DE102006021257A1

DE102006021257A1 - Nachweis von transgener DNA (t DNA)

Info

Publication number: DE102006021257A1
Application number: DE102006021257A
Authority: DE
Inventors: Perikles Dr. Simon
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen; Universitaetsklinikum Tuebingen
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2006-04-28
Publication date: 2007-11-08
Also published as: EP2013361A2; WO2007124861A3; AU2007245903A1; CA2648877A1; WO2007124861A2; AU2007245903B2; US20090208951A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von transgener DNA (tDNA) in einem Lebewesen und einen Kit zur Durchführung eines solchen Verfahrens (Fig. 2).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von transgener DNA (tDNA) in einem Lebewesen und ein Kit zur Durchführung eines solchen Verfahrens.
Bislang kann eine genetische Manipulation an Organismen vor allem dann nachgewiesen werden, wenn eine solche im Sinne einer Veränderung des Genoms der Keimbahn erfolgt, beispielsweise durch eine genetische Manipulation von embryonalen Stammzellen (ESZ) oder von solchen Progenitorzellen eines Gesamtorganismus, die zur Keimbahn gehören. Die Manipulation von Keimbahnzellen hat zur Folge, dass sich in Abhängigkeit von der verwendeten Technik die genetische Modifikation mehr oder weniger ausgeprägt auf jede Nachfolgezelle der Progenitorzelle und somit in der Konsequenz auf jede Zelle des heranwachsenden und adulten Lebewesens erstreckt.
Ein klassischer Anwendungsbereich einer Keimbahnmanipulation ist die Erzeugung so genannter transgener Lebewesen durch genetische Manipulation an ESZ mittels Gentransfers. Das an die ESZ vermittelte Gen bezeichnet man auch als Transgen und die vermittelte DNA als transgene DNA (tDNA). Im klassischen Sinne stammt die tDNA aus einem anderen Organismus als dem Zielorganismus und ist damit als nicht spezieshomologe tDNA zu bezeichnen. In der gängigen gentherapeutischen Terminologie ist die tDNA eine von außen in Zielzellen eines Organismus integrierte DNA, welche auch spezieshomolog sein kann. Das entstehende Lebewesen bezeichnet man als transgenes Lebewesen. Anwendungsbeispiel hierfür ist die Erzeugung einer transgenen „Riesenmaus", welcher die tDNA des Wachstumshormones der Ratte integriert wurde; vgl. Brinster und Palmiter (1986), Introduction of Genes into the Germ Lines of Animals, in Harvey Lectures 80, Seiten 1-38. Diese Maus erreichte hierdurch die doppelte Größe einer normalen Maus. In einem solchen Fall ist der Nachweis einer technisch erfolgreichen genetischen Manipulation einfach, da er sich unmittelbar und uneindeutig im Phänotyp der transgenen Maus äußert, die größer ist als jede andere ihrer Wildtypartgenossen.
Die genetische Manipulation eines Lebewesens kann aber auch so subtile oder lediglich graduelle Veränderungen bewirken, welche keine unmittelbare Unterscheidung zum genetisch nichtmanipulierten Wildtyplebewesen anhand des Phänotyps zulassen. In der Folge wurden diverse Nachweisverfahren entwickelt, die aufzeigen, ob in einem Lebewesen ein erfolgreicher Gentransfer durchgeführt wurde oder nicht. Ein solcher Nachweis erfolgt in aller Regel mittels Genotypisierung des heranwachsenden und adulten Lebewesen. Ein solcher kann anhand von allerlei unterschiedlichem aus oder von dem manipulierten Tier entnommenen Material durchgeführt werden; vgl. Schneider und Wolf (2005), Genotyping of transgenic mice: Old principles and recent developments, Analytical Biochemistry 344, Seiten 1-7, als aktuellste Übersichtsarbeit über die möglichen Verfahren zur Genotypisierung bei transgenen Tieren. Mittels PCR gelingt der Nachweis einer erfolgreichen Manipulation der Keimbahn aus Speichelsekret, Stuhlproben und Haaren, wobei bereits wenige Zellen oder deren Fragmente für einen erfolgreichen Nachweis ausreichen können.
Der Stand der Technik bezüglich eines Nachweises einer genetischen Manipulation der Keimbahn eines Lebewesens und unterscheidet sich allerdings, wie nachfolgend dargelegt, fundamental vom Stand der Technik bezüglich des Nachweises einer genetischen Manipulation genannter Somazellen eines Körpers. Die Somazellen des Körpers sind die Zellen, welche nicht zur Keimbahn gehören und in der Folge auch nicht das endogene Potential besitzen, dass sich aus ihnen ein vollständiges Lebewesen entwickelt. Genetische Manipulationen der Somazellen werden als somatische Gentherapie oder als Gendoping bezeichnet. Von einer somatischen Gentherapie spricht man, wenn tDNA zum Zwecke der Heilung einer Erkrankung in ein Lebewesen eingebracht wird. Von Gendoping spricht man, wenn der im Prinzip auf den gleichen Techniken beruhende Vorgang zum Zweck der Leistungssteigerung eingesetzt wird.
In der somatischen Gentherapie hat sich bislang noch nicht die Notwendigkeit eines Nachweisverfahrens bezüglich der stattgefundenen genetischen Modifikation ergeben. Dies liegt darin begründet, dass 1. Patient und Therapeut über die erfolgte genetische Intervention und ihre technischen Modalitäten genauestens informiert sind und dritte Personen bei entsprechend vorhandener rechtlicher Vorraussetzung über die Intervention informieren müssen, 2. nicht die genetische Manipulation, sondern die Heilung der zugrunde liegenden Erkrankung das Ziel ist und in der Folge 3. bislang nicht der Nachweis einer genetischen Manipulation an sich, sondern lediglich der Nachweis einer funktionell wirksamen Modifikation im Vordergrund steht. Dieser Umstand kann sich jedoch ändern, wenn eine Ausweitung der Krankheitsbilder, welche mittels somatischer Gentherapie geheilt werden sollen, hin zu den harmloseren, asymptomatischen Erkrankungen stattfindet. Hier werden andere Sicherheitsmaßstäbe an die durchgeführte Behandlung angelegt, welche es erfordern, dass in jeglichem Körperexkrement, Körpersaft oder auch in jeglichem Körpergewebe ein möglichst sensitiver Nachweis von tDNA erfolgen kann.
Anders ist die Situation beim Gendoping. Hier werden die gleichen Techniken und auch in weiten Teilen die gleichen Kandidatengene, wie in der somatischen Gentherapie verwandt, doch hier besteht bereits jetzt von Seiten der Öffentlichkeit höchstes Interesse an einem Verfahren, das einen Nachweis der erfolgten genetischen Manipulation erbringt. Diese Manipulation erfolgt wohlgemerkt wie bei der somatischen Gentherapie durch eine spezieshomologe tDNA, welche nur schwer von der in jeder Körperzelle vorhandenen zugehörigen genomischen DNA (gDNA) abzugrenzen ist.
Im Folgenden wird das technische Problem eines Nachweises von Gendoping oder auch einer somatischen Gentherapie näher ausgeführt und es wird der Stand der Technik bezüglich eines Nachweises erläutert.
Doping bezeichnet allgemein unerlaubte Methoden zur Leistungssteigerung im Sport. In der Regel umfassen diese Methoden die Einnahme bestimmter Substanzen durch den Sportler, die sich von körpereigenen Substanzen wie beispielsweise dem Testosteron oder Wachstumsfaktoren ableiten, und bspw. ein verstärktes Muskelwachstum oder aber die Reifung von roten Blutkörperchen fördern. Die Zufuhr solcher leistungssteigernden Substanzen ist bei internationalen Wettkämpfen strikt verboten.
Mit dem Ziel der Sicherstellung von dopingfreien Wettkämpfen kommen verschiedenste Verfahren zum Einsatz, mit denen ein Athlet daraufhin überprüft werden soll, ob dieser derartige Substanzen eingenommen hat. Mittels solcher Verfahren sollen vorzugsweise in einer von dem Athleten stammenden biologischen Probe die leistungssteigernde Substanz direkt nachgewiesen werden. Dies ist beispielsweise dann möglich, wenn sich die Substanz aufgrund ihrer chemischen Struktur von körpereigenen Substanzen unterscheidet. Auf diese Art und Weise gelingt beispielsweise häufig die Detektion von Testosteronabkömmlingen, die gegenüber dem natürlichen Testosteron modifiziert wurden. Gleichermaßen gelingt häufig die Detektion von exogen zugeführ ten Peptidhormonen, wie dem Erythropoietin (EPO), da sich dieses hinsichtlich des Glykosylierungsmusters vom endogenen EPO unterscheidet. Die Detektion der vorstehend genannten leistungssteigernden Substanzen im Rahmen von Standarddopingtests ist vor allem deshalb grundsätzlich möglich, da diese im Urin oder Blut des gedopten Athleten auffindbar sind und eine solche Probe einem Athleten ohne weiteres entnommen werden kann, ohne gravierend in dessen körperliche Unversehrtheit einzugreifen.
In den letzten Jahren ist eine neue Form des Dopings in den Mittelpunkt des Interesses gerückt, nämlich das so genannte Gendoping. Hierunter wird die gezielte Zufuhr von ausgewählten Genen oder Genfragmenten in spezifische Gewebe oder Zellen mittels verschiedenster Methoden der somatischen Gentherapie verstanden. Diese Methoden können biologischer Art sein, wobei das Gen oder Genfragment über einen viralen oder nicht-viralen Vektor in das Zielgewebe, beispielsweise die Muskulatur, eingebracht wird. Weitere Methoden sind physikalischer Art und umfassen die direkte Injektion des Genes oder Genfragmentes in das Gewebe oder die Zelle mittels einer ultradünnen Kanüle oder einer so genannten „Genkanone". Methoden biochemischer Art umfassen die Verwendung von Phospholipidvesikeln oder Liposomen, in denen die Gene oder Genfragmente enthalten sind, und die dem Organismus zugeführt werden. Das Einbringen der Gene kann dabei im Körper selber erfolgen (in vivo), oder es kann an zuvor entnommenen Zellen des Körpers durchgeführt werden, die nach der genetischen Modifikation dem Körper wieder zu geführt werden (ex vivo), oder es wird eine Modifikation von nicht körpereigenen Zellen im Reagenzglas durchgeführt, die dann dem Körper nach erfolgter Modifikation zugeführt werden.
Es wird erwartet, dass die effizienteste Methode des Gendopings in der Verwendung von solchen genetisch veränderten viralen Vektoren liegt, die sich von den Retroviren, den Adenoviren oder den Lentiviren ableiten, replikationsdefizient sind und das so genannte „Transgen", d.h. die Codierungssequenz des gewünschten Genproduktes enthalten. Die genetisch veränderten Viren werden dann in den Körper eingebracht, wo sie Zellen infizieren und die biochemische Maschinerie der Zelle rekrutieren, um das eingebrachte Transgen zu exprimieren. Über geeignete Gestaltung dieser Vektoren kann eine lang andauernde Expression, eine niedrige Anti-Vektor-Immunität, zellspezifischer Tropismus und eine große Verpackungskapazität erzielt werden.
Eine Übersicht über den derzeitigen Stand der Technik im Bereich des Gendopings findet sich beispielsweise in H. Lee Sweeney (2004), Gene Doping, Scientific American, Seiten 37 bis 43, und in Azzazy et al. (2005), Doping in the recombinant era: Strategies and counterstrategies, Clinical Biochemistry 38, Seiten 959-965.
H. Lee Sweeney und Kollegen konnten mittels Gendopings eine so genannte „Supermaus" generieren. Dazu wurde einer Maus über das Adeno-assoziierte Virus (AAV) das Gen für den Insulin-like-growth-factor (IGF1) direkt in den Muskel eingebracht. Diese Mäuse wiesen eine 30% bis 40% größere Muskelmasse auf, lebten länger und erholten sich schneller von Verletzungen als Kontrollmäuse. Das in der Muskulatur exprimierte transgene IGF1 findet sich nach Informationen der Experimentatoren lediglich im Muskel, nicht aber im Blut oder im Urin. Hinzu kommt, dass das transgene IGF1 identisch mit der endogenen IGF1-Variante ist.
Eine kürzlich in der Fachwelt veröffentlichte Methode, mit der angeblich mittels Gendopings in den Organismus eingebrachtes EPO im Serum nachweisbar sein soll, hat sich als nicht durchführbar herausgestellt. So behaupten Lasne et al. (2004), „Genetic Doping with erythropoietin cDNA in primate muscle is detectable", Molecular Therapy 10, Nr. 3, Seiten 109 und 110, dass bei Makaken, denen für EPO codierende cDNA über rekombinante AAV in den Skelettmuskel injiziert wurde, eine solche EPO-Variante im Blut nachweisbar sei, die ein anderes isoelektrisches Muster aufweise als physiologisches EPO. Diese Ergebnisse basieren jedoch auf der Verwendung des Standardverfahrens zum Nachweis von rekombinanten Erythropoietin im Urin. Es konnte erst kürzlich gezeigt werden, dass dieses Verfahren obsolet ist, weil körperliche Belastungen zu falsch positiven Befunden führen; vgl. Beullens et al. (2006), False-positive detection of recombinant human erythropoietin in urine following strenuous physical exercise, Blood First Edition Paper, Online-Vorabveröffentlichung. Der bei Lasne et al. (a.a.O.) verwendete Antikörper für den Erythropoietinnachweis hat sich als nicht monospezifisch herausgestellt und mag deshalb auch unter der Belastung einer Gentherapie durch Kreuzreaktion mit einem noch nicht näher bekannten, stressinduzierten Peptid zu einem falsch positiven Befund führen.
So wird in der Fachwelt derzeit die Auffassung vertreten, dass ein Athlet des Gendopings höchstens indirekt aufgrund der physiologischen Veränderungen im Körper, die aus der Expression des Transgenes resultieren, überführt werden kann. Ein solcher indirekter Nachweis von erfolgtem Gendoping hätte jedoch den Nachteil, dass auch solche Athleten als vermeintlich gedopt identifiziert würden, die aufgrund genetischer Polymorphismen natürlicherweise eine verstärkte Expression dopingrelevanter Proteine zeigen. Dies hätte zur Folge, dass ungedopte Athleten des Dopings bezichtigt würden. Ferner würden sich derart überführte gedopte Athleten bei entsprechend günstiger Verteidigung auf eine vermeintlich von Geburt an vorliegende genetische Begünstigung berufen können, so dass ein solcher indirekter Nachweis von Gendoping regelmäßig ins Leere läuft. Ein weiteres Problem dieses Ansatzes liegt darin, dass die Reaktionen eines Körpers auf Extrembelastungen im Leistungssport aber auch bereits Reaktionen auf alltägliche Erkrankungen derart vielschichtig und extrem seien können, dass ein indirekter Nachweis eines Gendopings immer die Frage aufwerfen wird, ob die beobachteten Veränderungen nicht auch auf irgend eine andere Ursache als auf ein vermeintliches Gendoping zurückgeführt werden könnten.
Der direkte Nachweis von Gendoping ist demnach nach Auffassung der Fachwelt derzeit lediglich über die Vornahme einer gezielten Biopsie genau des Gewebeanteils möglich, welcher genetisch modifiziert wurde, beispielsweise des Muskels. Der Muskel oder das verdächtigte Gewebe wird dann direkt auf das Vorliegen des Vektors oder des Transgens untersucht. Im Falle des AAV findet man jedoch häufig bei Sportlern eine auf natürlich Weise erfolgte Infektion mit diesem harmlosen Virus, so dass eine Schlussfolgerung auf das Vorliegen von Gendoping nur schwer möglich sein wird. Ferner werden die meisten Athleten insbesondere kurz vor einem Wettkampf nicht dazu bereit sein, eine invasive Biopsie über sich ergehen zu lassen, wenn dabei beispielsweise Muskelgewebe verletzt wird. Im Hinblick auf die somatische Gentherapie muss bedacht werden, dass behandeltes Gewebe womöglich nur an bestimmten, dem Kontrolleur nicht be kannten Lokalisationen ein Transgen oder Vektor aufweist. So ist im Tierversuch bereits nachgewiesen, dass die Vermittlung einer tDNA des Erythropoietingens an nur kleine Gewebsanteile des Körpers einen dopingwirksamen Effekt hervorrufen kann. Kontrolleure wissen deshalb häufig nicht, welche Gewebe biopsiert werden sollen.
Vor diesem Hintergrund liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde ein zuverlässiges Verfahren zum Nachweis von transgener DNA (tDNA) in einem Lebewesen bereitzustellen, bei dem die Nachteile aus dem Stand der Technik vermieden werden. Insbesondere soll ein solches Verfahren bereitgestellt werden, bei dem mit einem vertretbar invasiven oder auch nicht-invasiven Eingriff in das Lebewesen ein direkter Nachweis des Transgens möglich ist und falsch-positive Ergebnisse weitgehend vermieden werden.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Verfahrens gelöst, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellung einer aus dem Lebewesen stammenden biologischen Probe, (2) Untersuchung der biologischen Probe auf das Vorhandensein von tDNA, und (3) Korrelation eines positiven Befundes in Schritt (2) mit dem positiven Nachweis von tDNA in dem Lebewesen, wobei die biologische Probe eine nichtbioptische Probe ist.
Unter transgener DNA (tDNA) wird erfindungsgemäß ein solches Nucleinsäuremolekül verstanden, das für ein Transgen codiert, wobei das Transgen die Codierungssequenz für ein solches Protein oder Peptid aufweist, das eine gewünschte physiologische, vorzugsweise leistungssteigernde Wirkung in einen Organismus ausübt, in den es eingebracht wurde. Erfindungsgemäß handelt es sich bei einer tDNA ferner um ein solches Nucleinsäuremolekül, das dem zu untersuchenden Lebewesen mittels den Methoden der Gentherapie gezielt, vorzugsweise organ- oder gewebetypspezifisch und spezieshomolog, zugeführt werden kann. Ein Transgen kann identisch mit einer cDNA sein, die sich von einem natürlichen Gen bzw. einem so genannten Kandidatengen ableitet, wie bspw. im Falle von Erythropoietin (EPO), dem humanen Wachstumsfaktor (hGH), Insulin-like-growth-factor-1 (IGF1) etc. Die tDNA kann aber auch eine Codierungssequenz aufweisen, die sich von der cDNA des zugrunde liegenden Kandidatengenes unterscheidet, wie dies beispielsweise für Myostatin gilt. Während Myostatin im Organismus das Muskelwachstum hemmt, würde eine sich von Myostatin ableitende tDNA in ihrer Sequenz derart verändert sein, dass diese inhibierende Wirkung aufgehoben ist.
Der Erfinder hat überraschenderweise erkannt, dass die tDNA in nichtbioptischen Proben des transfizierten Lebewesens nachweisbar ist. Erfindungsgemäß wird unter einer nichtbioptischen Probe eine solche Probe verstanden, die biologisches Material aufweist und unter Umgehung einer Biopsie über weitgehend nicht-invasive Methoden aus dem Lebewesen erhalten werden kann. Nichtbioptische Proben umfassen Blutproben, Speichelproben, Urinproben, Haarproben, Stuhlproben, sowie Abstrich-/Flüssigkeitsproben aus dem Mund-, Augen-, Nasen-, Rektal- und Genitalbereich.
Diese Erkenntnis war insbesondere deshalb so überraschend, da die Fachwelt bislang die Auffassung vertrat, dass tDNA ausschließlich im transfizierten Gewebe bzw. der transfizierten Zelle nachzuweisen ist, nicht aber in vorstehend genannten Proben, insbesondere nicht im Blut; vgl. Sweeney (a.a.O.), Seite 43, linke Spalte, 3. Absatz; S. Pincock (2005), Feature Gene doping, Lancet 366, Seite 18, rechte Spalte, erster Absatz; Azzazy et al. (a.a.O.) Seite 963, linke Spalte, letzter Absatz; L. DeFrancesco (2004), The faking of champions, Nature Biotechnology Vol. 22, Nr. 9, Seite 1070, rechte Spalte, erster Absatz.
Auch Ergebnisse aus der somatischen Gentherapie weisen in die gleiche Richtung. Raper et al. (2003), Fatal Systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer, Molecular Fenetics and Metabolism 80, Seiten 148 bis 158, berichten über den ersten Todesfall eines Patienten, dem über den humanen Adenovirus-Typ-5 eine tDNA codierend für humane Ornithin-Transcarbmaylase (OTC) mittels Infusionen über ein Femoralkatheter in die rechte Leberarterie zugeführt wurde. Da es sich in dem Fall dieses Patienten um einen Todesfall handelte, der erstmals eindeutig nicht auf die vorhandene Grunderkrankung sondern auf die durchgeführte somatische Gentherapie zurückgeführt werden konnte, wurden dort bislang beispielslos umfangreiche Kontrollexperimente peri- und postmortal durchgeführt. Während sich innerhalb der Infektionsphase, d.h. innerhalb der ersten 8 Stunden nach der Infusion noch Vektor im peripheren Blut des Patienten nachweisen ließ, so konnten die Autoren bereits einen Tag nach der Infusion weder im Blut noch im Urin, Stuhl oder in der Nasalflüssigkeit einen solchen nachweisen, sondern lediglich postmortal konnte in den verschiedensten Organen tDNA nachgewiesen werden; vgl. Seite 155, linke Spalte, erster und zweiter Absatz.
Vor diesem Hintergrund war nicht zu erwarten, dass sich die tDNA tatsächlich den nichtbioptischen Proben finden lässt. Dies konnte jedoch von dem Erfinder überraschender Weise gezeigt werden, wobei festgestellt wurde, dass in diesen nichtbioptischen Proben die tDNA im Vergleich zu genomischer DNA (gDNA) sehr stark verdünnt vorliegt. Es wird deshalb angenommen, dass die tDNA aufgrund ihrer geringen Konzentration in den nichtbioptischen Proben bislang nicht gefunden wurde.
Die tDNA wird dann entweder über virale Abschnitte des Vektors oder aber über Abschnitte der Codierungssequenz nachgewiesen.
Die Entnahme geringer Mengen von nichtbioptischen Proben reicht zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens für einen zuverlässigen Nachweis vollkommen aus. Das Verfahren eignet sich deshalb sowohl zum Nachweis von Gendoping, wobei dann auf das Vorliegen einer solchen tDNA untersucht wird, die für dopingrelevante Gene codiert, als auch zum Nachweis einer solchen tDNA, die im Rahmen der Gentherapie in ein Lebewesen eingebracht wurde.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird damit vollkommen gelöst. Insbesondere wird ein solches Verfahren bereitgestellt, bei dem ein unvertretbar invasiver Eingriff in das zu untersuchende Lebewesen vermieden wird.
Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die nichtbioptische Probe eine Blutprobe ist.
Der Erfinder hat festgestellt, dass sich die tDNA im Blut in ausreichenden Mengen auffinden lässt und Letzteres deshalb eine besonders geeignete nichtbioptische Probe darstellt. Dabei sind die genauen Ursachen des Vorliegens von tDNA im Blut im Einzel nen noch nicht bekannt. Es wird angenommen, dass die transformierten Zellen teilweise dem Zelltod unterliegen, was dazu führt, dass tDNA sowohl unversehrt als auch in Sequenzfragmenten von vorzugsweise >100 und <1000 bp in das periphere Blut gelangt. Dabei wurde festgestellt, dass die tDNA löslich oder im Inneren von Blutzellen und gegebenenfalls lysosomal verpackt vorliegen kann.
Dabei ist es bevorzugt, wenn Schritt (2) des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erfolgt. Mittels selektiver PCR, die entweder virale Abschnitte oder aber die Codierungssequenz der tDNA selbst amplifiziert, kann Letztere so stark amplifiziert werden, dass sich diese trotz der hohen Verdünnung gegenüber gDNA mittels im Stand der Technik bekannter Methoden zur Darstellung von Nucleinsäuren, wie Elektrophorese und Ethidiumbromidfärbung, ohne weiteres eindeutig nachweisen lässt. Der Erfinder konnte damit die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens derart erhöhen, dass ein tDNA-Molekül auf bis zu 5 Mio. gDNA-Molekülen nachweisbar ist.
Dabei ist es bevorzugt, wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein solches PCR-Primerpaar verwendet wird, bei dem der Gegensinn-PCR-Primer derart gestaltet ist, dass dieser an ein solches Exon der tDNA hybridisiert, dass stromabwärts zu dem Exon der tDNA liegt, an das der Sinn-PCR-Primer hybridisiert.
Diese Maßnahme macht sich die Erkenntnis des Erfinders zu Nutze, dass tDNA im Gegensatz zu gDNA weitgehend oder vorzugsweise vollständig intronfrei vorliegt. Wird nämlich beispielsweise der Sinn-PCR-Primer so gewählt, dass sich dieser im ersten Exon (E1) der tDNA anlagert, der Gegensinn-PCR-Primer wird hingegen so gewählt, dass sich dieser 3'-wärts der tDNA im anschließenden zweiten Exon (E2) anlagert, so führt dies dazu, dass es auf Ebene der tDNA zur Amplifizierung eines relativ kurzen Abschnittes von vorzugsweise 50 bis 400 bp kommt, während auf der Ebene der gDNA, die für das entsprechende Gen codiert, ein deutlich längerer Abschnitt von beispielsweise ca. 1000 bis >10.000 bp amplifiziert wird, da zwischen E1 und E2 ein Intron liegt, welches mitamplifiziert wird. Das Vorliegen von tDNA in der Blutprobe lässt sich dann in der Elektrophorese aufgrund der geringeren Länge des tDNA-Amplifikates gegenüber der Länge des gDNA-Amplifikates nachweisen.
Des Weiteren ist es bevorzugt, wenn bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die PCR mittels intronübergreifenden PCR-Primern durchgeführt wird.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens nochmals erhöht wird. Unter intronübergreifenden PCR-Primern werden solche verstanden, die sich nur an Bereiche der tDNA anlagern, in denen zwei benachbarte Exons aneinandergrenzen. Solche PCR-Primer sind deshalb „intronübergreifend", da sie nicht an Intronsequenzen hybridisieren können, die zwischen benachbarten Exons liegen. Ein 5'-wärts gelegener Teil des intronübergreifenden PCR-Primers hybridisiert mit Sequenzabschnitten, die zu einem ersten Exon (beispielsweise E1) gehören, der 3'-wärts gelegene Teil des intronübergreifenden Primers hybridisiert mit Abschnitten, die zu einem zweiten Exon (beispielsweise E2) gehören. Ein solcher intronübergreifender PCR-Primer kann sich deshalb nur stabil an die intronfreie tDNA anlagern, nicht aber an die gDNA, da dies durch die Intronsequenzen verhindert wird, die zwischen den dortigen Exons liegen. Bei dieser Ausführungsvariante reicht es aus, wenn einer der beiden Primer intronübergreifend ausgestaltet ist, wobei jedoch die Sensitivität nochmals erhöht wird, wenn beide Primer intronübergreifend ausgebildet sind.
Nach einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist zumindest einer der PCR-Primer derart ausgestaltet, dass er an solchen Übergangsbereichen zwischen zwei Exons hybridisiert, die innerhalb von Splice-Varianten des Genes, von dem sich die Codierungssequenz der tDNA ableitet, konserviert sind.
Diese Maßnahme hat den besonderen Vorteil, dass mit einem solchen Primer verschiedenste Splice-Varianten des Transgens erfasst werden, was die Sensitivität des Verfahrens nochmals erhöht. So ist bekannt, dass beispielsweise das humane Wachstumshormon (GH) in verschiedensten Splice-Varianten in Erscheinung tritt, die sich in ihrer Sequenz teilweise voneinander unterscheiden, jedoch gleichermaßen funktionell sind und somit im Rahmen einer somatischen Gentherapie oder im Rahmen von Gendoping Anwendung finden können. Allerdings weisen diese Splice-Varianten konservierte Bereiche auf, die an entsprechenden Position weitgehend identische Nucleotide aufweisen. Dabei beträgt die Identität unter diesen Splice-Varianten vorzugsweise 90%, weiter vorzugsweise 95% und höchst bevorzugt 100. Auch ist bekannt, dass zur Erzielung eines dopingrelevanten Effektes häufig nur ein bestimmter Abschnitt und nicht zwingend das gesamte Peptidhormon erforderlich ist, so dass erfindungsgemäß unter konservierten Bereichen auch solche verstanden werden, die zur Erzielung des gewünschten Effektes zwingend notwendig sind und deshalb im Transgen vorhanden sein müssen. Derartig konservierte Bereiche finden sich auch in den Übergangsbereichen zwischen zwei Exons, so dass ein erster Teil des konservierten Bereiches 5'-wärts in einem ersten Exon (z.B. E1) der tDNA und ein zweiter Teil desselben konservierten Bereichs 3'-wärts in einem sich daran anschließenden Exon (z. B. E2) befindet. Diese Maßnahme macht die Detektion nahezu aller theoretisch möglichen von der tDNA codierten Splice-Varianten durch nur eine oder durch eine überschaubare Anzahl von PCRs möglich.
Nach einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die PCR als verschachtelte PCR, so genannte „nested" PCR durchgeführt, die eine Pre-PCR und eine anschließende Sekundär-PCR umfasst.
Diese Maßnahme hat den besonderen Vorteil, dass die Spezifität und Effizienz der durchgeführten PCR weiter erhöht wird. Dabei wird in einer ersten PCR-Runde im Rahmen der so genannten Pre-PCR ein erstes Template über wenige Zyklen amplifiziert. Die Primer werden hier so gewählt, dass diese relativ weit auseinanderliegen, d.h. der Sinn-PCR-Primer beispielsweise an dem Übergangsbereich von Exon 1 (E1) zu Exon 2 (E2) hybridisiert, der Antisense-PCR-Primer hingegen beispielsweise an dem Übergangsbereich von Exon 5 (E5) zu Exon 6 (E6). Das Amplifikat dieser Pre-PCR wird dann im Rahmen einer weiteren PCR-Runde, der Sekundär-PCR oder Post-PCR, unter Verwendung eines neuen PCR-Primerpaares amplifiziert. Die neuen PCR-Primer liegen weiter innen als die ersten, so dass in diesem zweiten Schritt nur noch die spezifischen tDNA-Abschnitte aus der Pre-PCR amplifiziert werden. So lagert sich der Sinn-PCR-Primer der Sekundär-PCR nun beispielsweise im Übergangsbereich zwischen Exon 2 (E2) und Exon 3 (E3) an und der Gegensinn-PCR-Primer im Übergangsbereich von Exon 3 (E3) zu Exon 4 (E4). Es kann im Rahmen der Sekundär-PCR auch nur ein einziger weiter innenliegender Primer eingesetzt werden, beispielsweise nur ein Gegensinn-PCR-Primer, der im Übergangsbereich von Exon 4 (E4) zu Exon 5 (E5) liegt. Auch dadurch wird die Empfindlichkeit und Effizienz des erfindungsgemäßen Verfahrens deutlich erhöht.
Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich vorzugsweise auf den Nachweis einer solchen tDNA anwenden, die für dopingrelevante oder auch für Proteine codiert, die für die Durchführung einer somatischen Gentherapie von Bedeutung sind.
Mit dieser Maßnahme wird ein zuverlässiges und einfach durchzuführendes und wenig invasives Verfahren bereitgestellt, dass sich als hochsensitives Standardverfahren zum Nachweis von Gendoping oder der stattgefundenen Durchführung einer somatischen Gentherapie eignet. Die relevanten Proteine sind dabei vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Erythropoietin (EPO), Wachstumshormon 1 (GH1), Wachstumshormon 2 (GH2), Insulin-like-growth-factor-1 (IGF1), Insulin-likegrowth-factor-2 (IGF2), Myogenin, Peroxisom-Proliferatoraktivierter-Rezeptor-delta (PPARd), Calcineurin-A-alpha, Vascular-endothelial-growth-factor (VEGF), Chorionic-somatomammotropin-Hormon 1 (CSH1), Chorionic-somatomammo-tropin-Hormon 1/2 (CSH1/CSH2), Chorionic-somatomammo-tropin-Hormon 2 (CSH2), Chorionic-somatomammo-tropin-Hormon-like 1 (CSHL1), und Myostatininhibitor. Weiter vorzugsweise handelt es sich dabei um die jeweils humanen Varianten.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis der wichtigsten gentherapie- und doping relevanten Proteine eignet. Sämtliche der genannten Proteine sind in der humanen Variante sequenziert und die Aminosäure- und Nucleotidsequenzen öffentlich zugänglichen Datenbanken, wie beispielsweise der NCBI-Datenbank, entnehmbar. So können die entsprechenden vorzugsweise intronübergreifenden Primer im Rahmen des fachmännischen Könnens einfach hergestellt werden.
Ein weiterer Gegenstand des vorliegenden Verfahrens betrifft einen Kit, das eine Vorschrift zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie gegebenenfalls Reagenzien, Lösungen, Reaktionsbehälter und weitere zur Durchführung des Verfahrens vorteilhafte Substanzen und Gegenstände aufweist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass sämtliche Informationen, Reagenzien und Reaktionsbehälter zusammen bereitgestellt werden, was die Durchführung eines Tests auf genetische Manipulation auch außerhalb eines klinischen Labors durch angelerntes Personal ermöglicht. Ein solches Genmodifikations-Testkit kann beispielsweise ein Set von verschiedensten PCR-Primern für unterschiedliche tDNAs, ausreichende Mengen von Taq-DNA-Polymerase, Nukleotidtriphosphaten, Salzen wie Magnesiumchlorid, Reaktionspuffer, Reinstwasser, etc. enthalten. Ferner kann das Kit Spritzen, Kanülen und sonstige Gegenstände zur Blutentnahme, Pipetten, Reaktionsgefäße, Kühlmittel und gegebenenfalls sogar eine Vorrichtung zur Durchführung von PCR, wie beispielsweise einen Thermocycler, enthalten. Diese Zusammenstellung von sowohl Durchführungsvorschrift als auch der für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlichen Utensilien sichert die ordnungsgemäße Durchführung des Verfahrens und verhindert falsch-negative und falsch-positive Ergebnisse.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, die rein illustrativen Charakter haben und die Reichweite der Erfindung keinesfalls einschränken. Dabei wird auf die beigefügten Figuren Bezug genommen, in denen Folgendes dargestellt ist:
1 zeigt (A) das Problem des Nachweises von Gendoping oder der stattgefundenen Durchführung einer somatischen Gentherapie aus entnommenen nichtbioptischen Material, (B) das Prinzip der intronübergreifenden PCR-Primer und das Prinzip der verschachtelten PCR;
2 zeigt das Auswahlprinzip für geeignete PCR-Primer zum Nachweis von tDNA codierend für verschiedene Wachstumshormone;
3 zeigt das Auswahlprinzip für geeignete PCR-Primer zum Nachweis von tDNA codierend für Erythropoietin (EPO);
4 zeigt das Auswahlprinzip für geeignete PCR-Primer zum Nachweis von tDNA codierend für Myostatin-Inhibitor (GDF8-Inhibitor);
5 zeigt das Auswahlprinzip für geeignete PCR-Primer zum Nachweis von tDNA codierend für Insulin-like-growth-factor-1 (IGF1);
6 zeigt das Auswahlprinzip für geeignete PCR-Primer zum Nachweis von tDNA codierend für Insulin-like-growth-factor-2 (IGF2);
7 zeigt das Auswahlprinzip für geeignete PCR-Primer zum Nachweis von tDNA codierend für Myogenin (MYOG);
8 zeigt das Auswahlprinzip für geeignete PCR-Primer zum Nachweis von tDNA codierend für Peroxisom-Proliferator-aktivierter-Rezeptor-delta (PPARd);
9 zeigt das Auswahlprinzip für geeignete PCR-Primer zum Nachweis von tDNA codierend für Calcineurin-A-alpha (PP3CA);
10 zeigt das Auswahlprinzip für geeignete PCR-Primer zum Nachweis von tDNA codierend für Vascular-endothelialgrowth-factor (VEGF); und
11 zeigt das Ergebnis der gelelektrophoretischen Auftrennung eines EPO-tDNA-PCR-Produktes aus der Pre-PCR (A) und aus der zugehörigen Sekundär-PCR (B und C) auf einem 1,5%igen Agarosegel.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1: Gentherapeutisch- und dopingrelevante Gene
In nachstehender Tabelle 1 sind die wichtigsten Kandidatengene gelistet, für deren Genprodukte im Tierexperiment bereits ihre dopingrelevante oder gentherapeutische Funktionalität nachgewiesen wurde. Angegeben ist die Bezeichnung des Gens, die offizielle Abkürzung, die chromosomale Lokalisierung, in der Spalte NCBI-Gen-ID ist die NCBI Referenznummer für das Gen angegeben. In der Spalte UniProtKB sind die Proteinvarianten aufgelistet mit den Referenz-Zugriffsnummern der Swiss-Prot-Proteindatenbank. In der anschließenden Spalte findet sich zu jeder bekannten Splice-Variante die Zugriffsnummer für die NCBI-Datenbank, mittels derer die entsprechende mRNA-Sequenz erhältlich ist. Auf Grundlage der mRNA-Sequenz und der zugehörigen Gensequenz, erhältlich über die NCBI Referenznummer für das Gen, können dann geeignete PCR-Primer zur Amplifizierung der jeweiligen tDNA abgeleitet werden.
Im Falle von Genen, zu denen es viele alternative Splice-Varianten gibt, wie beispielsweise bei VEGF, oder wenn es neben den alternativen Splice-Varianten artverwandte Gene mit hoher Konservierung untereinander gibt, die für ein ähnliches Protein codieren, wie beispielsweise GH1, GH2, CSH1, CSH2, CSHL1, muss der PCR-Primer derart gestaltet werden, dass er an solchen Übergangsbereichen zwischen zwei Exons hybridisiert, die innerhalb der Splice-Varianten hoch konserviert sind (siehe unten Beispiel 2). In solchen Fällen kommen für einen Nachweis mittels intronübergreifenden Primern oft nur wenige Sequenzberei che in Frage, die sich bei allen oder möglichst vielen Varianten finden.
Tabelle 1: Auflistung der wichtigsten gentherapeutisch- und dopingrelevanten Gene
Beispiel 2: Das Prinzip der intronübergreifenden PCR-Primer
In 1A ist schematisch das Problem des Gendoping- oder auch Gentherapienachweises aus nichtbioptischem Material dargestellt. So liegt die transgene DNA (tDNA) im Verhältnis zur genomischen DNA (gDNA) sehr stark verdünnt vor, was grundsätzlich ein Nachweis der stattgefundenen genetischen Modifikation erschwert. In 50 μg isolierter Gesamt-DNA aus nichtbioptischem Material wie Blut, Stuhl oder Urin, finden sich durchschnittlich etwa 10⁷ Kopien gDNA. Um in 50 μg isolierter Gesamt-DNA eine einzelne Kopie der tDNA nachweisen zu können, wird diese zuvor vorzugsweise etwa ver-10¹¹-facht.
In 1B ist das Prinzip der intronübergreifenden PCR-Primer gezeigt. Die gDNA weist 6 Exons (E1 bis E6) mit dazwischenliegenden Introns auf, wohingegen die tDNA intronfrei ist und ferner nicht E5, das für den gewünschten Dopingeffekt im Organismus nicht nötig ist, enthält. Beim schwarz dargestellten Primerpaar wird die höchste Spezifität der PCR-Amplifikation der tDNA auch bei sehr starker Verdünnung durch gDNA erreicht, weil es sich bei beiden Primern um primerintern intronübergreifende Primer handelt. Der schwarze Sinn(Sense)-PCR-Primer hybridisiert an den Übergangsbereich zwischen Exon 1 (E1) und Exon 2 (E2), während der Gegensinn(Antisense)-PCR-Primer an den Übergangsbereich zwischen Exon 2 (E2) und Exon 3 (E3) hybridisiert. Im Folgenden wird ein solches Primerpaar „zweiseitig intronübergreifendes Primerpaar" genannt. Zweiseitig intronübergreifende Primerpaare können über zwei oder mehr als zwei Introns hinweggehen.
Bei den beiden dunkelgrau dargestellten Primern handelt es sich um „einseitig intronübergreifende Primerpaare". Beim oberen dunkelgrauen Primerpaar ist nur der Gegensinn(Antisense)-PCR-Primer intronübergreifend ausgebildet und hybridisiert an den Übergangsbereich zwischen E3 und E4. Beim unteren dunkelgrauen Primerpaar ist nur der Sinn(Sense)-PCR-Primer intronübergreifend ausgebildet und hybridisiert an den Übergangsbereich zwischen E2 und E3. In beiden Fällen der einseitig intronübergreifenden Primerpaaren ist die Sensitivität und Spezifität der tDNA-Amplifikation etwas schlechter als beim zweiseitig intronübergreifenden schwarz dargestellten Primerpaar, da zumindest ein Primer [dunkelgrau (oben): Sinn(Sense)-PCR-Primer; dunkelgrau (unten): Gegensinn(Antisense)-PCR-Primer] volle Affinität zu der im Überschuß vorhandenen gDNA aufweist.
Das dunkelgrau dargestellte Primerpaar ist ein sogenanntes „primerextern intronübergreifendes Primerpaar". Hier hybridisieren beide Primer ausschließlich an jeweils ein Exon und nicht an Übergangsbereiche zwischen zwei verschiedene Exons. Der Sinn(Sense)-PCR-Primer hybridisiert ausschließlich an E4 und der Gegensinn(Antisense)-PCR-Primer hybridisiert ausschließlich an E6. Auch auf diese Weise kann ein tDNA-Nachweis erfolgen, da sich die Produkte bzw. Amplifikate aus gDNA und tDNA in ihrer Größe unterscheiden. Sensitivität und die Spezifität sind bei diesem Ansatz mit primerextern intronübergreifendes Primerpaar aber aufgrund der starken Verdünnung der tDNA und aufgrund des PCR-Produktes, das aus der gDNA entsteht, schlechter als bei den Ansätzen, in denen einseitig oder zweiseitig intronübergreifende Primerpaare verwendet werden.
Die höchste Sensitivität wird erreicht, indem eine Pre-PCR mit dem Sinn-Primer des Primerpaars 1 und dem Gegensinn-Primer des Primerpaars 3 durchgeführt wird. Nach diese Pre-PCR wird dann mit einer Verdünnung des Pre-PCR-Amplifikates mit den weiter innen liegenden Primerpaaren, d.h. mit dem Primerpaar 1, Primerpaar 2 und Primerpaar 3 eine Sekundär-PCR durchgeführt. Diese Maßnahme bezeichnet man auch als verschachtelte PCR oder „nested" PCR.
In 1C ist das Prinzip der verschachtelten PCR dargestellt. Wie oben erwähnt, wird die tDNA aus 50 μg isolierter Gesamt-DNA für einen optimalen Nachweis vorzugsweise etwa ver-10¹¹-facht, da 10¹¹ Kopien einer 400 bp großen DNA etwa 50 ng wiegen, was u.a. zur Sequenzierung eines PCR-Produktes ausreicht. Bei einer optimal ablaufenden PCR wird mit jedem Amplifikationszyklus eine Verdopplung der geprimten DNA erreicht. Um eine Ver-10¹¹-fachung zu erreichen benötigt man somit in etwa 37 optimal ablaufende PCR-Zyklen. Da die PCR eine enzymatische Reaktion ist, welche naturgemäß einer Sättigungskinetik unterliegt, können 37 optimale PCR-Zyklen nicht in einem PCR-Durchlauf erreicht werden. D.h. um maximale Sensitivität zu erreichen werden 2 PCR-Durchläufe hintereinander absolviert, wobei der erste Durchlauf als Pre-PCR und der zweite Durchlauf als Sekundär-PCR bezeichnet wird. Dabei wird eine Verdünnung des PCR-Amplifikates aus der Pre-PCR als Template in der Sekundär-PCR eingesetzt. Die Anzahl der Zyklen in der Pre- und Sekundär-PCR liegt zwischen 20 und 35 Zyklen und variiert in Abhängigkeit der verwendeten Primer.
Um auf tDNA zu möglichst vielen unterschiedlichen Kandidatengenen für genetische Modifikationen testen zu können, wird die Pre-PCR in manchen Fällen als so genannte Multiplex-PCR gefahren. D.h. es werden in der Pre-PCR mehrere Primerpaare auf einmal eingesetzt um zunächst ein breiteres Spektrum an tDNAs vorzuamplifizieren. In der Sekundär-PCR werden dann genspezifische Primer verwendet, um gezielt einzelne tDNA-Kandidaten aus der Pre-PCR herauszuamplifizieren.
Um in dem in 1C dargestellten Beispiel die höchste Sensitivität zu erreichen, wird eine Pre-PCR mit dem oberen schwarzen Primerpaar durchgeführt. Nach dieser Pre-PCR, wird dann mit einer Verdünnung des Pre-PCR-Amplifikates entweder wieder mit dem oberen schwarzen Primerpaar oder auch mit dem unteren schwarzen Primerpaar eine Sekundär-PCR durchgeführt (sogenannte verschachtelte oder „nested" PCR). In der Sekundär-PCR als nested Sekundär-PCR entsteht somit ein kleineres Amplifikat als in der Pre-PCR. Die Primer in der Sekundär-PCR können in diesem Fall auch eine kleinere Anzahl von Introns übergreifen.
Beispiel 3: Primerdesign
3.1 Primer für den Nachweis von Gentherapie oder Doping mittels tDNA des Wachstumshormons (GH), Chorionic-somatomammo-tropin-Hormons (CSH) und Chorionic-somatomammotropin-Hormon-like Gens (CSHL)
In 2 sind die proteincodierenden Referenzsequenzen der fünf sich auf dem so genannten Wachstumshormon-Lokus 17q23.3 befindlichen Wachstumshormonsequenzen schematisch dargestellt. Insgesamt ist die Exon-Intron-Struktur für alle 15 Referenz-mRNA-Sequenzen des Wachstumshormones dargestellt. Alle fünf Gene weisen eine Sequenzhomologie von 90% zueinander auf. Durch Mehrfachsequenzabgleiche konnten drei Exon-Intron-Übergänge (Kästen) ermittelt werden, die eine ausreichende Homologie aufweisen, um alle Kandidaten möglichst sensitiv und mit einer überschaubaren Anzahl von PCRs nachzuweisen. In diesem Fall gibt es drei Sequenzbereiche, in denen Sinn-Primer und fünf Sequenzbereiche, in denen Gegensinn-Primer ausgewählt wurden. Die Primer können alle zusammen mit je 0,2 μM in einer Multiplex-Pre-PCR eingesetzt werden. Anschleißend können sieben PCRs für die unterschiedlichen genspezifischen Nachweise geführt werden. Das CSH1/CSH2-Hybrid besteht aus dem Exon1 des CSH1 und den Exons 2-4 des CSH2-Lokus.
Verschiedene mRNA-Splicevarianten aus dem Wachstumshormon Lokus wurden miteinander verglichen, um hochkonservierte Abschnitte in den Übergangsbereichen zwischen zwei Exons zu bestimmen und um entsprechende PCR-Primer herzustellen. Dargestellt ist jeweils die gesamte mRNA, wobei der ausgewählte Sinn-Primer fettgedruckt und der Gegensinn-Primer unterstrichen ist. a) GH1-Primer:

b) GH2-Primer

c) CSH1-Primer

d) CSH2-Primer

e) CSHL1-Primer
Die abgeleiteten PCR-Primer zur Amplifizierung der Wachstumshormon-tDNA sind in der nachstehenden Tabelle 2 zusammengestellt. Diese PCR-Primer stellen hierbei lediglich Beispiele dar. Weitere geeignete PCR-Primer zum Nachweis von transgener DNA, die für das Wachstumshormon codiert, können gegenüber der genannten Beispiele kürzer oder länger sein und in Richtung 5'- Ende bzw. 3'-Ende verschoben sein, solange diese im hochkonservierten Übergangsbereich zwischen zwei benachbarten Exons liegen.
Tabelle 2: Beispiele für Wachstumshormon-PCR-Primer.

„s" bedeutet Sinn-Primer, „gs" bedeutet Gegensinn-Primer; GH1 steht für Wachstumshormon 1, GH2 für Wachstumshormon 2, CSH1 für Chorionic-somatomammotropin-Hormon 1, CSH2 für Chorionic-somatomammotropin-Hormon 2, CSHL1 für Chorionic-somatomammotropin-Hormon-like 1.

3.1.1Pre-PCR
Die Pre-PCR läuft für sämtliche Wachstumshormon-Gene identisch als Multiplex-PCR. Dafür wird ein Gemisch aus folgenden Primern verwendet, die alle 0,2 μM eingesetzt werden: GH1s (Sinn-Primer), GH2-CSHL1-CSH2s (Sinn-Primer), CSH1s (Sinn-Primer), GH1gs (Gegensinn-Primer), GH2gs (Gegensinn-Primer), CSHL1gs (Gegensinn-Primer), CSH1-CSH2gs1 (Gegensinn-Primer), CSH1-CSH2gs (Gegensinn-Primer). Bei der Pre-PCR wird das PCR-Amplifikat GH-Pre erhalten.
3.1.2Sekundär-PCR
Die Sekundär-PCR läuft genspezifisch ab.
a) für GH1:
Die genspezifische Sekundär-PCR folgt dann mit dem Primerpaar GH1s (Sinn-Primer) und GH1gs1 (Gegensinn-Primer), die in einer Konzentration von je 0,3 μM eingesetzt werden. Das GH1-PCR-Amplifikat hat eine Länge von 307 bp für P01241 und P01241-3+4, und 262 bp für P01241-2.
b) für GH2
Die genspezifische Sekundär-PCR erfolgt mit GH2-CSHL1-CSH2s (Sinn-Primer) und GH2gs (auf Gegensinn-Primer), die jeweils in einer Konzentration von je 0,3 μM eingesetzt werden. Das GH2-PCR-Produkt hat für die Varianten 1 bis 3 eine Länge von 309 Basenpaaren und für die Variante 4 eine Länge von 264 Basenpaaren.
c) für CSH1
Im Rahmen der genspezifischen Sekundär-PCR werden zur Amplifizierung der Codierungssequenz für das Protein P01243 (CSH1-I-PCR-Amplifikat) folgende Primer verwendet, die jeweils in einer Konzentration von je 0,3 μM eingesetzt werden: CSH1s (Sinn-Primer) und CSH1-CSH2gs1 (Gegensinn-Primer). Das sich hieraus ergebende Amplifikat weist eine Länge von 309 Basenpaaren auf.
Zur Amplifizierung der Codierungssequenz für das Protein Q7KZ35 (CSH1-II-PCR-Amplifikat) wurden folgende Primerpaare verwendet verwendet, die jeweils in einer Konzentration von je 0,3 μM eingesetzt werden: CSH1s (Sinn-Primer) und CSH1-CSH2gs2 (Gegensinn-Primer). Das CSH1-II-PCR-Amplifikat weist eine Länge von 184 Basenpaaren auf.
d) für CSH2
Im Rahmen der genspezifischen Sekundär-PCR wird zur Amplifizierung der Codierungssequenz für das Protein P01243 (CSH2-I-PCR-Amplifikat) folgende Primer verwendet, die jeweils in einer Konzentration von je 0,3 μM eingesetzt werden: GH2-CSHL1-CSH2s (Sinn-Primer) und CSH1-CSH2gs1 (Gegensinn-Primer). Das sich hieraus ergebende Amplifikat weist eine Länge von 309 Basenpaaren auf.
Zur Amplifizierung der Codierungssequenz für das Protein Q7KZ35 (CSH2-II-PCR-Amplifikat) wurden folgende Primerpaare verwendet verwendet, die jeweils in einer Konzentration von je 0,3 μM eingesetzt werden: GH2-CSHL1-CSH2s (Sinn-Primer) und CSH1-CSH2gs2 (Gegensinn-Primer). Das CSH2-II-PCR-Amplifikat weist eine Länge von 184 Basenpaaren auf.
e) für CSHL1
Die genspezifische Sekundär-PCR erfolgt mit G2-GSHL1-CSH2s (Sinn-Primer) und CSHL1gs (auf Gegensinn-Primer). Das CSHL1-PCR-Amplifikat hat für Protein Q14406-1 eine Länge von 324 Basenpaaren und für Q14406-1 eine Länge von 255 Basenpaaren.
3.2 Primer für Nachweis von Gentherapie oder Doping mit Erythropoietin-tDNA
3 zeigt die Exon-Intron Struktur der Referenz-mRNA-Sequenz für die einzig bekannte Proteinvariante von Erythropoietin (EPO). Die gesamte mRNA-Referenzsequenz ist somit prinzipiell für die Konstruktion intronübergreifender Primer geeignet. Die hellen Kästen zeigen welche Bereiche exemplarisch für die Konstruktion von Primern verwendet wurden.
Nachfolgend ist beispielhaft anhand der genomischen DNA-Sequenz für EPO dargestellt, wie die PCR-Primer zur Amplifizierung von EPO-tDNA generiert werden können. Dabei sind die Intron-Sequenzen in dunkelgrau, die Codierungssequenz (cds) für das gentherapie- oder dopingrelevante Protein in schwarz, der Sinn-Primer fettgedruckt, der Gegensinn-Primer unterstrichen und nicht fett, und Abschnitte, die sowohl Sinn- als auch Gegensinn-Primer darstellen können fett und unterstrichen dargestellt. ¹ steht für den Anfang oder das Ende von Primer 1, ² steht für den Anfang oder das Ende von Primer 2.
Nachfolgend ist die entsprechende EPO-mRNA gezeigt.
Die abgeleiteten PCR-Primer zur Amplifizierung der EPO-tDNA sind in der nachstehenden Tabelle 3 zusammengestellt. Auch diese PCR-Primer stellen hierbei lediglich Beispiele dar.
Tabelle 3: Beispiele für Erythropoietin-Primer.

„s" bedeutet Sinn-Primer, „gs" bedeutet Gegensinn-Primer; EPO steht für Erythropoietin.

3.2.1Pre-PCR
Das PCR-Amplifikat EPO1-3, erhältlich mit dem Primerpaar EPOs1 (Sinn-Primer) und EPOgs3 (Gegensinn-Primer), die jeweils in einer Konzentration von je 0,3 μM eingesetzt werden, weist eine Länge von 437 bp auf.
3.2.2Sekundär-PCR
Das PCR-Produkt EPO1, erhältlich mit dem Primerpaar EPOs1-II (Sinn-Primer) und EPOgs1 (Gegensinn-Primer), weist eine Länge von 169 Basenpaaren auf, das PCR-Produkt EPO2, erhältlich mit dem Primerpaar EPOs2+3 (Sinn-Primer) und EPOgs2 (Gegensinn-Primer) weist eine Länge von 109 Basenpaaren auf, das PCR-Produkt EPO3, erhältlich mit dem Primerpaar EPOs2+3 (Sinn-Primer) und EPOgs3-II (Gegensinn-Primer), weist eine Länge von 289 Basenpaaren auf und das PCR-Produkt EPO1-3-II erhältlich mit den Basenpaaren EPOs1-II (Sinn-Primer) und EPOgs3-II (Gegensinn-Primer) weist eine Länge von 423 Basenpaaren auf. Die Primer für die Sekundär-PCR werden jeweils in einer Konzentration von je 0,3 μM eingesetzt.
3.3 Primer für den Nachweis von Gentherapie oder Doping mit Myostatin-Inhibitor-tDNA
4 zeigt die Exon-Intron Struktur der Referenz-mRNA-Sequenz für die gentherapie- oder dopingrelevanten Proteinregionen von Myostatin (GDF8). Die gesamte mRNA-Referenzsequenz ist somit prinzipiell für die Konstruktion intronübergreifender Primer geeignet. Die hellen Kästen zeigen, welche Bereich hier exemplarisch für die Konstruktion von Primern verwendet wurden.
Bei der Auswahl der Primer wurde darauf geachtet, dass in Exon 3 ein dunkelgrau markierter Sequenzbereich liegt, der zum Zweck der Leistungssteigerung modifiziert oder deletiert wird. Hierdurch entsteht ein dominant negativer My ostatin-Inhibitor (GDF8-Inhibitor), welcher somit nicht mehr wie das natürliche Myostation (GDF8) das Muskelwachstum inhibieren kann. Der Bereich wird bei der Konstruktion der Primer ausgespart.
Nachfolgend ist beispielhaft anhand der genomischen DNA-Sequenz für Myostation dargestellt, wie die PCR-Primer zur Amplifizierung von Myostatin-Inhibitor-tDNA generiert werden können. Dabei sind die Intron-Sequenzen in dunkelgrau, die Codierungssequenz (cds) für das dopingrelevante Protein in schwarz, der Sinn-Primer fettgedruckt und der Gegensinn-Primer ist unterstrichen und nicht fett dargestellt. ¹ für den Anfang oder das Ende von Primer 1, ² steht für den Anfang oder das Ende von Primer 2.
Beginn des Sequenzteils, der für eine effiziente Gentherapie oder Doping modifiziert wird:
Nachstehend folgt die entsprechende mRNA codierend für Myostatin:
Beginn des Sequenzteils, der für eine effiziente Gentherapie oder Doping modifiziert wird:
Die abgeleiteten beispielhaften PCR-Primer zur Amplifizierung der Myostatin-Inhibitor-tDNA sind in der nachstehenden Tabelle 4 zusammengestellt.
Tabelle 4: Beispiele für GDF8-Primer.

„s" bedeutet Sinn-Primer, „gs" bedeutet Gegensinn-Primer; GDF8 steht für Myostatin („growth factor differentiantion factor")/Myostation-Inhibitor.

3.3.1 Pre-PCR
Das PCR-Produkt GDF8-1, das unter Verwendung der Primer GDF8s1 (Sinn-Primer) und GDF8gs1 (Gegensinn-Primer) erhalten wird, die jeweils in einer Konzentration von je 0,3 μM eingesetzt werden, weist eine Länge von 398 bp auf.
3.3.2 Sekundär-PCR
Das PCR-Produkt GDF8-2, das unter Verwendung der Primer GDFs2 (Sinn-Primer) und GDF8gs2 (Gegensinn-Primer), die jeweils in einer Konzentration von je 0,3 μM eingesetzt werden, erhalten wird, weist eine Länge von 389 bp auf.
3.4 Primer für den Nachweis von Gentherapie oder Doping mit IGF1-tDNA
5 zeigt die Exon-Intron-Struktur der vier Referenz-mRNA-Sequenzen für die bekannten dopingrelevanten Proteinvarianten von IGF1. Nur der Exon-Intron-Übergang zwischen Exon 2 und 3 ist vollständig konserviert. Die hellen Kästen zeigen, welche Bereich hier exemplarisch für die Konstruktion von Primern verwendet wurden. Die Variante, die für das Protein Q1462 codiert, weist als einzige Variante keine Konservierung zwischen Exon 1 und 2 auf und erfordert deshalb einen individuellen Primer.
(a) Primer für die PCR für die Varianten M11568, M29644 und NM 000618 (P01343 und P05019):
Dargestellt ist die genomische DNA-Sequenz von IGF1 im Bereich der mRNA > chr12:101314008 – 101376808 (reverse complement). Dabei sind die Intron-Sequenzen in dunkelgrau, die Codierungssequenz (cds) für das gentherapie- oder dopingrelevante Protein in schwarz, der Sinn-Primer fettgedruckt und der Gegensinn-Primer ist unterstrichen und nicht fett dargestellt. ¹ steht für den Anfang oder das Ende von Primer 1, ² steht für den Anfang oder das Ende von Primer 2.
(b) Primer für die PCR für die Variante M37484
Dargestellt ist die genomische DNA-Sequenz von IGF1 im Bereich der mRNA > chr12:101315008 – 101376808 (reverse complement). Dabei sind die Intron-Sequenzen in dunkelgrau, die Codierungssequenz (cds) für das gentherapie- bzw. dopingrelevante Protein in schwarz, der Sinn-Primer fettgedruckt und der Gegensinn-Primer ist unterstrichen und nicht fett dargestellt. ¹ steht für den Anfang oder das Ende von Primer 1, ² steht für den Anfang oder das Ende von Primer 2.
Die entsprechenden mRNAs für die verschiedenen IGF1-Varianten sind folgende:
Die abgeleiteten beispielhaften PCR-Primer zur Amplifizierung der IGF1-tDNA sind in der nachstehenden Tabelle 5 zusammengestellt.
Tabelle 5: Beispiele für IGF1-Primer.

„s" bedeutet Sinn-Primer, „gs" bedeutet Gegensinn-Primer; IGF bedeutet Insulin-like-Growth-Factor.

3.4.1 Pre-PCR
Im Rahmen einer Multiplex-PCR wird das PCR-Produkt IGF1-Pre erhalten, wozu die Primer IGFs1 (Sinn-Primer) in einer Konzentration von 0,3 μM und IGF1gs1 (Gegensinn-Primer) und IGFs1-II (Gegensinn-Primer) in einer Konzentration von jeweils 0,2 μM eingesetzt werden.
3.4.2 Sekundär-PCR
Das PCR-Produkt IGF1-1 für die Proteine P01343 und P05019, das bei Verwendung der Primer IGF1s2 (Sinn-Primer) und IGF1gs2 (Gegensinn-Primer), die jeweils in einer Konzentration von 0,3 μM eingesetzt werden, erhalten wird, weist eine Länge von 169 Basenpaaren auf.
Das PCR-Produkt IGF1-2 für das Protein Q14620, das unter Verwendung der Primerpaare IGF1s2-II (Sinn-Primer) und ISF1gs2 (Gegensinn-Primer) in einer Konzentration von jeweils 0,3 μM erhalten wird, weist eine Länge von 170 bp auf.
3.5 Primer für den Nachweis von Gentherapie oder Doping mit IGF2-tDNA
6 zeigt die Exon-Intron-Struktur der Referenz mRNA-Sequenz für IGF2. Die gesamte mRNA-Referenzsequenz ist prinzipiell für die Konstruktion von intronübergreifenden Primern geeignet. Die hellen Kästen zeigen, welche Bereiche hier exemplarisch für die Konstruktion von Primern verwendet wurden.
Die Exon-Intron-Übergänge zwischen den Exons 2 bis 4 liegen in der proteincodierenden Sequenz (cds) und sind somit für die Konstruktion intronübergreifender Primer besonders geeignet. Das Exon 1 ist komplett nicht-codierende Sequenz und somit nicht für eine Expression des Proteins maßgeblich. Dieser Sequenzbereich wurde deshalb bei der Auswahl der Primer ausgespart.
Dargestellt ist die genomische DNA-Sequenz von IGF2 im Bereich der mRNA > chr11:2110105 – 2113505 (reverse complement). Dabei sind die Intron-Sequenzen in dunkelgrau, die Codierungssequenz (cds) für das gentherapie- oder dopingrelevante Protein in schwarz, der Sinn-Primer fettgedruckt und der Gegensinn-Primer ist unterstrichen und nicht fett dargestellt. ¹ steht für den Anfang oder das Ende von Primer 1, ² steht für den Anfang oder das Ende von Primer 2.
Die abgeleiteten beispielhaften PCR-Primer zur Amplifizierung der IGF2-tDNA sind in der nachstehenden Tabelle 6 zusammengestellt.
Tabelle 6: Beispiele für IGF2-Primer.

3.5.1 Pre-PCR
Das PCR-Produkt IGF1-1, das im Rahmen der Pre-PCR unter Verwendung der Primer IGF2s1 (Sinn-Primer) und IGF2gs1 (Gegensinn-Primer) mit einer Konzentration von jeweils 0,3 μM erhalten wird, weist eine Länge von 177 bp auf.
3.5.2Sekundär-PCR
Das PCR-Produkt IGF1-2, das im Rahmen der genspezifischen Sekundär-PCR unter Verwendung der Primer IGF2s2 (Sinn-Primer) und IGF2gs2 (Gegensinn-Primer) mit einer Konzentration von jeweils 0,3 μM erhalten wird, weist eine Länge von 162 bp auf.
3.6 Primer für den Nachweis von Gentherapie oder Doping mit Myogenin-tDNA
7 zeigt die Exon-Intron-Struktur der Referenz mRNA-Sequenz für das einzig bekannte Protein von Myogenin (MYOG). Die gesamte mRNA-Referenzsequenz ist somit prinzipiell für die Konstruktion intronübergreifender Primer geeignet. Die hellen Kästen zeigen, welche Bereiche hier exemplarisch für die Konstruktion von Primern verwendet wurden.
Dargestellt ist die genomische DNA-Sequenz von MYOG im Bereich der mRNA > chr1:201318883 – 201321789 (reverse complement). Dabei sind die Intron-Sequenzen in dunkelgrau, die Codierungssequenz (cds) für das gentherapie- oder dopingrelevante Protein in schwarz, der Sinn-Primer fettgedruckt und der Gegensinn-Primer ist unterstrichen und nicht fett dargestellt. ¹ steht für den Anfang oder das Ende von Primer 1, ² steht für den Anfang oder das Ende von Primer 2.
Nachfolgend dargestellt ist die mRNA von Myogenin:
Die abgeleiteten beispielhaften PCR-Primer zur Amplifizierung der Myogenin-tDNA sind in der nachstehenden Tabelle 7 zusammengestellt.
Tabelle 7: Beispiele für MYOG-Primer.

„s" bedeutet Sinn-Primer, „gs" bedeutet Gegensinn-Primer; MYOG bedeutet Myogenin.

3.6.1 Pre-PCR
Das PCR-Produkt MYOG-1, das im Rahmen der Pre-PCR unter Verwendung der Primer MYOGs1 (Sinn-Primer) und MYOGgs1 (Gegensinn-Primer) bei einer Konzentration von je 0,3 μM erhalten wird, weist eine Länge von 100 bp auf.
3.6.2
Das PCR-Produkt MYOG-2, das im Rahmen der genspezifischen Sekundär-PCR unter Verwendung der Primer MYOGs1 (Sinn-Primer) und MYOGgs2 (Gegensinn-Primer) bei einer Konzentration von je 0,3 μM erhalten wird, weist eine Länge von 93 bp auf.
3.7 Primer für den Nachweis einer Gentherapie oder eines Dopings mit Peroxisom-Proliferator-aktivierter-Rezeptor-delta-tDNA
8 zeigt die Exon-Intron-Struktur der beiden Referenz-mRNA-Sequenzen für die bekannten Proteinvarianten von Peroxisom-Proliferator-aktivierter-Rezeptor-delta (PPARd). Nur die Exon-Intron-Übergänge zwischen den Exons 1 bis 7 sind bei den beiden Varianten konserviert und können für die Konstruktion von intronübergreifenden Primern genutzt werden. Die hellen Kästen zeigen, welche Bereiche hier exemplarisch für die Konstruktion von Primern verwendet wurden.
Primer für die PCR für die Varianten Q03181 und Q03181-2:
Dargestellt ist die genomische DNA-Sequenz von PPARd im Bereich der mRNA > chr6:35418313 – 35503933. Dabei sind die Intron-Sequenzen und untranslatierte Bereiche in dunkelgrau, die Codierungssequenz (cds) für das dopingrelevante Protein in schwarz, die cds, die in Q03181-2 nicht vorhanden ist, ist kursiv dargestellt, der Sinn-Primer fettgedruckt und der Gegensinn-Primer ist unterstrichen und nicht fett dargestellt. ¹ steht für den Anfang oder das Ende von Primer 1, ² steht für den Anfang oder das Ende von Primer 2.
Anschließend dargestellt sind die mRNAs für Varianten von humanem PPARd:
Die abgeleiteten beispielhaften PCR-Primer zur Amplifizierung der PPARd-tDNA sind in der nachstehenden Tabelle 8 zusammengestellt.
Tabelle 8: Beispiele für PPARd-Primer.

„s" bedeutet Sinn-Primer, „gs" bedeutet Gegensinn-Primer; PPARd bedeutet Peroxisom-Proliferator-aktivierter-Rezeptor-delta.

3.7.1 Pre-PCR
Das PCR-Produkt PPARD-1, das im Rahmen der Pre-PCR unter Verwendung der Primer PPARDs1 (Sinn-Primer) und PPARDgs1 (Gegensinn-Primer) bei einer Konzentration von jeweils 0,3 μM erhalten wird, weist eine Länge von 322 bp auf.
3.7.2 Sekundär-PCR
Das PCR-Produkt PPARD-2, das im Rahmen der genspezifischen Sekundär-PCR unter Verwendung des Primerpaars PPARDs2 (Sinn-Primer) und PPARDgs2 (Gegensinn-Primer) bei einer Konzentration von jeweils 0,3 μM für die Proteine P01343 und P05019 erhalten wird, weist eine Länge von 309 bp auf.
3.8 Primer für den Nachweis von Gentherapie oder Doping mit Calcineurin-A-alpha-tDNA
9 zeigt die Exon-Intron Struktur der beiden Referenz-mRNA-Sequenzen für die bekannten Proteinvarianten von Calcineurin A alpha (PPP3CA), die sich nur ab Exon 13 unterscheiden. Die konservierten Exon-Intron-Übergänge zwischen den Exons 7 bis 12 werden im untenstehenden Fall genutzt, um Sinn- und Gegensinn-Primer zu konstruieren. Im Exon 14 befindet sich der Sequenzbereich 1802 bis 1868 bp bezogen auf die Referenzsequenz NM_000944.2, der bei Gentherapie- oder Dopinganwendungen deletiert oder verändert wird. Dieser Bereich wird deshalb bei der Konstruktion von Primern ausgespart.
Dargestellt ist die genomische DNA-Sequenz von PPP3CA im Bereich der mRNA > chr4:102301765 – 102625531 (reverse complement). Dabei sind die Intron-Sequenzen, die Codierungssequenz (cds) für das gentherapie- oder dopingrelevante Protein in schwarz, der bei Doping modifizierte Sequenzbereich 1802 bis 1868 ist kursiv dargestellt, der Sinn-Primer fettgedruckt und der Gegensinn-Primer ist unterstrichen und nicht fett dargestellt, Sequenzen, die sowohl als Sinn- als auch als Gegensinn-Primer verwendet werden, sind fett und unterstrichen dargestellt. ¹ steht für den Anfang oder das Ende von Primer 1, ² steht für den Anfang oder das Ende von Primer 2.
Nachstehend dargestellt ist die mRNA für PPP3CA:
Die abgeleiteten beispielhaften PCR-Primer zur Amplifizierung der PPP3CA-tDNA sind in der nachstehenden Tabelle 9 zusammengestellt.
Tabelle 9: Beispiele für PPP3CA-Primer.

„s" bedeutet Sinn-Primer, „gs" bedeutet Gegensinn-Primer; PPP3CA bedeutet Protein-Phosphatase-3-(ursprünglich 2B), katalytische Untereinheit, Alpha-Isoform (Calcineurin A alpha) (PPP3CA).

3.8.1Pre-PCR
Das PCR-Amplifikat PPP3CA-1, das im Rahmen der Pre-PCR unter Verwendung der Primer PPP3CAs1 (Sinn-Primer) und PPP3CAgs3 (Gegensinn-Primer) bei einer Konzentration von jeweils 0,3 μM erhalten wird, weist eine Länge von 410 bp auf.
3.8.2
Das PCR-Amplifikat PPP3CA-2, das im Rahmen der genspezifischen Sekundär-PCR unter Verwendung der Primer PPP3CAs1 (Sinn-Primer) und PPP3CAgs1 (Gegensinn-Primer) bei einer Konzentration von jeweils 0,3 μM erhalten wird, weist eine Länge von 120 bp auf.
Das PCR-Amplifikat PPP3CA-2, das im Rahmen der genspezifischen Sekundär-PCR unter Verwendung der Primer PPP3CAs2 (Sinn-Primer) und PPP3CAgs2 (Gegensinn-Primer) bei einer Konzentration von jeweils 0,3 μM erhalten wird, weist eine Länge von 222 bp auf.
Das PCR-Amplifikat PPP3CA-3, das im Rahmen der genspezifischen Sekundär-PCR unter Verwendung der Primer PPP3CAs3 (Sinn-Primer) und PPP3CAgs3 (Gegensinn-Primer) bei einer Konzentration von jeweils 0,3 μM erhalten wird, weist eine Länge von 115 bp auf.
3.9 Primer für den Nachweis von Gentherapie oder Doping mit Vascular-Endothelial-Growth-Factor-tDNA
10 zeigt die Exon-Intron-Struktur der neun Referenz-mRNA-Sequenzen für die bekannten dopingrelevanten Protein varianten von Vascular-Endothelial-Growth-Factor (VEGF). Nur der Exon-Intron-Übergang zwischen Exon 1 bis Exon 5 ist vollständig konserviert und wird im Anwendungsbeispiel zur Generierung von intronübergreifenden PCR-Primern genutzt.
Dargestellt ist die genomische DNA-Sequenz von VEGF im Bereich der mRNA > chr7:99963074 – 99965972. Dabei sind die Intron-Sequenzen, die Codierungssequenz (cds) für das gentherapie- oder dopingrelevante Protein in schwarz, der Sinn-Primer fettgedruckt und der Gegensinn-Primer ist unterstrichen und nicht fett dargestellt, Sequenzen, die sowohl als Sinn- als auch als Gegensinn-Primer verwendet werden sind fett und unterstrichen dargestellt. ¹ steht für den Anfang oder das Ende von Primer 1, ² steht für den Anfang oder das Ende von Primer 2.
Nachfolgend dargestellt ist die mRNA codierend für humanen VEGF:
Die abgeleiteten beispielhaften PCR-Primer zur Amplifizierung der VEGF-tDNA sind in der nachstehenden Tabelle 10 zusammengestellt.
Tabelle 10: Beispiele für VEGF-Primer.

„s" bedeutet Sinn-Primer, „gs" bedeutet Gegensinn-Primer; VEGF steht für Vascular-Endothelial-Growth-Factor.

3.9.1 Pre-PCR
Das PCR-Amplifikat VEGF1-3, das im Rahmen der Pre-PCR unter Verwendung der Primer VEGFs1 (Sinn-Primer) und VEGFgs3 (Gegensinn-Primer) mit einer Konzentration von je 0,3 μM erhalten wird, weist eine Länge von 353 bp auf.
3.9.2 Sekundär-PCR
Das PCR-Amplifikat VEGF1, das im Rahmen der genspezifischen Sekundär-PCR unter Verwendung der Primer VEGFs1-II (Sinn-Primer) und VEGFgs1 (Gegensinn-Primer) mit einer Konzentration von je 0,3 μM erhalten wird, weist eine Länge von 80 bp auf.
Das PCR-Amplifikat VEGF2, das im Rahmen der genspezifischen Sekundär-PCR unter Verwendung der Primer VEGFs2 (Sinn-Primer) und VEGFgs2 (Gegensinn-Primer) mit einer Konzentration von je 0,3 μM erhalten wird, weist eine Länge von 220 bp auf.
Das PCR-Amplifikat VEGF3, das im Rahmen der genspezifischen Sekundär-PCR unter Verwendung der Primer VEGFs3 (Sinn-Primer) und VEGFgs3 (Gegensinn-Primer) mit einer Konzentration von je 0,3 μM erhalten wird, weist eine Länge von 97 bp auf.
Das PCR-Amplifikat VEGF1-3-II, das im Rahmen der genspezifischen Sekundär-PCR unter Verwendung des Primerpaars VEGFs1-II (Sinn-Primer) und VEGFgs3-2 (Gegensinn-Primer) erhalten wird, weist eine Länge von 340 bp auf.
Beispiel 5: Zusammenstellung von Gentherapie- oder Gendoping-Testkits
Mit Hilfe der PCR-Primer, die aus Beispiel 4 gewonnen werden, wird ein Gentherapie- oder Gendoping-Testkit hergestellt. Die Testkits dienen jeweils zum Nachweis einer spezifischen tDNA. Sie unterscheiden sich deshalb in den jeweils für die nachzuweisende tDNA spezifischen Primerpaaren für die Lösungen 1 bis 3, den jeweils zugehörigen Produkten 1 bis 3, in den Kontrollen 1 bis 3 und den Sequenzen der Sinn-Primer 1 bis 3.
Nachfolgend ist beispielhaft die Zusammensetzung eines Gentherapie- oder GendopinTestkits für 50 Tests (A- und B-Probe) auf Gendoping mittels EPO-tDNA dargestellt:
Lösung 1 (350 μl):

EPOs1: 3,0 μM
EPOgs3: 3,0 μM
In 350 μl Reinstwasser PCR-grade

Lösung 2 (350 μl):

EPOs1-II: 3,0 μM
EPOgs1: 3,0 μM
In 350 μl Reinstwasser PCR-grade

Lösung 3 (350 μl):

EPOs2+3: 3,0 μM
EPOgs2: 3,0 μM
In 350 μl Reinstwasser PCR-grade

Lösung 4 (350 μl):

EPOs2+3: 3,0 μM
EPOgs3II: 3,0 μM
In 350 μl Reinstwasser PCR-grade

Lösung 5 (350 μl):

EPOs1-II: 3,0 μM
EPOgs3-II: 3,0 μM
In 350 μl Reinstwasser PCR-grade

Lösung 6 (2 ml):

PCR-Produkt EP01-3 cDNA 0,4 fg (Femtogramm) in 1 ml Reinstwasser PCR-grade entsprechend einer Kopie EPO1-3 cDNA in einem μl.

Lösung 7 (3 ml):

Humane Gesamt-DNA aus Vollblut 6 mg in 3 ml entsprechend etwa 5,6 × 10⁵ Molekülen DNA in einem μl.

Lösung 8 (5,6 ml):

70 U HotStarTaq^TM DNA Polymerase (Qiagen, Hilden, Germany) 28 μl 10x HotStarTaq^TM DNA Polymerase 10x PCR Puffer 560 μl ATP, TTP, GTP, CTP PCR-grade (Preqlab, Germany) je 10 mM 112 μl 25 mM Magnesium Chlorid 112 μl
Reinstwasser PCR-grade 4788 μl

Lösung 9 (100 μl):

10 μM EPOs1-II in 100 μl Reinstwasser PCR-grade

Lösung 10 (100 μl):

10 μM EPOs2+3 in 100 μl Reinstwasser PCR-grade

Lösung 11 (100 μl):

10 μM EPOs3-II in 100 μl Reinstwasser PCR-grade

Lösung 12 (20ml):

Reinstwasser PCR-grade 20 ml

Beispiel 6: Durchführung des Verfahrens
6.1 Probenentnahme
Einer zu testenden Person wird eine ausreichende Menge von nichtbioptischem Material entnommen, die eine Konzentration von ca. 50 μg Gesamt-DNA enthält. Dies entspricht bspw. 8 bis 10 ml Vollblut, die durch Punktion einer peripheren Vene abgenommen werden. Ein solches Vorgehen entspricht den Richtlinien der WADA (World Antidoping Agency) für Dopingtests. Bei anderen nichtbioptischen Proben, wie bspw. Urin, muss ggf. eine Aufkonzentrierung der Probe mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren erfolgen.
6.2 DNA-Isolierung (am Beispiel Vollblut)
Aus 8-10 ml Vollblut wird nach ordnungsgemäßer Lagerung und Transport die DNA isoliert und in 150 μl Reinstwasser PCR-grade aufgenommen. Die so gewonnene DNA aus einer Blutprobe (DNABP) weist bei regelrechter Isolierung etwa eine Konzentration zwischen 1,4 und 3,0 μg/μl entsprechend etwa 4,0 bis 8,0 × 10⁵ /μl Molekülen DNA (Kopien gDNA) auf und reicht für die Erstellung von A- und B-Probentests mit vier unterschiedlichen Gendoping-Testkits aus.
6.3 PCR-Reaktionen
Es werden PCRs mit den unterschiedlichen Testkits und der DNABP-Probe sowie den Kontrollen 1 bis 3 wie folgt durchgeführt:
Pre-PCRs:
I) Probandenprobe:

In einem PCR-Tube 5 μl Wasser PCR-grade + 15 μl DNABP + 5 μl Lösung 1 + 25 μl Testkit-Lösung 8

II) Negativ Kontroll-PCR:

In einem PCR-Tube 5 μl Wasser PCR-grade + 15 μl Lösung 7 + 5 μl Lösung 1 + 25 μl Testkit-Lösung 8

III) Positiv Kontroll-PCR:

In einem PCR-Tube 5 μl Lösung 6 + 15 μl Lösung 7 + 5 μl Lösung 1 + 25 μl Testkit-Lösung 8

Sekundär-PCRs:
Die folgenden Sekundär-PCRs werden jeweils für die Pre-PCRs I-III laufen gelassen:

EPO1 für I-III: In je einem PCR-Tube 1 μl PCR-Produkt 1, II oder III + je 5 μl Lösung 2 + je 25 μl Testkit-Lösung 8 und je 19 μl Wasser PCR-grade
EPO2 für I-III: In je einem PCR-Tube 1 μl PCR-Produkt 1, II oder III + je 5 μl Lösung 3 + je 25 μl Testkit-Lösung 8 und je 19 μl Wasser PCR-grade
EPO3 für I-III: In je einem PCR-Tube 1 μl PCR-Produkt 1, II oder III + je 5 μl Lösung 4 + je 25 μl Testkit-Lösung 8 und je 19 μl Wasser PCR-grade
EPO1-3-II für I-III: In je einem PCR-Tube 1 μl PCR-Produkt 1, II oder III + je 5 μl Lösung 5 + je 25 μl Testkit-Lösung 8 und je 19 μl Wasser PCR-grade

Die insgesamt 15 PCRs (3 Pre- und 12 Sekundär-PCRs) werden unter folgenden Konditionen in einem geeigneten Thermocyc ler laufen gelassen. Als geeignet für das untenstehende Protokoll gilt ein Thermocycler mit einer temperature ramp-rate von mindestens 2°C pro Sekunde.
PCR-Konditionen für das Beispiel:
Pre-PCR und Sekundär-PCR: Aktivierung bei 95°C über 15 min, gefolgt von 35 Zyklen mit jeweils 25 sec Annealing bei 59°C, 30 sec Extension bei 72°C und Denaturierung bei 94°C für 15 sec.
6.4 Gelelektrophorese
Mit den 12 Post-PCR-Produkten wird eine gelelektrophoretische Auftrennung mit DNA-Färbung nach Standardprotokollen durchgeführt, indem bis zu 25 μl der jeweiligen Probe verwandt werden. Der Test (A-Probe) gilt dann als positiv, wenn bei einer der 4 Sekundär-PCRs zu I aus der Pre-PCR eine Bande auftritt, deren Lage mit ihrer zugehörigen Positiv-Kontrollbande aus II aus der Pre-PCR und mit der bekannten Lage auf Grund der bekannten Masse für EPO1, EPO2, EPO3 oder EPO1-3-II übereinstimmt. Gleichzeitig müssen alle Negativkontrollen (Sekundär-PCRs zu III) negativ sein.
6.5 B-Probe und Sequenzierung
Eine B-Probe kann entsprechend einer Wiederholung der Pre- und Sekundär-PCRs bei Bedarf durchgeführt werden. Sollte sich das Auftreten der Bande(n) aus der Patientenprobe reproduzieren lassen, können die übrig gebliebenen Volumina der positiven PCRs wie folgt mit den Lösungen 9-11 versetzt und anschließend sequenziert werden:

EPO1 mit Lösung 9 (9 μl EPO1 + 1 μl Lösung 9)
EPO2 mit Lösung 10 (9 μl EPO1 + 1 μl Lösung 10)
EPO3 mit Lösung 11 (9 μl EPO1 + 1 μl Lösung 11)
EPO1-3II mit Lösung 9 (9 μl EPO1 + 1 μl Lösung 9)

6.6 Anwendungsbeispiel für den Nachweis von EPO-tDNA
Im Folgenden wird ein Negativ- und Positiv-Kontrollversuch beschrieben, der mit dem Testkit zum Nachweis von Gendoping mittels EPO-tDNA durchgeführt wurde.
6.6.1 PCR-Reaktionen:
Pre-PCRs:
Positiv-Kontroll-PCRs in 5 Verdünnungsstufen (cDNA/gDNA):

I) In einem PCR-Tube 2 μl Lösung 6 + 18 μl Lösung 7 + 5 μl Lösung 1 + 25 μl Testkit-Lösung 8 Entsprechend 2 Kopien cDNA auf 10 Mio. Kopien gDNA
II) In einem PCR-Tube 2 μl Lösung 6 + 3,6 μl Lösung 7 + 14,4 μl Wasser PCR-grade + 5 μl Lösung 1 + 25 μl Testkit-Lösung 8 Entsprechend 2 Kopien cDNA auf 2 Mio. Kopien gDNA
III) In einem PCR-Tube 4 μl Lösung 6 + 1,8 μl Lösung 7 + 14,2 μl Wasser PCR-grade + 5 μl Lösung 1 + 25 μl Testkit-Lösung 8 Entsprechend 4 Kopien cDNA auf 1 Mio. Kopien gDNA
IV) In einem PCR-Tube 10 μl Lösung 6 + 0,9 μl Lösung 7 + 9,1 μl Wasser PCR-grade + 5 μl Lösung 1 + 25 μl Testkit-Lösung 8 Entsprechend 10 Kopien cDNA auf 500.000 Kopien gDNA

Negativ-Kontroll-PCR:

V) In einem PCR-Tube 2 μl Wasser PCR-grade + 18 μl Lösung 7 + 5 μl Lösung 1 + 25 μl Testkit-Lösung 8 Entsprechend 0 Kopien cDNA auf 10 Mio. Kopien gDNA

Erwartete PCR-Produkte I-V: EPO1-3 (437 bp)
Sekundär-PCRs:
Die folgenden Sekundär-PCRs werden jeweils für die Pre-PCRs I-V laufen gelassen:

1 für I-V: In je einem PCR-Tube 1 μl PCR-Produkt 1, II oder III + je 5 μl Lösung 2 + je 25 μl Testkit-Lösung 8 und je 19 μl Wasser PCR-grade

Erwartete PCR-Produkte I1-V1: EPO1 (169 bp)

2 für I-V: In je einem PCR-Tube 1 μl PCR-Produkt 1, II oder III + je 5 μl Lösung 3 + je 25 μl Testkit-Lösung 8 und je 19 μl Wasser PCR-grade

Erwartete PCR-Produkte I2-V2: EPO2 (109 bp)

3 für I-V: In je einem PCR-Tube 1 μl PCR-Produkt 1, II oder III + je 5 μl Lösung 4 + je 25 μl Testkit-Lösung 8 und je 19 μl Wasser PCR-grade

Erwartete PCR-Produkte I3-V3: EPO3 (289 bp)

4 für I-V: In je einem PCR-Tube 1 μl PCR-Produkt 1, II oder III + je 5 μl Lösung 5 + je 25 μl Testkit-Lösung 8 und je 19 μl Wasser PCR-grade

Erwartete PCR-Produkte I4-V4: EPO1-3II (423 bp)
Die Insgesamt 15 PCRs (3 Pre- und 12 Sekundär-PCRs) werden unter folgenden Konditionen in einem geeigneten Thermocycler laufen gelassen. Als geeignet für das untenstehende Protokoll gilt ein Thermocycler mit einer temperature ramp-rate von mindestens 2°C pro Sekunde
Konditionen:
Pre-PCR und Sekundär-PCR: Aktivierung bei 95°C über 15 min, gefolgt von 35 Zyklen mit jeweils 25 sec Annealing bei 59°C, 30 sec Extension bei 72°C und Denaturierung bei 94°C für 15 sec.
6.6.2 Gelelektrophorese
Das Ergebnis der gelelektrophoretischen Auftrennung der PCR-Produkte der Pre-PCR (A) und der zugehörigen Sekundär-PCR-Produkte (B und C) auf einem 1,5%igen Agarosegel ist in 11 gezeigt.
Pre- und Sekundär-PCR wurden mit dem Protokoll für den Testkit-Prototypen wie beschrieben durchgeführt. Man erkennt auf Gel A eine steigende Ausbeute an dem PCR-Produkt „EPO1-3" mit der erwarteten Größe von 437 bp von I-V. Die Negativkontrolle (V) war für alle 4 Sekundär-PCR-Produkte negativ (B).
In C sieht man die Sekundär-PCR Produkte I1-IV1 entsprechend „EPO1" (169 bp), I2-IV2 entsprechend „EPO2" (109 bp), I3-IV3 entsprechend „EPO3" (289 bp) sowie I4-IV4 entsprechend „EPO1-3II" (423 bp). Man erkennt, dass insbesondere für eine sichere Detektion des PCR-Produktes und eine evtl. nachfolgende Sequenzierung die alleinige Pre-PCR, die in diesem Beispiel 35 Zyklen umfasste, für eine Detektion nicht ausreicht, wenn die gDNA hochverdünnt vorliegt (in A, Linien I-III). Mit nachfolgender Sekundär-PCR sind unter den gegebnen Protokollbedingungen die großen PCR-Produkte EPO1-3II in I4-IV4 gut beurteilbar und für eine Sequenzierung in ausreichender Menge vorhanden (> 100 ng dsDNA).

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zum Nachweis von transgener DNA (tDNA) in einem Lebewesen, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellung einer aus dem Lebewesen stammenden biologischen Probe, (2) Untersuchung der biologischen Probe auf das Vorhandensein von tDNA, und (3) Korrelation eines positiven Befundes in Schritt (2) mit dem positiven Nachweis von tDNA in dem Lebewesen, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe eine nichtbioptische Probe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die nichtbioptische Probe eine Blutprobe ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (2) mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein solches PCR-Primerpaar verwendet wird, bei dem der Gegensinn-PCR-Primer derart gestaltet ist, dass dieser an ein solches Exon der tDNA hybridisiert, das stromabwärts zu dem Exon der tDNA liegt, an das der Sinn-PCR-Primer hybridisiert.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR mittels intronübergreifenden PCR-Primern durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der PCR-Primer derart gestaltet ist, dass er an solchen Übergangsbereichen zwischen zwei Exons hybridisiert, die innerhalb von Splice-Varianten des Genes, von dem sich die Codierungssequenz der tDNA ableitet, konserviert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine verschachtelte PCR (nested PCR) durchgeführt wird, die eine Pre-PCR und eine anschließende Sekundär-PCR umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine solche tDNA nachgewiesen werden soll, die für dopingrelevante oder für solche Proteine codiert, die für die Durchführung einer somatischen Gentherapie von Bedeutung sind.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Erythropoietin (EPO), Wachstumshormon 1 (GH1), Wachtumshormon 2 (GH2), Insulin-like-growth-factor-1 (IGF1), Insulin-like-growth-factor-2 (IGF2), Myogenin, Peroxisom-Proliferator-aktivierter-Rezeptor-delta (PPARd), Calcineurin-A-alpha, Vascular-endothelial-growth-factor (VEGF), Chorionic-somatomammo-tropin-Hormon 1 (CSH1), Chorionicsomatomammo-tropin-Hormon 1/2 (CSH1/CSH2), Chorionicsomatomammo-tropin-Hormon 2 (CSH2), Chorionic-somatomammotropin-Hormon-like 1 (CSHL1), und Myostatininhibitor.
Kit, der eine Vorschrift zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 sowie ggf. Reagenzien, Lösungen, Reaktionsbehälter und weitere zur Durchführung des Verfahrens vorteilhafte Substanzen und Gegenstände aufweist.