Verfahren zur Vermehrung von Nukleinsäuren
Gegenstand der Erfindung sind ein Verfahren zur Herstellung vo Nukleinsäuren, dessen Verwendung in Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren und Reagentien, die zur Anwendung dieses Verfahr geeignet sind.
Der Nachweis von Nukleinsäuren in Proben findet in jüngster Ze immer mehr Anwendung in der molekularbiologischen und genetisc Grundlagenforschung, in der klinischen Diagnostik und der Biotechnologie. Zweck dieses Nachweises ist beispielsweise das Auffinden von Pathogenen in biologischen Proben oder von spezifischen Nukleotidsequenzen in Genomen. Dabei kommt es insbesondere darauf an, auch sehr niedrige Konzentrationen nachweisen zu können. Für solche Anwendungen hat es sich als erforderlich erwiesen, die nachzuweisenden Nukleinsäuren in ei vorgeschalteten Schritt zu vermehren und dann erst nach konventionellen Methoden nachzuweisen.
Ein solches Vorgehen wird in der EP-A-0201184 vorgeschlagen. D zu vermehrende Nukleinsäure wird mit zwei einzelsträngigen Oligonukleotidprimern versetzt, die jeweils zu einem unterschiedlichen Strang der zu vermehrenden Nukleinsäure komplementär sind. Die Primer werden zu jeweils einem komplementären Strang der Nukleinsäure verlängert. Jeder der dadurch gebildeten Doppelstränge ist wieder als zu vermehrende Nukleinsäure einsetzbar, jedoch erst nachdem er in Einzelsträn getrennt wurde. Jeder der beiden komplementären Nukleinsäureeinzelstränge kann nun in den folgenden Zyklen mit neuem Oligonukleotidprimer umgesetzt und analog vermehrt werde Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß große Mengen an
Oligonukleotidprimern eingesetzt werden müssen. Außerdem müssen die gebildeten Nukleinsäuredoppelstränge jedesmal zwischen den eigentlichen Vermehrungsschritten in einem zusätzlichen Reaktionsschritt physikalisch voneinander getrennt werden. Dazu sind entweder erhöhte Temperaturen oder zusätzliche Reagentien erforderlich. Beides ist der Einfachheit der Reaktionsführung nicht zuträglich. Auch in der WO 88/10315 ist ein solches Verfahren beschrieben, welches jedoch die beschriebenen Probleme nicht löst; insbesondere werden auch hier mehr als äquimolare Mengen, bezogen auf die resultierende Nukleinsäuremenge, an Promoter-Oligonukleotid benötigt. Die Verfahren des Standes der Technik haben ferner den Nachteil, daß sie durch die Vielzahl der hintereinandergeschalteten Reaktionsschritte relativ langsam arbeiten.
Es bestand daher ein Bedarf an einem Verfahren zur Vermehrung von Nukleinsäuren, welches schnell, in wenigen Reaktionsschritten ohn Hintereinanderschaltung mehrerer identischer Reaktions-Zyklen, insbesondere Temperaturzyklen, und mit möglichst wenigen, einfachen Reagentien auskommt.
Die Aufgabe der Bereitstellung eines solchen Verfahrens wird durc die vorliegende Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren unter Verwendung einer Nukleinsäure A, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure A mit mindestens zwei Adaptoren, die jeweils eine Nukleotidsequenz aufweisen, welche mi jeweils einem Teil eines Stranges der Nukleinsäure A hybridisierbar ist, und von denen mindestens einer eine für ein Replikationssystem spezifische Nukleotidsequenz enthält, unter Bedingungen umsetzt, bei denen eine zu mindestens einem Teil der Nukleinsäure A im wesentlichen komplementäre Nukleinsäure gebilde wird, die außerdem mindestens einen Adaptor enthält, der eine für ein Replikationssystem spezifische Nukleotidsequenz aufweist, und den so gebildeten Komplex aus Nukleinsäure A und im vorherigen Schritt gebildeter Nukleinsäure unter für eine
Replikationsreaktion geeigneten Bedingungen mit einem oder mehreren Proteinen des Replikationssystems umsetzt, allein oder gemeinsam die Bildung von Nukleinsäuresequenzen katalysieren, welche mindestens die Nukleotidsequenz eines Adaptors, der eine für ein Replikationssystem spezifische Nukleotidsequenz sowie eine Nukleotidsequenz enthält, die entw im wesentlichen homolog oder im wesentlichen komplementär zu mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz der Nukleinsäure A Ein weiterer Gegenstand sind Reagenzien zur Durchführung diese Verfahrens.
Im Folgenden wird als eine zu einer anderen Nukleinsäure im wesentlichen komplementäre Nukleinsäure eine Nukleinsäure bezeichnet, deren Nukleotidsequenz mit einer anderen Nukleotidsequenz hybridisieren kann, obgleich die Basenpaarung einer oder mehreren Nukleotiden nicht der Regel nach Watson un Crick entspricht (mismatch) .
Als eine zu einer anderen Nukleinsäure im wesentlichen homolog Nukleinsäure wird eine Nukleinsäure bezeichnet, deren Nukleotidsequenz sich von der Nukleotidsequenz der anderen Nukleinsäure in einer oder mehreren Nukleotiden unterscheidet, aber dennoch mit einer zu der anderen Nukleinsäure komplementä Nukleotidsequenz hybridisieren kann.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können als Nukleinsäuren A Arten von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Dazu gehören sowohl als auch DNS, beide in Einzel- oder Doppelstrangform, natürlic wie synthetischen Ursprungs. Wenn die Nukleinsäuren in doppelsträngiger Form vorliegen, müssen sie in Einzelstränge überführt werden. Dies kann auf konventionelle Weise geschehen beispielsweise durch Erhitzen oder mit Hilfe geeigneter Reagentien, wozu auch doppelstrangaufwindende Enzyme, wie Helikase, zählen. Enzy atische Strangtrennung kann auch durch Enzyme wie recA in Anwesenheit von ATP oder analoger Enzyme induziert werden. Die Strangtrennung kann verstärkt werden dur Einzelstrang-bindende Enzyme, wie T4 Gen 32-Protein oder E.col
SSB. Die Nukleinsäuren A können auch mit kettenverkürzenden Enzymen, beispielsweise Restriktionsenzymen vorbehandelt sein.
Die Herkunft der Nukleinsäuren spielt keine Rolle. Bevorzugt können Nukleinsäuren in Lösungen, Suspensionen, aber auch fixier an Festkörpern, oder in zellhaltigen Medien, Zellabstrichen, fixierten Zellen bzw. Gewebsschnitten, oder an isolierten Chromosomen vermehrt werden. Besonders bevorzugt ist die Vermehrung von gelösten Nukleinsäuren. Beispiele sind viroide, virale, bakterielle oder zelluläre Nukleinsäuren. Das Medium, in dem die einzelsträngigen Nukleinsäuren vorliegen, wird im Folgenden als Probemedium bezeichnet. Dieses Medium kann neben d Nukleinsäure A auch noch andere Bestandteile, insbesondere Nukleinsäuren, enthalten, die nicht vermehrt werden sollen.
Zur Herstellung von Nukleinsäuren wird das Probemedium mit mindestens zwei Adaptoren versetzt. Bevorzugt ist die Zugabe von zwei Adaptoren pro Nukleinsäurestrang A. Beide Adaptoren müssen mit einem Strang der Nukleinsäure A entweder intern oder an Endsequenzen hybridisierbar sein. Dies ist erfüllt, wenn jeder Adaptor eine Nukleotidsequenz enthält, die im wesentlichen komplementär ist zu einer Nukleotidsequenz des einen Stranges de Nukleinsäure A. Diese Bereiche können überall auf der Nukleinsäu A liegen. Bevorzugt liegt mindestens einer der Bereiche an einem Ende der Nukleinsäure. Besonders bevorzugt liegen beide Bereiche an den Enden der Nukleinsäure A. Als zweckmäßig hat es sich erwiesen, wenn das eine Ende oder die Enden der Nukleinsäure A Nukleotide aufweisen, die zu der einzelsträngigen Sequenz des Adaptors oder der Adaptoren komplementär sind und mit diesen hybridisieren können. Die Adaptoren können sowohl Ribo- als auch Deoxyribonukleotide beinhalten. Bevorzugt enthalten sie Deoxyribonnukleotide. Mindestens zwei der Adaptoren hybridisiere mit demselben Strang der zu vermehrenden Nukleinsäure in voneinander getrennten Bereichen. Diese Hybridisierungsbereiche liegen bevorzugt 1 bis ca. 20000, besonders bevorzugt 100 bis 80 Nukleotide voneinander entfernt und überlappen daher nicht miteinander. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die
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Adaptoren in dem Bereich, in dem sie mit der Nukleinsäure hybridisieren sollen, einzelsträngig vorliegen.
Die Nukleotidsequenz des einzelsträngigen hybridisierenden Bereiches der Adaptoren ist so gewählt, daß freie Enden dieser einzelsträngigen Bereiche nach der Hybridisierung dieser Einzelstrangbereiche mit der Nukleinsäure aufeinander zu zeigen Es ist daher mindestens ein Adaptor mit einem einzelsträngigen Ende und einer mit einem einzelsträngigen 3'-Ende beteiligt. Bevorzugt ist das dem anderen Adaptor zugewandte 3 •-Ende des ei Adaptors ein Hydroxylende, und das dem ersten Adaptor zugewandt 5'-Ende des zweiten Adaptors weist eine Phosphatgruppe auf. And 5•-Enden der Adaptoren können Phosphatgruppen tragen. Andere 3' Enden der Adaptoren, die nicht an der "gap-filling" Reaktion beteiligt sind, können modifiziert sein, z.B. am 3 '-Ende ein 2' ,3 *-Dideoxynukleotid oder andere chemische Modifikationen tragen. Der mit der Nukleinsäure A hybridisierende einzelsträng Bereich der Adaptoren ist bevorzugt jeweils 15 bis 60, besonder bevorzugt 20 bis 40 Nukleotide lang.
Mindestens einer, bevorzugt zwei der Adaptoren weisen außerdem einen Bereich auf, der im wesentlichen nicht mit der zu vermehrenden Nukleinsäure hybridisieren kann. Bevorzugt ist die Bereich doppelsträngig. Dieser Adaptor oder diese zwei Adaptore enthalten in diesem Bereich eine für ein Replikationssystem spezifische Nukleotidsequenz. Der Bereich kann im Fall eines Doppelstrangbereichs beispielsweise durch die Doppelstrangsequ als solche oder ihre Sekundärstruktur gebildet werden. Unter Replikationssystem werden die zur Replikation einer Nukleinsäure erforderlichen Reagenzien verstanden. Dazu gehört insbesondere ein Replikationsenzym, bevorzugt eine DNS-Polymer Solche Replikationssysteme sind beispielsweise aus den Phagen PRD1, 015, M29, Nf, GA-1, Cpl und ,029 sowie Eukaryonten wie Adenoviren bekannt. Bevorzugt ist das Replikationssystem des Phagen 29. Nukleotidsequenzen, die für Replikationssysteme spezifisch sind, sind bevorzugt die "origin of replication" (o Sequenzen. (B. Lewin, Genes III, Verlag John Wiley 1987). Im F
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des Phagen >^29 sind diese bevorzugt 12 bis 59 Nukleotide (nt) lang. Jeder der 029-ori-Bereiche enthält bevorzugt einen 6 Nukleotide langen Doppelstrangbereich.
Bevorzugt weist mindestens einer der Adaptoren in einem Bereich, der bevorzugt nicht der zur Hybridisierung mit der Nukleinsäure vorgesehene einzelsträngige Bereich ist, einen an einen oder beid Nukleotidstränge gebundenen Rest auf. Dieser Rest ist bevorzugt ein Protein oder eine Komponente aus Zellextrakten. Das Protein kann vielfältige Funktionen haben. Als besonders vorteilhaft hat sich eine replikationsinitiierende Funktion herausgestellt. Als besonders zweckmäßig bei Verwendung des Replikationssystems von /0^29 hat sich das Protein p3 des Phagen J2T 29 erwiesen. Die Bindun des Restes an den Adaptor ist bevorzugt kovalent. Im Falle des Proteins p3 hat sich die Bindung mittels einer Reaktion mit dem ö""29-Protein p2 und dATP als geeignet erwiesen. Im Fall von p3 is es nicht unbedingt erforderlich, jedoch bevorzugt, daß ein Adapto schon zu Anfang der Hybridisierungsreaktion des Adaptors und der Nukleinsäure mit p3 kovalent verbunden ist. Die Bindung kann auch erst nach der Hybridisierung erfolgen. Besonders bevorzugt ist de Fall, daß zwei Adaptoren eingesetzt werden, die an den 5'-Enden des ori-spezifischen Bereichs jeweils ein Protein p3 gebunden haben. In diesem Fall ist das erfindungsgemäße Verfahren besonder wirksam. Es ist jedoch beispielsweise auch möglich, einen Adaptor mit einem doppelsträngigen spezifischen Bereich und einen Adaptor mit einem einzelsträngigen Bereich einzusetzen. Die Adaptoren können zusätzliche Sequenzen, insbesondere zwischen hybridisierenden und replikationsenzymspezifischem Bereich aufweisen.
Die Nukleinsäure A wird mit den Adaptoren unter Bedingungen umgesetzt, bei denen die Adaptoren mit den entsprechenden Bereichen eines Stranges der Nukleinsäure A hybridisieren. Das erfindungsgemäße Verfahren sieht dann die Bildung einer Nukleinsäure B vor, die zumindest zum Teil im wesentlichen komplementär zu der Nukleinsäure A ist und mindestens einen Adaptor mit umfaßt, der eine für das Replikationssystem
spezifische Sequenz enthält. Die Länge der Nukleinsäure B ist festgelegt durch die Länge der Adaptoren und die Länge des zwischen den einzelsträngigen Enden der hybridisierten Adaptor liegenden Nukleotidsequenz der zu vermehrenden Nukleinsäure A. Bildung der Nukleinsäure B geschieht bevorzugt in einer sogenannten "gap-filling"-Reaktion. Bedingungen hierfür sind bekannt, beispielsweise aus Maniatis et al. (Molecular Cloning, 1982, Verlag Coldspring Harbour Laboratory) oder Davis et al. (Base Methods in Molecular Biolόgy, 1986, Verlag Elsevier) ,~ Enzyme, die in der "gap-filling"-Reaktion eingesetzt werden, s solche Polymerasen, die in der Lage sind, zwischen 3'- und 5'- Enden von doppelsträngigen Bereichen einen komplementären Stra zu synthetisieren. Je nach Art der Nukleinsäure A handelt es s um RNS-abhängige DNS-Polymerasen, beispielsweise Virus-kodiert Enzyme, wie Reverse Transkriptase, oder DNS-abhängige DNS- Polymerasen wie T7-, T3- oder T4-DNS-Polymerase, Klenow-Enzym Taq-DNS-Polymerase. Besonders bevorzugt sind DNS-Polymerasen, keine Strangtrennungsaktivitäten aufweisen, wie T4-DNS-Polymer oder Klenow-Polymerase. Bevorzugt wird außerdem eine DNS-Ligas beispielsweise E.coli- oder T4-DNS-Ligase, eingesetzt. Falls d Reaktion bei erhöhten Temperaturen durchgeführt werden soll, w bevorzugt eine thermostabile DNS-Ligase, wie aus EP-A-0 373 96 bekannt, eingesetzt.
Ergebnis der "gap-filling"-Reaktion ist die Bildung eines zu d zwischen den Adaptoren liegenden Bereichs der Nukleinsäure A i wesentlichen komplementären Nukleinsäurestranges, der kovalent das einzelsträngige Ende mindestens eines Adaptors, der eine f ein Replikationssystem spezifische Nukleotidsequenz enthält, gebunden ist. Diese neu gebildete Nukleinsäure wird im Folgend Nukleinsäure B genannt.
Bevorzugt ist der Fall, daß in die neu gebildete Nukleinsäure die Nukleotidsequenz zweier Adaptoren eingebaut sind. Dies ist beispielsweise durch den zusätzlichen Einsatz der DNS-Ligase z erreichen.
Wesentlicher Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Umsetzung des gebildeten Komplexes aus Nukleinsäure A und Nukleinsäure B mit einem oder mehreren Proteinen eines Replikationssystems, die unter geeigneten Bedingungen in der Lage sind, über eine in-vitro Replikationsreaktion, die eine enzymatische Strangtrennung beinhaltet, zu Nukleinsäure B oder de zu ihr mindestens teilweise komplementären Nukleinsäuren unter Verwendung geeigneter Kofaktoren und/oder Zellextrakte eine komplementäre Nukleinsäure C bzw. D zu bilden. Bevorzugte Protein sind solche mit DNS-Polymerase-Aktivität. Besonders bevorzugt sin solche Proteine, die dazu ohne erneuten Zusatz von Adaptoren in der Lage sind. Ein solches Enzym ist bei Verwendung von^ö' 29-ori- Sequenzen beispielsweise das .Protein p2 des Phagen # 29 zusammen mit p3 und dATP.
Die Komponenten des Replikationssystems können beispielsweise einzeln, als Gemisch oder in Form eines Extraktes zugegeben werden. Bevorzugt ist die Zugabe gereinigter Komponenten.
Das Enzym bindet dazu an den Erkennungsbereich des Adaptors und bildet unter Mitwirkung von Nukleosidtriphosphaten die komplementäre Nukleinsäure C bzw. D. Ein Protein des Replikationssystems hat die Eigenschaft, eine Strangaufwindung (Strand displacement) durchzuführen. Im Falle von jβ" 29 hat p2 sowohl DNS-Polymerase- als auch Strangaufwindungsaktivitäten. Ein separater Denaturierungsschritt zwischen einzelnen Vermehrungsschritten kann wegen der enzymatischen Strangtrennung während der Vermehrungsreaktion entfallen. Das erfindungsgemäße Verfahren hat so den Vorteil, daß es kontinuierlich und schnell verlaufen kann. Für den Fall, daß zwei Adaptoren verwendet wurden die jeweils eine Erkennungsstelle für das Enzym aufweisen, ist da Verfahren besonders vorteilhaft, da prinzipiell die Bildung der Nukleinsäuren C bzw. D bei beiden Adaptoren beginnen kann. Die Vermehrungsreaktion wird daher stark beschleunigt.
Die Reaktion zur Bildung der Nukleinsäuren C bzw. D aus dem Komplex kann nun mehrmals hintereinander ablaufen, da auch die
frisch gebildeten Nukleinsäuren C bzw. D Komplexe bilden können deren Umsetzung mit dem Enzym ohne separate zwischengeschaltete Reaktionsschritte zu weiteren Nukleinsäuren D und C führt. Im Idealfall wird ein exponentieller Anstieg der Menge an den Nukleinsäuren C und D erreicht. Zur Bildung der Nukleinsäuren C und D werden keine weiteren Adaptoren benötigt. Die gebildeten Nukleinsäuren C bzw. D enthalten insbesondere jeweils mindesten eine Nukleotidsequenz der Adaptoren und mindestens eine Nukleotidsequenz, die im wesentlichen komplementär oder homolog der Nukleinsäure A oder einem Teil davon ist. Die Länge dieser Nukleotidsequenz entspricht der Nukleinsäure A in dem Bereich, zwischen den einzelsträngigen Enden der Adaptoren lag. Bevorzu enthalten die gebildeten Nukleinsäuren B, C und D daher nur ein Teil der Nukleinsäure A.
Wenn die gewünschte Anzahl von Nukleinsäuren C und D gebildet kann die Reaktion beendet werden. Dies geschieht bevorzugt dur Zugabe eines Stoppreagenzes, beispielsweise EDTA. Die zur Herstellung der Nukleinsäuren erforderliche Reaktionszeit wird gegenüber den Verfahren des Standes der Technik durch das erfindungsgemäße Verfahren stark herabgesetzt. Sie hängt wie b den bekannten Verfahren unter anderem von der Länge der gebild Nukleinsäuren ab.
Die Nukleinsäuren C und D bzw. aus ihnen gebildete Komplexe kö Gegenstand weiterer Reaktionen sein. Beispielsweise können aus ihnen gebildete Doppelstränge mit Restriktionsenzymen geschnit werden. In diesem Fall werden bevorzugt Adaptoren eingesetzt, in ihrem doppelsträngigen Bereich eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym aufweisen.
Die Adaptoren können auch eine Sequenz zur Hybridisierung mit universellen Sequenzierungsprimern und/oder M13 universellen reverse Sequenzierungsprimern enthalten.
Die Nukleinsäuren C und D können auch Gegenstand von Reaktionen zur Einführung von radioaktiven oder nicht radioaktiven Markierungen sein, sodaß die Nukleinsäuren C und D leicht nachgewiesen werden können.
Ob die gewünschte Anzahl von Nukleinsäuren C und D gebildet wurde kann durch bekannte Methoden ermittelt werden, beispielsweise durch GelChromatographie.
Prinzipiell können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren neben der Nukleinsäure A auch weitere Nukleinsäuren bzw. Teile davon mit unterschiedlicher Nukleotidsequenz in demselben Probemedium zur Herstellung von Nukleinsäuren verwendet werden. Voraussetzung ist, daß für jeden Nukleinsäureeinzelstrang die entsprechenden Adaptoren vorhanden sind. Wenn die Unterschiede in der Nukleotidsequenz der weiteren Nukleinsäuren derart sind, beispielsweise bei einem Unterschied nur in einer Base im inneren Bereich des zum Adaptor komplementären Bereichs, daß der Adaptor unter den Hybridisierungsbedingungen mit Nukleinsäure A auch mit den weiteren Nukleinsäuren hybridisiert, so sind keine für die weiteren Nukleinsäuren spezifischen Adaptoren erforderlich. War die in der Probe vorliegende Nukleinsäure ursprünglich eine doppelsträngige Nukleinsäure, so können beide Einzelstränge vermehrt werden, wenn sie als Einzelstrang vorliegen. Falls die Nukleotidsequenzen nicht Bereiche mit gleicher Nukleotidsequenz aufweisen, benötigt man dann mindestens vier Adaptoren, die bevorzugt an unterschiedliche, nicht komplementäre Sequenzen binden.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat verschiedene Vorteile: Die Reaktionsequenz kann, beispielsweise bei Verwendung des Replikationssystems des Phagen f 2 , bei einer Temperatur durchgeführt werden; hohe Temperaturen zur Denaturierung sind nicht erforderlich. Die in vitro-Replikation funktioniert mit langen DNS-Fragmenten bis zu 19 kb (mit ^29 DNS) und mindestens
bis zu 7 kb (M13-Genom) mit heterologer DNS. Im Vergleich dazu die Größe der nach EP-A-0201184 amplifizierbaren Sequenzen maxi 3-4 kb.
Die Amplifikationsrate ist theoretisch höher bzw. die Vermehrun der Nukleinsäuren schneller als bei anderen Target- Amplifikationsmethoden. Die Methode ist, da bevorzugt im Bereic zwischen 25°C - 45°C, und besonders bevorzugt 30-37°C durchführbar, zur A plifikation in in situ- ~
Hybridisierungsexperimenten, beispielsweise in Zellabstrichen, fixierten Zellen bzw. Gewebsschnitten, oder an isolierten Chromosomen, anwendbar. Die relativ kurzen Adaptoren diffundier in Gewebe ähnlich gut wie Oligonukleotide.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß der Replikationsschritt wegen der hohen Processivität und Stranddisplacement-Aktivität der Polymerase nicht von der SekundärStruktur des Gesamtkomplexes abhängig ist. Daher ist es möglich, auch lange Nukleinsäuren herzustellen.
Durch Einführung von Restriktionsenzym-Schnittstellen in den Adaptoren zwischen einzelsträngiger Region (spezifisch für Nukleinsäure A) und der für das Replikationssystem spezifischen Region können die entstandenen Produkte z.B. direkt kloniert bz sequenziert werden oder als Probe von den Adaptor-Sequenzen freigeschnitten werden. Dies ist mit den Produkten aus Transskriptions-Amplifikationsverfahren nicht möglich.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäur ist außerordentlich zeitsparend und äußerst empfindlich. Inklu Adaptorhybridisierung, gap-filling und Replikation ergibt sich ein 100-Nukleotide enthaltendes Teilstück der Nukleinsäure A e Zeitbedarf bis zu ca. 1 h mit einer theoretischen Amplifikationsrate von 2^92; Verfahren des Standes der Technik würden hierfür im günstigsten Fall 2-4 h benötigen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann als Eintopfreaktion geführt
werden, bevorzugt über aufeinanderfolgende Zugabe zuerst der Komponenten der gap-filling-Reaktion und dann der Komponenten für die in-vitro Replikation.
Die in der Vermehrungsreaktion entstehenden Nukleinsäuren B, C un D haben bevorzugt die gleiche Länge. Dies ist vorteilhaft, da ein homogene Nukleinsäurepopulation gleichmäßigere Bedingungen für deren Nachweis, beispielsweise bei Hybridisierungen, ermöglicht.
Die Nukleinsäuren B, C und D sind DNS. Dies hat den Vorteil, daß die aus ihnen gebildeten Nukleinsäuren C und D wieder als Templat für Bildung von D und C in der gleichen Reaktion ohne zwischengeschaltete separate Reaktionsschritte benutzt werden können. Dadurch, daß die neu gebildeten Nukleinsäuren B, C und D bereits mindestens eine für das Replikationssystem spezifische Sequenz aufweisen, ist die erneute Zugabe von Adaptoren überflüssig.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Herstellung einer Vielzah von Kopien von Nukleinsäuren A oder Teilen von ihr bzw. dazu komplementären Nukleinsäuren verwendet werden. Dies ist insbesondere in der molekularbiologischen und genetischen Grundlagenforschung, in der klinischen Diagnostik und der Biotechnologie, oder zum Studium von Struktur und Funktionen seltener Gene wichtig.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren A, welches das oben genannte Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren einschließt.
Dazu wird eine Probe, von der vermutet wird, daß sie die nachzuweisende Nukleinsäure enthält, dem oben genannten Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren ausgesetzt, wobei die nachzuweisende Nukleinsäure genauso behandelt wird, wie oben für die Nukleinsäure A beschrieben.
Die Nukleinsäuren B, C und D können dann mit Hilfe von modifizierten oder nicht modifizierten Nukleosidtriphosphaten hergestellt werden. Bevorzugt werden modifizierte Nukleosidtriphosphate eingesetzt. Solche modifizierten Nukleosidtriphosphate sind bekannt. Die Modifikation kann beispielsweise im Ersatz eines oder mehrerer Reste des Nukleosidtriphosphates durch einen radioaktiven, fluoreszierend farbigen, immunreaktiven, biospezifisch bindefähigen oder chemi reaktiven Rest bestehen. Geeignete immunreaktive Reste sind beispielsweise Haptene, wie Digoxigenin oder Sulfonsäurereste, biospezifisch bindefähige Reste sind beispielsweise Vitamine, w Biotin, und ein chemisch reaktiver Rest ist beispielsweise eine zusätzliche Aminogruppe oder Sulfhydrylgruppe, die evtl. über e Brücke an dem Nukleotidtriphosphat angebracht ist. Im Fall des Einsatzes modifizierter Nukleosidtriphosphate wird zum Nachweis der Anwesenheit oder Menge der Nukleinsäure A einfach die Menge oder die Anwesenheit der Nukleinsäuren B, C bzw. D über die eingebaute Modifizierung nach Abtrennung nicht umgesetzter Nukleosidtriphosphate bestimmt. Das Vorgehen über Inkorporierun bereits modifizierter Nukleotide ist besonders vorteilhaft, da dann übliche weitere Hybridisierungsschritte mit markierten Nukleinsäuresonden oder Elongationsreaktionen entfallen können.
Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren, in die modifizierte Nukleotidphosphate eingebaut sind, sind bekannt, im Fall der Haptenmarkierung beispielsweise aus der EP-A-0324468, im Fall Biotinmarkierung aus der DE-A-2915082.
Bevorzugt werden die hybridisierten Nukleinsäuren dazu an Molekularsieben oder Affinitätsmaterialien, die doppelsträngig Nukleinsäuren oder einen Rest der Nukleinsäure, beispielsweise erkennen und binden, von nicht umgesetzten Komponenten getrenn Anschließend wird die Menge an Markierung bestimmt.
Es ist jedoch auch möglich, insbesondere bei Einsatz nicht modifizierter Nukleosidtriphosphate, die gebildeten Nukleinsäuren C bzw. D durch Hybridisierung mit einer wenigstens zum Teil dazu im wesentlichen komplementären modifizierten Nukleinsäure nachzuweisen. Diese Nukleinsäuren können nachweisbar sein oder gemacht werden. Auch solche Verfahren sind bekannt. Beispielhaft beschrieben ist ein solches Verfahren in der US-A-4358535 oder de EP-A-0192168.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren ist wegen des möglichen Einbaus modifizierter Nukleosidtriphosphate auch hervorragend als Verfahren zur Herstellung modifizierter Nukleinsäuren, insbesondere modifizierter DNS geeignet. Solche modifizierten Nukleinsäuren finden als sogenannte Probes in der DNS-Diagnostik Verwendung. Is die Modifizierung eine nachweisbare Gruppe oder eine Gruppe, die in eine nachweisbare Gruppe umgewandelt werden kann, so erhält ma Nukleinsäuren, wie sie als Detektionsprobe beispielsweise in der US-A-4358535 eingesetzt werden. Ist die Modifizierung eine bindefähige Gruppe, beispielsweise eine immunreaktive Gruppe oder Biotin, so erhält man Nukleinsäuren, wie sie in der EP-A-0097373 beschrieben sind. Sie sind als Fangprobe beispielsweise des in de EP-A-0139489 Verfahrens einsetzbar.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren vereinigt die Vorteile des Verfahrens zur Vermehrung von Nukleinsäuren bzw. Teilen davon mit denen der Markierung während der Vermehrung.
Mit diesem Verfahren können sowohl DNS als auch RNS nachgewiesen werden. Im Falle von RNS ist der Nachweis von rRNS bevorzugt, da hier besonders hohe Empfindlichkeiten bzw. geringe Reaktionszeite möglich sind. Dadurch wird beispielsweise Speziesdiagnostik möglich. Die einzelsträngigen, hybridisierenden Bereiche der Adaptoren können nach den Anweisungen der US-A-4,851,330
ausgewählt werden. Diese Speziesdiagnostik ist aber auch möglic über bakterienspezifische Gene wie Toxingene oder Pathogenitätsfaktoren.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Mutagenese über Mutageneseadaptoren oder über Adaptoren, die im hybridisierende einzelsträngigen Bereich mindestens einen mismatch haben, oder Nachweis von Mutationen über Adaptoren, die im hybridisierenden einzelsträngigen Bereich mindestens einen mismatch haben, ~ verwendet werden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Nukleinsäuren wird durch die in- vitro Verwendung des Replikationssystems des Phagen 0" 9 zur Bildung der Nukleinsäure C bzw. D aus dem Komplex der Nukleinsäuren A und B möglich. Dieses Replikationssystem ist beispielsweise in Biochim. Biophys. Acta 951 (1988) 417-424 beschrieben.
Zum Start werden zwei Adaptoren zur sequenzspezifischen Amplifikation benutzt. Diese Adaptoren enthalten als Doppelstra den linken und rechten origin of replication (ori) des Phagen f und eine einzelsträngige targetspezifische Region. Das Replikationssystem von^29 wurde gewählt, da für die in vitro- Replikation neben den Nukleosidtriphosphaten nur die DNS- Polymerase p2 und ein an den 5'-Enden der Adaptoren korrekt gebundenes Protein p3 und freies p3 sowie dATP notwendig sind. Nach Hybridisierung der Adaptoren wird mit dNTPs und T4-DNS- Polymerase oder Klenow-Polymerase die einzelsträngige Lücke zwischen beiden Adaptoren geschlossen und durch E. coli-DNS-Li oder T4-DNS-Ligase zu einem kompletten Strang ligiert. Danach mit p2 und p3 die Replikationsreaktion initiiert und mit dNTPs Replikation durchgeführt. Die^29 DNS-Polymerase wird mit EDT nach entsprechender Reaktionszeit (abhängig von Template-Länge) inhibiert. Die Detektion der Amplifikationsprodukte ist sowohl
Gel unter Hybridisierung mit markierten Nukleinsäureprobes oder durch während der Amplifikationsreaktion eingebaute markierte Nukleotide möglich.
Folgende Bedingungen haben sich als vorteilhaft erwiesen: Gap- filling-Reaktion: Konzentration der Adaptoren 100-500 /uM; Temperatur 25-45°C, bevorzugt 30-37°C; Probevolumen 20-50 /ul; PufferSubstanzen, bevorzugt Tris HCl pH 7.5-8.0, 20-100 M; Salze bevorzugt MgCl2 2 mM-15 mM, (NH4)2S04, 5-50 mM; Hilfsmittel: DTT 1-10 mM, BSA 50-250 /ug/ml; Nukleosidtriphosphate: 50-250 /UM; Hybridisierungsdauer 5'-15'; Polymerasen 2-5 U; Ligase 2-5 U, Inkubation 5*-30' .
Replikation: Temperatur bevorzugt 25-45°C, besonders bevorzugt 30 37°C, besonders zweckmäßig wie bei Gap-filling (die Temperaturen von Gap-Filling und Replikation können jedoch auch voneinander unterschiedlich sein); Volumen 20-50 /ul; p3: 20-400 ng; p2: 2-30 ng; Puffer: Tris pH 7.5, 20-100 mM, Salze MgCl2: 2-15 mM, (NH4)2<S04: 20-50 mM, Hilfsstoffe: Spermidin 1-5 mM. Inkubationszeit 15' (für sehr kurze Regionen) bis 90' (für lange Regionen) . Nukleotide: wie oben jedoch alternativ: 32P-dNTPs, Biotin-dNTPs oder Digoxin-dNTPs.
Detektion: a) Agarosegel bei direkter markierter Nukleinsäure b) Hybridisierung mit radioaktiv oder nicht radioaktiv markierter Probe-DNS, dot, Southern-blot, z.B. an Membranen:
1) Fixierung mit UV, 250 nm
2) Fixierung über Hybridisierung mit wandgebundenen komplementären Nukleinsäuren,
oder in Mikrotiterplatten, Tubes (aus Nylon, NC, Kunststoff, Streptavidin-beschichtetem Kunststoff, Säulen oder Beads etc.).
Die angegebenen Werte dienen als Richtwerte. Es ist selbstverständlich, daß ein Fachmann Abwandlungen vornehmen ka
Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren kann theoretisch bis zu Detektion vollständig in einer Lösung ohne Abtrennung irgendwelcher Komponenten geführt werden. Erst dann ist eine Abtrennung überschüssigen Markierungsmittels erforderlich.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind die in den oben genann Verfahren eingesetzten Adaptoren, bestehend aus mindestens ein einzelsträngigen Nukleinsäurebereich, der im wesentlichen komplementär ist zu mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz einer zu vermehrenden Nukleinsäure, und einem doppelsträngigem Bereich, der eine Sequenz zur Erkennung einer DNS-Polyerase enthält. Bevorzugt sind Adaptoren, die zusätzlich ein Protein gebunden enthalten.
In Fig. 1 und 2 ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstel von Nukleinsäuren schematisch am Beispiel der proteingeprimten vitro-Replikation mit Hilfe des Replikationssystems des Phagen ,0^29 gezeigt.
Fig. 1 zeigt die Umsetzung von Nukleinsäure A (l) mit zwei Adaptoren (2,3), die in ihren einzelsträngigen Bereichen (6,5) unterschiedlichen Bereichen der einzelsträngigen Nukleinsäure hybridisieren. Jeder der Adaptoren 3 und 2 enthält außerdem jeweils eine Nukleotidsequenz zur spezifischen Bindung des Replikationssystems (4,7). Außerdem ist hier der Fall gezeigt, die Adaptoren am 5'-Ende das Protein p3 kovalent gebunden enth Durch gap-filling wird der Komplex (8) gebildet.
In Fig. 2 ist die Replikation des Komplexes (8) gezeigt. Durch Replikationssystem des Phagen^29, welches insbesondere die Proteine p2 und p3 enthält, sowie dATP und die übrigen Nukleosidtriphosphate werden die Nukleinsäuren C bzw. D (10 un 11) gebildet, die wiederum Komplexe (9) bilden, die wie Komple
(8) Grundlage für die Replikation sein können. Bei jeder neuen Replikation bilden sich somit neue Nukleinsäuren C und D. Sobald die gewünschte Menge an Nukleinsäuren erreicht ist, kann der Prozess gestoppt werden.
Fig. 3 verdeutlicht eine Möglichkeit der Anordnung der Adaptoren relativ zueinander und zu Nukleinsäure A.
Fig. 4 verdeutlicht eine alternative Anordnung der Adaption relativ zueinander und zu Nukleinsäure A. Diese Anordnung kann erreicht werden, indem die template-Nukleinsäure zur A plifikation z.B. mit einer Restriktionsendonuclease verdaut wurde.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher:
Beispiel 1
Als Adaptoren werden 4 Oliognukleotide verwendet. Der linke Adaptor besteht aus einem Nukleinsäurestrang von 66 nt, wobei 46 nt dem 5'-Ende der linken origin of replication Sequenz von 029 aus PNAS, 21, 2596-2600, 1981; Virology, 155, 474-483, 198 Gene, 42, 1-11, 1986; NAR, 16/13. 5895-5913, 1988 und 20 nt HBV spezifischen Sequenzen (EP-B-0013828, Nukleotide 1278-1297) entsprechen, und einem Gegenstrang zur ori-Region von 46 nt.- De rechte Adaptor besteht aus einem Nukleinsäurestrang von 79 nt, wobei 59 nt dem 3'-Ende der rechten ori-Sequenz von g 29 und 20 HBV-spezifischen Sequenzen (EP-B-0013828, Nukleotide 1403-1422) entsprechen, und einem Gegenstrang zur ori-Region von 59 nt. Di HBV-Sequenzen sind komplementär zur einzelsträngigen Region im HBV-Genom und begrenzen einen Bereich von 106 nt.
HBV-Template (HBV-Genom, 0,5 /ug-0,5 fg) wird mit den Adaptoren Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM; MgCl2 10 mM; (NH4)2 S04, 20 mM; Dithiothreitol (DTT) , 2 mM; Bovine Serumalbumin, (BSA) , 200 /ug/ml; dATP, 150 /uM; dCTP, 150 /UM; dGTP, 150 /UM; dTTP, /uM; NAD, 26 /uM; in einem Volumen von 20 /ul gemischt, so daß Adaptoren-Oligonukleotide in einer Konzentration von 250 nM vorliegen. Diese Lösung wird zum Binden der Adaptoren 15' bei 3 inkubiert, zur Auffüllung der Lücke zwischen den beiden gebunde Adaptoren werden 2 U T4-DNS-Polymerase und 2 U E. coli-DNS-Liga in 5/ul des oben angegebenen Puffers zugegeben und 10'bei 30°C inkubiert.
Zur Initiation der Replikation (PNAS, 79., 5522-5526, 1982; PNAS 80, 4282-4252, 1983; PNAS, £1, 5374-5378, 1984; PNAS, 81, 80-84 1984; PNAS, 82., 6404-6408, 1985; J. Biol. Chem. , 264/15. 8935- 8940, 1989) werden danach 150 ng des terminalen Proteins von 0 (p3) und 80 ng der & 29-Polymerase (p2) in 25 /ul Tris HCl, pH 7,5, 50 mM; MgCl2, 10 M; Spermidin, 2 mM; (NH4)2 S04, 20 mM; zugefügt und 30' bei 30°C inkubiert. Die Reaktion wird mit 10 EDTA und 0,1 % SDS gestoppt. Zur Detektion werden die
Replikationsprodukte in einem 0,8 % Agarose-Gel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht.
Beispiel lb
Dieselben Adaptoren wie in Beispiel la werden verwendet.HBV- Template wird wie in Beispiel la eingesetzt und in Tris-HCl, pH 7,5, 25 mM; KC1, 6,3 mM; MgCl2, 15 mM; Dithioerythritol (DTE), 2 mM; ATP, 50 μM; dATP, 25 μM, dCTP, 25 μM; dGTP, 25 μM; dTTP, 25 μ mit Adaptoroligonukleotiden, je 250 nM in einem Volumen von 30 μl zur Auffüllung der Lücke zwischen den beiden gebundenen Adaptoren mit 2 U Klenow, DNA-Polymerase und 2 U T4-Ligase 30' bei 30°C inkubiert. Zur Initiation der Replikation werden 150 ng des terminalen Proteins von ß 29 (p3) und 80 ng der ß 29-DNA- Polymerase (p2) in 20 μl Tris-HCl, pH 7,5, 87,5 mM; MgCl2, 2,5 mM Spermidin, 5 mM; (NH4) S04, 50 mM; zugefügt und 30' bei 30βC inkubiert. Die Reaktion wird wie in la mit 10 mM EDTA und 0,1 % SDS gestoppt und im Agarosegel detektiert.
Beispiel lc
Wie in Beispielen la und lb wird HBV-DNA in einem Volumen von 30 μl in Tris HCl, pH 8, 50 mM; MgCl2, 5 mM; NH4-Acetat, 60 mM; DTT, 5 mM; dATP, 250 μM; dCTP, 250 μM; dGTP, 250 μM; dTTP, 250 μM; NAD 200 μM; mit Adaptoroligonukleotiden, je 250 nM, 2 U E.coli-Ligase und 2 U T4-DNA-Polymerase bei 30βC 30' inkubiert. Zur nachfolgenden Replikationsreaktion werden 150 ng p3 und 80 ng p2 in 20 μl Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM; MgCl2, 17,5 mM; Spermidin,5 mM zugefügt und 30' bei 30°C inkubiert.Die Reaktion wird wie in la und lb gestoppt und ebenso wird das Reaktionsprodukt detektiert.
Beispiel ld
Die Reaktion wird in der initiierenden gap filling-Reaktion wie i la - lc durchgeführt, jedoch mit einer Konzentration der Adaptore von je 1 μM. Die anschließende Replikationsreaktionwird wiederum wie in la - lc durchgeführt.
Beispiel le
Die Experimente werden wie in la - ld durchgeführt, die Adapto Oligonukleotide werden jedoch vor dem Einsetzen in die Reaktio 10' auf 95°C erhitzt und schnell auf Eis abgekühlt.
Beispiel lf
Die startende gap-filling-Reaktion und die Replikationsreaktio werden wie in den Beispielenla - le durchgeführt, jedoch bei e Reaktionstemperatur von jeweils 37βC.
Beispiel 2
Die Adaptoren werden hierzu an den 5'-Enden der j3^29-spezifisc ori-Sequenzen mit dem 0^29-Protein p3 (aus PNAS, 7_7, 6425-6428, 1980; NAR 13/21. 7715-7728, 1985) gekoppelt. Die Kopplung von an das spezifische 5'-Ende wird durch in vitro-Replikation des jeweiligen Oligonukleotids zusammen mit seinem Gegenstrang unt den in Beispiel 1 a-f genannten Replikationsbedingungen durchgeführt. Die Oligonukleotide enthalten als Doppelstrang n an einem Ende die ori-spezifischen Sequenzen. Daher kann p3 nu hier am 5'-Ende binden, der zweite Strang enthält kein p3-Mole Durch Affinitätschromatographie, beispielsweise mit Antikörper gegen p3, werden diese Stränge aus dem Gemisch an eine Oberflä gebunden und nach Auswaschen der p3-freien Stränge eluiert. Di Oberfläche kann dabei mit Streptavidin gesättigt und der <p3>- Antikörper mit Biotin gekoppelt sein. Die Adaptor-p3-Moleküle werden dann wie in Beispiel 1 a-f in die Amplifikationsreaktio mit einer entsprechenden Template DNS eingesetzt. Die p3 enthaltenden Stränge können jedoch auch an Sephadex AcA 500 abgetrennt werden.
Beispiel 3a
Die Reaktion wird mit Adaptoren, welche sowohl p3 kovalent gebunden haben oder auch p3 nicht enthalten, wie im Beispiel 1 a mit der Adaptor-Hybridisierung gestartet. Die dNTP-Konzentration für die Auffüllung der Lücke zwischen linkem und rechtem Adaptor betragen jedoch 33 /uM für jedes Deoxynucleotid. Nach Elongation für 10' bei 30°C werden zur Initiation der Replikation neben den in Beispiel 1 a-f genannten Substanzen 25 /u Ci [a32P] dATP, (= 3000 Ci/mM) und dCTP, dGTP bzw. dTTP, zu je 150 /UM zugefügt und ebenso wie in Beispiel 1 a-f inkubiert.
Gestoppt wird die Reaktion wie in Beispiel 1 a-f. Die Reaktionsprodukte werden entweder nach Gelelektrophorese als spezifische Schwärzung auf dem Röntgenfilm detektiert oder nach Auftropfen auf Nylonmembranen, Fixierung durch UV-Bestrahlung un Exposition eines Röntgenfilms mit der getrockneten Membran detektiert. Vor dem Auftropfen auf Nylonmembranen werden die Amplifikationsprodukte durch Gelfiltration mit einer Sephadex G- 50-Säule von nichteingebauten dNTPs getrennt und durch Äthanolfällung konzentriert.
Beispiel 3b
Die Reaktion wird mit Adaptoren in den Startpuffern und bei den Reaktionst emperaturen, welche Beispiel la - lf entsprechen gestartet, die dNTP-Konzentration beträgt jedoch 33 μM für jedes Deoxynukleotid. Nach Abschluß der gap filling-Reaktion werden zu Start der Replikation die in den Beispielen la - lf genannten Substanzen einschließlich Digoxigenin-11-2'-Desoxy-Uridin-5'- Trisphosphat (DIG-11-dUTP) zu 50 μM, dTTP zu 100 μM und dATP, dC und dGTP zu je 150 μM zugefügt. Nach Abschluß der Reaktion und Stopp der Reaktion werden die Reaktionsprodukte entweder im Agarosegel aufgetrennt und auf eine Nylon-oder Nitrozellulose- Membran transferiert oder auf entsprechende Membranen aufgetropf und durch UV-Bestrahlung oder Hitzebehandlung fixiert. Danach wi die DIG-markierte DNA detektiert wie in Boehringer Mannheim
Biochemica Manual S. 93-115 (Boehringer Mannheim, Biochemicals Molecular Biology 1990) oder in C. Kessler et al., Non-radioact Labeling and Detection of Nucleic Acids: 1. A Novel DNA-Labelin and Detection System Based on Digoxigenin: Anti-Digoxigenin ELI Principle (Digoxigenin System) , 1991, Biological Che istry Hopp Seyler, in press, beschrieben.
Beispiel 4a
Die Experimente werden wie in Beispielen 1-3 durchgeführt, für Hybridisierungsreaktionen der Adaptoren werden jedoch nur die beiden Oligonukleotide, welche dem linken Adaptor entsprechen ( p3 kovalent gebunden) , und das Oligonukleotid, welches die HBV- spezifische Sequenz und das 3 '-Ende der rechten 029 ori-Region enthält, zugefügt. Nach der gap-filling Reaktion wie in Beispie 1-3 wird mit dem Substanzgemisch zum Start der
Replikationsreaktion der Gegenstrangs zur ori-Region zum rechte Adaptor (+/- p3 kovalent gebunden) zugefügt, so daß die Konzentration dieses Oligonukleotids 250 nM beträgt. Inkubation, Reaktionsstopp und Detektion wird wie in den Beispielen 1-3 durchgeführt.
Beispiel 4b
Die Experimente werden wie in la - lf, 2 und 3 durchgeführt, fü die gap filling-Reaktion werden allerdings der linke Adaptor oh Gegenstrang zur ori-Region und der rechte Adaptor mit seinem Gegenstrang zur ori-Region zugefügt, wobei dieser Gegenstrang a 3'-Ende ein Dideoxynukleotid enthält.
Beispiel 4c
Die Experimente werden wiederum wie in la - lf, 2 und 3 durchge führt, für die gap-filling-Reaktion werden jedoch der Gegenstra zur ori-Region des linken Adaptors, der rechte Adaptor und dess ori-Gegenstrang mit je einem Dideoxynukleotid am 3'-Ende zugefügt.
Beispiel 4d
Wiederum werden die Experimente wie in den Beispielen la - lf, 2 und 3 durchgeführt. Zur gap filling-Reaktion werden der linke Adaptor ohne ori-Gegenstrang und der rechte mit einem Dideoxynuk leotid am 3'-Ende und ebenfalls der entsprechende ori-Gegenstran mit einem Dideoxynukleotid am 3'-Ende zugegeben.
Beispiel 5
32P-markierte Amplifikationsprodukte werden wie in Beispiel 3a durch Gelfiltrationen mit Sephadex G-50 von nicht eingebauten Deoxynucleotiden getrennt. Danach werden die
Amplifikationsprodukte durch 10•Inkubation bei 95°C denaturiert und 4 h mit 20 ng eines zur amplifizierten Region sequenzhomolog Oligonucleotids von 40 nt, welches mit Biotin markiert ist (EP-A 0097373) in 200 /ul mit Formamid, 10%, SSC, 5x; Denhardt'sehe Lösung, lx; Natriumphosphat, pH 6,8, 50 mM; in Streptavidin beschichteten Tubes bei 45°C hybridisiert. Die Konzentration des Oligonucleotids beträgt dabei 8 nM. Nach
Hybridisierung/Wandbindung wird zweimal 30'bei 37°C mit 200 /ul SSC, 2x; und SDS, 0,2%; gewaschen und im Szintillationszähler di gebundenen radioaktiven Amplifikationsprodukte gemessen.
Beispiel 6
Unmarkierte Amplifikationsprodukte, wie in Beispiel 1, 2 oder 4 hergestellt, werden nach Gelfiltration wie in Beispiel 5 sowohl mit einem biotinmarkierten zu einem Teil der amplifizierten Regi homologen Oligonucleotid von 40 nt und einem zweiten zu einem anderen Teil dieser Region homologen Oligonucleotid von 40 nt, welches Digoxigenin-markiert ist, bei 45°C hybridisiert. Dabei zeigen diese Oligonucleotide keine Kreuzhybridisierung. 200 /ul Hybridisierungsansatz enthalten die beiden Oligonucleotide, je 8 nM, Formamid, 10%; SSC, 5x; Denhardt'sehe Lösung, lx; Natriumphosphat, pH 6,8, 50 mM. Es wird 4h in Streptavidin- beschichteten Mikrotiterplatten hybridisiert und danach mit
Konjugatpuffer (Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM; NaCl, 0,9%; BSA, 1%; Pluronic T 68, 0,5%) 1 x 10'bei 37°C gewaschen. Anschließend wi mit 40 U <Digoxigenin>-Alkalische Phosphatase-Konjugat 30' bei 37°C inkubiert und danach 5x mit je 200 /ul Tris HCl, 100 mM; u NaCl, 150 mM gewaschen. Anschließend wird 30' bei 37°C mit 4- Methylumbelliferyl-Phosphat (0,1 mM) inkubiert und im Dynatech Microfluor-Reader gemessen.