyse eine 1:10 Verdünnung in einem Verdünnungsmittel ohne Gelatine hergestellt. Nach einem Test bei 55°C mit 5 Polymerase-Einheiten wurden Fraktionen, die keine nennenswerten Verunreinigungen durch Endonucleasen oder DNA-Doppelstrang-spezifische Exonucleasen enthielten, vereinigt und als Fraktion VII bezeichnet.
Fraktion VII wurde bei Raumtemperatur gegen eine auf einen pH-Wert von 5 eingestellte Lösung aus 25 mM Natriumacetat, pH-Wert 5,2, 5% Glycerin, 5 mM beta-Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA, 0,1% NP-40 und 0,1% Tween 20 dialysiert. Die dialysierte Probe wurde auf eine vorher äquilibrierte 2 ml DEAE-Tris-Acryl-M-Säule (LKB) aufgetragen und anschließend mit dem gleichen Puffer gewaschen. Die Fraktionen, die nicht an der Säule haftende Polymerase-Aktivität enthielten, wurden vereinigt und im gleichen Puffer auf 50 mM NaCl eingestellt, wobei Fraktion VIII erhalten wurde.
Fraktion VIII wurde auf eine 2 ml CM-Tris-Acryl-M-Säule (LKB) aufgetragen, die mit dem gleichen Puffer (25 mM Natriumacetat, 50 mM NaCl, 5% Glycerin, 0,1 mM EDTA, 0,1% NP-40 und 0,1% Tween 20) äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 4 – 5 Säulenvolumina des gleichen Puffers gewaschen. Das Enzym wurde mit einem linearen Gradienten von 50 mM bis 400 mM NaCl in Natriumacetat-Puffer eluiert. Der Peak der Polymerase-Aktivität eluierte mit ∼0,15 – 0,20 M NaCl. Die Polymerase-Aktivität wurde in einer 1:300 bis 1:500 Verdünnung getestet, wobei zur SDS-PAGE-Analyse zuerst eine 1:10 Verdünnung in einem Verdünnungsmittel ohne Gelatine erfolgte. Unter Verwendung eines DNA-Polymerase-Testpuffers (25 mM TAPS-HCl, pH 9,4, 2,0 mM MgCl₂ und 50 mM KCl) wurde der Aktivitäts-Peak bei 74°C an supergeknäulten DNA-Matrizen auf spezifische und unspezifische Endonucleasen/Topoisomerasen getestet. Ebenso erfolgten damit an ss-M13-DNA und pBR322-Fragmenten Tests auf Nucleasen. Aktive Fraktionen ohne nachweisbare Nuclease(n) wurden vereinigt und auf einem mit Silber angefärbten SDS-PAGE-Minigel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Ergebnisse zeigten eine einzelne ∼88 – 92 kd-Bande mit einer spezifischen Aktivität von ∼200 000 Einheiten/mg.
Diese spezifische Aktivität liegt um mehr als eine Größenordnung über der Aktivität, die der früher isolierten Taq-Polymerase zugeschrieben wird, und mindestens eine Größenordnung über der Aktivität der E. coli-Polymerase I.
BEISPIEL XIV
Es stellte sich heraus, daß die Taq-Polymerase, die wie vorstehend in Beispiel XIII beschrieben gereinigt wurde, keine Verunreinigungen mit Taq-Endonuclease- und Exonuclease-Aktivitäten enthielt. Die Taq-Polymerase wird außerdem vorzugsweise in einem Aufbewahrungspuffer aufbewahrt, in dem jedes verwendete nichtionische polymere Detergenz in einer Konzentration von etwa 0,1% bis etwa 0,5% (Volumen/Volumen) enthalten ist. Besonders bevorzugt ist ein Aufbewahrungspuffer, der aus 50% (Vol./Vol.) Glycerin, 100 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1 mM Dithiothreitol, 0,5% (Vol./Vol.) NP-40, 0,5% (Vol./Vol.) Tween 20 und 200 μg/ml Gelatine besteht. Der Puffer wird vorzugsweise bei –20°C aufbewahrt.
Die aufbewahrte Taq-Polymerase wurde in einem Puffer verdünnt, der aus 25 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 20 mM KCl, 1 mMbeta-Mercaptoethanol, 0,5% NP-40, 0,5% Tween 20 und 500 μg/ml Gelatine bestand. Dann wurde ein Reaktionspuffer mit einem Endvolumen von 100 μl hergestellt, der 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 0,01% (Gew./Vol.) Gelatine, jeweils 200 μM der einzelnen dNTPs, jeweils 1 μM der Primer, die eine 500 Basenpaar große Zielsequenz auf einer Kontrollmatrize des Bakteriophagen lambda definieren, und 2,0 – 2,5 Einheiten Taq-Polymerase/Test enthielt. Dem Reaktionspuffer wurde Matrizen-DNA zugesetzt und die Probe wurde in ein 0, 5 ml-Polypropylenröhrchen gegeben. Zur Verhinderung von Verdunstung erfolgte eine Überschichtung mit 100 μl schwerem Weißöl.
Eine mindestens 105 fache Amplifikation wurde erzielt, wenn für 1 ng Kontrollmatrize (DNA des Bakteriophagen lambda), in der die Zielsequenz etwa 1% der Ausgangsmasse darstellt, die folgenden Bedingungen verwendet wurden.
Das Matrizengemisch wurde zuerst eine Minute und 30 Sekunden bei 94°C denaturiert, indem das Röhrchen in ein Warmwasserbad gegeben wurde. Dann wurde das Röhrchen zwei Minuten in ein Warmwasserbad mit 37°C gegeben. Danach wurde das Röhrchen drei Minuten in ein Warmwasserbad mit 72°C gegeben und anschließend eine Minute in ein Warmwasserbad mit 94°C. Dieser Zyklus wurde insgesamt 25mal wiederholt. Der Hitzedenaturierungsschritt bei 94°C wurde am Ende des 25. Zyklus weggelassen. Stattdessen wurde der Inkubationsschritt bei 72°C um weitere drei Minuten verlängert. Nach Beendigung des Tests ließ man die Proben auf Raumtemperatur abkühlen und sie wurden dann wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben untersucht.
Die Matrizen können gegebenenfalls mit anderen dNTP-Konzentrationen und einer anderen Taq-Polymerase-Menge amplifiziert werden. Die Größe der Zielsequenz in der DNA-Probe hat außerdem direkte Auswirkungen auf die Mindestzeit, die für eine ordnungsgemäße Verlängerung erforderlich ist (Inkubationsschritt bei 72°C). Zur Erzielung einer maximalen Effizienz sollte für jede einzelne Matrize, die amplifiziert werden soll, eine Optimierung des Temperaturzyklus-Profils erfolgen.
Beispiel XV
Wie vorstehend in Beispiel I beschrieben aufgereinigte Taq-Polymerase wurde unter den gleichen Bedingungen zur Aufbewahrung formuliert, wie im vorherigen Beispiel beschrieben, jedoch ohne nichtionische polymere Detergenzien. Bei Untersuchung auf Aktivität, wie in diesem Beispiel beschrieben, stellte sich heraus, daß das Enzym-Aufbewahrungsgemisch nicht aktiv war. Bei Zugabe von NP-40 und Tween 20 zum Aufbewahrungspuffer wurde die volle Enzymaktivität wieder hergestellt. Das zeigt, daß für die Stabilität des Enzympräparats die Gegenwart der nichtionischen polymeren Detergenzien notwendig ist.
Beispiel XVI
Mehrere Proben menschlicher genomischer DNA in jeweils einer Menge von 1 μg wurden wie in Beispiel II beschrieben 20 – 35 Amplifikationszyklen unterworfen, wobei äquivalente Einheiten des Klenow-Fragments oder der Taq-Polymerase verwendet wurden. Die amplifizierten Proben wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese und Southern-Blot-Hybridisierung untersucht. Die bei diesen Reaktionen verwendeten Primer PCO3 und PCO4 steuern die Synthese eines 110 bp großen Abschnitts des menschlichen beta-globin-Gens. Die mit der Klenow-Polymerase durchgeführten Amplifikationen zeigten den für dieses Enzym typischen DNA-Schmier, der offensichtlich durch unspezifische Anlagerung und Verlängerung der Primer an nichtkomplementären genomischen Sequenzen unter im wesentlichen nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen (1 × Klenow-Puffer bei 37°C) verursacht wird. Trotzdem wurde in allen Gelspuren durch Southern-Blot-Hybridisierung ein 110 bp großes spezifisches beta-Globin-Zielfragment nachgewiesen. Bei den mit Taq-Polymerase durchgeführten Amplifikationen war nach Elektrophorese ein vollkommen anderes Bandenmuster sichtbar, wobei die 110 bp große Zielsequenz als einzelne Hauptbande vorlag. Diese bemerkenswerte Spezifität war ohne Zweifel auf die Temperatur während der Primerverlängerung zurückzuführen.
Obwohl wie bei den Amplifikationen mit dem Klenow-Fragment der Anlagerungsschritt bei 37°C durchgeführt wurde, mußte die Temperatur der durch die Taq-Polymerase katalysierten Reaktionen auf etwa 70°C erhöht werden, bevor das Enzym eine signifikante Aktivität zeigte. Während der Temperaturerhöhung von 37°C auf 70°C trennten sich Primer-Matrizen-Hybride mit wenig übereinstimmenden Sequenzen (die sich bei 37°C gebildet hatten), so daß zum Zeitpunkt, wenn die Reaktion eine enzymaktivierende Temperatur erreicht hatte, nur ein hochkomplementäres Substrat verlängert werden konnte. Diese Spezifität führt auch zu größeren Ausbeuten der Zielsequenz als bei ähnlichen Amplifikationen, die mit dem Klenow-Fragment durchgeführt werden, da die unspezifischen Verlängerungsprodukte wirksam um die Polymerase konkurrieren, wodurch die Menge des 110-mer Fragments verringert wird, das durch das Klenow-Fragment hergestellt werden kann.
BEISPIEL XVII
Es wurde eine Amplifikation mit einer Probe durchgeführt, die 1 μg Molt 4-DNA, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 10 mM MgCl₂, 0,01% Gelatine, jeweils 1 μM der folgenden Primer (zur Amplifikation eines 150 bp großen Bereichs):
5'-CATGCCTCTTTGCACCATTC-3'(RS79) und
5'-TGGTAGCTGGATTGTAGCTG-3'(RS80)
jeweils 1,5 mM der einzelen dNTPs und 5,0 Einheiten Taq-Polymerase pro 100 μl Reaktionsvolumen enthielt. Es wurden drei weitere Proben hergestellt, die 2,5, 1,3 oder 0,6 Einheiten Taq-Polymerase enthielten. Die Amplifikation wurde in dem vorstehend beschriebenen Gerät mit zyklischer Temperaturveränderung durchgeführt, wobei der folgende Zyklus 30mal wiederholt wurde:
1 Minute Temperaturerhöhung von 70°C auf 98°C
1 Minute Halten der Temperatur bei 98°C
1 Minute Temperaturerniedrigung von 98°C auf 35°C, 45°C oder 55°C
1 Minute Halten der Temperatur bei 35°C, 45°C oder 55°C
1 Minute Temperaturerhöhung von 35°C, 45°C oder 55°C auf 70°C
30 Sekunden Halten der Temperatur bei 70°C.
Das beste Verhältnis zwischen Signal und Hintergrund bei einer Anlagerungstemperatur von 35°C wurde im Vergleich zu allen anderen Taq-Polymerase-Konzentrationen mit einer Taq-Enzymverdünnung von 2,5 Einheiten/100 μl erhalten, wie durch Agarose-Gelelektrophorese festgestellt wurde. Das beste Verhältnis zwischen Signal und Hintergrund bei 45°C wurde mit einer Taq-Enzymkonzentration von 5 Einheiten/100 μl erhalten, verglichen mit anderen Konzentrationen. Das beste Verhältnis zwischen Signal und Hintergrund bei 55°C wurde mit einer Taq-Enzymkonzentration von 5 Einheiten/100 μl erhalten, verglichen mit anderen Taq-Polymerase-Konzentrationen und mit der Anlagerung bei 45°C, wobei auch die Ausbeute erhöht wurde. Bei 55°C besitzt die Taq-Polymerase eine höhere Spezifität und führt zu einer höheren Ausbeute.
In einem getrennten Experiment wurde Molt 4-DNA in einer Verdünnungsreihe durch 10fache Verdünnungsschritte mit DNA der Zellinie GM2064 verdünnt, die keine beta- oder delta-Globin-Sequenzen enthält und von der Human Genetic Mutant Cell Depository, Camden, New Jersey, erhältlich ist. Die dadurch erhaltenen verschiedenen Konzentrationen stellen unterschiedliche Kopien pro Zelle dar. Mit diesen Proben wurde bei Anlagerungstemperaturen von 35°C und 55°C so wie in diesem Beispiel beschrieben eine Amplifikation durchgeführt. Mittels Agarose-Gelelektrophorese wurde festgestellt, daß bei 35°C 1 Sequenzkopie pro 50 Zellen nachweisbar ist. Bei 55°C ist 1 Sequenzkopie pro 5000 Zellen nachweisbar (eine 100fache Verbesserung gegenüber der niedrigeren Temperatur). Das zeigt, wie wichtig unter diesen Bedingungen eine erhöhte Anlagerungstemperatur für die Spezifität der Taq-Polymerase ist.
In einem dritten Experiment wurde DNA aus der Zellinie 368H, die HIV-positive DNA enthält und von B. Poiesz, State University of New York, Syracuse, NY, erhältlich ist, in ähnlicher Weise mit DNA aus der Zellinie SC1 (bei der ATCC am 19.März 1985 hinterlegt; eine mit dem Epstein-Barr-Virus transformierte beta-Zellinie, die für das Sichelzellen-Allel homozygot ist und keine HIV-Sequenzen enthält) in unterschiedlichen Konzentrationen, die verschiedene Kopiezahlen pro Zelle darstellen, verdünnt. Eine Amplifikation wurde so wie in diesem Beispiel beschrieben bei Anlagerungstemperaturen von 35°C und 55°C durchgeführt, wobei die Primer SK38 und SK39 verwendet wurden, wodurch ein 115 bp großer Bereich der HIV-Sequenz amplifiziert wird:
5'-ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-3'(SK38) und
5'-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-3'(SK39)
Mittels Agarose-Gelelektrophorese wurde festgestellt, daß bei einer Anlagerungstemperatur von 35°C nur mit der unverdünnten 368H-Frobe ein Nachweis erzielt wurde, während bei 55°C zumindest bei einer 10^–2-Verdünnung ein Nachweis erfolgen konnte, wodurch eine 100fache Verbesserung beim Nachweis erhalten wurde.
Die folgenden Bakteriophagen und Bakterienstämme wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA (ATCC) hinterlegt. Die Hinterlegungen erfolgten gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags über Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den dazugehörigen Verordnungen (Budapester Vertrag).

Claims

DNA-Sequenz, eine hitzestabile DNA-Polymerase codierend, die aus der die Aminosäuresequenz in 1 codierenden Nucleotidsequenz besteht.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die Polymerase eine Aminosäuresequenz besitzt, die (a) der 832 Aminosäuren aufweisenden Sequenz in 1; (b) den Aminosäureresten 4 bis 832 in 1; oder (c) den Aminosäureresten 290 bis 832 in 1 entspricht.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei bis zu einem Drittel der 5'-codierenden Sequenz nicht vorhanden ist.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die von Thermus aquaticus stammt.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die ein N-terminales Methionin codiert.
DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die in fusionierter Form vorliegt und ein die DNA-Polymerase enthaltendes Fusionsprotein codiert.
DNA-Sequenz, die eine hitzestabile DNA-Polymerase codiert, die eine Modifikation der hitzestabilen DNA-Polymerase mit der Aminosäuresequenz ist, auf die sich die Ansprüche 1 bis 6 beziehen, wobei die Modifikation eine Deletion, Addition, Substitution oder eine andere Änderung der Aminosäuren in der Aminosäuresequenz darstellt, mit Ausnahme der DNA-Insertionen der rekombinanten Vektoren CH35:Taq#4-2 (ATCC 40,336), pFC83 (ATCC 67,422), pFC85 (ATCC 67,421) und pLSG1 (zusammengesetzt aus dem ∼ 750 bp BgIII/HindIII-Fragment von pFC83, dem 2,8 kbp HindIII/Asp718-Fragment von pFC85 und dem BgIII/Asp718-Vektorfragment von BSM 13+).
Rekombinanter Vektor, der eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7 enthält, mit Ausnahme der rekombinanten Vektoren CH35:Taq#4-2 (ATCC 40,336), pFC83 (ATCC 67,422), pFC85 (ATCC 67,421) und pLSG1 (zusammengesetzt aus dem 750 bp Bglll/Hindlll-Fragment von pFC83, dem ∼ 2,8 kbp Hind1II/Asp718-Fragment von pFC85 und dem Bglll/Asp718-Vektorfragment von BSM 13+).
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 8, wobei die DNA-Sequenz mit Expressionskontrollsequenzen funktionell verknüpft ist.
Rekombinante Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 8 oder 9 enthält.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 10, die E. coli ist.
Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten hitzestabilen DNA-Polymerase, das die Züchtung einer Wirtszelle nach Anspruch 10 oder 11 und die Isolierung des rekombinanten Enzyms aus dem Medium oder den Zellen beinhaltet.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die rekombinante hitzestabile Polymerase in einem hitzelabilen Wirt hergestellt wird und wobei das das Enzym enthaltende Medium oder das Zelllysat durch Hitze mit Temperaturen im Bereich von 72° bis 75° C behandelt werden.
Verfahren zur Reinigung einer hitzestabilen Polymerase, das die Behandlung eines die hitzestabile Polymerase enthaltenden wässrigen Gemischs mit einem Träger für hydrophobe Wechselwirkungen beinhaltet, unter Bedingungen, die hydrophobe Wechselwirkungen fördern, und die Elution der hitzestabilen Polymerase von dem Träger mit einem Lösungsmittel, das hydrophobe Wechselwirkungen abschwächt, wobei die hitzestabile Polymerase in einer Wirtszelle nach Anspruch 10 oder 11 hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der hydrophobe Träger Phenylsepharose^® ist.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei die hydrophoben Wechselwirkungen durch einen Puffer mit einer Ionenstärke, die 0,05 M NaCl entspricht oder höher ist, bereitgestellt werden, wobei gegebenenfalls die die hydrophobe Wechselwirkung fördernden Bedingungen durch die Verwendung eines Puffers bereitgestellt werden, der 0,2 M oder mehr Ammoniumsulfat enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei das Elutionslösungsmittel einen Gradienten von 0-4 M Harnstoff verwendet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei das wässrige Gemisch zuvor durch Hitzebehandlung des das Enzym enthaltenden Mediums oder des Zelllysats bezüglich thermostabiler Polymeraseaktivität angereichert wurde, wobei die Hitzebehandlung gegebenenfalls bei Temperaturen im Bereich von 72° bis 75° C durchgeführt wird.