JPH05508305A - 非特異的ｄｎａ増幅 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 非特異的ＤＮＡ増幅 本発明は、１９８８年６月１７日に提出された通しＮｏ、２０８．５１２の「Ｄ ＮＡ増幅および控除（ｓｕｂｓｔｒａｃｔｉｏｎ）技術」に関する米国特許出願 の一部継続である。

発明の分野 本発明は、非特異的ＤＮＡ増幅の方法に、そしてｃＤＡＮ選択方法への適用に関 する。

参考文献 ０　（＋９８５） Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉ、Ｐ、ら、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６２．　１５ ６−１５９　（１９８７）Ｈａｍｅｓ、　Ｂ、Ｄ、およびＨｉｇｇｉｎｓ、　Ｓ 、Ｊ、編、”Ｎｕｃｌｅｉｓ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：　Ａ　 Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、”　ｒＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏ ｒｄ　（１９８５）Ｋａｒｉｎ、　Ｍ、、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃｄ　Ｓｃ ｉ　ＵＳＡ　８１．　ｐ、５４９４　（＋９８４）Ｋｉｙｏｋａｗａ、Ｔ、ら、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１．　６２０２−６２０ ６　（１９８４）Ｋｏｈｎｅ、Ｄ、Ｅ、、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６ （２と９．５３２９　（１９７７）ＬｅＢｅａｕ、Ｍ、Ｍ、、ら、　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８４．　ｐ、５９１３　（１９８７） ｆＨｃｃｉａｒｄ、Ｒ，Ｐ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　７６、　４９２７−４９３１　（１９７９）Ｓａｇａｔａ、Ｎ、ら、 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．　６７７−６８ １　（１９８５）Ｓｃｈａｒｆ、Ｓ、Ｊ、、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３３．　ｐ 、＋０７６　（１９８６）Ｓｃｈｒａｄｅｒ、Ｊ、Ｗ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３．　ｐ、　２４５８　（１９８６） Ｓｅａｌｅｙ、Ｐ、Ｇ、、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３．　 ｐ、１９０５　（１９８５）Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｒ，ら、Ｎａｔｕｒｅ　 ３３６．　ｐ、１６４　（１９８８）Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｊ、、ら、Ａｎａｌ　 Ｂｉｏｃｈｅｍ　３０３．　ｐ、３３４　（１９８７）Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，Ａ、 およびＲＪ、　Ｄａｖｉｓ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ　８０．　１１９４−１１９８　（１９８３）。

発明の背景 接圧（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）ゲノム領域に相同であるｃＤＡＮＤＮＡラグメン トしそしてクローン化できることは、医学における重要な適用性を有する。１つ の例として、既知のしかし未だ位置が決定されていない、疾病を引き起こす遺伝 子を含むＤＮＡセクションに全て相同であるｃＤＡＮｓを単離すると、その遺伝 子およびフランキング遺伝子の単離となるであろう：この分析は、疾病を引き起 こす遺伝子の位置の決定方法および分析を容易にするであろう。第二の重要な適 用は、既知のマーカーに連結する新たな遺伝子を同定できることである。

もう１つの例として、２つの関連しているウィルスの間の相同性は、第一ウィル スのゲノムに、第二ウィルスに感染した細胞型から得られるｃＤＮＡｓを結合し 、次いで第一ウィルスゲツムに相同であるそれらのｃＤＡＮ配列を単離すること により利用され得る。

医学研究への重要な適用性を有するもう１つのハイブリッド形成方法は、２つの 異なる生物学上の源、例えば、細胞型、または活性化もしくは発生の異なる段階 での細胞型に共通であるかまたは独特であるゲノムまたはｃＤＮＡフラグメント の選択を包含する。

それらの、ゲノムＤＮＡ材料へのハイブリッド形成に基づきｃＤＮＡｓを得る標 準方法は、しばしば、特にハイブリッド形成段階から得られる多数の異なる配列 フラグメントをクローニングすることを望む時に、入手てきるゲノムＤＮＡまた はｃＤＮＡ材料の量に制限される。この制限は、ハイブリッド形成溶出混合物中 の存在率（ａｂｕｎｄａ、ｎｃｅ）か非常に低い多数のフラグメントの損失とな り得る。

発明の概要 それ故、本発明の１つの目的は、挟在ゲノムＤＮＡの領域に相同であるそしてｃ ＤＮＡ種の混合物から選択されるｃＤＮＡ種をクローニングする方法を提供する ことである。この方法は、挟在ゲノムＤＮＡの興味のある領域を得そして末端ブ ライミング配列を含むｃＤＡＮ種を調製することを包含する。一本頑ｃＤＮＡ種 を、それらの、挟在ゲノムＤＮＡの領域へのハイブリッド形成に基つき単離する 。これらの単離した一部１１ｃＤＡＮ種を、ＤＮＡポリメラーゼ、４つ全てのデ オキシリボヌクレオチドトリホスファート、およびｃＤＡＮ末端ブライミング配 列に相同なプライマーと混合する。この混合物を次いで一重鎖ｃＤＮＡ種の、配 列に無関係な増幅を引き起こす条件下に反応させる。この反応から生じる増幅し たｃＤＮＡ種をベクターにクローニングする。

本発明の方法は、第二ｃＤＡＮ分子単離工程をも包含し得る。−重鎖ｃＤＡＮ分 子を、それらの、選択したゲノムフラグメントの第一セットに対する相同性に基 づいて単離し次いで増幅する。増幅したｃＤＮＡ種を変性させそして一重鎖ＣＤ ＡＮ種の新たなセットを、それらの、選択したゲノムフラグメントの第二セット に対するハイブリッド形成に基づいて単離する。例えば、ｃＤＡＮ種を、濃縮の ために選択したゲノムフラグメントの第一セットに対して再ハイブリッド形成す るか、または、ゲノムフラグメントの異なるセットに対してハイブリッド形成し てｃＤＡＮ種のサブセットを選択することができる。

末端ブライミング配列を含むｃＤＮＡ種を調製する際に、上記方法はさらに、配 列に無関係な増幅によるｃＤＡＮ種の増幅を包含し得る。

上記方法における接圧ＤＡＮの領域は、興味のある既知の遺伝子または領域を含 み得る。興味のある既知の遺伝子または領域を含むＤＡＮフラグメントは次のよ うにして得られ得る。興味のある領域を含むＤＮＡ部分をサイズ分別し、既知の コードを含むフラクションを同定し、そして同定したフラクションからのＤＮＡ を単離する。興味のあるＤＮＡフラグメントを同定する１つの方法は、興味のあ る領域中の配列に相同であるプライマーの存在下でのプライマー開始増幅による 。この単離したＤＡＮを次いで＃ＩＦ！ｉエンドヌクレアーゼで消化して興味の ある領域を多数のより小さいフラグメントに切断することができる。

上記方法の１つの実施態様において、接圧ゲノムＤＡＮセクションを保持体に結 合する。

接圧ゲノムＤＡＮセクションが、ＤＮＡの大きいセグメント、例えば、酵母人工 染色体をクローニングするために、当業者に知られている多数のクローニングベ クター中に含まれ得ることか認識されるであろう。

上記方法の１つの実施態様は、ウシ白血病ウィルスゲノムからの接圧ゲノムＤＡ Ｎセクションおよび細胞系１０Ｃ９から得られるウィルスに感染した細胞系から 得られるｍＲＮＡから作製されたｃＤＡＮライブラリーを利用する。

上記方法のもう１つの適用は、興味のある既知の遺伝子または領域と同一の染色 体領域中に位置している遺伝子に対応するｃＤＡＮｓを同定する手段を含む。

既知の遺伝子または領域を含むゲノムＤＡＮ領域を含むフラグメントは、既知の 遺伝子を含むゲノムＤＡＮフラグメントの予備サイズ分別により得られ得る。興 味のあるＤＡＮフラグメントを同定する１つの方法は、既知の遺伝子に相同なプ ライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および４つ全てのデオキシリボヌクレオチドを 、ゲルマトリックスに添加しそして当該ゲルマトリックスをプライマーによって 定められる既知の遺伝子の領域の増幅を促進する条件下に処理することによる。

配列に無関係な増幅のためのプライマーとして有用であるリンカ−を次いてその 末端に連結する。分子の末端上の余分のリンカ−は、適当な制限酵素で消化する ことによって除去され得る。ＤＮＡフラグメントをＤＡＮポリメラーゼ、４つ全 てのデオキシリボヌクレオチド、およびＤＮＡフラグメントの末端上に存在する リンカ−に相同なプライマーと混合し、そしてＤＡＮフラグメントの配列に無関 係な増幅を引き起こす条件下に反応させる。

上記方法は、次のものを含む、成長因子遺伝子および成長因子受容体遺伝子のよ うな既知の遺伝子を含むゲノムＤＡＮ領域のために使用され得る。インターロイ キン（例えば、ＩＬ−５およびＩＬ−３）、ＧＭ−ＣＳＦ、およびエリトロポエ チン。これらの遺伝子の各々を用いて、適当なｃＤＡＮライブラリー、例えば、 ＩＬ−５を用いた時はＴ−細胞ｃＤＡＮライブラリー、または、エリトロポエチ ンを用いた時は腎ｃＤＡＮライブラリーを選択する。

本発明のこれらのおよび別の目的ならびに特徴は、本発明の以下の詳細な説明が 、添付する図面と関連して読まれる時により十分に理解されるであろう。

図面の簡単な説明 図１は、本発明の二重（ｄｏｕｂｌｅ）増幅方法のフローチャートである：図２ Ａ〜２Ｃは、平滑末端二重フラグメント（実線）の向かい合っている末端に付着 後の、本発明を実施する際に使用する３つの典型的なリンカ−の配列を示してい る。

図３は、本発明を実施する際に、増幅ｃＤＮＡフラグメントをビオチン化（ｂｉ 。

ｔｉｎｙｌａｔｉｎｇ）する１つの方法を説明している；図４は、１つのフラグ メント源に独特であるＤＮＡフラグメントを単離する本発明の方法のフローチャ ートである。

図５は、与えられたウィルス剤に感染した個体に独特である、ＲＮＡ誘導配列を 単離するために適用された、図４に示される単離方法を説明している：図６は、 感染した動物からの胆汁中のＥＴ−ＮＡＮＢウィルス剤の存在を確認するために 、および、感染した個体中のウィルス剤の存在をアッセイするために使用される 時の、図１の増幅方法を説明している；図７は、染色体５のサブ領域中の潜在的 成長因子／受容体遺伝子の区域帰属を示している。次の名称が使用されている： ＣＳＦ−ＧＭ、顆粒細胞−マクロファージコロニー刺激因子：ＣＤ　１４．　単 球の表面マーカーである抗原をコード化する；Ｉ　Ｌ−３，多コロニー刺激因子 ； ＩＬ４．　Ｂ細胞成長因子： ＩＬ５．　Ｔ細胞置換因子； ＰＤＣ；ＦＲ，血小板誘導成長因子受容体。

ＡＤＲＢＲ，β−２アドレナリン受容体：ＦＧＦＡ、　繊維芽細胞成長因子： Ｃ５ＦＩＲ，Ｃ５ＦＩ受容体（プロトオンコジーンＣ−エエりＣ３Ｆ　１．　マ クロファージコロニー刺激因子；図８は、ヒトＩＬ−５遺伝子を含むヒト染色体 ５の領域から得られる小さい増幅ゲノムフラグメントの調製における工程を示し ている；図９Ａおよび９Ｂは、輪郭圧迫（ｃｏｎｔｏｕｒ−ｃｌａｍｐｅｄ）均 一電場（ＣＨＥＦ）ゲル上に分別されたＮｏｔｌで消化したＨＨＷ１０５ハムス ター／ヒト雑種細胞系からの単離ゲノムＤＮＡ　（９Ｂ）　、および！Ｌ−５特 異的プライマーで増幅した試料生成物（９Ｂ）を示している： 図」Ｏは、アガロースゲル上で分別されたＩＬ−５−特異的プライマーによって 増幅したフラグメントのサザンプロットを示している；図１１は、ｒＬ−５コー ド領域を取り囲んでいる染色体５領域から得られるゲノムフラグメントの非特異 的増幅生成物のアガロースゲル分別である；図１２は、図１１からのゲノムＤＮ Ａフラグメントでハイブリッド形成したＴ細胞ｃＤＮＡ’　ｓのアガロースゲル 分別である；図１３は、アクチン、ＩＬ−３およびＩＬ−５コード領域に特異的 なプローブを含む種々のプローブへの、ヒト染色体５のＩＬ−５領域に対する相 同性に基づいて単離されたＴ細胞ｃＤＮＡ’　ｓのハイブリッド形成を示してい る；図１４は、ｌ−３、ＧＭ−Ｃ３Ｆおよびアクチンコード領域に特異的なプロ ーブを含む種々のプローブへの、および完全なヒトゲノムＤＮＡのためのプロー ブへの、ヒト染色体５のＩＬ−３領域に対する相同性に基づいて単離されたＴ細 胞ｃＤＮＡｓのハイブリッド形成を示している、図■５は、ＶａｎＬｅｅｕｗｅ ｎら（１９８９）から翻案された、ＩＬ−５およびＩＬ−３を含むヒト染色体５ 領域の長距離制限地図を示している：そして図１６は、本発明の方法をどのよう に適用して特異的疾病関連遺伝子座およびそれらの遺伝子生成物を同定し得るか を示している。

本発明の詳細な説明 図１は、本発明による二重ＤＡＮフラグメントの増幅方法を説明している。二重 フラグメントは、フラグメント混合物、および典型的にはメツセンジャーＲＮＡ 　（ｍＲＡＮ）転写種から作製されるｃＤＡＮフラグメントの混合物中に一般に 存在しているが、ゲノムＤＡＮフラグメントまたは線形化ベクターまたはベクタ ーフラグメントも適している。

ｍＲＡＮ種を、細胞または体液試料、例えば、血清または胆汁から単離する方法 は周知である。１つの方法は、バナジル−ＲＮＡ複合体の形成、クロロホルム／ フェノールを用いたタンパク質の抽出、および冷エタノールを用いた沈澱を包含 する。第二の方法において、ＲＮＡは、グアニジニウムイソチオシアナート混合 物から、フェノールで抽出された後、クロロホルム　イソアミルアルコール抽出 、および、冷エタノールを用いた水性相からのＲＡＮの沈澱か続く。読者は、特 表千５−５０８３０５　（４） Ｍａｎｉａｔｉｓ、第１８８〜１９８頁、および本明細書に引用した参考文献を 詳細に参照のこと。

一般に、真核ｍＲＡＮｓは、保持体に結合したオリゴ−ｄＴまたはポリＵを用い て、アフィニティークロマトグラフィーにより単離される３′ポリＡ末端配列に よって特徴づけられる。さらに、または代わりに、全部の単離されたＲＮＡは、 さらに、密度勾配遠心分離、アガロースゲル電気泳動によって分別されてＲＡＮ 種の所望のサイズフラクションを得ることができる。

単離したｍＲＡＮ転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）からの二重ｃＤＡＮｓの作 製は、第−鎖（ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ）合成の慣用のオリゴｄＴまたはラン ダムブライミングによる。

前者の方法は、ポリＡＲＡＮｓからのみ得られた二重ｃＤＡＮｓが所望される場 合に育利である。この方法において、ＲＮＡ転写を、オリゴｄＴで開始し、４つ 全てのデオキシヌクレオチドの存在下の逆転写酵素による第一＠ｃＤＡＮ合成を 促進する。第−鎖合成生成物から形成される３′ヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）を 使用して、周知の方法（Ｍａｎｊａｔｉｓ、第２１３〜２１６頁）による、大腸 菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＤＮＡポリメラーゼ■による第二鎖（ｓｅｃｏｎｄ　５ｔ ｒａｎｄ）の合成を開始する。

ｃＤＡ、Ｎ二重形成のランダムブライミング方法は、（ａｌ二重形成かポリＡ種 に限定されない、またはｆｂｌ全長の二重ｃＤＡＮｓが必要とされない場合に好 ましい。

第−鎖ｃＤＡＮ合成方法は、市販の任意のシーケンスブライマーを利用する。

第二鎖合成に続いて、ｃＤＡＮＤＮＡラグメントしくは、例えば、以下の材料セ クションにおいて記載されているような大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノ ウフラグメント）の大きいフラグメントで付着末端を満たすことにより平滑末端 化される。

完全な染色体ＤＡＮｓは、染色体長さのＤＮＡ５が必要とされる場合、アガロー ス−固定化細胞調製物から単離され得る。選択された細胞源からのゲノムＤＮＡ は、襟準方法によっても単離されることができ、それは、一般に、エタノール沈 澱とともに連続フェノールおよびフェノール／クロロホルム抽出を包含する。

フラグメント混合物または精製した調製物中のいずれかのゲノムＤＡＮフラグメ ントは、本発明の方法による、増幅に同様に適している。機械せん断か使用され 得るが、二重ＤＡＮは、好ましくは、ｌまたはそれ以上の選択された制限エンド ヌクレアーゼを用いた部分的または完全な消化により断片化される。断片化した ゲノム片は、サイズ分別されるか、または、反復ＤＮＡを除去するためにさらに 処理され得る。二本鎖ＤＮＡフラグメントの別の源は、染色体外材料、例えば、 ミトコンドリアＤＡＮ、二本ＩＤＡＮウィルス、またはそれらの生活環の一部と して二本鎖中間体を有するウィルス、例えば、レトロウィルスを包含することか できる。

ｃＤＡＮフラグメントを作製するために使用するゲノムＤＮＡフラグメントまた はＲＮＡ転写物の細胞源は、培養した細胞系、あるいは、組織（またはまるごと の臓器または完全な生体）から得られる単離された細胞または細胞型を包含する 。細胞源は、２つの関連した細胞源の１つに独特である特定のＲＮＡ転写物また はゲノム材料を同定または単離することか所望される、種々の控除技術において 重要である。ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ転写物の体液源は、第一に、その液 か興味のあるウィルス源または別の微生物を含むことが知られているか疑われて いる場合に重要である。例えば例４は、腸伝染性非Ａ／非Ｂ　（ＥＴ−ＮＡＮＢ ）肝炎ウィルスでのカクィザルの感染前および後に取り出された胆汁がら単離さ れたＲＮＡから作製されるｃＤＮＡフラグメント混合物を開示している。

線形化または断片化プラスミドＤＮＡ、または断片化ファージＤＮＡは、増幅す ることか望まれ得るＤＮＡフラグメントのもう２つの源である。ベクターＤＮＡ は、慣用の技術により精製したプラスミドまたはファージＤＮＡから得られ、そ して、選択した制限エンドヌクレアーゼで消化することによって線形化および／ または断片化される。例２は、ｐｈｉＸ１７４ファージおよび線形化ｐｉＡＮ本 発明の重要な特徴に従って、増幅すべき二重ＤＮＡフラグメントを、それらの反 対末端で、リンカ−に連結して鎖重複のためのブライミング配列、即ち、末端ブ ラマーを提供する。リンカ−は好ましくは、一般に長さ約２０〜３０塩基対の、 定められた塩基対配列を有する、短い二重ＤＡＮフラグメントである。リンカ− の１つの末端は、反対のフラグメント末端への酵素連結反応のために設計される 。フラグメントか、平滑末端化ｃＤＮＡｓまたはゲノムフラグメントである場合 、例２に記載したように、このリンカ−末端は、Ｔ４ＤＡＮリガーセの存在下の フラグメント末端への連結反応のために、同様に平滑である。ＤＮＡフラグメン ト混合物が、ゲノムＤＮＡのエンドヌクレアーゼ消化により作られ、そして、付 着末端を育するフラグメントを作製する場合、これらの末端を、満たして平滑末 端を生成するかあるいはフラグメント一連結反応の終わりに相補的付着末端を有 するリンカ−を調製することができる。

リンカ−を必要とする連結反応は、同様に、リンカー−リンカ一連結反応をも引 き起こすので、リンカ−は好ましくは、二量体が、制限エンドヌクレアーゼ消化 により選択的に開裂され得るように設計される。これは、選択された制限一部位 配列の１／２を表現する配列を有するリンカ−の平滑末端を構成することによっ てなされ得る。平滑末端二量体化により作られる制限部位は、好ましくは、まれ なカッタ一部位であり、その結果、関連したエンドヌクレアーゼでのフラグメン トの消化は、ＤＮＡフラグメントにリンカ−を添加した後、かなりの数のフラグ メントを内部で開裂せず、それ故１つの末端のみにリンカ−を有するフラグメン トを生じない。

図２は、反対のフラグメント末端に付着した模範的なリンカ−Ａ、Ｂ、またはＣ を有するＤＮＡフラグメント（実線）を示している。理解されるように、３つの リンカ−の各々は、その平滑末端に１／２のＮｒｕ１部位を有しており、それに よって、平滑末端連結反応によって生じるリンカ−に二量体は、ＮｕＩＩ消化に よって開裂され得る。ＤＮＡフラグメントへのリンカ一連結反応は、指向性であ り、そしてリンカ−自己連結反応は、リンカ−の１つの付着末端のために、二量 体形成に限定されることに注意するべきである。リンカ−は、上述したように、 そして、図１の上部で説明したように、平滑末端化フラグメントに結合される。

対応するフラグメント付着末端への連結反応のための１つの付着末端を存する類 似のリンカ−が同様に使用され得ることが認識されるであろう。しかしなから、 これらのリンカ−は、リンカ−二量体の除去のための再開裂ができないという欠 点を育している。

図２に同様に見られるように、リンカ−は好ましくは１つまたはそれ以上の、フ ラグメントか増幅後に開裂され得る内部制限部位を含む。内部リンカ−制限部位 は、２つの目的にかない得る。第一に、増幅フラグメントか、以下のセクション Ｄ−１に記載されたＤＮＡ控除方法において使用される場合、制限部位を使用し て、２つのフラグメント混合物の１つにおいてリンカ−の大部分を開裂し、同一 のリンカ−が、両方のフラグメント混合物の増幅において使用される場合、２つ の異なる混合物からの鎖中のリンカ−領域の間のハイブリッド形成を妨げる。第 二に、リンカ−切断部位は、増幅したフラグメント（または、セクションＤ１控 除方法におけるハイブリッド形成したフラグメント）に、クローニングベクター 中にクローニングするための所望の付着末端部位を備え付けることを可能にする 。第三に、セクションＤ−１において理解されるように、リンカ−制限部位は、 フラグメントのビオチン化の目的で、一本鎖末端を造るために使用され得る。特 に、内部ＥｃｏＲ１部位は、市販のビオチン化ｄＵＴＰおよびｄＡＴＰヌクレオ チドで満たされ得るＡＡＴＴオーバーハングを生じる。

選択された配列を有する合成二重オリゴヌクレオチドリンか−、例えば、図２中 の３つの模範的リンカ−について示されたものは、市販の自動化オリゴヌクレオ チーオ合成機を用いて製造され得る。代わりに、あつらえの設計した合成オリゴ ヌクレオチドは、例えば、５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ　Ｄ ｉｅｇｏ、カリ’７ｔルニア州）から購入され得る。

Ｃフラグメント増幅 上述した方法段階は、図１の上部に示されている。これらの工程は、二重フラグ メントを得、平滑末端化しそしてリンカ−を反対のフラグメント末端に付着して 、図２において説明されているようなリンカ−を有するフラグメントを作製し、 そして選択されたエンドヌクレアーゼで処理して、リンカ−多量体（ｍｕｌｔｉ ｍｅｒｓ）をそれらの平滑末端接合部で切断することを包含する。代わりに、リ ンカ−二量体は、ＤＮＡを、ゲル濾過またはアガロースゲル電気泳動により分別 し７、そして、リンカ−二量体より大きい全てのＤＮＡ５を溶出することにより 除去され得る。

上からのリンカー−フラグメントは、次の工程に従って反復フラグメント複製に より増幅される。第一に、フラグメントを、大モル過剰の一重鎖オリゴヌクレオ チドブライマー、一般に１０’〜１０’モル過剰と混合する。プライマー配列は 、フラグメント末端リンカ−に相同である：すなわち、プライマー配列および長 さは、適度に厳しい再アニーリング条件下に２本の鎖の相補的−リンカ−領域へ のハイブリッド形成を促進するようなものである。もう１つの必要条件は、プラ イマーが、変性フラグメント鎖のリンカ−領域へハイブリッド形成される時に、 ポリメラーゼが触媒する鎖複製を開始できる；すなわち、プライマーの内部末端 が遊離３’　−ＯＨを提供することである。図２に示したリンカ−の場合、好ま しいプライマー配列はニ リンカ−Ａについてｄ（５°−ＧＧＡＡＴＴＣＣ；ＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧ−３° ）、リンカ−Ｂについてｄ　（５’−ＧＧＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧ−３“） ：そいてリンカ−Ｃについてｄ（５°　−ＧＡＣＧＣＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＧ− ３”）である。

所望の配列を有する一重鎖オリゴヌクレオチドプライマーは、上述したように、 慣用の方法により製造されるか、または営利的な製造所から入手され得る。

変性フラグメントおよびプライマーを、一般に約３７〜６０℃に冷却して、フラ グメントリンカ−末端を用いたブライマーハイブリッド形成を可能にする。冷却 期間は、かなり短く、一般に約５分未満に保たれて、長期間の再アニーリング時 に予期されるストランド−ストランドハイブリッド形成を最小限にする。この点 て、または、プライマー−添加段階で、４つのデオキシヌクレオチドおよび、第 二鎖開始複製を触媒することができるＤＮＡポリメラーゼを添加し、そして、反 応混合物を、酵素鎖複製に適当な温度にする。

以下の例２に記載した方法において、デオキシヌクレオチドおよびＤＮＡポリメ ラーゼは、フラグメント変性の前に添加された。熱変性後、この混合物を５０° Ｃて２分間アニーリングし、次いて開始される、第二鎖複製のために５〜１２分 間で７２℃にした。使用したＤＮＡポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａ ｔｉｃｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｇ　ＤＮＡポリメラーゼ）であり、それ は、短い期間９５°Ｃまでで、比較的熱安定である（Ｋａｌｅｄｉｎら；　Ｐｅ ｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）。

上記から、そして図１から、単一の添加プライマーは、各々のＤＮＡ鎖中の３′ 末端リンカ−領域でハイブリッド形成し、従って、フラグメント数の２倍化か起 こることか認識されるであろう。加熱によるフラグメント変性、フラツフ、１へ 鎖−プライマー複合体を形成するための冷却、そしてＤＮＡポリメラーゼの存在 下での複合体の第二ｉＪ！複製を包含する上記複製方法は、フラグメントの所望 の濃度か達成されるまで繰り返される。熱安定のＴａｑポリメラーゼを用いる上 記例において、３つの複製工程は、フラグメント混合物を変性温度（フラグメン トのＴｒｎより高い）に加熱し、簡単に冷却してフラグメント／プライマー複合 体を形成させ、そして第二鎖合成のために十分な期間インキュベージジンするこ とによって簡単に行われる。

例２は、フラグメント増幅方法を、線形化ＤＮＡプラスミド（ｐｉＡＮ１３）に およびファージｐｈｉＸ１７４フラグメントのＨａｅｌｌｌ消化によって作られ るフラグメント混合物に適用することを説明している。

Ｄ、効用 増幅方法は、限られた量のゲノムまたはｃＤＮＡフラグメント材料か利用できる ＤＮＡ二重フラグメント増幅におよび／またはＤＮＡ配列か未知である二重ＤＮ Ａ材料を増幅する簡単な方法として有用である。例えば、例４において報告され たプローブ結合研究において、当該方法を使用して大きさくｍａｇｎｉｔｕｄｅ ）の幾つもの種類（ｏｒｄｅｒｓ）によって、腸伝達性非−Ａ／非−Ｂ肝炎（Ｅ Ｔ−ＮＡＮＢ）ウィルス剤に感染した胆汁から得られるｃ−ＤＮＡフラグメント の数を増加した。

増幅は、胆汁中に存在する比較的少量のウィルス剤を、増幅ｃＤＮＡフラクショ ンとして容易に同定することを可能にした。

当該方法は、クローニングに利用できるフラグメント（ｆｒａｎｇｍｅ口ｔ　ｏ ｒ　ｆｒａｇｍｅｎｔＳ）の量を増幅してクローニング効率を高めるのに有用で ある。クローニングする方法の１つの利点は、選択したクローニングベクターに 適当な末端クローニング部位を育する増幅フラグメントを提供できることである 。

さらに処理、例えばさらに濃縮するのに利用できるフラグメント材料の量を増加 するために、精製し、濃縮し、またはサブ分別したＤＮＡフラグメントに当該方 法を適用できる。例えば、以下に記載したフラグメント−単離方法において、単 離した非反復配列フラグメントをさらに、付加的な増幅および選択によって濃縮 することかできる。もう１つの例として、ゲル電気泳動により得られるＤＮＡサ ブフラクションを選択的に増幅できる。ここで、フラグメント混合物に、分別前 に、末端リンカ−を備え付け、そして選択したフラグメントノくントをさらに、 ゲル中のもとの位置で、あるいは選択的溶出の後に、プライマー、ポリメラーゼ 、およびヌクレオチドの添加によって、繰返しの加熱および冷却複製工程を用い て、単離する。以下の特定の適用が例証している。

図４は、本発明による、２つのフラグメント混合物の１つから非反復（ｕｎｉｑ ｕｅ）配列を単離する方法のフローチャートである。２つのフラグメント混合物 は、本明細書中では、陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）−および陰性（ｎｅｇａｔ　１ ｖｅ）−原理合物と呼ばれ、そしてそれぞれ核酸種の陽性および陰性源から得ら れる。陽性源は、細胞、細胞群、組織、器官、サブ細胞フラクション、またはＲ ＮＡ転写物または、ベクターフラグメントを含むゲノムフラグメントの、多数の 異なる配列種を含む別の定められたソースであることかできる。陰性源は、陽性 源と類似しているか、１つまたはそれ以上の陽性原種を欠いている。

例として、陽性および陰性源は、微生物剤に感染した（陽性源）または感染して いない（陰性源）細胞または組織試料であり得る。ここで、ゲノム材料またはＲ ＮＡ転写転写形のいずれかの、感染剤と関連する核酸種は、感染した（陽性）源 に独特である。同様に、陽性および陰性源は、体液、例えば、それぞれ、感染し たまたは感染していない実験材料からの、血清または胆汁であり得る。本方法か 、遺伝病の研究に適用される場合、陽性源は、一般に、その細胞と関連している 通常のタンパク質の全範囲を生産できる通常の細胞系または組織であり、そして 陰性源は、変えられたまたは失われたｍＲＮＡ種の疑いをかけられている遺伝的 に変えられた細胞である。すなわち、陽性源は、遺伝的に変えられた、陰性源中 に存在しない通常のｍＲＮＡ種を産する。

もう１つの例として、細胞中の悪性形質転換か、悪性状態と関連する新たなＲＮ Ａ転写物の表現によって証明されるような、オンコジーンの活性化によって起こ り得ることが知られている。このようなＲＮＡ種を単離しそして同定するために 本発明の方法を適用する際に、悪性細胞または組織は、独特な（腫瘍関連）ＲＮ Ａ種の陽性源として、そして通常の、非形質転換細胞または組織は、陰性源とし て役に立つ。転写物またはＤＮＡ二重フラグメントの陰性および陽性の別の例が 考えられる。

図４中に示される陽性および陰性源は、ｍＲＮＡ種の混合物を産し、そしてこれ らは、上記セクション八において論ぜられているような対応する二重ＤＮＡフラ グメントに変換される。２つの混合物中の二重フラグメントは、平滑末端化され そして、セクションＢに記載されているように、別々に、反対のフラグメント末 端でリンカ−に連結される。陽性−源フラグメントに付着されるリンカ−は、好 ましくは、陰性−源フラグメントに付着されたものと異なる。例えば、例２にお いて概説された方法において、陽性源フラグメントは、図２においてリンカ−八 に連結され、そして陰性源材料は、リンカ−Ｃと連結される。異なる配列を有す るリンカ−を２つのフラグメント混合物に付着することは、２つの混合物をハイ ブリッド形成する時に、リンカ−ハイブリッド形成の問題を避ける。代わりに、 もしリンカ−か、実質的に全てのリンカ−を、制限エンドヌクレアーゼ消化によ りハイブリット形成の前に陰性−源フラグメント混合物から除去できる制限部位 を含むならば、同一のリンカ−を、両方のフラグメントに付着することかできる 。

次いで各フラグメント混合物を、上記セクションＩＣに記載したように、繰返し 複製によって増幅する。好ましい実施態様において、増幅した、陰性−源フラグ メント鎖を、ビオチン化するかまたは、さもなければ、当該鎖に、アフィニティ ークロマトグラフィーにより、リガンドを含む鎖または二重種を選択的に結合し そして除去するために使用され得るリガンドを備え付ける。二重フラグメントを ビオチン化する種々の方法が利用できる。例えば、ビオチン標識化デオキシヌク レオチド、例えばＢｉｏ−１１−ＵＰＴおよびＢｌｏ−７−ｄＡＴＰを、複製の 最終ラウンドの間に増幅反応混合物中に含ませることができる。二重フラグメン トを、製造業者、　Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、カリフォルニア 州）により供給されるプロトコールにおいて概説されているような、標準方法に よりすばやく光ピオチン化する。１つの好ましい方法において、増幅フラグメン トを、５’　−ＡＡＴＴ着末端を、共に市販されているＢｆｏ−ＩＩ−ＵＰＴお よび／またはＢｌｏ−７−ｄＡＴＰの存在下にクレノウフラグメンノで満たす。

２つのフラグメント混合物を今や合わせてそして熱変性して一本鎖形にする。

好ましくは、陰性−源フラグメントは、実質的にモル過剰で、一般に約１０倍過 剰で存在し、陽性−原理合物中の独特でない（ｎｏｎ−ｕｎｉｑｕｅ）フラグメ ントが、陰性−源フラグメントからの相補鎖でハイブリッド形成する高い蓋然性 を育することを保証する。

陽性−および陰性−源フラグメントを、２つの異なる混合物中のリンカ−の間の ハイブリッド形成が起こらない条件下にハイブリッド形成する。このことは、上 述したように、２つの混合物中の異なる配列のリンカ−を用いることによって、 ハイブリッド形成の前に陰性−源フラグメンノ混合物からのリンカ−を開裂する ことによって、または、リンカ−ハイブリッド形成を起こらないようにする条件 下にフラグメント鎖をハイブリッド形成することによって、なし遂げられ得る。

代わりに、ハイブリッド形成混合物は、陽性−源リンカー末端領域でノーイブリ ッド形成するのに有効なブリマーオリゴヌクレオチドの大モル過剰を含むことか でき、従って、インター−鎖リンカーハイブリッド形成を避ける。

ハイブリッド形成反応は、Ｈａｍｅｓに詳述されているような、古典的ノ＼イブ リッド形成技術に従って、あるいはより好ましくは、Ｋｏｈｎｅによって記載さ れているような、フェノールエマルション再会合技術（ＰＥＲＴ）、または、’ ｒｈｏｍｐｓｏｎによって記載されているような、グアニジニウムチオシアナー ト方法のような、迅速なハイブリッド形成技術により、行われ得る。

ＰＥＲＴハイブリッド形成方法において、フラグメントを、好ましくは約５〜５ ０μｇ／ｍｌの間の最終ＤＮＡ濃度で、フェノール反応混合物中でハイブリ・ン ド形成し、そして反応を、６０〜７０°Ｃで、５〜６時間行う。代わりに、反応 を、室温でホルムアミドの存在下に行うことができる。アニーリングの速度は、 ２８０ｎｍでの濃色シフトにより、または、反応混合物のアリコートを緩衝液て 稀釈し、そして、材料を、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）カラム（Ｋｏｈｎｅ ）の中を通過させることにより、追跡し得る。

グアニジンチオシアナート方法において、フラグメントを、好ましくは約５〜５ ０　μｍ／ｍＩの間の最終ＤＮＡ濃度で、８ｍＭＤＴＴ、および２０ｍＭクエン 酸Ｎａ、ｐＨ５，８を含む４Ｍグアニジンチオシアナート溶液中でハイブリ５． ト形成する。混合物を５分間で６０’Ｃに加熱し、完全な変性を保証し、次いて 、完全なハイブリッド形成か起こるまで２６°Ｃで７２時間までの期間インキユ ヘーノヲンする（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）。ＤＮＡ／ＤＡＮハイブリッドの形成は上 述したように確認され得る。

（ｂｌ　非反復−配列フラグメントの単離ハイブリッド形成に続いて、反応成分 を、独特でないフラグメントを優先的に結合するのに有効な固体支持体と接触さ せる。陰性−源鎖をビオチン化する、好ましい実施態様において、反応成分は、 ）１イブリツド形成される全てのビオチン化繊およびビオチン化していない（陽 性−源）鎖を結合するのに有効なアビジンまたはストレプトアビジン（ｓ　ｔｒ ｅｐｔａｖｉｄｉｎ）カラム上で分離される。ビオチン化繊は、大モル過剰で存 在するので、実質的に全ての、陽性−源からの共通−配列鎖は、相補的な、ビオ チン化繊に結合され、従って、アフィニティークロマトグラフィーにより除去さ れるであろう。

ストレプトアビジンカラム上でハイブリッド形成混合物を分離する方法は、例３ に詳述されている。手短に言えば、ハイブリッド形成混合物を、ストレプトアビ ジン−アガロースを詰めたカラムの中を通しそして、溶出緩衝液で広く洗浄する 。数回の洗浄からの溶出液はプールされそして核酸を、エタノール沈澱により濃 縮し、陽性−源材料に独特である配列について濃縮されたフラグメント混合物を 産する。

本発明の重要な特徴に従って、単離したフラグメントは、陽性−源フラグメント に最初に付着した末端リンカ−を含み、従って、さらに、セクションＣに記載し た増幅方法により、増幅され得るであろう。陽性−源リンカーが、陰性−源フラ グメント上のものと異なる場合、付加的な増幅（「陽性−源」プライマーを用い る）が、選択的に陽性−源フラグメントを増幅し、さらに、陽性源に独特である 配列の濃縮を与えるであろう。図４に示されているように、単離した増幅材料は 、陰性源フラグメント（それは必要かあれば付加的に増幅され得る）、およびア フィニティークロマトグラフィーにより再度単離された非反復フラグメントて再 ハイブリッド形成され得、濃縮を高める。

最終的な単離フラグメントを、ＤＮＡポリメラーゼで処理して二重種における完 全な鎖複製を確実にし、次いで、選択したリンカー一部位エンドヌクレアーゼで 処理して、クローニングなどに適当なフラグメント末端を提供することかできる 。代わりに、または、付加的に、単離したフラグメントを、ＤＮＡプローブとし て使用するために、既知の方法に従って放射能標識化することができる。

（２）ウィルス剤の単離およびクローニング図５は、感染した源、例えば、選択 した組織または体液（例えば、胆汁）中のＲＮＡ転写物として存在するウィルス 剤の単離およびクローニングのための、控除方法の１つの適用を説明している。

ここで、感染した（陽性の）および感染していない（陰性の）源から単離したＲ ＮＡ混合物を使用して、平滑末端化したＣＤＡＮ二重フラグメント混合物を作り 、選択したリンカ−に連結し、そして上述したように増幅する。陰性−源フラグ メントのビオチン化の後、２つのフラグメント混合物を合わせ、変性し、再アニ ーリングし、そして、アフィニティークロマトグラフィーにより分離する（セク ションＤ−１）。それらの末端−リンカ−領域中の選択した制限部位を含む、単 離フラグメントを、この部位で切断しそして適当な発現ベクター、例えばλｇｔ ｌｌベクター中でクローニングする。結果として得られるλｇｔｌｌファージは 、陽性源材料に独特な配列について濃縮されたフラグメントライブラリーを構成 する。

ウィルス抗原を生じる所望の隔離集団（ｉｓｏｌａｔｅｓ）について選択するた めに、宿主細胞を、ライブラリーファージで感染し、そして感染した固体からの 抗血清と反応して、ウィルス関連抗体を、ウィルス抗原を生じる宿主細胞に結合 する。次いで、細胞を洗浄して結合していない抗体を除去しそしてリボ−ター− 標識化抗−ヒトＩｇＧ抗体と接触させて、ウィルス−特異的抗体を結合した細胞 を標識化する。これらの細胞は、リポータ−の存在によって同定される。ウィル ス挿入断片を含むベクターは、連続抗原生産のために、または、ソースウィルス 配列プローブとして、使用することができる。

代わりに、フラグメントライブラリー中のクローン化した単離フラグメントは、 ＤＮＡプローブを用いて同定しそして選択され得る。説明として、上述したよう に作製したフラグメントライブラリーをレプリカ平板化するかまたは、感染した および感染していない源からの標識化ｃＤＮＡプローブでハイブリッド形成し得 る。プローブハイブリッド形成は、慣用のサザンブロツティングにより行われ得 る。ウィルス剤挿入断片を含むそれらのライブラリーベクターは、陽性〜源ＣＤ ＮＡプローブ中に存在するウィルス−剤ｃＤＮＡプローブでハイブリット形成す るか、しかし、陰性−源ブローブでハイブリッド形成しないであろう。

３、細胞核酸生成物の同定および単離 記載したばかりのＤＮＡ控除およびプローブ選択方法に類似した方法か、オンコ ジーンを発現する細胞、または、遺伝病に関連した転写物中に欠陥のある細胞に 独特な核酸フラグメントを同定しそして単離するために適用さね得る。

図６は、セクションＣにおいて記載した増幅技術をどのように使用して、上述し たように同定した非反復配列フラグメントクローンが、事実上、隅性源に独特で あることを確認するかを説明している。ここで、陽性および陰性源から調製され る２つのｃＤＡＮＤＮＡラグメントクションＣにおけるように、増幅し、そして 、ゲル電気泳動により分別する。次いで、サイズ分別したゲルフラグメントを、 慣用のササンブロツティングによりフィルターに移しそして、プローブ標識化の 後、興味のある単離したクローン化挿入断片でハイブリット形成する。もし、プ ローブ配列か、陽性源フラグメントに独特であるならば、ハイブリット形成は、 増幅した陽性−源フラグメントのみで見られるであろう：図６に示されているよ うに、増幅フラグメントは、あるサイズ範囲を有しているであろうから、予期さ れるように、結合するプローブ領域はかなり広範囲である。増幅したｃＤＮＡフ ラグメントをスクリーニングするこの方法は、例４に詳述されており、そこでは 、この方法を使用して、単離したＥＴ−ＮＡＮＢフラグメント挿入断片か感染し た胆汁源からのｅＤＡＮに独特であることを確認した。

４、連結した遺伝子を表現するｃＤＮＡｓの同定同様な構造または機能の遺伝子 の染色体分布に関する一般的規則はない。しかしなから、遺伝子重複し次いて分 岐することは、遺伝子ファミリーの複雑さおよび機能特殊化を増すだめの共通の メカニズムである。遺伝子重複は、転位またはレトロボノソヨン（ｒｅｔｒｏｐ ｏｓｊ　Ｎｏｎ）によって起こり得るか、多数の遺伝子ファミリーにおける観察 は、重複は、おそらく、一様でない乗換の結果として、遺伝子のタンデミゼーシ ョン（ｔａｎｄｅｍｊ　ｚａｔ　１ｏｎ）により起こることを示唆する。タンデ ミゼーションは、遺伝子の密接に連結したクラスターを作り、それは次いで、染 色体切断のような出来事によって分離され得るであろう。しかしながら、補体系 の遺伝子（Ｌｅｏｎａｒｄｓら）または血清リポタンパク質（Ａｅｇｅｒｔｅｒ −３ｈａｗ）中のように、関連した遺伝子か、１つより多い染色体上に位置して いる場合ですら、遺伝子系のサブセットは、密接に連結した遺伝子として生じ得 る。

関連した遺伝子が、はんのわずかな関連していない介在遺伝子を含むクラスター 中において連結される多数の場合かある。例は、ある下垂体および胎盤ホルモン の関連したペプチドのための遺伝子（Ｄ’　Ｅｕ５ｔａｃｉｌｏら）、免疫応答 およびクラスＩ主要組織適合性遺伝子のクラスター（Ｂａｒｓｈら）、いくつか のインターフェロンのための遺伝子のクラスター（Ｗｅｉｓｓら）、Ｕｌおよび Ｕ２ＲＮＡｓのための遺伝子（Ｅｒｉｃｋｓｏｎら）、ヒトメタロチオネイン遺 伝子（Ｗｅｓｔｉｎら）、ヒストン遺伝子（Ｋａｒｉｎら）、プロリン−リッチ 唾液タンパク質遺伝子（Ｏｌｄら）、イムノグロビンのＨ鎖またはＬ鎖の一定の 領域のための遺伝子（Ａｚｅｎら）、およびαグロビン遺伝子クラスター（Ｔｏ ｎｅｇａｗａ）を含む。２つのグロビン遺伝子クラスターは、早期の発達におけ る重要な機能を有するこれらのクラスター中に連結した胚の遺伝子（αクラスタ ー中のゼータ遺伝子およびβクラスター中のニブシロン遺伝子）か存在するので 、特に関連している。これらは、成人遺伝子でクロスハイブリッド形成すること により容易に検出されておらずそれ故、クロスハイブリッド形成が、必ずしも、 クラスター遺伝子の間の関連性の良好なテストではない点を説明するのに役に立 つ。同様に、この点に関連して、クロス−形相同性を用いて関連したリンホカイ ンを単離する試みにおいて問題に遭遇する。従って、マウス（Ｌ−３およびＧＭ −ＣＳＦ遺伝子は、それらのヒト等個物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）との限定 された相同性のみ共有しそして成長因子遺伝子がタンデミゼーシ３ン後に非常に 急速に分岐し得る可能性に向いている（Ｗｏｎｇら、　Ｙａｎｋら）。

一般に、哺乳類放散の初期相前または中に共通の祖先の複製（ｄｕｐｌ　１ｃａ ｔ　１ｏｎ）により生じた遺伝子は、それらか核酸配列のクロス−ハイブリッド 形成により容易に検出できない程度に分岐されている。これらの観察は、共通の 祖先の複製により生じた分岐遺伝子か存在する場合に、中位〜高度の厳重ノ＼イ ブリ１．ｌ・形成アプローチはおそらく、それらの検出のための適切な手段では ないか、ｃＤＮＡｓの間のコート配列比較は機能類似性を非常に十分に明らかに し得ることを示す。

本明細書に記載したｃＤＮＡ増幅方法は、特定の大きいＤＮＡフラグメントに認 められる（ｍａρ）ｃＤＮＡｓを単離する方法を可能にする。次いてこれらのｃ ＤＮＡｓの単離は、限定されたｅＤＮＡ配列分析か、それらか興味のある遺伝子 の生成物をフード化しつるかどうかを決定することを可能にし、そして同様に、 それらの対応する転写物の通常の組織分布を調査するプローブを提供する。この 方法の１つの適用は、新たな成長制御遺伝子の単離に向けられている。

新たな成長制御遺伝子の単離は、成長因子の通常の生理的機能を調査する際にお よび潜在的治療適用の評価のための、十分な量の材料の製造の際に、相当な重要 性を有しているであろう。図７は、染色体５のサブ領域中の潜在的成長因子／受 容体遺伝子の区域帰属を示している。これらの遺伝子座の５つは、Ｃ３Ｆｓ／イ ンターロイキンをコード化している。ＣＳＦ５は、骨髄の始原細胞の成長および 成熟のために必要であるあと信じられているグリコプロティンのファミリーであ る（Ｃ１ａｒｋら’）、ＧＭ−ＣＳＦは、５Ｑ２３−３１に位置している（Ｆｆ ｕｅｂｎｅｒら。

ＬｅＢｅａｕら、１９８６）。Ｉ　Ｌ　−３（ｍｕｌｔｉ−ＣＦ　Ｓ）は、５ｑ ２３−３１内に位置している（ＬｅＢｅａｕら、１９８７）。最初、ｃＤＮＡ単 離努力は、好酸球コロニー刺激因子、Ｔ細胞置換因子とも言う、（インターロイ キン５　：　ＩＬ−５）およびＢ細胞成長因子（ＩＬ−４）　（ＬｅＢｅａｕら 、　ＶａｎＬｅｅｕｗｅｎら）を含むヒト染色体５の５ｑ２３．３〜ｑ３２領域 上に優勢に集中された。

種々のソースが、ゲノムＤＮＡのために使用され得る。標準ソースは、もちろん 、組織または細胞系から単離されたゲノムＤＮＡである。ハイブリット細胞系は 同様に、ゲノム出発材料の便利なソースを提供する。５０ｋｂより大きい、大き いＤＮＡ５は、パルス電界ゲル電気泳動を含む、種々の技術により分離され得（ Ｃａｒｌｅら、　Ｓｍ１ｔｈら、　Ｃｈｕら）、標的領域について濃縮された適 当な出発材料を提供する。ゲノム出発材料の別の便利なソースは、クローニング ベクター中に作製されたゲノムＤＮＡバンクであり得る。当業者に知られている 多数のベクターが存在し、それらは、ＤＮＡの大きい片をクローニングするのに 有用である　二のような有用なりローニングベクターは、ファージλおよび酵母 人工染色体の変形を含む。λベクター（例えば、Ｐｒｏｔｏｃｌｏｎｅ”１ｇ　 ｔ　Ｉ　Ｏ，Ｐｒｏｍｅｇａ）は、比較的大きい挿入断片を許容できるゲノムラ イブラリーを作製するために開発されている・例えば、λｇｔｌＯは、７．６ｋ ｂまでの挿入断片を含み得る。酵母人工染色体（ＹＡＣ）は、それらが、単細胞 組織中の維持の便宜を提供しそして非常に大きい挿入断片　数百キロベースまで のための容量を有しているので、事実上、好ましいベクター系である（Ｂｕｒｋ ｅら）。事実上、ヒトゲノムＤＮＡバンクの構造中のＹＡＣ系の効能は、証明さ れている（Ｂｕｒｋｅら）。

興味のあるゲノムＤＮＡフラグメントを同定する種々の方法、例えば、標識化プ ローブを用いたハイブリッド形成は、しかし、多くの場合において、同定および 続く分子操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ）のための十分な量の標的配列の入 手によって極端に制限される。セクションＣに記載した増幅方法は１、それが、 それらの核酸配列の先の知識と無関係なりＮＡ分子群を増幅する方法を提供する のて、これに関して非常に価値かある；この方法の適用は、例５に示されている 。

ヒト染色体５の５ｑ２３−３１領域から得られるゲノムＤＮＡフラグメントの精 製のための全体の機構は、図８に示されておりそして例５に詳細に記載されてい る。出発ＤＮＡ源は、ハムスター／ヒトハイブリッド細胞系ＨＨＷＩ　０５　（ Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒら）であった；このハイブリッドは、その唯一のヒト材料 として染色体５を含んでいる。従って、このハイブリッド細胞系の使用は、ヒト 染色体５配列の即時の濃縮を与える。ＩＬ−５特異的プローブを用いてマツピン グする初期パルス−電界ゲル電気泳動（Ｂｕｒｋｅら）は、ＮｒｕＴで二重−消 化時に約５０ｋｂまで減ぜられた５００キロベース（ｋｂ）のＮｏｔＩＩＬ−５ −含有フラグメントを示した：このフラグメントは、ゲノムＤＮＡ標的フラグメ ントとして選択された。

ＨＨＷ１０５細胞ハイブリッドゲノムＤＮＡを、Ｎｏｔｒで切断した：結果とし て得られるフラグメントをＣＨＥＦゲル上で分けた（Ｓｍｉｔｈら＋　Ｃｈｕら ）。ＣＨＥＦゲルトラックは、曲線状よりもむしろ直線であるので、このゲル系 は、ゲルを水平にスライスすることによる別々のサイズＤＮＡワラクシコンの単 離を可能にした。ｌ−５を含むフラクシタンを、各ゲルスライスの小さい試料を 調べそして試料を、ＩＬ−５特異的プライマーを用いて複製連鎖反応アッセイす る（Ｓｃｈａｒｆら）ことにより同定した（第９頁）。

複製連鎖反応条件の我々の変更は、フェノール／クロロホルム抽出工程を用いて アガロースを除去する以前の方法と違って、ＤＮＡを、ゲルスライス試料中のア ガロースから精製することを不要にする。フェノール／クロロホルム抽出工程を 除去できることは、興味のあるゲノムフラグメントを同定するのに必要な多数の アッセイを行うことを非常に促進する。

この、ゲノムフラグメント単離方法が与える精製の程度の概算は、全体に対する 精製したバンド中のエチジウムプロミド蛍光量を評価することにより、または、 分光蛍光分析によりサイズフラクション中に存在するＤＮＡ量を直接測定するこ とにより、なされ得る。ヒト染色体５は、約５％の長さのヒトゲノムを構成しそ して二倍体ＨＨＷ１０５中ゲノムあたり１つのコピーに存在しており従って、ハ イブリッドゲノム中に存在する全てのＤＮＡの約２．５％を構成している（Ｗａ ｓｍｔ＋ｔｈ個人通信）。次の計算は、ヒトＤＮＡの１つの特定の大きいフラグ メントを単離するのに必要な精製の程度を評価するためになされ得る。ヒトおよ びハムスターの二倍体ゲノムサイズは、６ＸｌＯ”塩基対（ｂｐ）である。それ 故、ＨＨＷｌ、０５において、約１．５ｘｌＯ”　ｂｐのＤＮＡは、染色体５中 に含まれるであろう（２，５％の６×ＩＯ”ｂｐ）ｏ約５００ｋｂの平均Ｎｏｔ ！フラグメント長さを仮定すれば、染色体５は、３００のＮｏｔｌフラグメント を含むてあろう：従って、約３００倍の精製が、これらのフラグメントの１つだ けを単離するために必要とされるであろう。８０倍の精製は、１つのパルス−電 界ゲル（ＭｉｃｈｉＣＩら）上で容易に得られそして２つのゲル精製工程は、少 なくとも３００倍にこれを上げ得る。

＋Ｌ−５−含有Ｎｏｔｌゲノムフラグメントを、Ｎｒｕｌおよび第二Ｃ）（ＥＦ ゲル上に分けられたこの試料を用いて切断した。ゲルを上述したようイこスライ スしそして各ゲルスライスのアリコートを、ｒＬ−５特異的プライマーで複製連 鎖反応に付した。これらの増幅試料を次いで慣用のアガロースゲル上でサイズ分 別しそしてＤＮＡ分子をニトロセルロースに移した。この場合において、ＴＬ− ５−含有フラクションは、放射能標識化ＩＬ−５特異的プローブでニトロセルロ ース紙を調へることにより同定されたく図１０）。

ＩＬ−５−含有Ｎｏ　ｔ　Ｉ／Ｎｒ　ｕ　Ｉフラグメントおよび汚染するハムス ターフラグメントをさらにサイズ分別し、Ａリンカ−（セクションＢを参照）を 分子に連結し、そしてＤＮＡフラグメントを、セクションＣに記載した方法によ り増幅した。次いでこれらの増幅したフラグメントを、慣用のアガロースゲル上 でサイズ分別しく図１１）そしてニトロセルロースフィルターに移した。ニトロ セルロースフィルターと同一の機能を果たすであろう種々の保持体、例えばＧｅ ｎｅＳｃｒｅｅｎ”（ｄｕＰｏｎｔ−Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ ）またはセクション２Ａ（ｉｉ）に記載した保持体か利用できる。

例７は、例５で単離したゲノム領域に相同であるｃＤＮＡ分子の選択を記載して いる。ｃＤＡＮ分子は、Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーから選択された（例６）。

ｃＤＡＮ分子は、選択の前および／または後に増幅され得る。例えば、ｃＤＮＡ 挿入断片の５′および３′末端に隣接するベクター配列は、いかなる選択の前に もｃＤＡＮ挿入断片を増幅するために末端プライマーとして使用できる。プライ マーの５′末端は、同様に、ｃＤＮＡ分子の、クローニング／発現ベクターへの 挿入をその後に簡単にするであろう制限部位をコード化している配列を含み得る 。

ｃＤＮＡライブラリーが、ＩＬ−５見本（例７）において使用されたか、最初の 核酸はｃＤＮＡである必要はない。それは、例えば、分子の集団からハイブリッ ド形成により最初に選択した後、相同ＤＮＡの第−鎖か、既知の方法、例えば、 ランダムブライミング（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍキット）また はオリゴ−ｄｔプライミング（Ｍａｎｉａｔｉｓら）により合成され、そして第 二鎖合成が、古典的ヘアピン−開始様式において開始され得る（Ｍａｎｉａｔｉ ｓら）場合に、ＲＮＡ分子であり得るハイブリッド形成後に、比較的厳しい条件 を用いる、フィルターの広範囲の洗浄を行い、非特異的結合を最小限にした。異 なるリンカ−を、ゲノム配列（それぞれ、セクションＢに記載されているＣおよ びＡプライマー）と対比して選択したｃＤＡＮｓの増幅のために使用したので、 溶出工程の間にフィルターからはずれるいかなるゲノム配列をも増幅されないで あろう。

この選択技術は、すばやくそして、ある程度までは、選択したｃＤＮＡｓの存在 率を均一化するのに役に立つ。この均一化は、これらのゲノム配列に各々相同な ｃＤＮＡｓの異なる存在率にもかかわらず、フィルター上のゲノムエキソン配列 のコピー数が、おおよそ同等であるべきであるので存在する。従って、ｃＤＡＮ ｓが過剰である時、規格化は、ゲノム配列に関して存在するへきである。

ＩＬ−５の場合、図１２は、上記方法により選択された増幅したｃＤＡ、Ｎ分子 か分けられたアガロースゲルのエチジウムプロミド染色を示している。さらに、 図１３は、増幅したｃＤＮＡＳを用いた種々のプローブの／％イブリット形成を 示している。図から理解できるように、ｒＬ−５特異的配列は、予期されるよう に存在している。さらに、完全なヒトＤＮＡに相同なｃＤＮＡ配列に対応するハ イブリッド形成のスミャ（ｓｍｅａｒ）も存在し、ＩＬ−５以外の種々のｃＤＮ Ａ分子かこの方法によって単離されたことを示唆する。

染色体５の、［Ｌ−５を含む領域に相同なｃＤＮＡｓの単離に適用される方法は 、同様に、染色体５の、ＩＬ−３（図７）を含む領域に適用されている。図１４ から理解できるように、選択方法は同様に、染色体５のＩＬ−３領域に対応する ｃＤＮＡｓの単離に有効であった。我々がＩＬ−３領域から得たゲノムＤＮＡク ローンを用いて、我々は、この領域に長距離の制限地図を作成した。ＧＭ−ＣＳ Ｆに特異的なプローブを用いて、我々は、ｌＯキロベースのＩＬ−３中にあるＧ Ｍ−Ｃ３Ｆを物理的にマツピングした。ｒＬ−３領域ゲノムＤＮＡプローブへの それらのハイブリッド形成に基づいて選択したｃＤＮＡｓを、ＧＭ−Ｃ３Ｆ特異 的プローブへのそれらのハイブリッド形成について試験した時に、正のシグナル が得られた。この結果はさらに、興味のある選択した遺伝子（例えば、ＩＬ−３ ）と同一の染色体領域中に存在するｃＤＮＡｓを同定する本方法の能力を証明し ている。

上記選択技術における１つの重要な考慮すべき事柄は、種々のクローン化ＤＮＡ ５中のゲノム反復配列のクエンチングである。クエンチングは、つぎの処理の一 方または両方によってなし遂げられ得る：１）フィルターのプレーハイブリッド 形成：および２）フィルター選択工程の前の溶液中のｃＤＮＡライブラリーのプ レーハイブリッド形成。これらのアプローチは共に、反復配列を結びつけ、そし てそれらか、選択工程における相同ハイブリット形成部位として作用することを 妨げる（例えば、ｃＤＮＡライブラリーを用いたフィルターの）＼イブリット形 成）。有効なりエンチングは、次の方法でなし遂げられ得る。

クエンチングへの１つのアプローチは、全てのランダムにせん断されたヒトゲノ ムＤＮＡを用いた中間のＣ０値までのプレーハイブリッド形成である（Ｌｉｆｔ ら、　５ｅａｌｅｙら）。

クエンチングゲノムリピートへのもう１つのアプローチは、プレーハイブリッド 形成のための標的染色体以外の染色体：ＩＬ−５の場合、ヒト染色体５以外のヒ ト染色体からの染色体−特異的ゲノムＤＮＡライブラリーを使用する二とである 。

最後に、クエンチングゲノムリピートへの最も好ましいアプローチは、リピート 配列の種々の存在率のクラスを代表して、単離した反復配列のライブラリーを使 用することである。リピートのこのセットは、低いプラーク密度で、全ての放射 能標識化ヒトＤＮＡを用いてヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングす ることにより単離される。低い、中間の、そして高い密度シグナルを示すプラー クの混合物を選び取りそして配列のこれらのセットはプレーハイブリッド形成の ための遮断試薬として使用され得る。代わりに、このようなライブラリーは、全 てのヒトゲノムＤＮＡを短い長さにせん断し、変性しそして中間のＣｏｔ値まで 再アニーリングし、そして修復二本鎖分子をクローニングすることにより、作製 され得る。一般に、超音波で処理したニシン精子ＤＮＡを用いたフィルターの初 期の遮断の後に、リピートライブラライーを用いたブレーハイブリッド形成遮断 が続（。

与えられたゲノム領域に対応するＣＤＮＡ５の表現を改善するために、）１イブ リット形成選択のさらに続く工程は、例えば：　（１）部分的に精製したゲノム サイズフラクションを作るために使用した制限酵素の異なる開始組合せ、および ／または（２）興味のあるゲノムＤＮＡ領域の異なるソース（例えば、適当なゲ ノム領域を含む酵母人工染色体クローン）を用いて行われる。上からの、溶出し たｃＤＮＡｓのセットは、これらの配列にハイブリッド形成されるであろう。こ の方法において、汚染するｃＤＮＡｓの再−選択（ｒｅ−ｅｌｅｃｔｉｎｇ）の 機会は最小限にされるであろう、そして、特異的領域からのｃＤＮＡｓのみの単 離の機会は最大限にされるであろう。

選択した染色体領域に相同なｃＤＮＡ分子を単離すると、ｃＤＮＡｓをクローン 化しくＰｒｏｔｏｃｌｏｎｅ”　λｇｔｌＯ）そして低いプラーク密度でプレー ト化される。ファージＤＮＡ５をフィルターに移しそして標識化反復配列ライブ ラリーを用いてまたは全ての放射能標識化ヒトＤＮＡを用いてハイブリッド形成 して（Ｗｏ。

）、非反復配列を含むクローンから反復配列（ｒｅｐｅａｔ　５ｅｑｕｅｎｃｅ ）を含むクローンを区別する。次いでＤＡＮを、非反復配列クローン（ＩＬ−５ の場合５００クローン）の代表的試料から単離し、そしてｃＤＮＡ挿入断片をＥ ｃｏＲ，Ｉ消化により単離する。ｅＤＮＡ挿入断片のアリコートを、ニトロセル ロースフィルターにスポットする。次いで、ｃＤＮＡ挿入断片を、ニックトラン スレーションしそしてニトロセルロースフィルターを調べるために使用して重複 クローンを同定する（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）　；　重複物（ｄｕｐｌ　１ｃａｔｅ ｓ）を次いで捨てる。

クローンを次いてハイブリッドＨＨＷｌ　０５ＤＮＡ、ハムスターＤＮＡ、およ びヒトＤＮＡのミニパネルを用いて染色体５にマツピングする。ササンブロソト のようなこれらのＤＮＡ５の種々のダイジェストの大きいコレクションは、ナイ ロンフィルター上に調製されている。染色体５に認められるそして独特のクロー ンは、ＣＨＥ　Ｆゲル電気泳動により最初に分けられた大きいＤＮＡフラグメン トに戻るハイブリッド形成を利用して、ＬＬ−５遺伝子を取り囲むゲノムＤＮＡ 地図上に買かれ得る。リピートを含むことか見出されるクローンは、さらに分析 する前に、ブし・−クエンチングされるかサブクローン化されるであろう。

この方法は、慣用のプローブが利用できない時に、ゲ、ツムＤＮＡの接在領域に 対応するｃＤＮＡｓを同定する新規なそして有効な方法を提供し、そして同様に 、当該方法は、潜在的研究および治療上の価値のある、以前に知られていない遺 伝子生成物を同定する手段を提供する。

５　相同ウィルス核酸配列の同定 本発明の方法は、ウィルスゲノム構造および機能を分析するのに有用である。

ウィルスゲノムの完全なりＮＡコピーか、プローブとして使用され得るか、ある いは、ゲノムの選択フラグメントが利用され得る。ＲＮＡウィルスの場合、逆転 写酵素によるように、ゲノムのＤＮＡコピーを合成でき、または、いくつかの場 合には、中間ＤＮＡ形のウィルスが単離され得る（Ｋａｓｈｍｉｒｉら）。固定 化したウィルスゲノムＤＮＡを使用して感染した細胞の核酸をスクリーニングす ることかできる：例えば、ｃＤＮＡライブラリーを、感染した細胞のＲＮＡ５、 および、ウィルスゲノムＤＮＡプローブに相同なそれらの配列に基づいて単離さ れるこれらのｃＤＮＡｓから作製することかできる。それらの特異的配列に無関 係なｃＤＮＡ分子を、すなわち、本発明のリンカ−（図２）の使用により（例え ば、例６）、増幅できることは、通常の低い存在率伝達暗号（ｍｅｓｓａｇｅ） の同定に役に立つ。さらに、ウィルスゲノムＤＮＡプローブから溶出したｃＤＮ Ａｓを増幅てきることは、時々のハイブリッド形成を有するｃＤＮＡｓを同定す る方法の能力をさらに増加する。

次いで単離したｃＤＮＡｓを、ウィルスゲノムにマツピングしてコード領域を割 り当てることかできる。この方法を使用してウィルスゲノム配列に関連する細胞 タンパク質を単離することもできる。

本発明の方法は同様に、非相同ウィルスの核酸配列の分析に適用できる。例えば 、関連ウィルスを使用して新たなウィルスを特徴づけるのを助けそして関連した コード配列を同定する。このアプローチは、ウシ白血病ウィルス（ＢＬＶ）およ び新たに単離されたヒト−リンパ腫関連ウィルス（ＨｕＬＡＶ、参考文献により 本明細書中に編入した、共に係属中の米国出願３６１，８５５）の間の関連を調 査するために使用さている。ＨｕＬＡＶウィルスの構造タンパク質は、別の既知 のレトロウィルスへの高い程度の相同性を証明している。特に、ＢＬＶエンベロ ープタンパク質との、ｌ０Ｃ９ＨｕＬＡＶについて血清陽性の個体の血清反応性 ハ、ＨｕＬＡＶ１０Ｃ９の推定エンベロープタンパク質が、免疫原性エピトープ をＢＬＶと共有（ｓｈａｒｅ）　シ得ることを示唆する。

ＨｕＬＡＶ１０Ｃ９粒子からｌｌ製されるｃＤＮＡライブラリー（例９−Ｂ）は を、ニトロセルロースフィルターに結合したＢＬＶゲノムＤＮＡプローブに対し てハイブリット形成し、そのフィルターを洗浄し、選択したｃＤＮＡｓを溶出し そしてλｇｔｌｌ中にクローン化した。λｇｔｌｌクローンを、抗−ＢＬＶ血清 または抗−ｇｐ６２血清を用いて免疫スクリーニングする時、正のシグナルを与 えるｃＤＮＡ分子は選択されなかった（ｇｐ６２は、別の関連レトロウィルス、 ＨＴＬＶ−１のエンベロープタンパク質である：にｉｙｏｋａｗａら）。

しかしながら、本発明の方法により単離したＨｕＬＡＶＩＯＣ９ｃＤＮＡｓは、 例９〜ＩＯに記載されているように、次の結果を生じた　抗−ＢＬＶて陽性のλ ｇｔｌｌｃＤＮＡクローン数百；その４／１５は、抗−ＢＬＶと交差反応した抗 −ｐ２４（ｐ２４は、約２７，０００分子量のＨｕＬＡＶコアタンパク質である ）で陽性の１５クローン：および４つ全てか抗−ＢＬＶと交差反応した、抗−１ ６２で検出される４つの陽性クローン。

従って、関連したしかし別個のウィルスＢＬＧおよびＨｕＬＡＶの間の相同核酸 配列の単離に適用される本発明の使用により、標準技術か失敗した場合に、相同 核酸配列を検出することかできる。この増加した能力は、クローン化した選択ｃ ＤＮＡｓのλｇｔ１１発現生成物の免疫反応性により証明された。さらに、選択 したｃＤＮＡｓを、λｇｔｌｏ中でクローン化し次いで完全な長さのＢＬＶプロ ーブを用いてスクリーニングした時、７６の陽性が、スクリーニングした２×１ ０’のクローンから検出された。この結果は、本発明の方法を使用することによ ってなし遂げられ得る増加した感度を説明している。

６、選択したゲノムＤＮＡフラグメントの濃縮哺乳類遺伝学における１つの難し さは、十分量の、分析に利用できる出発材料を得ることである。本増幅方法は、 異なる配列種と無関係な選択されたゲノム領域から得られる配列において高度に 濃縮されるライブラリーを作製する簡単な方法を提供する。ゲノムＤＮＡフラグ メントを、摘花ゲノムＤＮＡセクションから、例えば、ゲル上のサイズ分別によ り単離し、断片化して約２キロベースより小さい大きさのフラグメントを形成し 、本発明のリンカ−を、このフラグメント上に連結し、そしてフラグメントを増 幅することができる。染色体のＩＬ−５領域について上で説明されているように 、ゲノム配列は、興味のある領域について単離され得る。これらのゲノム配列を 、次いて、本発明のリンカ−（例５−Ｅ）を用いて特異的フラグメント配列と無 関係に増幅し次いで、適当なベクター（例えば、３ｇ　ｔ　ｌ　Ｏ，Ｐｒｏｔｏ ｃｌｏｎｅ”、　Ｐｒｏｍｅｇａ）中にサブクローン化することかできる。これ らのクローン化ゲノム配列は次いで、種々の操作、例えば、特に遺伝リンケージ 分析における、プローブとしての使用（例７〜８．９〜ＩＯ）、および長距離の 制限地図の作製に利用できる。二のような長距離の制限地図は、種々のクローン の制限消化、それらのフラグメントのサイズ分別、各クローンに関する制限地図 の作成、および、クローン間のオーバーラツプ領域の最終的なラインアップによ って、作成される。この方法において作製したライブラリーは、興味のあるゲノ ム領域の優れた表現を提供する。

７　疾病関連遺伝子座の同定 疾病関連遺伝子座に対応する遺伝子の分子同定および分析は、分子遺伝子学の主 なやりがいのある問題である。遺伝関連データは、多数の遺伝病（例えば、家族 性精神分裂症）について存在しくＳｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら）そしていくつかの 場合において特異的染色体領域の物理的地図か利用でき（例えば、嚢胞性繊維症 遺伝子座は、約５００ｋｂ領域にマツピングされている（Ｐｏｕｓｔｋａら）） 、家族性多飲遺伝子座のようなある新生物中に包含される成長因子が、ヒト染色 体４の小領域のため単離される（Ｂｏｄｍｅｒら）。本発明の方法は、特異的疾 病関連遺伝子生成物の同定を援助するために利用され得る。図１６は、特異的疾 病−関連遺伝子座およびそれらの遺伝子生成物の同定に導く、利用できるアプロ ーチの一般的概説を提供するゲノムＤＮＡフラグメントの単離について上で概説 した技術を用いて、疾病関連遺伝子座に対応するゲノムＤＮＡ領域の長距離の制 限地図が構成できる。興味のあるゲノムＤＮＡを含む、多数の潜在的出発材料、 例えば、酵母人工染色体、ハイブリッド細胞系、および染色体ジャンピングによ り得られるＤＮＡフラグメント（Ｃｏｌｌｉｎｓら）か、セクションＩＩ−Ｂに おいて論ぜられているように利用できる。次いで、ｒＬ−５の領域中のゲノムＤ ＮＡの単離のために使用される技術の適用により、疾病関連遺伝子座の領域のた めの既知の遺伝標識形質を同様に使用してこれらの領域からゲノムＤＮＡ５を単 離でき、次いで、これらの選択されたゲノムＤＮＡ５をプローブとして使用して 、対応する、通常のおよび疾病状態の試料からのｃＤＮＡ分子を選択できる。

興味のある領域からの候補ｃＤＮＡｓを次いで単離しそして種々の方法により比 較して通常のおよび疾病状態試料の間の相違をめることかできる。１つのアブロ ーチは、上記控除方法を使用して、一方の試料中に存在するか他方の中には存在 しないｃＤＮＡｓを検出することである。もう１つのアプローチは、上記技術を 用いてｃＤＮＡｓの小さいセットを直接選択することである。単離したｃＤＮＡ ｓ中の特定の変異を同定するために、以下のものを含む、多数の系か使用され得 る：　（１）単塩基対交替を同定するだめの、改造した、変性する勾配ポリアク リルアミドゲルの使用、および（２）野性型ＤＮＡ、ｓと比較することにより検 出される変異の位置をマークするための、組み込まれたビオチン化ヌクレオチド の使用。同様に、部分的ＤＮＡ配列分析を使用して、異なる試料から得られた候 補ｃＤＮＡｓのマツチングおよび比較を促進すること、および、配列データベー ス（例えば、Ｎ、　１．　Ｈ，ＧｅｎｅＢａ、ｎｋ）中に存在する既知の配列へ のそれらの相同性に基づいて候補者を除去することができる。

以下の例は、フラグメント増幅および単離の、および上述したｃＤＮＡ単離の方 法を説明しているか、決して、方法およびその適用範囲を限定することは意図さ れていない。

プラスミドｐｉＡＮ＋３は、叶、　Ｂｒ１ａｎ　５ｅｅｄ　（ＭＩＴ）から入手 された。大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株ＫＭ３９２．サプレッサー陽性株は、叶、 　Ｋｅｖｉｎ　Ｍｏｏｒｅ、　ＤＮＡＸ、　Ｐａｌ。

Ａｆｔ、カリフォルニア州から入手された。大腸菌株ＬＧ７５．サプレッサー陰 性株は、Ｄｒ、　Ｂｒ１ａｎ　５ｅｅｄ　（ＭＩＴ）から入手された。λファー ジＣｈ２１ａは、Ｄｒ、　Ｆｒ（Ｃｈ２＋ａＬＪ）の間に挿入された。Ｐ３プラ スミドを含む大腸菌株ＭＣ１０６１は、叶、　Ｂｒ１ａｎ　５ｅｅｄ　（ＭｉＴ ）から入手された。

末端トランスフェラーゼ（子牛胸腺）、アルカリ性ホスファターゼ（子牛腸）、 ポリヌクレオチドキナーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウフラグメ ント）、およびＳｌヌクレアーゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＩｎｄｉａＩＩて完全に消化することによって作 られる、ｐｈｉＸ１７４フラグメントは、ＢＲＩ。Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　 （Ｂｅｔｈｅｓｄａ、メリーランド州）から入手された。

Ｓｍａ　Ｉ、ＥｃｏＲＩ、Ｎｏｔ　Ｉ、Ｔ４ＤＮＡリガーセおよびＴ４ＤＡＮポ リメラーゼは、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　（Ｂｅｖｅｒｌｙ、 　？サチューセッツ州）から入手された：そしてストレプトアビジンアガロース は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、メ リーランド州）から入手された。低ゲル化温度アガロース（Ｓｅａ　Ｐｌａｑｕ ｅ）は、Ｆ　Ｍ　Ｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、メイン州）から入手された。ニトロセ ルロースフィルターは、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌから入手さ れた。

合成オリゴヌクレオチドリンカーおよびプライマーは、市販の自動化オリゴヌク レオチド合成機を用いて調製した。代わりに、あつらえの、設計された合成オリ コ゛ヌクレオチドを、例えば、５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（Ｓａ ｎ　Ｄｉｅｇｏ、カリフォルトニア州）から、購入することかできる。ｃＤＮＡ 合成キットおよびランダムブライミング標識化キットは、Ｂｏｅｈｒｊｎｇｅｒ −Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｊｃａｌ　（ＢＭＢ、　Ｉｎｄｉａｎａｐ ｏｌｉｓ。

インディアナ州）から入手された。

アニーリング前のまたは標識化するための一本鎖のリン酸化（ｋｉｎａｓｉｎｇ ）は、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，６，１０ｍＭ　！ｌ１ｇＣ１ｔ　、　５ 　ｍＭ　ジチオトレイトール、１〜２ｍＭＡＴＰ、１．７　ｐｍｏｌｅ　７”Ｐ −Ａ　ＴＰ　（２，９ｍｃｉ／ｍｍｏｌｅ）、０．１ｍ１ｉｌ　スペルミジン、 Ｏ，１ｍＭＥＤＴＡの存在下に、過剰の、例えば、！ｎｍｏ　］　ｅ基質に対し て約ｌＯ単位のポリヌクレオチドキナーゼを用いることによって行われる。

部位−特異的ＤＮＡ開裂は、当該技術において一般に理解される条件下に適当な 制限酵素（または酵素）を用いて処理することにより行われ、そしてその詳細な 点は、これらの市販の制限酵素の製造業者によって特定されている（例えば、Ｎ ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｃａｔａｌｏｇを 参照のこと）。一般に、プラスミドまたはＤＮＡ配列約１μｍは、緩衝溶液約２ ０μｌ中１単位の酵素によって３７℃で１時間消化後に開裂される；本明細書中 の例においては、一般に、過剰の制限酵素を使用して、ＤＮＡ基質の完全な消化 を保証する。

変動は、容易に黙認できるが、約３７°Ｃでの約１時間〜２時間のインキュベー ション時間は、実際に使える。各インキュベーション後、タンパク質を、フェノ ール／クロロホルムを用いた抽出によって除去し、次いで、エーテル抽出し、そ して核酸を、エタノール（７０％）を用いた沈澱によって水性フラクションから 回収する。所望であれば、開裂したフラグメントのサイズ分離を、ポリアクリル アミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動により標準の技術を使って行う二とか できる。サイズ分離の一般的記載は、Ｍｅｔｈｏｃｌｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ　（＋９８０＞６５：４９９−５６０に見出される。

制限開裂フラグメントは、４つのデオキシヌクレオチドトリホスファート（ｄＮ ＴＰｓ）の存在下に、５０ｍＭＴｒｉｓ　ｐＨ７，６，５０ｍＭＮａＣ１，６ｍ ｌＪＭｇＣ１ｔ　、６ｍＭ１）ＴＴおよび０．１〜１．　Ｏｍ　ｄＮＴＰｓ中で ２０℃〜２５℃で約１５〜２５分のインキュベーション時間を用いて、大腸菌Ｄ ＮＡポリメラーゼＩ（フレノウ試薬）の大きいフラグメントで処理することによ り平滑末端化され得る。フレノウフラグメントは、５°一本舗オーバーハングで ４つのヌクレオチドの存在下に満たされる。

所望であれば、選択的修復が、オーバーハングの性質によって要求される制限内 でその、または選択された、ｄＮＴＰｓの１つだけを供給することによってなし 遂げられ得る。フレノウ試薬で処理した後、混合物を、フェノール／クロロホル ムを用いて抽出しエタノール沈澱させる。Ｓ１ヌクレアーゼを用いて適当な条件 下で処理して、ＤＮＡの一本鎖部分を加水分解する。特に、ｃＤＮＡの合成時に 形成される５゛ヘアピンのニラキングが達成される。

連結反応は、次の標準条件および温度の下で１５〜５０μｍ容積の中で行われる １例えば、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ　 、１０　ｍＭ　ＤＴＴ　、３３ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、１．０　ｍ１Ｊ−５０ｍ！ ｉｔ　ＮａＣ１、および４０ｍＭＡＴＰ、１４℃で０．０１〜０．０２　（Ｗｅ ｉｓｓ）単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（「付着末端」連結反応のため）または１ｍＭ ＡＴＰ、１４°Ｃて０．３〜０．６　（Ｗｅｉｓｓ）単位Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ 「平滑末端」連結反応のため）のいずれか。分子間「付着末端」連結反応は、通 常、３３〜１００ｍｇ／ｍｌの全ＤＮＡ濃度（５〜Ｉ００ｎＭの全最終濃度）で 行われる。分子間平滑末端連結反応は、１ｍＭの全最終濃度で行われる。

「ベクターフラグメント」を用いたベクター構築において、５′ホフフアートを 除去しベクターの自己連結反応を避けるために、ベクターフラグメントを一般に 細菌アルカリ性ホフファターゼ（ＢＡＰ）または子牛腸アルカリ性ホスファター ゼ（ＣＴＰ）を用いて処理する。消化は、ｐＨ８で約１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣ Ｉ　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ中で、６０°Ｃで１時間ＢＡＰ１ｍｇあたり約１単位ま たは３７°Ｃて約１時間ベクター１ｍｇあたり１単位またはＣＩＰを用いて行わ れる。核酸フラグメントを回収するために、調製物を、フェノール／クロロホル ムで抽出しそしてエタノールで沈澱する。代わりに、再連結反応か、付加的な制 限酵素消化および必要てないフラグメントの分離により二重に消化されたベクタ ー中で妨げられ得る。

例２ 二重ＤＮＡフラグメントの増幅 Ａ、　ｐｉＡＮ１３プラスミドの修飾および増幅プラスミドｐｉＡＮ１３は、ア ンバー変異を抑制できる５ｕｐＦサブレ、サー遺伝子を持つ。このプラスミドを 、Ｓｍａｌを用いる消化により線形化しそしてその配列か図２中の八に示されて いるリンカ−に、ｌ　：　１００モル比てＴ４ＤＮＡＩＪガーゼの０．３〜０． 　６Ｗｅｉｓｓ単位の存在下に連結する。リンカ−付着末端を、慣例に従って、 フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントで満たし、そして、この混合物をＮ二ｕ ｌて処理してリンカ−二量体を開裂した。ＳｍａＩリンカ−を、上記条件と同様 の連結反応条件下にプラスミドフラグメントの平滑末端に付着した。

Ｓｍａｌで処理して余分のＳｍａＩリンカ−を除去した後、フラグメントを再環 状化した。これは、約ｌμｇ／ｍｌのフラグメント濃度で、４．０００単位／ｍ ｌＤＮＡリガーゼの存在下に、約１４℃で１８時間行われた。結果として得られ Ｐ３プラスミドを含む大腸菌株ＭＣ１０６１を、再環状化プラスミドを用いて形 質転換し、そして好結果のプラスミドの選択を、カナマイノン、アシピノリン、 およびテトラサイクリンの存在下ての細菌の成長に基づいて行った。プラスミド を、耐性細菌コロニーから単離しそしてＳｍａ　Ｉで切断して、所望のＡ−配列 末端リンカ−を有する平滑末端の、線形化フラグメントを作る。

１、　５ｍＭ　ＭｇＣｌ＊を含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ緩衝液、ｐＨ８，３ （緩街液Ａ）１００μｌにｌＸｌ０−３μｇの線形化プラスミド、配列ｄ（５° 　−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＣ；ＣＴＣＧ−３’　）を有するプライマー２ μＭ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ各々２００μＭ、および Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｅｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｇポリメラー ゼ）５単位を添加した。反応混合物を、変性のために１時間で９４°Ｃに加熱し 、ブライマーアニーリングのために２分間で５０°Ｃに冷却し、次いでＴａｇポ リメラーゼによるプライマー伸長を考慮して５〜１２分間で７２°Ｃに加熱した 。連続加熱、冷却、およびポリメラーゼ反応を佳う、複製反応を、さらに２５回 、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ熱サイクラ−（ｃｙｃｌｅｒ ）を用いて繰り返した。

Ｂ、ｐｈｉＸ１７４フラグメントの増幅Ｈａｅｉｒｌ平滑末端フラグメント１１ ００ｎを含む５０μｍ溶液に、配列か図２中のＣに示されているリンカ−３００ ｎｇを添加し、その際ＤＮＡリガーセの存在下でリンカ−の連結反応が上述した ように行われた。この混合物をＮｒｕｌで処理してリンカ−二量体を開裂した。

緩衝液Ａ１００μｌに、ｐｈｉＸ１７４／ＨａｅＩＩＩフラグメントＩｎｇ、配 列ｄ　（５’　−ＣＡＣＧＣＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＧ−３’　）を育するプライ マー２μＭ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ各々２００μＭ１ およびＴａｇＤＮＡポリメラーゼ５単位を添加した。反応混合物を変性のために １時間で９４℃に加熱し、ブライマーアニーリングのために２分間で５０゛Ｃに 冷却し、次いでＴａｇポリメラーゼによるプライマー伸長を考慮して５〜１２分 間で７２°Ｃに加熱した。複製反応工程を、上述したように２５回繰り返した。

増幅したフラグメントを、以下、ｐｈｉＸ／リンカー−Ｃフラグメントと呼ぶ。

ｐｌ〕ｊＸＩ７４フラグメントの第二調製物を、同様の方法により、しかし、ｐ ｉＡＮ１３増幅において使用した配列−Ａリンカ−を用いて増幅した。この調製 物を、以下、ｐｈｉＸ／リンカー−へフラグメントと呼ぶ。

例３ ｐｉＡＮ１３配列の選択 Ａ、増幅したｐｈｊＸ１７４フラグメントのビオチン化例２−Ｂにおいて作られ た増幅したｐｈｉＸ＋７４／リンカー−Ｃフラグメン１３頁）に従ってフレノウ 充填反応（ｆｉｌｌ−ｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）によりビオチン化する。

手短に言えば、反応混合物は、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７，２）、２ｍ Ｍ　ＣＯＣｌ２．０．２　ｍＭ　ＤＴＴ、　４０℃Ｍ　Ｂｌｏ−７−ｄＡＴＰ　 Ｓｌ　００μＭ　ｄＴＴＰ中１００μｇ／ｍｌフラグメント、および１００単位 ／ｍｌクレノウフラグメントからなる。２５°Ｃで４５分間インキュベーション した後、この反応を、６５°Ｃで１０分間加熱することにより終えた。

Ｂ、ハイブリッド形成反応 増幅したｐｉＡＮ１３ベクターを、種々のモル比で、例２−Ｂにおいて作られた ｐｈｉＸ／リンカー−Ａフラグメントと混合する。１：１００，１：３０および ｌ：３のｐ　１ＡＮ１３　：　ｐｈｉ／リンカー−Ａフラグメントの重量比で含 む混合物を調製する。各混合物を次いで、２Ｍグアニジニウムイソチオシアナー トを含むアニーリング緩衝液（ｐＨ５，８）中で、上述したように調製した、１ ０倍モル過剰のビオチン化ｐｈｉＸ／リンカーーＣフラグメントと混合する。こ の混合物を５分間で６５℃に加熱し、次いで２５℃に冷却し、そして１２時間ハ イブリッド形成する。

Ｃ，アフィニティークロマトグラフィーによる分離シリコーン化ガラスウールで 栓をした１ｍｌシリコーン化注射器に、０，５ｍｌのストレプトアビジン−アガ ロースを詰めそして１ｍＭＥＤＴＡを含む、ｌ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ、０．　 ５ＭＮａＣ１，ｐＨ７，０（溶出緩衝液）で洗浄する。上からの３つのハイブリ ッド形成混合物の各々の一部を、ＥｔＯＨ沈澱しく７０％）、１０ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ　ＨＣＩ、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，０中で再懸濁し、次いで、数容積の カラム溶出緩衝液で洗浄されるカラム上に載せる。

各混合物について、ストレプトアビジンカラムからの溶出フラクションを合わせ そしてエタノール沈澱によりＤＮＡを濃縮する。ＤＮＡを、緩衝液Ａ中で、０． ０１℃ｇ／ｍｌの濃度まで再懸濁し、そして配列ｄ　（５’　−ＧＣ；ＡＡＴＴ ＣＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧ−３’　）を有する上記プライマー２μＭ１およびｄＡ ＴＰ。

ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ各々２００μＭ、およびＴａｇボリメラー セ５単位と混合する。反応混合物を９４°Ｃで１時間変性し、ブライマーアニー リングのために５０℃に冷却し、そしてプライマー伸長を、７２℃で５〜１２分 間行う。

１１Ｎ２Ａから認識できるように、上記の３つの溶出混合物の各々からのフラグ メントを、Ｎｏｔｌで切断して、フラグメントのリンカ−領域中にＮｏｔｌ付着 末端を作る。フラグメント（１３℃ｇ／ｍｌ）を、６０℃ｇ／ｍ１Ｎｏｔ　Ｉ− 消化ファージＣｈ２１ａ、ＬＪと混合し、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下に フｙ　−ジ中のＮｏｔＩ部位に挿入する。カプセル化後、ファージを使用して大 腸菌株ＫＭ３９２．サプレッサー−陽性株、および大腸菌株ＬＧ７５．サプレッ サーー陰性株を感染する。この株は、ファージアンバー変異を抑制でき、従って 、そのＡおよびＢ遺伝子のファージ発現を可能にするので、ＫＭ３９２株中で作 られるプラークの数は、組換えファージの総数の尺度を提供する。ＬＧ７５株中 で、対照してみると、５ｕｐＦ遺伝子は、サプレッサー陰性細菌株中のファージ の成長のために必要とされるので、ｐｉＡＮ１３フラグメントを組み込んだファ ージだけかプラークを作る。２つの宿主株に関するプラークの比は、従って、フ ラグメント混合物中のｐｉＡＮＩ３フラグメントの比を示している。対照として 、ハイブリッド形成およびストレプトアビジン分離の前の３つの混合物中のフラ グメントの比が同様に測定される。

例４ 増幅ｃＤＮＡフラグメント混合物のスクリーニングＡ、胆汁から得られるｃＤＮ Ａｓ ２匹のカニクイザルに、ヒトボランティアから得られたＥＴ−ＮＡＮＢについて 陽性の大便の１０％サスペンションを静脈内注射した。既知のＥＴ−ＮＡＮＢ患 者からの免疫血清に大便中のウィルス様粒子（ＶＬＰｓ）を結合することにより 大便がＥＴ−ＮＡＮＢについて陽性であることを測定した。サルは、接種後２４ 〜３６日の間アラニンアミノトランスフェラーゼ（Ａ　Ｌ　Ｔ）の高めれたレベ ルになり、そして感染のプレー急性槽におけるそれらの大便中２７〜３０　ｎｍ ＶＬＰｓを排泄した。該動物は、接種材料中のＶＬＰｓについて血清陽性になっ た。

各感染動物の胆汁管にカニユーレを挿入しそして約１ｃｃの胆汁を集めた。ＲＮ Ａを、胆汁から、標準ＲＮＡ単離手順により、熱フェノール抽出により抽出した 。二本１ｉ！ｃＤＮＡを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　（ｌｎｄ ｉａｎａｐｏ［ｉｓ　、インディアナ州）から入手したｃＤＮＡ合成キットを用 いて、単離したＲＮＡから、第−鎖作製のだめのランダムプライマーにより形成 した。

非感染カニクイザル胆汁からのｃＤＮＡフラグメント混合物を同様に調製したＢ 、大便から得られるｃＤＮＡｓ ヒト大便試料から得られたｃＤＮＡフラグメントを次のように調製した　健康な またはＥＴ−ＮＡＮＢ感染した個体からの大便試料の１０％サスベンソヨンを、 ３０％蔗糖密度勾配クッションを介して重層し、そして２５ｋｇで６時間５Ｗ２ ７０−ター中で、１５°Ｃで遠心分離した。ベレット化した材料は、感染した大 便試料中のＥＴ−ＮＡＮＢ惑染に特有な２７〜３２ｎｍＶＬＰ粒子を含んでいた 。ＲＮＡを、感染したおよび感染していない試料の両方における蔗糖勾配ペレッ トから単離し、そして単離したＲＮＡを使用して、例２に記載したようにｃＤＮ Ａフラグメントを作った。

Ｃ，ｃＤＮＡフラグメント混合物の増幅感染したおよび感染していない胆汁源か らの、ならびに感染したおよび感染していないヒト大便源からの、ｃＤＮＡフラ グメント混合物を、本発明の方法による、リンカ−／プライマー複製により、そ れぞれ増幅した。手短に言えば、各試料中のフラグメントを、ＤＮＡ　Ｐｏｔ　 Ｉで平滑末端化し、次いでフェノール／クロロホルムで抽出しそしてエタノール を用いて沈澱した。平滑末端化材料を、例２に記載したのと同様の条件下に、図 ２において示されるリンカ−Ａと連結し、そして、この混合物をＮｒｕｌで消化 してリンカ−二量体を除去した。各混合物を、緩衝液Ａ中最終濃度０．０１μｇ ／ｍｌにし、そしてこれに、配列ｄ（５°　−ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣ ＴＣＧ−３’　）を有する、２μｍのプライマー、およびｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、 ｃｌＧＴＰ、およびｄＴＴＰ各々２００μＭを添加した。反応混合物を、変性す るために１分間で９４℃に加熱しそしてブライマーアニーリングのために２分間 で５０℃に冷却し、次いで、Ｔａｇポリメラーゼによるプライマー伸長を考慮し て５〜１２分間で７２°Ｃに加熱した。連続加熱、冷却、およびポリメラーゼ反 応を包含する、復製反応を、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＡＮ熱 サイクラ−を用いてさらに２５回繰り返した。

Ｄ　増幅ｃＤＮＡ混合物のスクリーニング上からの４つの増幅したｃＤＮＡフラ グメント混合物を、２％アガロースマトリックスを用いて、アガロースゲル電気 泳動により分別した。アガロースゲルからのＤＮＡフラグメントをニトロセルロ ース紙に移した後、このフィルターを、ＥＴ−ＮＡＮＢウィルス剤に関連した３ ２Ｐランダム−開始１．３３ｋｂフラグメントにハイブリッド形成した。ｐＴＺ −ＫＦＩ　（ＥＴｌ、Ｉ）プラスミド中にあるこのフラグメントの由来および配 列は、ＡＴＣＣＮａ６７７１７により同定される。クローン化フラグメントを、 ｐ、ＴＺ−ＫＦＩ　（ＥＴｌ、１）プラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、（ｉ　ｉ ）関連した１、３３ｋｂＥＴ−ＮＡＮＢフラグメントを単離し、そして（ｉ　ｉ 　ｉ）単離したフラグメントをランダムブライミングすることにより得た。

分別したｃＤＮＡ混合物を用いたプローブハイブリッド形成を、慣用のザザンプ ロット法（Ｍａｎ　ｉａ　ｔ　ｉ　ｓ、第３８２〜３８９頁）により行った。図 ６は、感染したおよび感染していない胆汁源からのｃＤＮＡｓを用いて得られた ハイブリ・ンド形成パターンを示している。理解されるように、ＥＴ−ＮＡＮＢ プローブは、感染した源から得られた増幅フラグメントでハイブリッド形成した か、感染していない源から得られた配列に非相同であった。同様の結果か、感染 したおよび感染していないヒト大便源から得られた増幅フラグメントて得られた 。この方法は、増幅の前の当量のｃＤＮＡは検出できるハイブリッド形成シグナ ルを生しないであろうから、記載した発明の効用を証明している。

例５ Ｉｔ−５をコード化している遺伝子に隣接する領域からのゲノムＤＮＡの単離１ 、大きいＤＮＡフラグメントの調製 ハイブリッド細胞系ＨＨＷＩ　０５　（Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒら）をゲノムＤＮ Ａのソースとして使用した。この細胞系は、ヒト染色体５の全てを含んでいる。

ヒト染色体を、対応する欠陥ハムスター遺伝子を補足するヒト染色体５上のロイ シンアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子について選択することにより保持 する。このハイブリット細胞系を使用して染色体５配列の即時の濃縮を得た。

ｒＬ−５をコート化している遺伝子は、染色体５の５ｑ３１．３領域中に位置し ている（ＬｅＢｅａｕら）。ゲノムＤＮＡを、細胞系ＨＨＷ１０５から単離しく Ｍａｎｉａｔｉｓら、　Ｓｍ１ｔｈら）そして種々の制限エンドヌクレアーゼで 消化した。結果として得られたゲノムＤＮＡフラグメントを、パルス−電界ゲル 電気泳動（Ｐｕ　１ｓｅ−Ｆ　１ｅＩｄ　Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓ ｉｓＸＣａｒｌｅ　＆　０１ｓｏｎ）によりサイズ分別した。このゲル中のＤＮ Ａフラグメントを次いでニトロセルロース（Ｓｏｕ　ｔｈｅｒｎ）に移しそして ニトロセルロースフィルターを、ランダム−開始ＩＬ−５ｃＤＮＡフラグメント （Ａｚｕｍｅら）でハイブリッド形成した。ｒＬ−５プローブでハイブリッド形 成するＮｏｔｌフラグメントを同定した。この５００キロベース（ｋｂ）のＮｏ ｔｌフラグメンめの標的領域として選択された。このフラグメントのＭ製は、図 ８に概説されそして以下に記載されている。

５ＸｉＯ’細胞を取り出しそしてＤｕｌｂｅｃｃｏのＰｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕ ｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌ　１ｎｅ（Ｐ　ＢＳ）中で一回洗浄した。この細胞を、Ｐ ＢＳ中でｌＸｌ０’細胞／ｍｌで再懸濁し、そこに、当容積のし一緩衝液（５０ ｍＭ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ８）および５０℃で保持された １％低ゲル化温度（ＬＯＴ）アガロース（ＦＭＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を添 加した。プロテイナーゼＫを次いで０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。

この混合物を、ブロックフォーマ（ｂｌｏｃｋ　ｆｏｒｍｅｒｓ）に静かにピペ ットで分注しそしてこのブロックを固体化する。次いでこれらのブロックを、５ ０ｍ１円錐管中に置き、４０ｍ１の０．　５ＭＥＤＴＡ、ｐＨ＝９．１％サルコ シル（ｓａｒｋｏｓｙｌ）、および２００μｇ／ｍｌプロテイナーゼに中にすっ かり浸し、次いて一晩５０℃でインキュベーションした。溶液の４０ｍ１を次い で、１ｍＭの最終濃度でＰＭＳＦを含むし一緩衝液に取り替えそして２時間室温 でインキュベーションした。この洗浄を繰り返した。次いてブロックを２回、各 洗浄について２時間のインキュベーションと共に、ＴＥ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ 　ＨＣＩ　、　１）Ｈ＝８．１ｍＭＥＤＴＡ）中で室温で洗浄した。

Ｂ、第一〇）（ＥＦゲル １％ＬＧＴアガロース、０．５ＸＴＢＥ　（５ＸＴＢＥ保存溶液、１リツトルあ たり　Ｔｒｉｓ　Ｂａ５ｅ５４　ｇ、ホウ酸２７５ｇ、および０．　０５Ｍ　Ｅ ＤＴＡ（ｐｔｌ＝８’＞　２０　ｍ　１．　）ゲルを、４つの慣用のウェルおよ び１つの長い予備ウェルを入れて、流した。ＨＨＷＩ　０５ＤＮＡの１６のブロ ックを、各１時間の２回のインキユヘーンキュベーションした：１５ｍ１コＬ／ ツクス（ｃｏｒｅｘ）管中に１６ブロツク、２００μｍのｌ０ＸＮｏｔｌ緩衝液 、２０μｍの１０ｍｇ／ｍＩアセチル化ウノ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２００ μｍのＮｏｔｌ酵素（ｌμｌあたりｌＯ単位）、１５６０μｍの水。ブロックを 次いで２時間１ｍＭのＰＭＳＦ中で処理した。１個のブロック、λＤＮＡはしご 状サイズマーカー（ｃｌ、８５７５７、ＦＭＣＢｉｏｐｒ。

ｄｕｃｔｓ）およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｅｅｓ　ｐｏｍｂｅ染色 体ＤＮＡ　（９７２，ＦＭＣＢｉｏｐｒ。

ｄｕｃｔｓ）を、慣用のウェル中に負荷した。残りのブロックを６５℃に加熱し 、溶融しそして溶融した状態で、予備ウェルに負荷した。ゲルを、標準ＣＨＥＦ ゲル条件下に（Ｓｍｉｔｈら、ｃｈｕら）４８時間２００ｖて８２秒のスイッチ 間隔て動かした。４つの慣用のレーンを含むゲル部分を次いで予備ウェルから切 り離しそしてエチジウムプロミドで染色した（図ＩＡ、第−ＣＨＥＦゲルを参照 ）。ＣＨＥＦゲルトラックが、曲線状よりむしろ直線状であるので、ゲルを横切 ってサイズ範囲をカバーするＤＮＡフラクシタンを集めることかできた。ゲルの 予備部分を、カバーグラスを用いて、ゲルの下方に全部で３０のスライスについ て、約＋０００ｋｂ〜１５０ｋｂのサイズ範囲をカバーする１〜２ｍｒｎのスラ イスに、スライスした。

Ｃ，ｌ−５を含むフラクションの同定 １−５を含むフラクションの同定は、ＩＬ−５特異的プライマー（ＩＬ−５−５ ’　＝５’　−ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＧＡＴＧＣＴＴＣＴＧＣＡＴＴＴＧ −３’　；ｒＬ−５−３°＝５’　−ＧＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＣＴＴＴＣＴＡ ＴＴＡＴＣＣＡＣＴＣＧＧＴＧＴＴＣＡＴＴＡＣ−３’　）を用いて配列−特異 的増幅により行われた。ＤＮＡを、ゲルの各スライスのｌｍｍＸ２ｍｍ部分から 抽出した：各スライスの残りを、ＩＬ−５−相同フラグメントを含むフラクショ ンを同定するまで貯蔵した。ｌＸ２ｍｍ試料を、マイクロッアブ（ｍｊｃｒｏｆ ｕｇｅ）管中に置き、アガロースか溶解するまで（約５分）６５℃に加熱し、静 かに混合しぞして２０μｍのアリコートを、ＰａｒａｆｉｌｍＴＭの断片上に置 きそして固体化してアガロースビーズにする。アガロースビーズを、２００ｍ１ の１×複製連鎖反応緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｇｅｎｅ 　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）中に置きそして室温で３０分間平衡化 した。次いで緩衝液を除去しそして次の標準反応混合物をアガロースビーズに添 加した：１６μＩの！、２５ｍＭ　ｄＮＴＰｓＳＩ　Ｏｔｔ　１のＩＯＸ複製連 鎖反応緩衝液、５μｍの２０μＭＩＬ−５−３°プライマー、５μＬの２０μＭ ＩＬ−５−５’　、６３．５μｍの水。この混合物を、アガロースか溶解するま で６５°Ｃに加熱し次いでＴａｇｌＤＮＡポリメラーゼ０．５μｍを添加した。

この混合物を一時的に渦巻状にしくｖｏｒｔｅｘ）、鉱油の薄層をこの反応混合 物の上部に置き、そして増幅反応を次の条件下に行った２９４°Ｃで１分間変性 、５０°Ｃで１分間アニーリング、７２°Ｃて２分間伸長、２５サイクルの繰り 返し。増幅に続いて、慣用のアガロースゲルを動かしてＩＬ−５を含むフラクシ ョンを測定する（図９を参照、複製連鎖反応生成物）：並行して、３つの対照！ ｙ製連鎖反応を各ゲル上で行った：　ＩＬ−５プライマーでヒトＤＮＡ、ＩＬ− ５プライマーでハムスターＤＮＡ、そしてｆＬ−５プライマーのみ。ＮｏｔＴ消 化）ｆＨＷ１０５ゲノムＤＮＡのおよび複製連鎖反応生成物の一本のＣＨＥＦゲ ルトラックの例が、図９に示されている。この図から理解されるように、１つの ＤＮＡ試料はＩＬ−５フラグメントの大部分を含んでいた：この複製連鎖反応生 成物は、ヒトＤＮＡ対照複製連鎖反応生成物と共役した（ｃｏｍｉｇｒａｔｅ） 。ハムスターＤＮＡおよびプライマーだけか、複製連鎖反応生成物を示さなかっ た。

Ｄ、第二ＣＨＥＦゲル 関連したフラグメントを、汚染するハムスターフラグメントから、さらに精製す るために、ＩＬ−５陽性複製連鎖反応生成物に対応するスライス中のＤＮＡをし たようにスライスし、各スライスから得られるＤＮＡの小アリコートを、ＩＬ− ５＝特異的プライマーで複製連鎖反応増幅して陽性のフラクションを決定する。

複製連鎖反応増幅生成物を、慣用のアガロースゲル上で分け、ＤＮＡ分子をニト ロセルロースに移し、そして、この場合、ＫＬ−５−特異的フラクションを、放 射能標識化ＫＬ−５ｃＤＮＡプローブを用いたハイブリッド形成により同定した 。結果として得られるオートラジオグラムは図１０に示されている。

Ｅ、配列に無関係な増幅によるＩＬ−５陽性フラクシヨンの増幅ｃＤＮＡライブ ラリースクリーニングにおいて使用するためのおよびこれらのゲノムフラグメン トのライブラリーを構成するための、これらのゲノムＤＮＡフラグメントの十分 量を得るために、ゲノムＤＮＡフラグメントを、セクションＣに記載した配列に 無関係な単一プライマー増幅（ＳＩＳＰＡ）方法を用いて増幅した。リンカ−添 加に必要な平滑末端分子を発生させるために、第二〇ＨＥＦゲル中で同定される 適切なサイズフラクションからのＤＮＡを、ＤＮＡ中でヘキサヌクレオチド認識 部位で平滑末端切断部を発生させるＥｃｏＲＶで消化した。消化生成物を、慣用 の０．８％アガロースゲル上でサイズマーカーを用いて並行して分別した。ゲル を、９０°回転させそして消化ＤＮＡを、荷電メンブランフィルタ−（ＮＡ４５ ．５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ）上で電気泳動した。フィルター を、１０片に切断し、５つは、２ｋｂまたはそれ以下の大きさのＤＮＡ５の位置 に対応しており、そして５つは２ｋｂより大きい大きさのＤＮＡ５に対応してい た。ＤＮＡ５をフィルターから非常に小容積中で（溶出緩衝液：　ＩＭ　ＮａＣ １，５０ｍＭ了ルギニン１時間６５℃で）溶出し、フェノール／クロロホルムで 抽出し、そしてキャリヤーｔ−ＲＮＡの存在下に沈澱した。約２ｋｂ長さより大 きいＤＮＡ５を、ＨａｅｌｌＮおよびＲｓａｌを用いてｌまたはそれ以上のセッ トの制限エンドヌクレアーゼ消化に付した；これらの酵素は共に、平滑末端を発 生させてそして４つの塩基対部位を認識する。この方法において、より大きいＤ ＮＡ５をより有効に増幅できる長さに減じた。ｌＯのフラクションの各々をＴ４ ＤＮＡリガーセを用いて八−リンカ−に連結しく図２−Ａ）次いでＮｒｕｌで切 断して連結反応において形成されたいかなるリンカ−二量体をも除去した。制限 エンドヌクレアーゼ消化反応の容積は１００μｌまで増加した。次いでフラクシ ョンを５ｅｐｈａｄｅｘ”Ｇ−５０に通した（Ｍａｎｊａｔｉｓら、第４６６頁 ）。

次いてゲノムフラグメントを、セクションＣおよび例２に記載したようにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｈｎｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）およびＡプ ライマーを用いて次の条件下に増幅した・リンカ−フラクション山ｎｋｅｒｅｄ 　ｆｒａｃｔｉｏｎ）　２５　ａ　Ｉ、２゜ｕＭＡプライ７−５μｌ、ＩＯＸ増 輻増芯反応緩衝液１ｔｔ　Ｉ　（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　）ＩＣＩ、ｐＨ＝８． ３，５００ｍＭ　ＫＣＩ、１５ｍＭ　ＭｇＣ１＊　、０．　１％（ｗ／ｖ）ゼラ チン）、１．２５ｍＭｄＮＴＰｓ１６μｌ、水４３．５μｌ、Ｔａｑｌ　ＤＮＡ ポリメラーゼ０．５μｍ。反応混合物を次の期間２５回循環させた＝１分間９４ °Ｃで変性、１分間５０°Ｃでアニーリング、そして２分間７２゛Ｃで伸長。各 増幅フラクションのアリコートを［１ＷＩＩに示される１％アガロースゲル上で 分離した。増幅生成物のスミャ（ｓｍｅａｒ）か見られた。並行して処理したキ ャリヤーｔ−ＲＮＡは増幅していない。図１１のもっと先の最も右手のレーンは 、サイズ標準λＨｉｎｄｌＩＩである。このゲル（最終５ＩＳＰＡゲル）中のＤ ＮＡをＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ”フィルター（ＤｕＰｏｎｔ／Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）に移し、ＤＮＡをフィルターにＵＶにより架橋し、そし てせん断されたニシン精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌを添加してフィルターを一晩 ６５℃てＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ”″緩衝液（Ｃｈｕｒｃｈ　＆　Ｇｊｌｂｅｒｔ ）中でプレーハイブリッド形成した（最終５ＩＳＰＡフイルター、例７を参照） 。

増幅したゲノムフラグメントのアリコートにトロセルロースに結合していない） を、フラグメントライブラリーの作成に使用した。

例６ Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーの調製 Ｔ細胞を、全血から、標準方法を用いて分離しそして１ｅｕ３＋フラクシヨンを 特に選択した。１ｅｕ３＋Ｔ細胞をＰＭＡ　（ｐｈｏｒｂｏｌ　ｍｙｒｉｓｔａ ｔｅ　ａｃｅｔａｔｅ）を用いて標準方法によって誘導した。ＲＮＡを６時間Ｐ ＭＡとともにポストインキュベーションした細胞から抽出し、そしてポリ−Ａ“ ＲＮＡフラクションを、Ｔ細胞全ＲＮＡから、オリゴ−ｄＴセルＣ−メカラム上 のアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。１ｅｕ３＋Ｔ細胞ｃＤＮ Ａライブラリーを、実質的にＭａｎｉａｔｆｓらにより記載されているように（ 第２２９〜２４６頁）調製した。第−鎖の合成は、オリゴ−ｄＴプライマーおよ び逆転写酵素を用いて行われた。第二鎖ｃＤＮＡ合或は、ＤＮＡポリメラーゼＩ のフレノウフラグメントの結合、次いで逆転写酵素での処理により行われた。ヘ アピン構造物は、Ｓｌヌクレアーゼで分けられた。ＥｃｏＲＩリンカ−を新たに 合成された二重ｃＤＮＡ分子上に平滑末端連結しそしてこれらの分子を、次いで クローニングの目的のためにλｄｔｌＯベクター（Ｐｒｏｔｏｃｌ、ｏｎｅＴＭ λｇｔｌＯ１Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結した。

Ｔ細胞ＤＮＡライブラリーＤＮＡの２０μｇアリコートを、ＥｃｏＲｌて消化し てｃＤＮＡ挿入断片をファージアームから遊離させる（全量の約４％が挿入断片 ＣＤＮＡである）。次いでＥｃｏＲＩ末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ フラグメント（Ｍａｎｉａｔｉｓら、第１１３頁）を用いて、ｄＡＴＰおよびＴ ＴＰで満たすことにより平滑末端に変えた。ｄＡＴＰおよびＴＴＰのみの使用は 、ＥｃｏＲ工部位だけを修復するがλのＣＯＳ部位を修復せず、従って、汚染す るファージベクターＤＮＡの両方の末端上に平滑末端を作る潜在的な問題を避け る。Ｃリンカ−（図２−Ｃ）を次いでこの全ｃＤＮＡライブラリーに連結しそし て連結反応混合物をＮｒｕｌで消化してこ量体を除去した。次いで反応混合物の 容積をＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ”緩衝液で１．０ｍｌに増加し、せん断したλｇｔ ｌＯＤＮＡを、■００μｇ／ｒｎｌの最終濃度まで添加し、そしてこの混合物を ６５°Ｃで９０分間インキユヘーションした：この混合物は例７において使用し たプローブである。

さらに、ｃＤＮＡライブラリーのこの調製物を、最終５ｒＳＰＡフイルターへの ハイブリッド形成の前に、ランダムにせん断した全てのヒトゲノムＤＮＡに、プ レーハイブリッド形成しｃＤＡＮライブラリー中に存在する反復配列にプレーブ ロックしそして従ってバックグラウンド／シグナルノイズを減することかできる （セクションｉ　ｉ　−ｂ　（Ｉ　Ｔ　Ｉ）を参照）。ｃＤＮＡライブラリーは 、増幅のための末端プライマーとしてＣ−リンカ−配列を用いて増幅することが できる（例７）。代わりに、ｃＤＮＡ分子をλｇｔ１ｏベクターから遊離する前 に、ｃＤＮＡ挿入断片の５′および３″末端に隣接する共通のベクター配列を、 ｃ　ＤＮＡ挿入断片を増幅するための末端プライマーとして使用することができ る。

例７ 染色体５から得られたゲノムＤＮＡへのＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーのハイブリ ット形成 Ａ、ハイブリッド形成および洗浄 例６で構成したＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーを、全容積１０ｍ１のＧｅｎｅＳｃ ｒｅｅ口ＴＭａ衝液中で、例１５で調製した最終５ＩＳＰＡフイラターに添加し た。ハイブリッド形成を、６５°Ｃて４８時間行った。フィルターを次いで次の 条件下に広く洗浄した。

■、各１５分間、室温でｌＸ５ＳＣ１０，Ｉ％ＳＤＳで２回洗浄。

２、各１５分間、６５°ＣでｌＸ５ｓｃ１０．１％ＳＤＳで２回洗浄。

３、各１５分間、６５°Ｃで０．ｌＸ５ＳＣ１０，Ｉ％ＳＤＳで２回洗浄。

４．２０分間、６５℃でＯ，ｌＸ５ＳＣ１０，１％ＳＤＳで最終洗浄。

Ｂ、フィルターからの選択したｃＤＮＡｓの溶出最終洗浄後、選択したｃＤＮＡ ｓを、フィルターから、５ｍｌの５０ｍＭＮａＯＨで室温で処理することにより 溶出した。この溶離液を、約２ｍｌの０．１ＭＴｒｉｓ　ＨＣＩを用いてｐＨ＝ ８．０に中和した。ｃＤＡＮｓｔ−ＮａＣＬ酵母ＲＮＡ、およびエタノールを用 いて沈澱し、次いで水１００μＩ中で再懸濁した。再懸濁したｃＤＮＡを次いで ５ｅｐｈａｄｅｘ”Ｇ　−５０カラムに通した。

Ｃ３選択したｃＤＮＡｓの増幅および分析溶離液中に存在するｃＤＮＡｓを次い でＣプライマーおよび次の条件を用いて増幅した。３０μｍの溶出材料、１０μ ｍのＩＯＸ増幅反応緩衝液、１６μｍの１、　、　２５　ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、５ μｌの２０−Ｃプライマー、４５μｍの水、０５μｍのＴａｇｌＤＮＡポリメラ ーゼ。増幅反応を次のように２５サイクル行った２１分間９４°Ｃで変性、１分 間４５°Ｃでアニーリング、および２分間７２°Ｃで伸長。増幅生成物を、慣用 のアガロースゲル上に流し生成物を調へた（ｌｉＵＩ２）。ゲル中のＤＮＡをニ トロセルロースフィルターに移しそしてこのフィルターを６の放射能標識化プロ ーブ：アクチン、ハムスターゲノムＤＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡ、ＩＬ−３特異的 （Ｙａｎｇら）、ＩＬ−５特異的（Ａｚｕｍｅら）、およびヒトミトコンドリア ＤＮＡ特異的（ＣＦ１４）（図１３）でハイブリッド形成した。

例８ ＩＬ−３およびＧＭＣＳＦを含むゲノム領域に対応するｃＤＮＡｓの選択ＩＬ− ５の分析に適用される方法を、ＩＬ−３にも適用した。Ｉ　Ｌ　−３（Ｙａｎｇ ら）およびＧ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆ　（Ｓｃｈｒａｄｅｒら）のための特異的プロー ブが知られているＩＬ−３特異的プローブを用いて、染色体５のＩＬ−３含有領 域を上述したように単離した：この領域の長距離制限地図を図１５に示す。単離 したゲノムクローンを、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦに特異的な標識化プローブ で調べることによって、我々は、１０キロベースより小さいこれらの遺伝子座の 間の物理的連鎖を示した。次いでＴ細胞ｃＤＮＡｓを、それらの、選択したＩＬ −３含有領域ゲノムＤＮＡ領域への相同性に基づいて選択した。図１４は、これ らの選択したｃＤＮＡｓの、Ｈ，、−３、ＧＭ−ＣＳＦ、およびアクチンに特異 的なプローブならびに同様に完全なヒトゲノムプローブでのハイブリッド形成を 示している。ｒＬ−３およびＧＭ−Ｃ３Ｆへの特異的ハイブリッド形成は明らか に目に見えた。アクチンへのハイブリッド形成の欠如は、ＩＬ−３およびＧＭ− Ｃ３Ｆへのハイブリッド形成か特異的であることをはっきり示しそして完全なヒ トゲノムＤＮＡへのハイブリッド形成の欠如は、選択したｃＤＮＡｓ中の多数の 反復配列ＤＮＡの不存在を示している。

Ａ、ゲノムウシ白血病ウィルスＤＮＡの調製ウソ白血病ウィルス（ＢＬＶ）ゲノ ムのクローニングおよび配列決定は、以前。

に開示されている（Ｋａｓｈｉｍｉｒｉら、Ｓａｇａｔａら）。ウィルスのＲＮ Ａゲノムに対応するＢＬＢの全長分子ＤＮＡクローンを、Ｊ、Ｆ、　Ｆｅｒｒｅ ｒ、ペンシルバニア州大学。

５ｅｈｏｏｆ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　５ｃｉｅｎｃｅから入手した。１ ００ナノグラムのＢＬＶ　ＤＮＡを熱変性して一本鎖を産しそして０．４５ミク ロンニトロセルロースフィルターにスポットした（Ｓｃｈｌｅｉｅｈｅｒ　＆　 ５ｈｕｅｌｌ）　ｏ次いでフィルターを、減圧下に７５’で２時間焼きＤＮＡを フィルターに固定した（Ｒｉｅｃｉａｒｄｉら）。次の溶液をフィルターのハイ ブリッド形成のために使用した。：　５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ、　ｐＨ＝ ７．５：　Ｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡ；０．５％ＳＤＳ＋　３ＸＳＳＣ（２０ＸＳＳＣ 保存溶液−１７５，３ｇのＮａＣ１，８８，２ｇのクエン酸ナトリウム、ｐＨ＝ ７に調整、水１１の全容積を有する）。

ＩＸＦＰＢ　（ＩＯＸＦＰＢ保存溶液＝０．２％Ｆｉｃｏｌｌ、　０．　２％ポ リビニルピロリドン、および０２％ウシ血清アルブミン）：５０％ホルムアミド （Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）；および、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、プレ ーハイブリット形成を２０時間３７℃で行った。

Ｂ、細胞系１０Ｃ９からのヒトリンパ腫関連ウィルスｃＤＮＡの調製１０Ｃ９ウ ィルス粒子を、遠心分離（１０，ＯＯＯＸｇ、４°Ｃで１５分間）により細胞破 片から清澄にした１　０Ｃ９細胞培養上清から精製し、ＡｍｉｃｏｎＴＭ限外濾 過により１００倍に濃縮し、そして２５％蔗糖クッりョン／ＰＢＳ　（１００， ０００×ｇ、９０分間４°のを通してベレット化した。結果として得られたベレ ットをＤｕｌｂｅｃｃｏのＰｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎ ｅ　（ＰＢＳ）中で再懸濁し、均一化し、そして１５−６０％蔗糖密度勾配上に 置き、１６時間１００．０００Ｘｇ、４℃で遠心分離した；１．１５〜１．１８ ｇ／ｍｌでのウィルス帯を集め、ＰＢＳで稀釈しそして超遠心分離によりベレッ ト化して蔗糖を除去した（１００．ＯＯＯＸｇ、９０分間４℃）。

ウィルスＲＮＡを粒子から、Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉらの方法により抽出し、次い でランダム開始ｃＤＮＡ合成においてテンプレートとして使用した（Ｂｏｅｒｈ ｉｎｇｅｒ−Ｍａ口ｎｈｅｉｍから入手されたキット）。ｃＤＡＮ分子をＤＮＡ ポリメラーゼＩのフレノウフラグメントおよび４つ全てのデオキシリボヌクレオ チド（Ｍａｎｉａｔｉｓら、第１１３頁）を用いて平滑末端化した。Ａリンカ− （図２−Ａを参照）を次いてｃＤＡＮ分子の末端に、Ｔ、ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて連結した。これらのｃＤＡＮ分 子を次いでＮｒｕｌで消化して連結反応中に生じたいかなるリンカ−二量体をも 除去した。１０Ｃ９ｃＤＮＡライブラリーを次いで、例２および６に記載した、 配列に無関係な単一プライマー増幅方法を用いて増幅した。

Ｃ，１Ｏｃ９ｃＤＮＡライブラリーの、ＢＬＶゲノムへのハイブリッド形成上記 プレーハイブリッド形成したフィルターを次いで３６時間３７°Ｃてｌ０ｃ９ｃ ＤＮＡライブラリーで次の条件下にハイブリッド形成した：５０ｍＭＴｒｉｓＨ Ｃ１，ｐＨ＝７．５；　１　ｍＭ　ＥＤＡＴ；　ｏ、５％ＳＤＳ　；　３ＸＳＳ Ｃ（２０ＸＳＳＣ保存溶液＝１７５．３ｇのＮａＣ１：８８．２ｇのクエン酸ナ トリウム、ｐＨ＝７ｔ：調整した、水１１の全容積を育する）；　１ＸＦＰＢ　 （１０ＸＦＰＢ保存溶液＝０．２％Ｆｉｃｏｌｌ　、０．　２％ポリビニルピロ リドン、および０．２％ウシ血清アルブミン）、５０％ホルムアミド（Ｆｏｒ証 順１ｄｅ）　；　１０％デキストランフスフアート（Ｄｅｘｔｒａｎ　５ｕｌｆ ａｔｅ）；および１００μｇ／ｍＩの１Ｏｃ９増幅ＣＤＮＡライブラリー。

ハイブリッド形成期間後、フィルターをよごれていない１．５ｍｌ微小管に移し そして洗浄の次の連続を行った： １．１５分間室温で、１００μｍの２ＸＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ。

２、段階１を繰り返す。

３．３０分間６０°Ｃで、１００μｍの２ＸＳＳＣおよび０．　１％５ＤＳ０４ ゜段階３を繰り返す。

５３０分間６０°Ｃで、１００μｌの０．５ＸＳＳＣおよび０．　１％ＳＤＳ。

６　段階５を繰り返す。

７、結合ｃＤＮＡｓの溶出を、１５分間９５〜１００℃で、１００μ＋の０゜１ 、Ｘ５ＳＣおよび０゜１％ＳＤＳで洗浄することによりなし遂げた。

８゜段階７を繰り返す。

溶離液を、慣用のアガロースゲル上に流し、ニトロセルロースに移しそしてＩＬ −５特異的プローブでハイブリッド形成した（Ｃａｍｐｂｅｌ　ｌら；　Ａｚｕ ｍｅら）；　Ｉ　Ｌ−５特異的配列の溶出は、段階７および８の溶離液中にのみ 見られた。

溶離液を、Ａプライマーを使用したことを除いて、例７Ｃに記載したように増幅 した。

例１０ ＢＬＶゲノムに相同な１０Ｃ９ウイルスｃＤＮＡｓのキャラクタリセーソヨン例 ９中の溶離液中に存在する、増幅した選択１０Ｃ９ｃＤＮＡｓを次いてクローン 化して２つのライブラリー：１ｇ　ｔ　１０　（Ｐｒｏｔｏｃｌｏｎｅ”Ａ　ｇ 　ｔ　Ｉ　Ｏ系、　Ｐｒｏｍｅｇａ）中のものおよび１ｇ　ｔ　１１　（Ｐｒｏ ｔｏｃｌｏｎｅ”Ａ　ｇ　ｔ　１１系、　Ｐｒｏｍｅｇａ）中のものを作製した 。増幅したｃＤＮＡｓの構築において使用したリンカ−は、同様に、増幅したｅ ＤＮＡｓを、λｇｔｌＯおよびｇｔｌｌベクターの両方への直接的挿入を考慮に 入れたＥｃｏＲ１部位（図２を参照）を含んでいた。

λｇｔｌｌクローンにより発現した融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅ ｉｎｓ）を抗体プローブを用いてスクリーニングしたＣＹｏｕｎｇら）。ウシ抗 −ＢＬＶ　（α−ＢＬＶ）でのスクリーニングはスクリーニングした４Ｘ１０’ プラークから数百の陽性クローンを検出した。α−ｐ２４でのスクリーニングは 、スクリーニングしたｌＯ４から１５の陽性プラークを検出し、これらの陽性は 精製したそしてα−５Ｌｙで交差スクリーニングしたプラークであり、これらの クローンの４／１５は両方の抗−血清で陽性であった。α−ｇｐ６２でのスクリ ーニングは、α−ＢＬＶで交差スクリーニングした時同様に全て陽性である４つ の陽性クローンを検出した。

λｇｔｌＯｃＤＮＡライブラリーを、ＢＬＶの全長分子クローンでスクリーニン グした。約６００塩基対挿入断片を含むλｇｔｌＯクローンのプラーク／Ｓイブ リッド形成スクリーニング（Ｗｏｏ）は、スクリーニングした２ＸｌＯ’プラー クから７６の陽性を産した。

本発明を実施する好ましい実施態様、用途、および方法を詳細に記載したが、本 明細書中に示したような実施の種々の別の用途、および方法は、本発明の予期の 中にあることが認識されるであろう。

ュ。ＮＡ７うア、、、　ＦＩＧ、１ ＋Ｎｒｕｌ　二量体を開裂 １／２Ｊ＆ｔ＋Ｉ ＥｃｏＲＩ　ｌ／２Ｎｒｕｌ　ｌニーＩＧ、　２Ｇ１ｕｌ ＦＩＧ、　３ 陽性源　陰性源 クローン２　プローブ 感染源　非感染源 ＦＩＧ、５　ｔ　非反復フラグメントをクローニング感染源　非感染源 増幅したｃＤＮＡｓ　増幅したｃＤＮＡｓ十　十 ゲル電気泳動による分別 ＮＯｔ＋で切断した ψ 添加　「最終５ＩＳＰＡゲルｊ ＰＦＧＥ、ＰＣＲおよび９１ＳＰＡを用いた部分的精製下−ｃｌ−ＴＥＦゲル　 （Ｎｏｔｌ）　ＰＣＲ生成物ハイブリット形成により検出されたＰＣＲ生成物ｆ ｉｎｓ　ｌ　Ｓ　ＰＡケル　溶出した５ＩＳＰＡＤＮＡ５ ＩＬ３／ＧＭＣ５Ｆ　溶出　ｃＤＮＡｓ種々のプローブでハイブリッド形成 補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 請求の範囲 ■、ゲノムＤＮＡの接圧領域を得、 末端ブライミング配列を含むようにｃＤＮＡフラグメントの混合物を調製し混合 物のフラグメントを変性して、末端ブライミング配列を有する単フラグメント鎖 を作り、 一本鎖形のフラグメントの混合物から、ゲノムＤＮＡの接圧領域にハイブリッド 形成する単フラグメント鎖を単離し、ゲノム領域に相同である単フラグメント鎮 を、配列が各フラグメント鎖上の当該末端ブライミング配列に相補的であるプラ イマーでハイブリッド形成して、鎖／プライマー複合体を形成し、 鎖／プライマー複合体を、ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドの存在下に 二本鎖フラグメントに変換し、 二本鎖フラグメントを変性し、そして 当該ハイブリッド、変換、および変性段階を、所望の程度のｃＤＮＡ増幅か達成 されるまで繰り返す、 ことを包含する、ｃＤＮＡフラグメントの混合物から、ゲノムＤＮＡの接圧領域 に相同である２またはそれ以上の特異的ｃＤＮＡフラグメントを単離する方法。

２、　接圧ゲノムＤＮＡセクションか、保持体に結合される、請求項１記載の方 法。

３、　接圧ゲノムＤＮＡセクションか、酵母人工染色体中に含まれている、請求 項１記載の方法。

４、　接圧ゲノムＤＮＡセクションか、ウシ白血病ウィルスゲノムを表現しモし てｃＤＮＡ種の混合物か、細胞系１０Ｃ９から得られたウィルスに感染した細胞 系から得られたｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーである、請求項１ 記載の方法。

５、　当該ゲノムフラグメントか、 （ａｌ　既知の遺伝子を含むゲノムＤＮＡフラグメントを予備サイズ分別し、（ ｂｌ　配列に無関係な増幅のためのプライマーとして有効であるゲノムＤＮＡフ ラグメントに、ＤＮＡフラグメントの末端のほうに、リンカ−を連結し、そして 、制限酵素で消化してＤＮＡフラグメントの末端上の余分のリンカ−の存在を除 去し、 （ＣＩ　ＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡポリメラーゼ、４つ全てのデオキシリホ ヌクレオチド、および、ＤＮＡフラグメントの末端上に存在するリンカ−に相同 であるプライマーと混合し、そして （ｄｌ　ＤＮＡフラグメントの、配列に無関係な増幅を生ずるような条件下に混 合物を反応する、 ことにより得られる、既知の遺伝子と同一の染色体領域中に位置する遺伝子に対 応するｃＤＮＡｓを同定する際に使用するための、請求項１記載の方法。

６　既知の遺伝子を含むゲノムＤＮＡフラグメントの予備サイズ分別か、既知の 遺伝子に相同なプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および４つ全てのデオキシリ ホヌクレオチドを、ゲルマトリックスに添加し、そしてゲルマトリックスを、プ ライマーにより定められた既知の遺伝子の領域の増幅を促進する条件下に処理す ることによる、興味のあるＤＮＡフラグメントの同定を含む、請求項５記載の方 法。

７、　既知の遺伝子が、成長ファクターまたは成長ファクター受容体遺伝子であ る、請求項１記載の方法。

８、　既知の遺伝子か、インターロイキンである、請求項７記載の方法。

９、　既知の遺伝子がＩＬ−５でありモしてｃＤＮＡ種の混合物かＴ細胞ｃＤＮ Ａライブラリーである、請求項８記載の方法。

１０、既知の遺伝子がエリトロボイエチンでありそしてｃＤＮＡ種の混合物か腎 ｅＤＮＡライブラリーである、請求項７記載の方法。

比　末端ブライミング配列を含むｃＤＮＡ種の上記調製か、二本鎖リンカ−を、 ｃＤＮＡ混合物のフラグメントに付着し、フラグメントを変性して、リンカー− 鎖末端を有する単フラグメント鎖を作り、リンカー−鎖末端は、末端ブライミン グ配列として役立ち、−重鎖を、配列か、各フラグメント鎖上のリンカー−鎖末 端に相補的であるプライマーでハイブリッド形成して鎖／プライマー複合体を形 成し、鎖／プライマー複合体を、ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドの存 在下に二本鎖フラグメントに変換し、そして当該変性、ハイブリッド形成、およ び変換段階を、所望の程度の増幅か達成されるまで繰り返す、 ことを特徴する請求項１記載の方法。

１２、末端ブライミング配列を含むｃＤＮＡ種の上記調製が、さらに、ｃ　ＤＮ Ａ種を適当なベクターにそして、ｃＤＮＡ挿入断片に隣接する５′および３゛ベ クタ一配列を、末端ブライミング配列として使用してクローニングすることを特 徴する請求項ｌ記載の方法。

１３、当該調製が、さらに、当該末端ブライミング配列を含むｃＤＮＡ種を、Ｄ ＡＮポリメラーゼ、４つ全てのデオキシリボヌクレオチドトリホスファート、お よび、ｃＤＮＡ末端ブライミング配列に相同なプライマーと混合し、そして当該 混合物を、一本＊ｃＤＮＡ種の、配列に無関係な増幅が生じるような条件下に反 応することによる、ｃＤＮＡ種の増幅を特徴する請求項１２記載の方法。

１４、さらに、増幅した特異的ｃＤＮＡｓをベクターにクローニングすることを 含む、請求項１記載の方法。

＋５．　ゲノムＤＮＡの接圧領域に相同でありそしてｃＤＮＡ種の混合物から選 択される２またはそれ以上のｃＤＮＡ種のクローニング方法であって、ｆａｌ　 末端ブライミング配列を含むｃＤＮＡ種を調製し、（ｂｌ　それらの、選択した ゲノムフラグメントの第一セットへのノ＼イブリッド形成に基づいて、−重鎖ｃ ＤＮＡ種を単離し、（Ｃ１単離した一重鎖ｃＤＮＡ種を、ＤＮＡポリメラーゼ、 ４つ全てのデオキシリポヌクレオチドトリホスファート、およびｃＤＮＡ末端ブ ライミング配列に相同なプライマーと混合し、 （ｄ　この混合物を、一本＠ｃＤＮＡ種の、配列に無関係な増幅が生じるような 条件下に反応し、 ｔｅｌ　それらの、選択したゲノムフラグメントの第二セットへのハイブリツド 形成に基づいて、段階（ｄｉの混合物から一部＠ｃＤＮＡ種を単離し、（ｆｌ　 段階＋ｅ＋の単離した一重鎖ｃＤＮＡ種を、ＤＮＡポリメラーゼ、４つ全てのデ オキシリホヌクレオチドトリホスファート、およびｃＤＮＡ末端プライミング配 列に相同なプライマーと混合し、 （ｇｌ　この混合物を、−重鎖ｃＤＮＡ種の、配列に無関係な増幅を生じるよう な条件下に反応し、 （社）増幅したｃＤＮＡ種をベクターにクローニングする、ことを含む、上記方 法。

１＋＋、、−１１１＋ＰＣＴ／ＬＩＳ９０１０５９３８国際調査報告 Ｓ＾　４１７６７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．接在ゲノムＤＮＡの領域に相同であるそしてｃＤＮＡ種の混合物から選択さ れるｃＤＮＡ種のクローニング方法であって、（ａ）接在ゲノムＤＮＡの與味の ある領域を得、（ｂ）末端プライミング配列を含むようにｃＤＮＡ種を調製し、 （ｃ）それらの、接在ゲノムＤＮＡの領域へのハイブリッド形成に基づき一本鎖 ｃＤＡＮ種を単離し、 （ｄ）一本鎖ｃＤＮＡ種をＤＮＡポリメラーゼ、４つ全てのデオキシリボヌクレ オチドトリホスファート、および、ｃＤＮＡ末端プライミング配列に相同なプラ イマーと混合し、 （ｅ）混合物を、一本鎖ｃＤＮＡ種の、配列に無関係な増幅を生じるような条件 下に反応し、そして （ｃ）増幅ｃＤＮＡ種をベクター中にクローニングする、ことを包含する、上記 方法。 ２．接在ＤＮＡの領域が、與味のある領域を含み、そして当該入手が、（ａ）與 味のある領域を含むＤＮＡセクションをサイズ分別する、（ｂ）当該領域を含む フラクションを同定する、（ｃ）同定したフラクションからＤＮＡを単離する、 および（ｄ）単離したＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化して、興味のある 領域を多数のより小さいフラグメントに切断する、 ことを含む、請求項１記載の方法。 ３．興味のある領域を含むＤＮＡが、相同な領域であるプライマーの存在下にプ ライマー開始増幅を用いてフラクション中で同定される、請求項２記載の方法４ ．接在ゲノムＤＮＡセクションが、保持体に結合される、請求項１記載の方法。 ５．接在ゲノムＤＮＡセクションが、酵母人工染色体中に含まれている、請求項 １記載の方法。 ６．接在ゲノムＤＮＡセクションが、ウシ白血病ウイルスゲノムを表現しそして ｃＤＮＡ種の混合物が、細胞系１０Ｃ９から得られるウイルスで感染した細胞系 から得られるｍＲＮＡから作製されるｃＤＮＡライブラリーである、請求項１記 載の方法。 ７．当該接在ゲノムＤＮＡ領域を含むフラグメントが、（ａ）既知の遺伝子を含 むゲノムＤＮＡフラグメントを予備サイズ分別し、（ｂ）配列に無関係な増幅の ためにプライマーとして有用である、既知の遺伝子を含む、ゲノムＤＮＡフラグ メントにリンカーを連結し、（ｃ）ＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡポリメラーゼ 、４つ全てのデオキシリボヌクレオチド、およびＤＮＡフラグメントの末端上に 存在するリンカーに相同なプライマーと混合し、 （ｄ）ＤＮＡフラグメントの、配列に無関係な増幅を生ずるような条件下に混合 物を反応する、 ことにより得られる、既知の遺伝子と同一の染色体領域中に位置する遺伝子に対 応するｃＤＮＡｓを同定する際に使用するための、請求項１記載の方法。 ８．既知の遺伝子を含むゲノムＤＮＡフラグメントの予備サイズ分別が、既知の 遺伝子に相同なプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および４つ全てのデオキシリ ボヌクレオチドを、ゲルマトリックスに添加しそしてゲルマトリックスをプライ マーにより定められた既知の遺伝子の領域の増幅を促進する条件下に処理するこ とによる、興味のあるＤＮＡフラグメントの同定を包含する、請求項７記載の方 法。 ９．既知の遺伝子が成長因子または成長因子受容体遺伝子である、請求項１記載 の方法。 １０．既知の遺伝子がインターロイキンである、請求項９記載の方法。 １１．既知の遺伝子が、ＩＬ−５でありそして、ｃＤＮＡ種の混合物がＴ細胞ｃ ＤＮＡライブラリーである、請求項１０記載の方法。 １２．既知の遺伝子が、エリトロポイエチンでありそしてｃＤＮＡ種の混合物が 腎ｃＤＮＡライブラリーである、請求項９記載の方法。 １３．末端プライミング配列を含むｃＤＮＡ種の上記調製が、さらに、一本鎖ｃ ＤＮＡ種をＤＮＡポリメラーゼ、４つ全てのデオキシリボヌクレオチドトリホス ファート、およびｃＤＮＡ末端プライミング配列に相同なプライマーと混合し、 そして当該混合物を、一本鎖の、ｃＤＮＡ種が配列に無関係な増幅を生じるよう な条件下に反応することによるｃＤＮＡ種の増幅を包含する、請求項１記載の方 法。 １４．末端プライミング配列を含むｃＤＮＡ種の上記調製が、ｃＤＮＡ種を適当 なベクターにそして、ｃＤＮＡ挿入断片に隣接する既知の５′および３′ベクタ ー配外を、末端プライミング配列として使用してクローニングすることを包含す る、請求項１記載の方法。 １５．当該調製が、さらに、一本鎖ｃＤＡＮ種を、ＤＮＡポリメラーゼ、４つ全 てのデオキシリボヌクレオチドトリホスファート、およびｃＤＮＡ末端プライミ ング配列に相同なプライマーと混合し、そして混合物を、一本鎖ｃＤＮＡ種の、 配列に無関係な増幅を生ずるような条件下に反応することによる、ｃＤＮＡ種の 増幅を包含する、請求項１４記載の方法。 １６．接在ゲノムＤＮＡの領域に相同でありそしてｃＤＮＡ種の混合物から選択 されるｃＤＮＡ種のクローニング方法であって、（ａ）末端ブライミング配列を 含むようにｃＤＮＡ種を調製し、（ｂ）それらの、選択したゲノムフラグメント の第一セットヘのハイブリッド形成に基づいて、一本鎖ｃＤＮＡ種を単離し、（ ｃ）単離した一本鎖ｃＤＮＡ種を、ＤＮＡポリメラーゼ、４つ全てのデオキシリ ボヌクレオチドトリホスファート、およびｃＤＮＡ末端プライミング配列に相同 なプライマーと混合し、 （ｄ）この混合物を、一本鎖ｃＤＮＡ種の、配列に無関係な増幅が生じるような 条件下に反応し、 （ｅ）それらの、選択したゲノムフラグメントの第二セットヘのハイブリッド形 成に基づいて、段階（ｄ）の混合物から一本鎖ｃＤＮＡ種を単離し、（ｆ）段階 （ｅ）の単離した一本鎖ｃＤＮＡ種を、ＤＮＡポリメラーゼ、４つ全てのデオキ シリボヌクレオチドトリホスファート、およびｃＤＮＡ末端プライミング配列に 相同なプライマーと混合し、 （ｇ）この混合物を、一本鎖ｃＤＮＡ種の、配列に無関係な増幅を生じるような 条件下に反応し、 （ｈ）増幅したｃＤＮＡ種をベクターにクローニングする、ことを含む、上記方 法。