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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, welches insbesondere
dazu bestimmt ist, spezielle Sequenzen aus DNA-Banken zu eliminieren.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft genauer gesagt ein Verfahren, welches
dazu bestimmt ist, wenigstens eine spezielle, insbesondere häufig vorkommende
Sequenz aus einer cDNA-Bank zu eliminieren.
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Die
Schrotschuss-Sequenzierung von cDNA-Klonen wird seit mehreren Jahren
als Mittel zum Erhalten von differenziellen Expressionsprofilen
sowie zur Entdeckung von neuen Sequenzen eingesetzt. Typischerweise
handelt es sich darum, die Messenger-RNAs (mRNA) aus Zellen oder
bestimmten Geweben zu extrahieren, die entsprechenden cDNAs zu klonieren,
anschließend
zufällig
Klone auszuwählen,
welche sequenziert werden. Wenn das Ziel die Suche von neuen Sequenzen
ist, wird der Vorgang der vollständigen
Sequenzierung einer cDNA-Bank aufgrund der Redundanz der mRNA-Population
kostspielig. Wenn je nach den Geweben 15000 bis 50000 mRNA-Molekülspezies
exprimiert werden, repräsentieren
diese in der Tat insgesamt 200 bis 500000 Moleküle in den Zellen (Davidson
und Britten, 1979).
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In
den Zellen werden die Messenger je nach den Molekülspezies
mit unterschiedlichen Raten exprimiert. So können 10 bis 20 Molekülspezies
10 bis 20 % der mRNA-Moleküle
repräsentieren.
Zahlreiche Autoren haben die Redundanz der Banken untersucht und
gezeigt, dass in bestimmten Fällen
eine einzige Molekülspezies
mehr als 20 % der Klone zuzurechnen sein kann. Um diese Angaben
zu präzisieren,
haben die Erfinder in mehreren menschlichen Geweben die Redundanz
von mRNA-Sequenzen untersucht. Zu diesem Zweck haben sie die Sequenzen
von zufällig
aus 5'-Enden-Banken
ausgewählten
Klonen in Ähnlichkeitsgruppen
eingeteilt.
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Für 2 bis
3000 sequenzierte Klone betragen die Fraktionen von Klonen, die
zu Ähnlichkeitsgruppen gehören, die
10 Sequenzen oder mehr enthalten, 39 %, 6,8 %, 22 %, 54 %, 34 %,
46 %, 27 %, 27 %, 7 %, 39 % für
Gewebe oder Zellen wie Plazenta, Hirn, Milz, Pankreas, Dickdarm,
Lymphozyten, Leber, Niere, Eierstock bzw. Herz (Tabelle I).
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Tabelle
I: Häufigkeitsprofil
der am häufigsten
repräsentierten
Klone von markierten cDNA-Banken. Die Banken werden konstruiert
ausgehend von Messenger-RNAs von: Pankreas, Milz, Dickdarm, Lymphozyt,
Niere, dystrophischem Muskel, Leber, Eierstock und Hirn. Die Tabelle
zeigt die Verteilung der am häufigsten
repräsentierten
15, 20 oder 30 Klone in jeder unserer Banken.
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Somit
können
die Kosten einer neuen Sequenz sehr erheblich sein; in der Tat sind
im Laufe einer Sequenzierung sehr schnell zwischen einem Viertel
und der Hälfte
der Sequenzen bereits bestimmt worden. Für jede Sequenz besteht folglich
eine Wahrscheinlichkeit zwischen 50 und 75 %, dass diese Sequenz
bereits erhalten wurde. Um die Kosten von neuen Sequenzen zu begrenzen,
wurden verschiedene Lösungen
vorgeschlagen.
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Die
erste besteht darin, die cDNA-Banken oder die Ausgangs-mRNA-Population
zu normalisieren. Dies bedeutet, die Häufigkeit der häufig vorkommenden
Sequenzen derart zu verringern, dass sie der Häufigkeit der seltenen Sequenzen
nahe kommt. Es wurden verschiedene Normalisierungsverfahren vorgeschlagen. Eines
von ihnen besteht darin, genomische DNA als Normalisierungsmatrix
zu verwenden (Weisman, 1987). In diesem Fall sollte die Verteilung
der cDNA-Klone mit der Anzahl der Exons des Gens korreliert sein.
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Das
am häufigsten
eingesetzte Normalisierungsverfahren beruht auf der Kinetik der
Hybridisierung. Wenn eine Population von Nukleinsäuren denaturiert
ist, ist die Geschwindigkeit der Renaturierung (oder des Wiederauftretens
von Molekülen)
proportional zur Anzahl der vorhandenen Molekülspezies. Mit anderen Worten,
je häufiger
eine Molekülspezies
in einer cDNA-Population vorhanden ist, desto schneller werden die
entsprechenden cDNA-Moleküle
renaturiert (Britten et al., 1974; Young & Anderson, 1985). Die technische
Hauptschwierigkeit dieser Vorgehensweise ist, die Populationen von
gepaarten Molekülen
von den Populationen von nicht gepaarten Molekülen korrekt zu trennen.
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Der
größte Teil
der Verfahren macht von einer Chromatographie an Hydroxyapatitharz
Gebrauch, welche die einzelsträngigen
Moleküle
und die doppelsträngigen
Moleküle
bei verschiedenen Phosphationenkonzentrationen freigibt (Patanjali
et al., 1991). Kürzlich
wurden Strategien vorgeschlagen, welche halbfeste Systeme zum Eliminieren
von DNA-DNA-Doppelsträngen oder
DNA-RNA-Heterodoppelsträngen
einsetzen (Sasaki et al., 1994). In diesem Fall werden die cDNAs
mit Hilfe von Primern synthetisiert, an welche Latexkügelchen
am 5'-Ende angehängt worden
sind. Die erhaltenen cDNA-Populationen werden als Hybridisierungsmatrix
mit einer mRNA-Population verwendet und die Heterodoppelstränge werden
durch Zentrifugation gesammelt.
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Alle
Methoden der Normalisierung durch Hybridisierung weisen die Einschränkung auf,
dass sie keine Unterscheidung zwischen geringfügig voneinander verschiedenen
Sequenzen zulassen. Kürzlich
hat Bento Soares (Soares et al., 1994; Soares & Efstratiadis, 1995) ein Verfahren
vorgeschlagen, das es gestattet, häufig vorkommende Sequenzen
aus cDNA-Banken zu entfernen. Dieses Verfahren beruht auf der Massenproduktion
von einzelsträngigen
Plasmiden einer cDNA-Bank, die durch am Poly-A-Schwanz der mRNA
verankertes Priming (amorçage
ancré sur
la queue poly-A des ARNm) erzeugt wird. Das so erhaltene definierte
Ende wird verwendet, um die Synthese von kurzen DNA-Segmenten an
der einzelsträngigen
Plasmidmatrix zu primen. Dies gestattet es, lokal doppelsträngige Moleküle zu erhalten.
Die geringe Größe des neu
synthetisierten Fragments (200 ± 20 nt) ist ein Vorteil bei
der Entfernungsstrategie, da die nichttranslatierten Sequenzen in
3' sehr viel unterschiedlicher
sind als die codierenden Sequenzen. Außerdem ist die Hybridisierungskinetik
für die
Gesamtheit der Plasmidpopulation einfacher, da alle Fragmente ungefähr die gleiche
Größe aufweisen.
Anschließend
erfolgt die Normalisierung der Bank durch Denaturieren der Doppelstränge und
durch Ausnützen
ihrer unterschiedlichen Rehybridisierungskinetiken. Die Trennung
von einzelsträngigen
zirkulären
Plasmiden und Heterodoppelsträngen
erfolgt anschließend
mittels Hydroxyapatitsäulen.
Anschließend
werden die einzelsträngigen
Plasmide durch Primerverlängerung
in Doppelstränge
umgewandelt und in Bakterien transfiziert. Dieses Verfahren weist
den Vorteil auf, dass die Hybridisierungspartner in äquimolaren
Anteilen vorliegen; im Gegensatz dazu weist es zwei Nachteile auf:
- 1) die Reinigung von nichtrekombinanten Klonen
- 2) für
eine gute Hybridisierung muss die Größe des ausgehend von einzelsträngigen zirkulären Plasmiden neu
synthetisierten Fragments ungefähr
200 nt betragen.
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Im
Fall der hier hergestellten 5'-Enden-Banken
beträgt
die mittlere Größe der Insertionen
200 bis 250 nt. Somit ist die Normalisierungsstrategie von Soares
schwierig anzuwenden.
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Die
zweite vorgeschlagene Lösung
zum Begrenzen der Kosten von neuen Sequenzen besteht darin, die
cDNA-Bank auf Filter zu übertragen
und die Filter mit Sonden zu hybridisieren, die den am häufigsten
vorkommenden Messengern entsprechen, und anschließend die
Klone, die nicht durch die Sonde identifiziert werden, in eine Mikrotiterplatte
zu übertragen.
Die Wahl der Gruppen der am häufigsten
vorkommenden Sequenzen kann nach einer Analyse von einigen Tausend
Klonen (Lanfranchi et al., 1985) oder auch unter Verwendung von
Sonden erfolgen, die aus Gesamt-cDNA, mitochondrialem Genom und/oder
einigen speziellen Klonen, die wegen ihres häufigen Vorkommens gewählt werden,
bestehen (Adams et al., 1995). Diese Vorgehensweise kann verführerisch
sein, da sie im Gegensatz zur Normalisierung aufgrund der Selektion
von nicht erkannten Klonen das Auffinden und anschließend das
Entfernen der Klone gestattet, die den am häufigsten vorkommenden Sequenzen
entsprechen.
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Die
Arbeitsschritte des Übertragens
der Klone auf den Filter und der Hybridisierung sind jedoch mühsam und
die Selektion der von den verwendeten Sonden nicht erkannten Klone
ist oft delikat (Hintergrundrauschen der Hybridisierung, genaue
Identifizierung der Klone, mögliche
Fehler bei der Rückübertragung
oder dem Umpflanzen der Bank).
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In
der vorliegenden Erfindung wird die Eliminierung durchgeführt, indem
die Plasmide, welche Insertionen aufweisen, die speziellen Zielsequenzen
unter den am häufigsten
vorkommenden entsprechen, unklonierbar gemacht werden. Dies wird
bewirkt durch selektives Lenken der Aktivität von Restriktionsenzymen auf die
zu eliminierenden Sequenzen. Die so linearisierten Klone sind nicht
mehr in der Lage, Bakterien zu transformieren.
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Aus
diesem Grund betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, welches
dazu bestimmt ist, spezifisch wenigstens eine Art von doppelsträngigem DNA-Plasmid
in einer Gesamtheit von Plasmiden, insbesondere im Fall der Erzeugung
einer Bank zu eliminieren, dadurch gekennzeichnet, dass:
- – man
Nukleinsäurefragmente
herstellt, welche in der Lage sind, dreifachsträngige Strukturen (Triplex-Strukturen)
zu bilden, und deren Sequenz einer Sequenz des zu eliminierenden
Plasmids, genauer gesagt einem Fragment der Sequenz der Gruppe der
zu eliminierenden Klone entspricht und außerdem eine Erkennungsstelle
für ein
gegenüber
Methylierung empfindliches Restriktionsenzym umfasst;
- – man
die Gesamtheit der Plasmide mit den Nukleinsäurefragmenten mischt, um Dreifachstränge mit
den zu eliminierenden Plasmiden zu bilden;
- – man
die erhaltene DNA-Mischung methyliert;
- – man
die Dreifachstränge
freigibt (dissoziieren lässt);
- – man
die erhaltene Mischung mit dem gegenüber Methylierung empfindlichen
Restriktionsenzym verdaut;
- – sofern
erforderlich, man die linearen doppelsträngigen DNAs, welche den zu
eliminierenden Plasmiden entsprechen, eliminiert oder abtrennt.
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In
einer ersten Ausführungsform
erfolgt die Bildung des Dreifachstrangs durch Hybridisierung eines präsynaptischen
Filaments mit der Zielsequenz in Gegenwart eines Proteins mit RecA-Aktivität.
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Dieses
Verfahren ist von der sogenannten "Achillesferse"-Strategie abgeleitet, die von Koob
et al. (1992) beschrieben ist, welche für lineare DNA-Sequenzen angewandt
wird.
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In
diesem Verfahren katalysiert die Anheftung eines Proteins, insbesondere
des RecA-Proteins,
an ein passendes einzelsträngiges
DNA-Molekül
die Bildung eines Dreifachstrangs zwischen der einzelsträngigen DNA
(Oligonukleotid) und einer entsprechenden doppelsträngigen DNA;
der so gebildete Dreifachstrang schützt die daran beteiligten Sequenzen
vor der Methylierung.
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Wenn
die Dreifachstränge
freigegeben (dissoziieren gelassen) werden, sind die entsprechenden nichtmethylierten
Sequenzen die einzigen, die für
die gewählten
spezifischen Restriktionsenzyme empfindlich sind. Man erhält somit
in der Mischung zirkuläre
Plasmide und lineare DNAs, die den Plasmiden entsprechen, welche
man zu eliminieren wünscht,
was auf verschiedene Weisen erfolgen kann, wie nachstehend ausführlich dargelegt
wird.
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Die
schematische Wiedergabe der auf zirkuläre plasmidische doppelsträngige DNA
von einer cDNA-Bank angewandten Erfindung ist in der 1 genauer
dargestellt.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist insbesondere brauchbar, wenn die Gesamtheit der Ausgangsplasmide
eine cDNA-Bank darstellt, wie bereits erwähnt wurde.
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Das
Verfahren ist insbesondere brauchbar zur Eliminierung eines Klons,
der eine spezielle bekannte Sequenz trägt.
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In
dem ersten Schritt, d. h. der Bildung des präsynaptischen Filaments, ist
es möglich,
das RecA-Protein zu verwenden, welches sich bekanntermaßen an einzelsträngige DNA (Oligonukleotid)
anheftet und das besagte präsynaptische
Filament bildet, aber es ist auch möglich, andere Proteine zu verwenden,
insbesondere ein sogenanntes Protein "mit RecA-Aktivität", welches nachstehend so definiert wird,
dass es in der Lage ist, an der Bildung eines präsynaptischen Filaments teilzuhaben,
welches die doppelsträngige
DNA-Zielsequenz durch Bildung eines Dreifachstranges mit dieser
vor der Methylierung schützt.
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Dieser
erste Schritt der Bildung des präsynaptischen
Filaments erfordert die Hydrolyse von ATP oder seinem modifizierten
Homologen ATP(γS).
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Es
versteht sich, dass die Auswahl der einzelsträngigen DNA, die zum Bilden
des präsynaptischen
Filaments (Oligonukleotids) verwendet wird, eines der Schlüsselelemente
der vorliegenden Erfindung darstellt, da es erforderlich ist, die
Sequenz dieses Oligonukleotids aus der (den) Sequenz(en) des Klons
(der Klone), die man zu eliminieren wünscht, auszuwählen, und
diese Sequenz muss eine Erkennungsstelle für ein "gegenüber Methylierung empfindliches" Restriktionsenzym
enthalten. Unter "gegenüber Methylierung
empfindliches Restriktionsenzym" versteht
man ein Restriktionsenzym, das seine Stelle erkennt, wenn diese
nicht methyliert ist. Unter den Enzymen, die verwendet werden können, sind
insbesondere die in der Tabelle II aufgeführten Enzyme und ganz besonders
die Enzyme HaeIII und MspI zu nennen.
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Die
zur Bildung des präsynaptischen
Filaments verwendeten Oligonukleotide sind vorzugsweise Oligonukleotide
sind vorzugsweise Oligonukleotide, die ungefähr 30 Nukleotide umfassen.
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TABELLE II
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LISTE DER
ENZYME DIE IN DEM VERFAHREN ZUR ELIMINIERUNG VON EINEM ODER MEHREREN SPEZIELLEN
INSBESONDERE HÄUFIG
VORKOMMENDEN KLONEN AUS EINER DNA-BANK VERWENDET WERDEN KÖNNEN
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(nicht-beschränkende Liste)
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I. Methylasen
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- – M.BamHI
- – M.EcoRI
- – M.pstI
- – M.ClaI
- – M.HaeIII
- – M.MspI
- – M.HhaI
- – M.HpaI
- – CpG-Methylase
(methyliert die C-Reste von Dinukleotiden (5'.....CG.....3'. Von den nachstehend aufgeführten Restriktionsenzymen
betrifft diese Methylase die folgenden: AciI, BstUI, ClaI, HhaI,
HinPI und MspI).
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II. 6-Basen-Restriktionsenzyme
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- – BamHI
- – EcoRI
- – PstI
- – ClaI
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III. 4-Basen-Restriktionsenzyme
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- – HaeIII
- – MspI
- – HhaI
- – HpaI
- – AciI
- – BstUI
- – HinPI
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In
dem zweiten Schritt wird das so gebildete präsynaptische Filament mit der
doppelsträngigen
DNA, im vorliegenden Fall den Plasmiden, in welche die Sequenzen
der Bank kloniert worden sind, unter Bedingungen gemischt, welche
das Bilden eines stabi len DNA-Dreifachstrangs gestatten, und dies
in Gegenwart von ATP(γS).
Die Reaktion wird auch in Gegenwart eines zweiwertigen Kations,
insbesondere Mg2++ durchgeführt.
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Das
RecA-Protein verändert
die Topologie der DNA-Doppelhelix und ermöglicht den Zugang des präsynaptischen
Filaments, im vorliegenden Fall des Oligonukleotids, zu seiner komplementären Sequenz
auf der doppelsträngigen
DNA der zu eliminierenden Klone. Der Komplex wird während dieses
Schritts stabilisiert.
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Es
ist zu erwähnen,
dass es keinen möglichen
Austausch des Stranges zwischen dem präsynaptischen Filament und der
doppelsträngigen
DNA gibt. In der Tat würde
ein solcher Vorgang eine starke Hydrolyseeffizienz erfordern, welche
nicht vorhanden ist aufgrund der Tatsache, dass man ATP(γS) verwendet,
dessen Hydrolyseeffizienz hundertmal geringer ist als die von ATP.
Unter diesen Bedingungen bleibt der DNA-Dreifachstrang stabil und kann mehrere
Tage bei –20°C aufbewahrt
werden.
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In
einer zweiten Ausführungsform
bildet man die Dreifachstränge
mit den vor der Methylierung zu schützenden Zonen durch Hybridisierung
der Zielsequenzen mit PNAs, "Peptide
Nucleic Acids" (Veselkov
et al., 1996).
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Der
dritte Schritt besteht darin, das DNA-Gemisch zu methylieren, das
aus doppelsträngigen
DNA-Molekülen
besteht, die in einigen Fällen
lokal Regionen umfassen, die in den Dreifachsträngen eingebunden sind.
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Zu
diesem Zweck verwendet man Methyltransferasen, um die Erkennungsstellen
der ausgewählten Restriktionsenzyme
spezifisch zu methylieren.
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Dieser
Schritt ist selbstverständlich
wichtig, da er andere gegebenenfalls anderswo in den Insertionen der
Bank und in dem Klonierungsvektor vorhandene Stellen vor dem Schneiden
durch die Restriktionsenzyme schützt.
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Die
spezifischen Regionen, welche den Klonen entsprechen, die man zu
eliminieren wünscht,
werden im Prinzip durch die Bildung des Dreifachstrangs vor der
Methylierung geschützt.
Diese Regionen werden folglich nicht methyliert und sind später die
einzigen, die von dem entsprechenden Restriktionsenzym erkannt werden.
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In
dem folgenden Schritt gibt man die Dreifachstränge frei (lässt sie dissoziieren), entweder
durch Denaturieren des Proteins mit RecA-Aktivität, insbesondere RecA, oder
durch Denaturieren der mit den PNA gebildeten Dreifachstränge. Man
erhält
so eine Mischung aus doppelsträngigen
zirkulären
Plasmiden. Am Ende dieses Schritts umfassen bestimmte dieser Plasmide
Regionen, die nicht methyliert sind, da sie den durch den Dreifachstrang
geschützten
Regionen entsprechen.
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In
dem vierten Schritt verdaut man die erhaltene Mischung mit dem gegenüber Methylierung
empfindlichen Restriktionsenzym, wobei es sich selbstverständlich um
ein oder mehrere Restriktionsenzyme handeln kann, in Abhängigkeit
von den Stellen, die zurückbehalten
wurden, um durch die Bildung der Dreifachstränge geschützt zu werden.
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Dieser
Verdau führt
zur Bildung von linearer doppelsträngiger DNA ausgehend von allen
Plasmiden, welche vor der Methylierung geschützte Stellen umfassten. Im
Gegensatz dazu bleiben die anderen Plasmide intakt.
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Die
verwendeten Restriktionsenzyme müssen
ausreichend häufige
Stellen aufweisen, damit die Wahrscheinlichkeit hoch ist, sie in
den Zielinsertionen, deren Länge
von 200 bis 250 nt variiert, vorzufinden; aus diesem Grund verwendet
man vorzugsweise Restriktionsenzyme, deren Erkennungssequenz 4 Nukleotide
umfasst.
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Wenn
man mehrere Enzyme verwenden muss, ist es überdies bevorzugt, dass diese
unter den gleichen Bedingungen, insbesondere des Puffers, aktiv
sind; dies vermeidet, dass man einen Verdau in mehreren Schritten
durchführen
muss, wenngleich dies im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht
ausgeschlossen ist.
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Wie
vorstehend angedeutet wurde, wurden zwei Enzyme in den Beispielen,
welche folgen, verwendet; es handelt sich um MspI und HaeIII.
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Der
letzte Schritt, die Eliminierung oder Abtrennung der linearen doppelsträngigen DNA-Moleküle, ist fakultativ.
Es ist in bestimmten Fällen
möglich,
Verfahren einzusetzen, welche die Trennung von zirkulären doppelsträngigen Plasmiden
von linearen doppelsträngigen
DNA-Fragmenten gestatten; bestimmte dieser Verfahren wurden vorstehend
er wähnt.
Es ist aber auch möglich,
die linearen doppelsträngigen
DNAs durch Verdau zu eliminieren, insbesondere indem man sie durch
Exonukleasen hydrolysiert, insbesondere durch Exonuklease III, welche
die DNA in der 5'-3'-Richtung hydrolysiert.
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Dieser
Verdauungsschritt hat den Vorteil, mögliche Umlagerungen zu vermeiden,
wenn die lineare DNA in Bakterien transformiert wird.
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Dieser
Schritt ist insbesondere interessant zum Vermindern der Redundanz
von cDNA-Banken.
Allgemeiner gesagt, kann er dazu verwendet werden, um jede unerwünschte Sequenz
aus einer Bank zu eliminieren. Die Auswahl der unerwünschten
Sequenzen kann erfolgen:
- – nach einer Analyse einer
Stichprobe von Klonen (z. B. 2000 bis 3000 Klonen),
- – absichtlich,
um bestimmte Sequenzen zu eliminieren, die klassischerweise die
cDNA-Banken verunreinigen (ribosomale oder mitochondriale Sequenzen).
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Insbesondere
gestattet das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung, die am meisten redundanten Klone, z. B. die TOP20, d.
h. die Klone, die den 20 am häufigsten
vorkommenden Sequenzen entsprechen, aus jeder Bank zu eliminieren.
Die durchgeführten
Berechnungen haben gezeigt, dass es die Eliminierung der TOP20 in
einer cDNA-Bank
gestattet, die relative Repräsentation
der verbleibenden Klone beträchtlich
zu erhöhen.
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In
dieser Ausführungsform
könnte
man z. B. die Molverhältnisse
zwischen jedem eingesetzten Oligonukleotid und seiner Zielsequenz
anpassen, um gleichzeitig und auf optimale Weise verschiedene Sequenzen zu
eliminieren.
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Es
ist auch möglich,
das erfindungsgemäße Verfahren
durchzuführen,
entweder um die Verteilung von Sequenzen in einer Bank zu normalisieren
oder um Klone blind zu eliminieren.
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Im
Fall der Normalisierung könnte
das angewandte Protokoll wie folgt sein:
- 1)
Herstellen einer Plasmidzubereitung (doppelsträngig) der Bank
- 2) Synthetisieren von einzelsträngigen PNA- oder DNA-Fragmenten,
welche alle Insertionen oder einen Teil von ihnen abdecken, ausgehend
von der Plasmidzubereitung,
- 3) Verwenden der einzelsträngigen
DNA-Fragmente als Matrix zur Bildung von durch RecA katalysierten Dreifachsträngen oder
direktes Bilden der Dreifachstränge
mit den PNA-Fragmenten,
- 4) Methylieren der nicht an den Dreifachsträngen beteiligten Sequenzen,
- 5) Zerstören
der Dreifachstränge,
- 6) Verdauen der Plasmidzubereitungen mit einem oder zwei Restriktionsenzymen
(Enzymen, deren Restriktionsstelle 4 Basen umfasst), die gegenüber Methylierung
empfindlich sind;
- 7) Verdauen der linearisierten DNAs mit Exonuklease,
- 8) Klonieren und Vermehren der intakten Plasmide.
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Im
Fall der blinden Eliminierung von Klonen bestehen die Arbeitsschritte
aus dem:
- 1) Übertragen von 2000 bis 4000
Klonen,
- 2) Umgruppieren dieser Klone, um ausgehend von diesen Klonen
einzelsträngige
DNA-Sonden herzustellen,
- 3) Verwenden der einzelsträngigen
DNAs zum Eliminieren der Sequenzen, die der ursprünglichen
Bank entsprechen,
- 4) anschließend
können
2 bis 4000 neue Klone übertragen,
sequenziert und ebenso verwendet werden, um die Sequenzen zu eliminieren,
die der verbleibenden Bank entsprechen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft schließlich die so durch Ausführen des
vorstehend beschriebenen Verfahrens erhaltenen cDNA-Banken.
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Die
nachstehenden Beispiele gestatten es, weitere Merkmale und Vorteile
der vorliegenden Erfindung darzulegen.
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Die 1 stellt
das Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung schematisch dar.
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Die 2 gibt die auf Agarosegel erhaltenen Ergebnisse
für die
Linearisierung eines zirkulären
Plasmids durch gezielten Verdau an einer Restriktionsstelle unter
Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wieder.
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Die 3 gibt die Ergebnisse der Eliminierung
eines Zielplasmids in einer Mischung von Plasmiden unter Verwendung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wieder.
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Die 4 gibt
die Sequenzen von Insertionen von zwei Zielplasmiden CL1 und CL13
wieder. Die zum Durchführen
des erfindungsgemäßen Eliminierungsverfahrens
verwendeten Oligonukleotide, OCL1 bzw. OCL13, sind unterstrichen.
Die verwendeten Restriktionsstellen, MspI bzw. HaeIII sind mit fetten
Buchstaben wiedergegeben.
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Strategie des Schutzes
und der Eliminierung mit RecA.
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Diese
Figur fasst das zum Eliminieren von spezifischen Sequenzen einer
cDNA-Bank unter Verwendung des RecA-Proteins verwendete Verfahren
zusammen. Sie zeigt die Wirkung des Protokolls auf das Plasmid von
einem der Zielklone unter den TOP20 (Plasmid A) und auf das Plasmid
eines Nicht-Zielklons (Plasmid B). Nach der Bildung des präsynaptischen
Filaments wird der Oligonukleotid-RecA-Komplex mit der Zubereitung
der doppelsträngigen
Plasmid-DNA vermischt. Da das Oligonukleotid speziell ausgewählt ist,
um an diejenigen der 20 am häufigsten
vorkommenden Sequenzen, die der Insertion des Plasmids A entsprechen,
zu hybridisieren, kann dieses einen Dreifachstrang mit dem mit dem
Protein komplexierten Oligonukleotid bilden, im Gegensatz zu Plasmid
B. Die Methylierung modifiziert alle Stellen des gewählten Restriktionsenzyms (schraffierte
Bereiche) an den Plasmiden A und B, mit Ausnahme der Stelle des
Plas mids A, die durch die Bildung des Dreifachstranges geschützt ist.
Nach der Denaturierung des RecA-Proteins führt die Zugabe des Restriktionsenzyms
zur Linearisierung des Plasmids A, während das Plasmid B zirkulär bleibt.
Der abschließende Schritt
ist eine Hydrolyse des Plasmids A (linearisiert) durch die Exonuklease.
Dies macht das linearisierte Plasmid kürzer und sicherlich nicht klonierbar.
Dieser Schritt beeinflusst das zirkuläre Plasmid B nicht.
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Materialien und Methoden:
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Während der
Versuchsdurchführung
wird das folgende Material verwendet:
- – BRM (Buffer
RecA and Methylase, RecA- und Methylase-Puffer): 250 mM Tris-Acetat,
40 mM Magnesiumacetat.
- – RecA-Protein:
Promega, Nr. M1692. A 2,58 mg/ml.
- – ATP(γS): Adenosin-5'-O-(3-thiotriphosphat),
10 mM. Boehringer Mannheim. Nr. 83317521-12.
- – BSA:
Rinderserumalbumin, 10 mg/ml, New England Biolabs. Zusammen mit
den Enzymen geliefert.
- – DTT:
100 mM.
- – Magnesiumacetat:
80 mM.
- – HaeIII-Methylase.
New England Biolabs, Nr. 224L, 10000 U/ml.
- – MspI-Methylase.
New England Biolabs, Nr. 215L. 5000 U/ml.
- – SAM:
S-Adenosylmethionin. 32 mM. New England Biolabs. Zusammen mit den
Enzymen geliefert.
- – Restriktionsenzym
HaeIII. New England Biolabs. Nr. 108L. 10000 U/ml.
- – Restriktionsenzym
MspI. New England Biolabs. Nr. 106L. 20000 U/ml.
- – Exonuklease
III. New England Biolabs. Nr. 206L. 100000 U/ml.
- – Ampicillin.
Sigma. Nr. A-9518.
- – X-gaI.
Sigma. Nr. B-9146.
- – ITPG.
Sigma. Nr. I-6758.
(COLONY PICKER. Hybaid)
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Die
verschiedenen während
des Verfahrens verwendeten Protokolle sind wie folgt:
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Protokoll 1: Bildung des
präsynaptischen
Filaments
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In
einem 1,5 ml-Eppendorfröhrchen
werden 1 μl
BRM, 6,25 μg
RecA-Protein, 160 ng des Oligonukleotids zugegeben und mit destilliertem
Wasser auf 9 μl
aufgefüllt.
Beim Pipettieren wird vorsichtig vermischt und eine Minute bei 37°C inkubiert.
Es wird 1 μl
ATP(γS)
(bei –80°C aufbewahrt)
zugegeben und 10 Minuten bei 37°C
inkubiert. Das Oligonukleotid und das RecA-Protein werden in Anbetracht
dessen, dass ein Monomer des Proteins bei jeder dritten Base an
die Nukleotidsequenz bindet, in einem Molverhältnis von 3:1 vermischt.
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Protokoll 2: Bildung des
Dreifachstrangs
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In
einem 1,5 ml-Eppendorfröhrchen
werden 1 μg
Plasmid-DNA, 2 μl
BRM, 2,7 μl
DTT, 3 μl
BSA vorsichtig vermischt und mit destilliertem Wasser auf 17 μl aufgefüllt. Diese
Mischung wird zu der vorstehenden Lösung zugegeben und 40 Minuten
bei 37°C
inkubiert.
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Protokoll 3: Methylierung
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Zu
der vorstehenden Lösung
werden 20 Einheiten Methylase, Magnesiumacetat und SAM in Endkonzentrationen
von 8 mM bzw. 80 mM zugegeben und mit destilliertem Wasser auf 40 μl aufgefüllt. Es
wird 45 Minuten bei 37°C
inkubiert. Am Ende der Reaktion wird die Lösung 15 Minuten auf 65°C erwärmt, um
die Methylierung anzuhalten und den Oligonukleotid-RecA-Komplex
zu denaturieren. Die Lösung
wird anschließend durch
eine Phenolextraktion gefolgt von einer Fällung mit 0,3 M Natriumacetat
in Ethanol gereinigt.
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Protokoll 4: Verdau mit
dem Restriktionsenzym
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Der
Bodensatz wird in 10 μl
destilliertem Wasser aufgenommen. Es werden 2,5 μl des 10X-Puffers des Enzyms
und 20 Einheiten des Restriktionsenzyms zugegeben, mit destilliertem
Wasser auf 25 μl
aufgefüllt
und eine Stunde bei 37°C
inkubiert. Schließlich
wird die Lösung
durch eine Phenolextraktion, gefolgt von einer Fällung mit 0,3 M Natriumacetat
in Ethanol gereinigt.
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Protokoll 5: Verdau mit
Exonuklease III
-
Der
Bodensatz wird in 10 μl
destilliertem Wasser aufgenommen. Es werden 5 μl des 10X-Puffers des Enzyms
und 400 Einheiten der Exonuklease zugegeben und mit destilliertem
Wasser auf 50 μl
aufgefüllt.
Es wird 45 Minuten bei 37°C
inkubiert. Die DNA wird mit einer Phenolextraktion gereinigt und
mit Ethanol in Gegenwart von 0,3 M Natriumacetat gefällt. Der
Bodensatz wird in 10 μl
destilliertem Wasser aufgenommen.
-
Die
so erhaltene DNA wird zum Transformieren von kompetenten Bakterien
verwendet.
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Ergebnisse
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Linearisierung
eines zirkulären
Plasmids durch gezielten Verdau an einer Restriktionsstelle
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Beispiel I: Effizienz
der Verwendung des RecA-Proteins
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Dieser
Versuch wird an zwei cDNA-Klonen (CL1 und CL13) durchgeführt, die
mit unterschiedlicher Häufigkeit
in einer Pankreas-Bank vorkommen. Einer der beiden Klone (CL1) entspricht
einer cDNA, deren Häufigkeit
15 % beträgt,
wobei die dem anderen Klon (CL13) entsprechende Sequenz mit einer
Häufigkeit
von 1 % in der Bank vorhanden ist. Die Oligonukleotide OCL1 und
OCL13 wurden unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen gewählt; sie
enthalten die Restriktionsstellen MspI (C*CGG) und HaeIII (GG*CC)
in den Positionen 16 bzw. 473 auf den Sequenzen der entsprechenden
Klone; die Zielsequenzen und die Oligonukleotide OCL1 und OCL13
sind in 4 wiedergegeben. Das RecA-Protein
ist mit den Oligonukleotiden OCL1 und OCL13 komplexiert. Die erhaltenen
präsynaptischen
Filamente werden anschließend
mit Plasmidzubereitungen vermischt, die von den Klonen CL1 bzw.
CL13 stammen. Die Ergebnisse auf 0,8 % Agarosegel (2) zeigen,
dass für
die Produkte des Eliminierungsverfahrens, durch RecA geschützte, methylierte
und anschließend
mit einem Restriktionsenzym verdaute Plasmide (Bahnen 3), die Plasmid-DNA
linearisiert worden ist und ein Migrationsprofil aufweist, das einer
einzigen Bande mit 3 Kb entspricht, welche zwischen der von superspiralisierter
DNA und der von zirkulärer
DNA wandert. Die Migrationsprofile der nichtgeschützten, anschließend methylierten
und mit einem Restriktionsenzym ver dauten Plasmide (Bahnen 4) und
der nativen Plasmide (Bahnen 2) sind ähnlich, was zeigt, dass die
Methylierungsbedingungen ausreichen, um alle nichtgeschützten Restriktionsstellen
zu modifizieren; es findet keinerlei Verdau statt. Die Mehrzahl
von Banden, die man für
die nichtgeschützten,
nichtmethylierten, aber mit Restriktionsenzymen verdauten Plasmide
sieht (Bahnen 5), beruht auf der Tatsache, dass die Stellen der
Enzyme MspI und HaeIII in 13 bzw. 14 Kopien in dem Klonierungsvektor
(BlueScript II SK(-), Stratagene, Nr. 212206) vorhanden sind. Dies
führt dazu,
dass der Vektor an mehreren Stellen geschnitten wird.
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Spezifische
Eliminierung eines Zielplasmids in einer Mischung von Plasmiden
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Beispiel II: Effizienz
der Verwendung des RecA-Proteins: zwei verschiedene Modellsysteme
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Um
die Eliminierungseffizienz eines häufig vorkommenden Klons unter
Verwendung des RecA-Proteins zu testen, wurden zwei Versuche durchgeführt.
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In
dem ersten Versuch besteht die behandelte doppelsträngige DNA
aus einer von unseren beiden vorstehenden Zubereitungen von Plasmiden
(CL1 und CL13), vermischt mit einer Zubereitung von Plasmiden, die
einem Klonierungsvektor (pBSSK) entsprechen. Die beiden Klone 1
und 13 wurden getrennt mit dem Plasmid pBSSK in einem Verhältnis vermischt,
das ihrer Häufigkeit
in der Pankreas-Bank entspricht, d. h. 15 % bzw. 1 %. Die erfindungsgemäße Eliminierung
unter Verwendung des RecA-Proteins wurde unter Einsatz der Oligonukleotide
OCL1 und OCL13 gemäß dem vorstehend
beschriebenen Protokoll durchgeführt.
Das Endprodukt wurde verwendet, um elektrokompetente Bakterien (Epicurian
Coli SURE, Stratagene Nr. 2000227) zu transformieren und die erhaltene
Lösung
wurde in Schalen mit LB-Agar mit Ampicillin, X-Gal und ITPG ausgegossen.
Die Anzahl der rekombinanten Klone (weiße Kolonien, die Insertionen
enthalten, die den Sequenzen der Klone 1 oder 13 entsprechen) wurde
vor und nach der Eliminierungsbehandlung ausgezählt. Für den Klon 1 beträgt der Prozentsatz
der rekombinanten Klone 9 % vor der Behandlung und 1,4 % nach der
Eliminierung dieses Klons. Für
den Klon 13 erfolgt eine Abnahme von 1,5 % auf 0,28 %. Diese beiden
Tests zeigen eine Effizienz der Eliminierung von 84 %.
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In
dem zweiten Versuch hat eine Zubereitung von Plasmiden, die der
Gesamtheit der Pankreas-Bank entspricht, eine doppelsträngige DNA
ergeben, die durch das Eliminierungsverfahren behandelt wurde. Diese wurde
mit dem Oligonukleotid OCL1 mit dem Ziel durchgeführt, den
Klon CL1 aus der gesamten Bank zu entfernen.
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Die
cDNA-Bank aus menschlichem Pankreas ist eine Bank, die den 5'-Enden der Pankreas-mRNA entspricht.
Da das Oligonukleotid OCL1 in der Nähe des 5'-Endes (Position 16) gewählt wird,
sollten somit alle Klone, die dem 5'-Ende dieses Messengers entsprechen,
eliminiert werden. In einer dT-geprimten cDNA-Bank können die
gleichen Arbeitsschritte an dem 3'-Ende von Messenger-RNAs durchgeführt werden.
Im Gegensatz dazu ist im Fall einer nach dem Zufallsprinzip geprimten
Bank die Wahl der Oligonukleotide delikater. Dies kann umgangen
werden entweder, indem man entweder mit Hilfe von Computerprogrammen
Homologien zwischen den Sequenzen findet und die Oligonukleotide
in der konservierten Region wählt
oder indem man einzelsträngige
DNA-Sonden ausgehend von Insertionen unter Verwendung von Sequenzen
der multiplen Klonierungsstelle als Primer synthetisiert.
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Nach
der Bildung des präsynaptischen
Filaments mit dem Oligonukleotid OCL1 und dem Schützen erfolgte
die Methylierung mit der MspI-Methyltransferase. Anschließend wurde
das Enzym MspI zugegeben und die Mischung des Verdaus mit Exonuklease
III behandelt. Elektrokompetente Bakterien wurden mit dem Endprodukt
transformiert und in LB-Agar-Schalen ausgebreitet. In der Theorie
werden alle Plasmide der Bank außer denjenigen, die die Sequenz
tragen, die der Insertion von Klon 1 entspricht, vollständig methyliert
und folglich von dem Enzym MspI nicht verdaut. Es wurden PCRs (Amplifikation
durch Polymerase-Kettenreaktion) von 96 rekombinanten Kolonien durchgeführt, wobei
als Amplifikationsprimer die klassischen "reversen" und "universellen" Primer verwendet wurden, um die Insertionen
aus den Plasmiden herauszuholen. Die Produkte der PCR wurden auf
positiv geladene Nylonfilter (Amersham Life Sciences) aufgebracht
(gespottet) und die so erhaltenen Filter unter Verwendung des P32-phosphorylierten
Oligonukleotids (OCL1) hybridisiert, das für den in Frage kommenden Klon
(CL1) spezifisch ist. Die Ergebnisse dieses Versuchs (3) zeigen eine Eliminierungseffizienz
von 85 %: die Anzahl der positiven Signale nimmt von 21 vor der
Behandlung auf 3 nach der Eliminierung des in Frage kommenden Klons
ab.
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Referenzen
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