JP2002535999A - ゲノム分析方法 - Google Patents

ゲノム分析方法

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JP2002535999A
JP2002535999A JP2000597461A JP2000597461A JP2002535999A JP 2002535999 A JP2002535999 A JP 2002535999A JP 2000597461 A JP2000597461 A JP 2000597461A JP 2000597461 A JP2000597461 A JP 2000597461A JP 2002535999 A JP2002535999 A JP 2002535999A
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グレッグ・ファース
ラジェシュ・ムル・オデドラ
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アマシャム バイオサイエンス ユーケイ リミテッド
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Abstract

(57)【要約】 表現型を共有する2個体からのゲノムDNAを比較し、DNAを平均して一つまたは幾つかの多型を含むのに充分な長さのフラグメントに切断し、ハイブリダイゼーション条件下でフラグメントを合わせ、ミスマッチ不含有ヘテロハイブリッドを回収する方法であって、ヌクレアーゼ消化に抵抗するアダプターをゲノムフラグメントの端部に連結する方法。関連方法では、共通の表現型をもつ個体からプールしたゲノムDNAを使用する。別の関連方法では、平均して一天然多型より少ないものを含むと思われる制限核酸フラグメントを使用する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 ヒト、動物および植物における疾病感受性および他の形質に関与する遺伝子の
連鎖マッピングは、近年の生物学および医学における進歩の最重要手段の一つに
なっている。連鎖マッピングの目標としての多型DNAマーカーの開発は、この
進歩における主要因となってきた。しかしながら、ヒトにおけるこれらの連鎖マ
ッピング用マーカーに頼る現行方法は労力を要するものであり、同時にせいぜい
数個のマーカーがスクリーニングされ得るに過ぎない。さらに、それらの能力は
、ヒトゲノムの多くの部分において高度情報マーカーがまばらであることにより
制限されている。
【0002】 ゲノムミスマッチ走査(GMS)は、慣用的な多型マーカーまたはゲル電気泳
動に関する必要条件を全くもたないポジショナルクローニング戦略である。その
戦略では、充分なミスマッチ不含有ハイブリッド分子の情報に基づき関連した2
個体間における同祖(IBD)のフラグメントを単離する。GMS技術は、米国
特許5376526に記載されており、この明細書に添付された図面の図1で説
明されている。
【0003】 ハイブリダイゼーション前に一試料をダムメチル化することにより、完全メチ
ル化または完全非メチル化DNAのみを開裂するメチル化感受性制限エンドヌク
レアーゼによりホモハイブリッド二重らせんが識別され得る。MutHLSメチ
ル指向性ミスマッチ修復タンパク質は、非メチル化鎖におけるミスマッチヘテロ
二本鎖を開裂する。ミスマッチ不含有ヘテロハイブリッド分子の場合を除き、D
NAは全てエキソヌクレアーゼIII消化および結合カラムを用いる1本鎖DNA
の物理的分離の組み合わせにより排除される。選択された分子は、一般的プライ
マーの組み合わせを用いるインターAlu PCRにより増幅され、それに続い
てゲノムの間隔を表すDNA試料の定序アレイとのハイブリダイゼーションによ
り同定される。
【0004】 天然多型は平均して数百bpごとに1回、すなわち1000bpごとに少なく
とも1回現れるため、長さ数キロベースでミスマッチ不含有のヘテロハイブリッ
ドはIBDであると思われる。同様に、充分に大きいヘテロ二本鎖における非I
BD対立遺伝子は、1個またはそれ以上のミスマッチを含むと思われ、ミスマッ
チ修復タンパク質により開裂される。
【0005】 疾病同胞の複数対からのIBD地図を合わせ、作成された構成地図を、遺伝子
型一致の頻度が偶然により予測されるよりも高い遺伝子座について検索する。こ
れらの遺伝子座は、標的突然変異(複数も可)を内包し得る候補領域を表す。
【0006】 2ゲノムがIBDではないときの遺伝子座からのDNA収率と比較した、2ゲ
ノムが対立遺伝子IBDを共有するときの座からのDNAの相対収率は、この技
術の信頼性を示している。ヒトゲノムDNAを含む分析の場合、IBDフラグメ
ントの50%に関して1−2の係数およびIBDフラグメントの35%に関して
2−5の係数による濃厚化が報告されている。IBDフラグメントの15%のみ
、>5の係数による濃厚化が報告されている。さらに、GMS選択後のDNA収
率は非常に乏しいため、アレイとのハイブリダイゼーション前に選択されたフラ
グメントの増幅が要求される。
【0007】 共通の祖先をもつ2個体におけるIBDのフラグメントの濃厚化。 IBDのフラグメントの濃厚化を達成するための新規遺伝子分析遂行方法を提
供することが、本発明の一態様である。すなわち一態様において、この発明は、 a)2種の異なる供給源から比較されるべきゲノムDNAを消化することによ
り、平均長が天然多型間の平均スペーシングよりも大きいゲノムフラグメントを
提供し、 b)ハイブリダイゼーション条件下、2種の供給源からのゲノムフラグメント
の1本鎖を合わせ、 c)ホモハイブリッドからヘテロハイブリッドを分離し、そして d)ミスマッチをもつハイブリッドからミスマッチ不含有ヘテロハイブリッド
を分離すること によるゲノム分析遂行方法であって、アダプターを段階a)で製造された各ゲノ
ムフラグメントの各端へ連結することを含み、上記アダプターが2本鎖ミスマッ
チ不含有形態においてヌクレアーゼ消化に抵抗性を示す、方法を提供する。
【0008】 この方法では、2種の異なる供給源、一般的には共通祖先から獲得した可能性
がある特定表現型を共有する2種の異なるウイルスまたは原核生物または真核生
物(例、ヒト、動物または植物)個体からのゲノムDNAを比較する。表現型は
、特定の一連の環境的および/または遺伝的影響下にある生物体が示す観察可能
または測定可能な特性である。ハイブリダイゼーション条件は、分析されている
ゲノムフラグメントにより異なり得、当業界に精通した読者には熟知されている
はずである。示されている通り、天然多型は、ヒトゲノムDNAでは平均して数
百bpごとに1回、すなわち1000bpごとに少なくとも1回出現する。比較され
るべき2個体のゲノムDNAを、一般にこれより長いフラグメントに切断する。
すなわち、各ゲノムフラグメントは平均して1種またはそれ以上の多型を含む。
これは、比較的低頻度で切断する一制限酵素(または2種またはそれ以上の制限
酵素)の使用により実施され得る。好適な制限酵素にはII型のものおよびまたII
S型のものがある。別法として、酵素的手段とは対照的に物理的または化学的手
段によるゲノムDNAの制限も行われ得る。
【0009】 アダプターは各フラグメントの各端へ連結される。アダプターは少なくとも部
分的に2本鎖ポリヌクレオチド、一般的にはオリゴヌクレオチドであり、必要な
らば制限酵素により生成されるオーバーハングと相補的なオーバーハングを有す
る。別法として、フラグメントおよびアダプターは両方とも連結用の平滑末端を
有し得る。アダプターは、ミスマッチ識別に基いた有効な連結反応、増幅または
選別を妨害しがちである、2次構造に陥り易くさせることのない不定の配列のオ
リゴヌクレオチドを含み得る。分析下のDNAを増幅するのに使用される、アダ
プター配列の全部または一部を含むプライマーをさらに調べることにより、確実
に非特異的増幅が回避される。2本鎖ミスマッチ不含有形態であるときは、アダ
プターはヌクレアーゼ消化に抵抗性を示し、すなわち通常のDNAの場合よりも
抵抗性が高くなる。かかる抵抗性は、修飾ヌクレオチド間連鎖、例えばホスホロ
チオエートまたはメチルホスホネート連鎖を提供することにより、またはヌクレ
アーゼ抵抗性を付与するヌクレオチド類似体の使用により付与され得る。しかし
ながら、好ましくは、第1供給源からのゲノムDNAのフラグメントに連結され
た第1アダプターはミスマッチを含み、また第2供給源からのゲノムDNAのフ
ラグメントに連結された第2アダプターもミスマッチを含む。2つのアダプター
は、一方のアダプターの前方鎖が他方のアダプターの後方鎖とハイブリダイズす
ることにより、ミスマッチ不含有ヘテロハイブリッドを形成するように設計され
ている。ヘテロハイブリッドは、異なる個体からの2本鎖を含み、同じ個体から
の2本鎖を含むホモハイブリッドとは対照的である。2種の系は、添付図面の図
2および3に関してより詳細に記述されている。
【0010】 ここで、図2は、各々ホスホロチオエート連鎖を含むセクション内にミスマッ
チを有する2種のアダプターの使用を示す。
【0011】 そして図3は、各々ホスホロチオエート連鎖を有するセクションの外側にミス
マッチを有する2種の異なるアダプターの使用を示す。
【0012】 疾病対分析に関する修正方法は、両ゲノムDNA試料の制限消化およびアダプ
ター配列相互の連結反応を含む。これらのアダプターは、ホモ二本鎖分子におけ
るハイブリダイゼーション後も存続するミスマッチ領域を含む。対照的に、アダ
プター配列はヘテロ二本鎖において完全に相補的である。ミスマッチ認識タンパ
ク質、例えばT4エンドヌクレアーゼVIIの後続使用およびヌクレアーゼ消化の
結果、ミスマッチを有する分子が全て排除される。ミスマッチ不含有ヘテロ二本
鎖分子は、例えば保護を意味するアダプター配列にホスホロチオエートまたはメ
チルホスホネート連鎖が含まれるため、消化に抵抗を示す。これらの分子は、下
記で検討されている分析前に単一プライマー対により効果的および好都合に増幅
され得る。
【0013】 全フラグメント末端へアダプターを連結することにより、2種DNA試料のハ
イブリダイゼーションにより製造されるホモハイブリッド分子が選択的に消化さ
れ、そして適当なアダプタープライマーにより濃厚化フラグメントが効果的に増
幅される好都合な機会が提供される。アダプター端における、ホスホロチオエー
トまたはメチルホスホネート連鎖の存在、または他の阻害的特徴により、ヌクレ
アーゼ消化に対する防御性が提供される。アダプター配列は、ヘテロハイブリッ
ド分子の形成に関して完全に相補的であるように慎重に設計されている。しかし
ながら、ホモハイブリッド分子では、ミスマッチが存続する。ホスホロチオエー
トまたはメチルホスホネート連鎖に近い位置におけるミスマッチの鎖開裂により
、後続のヌクレアーゼ消化に対する脆弱性が生じ、ホモハイブリッド分子の排除
が最高潮に達する。しかしながら、鎖開裂はミスマッチの非存在下では行なわれ
ないため、ヘテロハイブリッド分子におけるホスホロチオエートまたはメチルホ
スホネート防御性は存続している。
【0014】 若干の型のミスマッチアダプターは、この目的に適しており、非相補的末端を
伴う「Y」形状アダプター(図2)、およびアダプター長に沿った位置に1個ま
たはそれ以上のミスマッチヌクレオチドを伴うアダプター(図3)を含む。前者
の場合、1本鎖特異的エンドヌクレアーゼは鎖開裂の達成に使用され得、T4エ
ンドヌクレアーゼVIIは後者の場合にミスマッチを開裂する。それに続いて3'−
5'エキソヌクレアーゼを用いることにより開裂した分子を消化する場合、両ア
ダプター鎖が各ゲノムフラグメントとの共有結合を形成するのを確実にするため
にはオリゴヌクレオチド燐酸化が必要である。しかしながら、5'−3'エキソヌ
クレアーゼを使用する場合、これは必要ではないこともあり得る。ミスマッチ識
別方法本来の特徴としてホモハイブリッド2本鎖を選択的に排除するためのミス
マッチアダプターを使用することにより、一ゲノム試料のダムメチル化およびメ
チル化感受性制限酵素によるハイブリッド分子の後続消化は不要となる。
【0015】 MutHLSミスマッチ認識タンパク質(米国特許5376526で使用され
ている)による鎖切断は、最大活性を達成するためにはフラグメント端から少な
くとも150塩基対であるべきミスマッチ二本鎖内の少なくとも1つの(GAT
C)部位に関する絶対的必要条件を有する。非メチル化鎖のみヘミメチル化二本
鎖で開裂され、これの効率はミスマッチの性質および周囲配列の前後関係により
異なる。この酵素系は、C・Cミスマッチおよび4ヌクレオチドより長い挿入/
欠失ループを認識し得ない。反対に、T4エンドヌクレアーゼVIIは、全ての単
一塩基ミスマッチおよびあらゆるサイズの挿入/欠失ループを識別し得るミスマ
ッチ認識タンパク質である。4kbp以下のフラグメントはうまく消化され、ミス
マッチが少なくとも9ヌクレオチドによりフラグメント端から分離されたとき最
大開裂効率が達成される。適当な緩衝液にはトリス、pH8があり、さらに好ま
しくは燐酸緩衝液がある。配列前後関係およびミスマッチの性質はまたT4エン
ドヌクレアーゼVII消化効率に影響を及ぼすが、顕著な利益は、MutHLSタ
ンパク質をこの酵素と置き換えることにより達成され得る。他のミスマッチ認識
/修復タンパク質は、Cel1およびT7エンドヌクレアーゼIを含め好適であ
り得る。マッチフラグメントからミスマッチフラグメントを分離する方法の選択
は、酵素の使用に限られるわけではなく、化学的または物理的手段によっても達
成され得る。
【0016】 ヌクレアーゼ消化により開裂された二重らせんの排除の方が、1本鎖DNA結
合カラムによるそれらの物理的分離に頼る場合よりも有効であると思われる。1
本鎖特異的エンドヌクレアーゼ活性および5'−3'または3'−5'エキソヌクレ
アーゼ活性を提供する1種またはそれ以上の酵素が適当であり得る。さらに、T
4エンドヌクレアーゼVIIは環境によっては1本鎖切除部を作成する場合もあり
得るため、エキソヌクレアーゼがニックで活性を示すことが重要である。さらに
、ヘテロ二本鎖分子を保存するためには、エキソヌクレアーゼはホスホロチオエ
ートまたは他の修飾連鎖により阻害されなければならない。単独または組み合わ
せて使用するのに適した候補には、Bal3lヌクレアーゼ、SIヌクレアーゼ
、緑豆ヌクレアーゼ、T7遺伝子6エキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼII
Iおよびポリメラーゼの3'−5'エキソヌクレアーゼ活性、例えばT4 DNAポ
リメラーゼがあるが、これらに限定されるわけではない。
【0017】 プールされた試料における共通配列の選択的濃厚化:共通祖先を有する個体の
プールされたゲノムにおけるフラグメントIBDの濃厚化 現行のGMS方法を用いた候補疾病遺伝子座の同定は、典型的には200を越
える疾病対分析およびゲノムクローン系列への濃厚化フラグメントのハイブリダ
イゼーションを必要とする。全ての疾病対分析の累積データから構築された、濃
厚化フラグメントの構成地図の精査、および遺伝子型の一致が偶然により予測さ
れる場合よりも高頻度で出現する領域の同定により候補領域を決定する。
【0018】 多数の疾病個体が全部一緒に分析される場合、多様な別々の対に関する分析お
よび後続のハイブリダイゼーション段階に対する必要性は回避され得る。表現型
の正確な診断は重要な予備段階である。しかしながら、例えば疾病個体の全部ま
たは大多数が共通の祖先を通してそれらの表現型を獲得したため、同じ配列変異
型が全てに共通している場合、候補領域は単一分析で同定され得る。
【0019】 この発明の別の目的はこの必要性を満たすことである。この態様において、本
発明は、 i)表現型を共有する複数の個体からプールされたゲノムDNAを用意し、 ii)ゲノムDNAを消化することにより、平均長が天然多型間の平均スペー
シングよりも大きいゲノムフラグメントを提供し、 iii)アダプターを段階ii)で製造された各ゲノムフラグメントの各端に
連結させ、ここでアダプターが2本鎖ミスマッチ不含有形態であるときは、ヌク
レアーゼ消化に抵抗性を示すものとし、 iv)段階iii)で製造されたアダプター終結ゲノムフラグメントの混合物
を変性および再アニーリングし、 v)段階iv)で製造された混合物からミスマッチを含むハイブリッドを除去
し、そして必要ならばミスマッチ不含有ハイブリッドを増幅し、 vi)そして段階iv)およびv)を反復することにより、表現型に伴う1個
または数個のミスマッチ不含有ハイブリッドを回収すること によるゲノム分析遂行方法を提供することである。
【0020】 参考となるものが、この技術を示す図である添付の図4に示されている。
【0021】 適当なプロトコルには、例えば共通祖先であると推定される疾病個体のゲノム
DNA試料のプールおよびゲノムプールの制限消化が含まれる。ホスホロチオエ
ートまたはメチルホスホネートまたは他の保護手段を運ぶ相補的オリゴヌクレオ
チドを含む単一アダプターを、プールの変性および再アニーリング前に全フラグ
メントへ連結させる。多数の個体がプールに寄与する場合、ほとんどのフラグメ
ントはハイブリダイゼーション時にヘテロ二本鎖を形成する。ミスマッチ修復タ
ンパク質、例えばT4エンドヌクレアーゼVIIの使用およびヌクレアーゼ消化に
よりミスマッチ分子を排除する。アダプター配列を相補するよう適当に設計され
た単一プライマーを用いて残りの分子を増幅する。増幅産物をミスマッチ識別の
反復ラウンドに付すことにより、ミスマッチヘテロ二本鎖分子が激減し、IBD
フラグメントの濃厚化が促進される。サイクルの数は、関与する個体の数および
類似性(または関連性)により異なり得る。最後に、選択されたフラグメントは
、例えば核酸のレファレンス配列へのハイブリダイゼーションによりさらに分析
され得る。別法として、反復ミスマッチ識別によるIBDフラグメントの濃厚化
が非情報的フラグメントを全て有効排除するのに充分である場合、選択された分
子は直接クローン化および配列決定され得る。従って、多重疾病対分析に対する
必要性の排除に加えて、ゲノムクローンのアレイに関する必要条件が排除される
【0022】 別の態様において、この発明は、4オリゴヌクレオチドから成るセットを提供
し、セットの各オリゴヌクレオチドは、セットの第1の他のオリゴヌクレオチド
と相補的であり、それとヌクレアーゼ消化に抵抗性を示すハイブリッドを形成し
、セットの第2の他のオリゴヌクレオチドと実質的に相補的である。好ましくは
、各オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネートから
選択される1個またはそれ以上のホスホジエステル結合を含む。
【0023】 別の態様において、この発明は、上記方法を遂行するためのキットであって、
リガーゼおよびヌクレアーゼと一緒に4オリゴヌクレオチドから成るこのセット
を含むキットを提供する。
【0024】 疾病および野生型ゲノムフラグメントの消去的ハイブリダイゼーションによる
共通配列の選択的濃厚化 本来のGMS方法を用いて、同祖DNAの大域が濃厚化され得る。それに続い
てこれらの候補配列を分析し、それらが含み得る配列変異型を同定するのにはか
なりの努力が要求される。候補配列が大きいとき、配列変異型に関してそれらを
精査するのに要する努力も多大となる。従って、非常に短い候補配列を生成する
方法は、かなりの利点を提供することになる。さらに、この方法は、DNAおよ
びRNAの両方における全配列差異の分析に特に適している。
【0025】 この発明の別の目的は、この要望を満たすことである。この態様において、本
発明は、 i)表現型を共有する複数の個体からプールされた第1核酸を用意し、 ii)第1核酸を消化することにより、平均長が天然多型間の平均スペーシン
グとほぼ同じかまたはそれより短いフラグメントを提供し、 iii)段階ii)で製造された各フラグメントの各端へアダプターを連結さ
せることにより、アダプター終結核酸フラグメントを形成し、これらは2本鎖ミ
スマッチ不含有形態であるときは、ヌクレアーゼ消化に対する抵抗性を示すもの
とし、 iv)段階iii)で製造されたアダプター終結核酸フラグメントの混合物を
変性および再アニーリングし、 v)段階iv)で製造された混合物からミスマッチを含むハイブリッドを除去
し、そして必要ならばミスマッチ不含有ハイブリッドを増幅し、 vi)段階iv)およびv)を反復することにより、ミスマッチ不含有ハイブ
リッドの第1混合物を回収し、 vii)同じ表現型を共有しない複数の個体からプールされた第2核酸を用意
し、 viii)vii)の核酸を段階ii)〜vi)に付すことにより、ミスマッ
チ不含有ハイブリッドの第2混合物を回収し、 ix)ハイブリダイゼーション条件下、ミスマッチ不含有ハイブリッドから成
る第1混合物およびミスマッチ不含有ハイブリッドから成る第2混合物の1本鎖
を合わせ、 x)そしてミスマッチ不含有ハイブリッドを形成せず、表現型に付随する核酸
フラグメントを回収すること によるゲノム分析遂行方法を提供する。
【0026】 段階ii)は、比較的高頻度で切断する少なくとも1個の制限酵素の使用によ
り実施され得る。すなわち、フラグメントの大多数は天然多型を全く含まない。
【0027】 参考となるものが、この技術を示す図である図5に示されている。
【0028】 疾病個体のゲノムが、核酸を頻繁に開裂する1種またはそれ以上の酵素で制限
される場合、非常に短いフラグメントのプールが得られる。この方法で生成され
たフラグメント数は、ゲノム内の多型配列の総数より多い。それ自体、解離され
、再アニーリングされると、ほとんどのフラグメントは完全にマッチしたヘテロ
二本鎖分子を形成する。達成できる限り一制限フラグメントにつき一多型に近づ
くのが好ましいが、好ましくはそれ以上ではない。フラグメントが小さい場合、
この方法において、2プール間においてミスマッチした情報性フラグメントとは
識別されなければならない「ノイズ」に寄与する同一フラグメントの比率は増加
する。同じフラグメントにおける近隣の多型性(複数も可)は個体のプールにお
いて同一ではあり得ないため、フラグメントが大きい場合、複数の多型性をもつ
フラグメントの比率が増加し、このため情報性配列変化を含むフラグメントを失
う可能性も増加する。
【0029】 ホスホロチオエートまたはメチルホスホネート連鎖を含むことによりヌクレア
ーゼ消化に対する防御性が提供される単一アダプターは、あらゆる核酸フラグメ
ントに連結される。これらのフラグメントは解離され、再アニーリングされ、ミ
スマッチ分子はミスマッチ修復タンパク質、例えばT4エンドヌクレアーゼVII
により開裂される。開裂分子は、エンドヌクレアーゼおよび5'−3'または3'
−5'エキソヌクレアーゼ活性を提供する1種またはそれ以上のヌクレアーゼに
より排除される。鎖解離および再アニーリング、次いでT4エンドヌクレアーゼ
VIIおよび適当なヌクレアーゼを用いたミスマッチ認識から成るこのプロセスは
反復される。
【0030】 疾病個体の場合と同様の方法で、野生型個体の核酸をプールし、制限し、アダ
プターに連結し、反復ミスマッチ識別に付す。従って、各個別プールでは、プー
ルにおける全個体に共通する配列を含むフラグメントのみが当然存続している。
【0031】 疾病プールの濃厚化フラグメントを、野生型プールの過剰の濃厚化フラグメン
トにハイブリダイズさせる。各プールへ核酸を与える個体が例えば同じ人種起源
を共有する同じ集団から選ばれた場合、当然、非常に多数のフラグメントが完全
にマッチした二重らせんを形成する。表現型が区別される原因となる突然変異を
含むフラグメントのみ、当然、ハイブリダイゼーション時にミスマッチ二本鎖を
形成する。これらのミスマッチ分子を選択する。従って、プロトコルの完成は、
興味の対象である配列変異型を潜在的に含む非常に短いゲノムフラグメントにお
いて完結する。次いで、これらの選択されたフラグメントは、例えば核酸のレフ
ァレンス配列へのハイブリダイゼーションにより比較的容易に分析され、情報性
配列変化が同定され得る。
【0032】 上記方法は、好ましくはゲノムの一部または全部を代表するゲノムDNAによ
り行なわれる。ゲノムサブセットは、限定されるわけではないが、例えばインタ
ーAlu−PCRといった技術による選択的増幅を含むか、または分析を予め画
定されたサイズ範囲内にある制限酵素消化により製造されたフラグメントに制限
する当業界の専門家には公知である若干の方法の一つにより分析用に生成され得
る。分析されるゲノムのフラクションは、興味の対象である組織における発現に
基いて選択され得る。この場合、mRNAは、まず上記と同様分析前に慣用的方
法を用いてcDNAに変換され得る。別法として、RNAは、上記要領で分析に
かけられ得る。
【0033】 クローニングおよび配列決定は、これらの方法の最後に残る配列を分析するた
めの好ましい方法である。しかしながら、またゲノムDNA、cDNAまたはそ
のオリゴヌクレオチド呈示量を含む核酸のレファレンス配列へのハイブリダイゼ
ーションによりこの分析を遂行することも可能である。例としては、BACまた
はcDNAクローン、オリゴヌクレオチドまたは染色体を含む核酸配列のアレイ
へのハイブリダイゼーションがある(Boyleら(1990)Genomics 7:127
−130、Lichterら(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6634−6
638、Schenaら(1995)Science 270:467−470、Lockhartら(
1996)Nature Biotechnology 14:1675−1680参照)。
【0034】 参考となるものが添付図面に示されており、図1は、「共通の祖先をもつ2個
体における同祖(IBD)フラグメントの濃厚化」と題される、公知GMSシス
テムの図である。
【0035】 図2〜5の各々は、ここに記載されている異なるゲノム分析方法の図である。
図2および3の各々は「共通の祖先をもつ2個体におけるフラグメントIBDの
濃厚化」と題される。
【0036】 図4は、「共通の祖先をもつ個体のプールされたゲノムにおけるフラグメント
IBDの濃厚化」と題される。
【0037】 図5は、「疾病および野生型個体のプールされた核酸を用いた情報性フラグメ
ントの消去的濃厚化」と題される。 図6は、実施例3で使用されるシステムの図である。 図7は、実施例4で使用されるシステムの図である。
【0038】 下記実験の項において、実施例1および2は、本発明による4オリゴヌクレオ
チドの異なるセットの製法および特性検定を示す。実施例3および4は、アダプ
ターとしてそれらのオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて遂行された、本発
明によるゲノム分析方法に関するものである。
【0039】 (実験データ) 実施例1 4種のオリゴヌクレオチドを合成して[ジェノシス・バイオテクノロジーズ(
ヨーロッパ)リミテッド]、PstI消化DNAへ連結させ、ヌクレアーゼ消化
によりホモハイブリッド分子を選択的に排除させると、ヘテロハイブリッド二本
鎖DNAは無傷のままであった。適当な場合、燐酸化(ホスフェート−)および
ホスホロチオエート連鎖(複数も可)は、各オリゴヌクレオチドの合成に含まれ
た。配列は次の通りであった。
【化1】
【0040】 オリゴA+DおよびオリゴB+Cは相補的であり、オリゴA+Bおよびオリゴ
C+Dは部分的にのみ相補的である。
【0041】 オリゴA+Bをアニーリングし、PstI消化DNAに連結させた場合、各フ
ラグメント端部にミスマッチアダプターが形成される。同様に、オリゴC+Dを
アニーリングした場合、ミスマッチアダプターはPstI消化DNAの別の供給
源へ連結され得る。従って、消化され特異的に連結されたDNAの2種供給源を
ハイブリダイゼーションすることにより、ミスマッチアダプター配列を有するホ
モ二本鎖分子およびアダプターがミスマッチ不含有であるヘテロ二本鎖が得られ
た。後続のヌクレアーゼ消化によりホモ二本鎖DNAが選択的に排除され、ヘテ
ロ二本鎖分子はそれらのホスホロチオエート保護性を保持し、無傷のままであっ
た。
【0042】 ヌクレアーゼ消化に対するマッチおよびミスマッチアダプターの作用を調べる
ため、PstI[アマーシャム・ファーマシア・バイオテク]を用いてプラスミ
ドDNAを完全に消化し、微小濃縮(マイクロコン−30:アミコン)した。オ
リゴA+BまたはオリゴA+Dを当モル量で合わせ、1×T4 DNAリガーゼ
緩衝液[アマーシャム・ファーマシア・バイオテク]で1時間50℃〜10℃の
温度範囲でそれらをインキュベーションすることによりアダプターを製造した。
50倍モル過剰のアダプターにより、PstI消化DNAを、T4 DNAリガ
ーゼの存在下16℃での一夜インキュベーションにより各アダプター型に連結さ
せた。どの場合も、アダプター連結プラスミドDNAを、ヌクレアーゼ消化前に
ゲル精製[キアクイック・ゲル抽出キット:キアゲン]した。35ng/μlの濃
度で、2つのゲル精製DNAを各々様々な反応条件下Bal31ヌクレアーゼ[
アマーシャム・ファーマシア・バイオテク]消化にかけた。0.2単位/μlのB
al31ヌクレアーゼの存在下20℃で40分間インキュベーションすると、ミ
スマッチアダプターに連結されたDNAが消化され、ミスマッチ不含有アダプタ
ーに連結されたものはヌクレアーゼ攻撃に対して抵抗を示すことが判った。従っ
て、適当に設計されたアダプターを用いると、ヘテロ二本鎖DNAを含む混合物
からホモ二本鎖分子を選択的に排除することが可能であるという結論に達した。
【0043】 実施例2 メチルホスホネート連鎖の存在により付与されたヌクレアーゼ抵抗性および非
ミスマッチアダプターを担うフラグメント選択におけるそれらの有用性の立証。 エキソヌクレアーゼIIIおよびS1は、線状DNAフラグメントを消化する。
下記の実験を行うことにより、メチルホスホネート修飾アダプターによるDNA
において付与された酵素消化からの保護性を立証した。これおよび後続実施例に
おける試薬は全て、特記しない場合アマーシャム・ファーマシア・バイオテクか
ら購入された。
【0044】 プライマーIおよびプライマーJ(ジェノシスから入手)を用いることにより
、プラスミドpT3/T7へクローン化しておいた、129bpイヌゲノムDNA
フラグメント、31Aを増幅した。これらのプライマーはまた、挿入体の両側に
隣接するプラスミド配列の短い伸長部を増幅した。PCR増幅は、最終体積10
0μl中IおよびJの各プライマー100ピコモル、1.5ミリモルのMgCl 、0.2ミリモルのdNTP、2.5単位のTaqポリメラーゼおよび1×Taq
反応緩衝液の存在下で行なわれた。33P−dATPをPCR反応に含ませるこ
とにより、増幅産物を内部放射性標識した。185bpの生成した増幅フラグメン
トを、GFX−PCR精製キットにより精製し、DNAの量を、ヴィストラ・グ
リーン(商標)染色を用いて1%アガロースゲルで定量した。
【0045】 プライマーIおよびJ(ジェノシス)は次の通りであった:
【化2】
【化3】
【0046】 TaqポリメラーゼによるPCR増幅の結果、増幅分子の3'末端に余分のA
−残基が付加される。この特性を利用することにより、アダプターKLおよびK
Mを目的として増幅フラグメント31Aに相補末端を作製した。アダプターKL
はオリゴヌクレオチドKおよびLを一緒にアニーリングすることにより形成され
るもので、これらは一端が部分相補的であるため連結が行われ得るが、他端がミ
スマッチであり、一緒にアニーリングされると「Y」形状構造を形成する。互い
に完全に相補的であるオリゴヌクレオチドKおよびMをアニーリングすると、非
ミスマッチアダプターKMが得られる。両アダプターには、Taq増幅DNAフ
ラグメントに相補的である1bpオーバーハングが存在する。
【0047】 オリゴヌクレオチドK、LおよびM(インテラクティバ・ビオテクノロギーG
mBH)は次の通りであった:
【化4】 (ただし、5はdA−メチルホスホネートを表し、 6はdG−メチルホスホネートを表し、 7はdC−メチルホスホネートを表し、 8はdT−メチルホスホネートを表す。)
【0048】 20倍モル過剰のアダプターKLおよびKMを別々に64ngのPCR増幅フラ
グメント31Aにより連結した。これらの反応は、37℃で2時間体積10μl
中1×リガーゼ緩衝液および1単位のT4リガーゼの存在下で行なわれた。
【0049】 6%変性ポリアクリルアミドゲルで連結反応物1μlアリコートを分析するこ
とにより、連結反応の成果を証明した。ゲルを10%酢酸に固定し、乾燥し、燐
光体スクリーンに暴露した。非連結フラグメント31Aの場合と比較すると、両
連結反応の結果、56bpのサイズ増加に相当するさらに高い分子量、すなわち2
種のアダプターを合わせた長さを有するフラグメントが出現した。これにより、
31Aフラグメントが両端においてアダプターに有効に連結されることが確認さ
れた。
【0050】 KLおよびKMの両アダプターは、連結事象には関与しない3'末端に3つの
メチルホスホネート連鎖を有する。これらの連鎖がエキソヌクレアーゼIIIおよ
びS1ヌクレアーゼによる消化から保護する能力を次の要領で分析した。フラグ
メント31Aを、ミスマッチ含有Y形状アダプターKL、非ミスマッチ含有アダ
プターKMに連結し、またはアダプター不含有のものを、独立して37℃で60
分間、10μlの最終体積で50ミリモルのトリス−HCl(pH7.5)、20
ミリモルのMgClおよび50ミリモルのNaClを含む緩衝液中10単位の
エキソヌクレアーゼIIIおよび25単位のS1ヌクレアーゼとインキュベーショ
ンした。20ミリモルEDTA、95%ホルムアミド、0.01%ブロモフェノ
ールブルーおよび0.01%キシレンシアノールを含む停止溶液4μlを加えるこ
とにより、反応を停止させた。7μlのアリコートを6%変性PAGEゲルにお
いて分析した。ゲルを10%酢酸に固定し、乾燥し、燐光体スクリーンに暴露し
た。
【0051】 これらの結果は、両端がアダプターKMと連結された31Aフラグメントが唯
一消化に耐え得るものであることを示していた。この結果は、DNAフラグメン
トが、3'メチルホスホネート連鎖を含むアダプターに連結されることにより、
エキソヌクレアーゼIIIおよびS1ヌクレアーゼ消化から保護され得ることを立
証している。
【0052】 類似した戦略を別々に用いて、アダプターの5'末端にメチルホスホネート連
鎖を含むことにより、DNAフラグメントがT7遺伝子6−産物による消化から
保護され得ることを立証した。
【0053】 実施例3(図6)および実施例4(図7)で使用されるモデルシステム。 DNAフラグメントを使用することにより、2集団のDNA(実施例3)また
は一プールのDNA(実施例4)からのミスマッチを含むフラグメントに対する
共通フラグメントの濃厚化を立証した。フラグメントを、ヒトゲノムDNAまた
はエシェリキア・コリ(E.coli)ゲノムDNAのバックグラウンドへスパイクし
た。スパイクの使用により、同じ生物体からの2種の異なるゲノムを比較する場
合に必要とされる広範な遺伝子型分類が回避され、さらにまた実験分析が簡易化
された。下記実施例では、DNA二本鎖における単一塩基ミスマッチの認識を利
用した。
【0054】 使用されるフラグメントは次の通りであった(配列は付録1に示されている)
: 1.ラムダから切除された1700bpのPstIフラグメント。 2.プラスミドpSD1からPCRにより増幅された1000bpフラグメント。
3.プラスミドpES3からPCRにより増幅された1000bpフラグメント、
ただし、pSD1およびpES3は、フラグメントの5'末端から200塩基の
、GからCへの単一塩基変化のみが異なっていた。 4.プラスミドpES4からのPCRにより増幅された1000bpフラグメント
、ただしES4は、フラグメントの5'末端からの単一塩基欠失200塩基がS
D1およびES3とは異なっていた。 5.プラスミドpES1からのPCRにより増幅された1000bpフラグメント
、ただしES1は、フラグメントの5'末端からのGからAへ200塩基の単一
塩基変化がSD1と異なっていた。
【0055】 下記オリゴヌクレオチドを用いて、アダプターを製造した:
【化5】 (ただし、5はdA−メチルホスホネートを表し、 6はdG−メチルホスホネートを表し、 7はdC−メチルホスホネートを表し、 8はdT−メチルホスホネートを表す)
【0056】 実施例3では、次の要領でアダプターを2種の異なるDNA試料へ連結した: 試料1:当モル量のフラグメントSD1およびラムダ1700を、一端は相補
的であるため連結され得るが他端がミスマッチであるオリゴヌクレオチドEおよ
びFを含むアダプターに連結した。アダプターはまた、メチルホスホネート連鎖
領域を含んでいた。
【0057】 試料2:当モル量のフラグメントES3およびラムダ1700を、一端は相補
的であるため連結され得るが他端がミスマッチであるオリゴヌクレオチドGおよ
びHを含むアダプターに連結した。アダプターはまた、メチルホスホネート連鎖
領域を含んでいた。
【0058】 配列EおよびFは、HおよびGとそれぞれ完全に相補的であった。試料1およ
び2を合わせ、変成させ、再アニーリングさせると、下記のものを含む異なる二
本鎖の混合物が予測された:すなわち、 1.ラムダまたはSD1のマッチしたホモ二本鎖、末端ミスマッチを含むアダプ
ターを伴い、試料1からのフラグメントの再会合時に形成された。 2.ラムダまたはES3のホモ二本鎖から成る混合物、末端ミスマッチを含むア
ダプターを伴い、試料2からのフラグメントの再会合時に形成された。 3.単一塩基ミスマッチを含むが、完全マッチしたアダプターを伴うES3およ
びSD1フラグメントのヘテロハイブリッド。 4.相補鎖が、試料1および2から互いに再アニーリングする時に形成されたマ
ッチしたアダプターを伴うラムダのホモ二本鎖。これらの分子におけるアダプタ
ーもまた完全に相補的であった。
【0059】 混合物全体を、1個またはそれ以上の塩基のミスマッチにおいてDNAの一方
または両方の鎖を開裂するT4エンドヌクレアーゼVIIで消化した。さらにまた
、それは、末端ミスマッチアダプターの一方の鎖を開裂する。後続のエキソヌク
レアーゼIIIおよびS1ヌクレアーゼ消化は、T4エンドヌクレアーゼVIIにより
開裂される二本鎖であれば全て消化する。エキソヌクレアーゼIIIは、実施例2
で示されている通り、メチルホスホネート含有ヌクレオチドをもつDNAを消化
できない3'−5'エキソヌクレアーゼである。S1は、一本鎖DNAを特異的に
消化するエンドヌクレアーゼである。このようにして、T4エンドヌクレアーゼ
VIIにより開裂されなかったDNAは、各二本鎖の3'末端にメチルホスホネート
ヌクレオチドが存在するためエキソヌクレアーゼIIIおよびS1ヌクレアーゼに
よる消化から保護される。消化段階後、残りのDNAはアダプター特異的プライ
マーを用いて増幅され得る。
【0060】 実施例4において、フラグメントSD1、ES1、ES3、ES4およびラム
ダ1700を合わせ、オリゴヌクレオチドEおよびHを合わせることにより形成
されるアダプターをそれらに連結した。こうして、フラグメントの端部は全て、
マッチしたメチルホスホネート含有アダプターにより保護された。混合物を変性
させ、ハイブリダイズさせた。完全にマッチしたアダプターを伴うラムダ、SD
1、ES1、ES3またはES4のマッチしたホモ二本鎖の混合物が、フラグメ
ントの再会合時に予測された。さらに、完全にマッチしたアダプターを伴うミス
マッチ二本鎖は次のように予測された: ES1を伴うSD1 ES3を伴うES1 ES3を伴うSD1 ES4を伴うES1 ES4を伴うSD1 ES4を伴うES3
【0061】 上記実施例3の場合と同様にして混合物をミスマッチ開裂にかけた。ラムダ1
700フラグメントは、消化に抵抗を示すことが予測され、ミスマッチを形成す
るフラグメントのいくつかは削除されることが予測された。
【0062】 消化後産物を増幅し、変性、ハイブリダイゼーション、消化および増幅のさら
なるラウンドにかけた。ラムダ1700フラグメントの量は、これらの段階を各
連続ラウンド反復するにつれて、SD1/ES1/ES3/ES4フラグメント
に対してますます濃厚化されることが予測された。
【0063】 実施例3 方法 サザーンブロットハイブリダイゼーション分析 この方法の各段階で除去されたDNA試料を、ヴィストラ・グリーン(商標)
で染色したアガロースゲルで分析し、フルアイメージャー595を用いて調べた
。次いで、ゲルからのDNAを、製造業者により提供された使用説明書に従いハ
イボンド−N+ナイロン(アマーシャム・ファーマシア・バイオテク)膜に転移さ
せ、ES3にハイブリダイズする放射性標識SD1プローブによりプローブした
。次いで、膜を剥がし、SD1プローブと類似した比活性を有するラムダ170
0プローブでプローブした。
【0064】 連結反応 ラムダ1700フラグメントおよびフラグメントSD1を当モル量で混合し、
オリゴヌクレオチドEおよびFから成るアダプターをフラグメントに連結させた
。反応は、3.2ミリモルの各オリゴヌクレオチドおよび1×T4リガーゼ緩衝
液により構成された。反応におけるフラグメントの濃度は100ng/μlであっ
た。同様に、ラムダ1700およびES3フラグメント当モル量で混合した。オ
リゴヌクレオチドGおよびHを含むアダプターを、4ミリモルの各オリゴヌクレ
オチド、1×T4リガーゼ緩衝液との反応においてフラグメントの混合物に連結
した。反応におけるフラグメントの濃度は120ng/μlであった。平行して、
オリゴヌクレオチドEおよびFまたはGおよびHを含むアダプターを、各々独立
して予めPstIにより切断しておいたヒトゲノムDNA(67ng/μl)に連
結した。これらの反応物は、6.7ミリモルの各オリゴヌクレオチド、1×T4
リガーゼ緩衝液を含んでいた。反応をリガーゼ無しで誘発し、65℃でインキュ
ベーションし、ゆっくりと40℃に放冷した。T4 DNAリガーゼを各反応に
加えて0.1単位/μlの最終濃度とし、反応物を37℃で一夜インキュベーショ
ンした。マイクロスピンS−400カラムを用いて未連結アダプターを除去した
。フラグメントの100%回収が仮定された。
【0065】 フラグメントの変性およびハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーション反応を誘発したところ、上記と同様100%回収を想
定すると、それらは、0.15ピコモルの各ラムダ1700bpおよびSD1フラ
グメントおよびアダプターEFに連結されたヒトゲノムDNA500ngを、0.
15ピコモルの各ラムダ1700bpおよびES3フラグメントおよびアダプター
GHに連結したヒトゲノムDNA500ngと一緒に含んでいた。
【0066】 水を加えて各試料の体積を45μlとし、各管に1.2μlの10%(v/v)
トウィーン−20(ピアス)、58μlの2×ハイブリダイゼーション緩衝液(
2.4モルのチオシアン酸ナトリウム(シグマ)、0.2モルのホスフェート p
H7.4、4ミリモルのEDTA、pH8.0)および11.5μlの90%(v/
v)フェノール(シグマ)を加えた。試料を混合すると、溶液が少し不透明に見
えた。
【0067】 試料を75℃に予熱しておいたブロックに置き、2分間インキュベーションし
た。次いで、管を混合すると、均一な溶液が得られた。試料を次の要領で循環さ
せた。すなわち95℃で2分間の後、22℃で15分間および65℃で2分間の
70サイクルで循環させた。循環後、反応物を、400μlの0.1%トウィーン
20水溶液を含む1.5ml管に移した。0.5mlフェノール/クロロホルム/IA
A(シグマ)を加え、試料に渦を巻かせ、卓上用微細遠心機において12000
rpmで5分間遠心分離にかけた。水相を新しい管に移し、1倍体積のクロロホル
ムで洗浄した。次いで、試料を5分間12000rpmの遠心分離にかけ、水相を
新しい管に移した。1μlの1mg/mlグリコーゲン、40μlの3モル酢酸ナトリ
ウムpH5.2および0.7倍体積のイソプロパノール(オールドリッチ)を加え
、混合した。試料を室温で30分間インキュベーションした後、室温で10分間
12000rpmの遠心分離にかけた。次いで、ペレットを70%氷冷エタノール
で洗浄した。12000rpmで5分間回転後、エタノールを廃棄し、ペレットを
風乾した。各ペレットを48μlの1×Taqポリメラーゼ緩衝液に再懸濁した
。5μlアリコートを分析用に除去した。
【0068】 T4エンドヌクレアーゼVII消化 製造業者の使用説明書の従い、37℃で15分間1000単位の酵素により最
終体積50μl中でT4エンドヌクレアーゼVII消化を行った。 この消化後、800bpの追加バンドが検出された。これは、ミスマッチ部位に
おけるES3/SD1ヘテロ二本鎖の開裂から予測される大きい方の特異的開裂
産物のサイズに相当する。
【0069】 エキソヌクレアーゼIII消化 各反応を行うため、250ミリモルのNaCl 4μl、0.1モルのトリス−
HCl pH8.0および0.5モルのMgClを含む1.6μlの緩衝液、1.2
μlの水および1.3μlのエキソヌクレアーゼIII(250単位)を加え、37℃
で10分間インキュベーションすることにより、エキソヌクレアーゼIII消化を
行った。消化後、15μlのアリコートを分析用に除去した。
【0070】 エキソヌクレアーゼIII段階後にDNAのかなりの喪失があり、ES3/SD
1フラグメントおよびラムダ1700フラグメントは両方ともある程度まで消化
されたと思われた。しかしながら、ラムダ1700バンドは、SD1およびラム
ダプローブでプローブしたアガロースゲルのブロットにおいて依然として容易に
見出され得たが、SD1/ES3バンドは検出されなかった。
【0071】 S1ヌクレアーゼ消化 最終消化段階のため、1.2μlのS1ヌクレアーゼ(16単位)をエキソヌク
レアーゼIII消化試料に加え、反応物を37℃で15分間インキュベーションし
た。
【0072】 しかしながら、S1ヌクレアーゼ段階後、ラムダ1700およびSD1プロー
ブでプローブしたゲルのブロットにおけるアガロースゲルからDNAを検出する
ことは困難であり、明確で強いラムダ1700バンドは存在したが、SD1/E
S3フラグメントは全く検出されなかった。従って、予測される結果、すなわち
同一フラグメントの保存と同時にミスマッチフラグメントの消化が立証された。
最終産物はまた、プライマーとしてオリゴヌクレオチドGを用いたPCRにより
増幅され得た。
【0073】 上記実施例はまた、エシェリキア・コリ(E.coli)DNAのバックグラウンド
を用いて行なわれ、結果は同じであった。すなわち、ラムダ1700フラグメン
トは保持され、1000bpフラグメントは実験の最後にはもはや検出されない。
【0074】 実施例3の結果を表1において表にまとめた形態で要約する。 表1.実施例3に関する結果の要約:
【表1】
【0075】 +は、記載されたフラグメントが、実施例3の最終産物のサザーンブロットで
検出され得ることを示す。検出に使用されるプローブは、フラグメント、すなわ
ち1000bpフラグメント(ES3およびSD1)またはラムダ1700フラグ
メントに特異的であった。
【0076】 −は、興味の対象であるフラグメントが、実施例3の最終産物のサザーンブロ
ットで検出され得ないことを示す。検出に使用されるプローブは、フラグメント
、すなわち1000bpフラグメント(ES3およびSD1)またはラムダ170
0フラグメントに特異的であった。
【0077】 実施例4 方法 フラグメントの生成 SD1、ES1、ES2、ES3およびES4 PCR 1000bpフラグメン
トおよびラムダ1700bpフラグメントを、本質的には実施例3記載の要領で1
00倍過剰のオリゴヌクレオチドを用いてオリゴヌクレオチドEおよびHを含む
アダプターに連結した。連結したフラグメント各々約0.5ngを、200マイク
ロモルのdNTPおよび5単位のTaqポリメラーゼおよび1×Taqポリメラ
ーゼ反応緩衝液を含む100μl反応液中プライマーとして20ピコモルのオリ
ゴヌクレオチドEを用いたPCRにより増幅した。94℃で3分間の初回変性段
階後、25サイクルの増幅を次のように、すなわち30秒間94℃、2分間72
℃で遂行した。反応物をGFXカラムで精製し、生成物をピコグリーン(モレキ
ュラー・プローブ)を用いて製造業者の使用説明書に従い定量した。
【0078】 フラグメントの変性およびハイブリダイゼーション 上記5種の1000bpPCR産物の各々当モル量のプールを製造した。次いで
、このプールの25ngアリコートを当モル量のラムダPCR産物と混合した。1
×Taqポリメラーゼ反応緩衝液30μlの最終体積でこのDNAフラグメント
混合物を、95℃で5分間変性させ、4分間4℃に冷却した後、MJリサーチ温
度循環装置(サーマル・サイクラー)中65℃で30分間ハイブリダイゼーショ
ンした。ハイブリダイゼーション後、1×Taqポリメラーゼ反応緩衝液の追加
の20μlを各管に加えた。2μlアリコートを分析用に除去した。
【0079】 T4エンドヌクレアーゼVII消化 残りのハイブリダイゼーション反応物に、2μg/μlのPstI消化エシェリ
キア・コリ(E.coli)DNA1μlを補い、製造業者の使用説明書に従って、3
7℃で15分間58μlの最終体積中2000単位のT4エンドヌクレアーゼVII
により消化した。5.8μl試料を分析用に各反応物から除去した。
【0080】 エキソヌクレアーゼ消化 125ミリモルのNaCl、50ミリモルのトリス(pH8)、15ミリモル
のMgCl、12.5単位/μlのT7遺伝子6エキソヌクレアーゼを含む酵素混
合物の8μlアリコートを、各T4エンドヌクレアーゼVII消化物の残量に加えた
。次いで、反応物を混合し、37℃で10分間インキュベーションした。13.
2μlアリコートを分析用に各反応物から除去した。
【0081】 S1ヌクレアーゼ消化 各反応物の残量に、1.2μlのS1ヌクレアーゼ(16単位)を加えた。次い
で、反応物を37℃で15分間インキュベーションし、5μlの0.5モルEDT
A(pH8.0)を加えることにより終結させた。15.1μlアリコートを後の
分析用に保持した。
【0082】 各酵素段階後に除去した試料を、ES2の1000bpフラグメントおよび17
00bpラムダフラグメントの系列希釈液と一緒に1%アガロースゲルにかけた。
ゲルを15分間ヴィストラグリーン(1:10000)で後染色し、フルアイメ
ージャー595で分析した。
【0083】 第2ラウンドのハイブリダイゼーションおよび酵素消化のためのPCR増幅 上記の第1ラウンドのハイブリダイゼーションおよび酵素消化から生じた生成
物のデュプリケイト管を合わせ、製造業者の使用説明書に従いGFXカラムで精
製した。試料を100μlの水で溶離し、次いで、この溶離液の20μlアリコー
トを、1×Taqポリメラーゼ反応緩衝液中プライマーとして20ピコモルのオ
リゴヌクレオチドG、200マイクロモルのdNTPおよび5単位のTaqポリ
メラーゼを含む100μlのPCR反応において鋳型として使用した。94℃で
3分間の初回変性段階後、94℃、30秒、72℃2分という条件を用いて20
サイクルの増幅を遂行した。反応物を、1%アガロースゲルにおいて各反応物1
5μlを分離することにより分析し、上記と同様に染色し、視覚化した。
【0084】 第1ラウンドの結果 最初に5種の異なる1000bpフラグメントおよび1700bpラムダフラグメ
ントから成る混合物を含む反応物のハイブリダイゼーションおよび酵素消化の第
1ラウンド後、ラムダフラグメントに相当する1700bp生成物がはっきりと見
られた。また、微かな1000bpバンドは、ES1/ES2/ES3/ES4/
SD1フラグメントに対応するアガロースゲルにおいて検出可能なだけであった
。ES1のみを含む対照反応では、1000bpの明確なバンドが観察された。こ
れらの結果は、1ラウンドのハイブリダイゼーションおよび酵素ミスマッチ開裂
後に、ミスマッチ含有二本鎖を形成し得る1000bpフラグメントが、完全にマ
ッチした二本鎖しか形成し得ないラムダフラグメントに対して消耗されることを
立証していた。
【0085】 ハイブリダイゼーションおよびミスマッチ消化の第2ラウンド 第1ラウンドのハイブリダイゼーションおよび酵素消化に耐えた増幅材料を、
本質的には上記と同様の第2ラウンドにかけた。しかしながら、第2ラウンドで
は、100単位ではなく80単位のT7遺伝子6エキソヌクレアーゼを各反応に
加えた。S1ヌクレアーゼ消化後、この方法の第2ラウンドの生成物をGFXカ
ラムで精製し、100μlの水で溶離した。次いで、40μlアリコートを上記と
同様にPCR増幅用鋳型として使用した。
【0086】 第2ラウンドの結果 第2ラウンドのハイブリダイゼーションおよび酵素消化後、1700bpラムダ
フラグメントに相当するバンドが、アガロースゲル電気泳動後にはっきりと見ら
れた。反対に、1000bpのES1/ES2/ES3/ES4/SD1フラグメ
ントに対応する非常に微かなバンドはほとんど検出され得なかった。対照反応(
ES1 1000bpのみの出発集団)では、明確な1000bpバンドが増幅後に
検出された。
【0087】 ハイブリダイゼーションおよび酵素消化の第1および第2ラウンドの最終産物
に対応するアガロースゲルバンドの定量により、全1000bpフラグメントに対
する1700bpラムダフラグメントの割合は、第1ラウンドと比べて第2ラウン
ドの最後にさらなる濃厚化を示すことが立証された。
【0088】 (付録1)
【化6】
【化7】
【化8】
【0089】 他のプラスミドの配列は、上記配列において、太字で配列の残りより大きいフ
ォントサイズで示された6塩基「GATATC」の連続配列でのみ変化する。こ
れらの変異型は次の通りである: SD1 GATATC ES1 AATATC ES3 CATATC ES4 −ATATC
【0090】 全プラスミドからのPstI部位を含む端部をもつ1000bpフラグメントの
増幅に使用されるプライマーの配列は、次の通りであった。プラスミドにおける
それらの位置には下線が付されている:
【化9】 PCR後、生成物をPstIで消化した。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、「共通の祖先をもつ2個体における同祖(IBD)フラ
グメントの濃厚化」と題される、公知GMSシステムの図である。
【図2】 図2は「共通の祖先をもつ2個体におけるフラグメントIBDの
濃厚化」と題される、ここに記載されている異なるゲノム分析方法の図である。
【図3】 図3は「共通の祖先をもつ2個体におけるフラグメントIBDの
濃厚化」と題される、ここに記載されている異なるゲノム分析方法の図である。
【図4】 図4は、「共通の祖先をもつ個体のプールされたゲノムにおける
フラグメントIBDの濃厚化」と題される、ここに記載されている異なるゲノム
分析方法の図である。
【図5】 「疾病および野生型個体のプールされた核酸を用いた情報性フラ
グメントの消去的濃厚化」と題される、ここに記載されている異なるゲノム分析
方法の図である。
【図6】 図6は、実施例3で使用されるシステムの図である。
【図7】 図7は、実施例4で使用されるシステムの図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW ),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU, TJ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ, BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,C R,CU,CZ,DE,DK,DM,EE,ES,FI ,GB,GD,GE,GH,GM,HR,HU,ID, IL,IN,IS,JP,KE,KG,KP,KR,K Z,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MA ,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ, PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,S K,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG ,US,UZ,VN,YU,ZA,ZW (72)発明者 ラジェシュ・ムル・オデドラ イギリス、エスジー2・7イーアール、ハ ートフォードシャー、スティーブンエイ ジ、ゴダード・エンド21番 Fターム(参考) 2G045 AA35 AA40 DA13 FB01 FB02 FB07 JA01 4B024 AA11 AA20 CA03 HA12 4B063 QA13 QQ43 QR08 QR32 QR42 QR56 QS25 QS34 QX07 【要約の続き】

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 a)2種の異なる供給源から比較されるべきゲノムDNAを消化することによ
    り、平均長が天然多型間の平均スペーシングよりも大きいゲノムフラグメントを
    提供し、 b)ハイブリダイゼーション条件下、2種の供給源からのゲノムフラグメント
    の1本鎖を合わせ、 c)ホモハイブリッドからヘテロハイブリッドを分離し、そして d)ミスマッチをもつハイブリッドからミスマッチ不含有ヘテロハイブリッド
    を分離すること によるゲノム分析遂行方法であって、アダプターを段階a)で製造された各ゲノ
    ムフラグメントの各端へ連結することを含み、上記アダプターが2本鎖ミスマッ
    チ不含有形態においてヌクレアーゼ消化に抵抗性を示す、方法。
  2. 【請求項2】 アダプターが、ヌクレアーゼ抵抗性である、ホスホロチオエ
    ートおよびメチルホスホネートから選択される、1個またはそれ以上のホスホジ
    エステル結合を含む、請求項1記載の方法。
  3. 【請求項3】 ホモハイブリッドのアダプターが少なくとも1個のミスマッ
    チを含み、ヘテロハイブリッドのアダプターが完全にマッチしている、請求項1
    または請求項2記載の方法。
  4. 【請求項4】 段階c)およびd)が、ミスマッチ認識タンパク質およびエ
    キソヌクレアーゼ/エンドヌクレアーゼの組み合わせを用いて行なわれる、請求
    項1〜3のいずれかに記載の方法。
  5. 【請求項5】 i)表現型を共有する複数の個体からプールされたゲノムDNAを用意し、 ii)ゲノムDNAを消化することにより、平均長が天然多型間の平均スペー
    シングよりも大きいゲノムフラグメントを提供し、 iii)アダプターを段階ii)で製造された各ゲノムフラグメントの各端に
    連結させ、ここでアダプターが2本鎖ミスマッチ不含有形態であるときは、ヌク
    レアーゼ消化に抵抗性を示すものとし、 iv)段階iii)で製造されたアダプター終結ゲノムフラグメントの混合物
    を変性および再アニーリングし、 v)段階iv)で製造された混合物からミスマッチを含むハイブリッドを除去
    し、そして必要ならばミスマッチ不含有ハイブリッドを増幅し、 vi)そして段階iv)およびv)を反復することにより、表現型に付随する
    1個または数個のミスマッチ不含有ハイブリッドを回収すること によるゲノム分析遂行方法。
  6. 【請求項6】 段階vi)で回収された1個または数個のミスマッチ不含有ハ
    イブリッドが、核酸のレファレンス配列へのハイブリダイゼーションにより分析
    される、請求項5記載の方法。
  7. 【請求項7】 段階vi)から生じるミスマッチ不含有ハイブリッドが配列
    決定される、請求項5記載の方法。
  8. 【請求項8】 i)表現型を共有する複数の個体からプールされた第1核酸を用意し、 ii)第1核酸を消化することにより、平均長が天然多型間の平均スペーシン
    グとほぼ同じかまたはそれより短いフラグメントを提供し、 iii)段階ii)で製造された各フラグメントの各端へアダプターを連結さ
    せることにより、アダプター終結核酸フラグメントを形成し、ここでこれらが2
    本鎖ミスマッチ不含有形態であるときは、ヌクレアーゼ消化に対する抵抗性を示
    すものとし、 iv)段階iii)で製造されたアダプター終結核酸フラグメントの混合物を
    変性および再アニーリングし、 v)段階iv)で製造された混合物からミスマッチを含むハイブリッドを除去
    し、そして必要ならばミスマッチ不含有ハイブリッドを増幅し、 vi)段階iv)およびv)を反復することにより、ミスマッチ不含有ハイブ
    リッドの第1混合物を回収し、 vii)同じ表現型を共有しない複数の個体からプールされた第2核酸を用意
    し、 viii)vii)の核酸を段階ii)〜vi)に付すことにより、ミスマッ
    チ不含有ハイブリッドの第2混合物を回収し、 ix)ハイブリダイゼーション条件下、ミスマッチ不含有ハイブリッドから成
    る第1混合物およびミスマッチ不含有ハイブリッドから成る第2混合物の1本鎖
    を合わせ、 x)そしてミスマッチ不含有ハイブリッドを形成せず、表現型に付随する核酸
    フラグメントを回収すること によるゲノム分析遂行方法。
  9. 【請求項9】 段階x)で採取された核酸フラグメントが、核酸のレファレ
    ンス配列へのハイブリダイゼーションにより分析される、請求項8記載の方法。
  10. 【請求項10】 段階x)で採取された核酸フラグメントが配列決定される
    、請求項8記載の方法。
  11. 【請求項11】 核酸がゲノムDNAである、請求項8〜10のいずれかに
    記載の方法。
  12. 【請求項12】 核酸が、興味の対象である一組織または複数の組織で転写
    されるゲノムのサブセットを表す、請求項8〜10のいずれかに記載の方法。
  13. 【請求項13】 段階x)が、少なくとも1個のミスマッチ特異的タンパク
    質への結合後、ミスマッチフラグメントの物理的分離により遂行される、請求項
    8〜12のいずれかに記載の方法。
  14. 【請求項14】 アダプターが、ヌクレアーゼ抵抗性を示す、ホスホロチオ
    エートおよびメチルホスホネートから選択される、ホスホジエステル結合を含む
    、請求項5〜13のいずれかに記載の方法。
  15. 【請求項15】 段階v)において、ミスマッチ含有ハイブリッドがミスマ
    ッチ認識タンパク質およびエキソヌクレアーゼ/エンドヌクレアーゼの組み合わ
    せ手段により除去される、請求項5〜14のいずれかに記載の方法。
  16. 【請求項16】 4オリゴヌクレオチドから成るセットであって、セット中
    の各オリゴヌクレオチドがセット中の第1の他のオリゴヌクレオチドに相補的で
    あって、それと共にヌクレアーゼ消化に抵抗性を示すハイブリッドを形成し、そ
    してセット中の第2の他のオリゴヌクレオチドと実質的に相補的であるセット。
  17. 【請求項17】 各オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートおよびメチ
    ルホスホネートから選択される1個またはそれ以上のホスホジエステル結合を含
    む、請求項16記載のセット。
  18. 【請求項18】 キットが請求項16または請求項17記載の4オリゴヌク
    レオチドから成るセットをリガーゼおよびヌクレアーゼと一緒に含む、請求項1
    〜4のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。
  19. 【請求項19】 キットが、2本鎖形態であるときヌクレアーゼ消化に抵抗
    性を示すアダプター、およびリガーゼおよびヌクレアーゼの供給を含む、請求項
    5〜15のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。
  20. 【請求項20】 アダプターが、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネ
    ートから選択される1個またはそれ以上のホスホジエステル結合を含む、請求項
    19記載のキット。
  21. 【請求項21】 またミスマッチ認識タンパク質も存在する、請求項18〜
    20のいずれかに記載のキット。
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000046402A1 (en) * 1999-02-05 2000-08-10 Amersham Pharmacia Biotech Uk Limited Genomic analysis method
DE19911130A1 (de) * 1999-03-12 2000-09-21 Hager Joerg Verfahren zur Identifikation chromosomaler Regionen und Gene
US6524794B1 (en) * 1999-10-29 2003-02-25 Decode Genetics Ehf. Identical-by-descent fragment enrichment
WO2002029095A1 (de) * 2000-10-06 2002-04-11 Axaron Bioscience Ag Verfahren zur mutationsanalyse
GB0108329D0 (en) * 2001-04-03 2001-05-23 Univ Cambridge Tech Method for determining nucleotide mismatches
US7009140B2 (en) 2001-04-18 2006-03-07 Cymer, Inc. Laser thin film poly-silicon annealing optical system
US20160040229A1 (en) * 2013-08-16 2016-02-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
WO2014039556A1 (en) 2012-09-04 2014-03-13 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11913065B2 (en) 2012-09-04 2024-02-27 Guardent Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10876152B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
EP3087204B1 (en) 2013-12-28 2018-02-14 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
EP3390668A4 (en) 2015-12-17 2020-04-01 Guardant Health, Inc. METHODS OF DETERMINING THE NUMBER OF TUMOR GENE COPIES BY ACELLULAR DNA ANALYSIS
WO2017155416A1 (en) * 2016-03-08 2017-09-14 Otago Innovation Limited Genotyping method
CN111254138A (zh) * 2018-12-03 2020-06-09 北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司 一种分子克隆中提高酶切产物浓缩效率的方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5556750A (en) * 1989-05-12 1996-09-17 Duke University Methods and kits for fractionating a population of DNA molecules based on the presence or absence of a base-pair mismatch utilizing mismatch repair systems
US5494810A (en) * 1990-05-03 1996-02-27 Cornell Research Foundation, Inc. Thermostable ligase-mediated DNA amplifications system for the detection of genetic disease
US5376526A (en) * 1992-05-06 1994-12-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Genomic mismatch scanning
US5403709A (en) * 1992-10-06 1995-04-04 Hybridon, Inc. Method for sequencing synthetic oligonucleotides containing non-phosphodiester internucleotide linkages
US5710000A (en) * 1994-09-16 1998-01-20 Affymetrix, Inc. Capturing sequences adjacent to Type-IIs restriction sites for genomic library mapping
AU705257B2 (en) * 1995-06-07 1999-05-20 Genzyme Corporation Methods for the identification of genetic modification of DNA involving DNA sequencing and positional cloning
ATE244771T1 (de) * 1998-07-29 2003-07-15 Keygene Nv Verfahren zur erkennung von nukleinsäuremethylierungen durch aflp
US6287825B1 (en) * 1998-09-18 2001-09-11 Molecular Staging Inc. Methods for reducing the complexity of DNA sequences
WO2000046402A1 (en) * 1999-02-05 2000-08-10 Amersham Pharmacia Biotech Uk Limited Genomic analysis method
DE19911130A1 (de) * 1999-03-12 2000-09-21 Hager Joerg Verfahren zur Identifikation chromosomaler Regionen und Gene

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