JPH08503365A

JPH08503365A - Ｄｎａ分析への選択的アプローチ

Info

Publication number: JPH08503365A
Application number: JP6512249A
Authority: JP
Inventors: ウィグラー，マイケル; リシツィン，ニコライ
Original assignee: コールドスプリングハーバーラボラトリー
Priority date: 1992-11-12
Filing date: 1993-11-08
Publication date: 1996-04-16
Anticipated expiration: 2019-06-07
Also published as: WO1994011383A1; US6159713A; DK0733125T3; DE69331786D1; EP0733125B1; US5876929A; JP3535159B2; US5436142A; US5501964A; DE69331786T2; CA2149249A1; EP0733125A4; EP0733125A1

Abstract

(57)【要約】２つの関連するDNA集団、制限エンドヌクレアーゼ切断DNA又はcDNAのDNA断片又は集合の組の間の配列差を同定するためのプローブを開発するための方法が提供される。本方法は、第一段階を用いて両DNA集団の代表物を得る、即ちPCRを用いてアンプリコンと呼ばれる相対的に短い断片を製造する。問題の配列である標的DNAを含有するテスターアンプリコンをアダプターに結紮し、融解及びアニーリング条件下で過剰ドライバーアンプリコンと混合した後、PCR増幅を行なう。本工程を反復して標的DNAを高度に濃縮し得る。任意にその後標的DNＡをクローニングして、DNAをプローブとして用い得る。

Description

【発明の詳細な説明】 DNA分析への選択的アプローチ関連出願に対するクロスリファレンス本出願は、1993年11月12日に提出された出願第07/974,447号の一部継続出願である。序技術的分野本発明の分野はDNA分析である。背景ゲノミックDNAの比較分析は、多型現象、感染性のDNAベースの作用物質、ガンなどの疾病に関連する病巣、優性及び劣性の遺伝的形質などに関する情報を提供することのできる配列の発見を約束するものである。細胞の機能をもつか又は細胞の機能に影響を及ぼす特定のDNA配列を検出することができれば、血統を監視することができ、かくして動物を飼育するにあたり望ましい形質に結びついた特定の配列の遺伝を追跡することが可能となる。人間においては、法医学、診断及び遺伝子型決定及びさまざまな個体間の関係の決定において実質的に関心が示されている。従って、複数の供給源の間の共通の配列及び供給源によって異なる配列を検出できるようにする技術を提供することについて実質的関心が存在している。哺乳動物のゲノムは異常に大きく、約６×１０⁹bpである。ヒトゲノムのプロジェクトはゲノム全体をマッピングし配列決定する研究努力を開始させた。しかしながら、初期研究作業の多くは、特定の染色体の隣接する配列を決定することよりもむしろ特定の遺伝子の部位を決定することの方に向けられることだろう。ヒトゲノムの複雑性のため、ヒトのゲノミックDNAについてはきわめて実質的な取り扱い上及び処理上の問題が存在する。このように大量なDNAを処理するためには、望まれる情報をなおも提供しながら、単純化及び選択を可能にする方法を開発しなければならない。従って、２つの異なるDNA供給源の間で比較を行なうことのできる、多少程度の差こそあれ問題のゲノムの一部分を詳細に分析することを可能にするような機会を提供する研究努力が行なわれなければならない。関連文献ゲノムレベルでの差異分析における研究努力については、Lamar及びPalmer，C ell（細胞）37，171（1984）；Kunkel et al.，Proc．Natl．Acad．Sci，USA 82 ，4778（1985）；Nussbaum et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84，6521（19 87）；Wieland et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87，2720（1990）；Strau s及びAusubel，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87，1889（1990）によって記述されている。発明の要約関係する２つのDNA供給源の間の類似性又は差異を決定するため、代表差異分析が提供されている。第１段階においては、各ゲノムの代表的部分を、制限エンドヌクレアーゼ（REI）、部分的に２本鎖であるアダプターの連結及びポリメラーゼ連鎖反応ならびに、「アンプリコン」と呼ばれる比較的小さいDNAフラグメントの個体群を提供するためのREIでの分割、を用いて調製する。この段階は、異なる制限エンドヌクレアーゼ又は異なるスキーマ例えば分画などを用いて別々の分析において反復することができる。 DNA供給源アンプリコンは「ドライバー」と呼ばれ、このアンプリコンは、その後のもう１つの「テスター」アンプリコンの処理において実質的に余剰に使用される。このテスターには、ドライバーアンプリコンの中に存在しないか又は少ない量でしか存在しない「標的」DNAが含まれる。部分的２本鎖のPCRアダプターはテスターアンプリコンフラグメントのみに連結され、テスターとドライバーDN Aが組合わされ、溶融され再度アニールされる。アンプリコンの末端は充てんされ、アダプターに相補的なプライマを用いてDNA混合物は増幅に付され、ここで標的DNAは対数増幅を受け、ドライバーDNAにアニールする非標的テスターDNA及びドライバーDNAに比べて実質的に富化されることになる。次に、アダプターを除去し、異なるアダプターを用いてサイクルを反復することができる。さらに標的DNAの選択を強化するため異なる段階でさまざまな修正を利用することも可能である。図面の簡単な説明図１は、遺伝子の増幅を検出するプローブを分離するためのRDAの応用のゲル電気泳動及びゲノミックブロット分析である。図２は、異なる供給源からのドライバを用いた遺伝子増幅のゲル電気泳動分析である。図３は、ラットレトロトランスポゾンRat LlRnB6とヒト前立腺ガンからの差異産物P35の配列比較である。図４は、２つのcDNA個体群へ差異配列のゲル電気泳動分析である。特定の実施態様の説明２つのDNA供給源の間の代表差異分析（「RDN」）のための方法が提供されている。この方法は、選択的なハイブリダイゼーション条件の下で２つの供給源のうちの１方からのDNAがもう１つの供給源からのDNAに対して有意にハイブリッド形成されない状態で、２つの供給源の間で異なる配列の検出を可能にする。供給源としては、ゲノム、通常０．２kbp以上であるDNAフラグメントセット、制限エンドヌクレアーゼで分割されたフラグメントの収集物、cDNA又はcD NAライブラリなどが含まれる。この方法には、代表と呼ばれる第１の段階と、問題の配列の実質的な富化を提供するために反復することのできる減法及び運動による富化と呼ばれる２つ以上のさらなる段階が関与している。本発明においては、一定数の新たな造語が用いられる。「ドライバー」DNAというのは、第２の供給源すなわち「テスター」供給源内のDNAの存在を決定するのに使用されることになる１つの供給源からのDNAである。テスターDNAに唯一のものであるか又はドライバーDNAに比べてテスターDNAに対する濃度が高いフラグメントは「標的」DNAと呼ばれる。DNA配列は、制限エンドヌクレアーゼ消化とそれに続くアダプターの連鎖そして次にアダプターに対し相補的なプライマーでの増幅の結果として第１段階にて得られる。結果として得られるDNAは、「アンプリコン」と呼ばれる。このアンプリコンは、末端が通常アダプターに対する連鎖に先立って同じ制限エンドヌクレアーゼ認識配列を有している状態で、約２kb未満、通常は少なくとも約０．５kb未満であるということを特徴とする。本出願は、広範な状況の下で使用することができる。特に劣性又は優性形質と結びつけられた特定のDNA配列の存在又は不在を決定するにあたり、コーディング配列であっても非コーディング配列であってもよいもののその形質と結びつけられたDNA配列と結びついた状態で遺伝されることになる特定の配列を共有しているか否かを決定するべく、２つの関係するDNA供給源を比較することが可能である。当該方法は法医学において、２つの供給源の間の関係の度合いに関心がある場合にこれら２つの供給源からのDNAの間の類似性を立証するために使用できるものである。当該方法は同様に、ゲノム内に組込むことのできる又はできないウイルス配列といったような感染に結びついた配列の存在を調査することができる、疾病の研究においても応用可能である。同様に、ガンの結果としてのゲノム内の変化を研究する上でも当該方法を使用することができ、この場合、ガン細胞は正常な野生型細胞に比較することができる。かくして、当該方法は、遺伝的再配列、遺伝的喪失、遺伝子又はその他のDNAの増幅を除去するための、ゲノム内に組込まれた又は細胞宿主内に存在する病原性生体からのDNAの同定のため、遺伝的疾患と結びつけられた遺伝子又はその近くにある多型の同定のため、特に細胞宿主内で発現される遺伝子の同定のため、新生細胞内の病巣の同定のためなどに応用できるものである。当該方法を実施するにあたっては、この方法を利用するときに考慮に入れるべき事項が存在する。PCRは、このプロセスが確率論的な性格をもつことから、人為構造の源となりうる。従って、各々の差異産物候補は、テスター及びドライバーアンプリコン内でのその存在又は不在についてテストされるべきである。もう１つの人為構造源は組織の試料採取の間に起こりうる。テスターの標本を汚染する正常なフローラは、それがドライバ内にも存在しない場合差異分析の間に容易に富化されることになる。遺伝的モザイク現象に遭遇する可能性もある。ポリクローナル組織を扱っている場合、つまり例えばガン生検などにおいては、突然変異の存在を検出できるためには特定の突然変異をもつ細胞が最低限の割合で存在しなければならない。従って、テスターDNAのための供給源として物理的分離によって得られたきわめて精製度の高いガン細胞又はガン細胞の培養を使用することが望まれる。病原体の発見の場合には、感染を受けた又は受けていないDNA供給源からの多型性の入念な整合がなくてはならない。後者の場合、テスター及び／又はドライバーDNAは、同じ個体から誘導されてもよいし、同一の双生児から又は別々であるが関連ある個体からのものであってもよいし、テストされた個体の親からのプールされたDNAであってもよいし、関連ある供給源例えば細胞系統、共通の遺伝的機能障害又は共通の形質などからのプールされたDNAであってもよい。最終的に、標的DNAを同定することのできる容易さについて、全ての制限エンドヌクレアーゼが同等ではない。従って、各々の場合において、合理的な数のサイクル内で標的DNAを確実に得るようにするためのみならず、得られる標的DNA配列の数を増大させるため、別々の決定において複数の制限エンドヌクレアーゼを使用することが望ましいだろう。ここで特定のプロセスを見てみると、第１段階はDNAの分離である。すでに記した通り、DNAは、あらゆる供給源つまり真核生物、又は原核生物、無脊推動物又は脊椎動物、哺乳動物又は非哺乳動物、植物又はその他の高等真核生物といった供給源からのものであってよい。ヒトの利益のため直接応用するという観点から見ると、供給源はヒトDNAとなるが、当該方法は、実験用の動物、植物、家畜などのような関連するDNAの存在又は不在を同定することに関心がある場合、又は近交系又は非近交系個体群が問題となっているその他のあらゆる状況の下では、あらゆる複合ゲノムに対して応用することができる。DNAは通常、近い関係をもつ供給源からのものであり、かくして、得られる標的DNA配列の数は比較的制限されることになり、往々にして約10⁴未満、通常は約10³未満の異なる配列である。ゲノミックDNAが通常ドライバー及びテスターDNAの供給源となるが、２つの異なるmRNA供給源からの２つのcDNA個体群の間の差に関心がある場合、cDNAを使用することもできる。第１段階においては、DNAを分離させ、タンパク質を除去し、その後、比較的頻繁でない切断を提供する制限エンドヌクレアーゼを用いて完全に消化させる。通常エンドヌクレアーゼは、６個以上のヌクレオチドから成るコンセンサス配列を有し、平滑末端又は付着末端、通常は付着末端を提供することができる。 Bam ＨＩ， BglII，HindIIIなどといったさまざまなエンドヌクレアーゼを利用することができる。DNAの消化の後、ドライバからのDNA及びテスターからのDNAの各々のストランドの端部に、２本鎖オリゴヌクレオチドアダプターを連結させる。アダプターは通常両端で付着され、１方のストランドが長めで、プライマに相補的な配列として役立つ。アダプタは２本鎖であり、消化からのdsDNAの末端に対し相補的な片端をもつ。２つの供給源からのDNAは次に、プライマを付加し、最終ラウンドについての拡張を伴うポリメラーゼ連鎖反応を用い通常は10サイクル以上、より通常的には15サイクル以上、一般には約30サイクル以下、より通常的には15サイクル以上、一般には約30サイクル以下、より通常的には約25サイクル以下そして好ましくは約20サイクルを用いることによって、別々に増幅される。このサイクル数の後、大部分について、フラグメントは主として約２kb未満、通常は約1.0kb未満となる。このとき、アダプタは、適切なあらゆる手段を用いて、制限エンドヌクレアーゼ消化及び物理的分離により除去される。物理的分画とは異なり、代表を用いた場合出発物質の量が制限条件となることはない。 BamＨＩ， BglII及びHindIIIでの分割の後、哺乳動物のDNAのアンプリコンを利用する場合、結果として得られるアンプリコンの見積り上の複合性は、それぞれ出発ゲノミックDNAでの複合性の55分の1，13分の１及び８分の１である（Bishop etal.，Am．J．Hum．Gevet ．35，795［1983］）。ゲノムの複合性を減少させるために、このゲノムを代表するその他の方法を利用することもできる。例えば、４ntのコンセンサス配列制限酵素といったより頻繁に切断するゲノムを用いた分割そしてそれに続くアダプターの付加、PCR増幅及びサイズ分画が、この目的を達成することになる。もう１つの方法によると、反復的配列をフランキングするゲノムの代表部分を増幅するためゲノム内の反復的DNAに対するプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用する可能性がある。次の段階では、単一のハイブリダイゼーション及び増幅の作業において、減法及び運動による段階が利用される。望ましい場合には、段階を分離することもできるが、好ましくは同時発生的に行なわれる。この段階の第１の局面は、テスターアンプリコンフラグメントの５’末端又は手順が反復される場合には先行する富化ラウンドの産物に対するPCRアダプターの連結である。テスターアンプリコンの３’末端に対する連結は避けるべきであり、これは例えば、その５’末端でリン酸化されていないアダプタを用いることによって達成できる。通常、プライマに対して相補的なアダプター鎖は少なくとも約12nt、より通常的には少なくとも17nt、そして一般的には約20nt未満、さらに一般的には約100nt未満となる。５’末端に対するアダプターの連結のための適切なあらゆる方法を適宜利用することができる。次にアダプターに接合されたテスターアンプリコンフラグメントをドライバーアンプリコンフラグメントと組合わせ、溶融させ、再度アニールさせる。ドライバーアンプリコンフラグメントは実質的に余剰に、通常は少なくとも５倍の余剰で存在し、この余剰は、50以上を超えることもあり、通常は約10⁸倍の余剰を超えず、より通常には500倍の余剰を超えない。テスターDNAに対するドライバーDNAの比率は、異なるラウンドについて一定である必要はない。通常、この比率は、連続的ラウンドと共に増大し、この増加は約１：１〜10³まで変動しうる。初期比率は一般に約10〜1000倍の余剰の範囲内となる。適切には、高い温度、一般には95℃以上の温度での加熱により溶融が達成されハイブリダイゼーションは約60℃で進行するか、ここで、必要な緊縮性を提供するべくさまざまな緩衝液ならびに塩濃度を利用することができる。通常は、かなり高い緊縮性、つまり一般には少なくとも約0.1Ｍ NaCl以上、通常は約１Ｍ NaClの緊縮性が用いられることになる。溶融及び再アニールの後、ドライバーDNAの中に存在する相補的配列の欠如又は相対的欠失のために標的DNAが自己アニールの阻害を受けないことから、全２本鎖DNA中の標的DNAの実質的富化が存在することになる。このとき、４つのヌクレオチドの存在下で例えばTaq DNAポリメラーゼといったあらゆる適切なDNAポリメラーゼを利用することにより、張出しは充てんされ、かくして２本鎖の自己再アニールされたテスターDNAのみが充てん済みアダプターをアンプリコンの各端部において有することになる。ドライバーDNAは非標的テスターDNAが自己アニールするのを阻害するのに対して標的DNAが自己アニールするのを阻害しないことから、全テスターDNAに比べて標的DNAにおける実質的な富化が存在する。このとき、２本鎖の自己再アニールしたテスターアンプリコンは、少なくとも約５サイクル、頻繁には10サイクル、又通常は約40サイクル以下、好ましくは約 30サイクル以下が関与する従来のポリメラーゼ連鎖反応の下で増幅される。この増幅をほぼ中間で中断させることもでき、適切なヌクレアーゼを用いて一本鎖DNAを分解させることができる。さまざまなヌクレアーゼ、特に緑豆ヌクレアーゼを利用することが可能である。このとき、結果として得られた２本鎖DNA混合物を、テスターDNAからのアダプターを除去する制限エンドヌクレアーゼを用いて消化することができる。サイズ毎の分離を可能にするあらゆる適切な手段を用いて、アダプター配列からテスターDNAを分離することが可能である。適切には、ゲルろ過又はゲル電気泳動を利用することができる。このとき、アンプリコンは、第１のつまり先行したセットとは通常異なるものである第２のアダプターセットに連結され、余剰のドライバーアンプリコンの存在下での溶融、アニーリング、張出しでの充てん及びPCR増幅のサイクルが反復される。後のサイクルは先行するアダプターに依存する可能性がある。当該プロセスにおいては、このサイクルを１回以上反復することができ、通常少なくとも２回のラウンドつまり反復があり、約６ラウンド以下、通常は２〜４ラウンドで充分である。各研究について異なる制限エンドヌクレアーゼが利用される場合、往々にしてこのプロセスを１回以上行なうことが有利である。このようにして、異なるアンプリコンが得られることになり、異なる情報を得ることが可能である。このプロセスの用途に応じて、別々のアンプリコン調製において２つ以上の制限エンドヌクレアーゼを利用することができる。同様に、異なる制限エンドヌクレアーゼを用いて得られたプローブを比較してそれらか重複するか、近接するゲノミックDN A配列に結合するか、同じ遺伝子又は多型性領域の一部を成しているかなどということを決定することもできる。このプロセスを実施するにあたっては、最初のラウンドは主として減法による。それに続くラウンドは、運動による富化の成分が大幅に増大する。例えば、標的DNAがテスターDNAとの関係において等モルである場合（すなわち単一コピー）、及びテスターアンプリコンに対してＮ倍の余剰でドライバーアンプリコンがとられる場合、ドライバーアンプリコンの事実上完全な再アニーリングを仮定すると、標的は最初のラウンドの後Ｎ倍富化されることになる。第２ラウンドの後、標的は、減法成分による率を乗じたＮ²だけ富化されることになり、第３回目の後は、少なくともその２乗だけ富化される。Ｎが50である場合、第２ラウンドの終りで、標的は約10⁴だけ富化され、第３ラウンドの終りでは約10⁸ だけ富化される。一般に、唯一回の減法サイクルは、Ｎをテスターアンプリコンに対するドライバーアンプリコンのモル余剰としｆが再アニールするドライバーアンプリコンの分画であるものとしておよそfNの標的富化を生み出すと予測することができる。結果として得られる標的DNAつまり差異産物はさらに、DNA配列間の差異を構成するプローブについて富化することができる。適切には、配列をクローニングし、その後、テスター及びドライバアンプリコンに対する相補を見極めるべくサザンブロット又はその他の技術を用いてスクリーニングすることができる。テスターアンプリコンに対しハイブリッド形成するがドライバアンプリコンに対してはハイブリッド形成しないクローンをこのときさらに使用することができる。ドライバDNAとは異なるテスターDNAゲノム上の部位を同定するためのプローブとして、結果として得られた標的DNAを使用することができる。この用途のためには、これらにさまざまな方法で、例えば放射性標識、ビオチン、螢光剤などを用いて標識付けを行なうことができる。望ましくは、各々の標的アンプリコンの実質的に均質な組成を得るためには、原核生物宿主内でのクローニングを目的として適切なクローニングベクター内に挿入することによって、標的アンプリコンをクローニングすることができる。望ましい場合には、クローニングされたDNAを配列決定して、標的DNAの性質を決定することができる。代替的には、クローニングされたDNAを上述のとおりに標識付けして、標識DNAを支持するライブラリー内のフラグメントを同定するためのプローブとして使用することが可能である。標的DNA は、２つのDNA供給源の間に存在しうる差異を同定するのに利用できる。標的DNAに対する複数のプローブが得られる場合、これらは真正プローブとして立証されるまで推定プローブと呼ぶことができる。適切にも、配列をクローニングさせて、次にテスター及びドライバーアンプリコンに対する相補を見極めるためサザンブロット又はその他の技術をもちいてスクリーニングすることができる。かくして、プローブ群は、ドライバー及びテスターの両方のDNAに対しハイブリッド形成するハイブリッド形成配列を含むことができる。ドライバー及びテスターアンプリコンに対してプローブをハイブリッド形成、例えばサザンハイブリッド形成することにより、ドライバーDNAとテスターDNAの区別をしないような推定プローブを迅速に見極めることが可能である。推定上のプローブがドライバー及びテスターアンプリコンの両方に結合する場合、プローブを廃棄することができる。テスターアンプリコンに対しハイブリッド形成するもののドライバアンプリコンにはハイブリッド形成しないクローンは、このとき、さらに使用することができる。このスクリーンは、少なくとも５つ、さらに一般的には少なくとも 10個の推定プローブが得られる場合に、特に有用である。血統分析において、当該プロセスは、家族の１人の構成員の中に存在するもののもう１人の構成員には存在しない配列を規定するのに使用することができる。このようにして、このとき、家族のその他の構成員を、彼らが同じ DNAをもつか又はそれが欠如しているかについて比較することが可能である。これは、２つの個体、１つの供給源又は個体から得られた試料などの間の関係に関心がある場合などの法医学において使用することができる。当該方法は同様に、１つのゲノムからの増幅されたDNAの中に存在し同一の生体からの異なるゲノムからの増幅DNA内には存在しない多型性制限エンドヌクレアーゼフラグメントとして作動的に構成されているPARFと呼ぶことのできる遺伝子多型のためのプローブのライブラリを構成するためにも使用することができる。例えば、ドライバーDNAからの両方の対立遺伝子の中にテスターDNA内の短かいBam ＨＩフラグメントをフランキングする２つのBamＨＩ部位のうちの１つが欠如し、ドライバー内に大きいBamＨＩフラグメントのみを導いている場合、テスターの短かいBamＨＩフラグメントはそのBamＨＩアンプリコンの中にのみ存在し、ドライバのBamＨＩアンプリコンの中では欠如することになる。かくして、制限フラグメントは直接、２つのゲノムを区別することになるプローブを導き出すことになる。アンプリコンがクローニングされる場合、個々にピックアップされたクローンには実質的な重複性が存在しうるということも認識すべきである。従って、異なるプローブを選択する効率は、増幅効率の変動又は方法論中に組み込まれたその他の人為構造の結果としてもたらされるものでありうる、クローニングに先立って混合物中にアンプリコンが存在した頻度に実質的に存在して変動することになる。当該方法は、感染を受けている疑いのあるDNAを感染を受けていないと思われるDNAと比較することができる状態で、病原体のためのプローブを分離するために使用することができる。例えばＴ細胞及びマクロファーシにとってのHIV又は肝臓にとってのＢ型肝炎ウイルスといった特定の細胞型又は組織に対して屈性をもつウイルスに関心があるとすると、そのウイルスが屈性をもつ感染の疑いのある供給源からの組織及び同じ個体内のかかるウイルスが存在するはずのないもう１つの部位からの組織をとることができる。プロセスを実施することによって、細胞供給源の適切な選択によりその他のいかなる差異も予期されないことから、そのウイルスに特異的であるプローブが得られるはずである。ウイルスならびにその他の状況に対しても応用することができると思われる当該プロセスの制限条件は、標的DNAを支持する個体群が、テスターDNAを誘導させる細胞の合計数のうちの適正な割合を占めていなければならないという点にある。上述のとおり、組込まれた病原性DNAの存在に関心がある場合、組織内でこれらの細胞のわずかな割合だけが感染を受けている可能性がある。従って減法及び運動による富化に先立って、全てのテスター配列の濃度を等化するためには、テスター配列を正規化することか望まれる可能性がある。（Patanjali et al.，Pr oc Natl. Acad. Sci．USA 88，1943（1991））。病原体の発見に対するRDAの応用には、望ましくは、感染を受けた及び受けていないDNA供給源からの多型の入念な整合が必要とされる。個体が遺伝的モザイクでない場合、同じ個体からテスター及びドライバーDNAを誘導させることができる。これらのDNAは、関係の無い個体に由来していてはならない。というのもそれらのDNA内の豊富な多型性差異が病原体の検出を不明確にするからである。しかしながら、感染を受けていないＤＮＡ供給源（ドライバ）は、原則として同一の双生児から来るか又は感染を受けた個体の両親からのプールされたDNAでありうる。これは、感染を受けた個体のゲノミックDNA内で発見されるDN A制限フラグメントのほぼ全てが少なくとも１つの親DNAの中に存在しうると期待できるからである。当該方法は同様に、ガン細胞内で発生するゲノミック変性を検出するためにも応用できる。これらは次の３つの全く異なるタイプのものでありうる：すなわち、異型接合多型全体にわたり広がる欠失又は遺伝子変換から発生しうるような制限エンドヌクレアーゼフラグメントの喪失という結果をもたらすもの；点突然変異又はゲノム再配列から結果としてもたらされうるような新しい制限エンドヌクレアーゼフラグメントを産生するもの；及び通常１つの遺伝子を取り込むDNAの増幅を結果としてもたらすもの。２番目と３番目のケースにおいは、RDAは、テスターとしてガン細胞からのDNAを又ドライバーとして正常なDNAを使用して、修正無しで応用することができる。しかしながら、ガン生検における正常な間質（ストローマ）の存在は、ガン細胞内の遺伝子情報の喪失の検出を妨げる可能性がある。従って、第１のケースにおけるテスターのための供給源として、物理的分離によって得られた高度に精製されたガン細胞又はガン細胞の培養のいずれも必要とされない。これらの制約条件は、ゲノム再配列の検出にはあてはまらない。転座、挿入、逆位及び欠失を含むゲノム再配列は、再配列の部位を橋かけする新しい制限エンドヌクレアーゼフラグメントを作り出す結果となる。これらの橋かけフラグメントのいくつかは増幅可能でありうるのに対し正常なDNA内でそれらが由来したフラグメントの少なくとも１つは増幅不可能である。かかる橋かけフラグメントは、腫瘍からのDNAがテスターアンプリコンの調製のために使用され同じ個体の正常な組織からのDNAがドライバーアンプリコンの調製のために使用される場合、RDAによって発見可能である。ゲノム再配列により作り出された異なるサイズの制限エンドヌクレアーゼフラグメントをもう１つの方法で開発利用することができる。腫瘍のDNA消化物からの分画されたサイズ等級は時として、正常なDNAからの比較可能なサイズ等級の中に存在しない配列を含むことになる。前者をテスターとして後者をドライバーとして使用することより、第２の制限エンドヌクレアーゼでの分割後にアンプリコンを調製し、遺伝子再配列点の近くにおいて増幅可能な制限エンドヌクレアーゼフラグメントをクローニングする目的でRDAによりこれらを比較することができる。上述の方法のいずれかを用いると、腫瘍細胞の間に正常な細胞が存在することによって、再配列のためのプローブの検出が不明確になることはなくなる。最後の状況すなわちDNA増幅においては、増幅の検出は、RDAの間の運動による富化の結果であると思われる。発ガン遺伝子の増幅は、予後の不良を表わすことが分かっているため、増幅された配列を検出できるということをガンの経過の予想において応用することが可能である。 RDAを異なる個体に応用すると、先にPARFとして言及した１つのタイプの多型の収集物を生み出すことになる。かくして、予め広範な分子遺伝子特徴づけを受けていない種についてのみならず、ヒトやマウスといった周知の種についても新たな多型セットを生成させるのにRDAを用いることが可能である。PARFは最も頻繁に２元性多型を検出することから、これらは、遺伝的型別のために標準化されたフォーマットと共に用いることのできるプローブの一団として役立つ可能性がある。さらにもう１つの利用分野においては、RDAは、常染色体性優性遺伝性疾患を患う創立者グループからの個体のDNA（テスター）の中には存在するものの正常なグループからの個体のDNA（ドライバー）の中には存在しないPARFのためのプローブを生み出すことができる。換言すると、RDAは、正常な個体のDNA（テスター）の中には存在するものの劣性遺伝性疾患を患う創立者グループからの１個体のDNA（ドライバー）の中には存在しないPARFについてのプローブを生み出すことができる。併発クローニングのための方法論（Broo ks及びPorteous，Nuc，Acid Res．19, 2609［1991］）と組合わせると、このような応用は、優性遺伝子座と連鎖不平衡状態にある稀なPARF又は劣性遺伝子座と連鎖不平衡状態にある一般的なPARFの欠如についてのプローブの発見を加速することができる。多くの実験用動物及び植物においても、もどし交雑の連続的生成により１つの特定の遺伝子が１つの遺伝子背景からもう１つの遺伝的背景へと移されている共通遺伝子系系統が存在する。かかる系統は、問題の遺伝子をとり囲む比較的小さい領域において以外、遺伝的に同一である。この領域は、標準的には標的遺伝子までの染色体歩行を可能にするように充分小さいものの、当該方法論のニーズにとって充分大きいものである。当該方法論は、疾病可能性又は行動異常といった遺伝的形質に遺伝的に結びつけられる多型の発見に対し、応用することのできるものである。この目的で当該方法論を利用するためには、テスター又はドライバーとして又はその両方として使用するべく１つの個体グループからのDNAのプールを使用することが望ましい。このような形で使用された場合、この方法は、１つのグループの中には存在してもう１つのグループの中には存在しない多型性対立遺伝子を検出するプローブを生み出すことができる。特に、かかるプールがドライバとして使用される場合、ドライバープール内の全ての個体からテスターを区別するプローブが制限エンドヌクレアーゼ多型について得られる（「PARFs」）。プールがテスターとして用いられる場合、この方法は、ドライバー個体からテスタープールの少なくとも１つの構成員を区別するPA RFを生み出す。最も興味深い例においては、テスター及びドライバーの両方が個体グループからのプールされたDNAである場合、この方法は、ドライバーグループの全ての構成員からテスターグループの少なくとも１つの構成員を区別するPA RFを生み出す。プーリングはさまざまな状況において立証できる。１つの利用分野では、そのプールされたDNAが標的遺伝子の領域において同型接合であるもののゲノム内のその他の場所では異型接合であるという特性をもつ子孫の収集物を産生するため伝達遺伝学が用いられる。一例を挙げると、２つの近交系が問題の標的座Ｌで異なっており、１つの系統Ａが劣性対立遺伝子（ａ）を有しもう１つの系統Ｂが優性対立遺伝子（ａ⁺）を有している場合、テスターとして系統Ｂを用いることができ、一方ドライバーについては系統間のF2交雑を行ない、劣性表現型を示すｋ後代を選択し、それらのDNAを一緒に混合する。当該方法を利用する場合、Ｂ対立遺伝子は、Ｌのまわりの領域内を除いてゲノム内のあらゆる場所で減法されなくてはならない。遺伝子座Ｌが２つのフランキング遺伝標識Ｘ及びＹの間で遺伝的にマッピングされた場合、この方法のターゲティングをさらに改善することができる。ドライバーについては、Ｘ及びＬの間で乗換えが起った１／２ｋ後代及びＬとＹの間で乗換えが起った１／２ｋ後代を選択することができ、こうしてＢ対立遺伝子の割合がＸ及びＹで25％であることが保証されることになる。又こうして全体にわたりＢ対立遺伝子の割合が非常に低い領域が、Ｘ−Ｙの間隔に確実に制限されることになる。プールは、DNA供給源に応じてさまざまなサイズのものであってよい。哺乳動物及び植物のゲノムといった大きいゲノムから、８つ、通常は10個以上で一般的には50個以下、通常は約20個以下の異なる供給源のプールを一般に利用することができる。その他の利用分野では自然発生的な生殖細胞系ゲノム再配列が関与する可能性がある。このような感染を受けた個体のゲノムは、いずれの親にも存在しない制限エンドヌクレアーゼフラグメントを含むことになる。この状況は、前述のガン細胞内で起こる遺伝的再配列に類似している。当該プロセスが適切に作動したことを確認するため、通常は、テスター及びドライバーアンプリコン内での存在又は不在について差異産物候補（標的DNA）をテストすることが望まれる。同様に、関心の的となるのは、テスターを汚染する可能性があるもののドライバー内に存在しないフローラの存在であろう。遺伝的モザイク現象は同様に当該方法論を妨げることになる。しかしながらさまざまな情況の下で、当該方法は、多様な事象の結果としての２つのゲノム間の差異を分析するために使用することのできる配列を効率良く提供することだろう。以下の実施例は、制限的な意味をもたずに一例として示されるものである。実験アンプリコンの調製：リンパ球株DRL484（Baylor CollegeのT．Caskey氏の提供による）から精製した高分子DNA 10μｇを用いてドライバーアンプリコンを調製し、等モル量の標的（アデノウイルス-2 DNA 120 pg及び／又は、λファージD NA 160 pg。いずれもNew England Biolabsより入手）を含有する同一DNA 10μｇを使用してテスターアンプリコンを調製した。テスター及びドライバーDNAをともに制限エンドヌクレアーゼ（New England Biolabs）で消化し、各DNA消化物１μｇをT4 DNAリガーゼ緩衝液（New England Biolabs）30μｌ中で0.5nmolの24-mer及び12- mer非リン酸化オリゴヌクレオチド（セット１。表１参照）と混合した。それぞれプライマーセット１（Ｒシリーズ）は代表物として用い、セット２（Ｊシリーズ）及び３（Ｎシリーズ）は奇数及び偶数ハイブリダイゼーション／増幅として用いる。OLIGOコンピュータープログラム（National Biosciences）を用いて強力な二次構造の非存在に関してオリゴヌクレオチド設計を点検した。混合物を１時間に50℃から10℃に漸次冷却することによりオリゴヌクレオチドをアニーリングし、次いで16℃で400ＵのT4 DNAリガーゼを用いた一夜インキュベーションによりヒトDNA断片を結紮した。結紮後、テスター及びドライバーDNA サンプルをともに増幅した。ドライバーアンプリコンの調製のために使用した10 本の試験管及びテスターアンプリコンの調製用の２本の試験管の各々は、400μ ｌの容量中に：67mMのTris-HCl，25℃でpH8.8，16mMの（NH₄）₂SO₄，10mMのβ− メルカプトエタノール、100μｇ／mlのウシ血清アルブミン、（各々）200μＭの dATP，dGTP，dCTP及びdTTP，１μＭの24-merプライマー及び結紮アダプターを伴う80ngのDNAを含入した。試験管をサーマルサイクラーThermalcycler （Perkin Elmer Cetus）中で72℃で３分間インキュベートし、15ＵのTaqポリメラーゼ（Am plitaq,Perkin Elmer Cetus）を加え、反応物に鉱油を上塗りして５分間インキュベートし、結紮アダプターの５’突出端を充填し、20サイクル（各サイクルは 95℃で１分間及び72℃で３分間のインキュベーションを含み、最終サイクル後に 72℃で10分間伸長）の間増幅した。増幅後、ドライバー及びテスターアンプリコンをともに同一制限エンドヌクレアーゼ（10Ｕ／μｇ）で消化してアダプターを切り離した。10μｇのテスターアンプリコンDNA消化物を２％NuSieveアガロース（低融点。FMC Bio Products）を通して電気泳動処理し、DNA断片（150〜1500bp ）をアガローススライスの融解及びQiagen-tip20クロマトグラフィー（Quiagen Inc.）後に回収してアダプターを除去した。ハイブリダイゼーション及び増幅の第一ラウンドに備えて、これらの断片を新組のアダプターに結紮した。 DNAのハイブリダイゼーション及び増幅工程：アダプターと結紮したテスターアンプリコン0.5μｇ及びドライバーアンプリコンDNA 40μｇを混合し、エタノール沈殿させて、３×EE緩衝液（Straus and Ausbel，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 87，1889（1990））４μｌ中に溶解し、30μｌの鉱油（Perkin Elmer Cet us）を上塗りした。熱変性後、５ＭのNaCl溶液１μｌを加え、67℃で20時間DNA をハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション終了時に、その結果生じたDNA の1／10部をプライマーを含有しないPCR混合物400μｌ中のTaqポリメラーゼ15Ｕとともにインキュベート（72℃で５分間）して再アニール化テスターの末端を充填し、次いでテスターが結紮される同一24-merオリゴヌクレオチド付加後10サイクル間（95℃で１分間、70℃で３分間、次いで最終ラウンドの間10分間伸長）増幅した。供給元の推奨通りに400μｌの容量中の20Ｕの緑豆ヌクレアーゼ（New E ngland Biolabs）と共に30分間インキュベーションし、その後50mM Tris-HCl，p H 8.9中にサンプルを溶解して５倍希釈液とし、酵素を熱不活性化（95℃で５分間）して、増幅後に認められた一本鎖DNA分子を分解した。緑豆ヌクレアーゼ処理前と同じ条件下で15〜20サイクルの間、溶液40mLを増幅させた。増幅DNA（３〜５μｇ）を原制限エンドヌクレアーゼで消化し、消化物200ngを第三アダプター組に結紮した（表１参照）。50〜100ngのこのDNAを40ngのドライバーアンプリコンと混合し、第一サイクルの場合と同様にハイブリダイゼーション及び増幅手順を反復した。第二ハイブリダイゼーション／増幅工程後に得られた消化物200n gを次に第二組のアダプターに結紮し、この物質100〜400pgをドライバーアンプリコン40μｇと一緒に第三ラウンドのハイブリダイゼーションに用い、20〜25サイクル緑豆ヌクレアーゼ消化後に最終増幅した。第三組のアダプターに結紮された第三ラウンドからの物質5pgを用いてそれをドライバーアンプリコン40μｇと混合した後、第四ハイブリダイゼーション／増幅工程を実施した。実施例１：標的として付加したウイルスDNAによる代表的差異分析１回コピーレベルのアデノウイルス及び／又はバクテリオファージλ DNAをヒトDNAに付加してモデルテスターを作り、ドライバーとしてウイルスDNAを有しない同一ヒトDNAと一緒に用いた。標的としてアデノウイルス及びλDNAを有するヒトDNAからのBglII又は標的としてλDNAを有するHindIIIアンプリコンを調製した。BglIIアンプリコンに関しては、アガロースゲル電気泳動によって立証されたように、λ及びアデノウイルス小断片が主な差異生成物であった。これは出発物質の＞5×10⁵倍の濃縮を、そしてアンプリコンの約4×10⁵倍の濃縮を示した。 HindIIIアンプリコンからの濃縮は有効とは認められなかった。λHindIII断片はプロットハイブリダイゼーションにより立証されるように第三ラウンド後に非常に濃縮されたが、しかし依然として均質にはならなかった。第四ラウンド後、予期された標的断片はほぼ均質に精製された。HindIII制限エンドヌクレアーゼ及びBglII制限エンドヌクレアーゼを用いた場合の差異は、HindIIIアンプリコンの配列の複雑性がより大きいことに関連があると思われる。ドライバーの複雑性が非常に高い場合は、負の及び動的濃縮は低減し、競合工程が優位を占める。競合工程はテスター中の有効増幅反復配列の出現を伴う。実施例２：２個体からのDNAの代表的差異分析ヒトリンパ芽球細胞培養GM05901及びGM05987からそれぞれドライバー及びテスターアンプリコンを調製した（Amish Pedigree 884，Human Gene tic Mutant Cell Ropository，Camden，NJ）。BamＨＩ，BglII又はHindIIIで切断後にアンプリコンを調製した。上記のようにアンプリコン間の差異生成物を得て、ゲル電気泳動によりサイズ分別した。各場合に、別々のしかし複雑なパターンが観察された。３回ハイブリダイゼーション／増幅後、差異生成物をプラスミド中にクローニングした。各差異生成物に関しては、ブロットハイブリダイゼーションのために３つのプローブを選んだ。それらはすべてアマン派一族データ内では多形性であることが判った。BamＨＩ差異生成物を最も詳細に分析した。表２：ヒトDNAの17サンプル中のBamＨＩ PARFsの存在に関するスクリーニングアマン派の７家系のリンパ芽球細胞培養GM05901（ドライバー），GM05987（テスター），GM05918，GM05961，GM05963，GM05993，GM05995（カラムＡ〜Ｇ）、５つの異なる胎盤（カラムＨ〜Ｌ）、白血病患者の生検から確立された３つのリンパ芽球細胞株（カラムＭ，Ｎ，Ｏ）、並びにDMD患者の生検から確立された２つの繊維芽細胞培養DRL 484及びDRL 569（T．Caskey，Baylor Collegeの提供による）（カラムＰ，Ｑ）からのDNAからBamＨＩアンプリコンを調製し、GeneScre en膜に移して指示されたプローブに対してハイブリダイズした。“％”は指示クローンに対してハイブリダイズされた３回のハイブリダイゼーション−増幅工程後にクローン化された差異生成物のBamＨＩ PARF集合体中のクローンのパーセントを示す。“＋”は、小BamＨＩ PARF対立遺伝子がサンプル中に存在した（即ちプローブがアンプリコン中の正しいサイズの帯に対してハイブリダイズした）ことを意味する。“−”は、小対立遺伝子が検出されなかったことを意味する。実際のデータのサンプルに関しては図3Cを参照。PARFsとハイブリダイズしている対立遺伝子の長さは、判っている場合には示してある。“ND”は測定しなかったことを意味する。 ^(a) ２つの異なる小対立遺伝子がヒト集団で見出された。 ^(b) ２つの異なる大対立遺伝子がヒト集団で見出された。 20の無作為選択クローンのうち、過剰物除去後に12の独特のクローンが残存し、これらの９つからの挿入物を、家系のテスター、ドライバー及び他の成員（アマン派家系884からのGM05918，GM05987（テスター），GM05901（ドライバー）， GM05961，GM05963，GM05993及びGM05995）のサザンブロットにおけるプローブとして用いた。全プローブがテスター中の小BamＨＩ断片（表２、カラムＢ）及びドライバー中の大BamＨＩ断片のみ（表２、カラムＡ）を検出した。各プローブに関するブロットハイブリダイゼーションパターンはメンデルの遺伝パターンと完全に一致した。結果は、制限エンドヌクレアーゼ断片多形現象に関するプローブの集合体が２つの関連個体間で得られることを示した。上記の実験から得られた各BamＨＩプローブを、本家系からのアンプリコン及び細胞株又は胎盤から抽出された他の10種類の非関連ヒトDNAに対するブロットハイブリダイゼーションにも用いた（表２）。本方法と全ゲノムDNAのサザンブロッティングとの間の完全一致が見出された。これらの結果は、アマン派家系内の多形現象を検出するプローブがヒト集団中の多形現象をも十分に検出するという結論を支持する。前記のようにこれらの多形現象はPARFs（多形性増幅性制限エンドヌクレアーゼ断片）と呼ばれる。 PARFsのためのプローブは、異なる生成物中で等しく十分にあるというわけではない。これらの不等性の測定値を得るために、各クローン化BamＨＩ PARFを２つの同胞の差異生成物からの個別に無作為に選択した90クローンのグリッドに対してハイブリダイズさせ、集合体中のその頻度を確定した（表２中のパーセント値参照）。計90の無作為選択要素から、20の明白な多形性プローブが認められただけであった。プロトコールは２つのほぼ等しいゲノム間の少数の差異の検出のために企画されたということに留意すべきである。多形性遺伝子座のためのプローブを慎重に捜す場合、ハイブリダイゼーション／双幅のラウンド数を減少し、代表物の複雑性を増大し、及び／又はPCRサイクルの総数を低減することによりより代表的差異生成物が生じ得る。＊＊＊以下は、別記した場合を除いて、下記の実施例に用いた典型的プロトコールである。差異分析プロトコールＩ．アンプリコンの調製１．DNAの制限ａ．ドライバー及びテスターDNA 10μｇを代表として選択した制限酵素で消化し、10Ｕ／μｇの高分子DNAを得る。ｂ．等容量のフェノール及びフェノール／クロロホルムで抽出する。ｃ．NaOAcを加えて最終濃度を0.3 Ｍとし、Et0H沈殿させて、70％EtOHで洗浄して、真空乾燥し、0.1mg／mlで再懸濁する。２．オリゴヌクレオチドの精製ａ．Sep-Paq カートリッジ（Waters，Millipro）を5ml注射器に取り付けてそれを10mlのアセトニトリル及び10mlの水で洗浄する。ｂ．２mlの水中に溶解した20 OD₂₆₀のオリゴヌクレオチドを載せて、10ml の水で洗浄し、60％ Me0Hで溶離し、Eppendorf試験管中に７分画を収集する（各試験管当たり３滴）。ｃ．λ＝260nmで200倍希釈液のDNA濃度を測定し、分画を含有するDNAを併合（約500μｌ）して、親液化により200〜300μｌまで濃縮する。ｄ．1／10容量の３Ｍ NaOAcの付加後Et0H沈殿（４容量のEtOHを使用）させて、100％EtOHで洗浄し、乾燥して、62pmol／μｌ（24-merに関しては12 OD₂₆ ₀ ／ml，12-merに関しては6 OD₂₆₀／ml）で再懸濁する。３．アダプターの結紮ａ．混合物：20μｌ（２μｇ）のドライバー又はテスターDN A消化物。 15μｌの各12-mer及び24-mer（プライマーセット１）。４μｌのddH₂O。６μｌの10xリガーゼ緩衝液。ｂ．オリゴヌクレオチドをアニーリングするために、50〜55℃に加熱中のブロック（Termoline DriBath、穴をグリセロールで充填する）中に試験管を入れ、次いで温度が10〜15℃に下がるまで、ブロックを室温に約１時間置く。ｃ．試験管を氷上に３分間置いて、２μｌ（400 Ｕ／μｌ）のT4 DNAリガーゼを付加し、12〜16℃で一夜インキュベートする。４． PCR ａ．940μｌのTE（10mMのTris-HCl，pH8.0／1mM EDTA）＋ tRNA（20μｇ／ml）緩衝液を各結紮物に加えて希釈液を作る。ｂ．テスターアンプリコンの調製のためにPCRミックスの試験管２本、及びドライバーアンプリコンの調製用試験管10本を用意し、各々以下のものを含有する： 80μｌの５×PCR緩衝液（335 mM Tris-HCl，2CでpH8．8，20mM MgCl₂， 80mM（NH₄）₂SO₄，50mM β−メルカプトエタノール，0.5ｍｇ／mlのウシ血清アルブミン）。 32μｌの追跡溶液（各々４mMのdATP，dGTP，dCTP，dTTP）。８μｌの24-merオリゴヌクレオチド（プライマーセット）。 240μｌのddH₂0。ｃ．各試験管中のDNA結紮物希釈液（80ng）40μｌを加え、試験管を72℃ でThermocycler（Perkin Elmer Cetus）に入れる。ｄ．結紮化アダプターの５’突出端を充填するために、各試験管に３μｌ（15Ｕ）のAmpli Taq DNAポリメラーゼを加え（Aero sol Brrter Pipet Tips使用）、混合して、110μｌの鉱油を上塗りし、５分間インキュベートする。ｅ．20サイクルの間増幅（95℃で１分間、72℃で３分間）し、最終サイクル後、72℃で10分間伸長する。５．アンプリコンの制限ａ．鉱油を除去し、Eppendorf試験管の２本のPCR試験管の各々の内容物を併合し、600μｌのフェノール及びフェノール／クロロホルムで抽出する。ｂ．1／10容量の３Ｍ Na0Ac及び等容量のイソプロパノールを加え、氷浴中で15分間インキュベートし、攪拌して、洗浄し、乾燥する。0.2〜0.4mg／mlの濃度でTE中にドライバー及びテスターアンプリコンを再懸濁（１本のPCR試験管から10〜20μｇのDNAアンプリコンが期待される）し、EtdBr溶液（２μｇ／ml）を用いてDNA濃度を調べる。ｃ．アダプターを切断するために最初に選択した制限エンドヌクレアーゼでドライバーDNA（200μｇ）及びテスターDNA（20μｇ）をともに消化し、上記のように抽出して、イソプロパノール沈殿させる。ｄ．約１mg／mlでTE中にドライバーアンプリコンDNA消化物を、0.2〜0.4m g／mlでテスターアンプリコンDNA消化物を再懸濁する。EtdBr蛍光及びアガロースゲル電気泳動によりドライバー及びテスターDNA濃度を測定する。ドライバーD NA濃度を0.5mg／mlに、テスターDNA濃度を0.1mg／mlに調整する。６．テスターアンプリコン上のアダプターの変化ａ．10μｇのテスターアンプリコンDNA消化物を２％NuSieveアガロースゲル（低融点。FMC Bioproducts）上に載せる。ｂ．断片を含有するアガローススライス（0.2〜0.4ｇ）を 150〜1500bpの長さに切断し、それを５ml Falcon試験管中に入れる。0.4mIの0.5 Ｍ MOPS pH7.0，0.4mlの５Ｍ NaCl及び３mlのddH₂Oを加える。ｃ．混合し、加熱ブロック中で72℃10分間融解し、この工程をもう一回反復する。ｄ．供給元の推奨通りにQiagen-tip20（Qiagen Inc.）に温溶液（30〜50 ℃）を通して、溶離し、DNA物質を沈殿させる。TE緩衝液30μｌ中にDNAペレットを溶解し、EtdBr蛍光によりDNA濃度を調べて、0.1mg／mlに調整する。ｅ．上記のように２μｇの精製テスター DNAアンプリコンDNA消化物をプライマーセット２に結紮し、TE＋tRNAで10μｇ／ml（HindIII代表物に関しては2 5μｇ／ml）まで希釈する。 II．DNAハイブリダイゼーション／増幅工程１．ハイブリダイゼーション１ａ．80μｌのドライバーアンプリコンDNA消化物（0.5mg／ml）及び40μｌの希釈テスターアンプリコン結紮物（大半の６つのカッターで作った代表物に関しては0.4μｇ，HindIII代表物に関しては１μｇ）を混合し、フェノール／クロロホルムで１回抽出する。ｂ．30μｌの10Ｍ NH₄OAc及び380μｌ（2.5容量）のEtOHを加え、-70℃で 10分間冷却し、37℃で２分間インキュベートし、攪拌して、70％EtOHで２回洗浄し、乾燥する。ｃ．２分間攪拌しながら４μｌのEE×３緩衝液（Sigma社からの30mM EPPS ，20℃でpH8.0，３mM EDTA）中にペレットを再懸濁し、サンプルを底まで攪拌して、35μｌの鉱油を上塗りする。ｄ．加熱ブロック中で98℃で３〜４分間DNAを変性させて、注意深く５Ｍ NaCl １μｌをDNA滴に加え、67℃で20時間インキュベートする。２．選択的増幅ａ．油を除去し、tRNA溶液（５mg／ml）８μｌを加え、混合して、TE緩衝液390μｌを加えて再び混合する。ｂ．アダプター端を充填するために、360μｌのPCR混合物（上記）を有するが24-merプライマーは含まない試験管２本を用意する。各試験管に40μｌのハイブリダイズ化DNA希釈液を加え、72℃のThermocycler中に入れ、３μｌのAmpli Taq DNAポリメラーゼを加えて、混合し、５分間インキュベートする。10μｌの2 4-merプライマー（セット２）を加え、混合して、鉱油を上塗りし、上記のようにPCRの10サイクルを実行する。J Bgl 24プライマーに関しては、より低いアニーリング温度（70℃）を要する。ｃ．上記のようにフェノール及びフェノール／クロロホルム抽出し、イソプロパノール沈殿させて、各試験管中のペレットを20mLのddH₂Oに溶解し、併合する。ｄ．20μｌの増幅差異生成物１をとり、20μｌの２×緑豆ヌクレアーゼ緩衝液及び２μｌの緑豆ヌクレアーゼ（10Ｕ／μｌ，NEB）を加えて、30℃で30分間インキュベートする。160μｌの50mM Tris-HCl，pH8.9を加え、98℃で５分間インキュベーションにより酵素を不活性化する。J 24-merプライマーを含有する PCRミックス（360μｌ）を有する２本の試験管を調製し、各試験管に40μｌのMB N処理差異生成物を加えて、上記のようにPCRを15サイクル実施する。ｅ．２％アガロースゲル上で増幅物10μｌを処理し、DNAの量（通常は0.1 〜0.3μｇ）を概算して、収量を改善する必要がある場合には、３μｌの新鮮なA mpliTaq DNAポリメラーゼ付加後にさらに２〜４サイクル実施する。３．差異生成物上のアダプターの変化ａ．上記のようにフェノール及びフェノール／クロロホルム抽出し、イソプロパノール沈殿させて、約0.2mg／mlでペレットを溶解する。EtdBr蛍光により DNA濃度を調べて、0.1mg／mlまでに調整する。ｂ．差異生成物を選択した制限酵素（10Ｕ／μｇ）で消化し、上記のように抽出してEt0H沈殿させ、洗浄し、乾燥して、20ng／μｌで溶解する。ｃ．10μｌ（200 ng）のDNA溶液をとり、上記のように容量60μｌ中でアダプター３（プライマーセット３）に直接結紮する。結紮差異生成物をtRNAを含有する100μｌ（HlndIIIに関しては20μｌ）のTE緩衝液で1.25ng／μｌ（HindII I代表物に関しては2.5 ng／μｌ）まで希釈する。４．その後のハイブリダイゼーション／増幅工程ａ．二次ハイブリダイゼーションのために、40μｌ（50ng）のアダプター結紮差異生成物（HindIII代表物に関しては100 ng）及び80μｌ（40μｇ）のドライバーアンプリコンDNA消化物を混合する。上記のようにハイブリダイゼーション／増幅工程を進行させる。ｂ．第三ハイブリダイゼーション／増幅工程のために、アダプター２に結紮された100 pgの差異生成物２（HindIII代表物に関しては400 pg）をとり、20 （HindIII代表物に関しては25）サイクルの間のMBN処理後に最終増幅を行なう。ｃ．HindIII代表物に関しては、時折第四ハイブリダイゼーション／増幅工程を要する。アダプター３に結紮される5 pgの差異生成物３をとり、27サイクルの間増幅する。 III．差異生成物のクローニング及び分析１．クローニングａ．最終ハイブリダイゼーシヨン／増幅工程後に10μｇの差異生成物をとり、選択制限酵素で消化し、フェノール及びフェノール／クロロホルムで抽出して、エタノール沈殿させる。ｂ．得られたDNAを100μｌのTAE緩衝液中に溶解し、上記のように２％低融点（LMP）ゲル電気泳動及びDNA精製を実施する。ｃ．消化差異生成物を30μｌのTE緩衝液中に溶解し、濃度を調べてアリコート（２〜５μｇ）をTE緩衝液を含有するtRNAで10ng／mlまで希釈する。ｄ．プラスミドベクター中で差異生成物を結紮するために、以下のものを混合する：１μｌのl0xリガーゼ緩衝液。６μｌのddH₂O。１μｌ（10ng）のゲル精製差異生成物DNA消化物。１μｌ（40ng）の選択制限酵素で消化され、脱リン酸化されたあらゆる pUC由来ベクター。１μｌ（400Ｕ）のT4 DNAリガーゼ。 16℃で１〜３時間インキュベートし、TEを含有するtRNA 70μｌを加えて希釈する。ｅ．標準方法でコンピテントDH 5α細胞を形質転換する。アンピシリン、Ｘ-Gal及びIPTGを含有するLB寒天上に置く。２．クローン化挿入物のPCR増幅ａ．各々100μｌの標準PCR混合物、並びにシーケンシング及び逆シーケンシングプライマー（それぞれseq，24及びrev．25。表を参照）（試験管当たり各々500pmol）を含有するPCR試験管を調製する。ｂ．１つの白色細菌コロニーを各試験管中に選択して移し、攪拌して、95℃で５分間Thermocycler中に入れる。ｃ．72℃に切り替えて温度を下げて、１μｌ（５Ｕ）のAmpliTaqポリメラーゼを加えて、混合し、鉱油を上塗りして、PCRを30サイクル実施し（95℃で１分間、72℃で３分間）、72℃で10分間最終伸長を行なう。ｄ．５μｌのアリコートの２％ゲル電気泳動処理により増幅断片の収量及びサイズを分析する。Qiagen-tip20クロマトグラフィーにより選択DNA断片を精製し、イソプロパノール沈殿させて、洗浄し、乾燥して30μｌのTE中に溶解する。ｅ．EtdBr蛍光によりDNA濃度を測定する。プロットハイブリダイゼーションのために、TE緩衝液を含有するtRNAを用いて１〜２μｇの各断片を10μｇ／ml まで希釈する。実施例３：癌における遺伝子増幅を検出するDNAプローブを単離するためのRDA の適用腫瘍DNAをテスターとして選択し、ヒトからの正常DNAをドライバーとして選択した場合、RDAは、腫瘍DNA中の増幅配列に対してハイブリダイズする差異生成物を生じた。これは予想外の結果、おそらくはRDA中の動的濃縮の結果である。ヒト癌における増幅配列を検出するプローブは、このような配列の存在が通常は不十分な予後を示すため、臨床的価値がある。例えば、Ｎ−myc又はNEU腫瘍遺伝子の増幅はそれぞれ神経芽細胞腫又は乳癌に関する不十分な予後を示す。差異生成物は、黒色腫細胞株からのDNA又は小細胞肺癌細胞株からのDNAをテスターとして、個々のドナーからのDNAをドライバーとしてそれぞれ用いた場合に見出された。黒色腫の第一、第二及び第三ラウンド減数に関する差異生成物を電気泳動分離処理し、その結果を図１の右手パネルのレーンａ，ｃ及びｅに示す。肺癌の第一、第二及び第三ラウンド減数に関する差異生成物をレーンｂ，ｄ及びｆに示す。サイズマーカーはレーンｇにあって、右に示した塩基対の長さを有する。黒色腫細胞株はAH-Melであり、小細胞癌細胞株はA1770であった。差異生成物のいくつかをゲノムプロットの核酸ハイブリダイゼーシヨンプローブとして又は種々の癌細胞株からの制限エンドヌクレアーゼ切断ヒトDNAとして用いた場合、それらは小細胞癌細胞株（上部パネル。図１の左側）又は黒色腫細胞株（中及び下部パネル。図１の左側）中で増幅された配列を検出した。小細胞癌細胞株のRDA分析から得られるプローブも、神経芽細胞腫細胞株IMR-5（上部パネル。左側）中の増幅配列を検出した。RDAプローブを確定して、それらをNIGMSヒト遺伝子突然変異体細胞貯蔵所Human Genetic Mutant Cell Repositoryから得られた単一染色体ハイブリッド細胞＃２のパネルに対してそれらをハイブリダイズすることにより、ヒト第二染色体（小細胞肺癌）及び第三染色体（黒色腫）に対してマッピングした。第三染色体上の増幅は従来記載されていない。次に、ドライバーDNAはテスターと同一個体から得られる必要はないことを確定した。テスターとして黒色腫細胞株殻のDNAを用い、ドライバーとして適合する個々のドナー、不適合個体又は10名の不適合個体のプールからのDNAを用いて、RDAを実施した。ドライバーDNAを用いても用いなくても、同一パターンの差異生成物が見出された（図２参照）。したがって、テスター及びドライバーDNAは、テスター中に存在する増幅DNAを検出するプローブを探索中である場合には、同一個体からドライバーDNAをＬ必要はない。実施例４：新規のウイルスを発見するためのＲＤＡの使用 RDAを用いてヒト前立腺癌生検物を分析した。前立腺癌の外科的生検物から抽出したDNAをテスターとして用い、同一個体の正常組織からのDNAをドライバーとして用いた。単一差異生成物を得て、シーケンシングした。コンピューター分析は、この差異配列が、ラットゲノム全体に散在して見出される反復配列の一員であるラットLINE要素と最も密接に対応することを立証した（配列比較のために図３参照）。この要素の極左手及び右手配列から得られるオリゴヌクレオチドPCRプライマーを用いて、種々のDNA中のその存在を立証した。その存在はラットDNA、及びヒト前立腺癌の２つの異なる領域中で検出されたが、しかし癌が発生したヒトの正常組織からのDNA中には検出されなかった。したがって、ラットからの遺伝情報は、おそらくウイルスの作用を介して、ヒト組織中に見出された。この考え得るウイルスのDNA配列は、挿入された要素からの“染色体歩行”により得られる。この癌の病因におけるこのウイルスの原因的役割が推論される。実施例５：癌における遺伝子病変を検出するプローブを単離するためのRDAの使用純粋な又はほぼ純粋な（＞90％）癌細胞からのDNAをテスターとして用い、それぞれの患者の正常細胞からのDNAをドライバーとして用いて、多数の差異生成物を得た。これらの差異生成物は、Ｙ染色体上のヘテロ接合性の欠落、ヘミ接合性欠落、又は腫瘍DNA中のホモ接合欠落を検出した。RDAからのプローブをヒト染色体に対してマッピングした。その結果を表３に要約する。テスターとして、患者＃758からの４つの異なる腎細胞癌細胞株UOK114，UOK124，UOK132及びUOK112 からのDNA並びに１つの食道ガン生検物からのDNAを用いた。あるプローブRCC124 .1（表３の脚注ｄ）は、１つの別の腎癌細胞株及び２つの膀胱癌細胞株中の第二染色体上のホモ接合性欠落を検出した。さらにあるプローブRCC132.12（表３の脚注ｅ）は２つの黒色腫で第九染色体上にホモ接合性欠損を検出した。あるプローブBAR.6（表３の脚注ｆ）は、いくつかの結腸癌細胞株から第三染色体上のホモ接合性欠落を検出した。ホモ接合性欠落を検出するプローブは、腫瘍抑制遺伝子をコードする遺伝子座を限定するのに有用である。腫瘍抑制遺伝子の機能の欠落を検出する方法は、癌の臨床的類型化に有用である。ａ．異なる挿入物サイズを有するクローン。ｂ．括弧内の記載事項（ｘ／ｙ／ｚ）は、欠落のタイプによる断片の分布を示す。この場合、ｘはホモ接合性欠落を検出するプローブの数であり、ｙはヘテロ接合性の欠落を検出する数、zはＹ染色体からのヘミ接合性欠落を検出する数である。ｃ．プローブの染色体位置で、ｘ／・・・の場合はホモ接合性欠落を検出するプローブの位置であり、／ｘはヘテロ接合性の欠落を検出するプローブの位置である。NDは未確定であることを意味する。ｄ．プローブRCC124.1は、膀胱癌細胞株におけるホモ接合性欠落を検出する。ｅ．あるプローブRCC132.12は、黒色腫患者の第九染色体上のホモ接合性欠落を検出した。ｆ．プローブBAR.6は、７つの結腸癌細胞株のうちの４つ及び１つの膀胱癌細胞株におけるホモ接合性欠落を検出する。実施例６：個体のプールからのDNAの分析のためのRDAの適用ヒトにおける疾病の疑い又は行動異常といったような遺伝形質と遺伝子的に連鎖する多形現象の発見のために、RDAを用い得る。このためにRDAを利用するには、テスター、ドライバー又はその両方として用いるための一群の個体からのDNA のプールを用いるのが望ましい。この方法を用いる場合、RDAは、ある群には存在するが別の群には存在しない多形対立遺伝子を検出するプローブを産生し得る。特にこのようなプールをドライバーとして用いる場合には、RDAはドライバープール中の全個体からテスターを識別する制限エンドヌクレアーゼ多形現象のためのプローブ（PARFs）を産生する。プールをテスターとして用いる場合、RDAはドライバー個体からテスタープールの少なくとも一員を識別するPARFsを産生する。最も挑戦的な例ではテスター及びドライバーの両方が個体の群からのプールDNAである場合、RDAはドライバー群の全員からテスター群の少なくとも一員を識別するPAR Fsを産生する。これを表４に説明する。ヒトの２つの群を選択した：即ち遺伝的異常であり、バッテン病としても公知のニューロン性セロイドリポフスチン沈着症を共有した 10名とこの症状を有さなかった10名であった。各個体の細胞からDNAを調製し、適宜プールした。テスターとして一群からのDNAを用い、ドライバーとして他の群からのDNAを用いるRDAのためにDNAのプールを用い、次いでその逆の手順を実施した。各々の場合に、PARFsを検出する差異生成物を得た。表４には、プローブ名を列挙し、“＋”はそれが指定個体におけるPARFの小対立遺伝子を検出することを意味する。表に示すように、テスターとして正常個体を用いた場合は、その群の少なくとも一員において小PARF対立遺伝子を検出するプローブ（pA１，pA ２，pA４及びpA９）が得られ、この対立遺伝子はバッテン病患者では常に不在であった。同様に、罹患群からのDNAをテスターとして用いた場合は、罹患群の少なくとも一員において小PARF対立遺伝子を検出するプローブ（pN２，pN７，pN９，pN13及びpN15）が得られ、この対立遺伝子は正常群では常に不在であった。表４：20のヒトDNAアンプリコン中のBglII PARFの存在に関するスクリーニング実施例７：RNA集団における差異を反映するプローブを得るに際してのRDAの使用 RDAを適用してRNA由来の二本鎖cDNAの集団を比較することができる。差異生成物は、別の供給源中では等価に発現されないある供給源からのRNAの中で発現される配列を検出するプローブを産生する。このようなプローブは時々診断（例えば細胞の起源を調べるための、又は感染の証拠を見出すための）に用いられ、重要な組織特異的又は疾患関連遺伝子の発見をもたらし得る。雄マウス脳から抽出したRNAから二本鎖cDNA集団を調製した。これをドライバーとして用いた。大腸菌E．coliプラスミドによりコード化されるカナマイシン耐性遺伝子からの100／1000部の二本鎖DNAをこのcDNAの小部分に付加し、これをテスターとして用いた。このモデル系は、２つの供給源からの発現RNA間の単一小差異の場合を模倣するものである。酵素Sau3Aを用いてこれら２つのサンプルでRDAを実施してそれぞれのアンプリコンを調製した。図４に示すように、２ラウンドの減数後の差異生成物をゲル電気泳動を用いて分離した。左手レーンには 1.2kbのカナマイシン遺伝子から調製されたアンプリコンの電気泳動分離を示す。真ん中のレーンは、サイズマーカーである。RDAからの差異生成物は右手レーンに認められる。この生成物は、ブロットハイブリダイゼーションにより示されるようにカナマイシン遺伝子から得られ、したがってRDAを用いてRNA集団殻得られるDNAにおける差異を検出できることを示している。２つの関連するゲノム間の配列差異を同定するために用い得るプローブを単離するための強力な道具が提供されたということは上記の結果から明らかである。本技術は、法医学、病原性DNAの存在の検出、腫瘍細胞中に生じる病変、遺伝的カウンセリング、遺伝子疾患に関連した遺伝子の存在等に関する広範な種々の情況に用い得る。本明細書中に引用した出版物及び特許出願はすべて、各々の個々の出版物又は特許出願が特に又は個別に参照により組み込まれることが示されているように、参照により本明細書中に含めるものとする。外国の発明は理解し易くするために説明及び実施例により多少詳細に記載したが、しかし添付の請求の範囲の精神又は範囲を逸脱しない限りある種の変更及び修正をなし得ることは、当業者には公知である。

Claims

【特許請求の範囲】１．２つの関連する異なる真核性供給源からのDNA間の少なくとも１つの配列差を識別することができるプローブの製造方法であって、上記２つの異なる供給源（ここで、上記供給源の１つはドライバーDNAであり、他の供給源はテスターDNAであって、上記テスターDNAは標的DNAを包含し、上記標的DNAは上記２つの供給源のDNA間の配列差を包含する）からのDNAを別々に制限エンドヌクレアーゼで実質的に完全に消化して消化断片を用意し；第一組のアダプターを上記消化断片に連結し、上記第一組アダプターの鎖の１つに対するプライマーを用いて上記断片を増幅してアンプリコンとして約２kbp 未満の上記消化された配列の増幅された量の断片を用意し；標的DNAの濃縮のために以下の工程の第一ラウンドを実施し；上記アンプリコンから上記第一組のアダプターを除去し、第二組のアダプターをテスターDNAのアンプリコンの５’末端に連結し；融解及びアニーリング条件下で上記テスターアンプリコンを大過剰量のドライバーアンプリコンと結合させ、それによってその結果生じるdsDNAの一部は標的D NAを含む自己アニール化テスターDNAを包含し；アニール化DNAの３’末端をフィルインし；上記dsDNAを上記第二組のアダプターの上記鎖の１つと相補的なプライマーで増幅して標的DNAを濃縮し；任意に第二ラウンド又は継続ラウンドとして上記第一ラウンドを反復して上記テスター供給源及び上記ドライバー供給源間のDNA配列における差異を同定するのに役立つDNA配列を提供する工程；を含んで成る方法。２．上記フィルイン後の、ヌクレアーゼによる一本鎖DNAの消化の別の工程を含む請求項１記載の方法。３．上記第一ラウンドの工程が少なくとも１回反復される請求項１記載の方法。４．異なる組のアダプターが少なくとも最初の３ラウンドの間用いられる請求項３記載の方法。５．上記消化が、少なくとも６つのヌクレオチドの認識配列を有しジグザグ（ staggered）切断を提供する制限エンドヌクレアーゼによるものである請求項１記載の方法。６．DNAの供給源が関連のあるヒト個体又は同一個体からの細胞である請求項１記載の方法。７．上記２つの関連供給源からの上記DNAがcDNAである請求項１記載の方法。８．上記２つの関連供給源の少なくとも１つからの上記DNAが複数の個体関連供給源からプールされたDNAである請求項１記載の方法。９．２つの関連する細胞供給源からのゲノム間の少なくとも１つの配列差を識別することができるプローブの製造方法であって、上記２つの異なる供給源（ここで、上記供給源の１つはドライバーDNAであり、他の供給源はテスターDNAであって、上記テスターDNAは標的DNAを包含し、上記標的DNAは上記２つの供給源のゲノム間の配列差を包含する）からのDNAを別々に少なくとも４つのヌクレオチドのヌクレオチド認識配列を有する制限エンドヌクレアーゼで実質的に完全に消化し；第一組のアダプターを上記消化断片に連結し、上記第一組アダプターの鎖の１つに対するプライマーを用いて上記断片を増幅してアンプリコンとして約２kbp未満の上記消化配列の増幅量の断片を用意し；標的DNAの濃縮のために以下の工程の第一ラウンドを実施し；上記アンプリコンから上記第一組のアダプターを除去し、第二組のアダプターをテスターDNAのアンプリコンの５’末端に連結し；融解及びアニーリング条件下で上記テスターアンプリコンを大過剰量のドライバーアンプリコンと結合させ、それによってその結果生じるdsDNAの一部は標的D NAを含む自己アニール化テスターDNAを包含し；３’オーバーハングをフィルインし；上記dsDNAを上記第二組のアダプターの上記鎖の１つに対するプライマーで増幅して標的DNAを濃縮し；上記２ラウンドの間各連続ラウンドに異なる組のアダプターを用いて少なくとも２ラウンドの間上記第一ラウンドの工程を反復して優勢な量の標的DNAを包含するDNA組成物を用意し；上記DNA組成物をクローニングして推定される標的DNAの実質的に均質なプローブを有するクローンを用意するが；但し推定される標的DNAの複数のプローブが得られる場合には、任意に別の工程を含み；推定される標的DNAをドライバー及びテスターアンプリコンでハイブリダイズし、それによりドライバー及びテスターアンプリコンの両方と結合している推定標的DNAのプローブが捨てられる工程を含んで成る方法。 10．上記関連するヒト細胞供給源が同一個体からであり病原の疑わしい存在に関しては異なっている請求項９記載の方法。 11．上記関連ヒト細胞供給源が同一個体からであり遺伝的病変の疑わしい存在に関しては異なっている請求項９記載の方法。 12．上記関連ヒト細胞供給源が異なる個体からである請求項９記載の方法。 13．腫瘍性細胞供給源及び関連する正常細胞供給源からのゲノム間の少なくとも１つの配列差を識別することができるプローブの製造方法であって、上記２つの供給源（ここで、上記正常細胞供給源はドライバーDNAであり、上記腫瘍性細胞供給源はテスターDNAであって、上記テスターDNAは標的DNAを包含し、上記標的DNAは標的DNAを限定する挿入、欠失、転位又はDNA増幅の少なくとも１つを包含する上記２つの供給源のゲノム間の配列差を包含する）からのDNA を別々に少なくとも４つのヌクレオチドのヌクレオチド認識配列を有する制限エンドヌクレアーゼで実質的に完全に消化し；第一組のアダプターを上記消化断片に連結し、上記第一組アダプターの鎖の１つに対するプライマーを用いて上記断片を増幅してアンプリコンとして約２kbp 未満の上記消化配列の増幅量の断片を用意し；標的DNAの濃縮のために以下の工程の第一ラウンドを実施し；上記アンプリコンから上記第一組のアダプターを除去し、第二組のアダプターをテスターDNAのアンプリコンの５’末端に連結し；融解及びアニーリング条件下で上記テスターアンプリコンを大過剰量のドライバーアンプリコンと結合させ、それによってその結果生じるdsDNAの一部は標的D NAを含む自己アニール化テスターDNAを包含し；オーバーハングの３’末端をフィルインし；上記dsDNAを上記第二組のアダプターの上記鎖の１つに対するプライマーで増幅して標的DNAを濃縮し；各連続ラウンドにおける前ラウンドに関しては異なる組のアダプターを用いて少なくともさらに１ラウンドの間上記第一ラウンドの工程を反復して優勢な量の標的DNAを包含するDNA組成物を用意し；上記DNA組成物をクローニングして標的DNAの実質的に均質なプローブを有するクローンを提供する工程；を含んで成る方法。 14．腫瘍性細胞供給源及び関連する正常細胞供給源からのゲノム間の少なくとも１つの配列差を識別することができるプローブの製造方法であって、上記２つの供給源（ここで、上記腫瘍性細胞供給源はドライバーDNAであり、上記正常細胞供給源はテスターDNAであって、上記テスターDNAは標的DNAを包含し、上記標的DNAは標的DNAを限定するためのヘテロ接合性の欠落、ホモ接合性又はヘミ接合欠落を包含する上記２つの供給源のゲノム間の配列差を包含する）からのDNAを別々に少なくとも４つのヌクレオチドのヌクレオチド認識配列を有する制限エンドヌクレアーゼで実質的に完全に消化し；第一組のアダプターを上記消化断片に連結し、上記第一組アダプターの鎖の１つに対するプライマーを用いて上記断片を増幅してアンプリコンとして約２kbp 未満の上記消化配列の増幅量の断片を用意し；標的DNAの濃縮のために以下の工程の第一ラウンドを実施し；上記アンプリコンから上記第一組のアダプターを除去し、第二組のアダプターをテスターDNAのアンプリコンの５’末端に連結し；融解及びアニーリング条件下で上記テスターアンプリコンを大過剰量のドライバーアンプリコンと結合させ、それによってその結果生じるdsDNAの一部は標的D NAを含む自己アニール化テスターDNAを包含し；オーバーハングの３’末端をフィルインし；上記dsDNAを上記第二組のアダプターの上記鎖の１つに対するプライマーで増幅して標的DNAを濃縮し；各連続ラウンドにおける前ラウンドに関しては異なる組のアダプターを用いて少なくともさらに１ラウンドの間上記第一ラウンドの工程を反復して優勢な量の標的DNAを包含するDNA組成物を用意し；上記DNA組成物をクローニングして標的DNAの実質的に均質なプローブを有するクローンを用意する工程；を含んで成る方法。 15．請求項１記載の方法に従って調製される少なくとも２つのプローブを包含するキット。 16．請求項９記載の方法に従って調製される少なくとも２つのプローブを包含するキット。 17．請求項13記載の方法に従って調製される少なくとも２つのプローブを包含するキット。 18．請求項14記載の方法に従って調製される少なくとも２つのプローブを包含するキット。