JP2002535999A

JP2002535999A - ゲノム分析方法

Info

Publication number: JP2002535999A
Application number: JP2000597461A
Authority: JP
Inventors: グレッグ・ファース; ラジェシュ・ムル・オデドラ
Original assignee: アマシャムバイオサイエンスユーケイリミテッド
Priority date: 1999-02-05
Filing date: 2000-02-04
Publication date: 2002-10-29
Also published as: WO2000046402A1; AU2308900A; CA2360929A1; EP1147219A1; WO2000046402A8; US6573053B1; US20030165978A1

Abstract

(57)【要約】表現型を共有する２個体からのゲノムＤＮＡを比較し、ＤＮＡを平均して一つまたは幾つかの多型を含むのに充分な長さのフラグメントに切断し、ハイブリダイゼーション条件下でフラグメントを合わせ、ミスマッチ不含有ヘテロハイブリッドを回収する方法であって、ヌクレアーゼ消化に抵抗するアダプターをゲノムフラグメントの端部に連結する方法。関連方法では、共通の表現型をもつ個体からプールしたゲノムＤＮＡを使用する。別の関連方法では、平均して一天然多型より少ないものを含むと思われる制限核酸フラグメントを使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】ヒト、動物および植物における疾病感受性および他の形質に関与する遺伝子の
連鎖マッピングは、近年の生物学および医学における進歩の最重要手段の一つに
なっている。連鎖マッピングの目標としての多型ＤＮＡマーカーの開発は、この
進歩における主要因となってきた。しかしながら、ヒトにおけるこれらの連鎖マ
ッピング用マーカーに頼る現行方法は労力を要するものであり、同時にせいぜい
数個のマーカーがスクリーニングされ得るに過ぎない。さらに、それらの能力は
、ヒトゲノムの多くの部分において高度情報マーカーがまばらであることにより
制限されている。

【０００２】ゲノムミスマッチ走査（ＧＭＳ）は、慣用的な多型マーカーまたはゲル電気泳
動に関する必要条件を全くもたないポジショナルクローニング戦略である。その
戦略では、充分なミスマッチ不含有ハイブリッド分子の情報に基づき関連した２
個体間における同祖（ＩＢＤ）のフラグメントを単離する。ＧＭＳ技術は、米国
特許５３７６５２６に記載されており、この明細書に添付された図面の図１で説
明されている。

【０００３】ハイブリダイゼーション前に一試料をダムメチル化することにより、完全メチ
ル化または完全非メチル化ＤＮＡのみを開裂するメチル化感受性制限エンドヌク
レアーゼによりホモハイブリッド二重らせんが識別され得る。ＭｕｔＨＬＳメチ
ル指向性ミスマッチ修復タンパク質は、非メチル化鎖におけるミスマッチヘテロ
二本鎖を開裂する。ミスマッチ不含有ヘテロハイブリッド分子の場合を除き、Ｄ
ＮＡは全てエキソヌクレアーゼIII消化および結合カラムを用いる１本鎖ＤＮＡ
の物理的分離の組み合わせにより排除される。選択された分子は、一般的プライ
マーの組み合わせを用いるインターＡｌｕＰＣＲにより増幅され、それに続い
てゲノムの間隔を表すＤＮＡ試料の定序アレイとのハイブリダイゼーションによ
り同定される。

【０００４】天然多型は平均して数百ｂｐごとに１回、すなわち１０００ｂｐごとに少なく
とも１回現れるため、長さ数キロベースでミスマッチ不含有のヘテロハイブリッ
ドはＩＢＤであると思われる。同様に、充分に大きいヘテロ二本鎖における非Ｉ
ＢＤ対立遺伝子は、１個またはそれ以上のミスマッチを含むと思われ、ミスマッ
チ修復タンパク質により開裂される。

【０００５】疾病同胞の複数対からのＩＢＤ地図を合わせ、作成された構成地図を、遺伝子
型一致の頻度が偶然により予測されるよりも高い遺伝子座について検索する。こ
れらの遺伝子座は、標的突然変異（複数も可）を内包し得る候補領域を表す。

【０００６】２ゲノムがＩＢＤではないときの遺伝子座からのＤＮＡ収率と比較した、２ゲ
ノムが対立遺伝子ＩＢＤを共有するときの座からのＤＮＡの相対収率は、この技
術の信頼性を示している。ヒトゲノムＤＮＡを含む分析の場合、ＩＢＤフラグメ
ントの５０％に関して１−２の係数およびＩＢＤフラグメントの３５％に関して
２−５の係数による濃厚化が報告されている。ＩＢＤフラグメントの１５％のみ
、＞５の係数による濃厚化が報告されている。さらに、ＧＭＳ選択後のＤＮＡ収
率は非常に乏しいため、アレイとのハイブリダイゼーション前に選択されたフラ
グメントの増幅が要求される。

【０００７】共通の祖先をもつ２個体におけるＩＢＤのフラグメントの濃厚化。ＩＢＤのフラグメントの濃厚化を達成するための新規遺伝子分析遂行方法を提
供することが、本発明の一態様である。すなわち一態様において、この発明は、ａ）２種の異なる供給源から比較されるべきゲノムＤＮＡを消化することによ
り、平均長が天然多型間の平均スペーシングよりも大きいゲノムフラグメントを
提供し、ｂ）ハイブリダイゼーション条件下、２種の供給源からのゲノムフラグメント
の１本鎖を合わせ、ｃ）ホモハイブリッドからヘテロハイブリッドを分離し、そしてｄ）ミスマッチをもつハイブリッドからミスマッチ不含有ヘテロハイブリッド
を分離することによるゲノム分析遂行方法であって、アダプターを段階ａ）で製造された各ゲノ
ムフラグメントの各端へ連結することを含み、上記アダプターが２本鎖ミスマッ
チ不含有形態においてヌクレアーゼ消化に抵抗性を示す、方法を提供する。

【０００８】この方法では、２種の異なる供給源、一般的には共通祖先から獲得した可能性
がある特定表現型を共有する２種の異なるウイルスまたは原核生物または真核生
物（例、ヒト、動物または植物）個体からのゲノムＤＮＡを比較する。表現型は
、特定の一連の環境的および／または遺伝的影響下にある生物体が示す観察可能
または測定可能な特性である。ハイブリダイゼーション条件は、分析されている
ゲノムフラグメントにより異なり得、当業界に精通した読者には熟知されている
はずである。示されている通り、天然多型は、ヒトゲノムＤＮＡでは平均して数
百bpごとに１回、すなわち１０００bpごとに少なくとも１回出現する。比較され
るべき２個体のゲノムＤＮＡを、一般にこれより長いフラグメントに切断する。
すなわち、各ゲノムフラグメントは平均して１種またはそれ以上の多型を含む。
これは、比較的低頻度で切断する一制限酵素（または２種またはそれ以上の制限
酵素）の使用により実施され得る。好適な制限酵素にはII型のものおよびまたII
Ｓ型のものがある。別法として、酵素的手段とは対照的に物理的または化学的手
段によるゲノムＤＮＡの制限も行われ得る。

【０００９】アダプターは各フラグメントの各端へ連結される。アダプターは少なくとも部
分的に２本鎖ポリヌクレオチド、一般的にはオリゴヌクレオチドであり、必要な
らば制限酵素により生成されるオーバーハングと相補的なオーバーハングを有す
る。別法として、フラグメントおよびアダプターは両方とも連結用の平滑末端を
有し得る。アダプターは、ミスマッチ識別に基いた有効な連結反応、増幅または
選別を妨害しがちである、２次構造に陥り易くさせることのない不定の配列のオ
リゴヌクレオチドを含み得る。分析下のＤＮＡを増幅するのに使用される、アダ
プター配列の全部または一部を含むプライマーをさらに調べることにより、確実
に非特異的増幅が回避される。２本鎖ミスマッチ不含有形態であるときは、アダ
プターはヌクレアーゼ消化に抵抗性を示し、すなわち通常のＤＮＡの場合よりも
抵抗性が高くなる。かかる抵抗性は、修飾ヌクレオチド間連鎖、例えばホスホロ
チオエートまたはメチルホスホネート連鎖を提供することにより、またはヌクレ
アーゼ抵抗性を付与するヌクレオチド類似体の使用により付与され得る。しかし
ながら、好ましくは、第１供給源からのゲノムＤＮＡのフラグメントに連結され
た第１アダプターはミスマッチを含み、また第２供給源からのゲノムＤＮＡのフ
ラグメントに連結された第２アダプターもミスマッチを含む。２つのアダプター
は、一方のアダプターの前方鎖が他方のアダプターの後方鎖とハイブリダイズす
ることにより、ミスマッチ不含有ヘテロハイブリッドを形成するように設計され
ている。ヘテロハイブリッドは、異なる個体からの２本鎖を含み、同じ個体から
の２本鎖を含むホモハイブリッドとは対照的である。２種の系は、添付図面の図
２および３に関してより詳細に記述されている。

【００１０】ここで、図２は、各々ホスホロチオエート連鎖を含むセクション内にミスマッ
チを有する２種のアダプターの使用を示す。

【００１１】そして図３は、各々ホスホロチオエート連鎖を有するセクションの外側にミス
マッチを有する２種の異なるアダプターの使用を示す。

【００１２】疾病対分析に関する修正方法は、両ゲノムＤＮＡ試料の制限消化およびアダプ
ター配列相互の連結反応を含む。これらのアダプターは、ホモ二本鎖分子におけ
るハイブリダイゼーション後も存続するミスマッチ領域を含む。対照的に、アダ
プター配列はヘテロ二本鎖において完全に相補的である。ミスマッチ認識タンパ
ク質、例えばＴ４エンドヌクレアーゼVIIの後続使用およびヌクレアーゼ消化の
結果、ミスマッチを有する分子が全て排除される。ミスマッチ不含有ヘテロ二本
鎖分子は、例えば保護を意味するアダプター配列にホスホロチオエートまたはメ
チルホスホネート連鎖が含まれるため、消化に抵抗を示す。これらの分子は、下
記で検討されている分析前に単一プライマー対により効果的および好都合に増幅
され得る。

【００１３】全フラグメント末端へアダプターを連結することにより、２種ＤＮＡ試料のハ
イブリダイゼーションにより製造されるホモハイブリッド分子が選択的に消化さ
れ、そして適当なアダプタープライマーにより濃厚化フラグメントが効果的に増
幅される好都合な機会が提供される。アダプター端における、ホスホロチオエー
トまたはメチルホスホネート連鎖の存在、または他の阻害的特徴により、ヌクレ
アーゼ消化に対する防御性が提供される。アダプター配列は、ヘテロハイブリッ
ド分子の形成に関して完全に相補的であるように慎重に設計されている。しかし
ながら、ホモハイブリッド分子では、ミスマッチが存続する。ホスホロチオエー
トまたはメチルホスホネート連鎖に近い位置におけるミスマッチの鎖開裂により
、後続のヌクレアーゼ消化に対する脆弱性が生じ、ホモハイブリッド分子の排除
が最高潮に達する。しかしながら、鎖開裂はミスマッチの非存在下では行なわれ
ないため、ヘテロハイブリッド分子におけるホスホロチオエートまたはメチルホ
スホネート防御性は存続している。

【００１４】若干の型のミスマッチアダプターは、この目的に適しており、非相補的末端を
伴う「Ｙ」形状アダプター（図２）、およびアダプター長に沿った位置に１個ま
たはそれ以上のミスマッチヌクレオチドを伴うアダプター（図３）を含む。前者
の場合、１本鎖特異的エンドヌクレアーゼは鎖開裂の達成に使用され得、Ｔ４エ
ンドヌクレアーゼVIIは後者の場合にミスマッチを開裂する。それに続いて３'−
５'エキソヌクレアーゼを用いることにより開裂した分子を消化する場合、両ア
ダプター鎖が各ゲノムフラグメントとの共有結合を形成するのを確実にするため
にはオリゴヌクレオチド燐酸化が必要である。しかしながら、５'−３'エキソヌ
クレアーゼを使用する場合、これは必要ではないこともあり得る。ミスマッチ識
別方法本来の特徴としてホモハイブリッド２本鎖を選択的に排除するためのミス
マッチアダプターを使用することにより、一ゲノム試料のダムメチル化およびメ
チル化感受性制限酵素によるハイブリッド分子の後続消化は不要となる。

【００１５】ＭｕｔＨＬＳミスマッチ認識タンパク質（米国特許５３７６５２６で使用され
ている）による鎖切断は、最大活性を達成するためにはフラグメント端から少な
くとも１５０塩基対であるべきミスマッチ二本鎖内の少なくとも１つの（ＧＡＴ
Ｃ）部位に関する絶対的必要条件を有する。非メチル化鎖のみヘミメチル化二本
鎖で開裂され、これの効率はミスマッチの性質および周囲配列の前後関係により
異なる。この酵素系は、Ｃ・Ｃミスマッチおよび４ヌクレオチドより長い挿入／
欠失ループを認識し得ない。反対に、Ｔ４エンドヌクレアーゼVIIは、全ての単
一塩基ミスマッチおよびあらゆるサイズの挿入／欠失ループを識別し得るミスマ
ッチ認識タンパク質である。４kbp以下のフラグメントはうまく消化され、ミス
マッチが少なくとも９ヌクレオチドによりフラグメント端から分離されたとき最
大開裂効率が達成される。適当な緩衝液にはトリス、ｐＨ８があり、さらに好ま
しくは燐酸緩衝液がある。配列前後関係およびミスマッチの性質はまたＴ４エン
ドヌクレアーゼVII消化効率に影響を及ぼすが、顕著な利益は、ＭｕｔＨＬＳタ
ンパク質をこの酵素と置き換えることにより達成され得る。他のミスマッチ認識
／修復タンパク質は、Ｃｅｌ１およびＴ７エンドヌクレアーゼＩを含め好適であ
り得る。マッチフラグメントからミスマッチフラグメントを分離する方法の選択
は、酵素の使用に限られるわけではなく、化学的または物理的手段によっても達
成され得る。

【００１６】ヌクレアーゼ消化により開裂された二重らせんの排除の方が、１本鎖ＤＮＡ結
合カラムによるそれらの物理的分離に頼る場合よりも有効であると思われる。１
本鎖特異的エンドヌクレアーゼ活性および５'−３'または３'−５'エキソヌクレ
アーゼ活性を提供する１種またはそれ以上の酵素が適当であり得る。さらに、Ｔ
４エンドヌクレアーゼVIIは環境によっては１本鎖切除部を作成する場合もあり
得るため、エキソヌクレアーゼがニックで活性を示すことが重要である。さらに
、ヘテロ二本鎖分子を保存するためには、エキソヌクレアーゼはホスホロチオエ
ートまたは他の修飾連鎖により阻害されなければならない。単独または組み合わ
せて使用するのに適した候補には、Ｂａｌ３ｌヌクレアーゼ、ＳＩヌクレアーゼ
、緑豆ヌクレアーゼ、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼII
Iおよびポリメラーゼの３'−５'エキソヌクレアーゼ活性、例えばＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼがあるが、これらに限定されるわけではない。

【００１７】プールされた試料における共通配列の選択的濃厚化：共通祖先を有する個体の
プールされたゲノムにおけるフラグメントＩＢＤの濃厚化現行のＧＭＳ方法を用いた候補疾病遺伝子座の同定は、典型的には２００を越
える疾病対分析およびゲノムクローン系列への濃厚化フラグメントのハイブリダ
イゼーションを必要とする。全ての疾病対分析の累積データから構築された、濃
厚化フラグメントの構成地図の精査、および遺伝子型の一致が偶然により予測さ
れる場合よりも高頻度で出現する領域の同定により候補領域を決定する。

【００１８】多数の疾病個体が全部一緒に分析される場合、多様な別々の対に関する分析お
よび後続のハイブリダイゼーション段階に対する必要性は回避され得る。表現型
の正確な診断は重要な予備段階である。しかしながら、例えば疾病個体の全部ま
たは大多数が共通の祖先を通してそれらの表現型を獲得したため、同じ配列変異
型が全てに共通している場合、候補領域は単一分析で同定され得る。

【００１９】この発明の別の目的はこの必要性を満たすことである。この態様において、本
発明は、ｉ）表現型を共有する複数の個体からプールされたゲノムＤＮＡを用意し、ｉｉ）ゲノムＤＮＡを消化することにより、平均長が天然多型間の平均スペー
シングよりも大きいゲノムフラグメントを提供し、ｉｉｉ）アダプターを段階ｉｉ）で製造された各ゲノムフラグメントの各端に
連結させ、ここでアダプターが２本鎖ミスマッチ不含有形態であるときは、ヌク
レアーゼ消化に抵抗性を示すものとし、ｉｖ）段階ｉｉｉ）で製造されたアダプター終結ゲノムフラグメントの混合物
を変性および再アニーリングし、ｖ）段階ｉｖ）で製造された混合物からミスマッチを含むハイブリッドを除去
し、そして必要ならばミスマッチ不含有ハイブリッドを増幅し、ｖｉ）そして段階ｉｖ）およびｖ）を反復することにより、表現型に伴う１個
または数個のミスマッチ不含有ハイブリッドを回収することによるゲノム分析遂行方法を提供することである。

【００２０】参考となるものが、この技術を示す図である添付の図４に示されている。

【００２１】適当なプロトコルには、例えば共通祖先であると推定される疾病個体のゲノム
ＤＮＡ試料のプールおよびゲノムプールの制限消化が含まれる。ホスホロチオエ
ートまたはメチルホスホネートまたは他の保護手段を運ぶ相補的オリゴヌクレオ
チドを含む単一アダプターを、プールの変性および再アニーリング前に全フラグ
メントへ連結させる。多数の個体がプールに寄与する場合、ほとんどのフラグメ
ントはハイブリダイゼーション時にヘテロ二本鎖を形成する。ミスマッチ修復タ
ンパク質、例えばＴ４エンドヌクレアーゼVIIの使用およびヌクレアーゼ消化に
よりミスマッチ分子を排除する。アダプター配列を相補するよう適当に設計され
た単一プライマーを用いて残りの分子を増幅する。増幅産物をミスマッチ識別の
反復ラウンドに付すことにより、ミスマッチヘテロ二本鎖分子が激減し、ＩＢＤ
フラグメントの濃厚化が促進される。サイクルの数は、関与する個体の数および
類似性（または関連性）により異なり得る。最後に、選択されたフラグメントは
、例えば核酸のレファレンス配列へのハイブリダイゼーションによりさらに分析
され得る。別法として、反復ミスマッチ識別によるＩＢＤフラグメントの濃厚化
が非情報的フラグメントを全て有効排除するのに充分である場合、選択された分
子は直接クローン化および配列決定され得る。従って、多重疾病対分析に対する
必要性の排除に加えて、ゲノムクローンのアレイに関する必要条件が排除される
。

【００２２】別の態様において、この発明は、４オリゴヌクレオチドから成るセットを提供
し、セットの各オリゴヌクレオチドは、セットの第１の他のオリゴヌクレオチド
と相補的であり、それとヌクレアーゼ消化に抵抗性を示すハイブリッドを形成し
、セットの第２の他のオリゴヌクレオチドと実質的に相補的である。好ましくは
、各オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネートから
選択される１個またはそれ以上のホスホジエステル結合を含む。

【００２３】別の態様において、この発明は、上記方法を遂行するためのキットであって、
リガーゼおよびヌクレアーゼと一緒に４オリゴヌクレオチドから成るこのセット
を含むキットを提供する。

【００２４】疾病および野生型ゲノムフラグメントの消去的ハイブリダイゼーションによる
共通配列の選択的濃厚化本来のＧＭＳ方法を用いて、同祖ＤＮＡの大域が濃厚化され得る。それに続い
てこれらの候補配列を分析し、それらが含み得る配列変異型を同定するのにはか
なりの努力が要求される。候補配列が大きいとき、配列変異型に関してそれらを
精査するのに要する努力も多大となる。従って、非常に短い候補配列を生成する
方法は、かなりの利点を提供することになる。さらに、この方法は、ＤＮＡおよ
びＲＮＡの両方における全配列差異の分析に特に適している。

【００２５】この発明の別の目的は、この要望を満たすことである。この態様において、本
発明は、ｉ）表現型を共有する複数の個体からプールされた第１核酸を用意し、ｉｉ）第１核酸を消化することにより、平均長が天然多型間の平均スペーシン
グとほぼ同じかまたはそれより短いフラグメントを提供し、ｉｉｉ）段階ｉｉ）で製造された各フラグメントの各端へアダプターを連結さ
せることにより、アダプター終結核酸フラグメントを形成し、これらは２本鎖ミ
スマッチ不含有形態であるときは、ヌクレアーゼ消化に対する抵抗性を示すもの
とし、ｉｖ）段階ｉｉｉ）で製造されたアダプター終結核酸フラグメントの混合物を
変性および再アニーリングし、ｖ）段階ｉｖ）で製造された混合物からミスマッチを含むハイブリッドを除去
し、そして必要ならばミスマッチ不含有ハイブリッドを増幅し、ｖｉ）段階ｉｖ）およびｖ）を反復することにより、ミスマッチ不含有ハイブ
リッドの第１混合物を回収し、ｖｉｉ）同じ表現型を共有しない複数の個体からプールされた第２核酸を用意
し、ｖｉｉｉ）ｖｉｉ）の核酸を段階ｉｉ）〜ｖｉ）に付すことにより、ミスマッ
チ不含有ハイブリッドの第２混合物を回収し、ｉｘ）ハイブリダイゼーション条件下、ミスマッチ不含有ハイブリッドから成
る第１混合物およびミスマッチ不含有ハイブリッドから成る第２混合物の１本鎖
を合わせ、ｘ）そしてミスマッチ不含有ハイブリッドを形成せず、表現型に付随する核酸
フラグメントを回収することによるゲノム分析遂行方法を提供する。

【００２６】段階ｉｉ）は、比較的高頻度で切断する少なくとも１個の制限酵素の使用によ
り実施され得る。すなわち、フラグメントの大多数は天然多型を全く含まない。

【００２７】参考となるものが、この技術を示す図である図５に示されている。

【００２８】疾病個体のゲノムが、核酸を頻繁に開裂する１種またはそれ以上の酵素で制限
される場合、非常に短いフラグメントのプールが得られる。この方法で生成され
たフラグメント数は、ゲノム内の多型配列の総数より多い。それ自体、解離され
、再アニーリングされると、ほとんどのフラグメントは完全にマッチしたヘテロ
二本鎖分子を形成する。達成できる限り一制限フラグメントにつき一多型に近づ
くのが好ましいが、好ましくはそれ以上ではない。フラグメントが小さい場合、
この方法において、２プール間においてミスマッチした情報性フラグメントとは
識別されなければならない「ノイズ」に寄与する同一フラグメントの比率は増加
する。同じフラグメントにおける近隣の多型性（複数も可）は個体のプールにお
いて同一ではあり得ないため、フラグメントが大きい場合、複数の多型性をもつ
フラグメントの比率が増加し、このため情報性配列変化を含むフラグメントを失
う可能性も増加する。

【００２９】ホスホロチオエートまたはメチルホスホネート連鎖を含むことによりヌクレア
ーゼ消化に対する防御性が提供される単一アダプターは、あらゆる核酸フラグメ
ントに連結される。これらのフラグメントは解離され、再アニーリングされ、ミ
スマッチ分子はミスマッチ修復タンパク質、例えばＴ４エンドヌクレアーゼVII
により開裂される。開裂分子は、エンドヌクレアーゼおよび５'−３'または３'
−５'エキソヌクレアーゼ活性を提供する１種またはそれ以上のヌクレアーゼに
より排除される。鎖解離および再アニーリング、次いでＴ４エンドヌクレアーゼ
VIIおよび適当なヌクレアーゼを用いたミスマッチ認識から成るこのプロセスは
反復される。

【００３０】疾病個体の場合と同様の方法で、野生型個体の核酸をプールし、制限し、アダ
プターに連結し、反復ミスマッチ識別に付す。従って、各個別プールでは、プー
ルにおける全個体に共通する配列を含むフラグメントのみが当然存続している。

【００３１】疾病プールの濃厚化フラグメントを、野生型プールの過剰の濃厚化フラグメン
トにハイブリダイズさせる。各プールへ核酸を与える個体が例えば同じ人種起源
を共有する同じ集団から選ばれた場合、当然、非常に多数のフラグメントが完全
にマッチした二重らせんを形成する。表現型が区別される原因となる突然変異を
含むフラグメントのみ、当然、ハイブリダイゼーション時にミスマッチ二本鎖を
形成する。これらのミスマッチ分子を選択する。従って、プロトコルの完成は、
興味の対象である配列変異型を潜在的に含む非常に短いゲノムフラグメントにお
いて完結する。次いで、これらの選択されたフラグメントは、例えば核酸のレフ
ァレンス配列へのハイブリダイゼーションにより比較的容易に分析され、情報性
配列変化が同定され得る。

【００３２】上記方法は、好ましくはゲノムの一部または全部を代表するゲノムＤＮＡによ
り行なわれる。ゲノムサブセットは、限定されるわけではないが、例えばインタ
ーＡｌｕ−ＰＣＲといった技術による選択的増幅を含むか、または分析を予め画
定されたサイズ範囲内にある制限酵素消化により製造されたフラグメントに制限
する当業界の専門家には公知である若干の方法の一つにより分析用に生成され得
る。分析されるゲノムのフラクションは、興味の対象である組織における発現に
基いて選択され得る。この場合、ｍＲＮＡは、まず上記と同様分析前に慣用的方
法を用いてｃＤＮＡに変換され得る。別法として、ＲＮＡは、上記要領で分析に
かけられ得る。

【００３３】クローニングおよび配列決定は、これらの方法の最後に残る配列を分析するた
めの好ましい方法である。しかしながら、またゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはそ
のオリゴヌクレオチド呈示量を含む核酸のレファレンス配列へのハイブリダイゼ
ーションによりこの分析を遂行することも可能である。例としては、ＢＡＣまた
はｃＤＮＡクローン、オリゴヌクレオチドまたは染色体を含む核酸配列のアレイ
へのハイブリダイゼーションがある（Boyleら（１９９０）Genomics ７：１２７
−１３０、Lichterら（１９９０）Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８７：６６３４−６
６３８、Schenaら（１９９５）Science ２７０：４６７−４７０、Lockhartら（
１９９６）Nature Biotechnology １４：１６７５−１６８０参照）。

【００３４】参考となるものが添付図面に示されており、図１は、「共通の祖先をもつ２個
体における同祖（ＩＢＤ）フラグメントの濃厚化」と題される、公知ＧＭＳシス
テムの図である。

【００３５】図２〜５の各々は、ここに記載されている異なるゲノム分析方法の図である。
図２および３の各々は「共通の祖先をもつ２個体におけるフラグメントＩＢＤの
濃厚化」と題される。

【００３６】図４は、「共通の祖先をもつ個体のプールされたゲノムにおけるフラグメント
ＩＢＤの濃厚化」と題される。

【００３７】図５は、「疾病および野生型個体のプールされた核酸を用いた情報性フラグメ
ントの消去的濃厚化」と題される。図６は、実施例３で使用されるシステムの図である。図７は、実施例４で使用されるシステムの図である。

【００３８】下記実験の項において、実施例１および２は、本発明による４オリゴヌクレオ
チドの異なるセットの製法および特性検定を示す。実施例３および４は、アダプ
ターとしてそれらのオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて遂行された、本発
明によるゲノム分析方法に関するものである。

【００３９】（実験データ）実施例１４種のオリゴヌクレオチドを合成して［ジェノシス・バイオテクノロジーズ（
ヨーロッパ）リミテッド］、ＰｓｔＩ消化ＤＮＡへ連結させ、ヌクレアーゼ消化
によりホモハイブリッド分子を選択的に排除させると、ヘテロハイブリッド二本
鎖ＤＮＡは無傷のままであった。適当な場合、燐酸化（ホスフェート−）および
ホスホロチオエート連鎖（複数も可）は、各オリゴヌクレオチドの合成に含まれ
た。配列は次の通りであった。

【化１】

【００４０】オリゴＡ＋ＤおよびオリゴＢ＋Ｃは相補的であり、オリゴＡ＋Ｂおよびオリゴ
Ｃ＋Ｄは部分的にのみ相補的である。

【００４１】オリゴＡ＋Ｂをアニーリングし、ＰｓｔＩ消化ＤＮＡに連結させた場合、各フ
ラグメント端部にミスマッチアダプターが形成される。同様に、オリゴＣ＋Ｄを
アニーリングした場合、ミスマッチアダプターはＰｓｔＩ消化ＤＮＡの別の供給
源へ連結され得る。従って、消化され特異的に連結されたＤＮＡの２種供給源を
ハイブリダイゼーションすることにより、ミスマッチアダプター配列を有するホ
モ二本鎖分子およびアダプターがミスマッチ不含有であるヘテロ二本鎖が得られ
た。後続のヌクレアーゼ消化によりホモ二本鎖ＤＮＡが選択的に排除され、ヘテ
ロ二本鎖分子はそれらのホスホロチオエート保護性を保持し、無傷のままであっ
た。

【００４２】ヌクレアーゼ消化に対するマッチおよびミスマッチアダプターの作用を調べる
ため、ＰｓｔＩ［アマーシャム・ファーマシア・バイオテク］を用いてプラスミ
ドＤＮＡを完全に消化し、微小濃縮（マイクロコン−３０：アミコン）した。オ
リゴＡ＋ＢまたはオリゴＡ＋Ｄを当モル量で合わせ、１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
緩衝液［アマーシャム・ファーマシア・バイオテク］で１時間５０℃〜１０℃の
温度範囲でそれらをインキュベーションすることによりアダプターを製造した。
５０倍モル過剰のアダプターにより、ＰｓｔＩ消化ＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼの存在下１６℃での一夜インキュベーションにより各アダプター型に連結さ
せた。どの場合も、アダプター連結プラスミドＤＮＡを、ヌクレアーゼ消化前に
ゲル精製［キアクイック・ゲル抽出キット：キアゲン］した。３５ng／μlの濃
度で、２つのゲル精製ＤＮＡを各々様々な反応条件下Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ［
アマーシャム・ファーマシア・バイオテク］消化にかけた。０.２単位／μlのＢ
ａｌ３１ヌクレアーゼの存在下２０℃で４０分間インキュベーションすると、ミ
スマッチアダプターに連結されたＤＮＡが消化され、ミスマッチ不含有アダプタ
ーに連結されたものはヌクレアーゼ攻撃に対して抵抗を示すことが判った。従っ
て、適当に設計されたアダプターを用いると、ヘテロ二本鎖ＤＮＡを含む混合物
からホモ二本鎖分子を選択的に排除することが可能であるという結論に達した。

【００４３】実施例２メチルホスホネート連鎖の存在により付与されたヌクレアーゼ抵抗性および非
ミスマッチアダプターを担うフラグメント選択におけるそれらの有用性の立証。エキソヌクレアーゼIIIおよびＳ１は、線状ＤＮＡフラグメントを消化する。
下記の実験を行うことにより、メチルホスホネート修飾アダプターによるＤＮＡ
において付与された酵素消化からの保護性を立証した。これおよび後続実施例に
おける試薬は全て、特記しない場合アマーシャム・ファーマシア・バイオテクか
ら購入された。

【００４４】プライマーＩおよびプライマーＪ（ジェノシスから入手）を用いることにより
、プラスミドｐＴ３／Ｔ７へクローン化しておいた、１２９bpイヌゲノムＤＮＡ
フラグメント、３１Ａを増幅した。これらのプライマーはまた、挿入体の両側に
隣接するプラスミド配列の短い伸長部を増幅した。ＰＣＲ増幅は、最終体積１０
０μl中ＩおよびＪの各プライマー１００ピコモル、１.５ミリモルのＭｇＣｌ_２、０.２ミリモルのｄＮＴＰ、２.５単位のＴａｑポリメラーゼおよび１×Ｔａｑ
反応緩衝液の存在下で行なわれた。^３３Ｐ−ｄＡＴＰをＰＣＲ反応に含ませるこ
とにより、増幅産物を内部放射性標識した。１８５bpの生成した増幅フラグメン
トを、ＧＦＸ−ＰＣＲ精製キットにより精製し、ＤＮＡの量を、ヴィストラ・グ
リーン（商標）染色を用いて１％アガロースゲルで定量した。

【００４５】プライマーＩおよびＪ（ジェノシス）は次の通りであった：

【化２】

【化３】

【００４６】ＴａｑポリメラーゼによるＰＣＲ増幅の結果、増幅分子の３'末端に余分のＡ
−残基が付加される。この特性を利用することにより、アダプターＫＬおよびＫ
Ｍを目的として増幅フラグメント３１Ａに相補末端を作製した。アダプターＫＬ
はオリゴヌクレオチドＫおよびＬを一緒にアニーリングすることにより形成され
るもので、これらは一端が部分相補的であるため連結が行われ得るが、他端がミ
スマッチであり、一緒にアニーリングされると「Ｙ」形状構造を形成する。互い
に完全に相補的であるオリゴヌクレオチドＫおよびＭをアニーリングすると、非
ミスマッチアダプターＫＭが得られる。両アダプターには、Ｔａｑ増幅ＤＮＡフ
ラグメントに相補的である１bpオーバーハングが存在する。

【００４７】オリゴヌクレオチドＫ、ＬおよびＭ（インテラクティバ・ビオテクノロギーＧ
ｍＢＨ）は次の通りであった：

【化４】（ただし、５はｄＡ−メチルホスホネートを表し、６はｄＧ−メチルホスホネートを表し、７はｄＣ−メチルホスホネートを表し、８はｄＴ−メチルホスホネートを表す。）

【００４８】２０倍モル過剰のアダプターＫＬおよびＫＭを別々に６４ngのＰＣＲ増幅フラ
グメント３１Ａにより連結した。これらの反応は、３７℃で２時間体積１０μl
中１×リガーゼ緩衝液および１単位のＴ４リガーゼの存在下で行なわれた。

【００４９】６％変性ポリアクリルアミドゲルで連結反応物１μlアリコートを分析するこ
とにより、連結反応の成果を証明した。ゲルを１０％酢酸に固定し、乾燥し、燐
光体スクリーンに暴露した。非連結フラグメント３１Ａの場合と比較すると、両
連結反応の結果、５６bpのサイズ増加に相当するさらに高い分子量、すなわち２
種のアダプターを合わせた長さを有するフラグメントが出現した。これにより、
３１Ａフラグメントが両端においてアダプターに有効に連結されることが確認さ
れた。

【００５０】ＫＬおよびＫＭの両アダプターは、連結事象には関与しない３'末端に３つの
メチルホスホネート連鎖を有する。これらの連鎖がエキソヌクレアーゼIIIおよ
びＳ１ヌクレアーゼによる消化から保護する能力を次の要領で分析した。フラグ
メント３１Ａを、ミスマッチ含有Ｙ形状アダプターＫＬ、非ミスマッチ含有アダ
プターＫＭに連結し、またはアダプター不含有のものを、独立して３７℃で６０
分間、１０μlの最終体積で５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、２０
ミリモルのＭｇＣｌ_２および５０ミリモルのＮａＣｌを含む緩衝液中１０単位の
エキソヌクレアーゼIIIおよび２５単位のＳ１ヌクレアーゼとインキュベーショ
ンした。２０ミリモルＥＤＴＡ、９５％ホルムアミド、０.０１％ブロモフェノ
ールブルーおよび０.０１％キシレンシアノールを含む停止溶液４μlを加えるこ
とにより、反応を停止させた。７μlのアリコートを６％変性ＰＡＧＥゲルにお
いて分析した。ゲルを１０％酢酸に固定し、乾燥し、燐光体スクリーンに暴露し
た。

【００５１】これらの結果は、両端がアダプターＫＭと連結された３１Ａフラグメントが唯
一消化に耐え得るものであることを示していた。この結果は、ＤＮＡフラグメン
トが、３'メチルホスホネート連鎖を含むアダプターに連結されることにより、
エキソヌクレアーゼIIIおよびＳ１ヌクレアーゼ消化から保護され得ることを立
証している。

【００５２】類似した戦略を別々に用いて、アダプターの５'末端にメチルホスホネート連
鎖を含むことにより、ＤＮＡフラグメントがＴ７遺伝子６−産物による消化から
保護され得ることを立証した。

【００５３】実施例３（図６）および実施例４（図７）で使用されるモデルシステム。ＤＮＡフラグメントを使用することにより、２集団のＤＮＡ（実施例３）また
は一プールのＤＮＡ（実施例４）からのミスマッチを含むフラグメントに対する
共通フラグメントの濃厚化を立証した。フラグメントを、ヒトゲノムＤＮＡまた
はエシェリキア・コリ（E.coli）ゲノムＤＮＡのバックグラウンドへスパイクし
た。スパイクの使用により、同じ生物体からの２種の異なるゲノムを比較する場
合に必要とされる広範な遺伝子型分類が回避され、さらにまた実験分析が簡易化
された。下記実施例では、ＤＮＡ二本鎖における単一塩基ミスマッチの認識を利
用した。

【００５４】使用されるフラグメントは次の通りであった（配列は付録１に示されている）
：１．ラムダから切除された１７００bpのＰｓｔＩフラグメント。２．プラスミドｐＳＤ１からＰＣＲにより増幅された１０００bpフラグメント。
３．プラスミドｐＥＳ３からＰＣＲにより増幅された１０００bpフラグメント、
ただし、ｐＳＤ１およびｐＥＳ３は、フラグメントの５'末端から２００塩基の
、ＧからＣへの単一塩基変化のみが異なっていた。４．プラスミドｐＥＳ４からのＰＣＲにより増幅された１０００bpフラグメント
、ただしＥＳ４は、フラグメントの５'末端からの単一塩基欠失２００塩基がＳ
Ｄ１およびＥＳ３とは異なっていた。５．プラスミドｐＥＳ１からのＰＣＲにより増幅された１０００bpフラグメント
、ただしＥＳ１は、フラグメントの５'末端からのＧからＡへ２００塩基の単一
塩基変化がＳＤ１と異なっていた。

【００５５】下記オリゴヌクレオチドを用いて、アダプターを製造した：

【化５】（ただし、５はｄＡ−メチルホスホネートを表し、６はｄＧ−メチルホスホネートを表し、７はｄＣ−メチルホスホネートを表し、８はｄＴ−メチルホスホネートを表す）

【００５６】実施例３では、次の要領でアダプターを２種の異なるＤＮＡ試料へ連結した：試料１：当モル量のフラグメントＳＤ１およびラムダ１７００を、一端は相補
的であるため連結され得るが他端がミスマッチであるオリゴヌクレオチドＥおよ
びＦを含むアダプターに連結した。アダプターはまた、メチルホスホネート連鎖
領域を含んでいた。

【００５７】試料２：当モル量のフラグメントＥＳ３およびラムダ１７００を、一端は相補
的であるため連結され得るが他端がミスマッチであるオリゴヌクレオチドＧおよ
びＨを含むアダプターに連結した。アダプターはまた、メチルホスホネート連鎖
領域を含んでいた。

【００５８】配列ＥおよびＦは、ＨおよびＧとそれぞれ完全に相補的であった。試料１およ
び２を合わせ、変成させ、再アニーリングさせると、下記のものを含む異なる二
本鎖の混合物が予測された：すなわち、１．ラムダまたはＳＤ１のマッチしたホモ二本鎖、末端ミスマッチを含むアダプ
ターを伴い、試料１からのフラグメントの再会合時に形成された。２．ラムダまたはＥＳ３のホモ二本鎖から成る混合物、末端ミスマッチを含むア
ダプターを伴い、試料２からのフラグメントの再会合時に形成された。３．単一塩基ミスマッチを含むが、完全マッチしたアダプターを伴うＥＳ３およ
びＳＤ１フラグメントのヘテロハイブリッド。４．相補鎖が、試料１および２から互いに再アニーリングする時に形成されたマ
ッチしたアダプターを伴うラムダのホモ二本鎖。これらの分子におけるアダプタ
ーもまた完全に相補的であった。

【００５９】混合物全体を、１個またはそれ以上の塩基のミスマッチにおいてＤＮＡの一方
または両方の鎖を開裂するＴ４エンドヌクレアーゼVIIで消化した。さらにまた
、それは、末端ミスマッチアダプターの一方の鎖を開裂する。後続のエキソヌク
レアーゼIIIおよびＳ１ヌクレアーゼ消化は、Ｔ４エンドヌクレアーゼVIIにより
開裂される二本鎖であれば全て消化する。エキソヌクレアーゼIIIは、実施例２
で示されている通り、メチルホスホネート含有ヌクレオチドをもつＤＮＡを消化
できない３'−５'エキソヌクレアーゼである。Ｓ１は、一本鎖ＤＮＡを特異的に
消化するエンドヌクレアーゼである。このようにして、Ｔ４エンドヌクレアーゼ
VIIにより開裂されなかったＤＮＡは、各二本鎖の３'末端にメチルホスホネート
ヌクレオチドが存在するためエキソヌクレアーゼIIIおよびＳ１ヌクレアーゼに
よる消化から保護される。消化段階後、残りのＤＮＡはアダプター特異的プライ
マーを用いて増幅され得る。

【００６０】実施例４において、フラグメントＳＤ１、ＥＳ１、ＥＳ３、ＥＳ４およびラム
ダ１７００を合わせ、オリゴヌクレオチドＥおよびＨを合わせることにより形成
されるアダプターをそれらに連結した。こうして、フラグメントの端部は全て、
マッチしたメチルホスホネート含有アダプターにより保護された。混合物を変性
させ、ハイブリダイズさせた。完全にマッチしたアダプターを伴うラムダ、ＳＤ
１、ＥＳ１、ＥＳ３またはＥＳ４のマッチしたホモ二本鎖の混合物が、フラグメ
ントの再会合時に予測された。さらに、完全にマッチしたアダプターを伴うミス
マッチ二本鎖は次のように予測された：ＥＳ１を伴うＳＤ１ＥＳ３を伴うＥＳ１ＥＳ３を伴うＳＤ１ＥＳ４を伴うＥＳ１ＥＳ４を伴うＳＤ１ＥＳ４を伴うＥＳ３

【００６１】上記実施例３の場合と同様にして混合物をミスマッチ開裂にかけた。ラムダ１
７００フラグメントは、消化に抵抗を示すことが予測され、ミスマッチを形成す
るフラグメントのいくつかは削除されることが予測された。

【００６２】消化後産物を増幅し、変性、ハイブリダイゼーション、消化および増幅のさら
なるラウンドにかけた。ラムダ１７００フラグメントの量は、これらの段階を各
連続ラウンド反復するにつれて、ＳＤ１／ＥＳ１／ＥＳ３／ＥＳ４フラグメント
に対してますます濃厚化されることが予測された。

【００６３】実施例３方法サザーンブロットハイブリダイゼーション分析この方法の各段階で除去されたＤＮＡ試料を、ヴィストラ・グリーン（商標）
で染色したアガロースゲルで分析し、フルアイメージャー５９５を用いて調べた
。次いで、ゲルからのＤＮＡを、製造業者により提供された使用説明書に従いハ
イボンド−Ｎ＋ナイロン（アマーシャム・ファーマシア・バイオテク）膜に転移さ
せ、ＥＳ３にハイブリダイズする放射性標識ＳＤ１プローブによりプローブした
。次いで、膜を剥がし、ＳＤ１プローブと類似した比活性を有するラムダ１７０
０プローブでプローブした。

【００６４】連結反応ラムダ１７００フラグメントおよびフラグメントＳＤ１を当モル量で混合し、
オリゴヌクレオチドＥおよびＦから成るアダプターをフラグメントに連結させた
。反応は、３.２ミリモルの各オリゴヌクレオチドおよび１×Ｔ４リガーゼ緩衝
液により構成された。反応におけるフラグメントの濃度は１００ng／μlであっ
た。同様に、ラムダ１７００およびＥＳ３フラグメント当モル量で混合した。オ
リゴヌクレオチドＧおよびＨを含むアダプターを、４ミリモルの各オリゴヌクレ
オチド、１×Ｔ４リガーゼ緩衝液との反応においてフラグメントの混合物に連結
した。反応におけるフラグメントの濃度は１２０ng／μlであった。平行して、
オリゴヌクレオチドＥおよびＦまたはＧおよびＨを含むアダプターを、各々独立
して予めＰｓｔＩにより切断しておいたヒトゲノムＤＮＡ（６７ng／μl）に連
結した。これらの反応物は、６.７ミリモルの各オリゴヌクレオチド、１×Ｔ４
リガーゼ緩衝液を含んでいた。反応をリガーゼ無しで誘発し、６５℃でインキュ
ベーションし、ゆっくりと４０℃に放冷した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを各反応に
加えて０.１単位／μlの最終濃度とし、反応物を３７℃で一夜インキュベーショ
ンした。マイクロスピンＳ−４００カラムを用いて未連結アダプターを除去した
。フラグメントの１００％回収が仮定された。

【００６５】フラグメントの変性およびハイブリダイゼーションハイブリダイゼーション反応を誘発したところ、上記と同様１００％回収を想
定すると、それらは、０.１５ピコモルの各ラムダ１７００bpおよびＳＤ１フラ
グメントおよびアダプターＥＦに連結されたヒトゲノムＤＮＡ５００ngを、０.
１５ピコモルの各ラムダ１７００bpおよびＥＳ３フラグメントおよびアダプター
ＧＨに連結したヒトゲノムＤＮＡ５００ngと一緒に含んでいた。

【００６６】水を加えて各試料の体積を４５μlとし、各管に１.２μlの１０％（ｖ／ｖ）
トウィーン−２０（ピアス）、５８μlの２×ハイブリダイゼーション緩衝液（
２.４モルのチオシアン酸ナトリウム（シグマ）、０.２モルのホスフェートｐ
Ｈ７.４、４ミリモルのＥＤＴＡ、ｐＨ８.０）および１１.５μlの９０％（ｖ／
ｖ）フェノール（シグマ）を加えた。試料を混合すると、溶液が少し不透明に見
えた。

【００６７】試料を７５℃に予熱しておいたブロックに置き、２分間インキュベーションし
た。次いで、管を混合すると、均一な溶液が得られた。試料を次の要領で循環さ
せた。すなわち９５℃で２分間の後、２２℃で１５分間および６５℃で２分間の
７０サイクルで循環させた。循環後、反応物を、４００μlの０.１％トウィーン
２０水溶液を含む１.５ml管に移した。０.５mlフェノール／クロロホルム／ＩＡ
Ａ（シグマ）を加え、試料に渦を巻かせ、卓上用微細遠心機において１２０００
rpmで５分間遠心分離にかけた。水相を新しい管に移し、１倍体積のクロロホル
ムで洗浄した。次いで、試料を５分間１２０００rpmの遠心分離にかけ、水相を
新しい管に移した。１μlの１mg／mlグリコーゲン、４０μlの３モル酢酸ナトリ
ウムｐＨ５.２および０.７倍体積のイソプロパノール（オールドリッチ）を加え
、混合した。試料を室温で３０分間インキュベーションした後、室温で１０分間
１２０００rpmの遠心分離にかけた。次いで、ペレットを７０％氷冷エタノール
で洗浄した。１２０００rpmで５分間回転後、エタノールを廃棄し、ペレットを
風乾した。各ペレットを４８μlの１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液に再懸濁した
。５μlアリコートを分析用に除去した。

【００６８】Ｔ４エンドヌクレアーゼVII消化製造業者の使用説明書の従い、３７℃で１５分間１０００単位の酵素により最
終体積５０μl中でＴ４エンドヌクレアーゼVII消化を行った。この消化後、８００bpの追加バンドが検出された。これは、ミスマッチ部位に
おけるＥＳ３／ＳＤ１ヘテロ二本鎖の開裂から予測される大きい方の特異的開裂
産物のサイズに相当する。

【００６９】エキソヌクレアーゼIII消化各反応を行うため、２５０ミリモルのＮａＣｌ４μl、０.１モルのトリス−
ＨＣｌｐＨ８.０および０.５モルのＭｇＣｌ_２を含む１.６μlの緩衝液、１.２
μlの水および１.３μlのエキソヌクレアーゼIII（２５０単位）を加え、３７℃
で１０分間インキュベーションすることにより、エキソヌクレアーゼIII消化を
行った。消化後、１５μlのアリコートを分析用に除去した。

【００７０】エキソヌクレアーゼIII段階後にＤＮＡのかなりの喪失があり、ＥＳ３／ＳＤ
１フラグメントおよびラムダ１７００フラグメントは両方ともある程度まで消化
されたと思われた。しかしながら、ラムダ１７００バンドは、ＳＤ１およびラム
ダプローブでプローブしたアガロースゲルのブロットにおいて依然として容易に
見出され得たが、ＳＤ１／ＥＳ３バンドは検出されなかった。

【００７１】Ｓ１ヌクレアーゼ消化最終消化段階のため、１.２μlのＳ１ヌクレアーゼ（１６単位）をエキソヌク
レアーゼIII消化試料に加え、反応物を３７℃で１５分間インキュベーションし
た。

【００７２】しかしながら、Ｓ１ヌクレアーゼ段階後、ラムダ１７００およびＳＤ１プロー
ブでプローブしたゲルのブロットにおけるアガロースゲルからＤＮＡを検出する
ことは困難であり、明確で強いラムダ１７００バンドは存在したが、ＳＤ１／Ｅ
Ｓ３フラグメントは全く検出されなかった。従って、予測される結果、すなわち
同一フラグメントの保存と同時にミスマッチフラグメントの消化が立証された。
最終産物はまた、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＧを用いたＰＣＲにより
増幅され得た。

【００７３】上記実施例はまた、エシェリキア・コリ（E.coli）ＤＮＡのバックグラウンド
を用いて行なわれ、結果は同じであった。すなわち、ラムダ１７００フラグメン
トは保持され、１０００bpフラグメントは実験の最後にはもはや検出されない。

【００７４】実施例３の結果を表１において表にまとめた形態で要約する。表１．実施例３に関する結果の要約：

【表１】

【００７５】＋は、記載されたフラグメントが、実施例３の最終産物のサザーンブロットで
検出され得ることを示す。検出に使用されるプローブは、フラグメント、すなわ
ち１０００bpフラグメント（ＥＳ３およびＳＤ１）またはラムダ１７００フラグ
メントに特異的であった。

【００７６】 −は、興味の対象であるフラグメントが、実施例３の最終産物のサザーンブロ
ットで検出され得ないことを示す。検出に使用されるプローブは、フラグメント
、すなわち１０００bpフラグメント（ＥＳ３およびＳＤ１）またはラムダ１７０
０フラグメントに特異的であった。

【００７７】実施例４方法フラグメントの生成ＳＤ１、ＥＳ１、ＥＳ２、ＥＳ３およびＥＳ４ＰＣＲ１０００bpフラグメン
トおよびラムダ１７００bpフラグメントを、本質的には実施例３記載の要領で１
００倍過剰のオリゴヌクレオチドを用いてオリゴヌクレオチドＥおよびＨを含む
アダプターに連結した。連結したフラグメント各々約０.５ngを、２００マイク
ロモルのｄＮＴＰおよび５単位のＴａｑポリメラーゼおよび１×Ｔａｑポリメラ
ーゼ反応緩衝液を含む１００μl反応液中プライマーとして２０ピコモルのオリ
ゴヌクレオチドＥを用いたＰＣＲにより増幅した。９４℃で３分間の初回変性段
階後、２５サイクルの増幅を次のように、すなわち３０秒間９４℃、２分間７２
℃で遂行した。反応物をＧＦＸカラムで精製し、生成物をピコグリーン（モレキ
ュラー・プローブ）を用いて製造業者の使用説明書に従い定量した。

【００７８】フラグメントの変性およびハイブリダイゼーション上記５種の１０００bpＰＣＲ産物の各々当モル量のプールを製造した。次いで
、このプールの２５ngアリコートを当モル量のラムダＰＣＲ産物と混合した。１
×Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液３０μlの最終体積でこのＤＮＡフラグメント
混合物を、９５℃で５分間変性させ、４分間４℃に冷却した後、ＭＪリサーチ温
度循環装置（サーマル・サイクラー）中６５℃で３０分間ハイブリダイゼーショ
ンした。ハイブリダイゼーション後、１×Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液の追加
の２０μlを各管に加えた。２μlアリコートを分析用に除去した。

【００７９】Ｔ４エンドヌクレアーゼVII消化残りのハイブリダイゼーション反応物に、２μg／μlのＰｓｔＩ消化エシェリ
キア・コリ（E.coli）ＤＮＡ１μlを補い、製造業者の使用説明書に従って、３
７℃で１５分間５８μlの最終体積中２０００単位のＴ４エンドヌクレアーゼVII
により消化した。５.８μl試料を分析用に各反応物から除去した。

【００８０】エキソヌクレアーゼ消化１２５ミリモルのＮａＣｌ、５０ミリモルのトリス（ｐＨ８）、１５ミリモル
のＭｇＣｌ、１２.５単位／μlのＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼを含む酵素混
合物の８μlアリコートを、各Ｔ４エンドヌクレアーゼVII消化物の残量に加えた
。次いで、反応物を混合し、３７℃で１０分間インキュベーションした。１３.
２μlアリコートを分析用に各反応物から除去した。

【００８１】Ｓ１ヌクレアーゼ消化各反応物の残量に、１.２μlのＳ１ヌクレアーゼ（１６単位）を加えた。次い
で、反応物を３７℃で１５分間インキュベーションし、５μlの０.５モルＥＤＴ
Ａ（ｐＨ８.０）を加えることにより終結させた。１５.１μlアリコートを後の
分析用に保持した。

【００８２】各酵素段階後に除去した試料を、ＥＳ２の１０００bpフラグメントおよび１７
００bpラムダフラグメントの系列希釈液と一緒に１％アガロースゲルにかけた。
ゲルを１５分間ヴィストラグリーン（１：１００００）で後染色し、フルアイメ
ージャー５９５で分析した。

【００８３】第２ラウンドのハイブリダイゼーションおよび酵素消化のためのＰＣＲ増幅上記の第１ラウンドのハイブリダイゼーションおよび酵素消化から生じた生成
物のデュプリケイト管を合わせ、製造業者の使用説明書に従いＧＦＸカラムで精
製した。試料を１００μlの水で溶離し、次いで、この溶離液の２０μlアリコー
トを、１×Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液中プライマーとして２０ピコモルのオ
リゴヌクレオチドＧ、２００マイクロモルのｄＮＴＰおよび５単位のＴａｑポリ
メラーゼを含む１００μlのＰＣＲ反応において鋳型として使用した。９４℃で
３分間の初回変性段階後、９４℃、３０秒、７２℃２分という条件を用いて２０
サイクルの増幅を遂行した。反応物を、１％アガロースゲルにおいて各反応物１
５μlを分離することにより分析し、上記と同様に染色し、視覚化した。

【００８４】第１ラウンドの結果最初に５種の異なる１０００bpフラグメントおよび１７００bpラムダフラグメ
ントから成る混合物を含む反応物のハイブリダイゼーションおよび酵素消化の第
１ラウンド後、ラムダフラグメントに相当する１７００bp生成物がはっきりと見
られた。また、微かな１０００bpバンドは、ＥＳ１／ＥＳ２／ＥＳ３／ＥＳ４／
ＳＤ１フラグメントに対応するアガロースゲルにおいて検出可能なだけであった
。ＥＳ１のみを含む対照反応では、１０００bpの明確なバンドが観察された。こ
れらの結果は、１ラウンドのハイブリダイゼーションおよび酵素ミスマッチ開裂
後に、ミスマッチ含有二本鎖を形成し得る１０００bpフラグメントが、完全にマ
ッチした二本鎖しか形成し得ないラムダフラグメントに対して消耗されることを
立証していた。

【００８５】ハイブリダイゼーションおよびミスマッチ消化の第２ラウンド第１ラウンドのハイブリダイゼーションおよび酵素消化に耐えた増幅材料を、
本質的には上記と同様の第２ラウンドにかけた。しかしながら、第２ラウンドで
は、１００単位ではなく８０単位のＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼを各反応に
加えた。Ｓ１ヌクレアーゼ消化後、この方法の第２ラウンドの生成物をＧＦＸカ
ラムで精製し、１００μlの水で溶離した。次いで、４０μlアリコートを上記と
同様にＰＣＲ増幅用鋳型として使用した。

【００８６】第２ラウンドの結果第２ラウンドのハイブリダイゼーションおよび酵素消化後、１７００bpラムダ
フラグメントに相当するバンドが、アガロースゲル電気泳動後にはっきりと見ら
れた。反対に、１０００bpのＥＳ１／ＥＳ２／ＥＳ３／ＥＳ４／ＳＤ１フラグメ
ントに対応する非常に微かなバンドはほとんど検出され得なかった。対照反応（
ＥＳ１１０００bpのみの出発集団）では、明確な１０００bpバンドが増幅後に
検出された。

【００８７】ハイブリダイゼーションおよび酵素消化の第１および第２ラウンドの最終産物
に対応するアガロースゲルバンドの定量により、全１０００bpフラグメントに対
する１７００bpラムダフラグメントの割合は、第１ラウンドと比べて第２ラウン
ドの最後にさらなる濃厚化を示すことが立証された。

【００８８】（付録１）

【化６】

【化７】

【化８】

【００８９】他のプラスミドの配列は、上記配列において、太字で配列の残りより大きいフ
ォントサイズで示された６塩基「ＧＡＴＡＴＣ」の連続配列でのみ変化する。こ
れらの変異型は次の通りである：ＳＤ１ＧＡＴＡＴＣＥＳ１ＡＡＴＡＴＣＥＳ３ＣＡＴＡＴＣＥＳ４ −ＡＴＡＴＣ

【００９０】全プラスミドからのＰｓｔＩ部位を含む端部をもつ１０００bpフラグメントの
増幅に使用されるプライマーの配列は、次の通りであった。プラスミドにおける
それらの位置には下線が付されている：

【化９】ＰＣＲ後、生成物をＰｓｔＩで消化した。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、「共通の祖先をもつ２個体における同祖（ＩＢＤ）フラ
グメントの濃厚化」と題される、公知ＧＭＳシステムの図である。

【図２】図２は「共通の祖先をもつ２個体におけるフラグメントＩＢＤの
濃厚化」と題される、ここに記載されている異なるゲノム分析方法の図である。

【図３】図３は「共通の祖先をもつ２個体におけるフラグメントＩＢＤの
濃厚化」と題される、ここに記載されている異なるゲノム分析方法の図である。

【図４】図４は、「共通の祖先をもつ個体のプールされたゲノムにおける
フラグメントＩＢＤの濃厚化」と題される、ここに記載されている異なるゲノム
分析方法の図である。

【図５】「疾病および野生型個体のプールされた核酸を用いた情報性フラ
グメントの消去的濃厚化」と題される、ここに記載されている異なるゲノム分析
方法の図である。

【図６】図６は、実施例３で使用されるシステムの図である。

【図７】図７は、実施例４で使用されるシステムの図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ラジェシュ・ムル・オデドライギリス、エスジー２・７イーアール、ハートフォードシャー、スティーブンエイジ、ゴダード・エンド21番Ｆターム(参考） 2G045 AA35 AA40 DA13 FB01 FB02 FB07 JA01 4B024 AA11 AA20 CA03 HA12 4B063 QA13 QQ43 QR08 QR32 QR42 QR56 QS25 QS34 QX07 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）２種の異なる供給源から比較されるべきゲノムＤＮＡを消化することによ
り、平均長が天然多型間の平均スペーシングよりも大きいゲノムフラグメントを
提供し、ｂ）ハイブリダイゼーション条件下、２種の供給源からのゲノムフラグメント
の１本鎖を合わせ、ｃ）ホモハイブリッドからヘテロハイブリッドを分離し、そしてｄ）ミスマッチをもつハイブリッドからミスマッチ不含有ヘテロハイブリッド
を分離することによるゲノム分析遂行方法であって、アダプターを段階ａ）で製造された各ゲノ
ムフラグメントの各端へ連結することを含み、上記アダプターが２本鎖ミスマッ
チ不含有形態においてヌクレアーゼ消化に抵抗性を示す、方法。
【請求項２】アダプターが、ヌクレアーゼ抵抗性である、ホスホロチオエ
ートおよびメチルホスホネートから選択される、１個またはそれ以上のホスホジ
エステル結合を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】ホモハイブリッドのアダプターが少なくとも１個のミスマッ
チを含み、ヘテロハイブリッドのアダプターが完全にマッチしている、請求項１
または請求項２記載の方法。
【請求項４】段階ｃ）およびｄ）が、ミスマッチ認識タンパク質およびエ
キソヌクレアーゼ／エンドヌクレアーゼの組み合わせを用いて行なわれる、請求
項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】ｉ）表現型を共有する複数の個体からプールされたゲノムＤＮＡを用意し、ｉｉ）ゲノムＤＮＡを消化することにより、平均長が天然多型間の平均スペー
シングよりも大きいゲノムフラグメントを提供し、ｉｉｉ）アダプターを段階ｉｉ）で製造された各ゲノムフラグメントの各端に
連結させ、ここでアダプターが２本鎖ミスマッチ不含有形態であるときは、ヌク
レアーゼ消化に抵抗性を示すものとし、ｉｖ）段階ｉｉｉ）で製造されたアダプター終結ゲノムフラグメントの混合物
を変性および再アニーリングし、ｖ）段階ｉｖ）で製造された混合物からミスマッチを含むハイブリッドを除去
し、そして必要ならばミスマッチ不含有ハイブリッドを増幅し、ｖｉ）そして段階ｉｖ）およびｖ）を反復することにより、表現型に付随する
１個または数個のミスマッチ不含有ハイブリッドを回収することによるゲノム分析遂行方法。
【請求項６】段階vi）で回収された１個または数個のミスマッチ不含有ハ
イブリッドが、核酸のレファレンス配列へのハイブリダイゼーションにより分析
される、請求項５記載の方法。
【請求項７】段階ｖｉ）から生じるミスマッチ不含有ハイブリッドが配列
決定される、請求項５記載の方法。
【請求項８】ｉ）表現型を共有する複数の個体からプールされた第１核酸を用意し、ｉｉ）第１核酸を消化することにより、平均長が天然多型間の平均スペーシン
グとほぼ同じかまたはそれより短いフラグメントを提供し、ｉｉｉ）段階ｉｉ）で製造された各フラグメントの各端へアダプターを連結さ
せることにより、アダプター終結核酸フラグメントを形成し、ここでこれらが２
本鎖ミスマッチ不含有形態であるときは、ヌクレアーゼ消化に対する抵抗性を示
すものとし、ｉｖ）段階ｉｉｉ）で製造されたアダプター終結核酸フラグメントの混合物を
変性および再アニーリングし、ｖ）段階ｉｖ）で製造された混合物からミスマッチを含むハイブリッドを除去
し、そして必要ならばミスマッチ不含有ハイブリッドを増幅し、ｖｉ）段階ｉｖ）およびｖ）を反復することにより、ミスマッチ不含有ハイブ
リッドの第１混合物を回収し、ｖｉｉ）同じ表現型を共有しない複数の個体からプールされた第２核酸を用意
し、ｖｉｉｉ）ｖｉｉ）の核酸を段階ｉｉ）〜ｖｉ）に付すことにより、ミスマッ
チ不含有ハイブリッドの第２混合物を回収し、ｉｘ）ハイブリダイゼーション条件下、ミスマッチ不含有ハイブリッドから成
る第１混合物およびミスマッチ不含有ハイブリッドから成る第２混合物の１本鎖
を合わせ、ｘ）そしてミスマッチ不含有ハイブリッドを形成せず、表現型に付随する核酸
フラグメントを回収することによるゲノム分析遂行方法。
【請求項９】段階ｘ）で採取された核酸フラグメントが、核酸のレファレ
ンス配列へのハイブリダイゼーションにより分析される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】段階ｘ）で採取された核酸フラグメントが配列決定される
、請求項８記載の方法。
【請求項１１】核酸がゲノムＤＮＡである、請求項８〜１０のいずれかに
記載の方法。
【請求項１２】核酸が、興味の対象である一組織または複数の組織で転写
されるゲノムのサブセットを表す、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】段階ｘ）が、少なくとも１個のミスマッチ特異的タンパク
質への結合後、ミスマッチフラグメントの物理的分離により遂行される、請求項
８〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】アダプターが、ヌクレアーゼ抵抗性を示す、ホスホロチオ
エートおよびメチルホスホネートから選択される、ホスホジエステル結合を含む
、請求項５〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】段階ｖ）において、ミスマッチ含有ハイブリッドがミスマ
ッチ認識タンパク質およびエキソヌクレアーゼ／エンドヌクレアーゼの組み合わ
せ手段により除去される、請求項５〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】４オリゴヌクレオチドから成るセットであって、セット中
の各オリゴヌクレオチドがセット中の第１の他のオリゴヌクレオチドに相補的で
あって、それと共にヌクレアーゼ消化に抵抗性を示すハイブリッドを形成し、そ
してセット中の第２の他のオリゴヌクレオチドと実質的に相補的であるセット。
【請求項１７】各オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートおよびメチ
ルホスホネートから選択される１個またはそれ以上のホスホジエステル結合を含
む、請求項１６記載のセット。
【請求項１８】キットが請求項１６または請求項１７記載の４オリゴヌク
レオチドから成るセットをリガーゼおよびヌクレアーゼと一緒に含む、請求項１
〜４のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。
【請求項１９】キットが、２本鎖形態であるときヌクレアーゼ消化に抵抗
性を示すアダプター、およびリガーゼおよびヌクレアーゼの供給を含む、請求項
５〜１５のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。
【請求項２０】アダプターが、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネ
ートから選択される１個またはそれ以上のホスホジエステル結合を含む、請求項
１９記載のキット。
【請求項２１】またミスマッチ認識タンパク質も存在する、請求項１８〜
２０のいずれかに記載のキット。