WO1994029443A1 - Analyse von rna sequenzen mittels pcr - Google Patents

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WO1994029443A1
WO1994029443A1 PCT/EP1994/001869 EP9401869W WO9429443A1 WO 1994029443 A1 WO1994029443 A1 WO 1994029443A1 EP 9401869 W EP9401869 W EP 9401869W WO 9429443 A1 WO9429443 A1 WO 9429443A1
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dna
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Manfred W. MÜLLER
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Mueller Manfred W
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    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
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    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the invention relates to a method for producing a deoxy ribonucleic acid (DNA) strand (cDNA strand) complementary to a ribonucleic acid (RNA) molecule, and to the use of the method for analyzing RNA molecules.
  • DNA deoxy ribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • RNA is therefore translated into complementary DNA (cDNA) using an RNA-dependent DNA polymerase.
  • cDNA is the name for the single or double-stranded DNA copy of an RNA molecule.
  • the above-mentioned RNA-dependent DNA polymerase is also referred to as "reverse transcriptase". It uses deoxyribonucleoside triphosphates as substrates and uses the RNA as a template for the synthesis of the DNA strand.
  • oligonucleotide that are complementary to a partial region of an RNA molecule.
  • Hybridization of the oligonucleotide to the RNA results in a short, double-stranded nucleic acid region which is required by the reverse transcriptase as a primer (starter) for the synthesis of the first DNA strand.
  • starter a primer for the synthesis of the first DNA strand.
  • oligo (dT) is used as the primer, which can hybridize to the pol (A) tail of certain RNA molecules (poly (A) + RNA).
  • RNA such as, for example, ribosomal RNA
  • a poly (A) tail can be subsequently synthesized at the 3 'end of the RNA using poly (A) -poly erase. This can then again with Oligo (dT) form a double-stranded starting region.
  • Random priming some of these hexanucleotides will hybridize to RNA and can act as starters for cDNA synthesis.
  • a disadvantage is that the proportion of completely copied RNA molecules usually drops.
  • RNA molecule to be examined If part of the sequence of an RNA molecule to be examined is known, a specific oligonucleotide which is complementary to the known sequence can be used as a primer.
  • Another technique is based on single-stranded cDNA, at the 3'-end of which a hoopolymeric oligo (dC) tail is attached with terminal deoxynucleotidyl transferase.
  • the one for the synthesis of the second strand of cDNA required double-stranded primer region is formed by reaction of the oligo (dC) tail present on the first strand of cDNA with a complementary oligo (dG) primer.
  • RNA priming The Gubler-Hoffman method is "RNA priming".
  • the RNA strand is not removed from the RNA / DNA hybrid molecule formed after the synthesis of the first cDNA strand.
  • the RNA strand in the intact hybrid molecule is treated with a specific ribonuclease (RNAse H), so that short RNA primers with a free hydroxyl end remain on the single-stranded cDNA.
  • RNAse H a specific ribonuclease
  • RNA / DNA hybrid molecules created after the synthesis of the first strand of cDNA double-stranded cDNA is usually used. In further experiments, this can be built into a suitable cloning vector. Since the cDNA molecules usually have undefined ends due to the synthesis steps, they have to be provided with ends after the synthesis which allow targeted incorporation into a cloning vector. For this purpose, homopolymeric nucleotide tails or double-stranded oligonucleotides called "linkers" are used, which carry the recognition sequence for a restriction endonuclease. To attach the linker, the ends of the cDNA are processed enzymatically so that smooth DNA ends are formed.
  • linkers homopolymeric nucleotide tails or double-stranded oligonucleotides
  • oligo (dT) tails attached to a vector molecule are used for the attachment of poly (A) + RNA and for priming the cDNA synthesis.
  • a relatively complex sequence of reac- ions leads to the cloning of a double-stranded cDNA after the synthesis of the first strand of cDNA.
  • telomere sequence it is also known to amplify cDNA strands by means of suitable primers through the polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Suitable primers are oligonucleotides which either hybridize directly to the cDNA strand or to a homopolymeric nucleotide tail or linker attached to the cDNA strand.
  • the amplified cDNA fragments can then be cloned into a vector or sequenced directly.
  • DNA sequencing i.e. the determination of the sequence of bases in a DNA molecule
  • two methods which are different in terms of method are usually used today: the Maxam-Gilbert technique, also known as chemical DNA sequencing, and the Sanger chain termination method, also enzymatic Called DNA sequencing or dideoxy sequencing.
  • the object of the present invention is to provide an improved method for producing a DNA strand which is complementary to an RNA molecule and which, compared to known methods, provides increased yields of cDNA molecules.
  • the process according to the invention has the great advantage that it can be carried out starting from subnano-olar concentrations of both polyadenylated and non-polyadenylated RNA molecules, and in this way indirectly RNA molecules. coolers can be analyzed very efficiently.
  • the invention further relates to the use of the method according to one of claims 1 to 17 for the analysis of RNA molecules.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of the method according to the invention:
  • FIG. 2 shows schematically the steps of FIG. 1, with the difference that after the synthesis of the first cDNA strand, a homopolymeric nucleotide tail is added to it (2.1) and the second biotinylated primer to this homopolymeric nucleotide -Tail hybridized.
  • both single and double-stranded can be used DNA molecules with a 5'-phosphate end are used.
  • an at least partially double-stranded DNA molecule is preferably used in stage (a) of the method according to the invention.
  • a double-stranded DNA molecule with a 5 'overhanging end is particularly preferred.
  • the 5 'overhanging end can be obtained by cleaving the DNA molecule using a restriction endonuclease such as e.g. EcoRI.
  • a common, commercially available DNA vector is preferably used, which is linearized with a suitable restriction endonuclease.
  • the linkage of the 5'-phosphate end of the DNA strand with the 3'-hydroxyl end of the single-stranded RNA molecule is preferably carried out enzymatically by means of ligation.
  • RNA ligase such as e.g. T4-RNA-Liggaassee ,, ddiiee iinn GGeeggeennwwaarrtt vvoonn Mn DNA and RNA molecules covalently linked together.
  • an oligonucleotide which connects to the DNA strand is preferably used as a primer for the cDNA synthesis after the DNA strand has been linked to the single-stranded RNA molecule hybridizes.
  • a suitable oligonucleotide it is desirable to at least partly know the sequence of the single-stranded DNA molecule used.
  • the 3'-hydroxyl end of the DNA strand which is not linked to the RNA molecule acts directly as a primer for cDNA synthesis.
  • the cDNA synthesis is carried out enzymatically by means of reverse transcriptase, which is commercially available.
  • the first strand of cDNA obtained in this way can subsequently be amplified by polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • RNA molecule to be analyzed is completely unknown, i.e. no sequence information is available.
  • a first primer can be used for the PCR, the sequence of which is complementary to a partial sequence of the DNA strand linked to the RNA molecule (plus strand primer) and a second primer which is complementary to that first cDNA strand is (minus strand primer), ie whose sequence corresponds to a partial sequence of the RNA molecule.
  • oligonucleotide is added to its 3 'end ("tailing").
  • Homopolymeric, single-stranded nucleotide tails are preferably synthesized by means of terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT).
  • TdT terminal deoxynucleotidyl transferase
  • oligonucleotides such as linkers
  • T4 DNA ligase can be added to the synthesized first cDNA strand using T4 DNA ligase.
  • This enzyme also accepts DNA / RNA hybrid molecules as a substrate.
  • Linkers are chemically synthesized, short-chain oligonucleotides of 6 to 12 bases in length that contain the recognition sequence for one or more restriction endonucleases. Oligonucleotides which are complementary to the homopolymeric nucleotide tail attached to the cDNA strand or to the attached linker can thus be used as the minus strand primer.
  • the PCR is carried out in a manner known per se, e.g. using Taq DNA polymerase.
  • the cDNA molecules amplified by PCR can then be sequenced or cloned.
  • a minus-strand primer biotinylated at the 5 'end in the PCR. This allows rapid isolation of the cDNA molecules synthesized on this primer from the reaction mixture with the aid of streptavidin-coated magnetic beads (magnetic beads).
  • the isolated, single-stranded cDNA molecules can then be used using a suitable sequencing primer (plus-strand primer) e.g. can be sequenced by the dideoxy chain termination method using T7 DNA polymerase. Although this direct solid phase sequencing is preferred, all known sequencing methods can be used.
  • the sequence of the cDNA molecule can be used to draw direct conclusions about the sequence of the RNA molecule to be analyzed.
  • biotinylated oligonucleotides which contain the recognition sequence of a restriction endonuclease can also be used as minus-strand primer.
  • the amplified cDNA molecules can then be purified from the reaction mixture with the aid of magnetic beads coated with streptavidin. The magnetic beads over the
  • Streptavidin / biotin complex-bound cDNA molecules can then be released with the aid of a restriction endonuclease, which is specific for the recognition sequence contained in the primers. This method allows selection for cDNA molecules which are cut at both ends by the restriction endonuclease used, which increases the cloning yield.
  • the method according to the invention makes it possible to analyze RNA molecules.
  • the method according to the invention can preferably be used for the in vitro diagnosis of genetic defects.
  • blood cells are taken from the patient, for example, from which the cellular RNA is then isolated.
  • knowledge can be obtained, for example, as to whether and to what extent a certain gene is translated.
  • splice defects in RNA molecules as well as post-transcriptional RNA modifications e.g. the insertion or deletion of nucleotides (RNA editing) can be recognized after carrying out the method according to the invention.
  • the method according to the invention thus facilitates genetic diagnostics.
  • the method according to the invention is ideally suited for creating cDNA banks.
  • Commercially available cloning vectors can be used for this, the appropriate one
  • Restriction endonuclease interfaces in the vector can be religated vector plus cDNA. This method leads to high yields of cDNA clones and can be carried out both from poly (A) and from poly (A) ⁇ RNA.
  • PCR primers used BS / bll-specific plus-strand primer (5 'GATTAATGTGAAAGCATGCTAACTTC; 25 pmol); 5'-terminal biotinylated primer (5 'AAATCTGGTACCGGGAACAAAGGAAGAC: 25 pmol), partially complementary (underlined) to the 3' part of the cDNA sequence.
  • Tailing 2.5 ⁇ l of the cDNA synthesis reaction mixture were used for tailing with a homopolymeric dCTP tail in 20 ⁇ l final volume in the presence of 10 units of terminal transferase (Boehringer, Mannheim) among those from the manufacturer (Boehringer; Mannheim) described conditions used.
  • PCR amplification of the extended cDNA products 2.5 ⁇ l of the tagging reaction mixture were used directly in a standard PCR (94 ° C, 30 ° 58 ° C, 72 ° C, 35 cycles) which was carried out in a 50 ⁇ l reaction volume using 1 unit of Taq DNA polymerase (Stratagene) and under the buffer conditions described by the manufacturer (Stratagene).
  • PCR primers used BS / bll specific plus Strand primer (5 'GATTAATGTGAAAGCATGCTAACTTC; 25 pmol); 5'-th biallyinylated primer (5'GGGGGGGGGGGGGGG; 25 pmol), complementary or partially complementary to the 3'-terminal dC, tail of the cDNA sequence.

Abstract

Verfahren zum Herstellen eines zu einem RNA-Molekül komplementären DNA-Stranges (cDNA-Stranges). Die bisherigen Verfahren zum Herstellen eines cDNA-Stranges, der der vollständigen Länge des entsprechenden RNA-Moleküls entspricht, wurden ausgehend von Primern durchgeführt, die an den poly(A)-Schwanz des RNA-Moleküls hybridisieren. Poly(A)--RNA konnte daher auf diese Weise nicht umgeschrieben werden. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das 3'-Hydroxyl-Ende eines RNA-Moleküls mit dem 5'-Phosphat-Ende eines beliebigen, ersten DNA-Stranges kovalent verknüpft und der cDNA-Strang ausgehend von dem 3'-Hydroxyl-Ende eines zweiten DNA-Stranges oder Oligonukleotids, welcher(s) zu dem mit dem RNA-Molekül verknüpften DNA-Strang komplementär ist mittels reverser Transkriptase synthetisiert. Das erfindungsgemäße Verfahren wird zur Analyse von RNA-Molekülen verwendet.

Description

ANALYSE VON RNA SEQUENZEN MITTELS PCR.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines zu einem Ribonukleinsäure(RNA)-Molekül komplementären Desoxy¬ ribonukleinsäure(DNA)-Stranges (cDNA-Stranges) , sowie die Verwendung des Verfahrens zur Analyse von RNA-Molekülen.
Mangels geeigneter Verfahren wird eine direkte Analyse von RNA-Molekülen in modernen Gentechnik-Labors kaum noch durch¬ geführt. Das Arbeiten mit RNA erfordert zudem besondere, zeitaufwendige Vorkehrungen, um die RNA vor einem Abbau durch Ribonukleasen zu schützen. Heutzutage wird deshalb RNA mit Hilfe einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase in komplementäre DNA (cDNA) übersetzt. cDNA ist die Bezeichnung für die einzel- bzw. doppelsträngige DNA-Kopie eines RNA-Moleküls. Die vorstehend erwähnte RNA-abhängige DNA-Polymerase wird auch als "Reverse Transkriptase" bezeichnet. Sie verwendet Desoxyribonukleosid-Triphosphate als Substrate und benutzt die RNA als Matrize für die Synthese des DNA-Stranges.
Für die Synthese des ersten cDNA-Stranges sind verschiedene Verfahren entwickelt worden. Diese Verfahren basieren auf der Verwendung von kurzen Oligonukleotiden, die komplementär zu einem Teilbereich eines RNA-Moleküles sind. Durch Hybridisie¬ rung des Oligonukleotids an die RNA entsteht ein kurzer, dop- pelsträngiger Nukleinsäurebereich, der von der Reversen Transkriptase als Primer (Starter) für die Synthese des er¬ sten DNA-Stranges benötigt wird. Als Primer wird beispiels¬ weise Oligo(dT) verwendet, das an den pol (A)-Schwanz von be¬ stimmten RNA-Molekülen (poly(A)+-RNA) hybridisieren kann. Soll nichtpolyadenylierte RNA, wie z.B. ribosomale RNA, in DNA umgeschrieben werden, so kann nachträglich mit poly(A)- Poly erase ein poly(A)-Schwanz an das 3'-Ende der RNA ansyn¬ thetisiert werden. Dieser kann dann wiederum mit Oligo(dT) eine doppelsträngige Startregion ausbilden.
Weiterhin können als Primer Mischungen kurzer DNA-Hexanu- kleotide aller theoretisch denkbarer Sequenzabfolgen verwen¬ det werden. Bei diesem als "Random-Priming" bezeichneten Ver¬ fahren werden einige dieser Hexanukleotide an RNA hybridisie¬ ren und als Starter für die cDNA-Synthese fungieren können. Ein Nachteil ist jedoch, daß meist der Anteil vollständig ko¬ pierter RNA-Moleküle sinkt.
Falls ein Teil der Sequenz eines zu untersuchenden RNA-Mole¬ küls bekannt ist, kann ein spezifisches Oligonukleotid, das zu der bekannten Sequenz komplementär ist, als Primer einge¬ setzt werden.
Für die Synthese des zweiten DNA-Stranges gibt es ebenfalls mehrere Strategien. Beim sogenannten "Selbst-Priming" wird nach der Synthese des ersten cDNA-Stranges der RNA-Anteil aus dem gebildeten DNA/RNA-Hybrid durch Behandlung mit Alkali oder durch Hitzedenaturierung entfernt. Man nutzt nun die Tatsache aus, daß die gebildete, einzelsträngige cDNA am 3'-Ende, also demjenigen Ende, das dem 5'-Ende der kopierten RNA entspricht, vorübergehend sogenannte Haarnadelstrukturen ausbildet. Diese kurzen doppelsträngigen Bereiche können wie¬ derum von der DNA-Polymerase als Primer für die Synthese des zweiten DNA-Stranges verwendet werden. Der Haarnadelbereich wird durch die nachfolgende Synthese stabilisiert, so daß einseitig kovalent geschlossene, doppelsträngige cDNA-Mole- küle entstehen. Durch vorsichtige Behandlung mit Desoxyribo- nukleasen, wie z.B. Sl-Nuklease oder Mung bean-Nuclease kön¬ nen diese Moleküle geöffnet werden. Es besteht jedoch immer die Gefahr, daß man Sequenzen vom 5'-Ende der RNA verliert.
Eine weitere Technik geht von einzelsträngiger cDNA aus, an deren 3'-Ende mit terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase ein ho opolymerer Oligo(dC) -Schwanz angelagert wird. Der für die Synthese des zweiten cDNA-Stranges benötigte, doppel¬ strängige Primerbereich entsteht durch Reaktion des am ersten cDNA-Strang vorhandenen Oligo(dC)-Schwanzes mit einem komple¬ mentären Oligo(dG)-Primer.
Beim Gubler-Hoffman-Verfahren handelt es sich um "RNA-Pri- ming". Hierbei verzichtet man auf die Entfernung des RNA- Stranges aus dem nach der Synthese des ersten cDNA-Stranges gebildeten RNA/DNA-Hybridmolekül. Unter kontrollierten Bedin¬ gungen wird der RNA-Strang im intakten Hybridmolekül mit ei¬ ner spezifischen Ribonuklease (RNAse H) behandelt, so daß kurze RNA-Primer mit freiem Hydroxyl-Ende an der einzelsträn- gigen cDNA verbleiben. Diese dienen dann in einer gleichzei¬ tig laufenden Reaktion als Primer für die Synthese des zwei¬ ten DNA-Stranges durch DNA-Polymerase.
Obwohl es möglich ist, die nach der Synthese des ersten cDNA- Stranges entstandenen RNA/DNA-Hybridmoleküle direkt zu klo- nieren, wird meist mit doppelsträngiger cDNA gearbeitet. Die¬ se kann in weiteren Experimenten in einen geeigneten Klonie- rungsvektor eingebaut werden. Da die cDNA-Moleküle, bedingt durch die Syntheseschritte, meist Undefinierte Enden aufwei¬ sen, müssen sie nach der Synthese mit Enden versehen werden, die den gezielten Einbau in einen Klonierungsvektor erlauben. Für diesen Zweck verwendet man homopolymere Nukleotidschwanze oder doppelsträngige als "Linker" bezeichnete Oligonukleoti- de, die die Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonukle- ase tragen. Zum Anhängen der Linker werden die Enden der cDNA enzymatisch so bearbeitet, daß glatte DNA-Enden entstehen.
Verschiedene Techniken der cDNA-Synthese kombinieren die ein¬ zelnen Syntheseschritte und die nachfolgenden Klonierungsre- aktionen. Beispielsweise werden beim Heidecker-Messing-Ver¬ fahren an ein Vektormolekül angebrachte Oligo(dT)-Schwänze zur Anlagerung von poly(A)+-RNA und zum Primen der cDNA-Syn- these verwendet. Eine relativ aufwendige Abfolge von Reak- tionen führt nach der Synthese des ersten cDNA-Stranges zur Klonierung einer doppelsträngigen cDNA.
Es ist weiterhin bekannt, cDNA-Stränge mittels geeigneter Primer durch die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction; PCR) zu amplifizieren. Als Primer kommen Oligonu- kleotide in Frage, die entweder an den cDNA-Strang direkt hy¬ bridisieren oder an einen an den cDNA-Strang angelagerten ho- mopolymeren Nukleotid-Schwanz oder Linker. Die amplifizierten cDNA-Fragmente können danach in einen Vektor kloniert oder auch direkt sequenziert werden.
Für die DNA-Sequenzierung, d.h. die Bestimmung der Abfolge von Basen in einem DNA-Molekül, werden heute meist zwei me¬ thodisch unterschiedliche Verfahren angewendet: die Maxam- Gilbert-Technik, auch als chemische DNA-Sequenzierung be¬ zeichnet, und das Kettenabbruch-Verfahren nach Sanger, auch enzymatische DNA-Sequenzierung oder die Didesoxy-Sequenzie- rung genannt.
Von der Sequenz der cDNA kann man direkt auf die ursprüngli¬ che RNA-Sequenz schließen.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zum Herstellen eines zu einem RNA-Mo¬ lekül komplementären DNA-Stranges zur Verfügung zu stellen, welches im Vergleich zu bekannten Verfahren erhöhte Ausbeuten an cDNA-Molekülen liefert.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 17 gelöst.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet den großen Vorteil, daß es ausgehend von subnano olaren Konzentrationen von sowohl polyadenylierten als auch nicht-polyadenylierten RNA-Molekü¬ len durchführbar ist, und auf diese Weise indirekt RNA-Mole- küle sehr effizient analysiert werden können.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung des Verfah¬ rens nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Analyse von RNA-Molekülen.
Die Erfindung wird nachstehend mit Bezug auf die Zeichnungen im einzelnen erläutert.
Die Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens:
1) Verknüpfung des 5'-Phosphat-Endes (P5') eines doppel- strängigen DNA-Moleküls mit 5'- überhängendem Ende mit dem 3'-Hydroxyl-Ende (3OH) eines RNA-Moleküls ((+)RNA X),
2) cDNA-Synthese ausgehend vom 3'-Hydroxyl-Ende des DNA-Moleküls,
3) PCR-Amplifikation der cDNA mittels eines ersten Pri¬ mers, der an den 3'-5'-Strang des DNA-Moleküls hybridisiert (Vektor-Primer) , und eines zweiten, biotinylierten Primers, der an den ersten cDNA-Strang hybridisiert (-Primer) , und
4) Festphasen-Didesoxy-Sequenzierung des zweiten cDNA- Stranges mittels Streptavidin-beschichteter magnetischer Kügelchen.
Die Figur 2 stellt schematisch die Schritte der Figur 1 dar, mit dem Unterschied, daß nach der Synthese des ersten cDNA- Stranges an diesen ein homopolymerer Nukleotid-Schwanz ange¬ fügt wird (2.1) und der zweite biotinylierte Primer an die¬ sen homopolymeren Nukleotid-Schwanz hybridisiert.
In die Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens nach An¬ spruch 1 können sowohl einzel- als auch doppelsträngige DNA-Moleküle mit einem 5'-Phosphat-Ende eingesetzt werden.
Vorzugsweise wird jedoch in Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens nach Anspruch 1 ein zumindest teilweise doppel- strängiges DNA-Molekül eingesetzt. Besonders bevorzugt ist ein doppelsträngiges DNA-Molekül mit einem 5'-überhängenden Ende. Das 5'-überhängende Ende kann durch Spalten des DNA- Moleküls mit Hilfe einer Restriktionsendonuklease, wie z.B. EcoRI, erzeugt werden.
Vorzugsweise verwendet man einen gängigen,- kommerziell er¬ hältlichen DNA-Vektor, der mit einer geeigneten Restriktions¬ endonuklease linearisiert wird.
Die Verknüpfung des 5'-Phosphat-Endes des DNA-Stranges mit dem 3'-Hydroxyl-Ende des einzelsträngigen RNA-Moleküls ("tagging") wird vorzugsweise enzymatisch mittels einer Liga- se durchgeführt.
Als Ligase eignet sich eine RNA-Ligase, wie z.B. T4-RNA-Li- ggaassee,, ddiiee iinn GGeeggeennwwaarrtt vvoonn Mn DNA- und RNA-Moleküle kova- lent miteinander verbindet.
Falls ein einzelsträngiges DNA-Molekül in Stufe (a) einge¬ setzt wird, wird vorzugsweise nach dem Verknüpfen des DNA-Stranges mit dem einzelsträngigen RNA-Molekül ein Oligo- nukleotid als Primer für die cDNA-Synthese verwendet, das an den DNA-Strang hybridisiert. Für die Auswahl eines geeig¬ neten Oligonukleotids ist es wünschenswert, die Sequenz des eingesetzten einzelsträngigen DNA-Moleküls zumindest teil¬ weise zu kennen.
Bei Verwendung eines doppelsträngigen DNA-Moleküls fungiert das 3'-Hydroxyl-Ende des nicht mit dem RNA-Molekül verknüpf¬ ten DNA-Stranges direkt als Primer für die cDNA-Synthese. Die cDNA-Synthese wird enzymatisch mittels Reverser Trans¬ kriptase, welche kommerziell erhältlich ist, durchgeführt.
Der so erhaltene erste cDNA-Strang kann nachfolgend durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert werden. Dabei werden zwei Fälle unterschieden:
(i) eine Teilsequenz aus dem zu analysierenden RNA-Mole¬ kül ist bereits bekannt, und
(ii) das RNA-Molekül, welches analysiert werden soll, ist völlig unbekannt, d.h. es steht keine SequenzInforma¬ tion zur Verfügung.
Im ersten Fall kann man für die PCR einen ersten Primer ver¬ wenden, dessen Sequenz komplementär zu einer Teilsequenz des mit dem RNA-Molekül verknüpften DNA-Stranges ist (plus-Strang-Primer) und einen zweiten Primer, der komple¬ mentär zu dem ersten cDNA-Strang ist (minus-Strang-Primer) , d.h. dessen Sequenz einer Teilsequenz des RNA-Moleküls ent¬ spricht.
Im zweiten Fall, d.h. wenn keine SequenzInformation bezüglich des zu analysierenden RNA-Moleküls zur Verfügung steht, wird nach der Synthese des ersten cDNA-Stranges an dessen 3'-Ende ein Oligonukleσtid angefügt ("tailing") . Vorzugsweise werden mittels terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT) homo¬ polymere, einzelsträngige Nukleotid-Schwänze ansynthetisiert. Das Enzym katalysiert die Anlagerung von Desoxynukleosid-Triphosphaten an die 3'-Enden eines DNA-Fragments, ohne hierfür eine Matrize zu benötigen. An dem vorliegenden DNA-RNA/cDNA- Hybridmolekül verläuft die Reaktion effizienter an glatten Enden als an Enden, an denen aufgrund einer nur partiellen reversen Transkription das 5'-Hydroxyl-Ende des RNA-Moleküls noch übersteht. Diese Tat¬ sache begünstigt die Selektion auf cDNA, die der vollen Länge des zu analysierenden RNA-Moleküls entspricht. Alternativ können unter Verwendung von T4-DNA-Ligase Oligonukleotide, wie z.B. Linker, an den synthetisierten ersten cDNA-Strang angefügt werden. Dieses Enzym akzeptiert ebenfalls DNA/RNA-Hybridmoleküle als Substrat. Als Linker bezeichnet man chemisch synthetisierte, kurzkettige Oligonukleotide von 6 bis 12 Basen Länge, die die Erkennungssequenz für eine oder mehrere Restriktionsendonukleasen enthalten. Als minus-Strang-Primer können somit Oligonukleotide verwendet werden, die komplementär zu dem an den cDNA-Strang angefügten homopolymeren Nukleotid-Schwanz bzw. zu dem angefügten Linker sind.
Die PCR wird in an sich bekannter Weise durchgeführt, z.B. mittels Taq-DNA-Polymerase.
Die durch PCR amplifizierten cDNA-Moleküle können anschlie¬ ßend sequenziert oder kloniert werden.
Falls die cDNA sequenziert werden soll, ist es bevorzugt, in die PCR einen am 5'-Ende biotinylierten minus-Strang-Primer einzusetzen. Dies erlaubt eine schnelle Isolierung der an diesen Primer ansynthetisierten cDNA-Moleküle aus der Reakti¬ onsmischung mit Hilfe von Streptavidin-beschichteten mag¬ netischen Kügelchen (magnetic beads) . Die isolierten, einzel¬ strängigen cDNA-Moleküle können anschließend unter Verwendung eines geeigneten Sequenzierungs-Primers (plus-Strang-Primer) z.B. durch die Didesoxy-Kettenabbruch-Methode mittels T7-DNA- Polymerase sequenziert werden. Obwohl diese direkte Festpha¬ sensequenzierung bevorzugt ist, können alle bekannten Sequen¬ zierungsverfahren verwendet werden. Aus der Sequenz des cDNA- Moleküls kann man direkt auf die Sequenz des zu analysieren¬ den RNA-Moleküls schließen.
Wenn die durch die PCR a plifizierte cDNA kloniert werden soll, ist es bevorzugt, sowohl als plus-Strang-Primer als auch als minus-Strang-Primer biotinylierte Oligonukleotide zu verwenden, die die Erkennungssequenz einer Restriktionsendo¬ nuklease enthalten. Die amplifizierten cDNA-Moleküle können dann mit Hilfe von mit Streptavidin-beschichteten magne¬ tischen Kügelchen aus der Reaktionsmischung gereinigt werden. Die an die magnetischen Kügelchen über den
Streptavidin/Biotin-Ko plex gebundenen cDNA-Moleküle können anschließend mit Hilfe einer Restriktionsendonuklease, die für die in den Primern enthaltene Erkennungssequenz spezi¬ fisch ist, freigesetzt werden. Dieses Verfahren erlaubt eine Selektion auf cDNA-Moleküle, die an beiden- Enden von der verwendeten Restriktionsendonuklease geschnitten sind, wo¬ durch die Klonierungsausbeute erhöht wird.
Für die in der PCR amplifizierten cDNA-Moleküle können weite¬ re bekannte Klonierungssysteme verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, RNA-Moleküle zu analysieren. Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorzugsweise für die in vitro-Diagnostik von genetischen Defekten ver¬ wendet werden. Dazu werden dem Patienten beispielsweise Blut¬ zellen entnommen, aus denen anschließend die zelluläre RNA isoliert wird. Nach Durchführung des erfindungsgemäßen Ver¬ fahrens können beispielsweise Erkenntnisse erhalten werden, ob und in welchem Ausmaß ein bestimmtes Gen translatiert wird. Weiterhin können Spleiß-Defekte in RNA-Molekülen sowie post-transkriptionale RNA-Modifikationen (z.B. die Insertion oder Deletion von Nukleotiden (RNA-Editing) nach Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erkannt werden. Das er¬ findungsgemäße Verfahren erleichtert somit die genetische Diagnostik.
Außerdem ist das erfindungsgemäße Verfahren bestens dazu ge¬ eignet, cDNA-Banken zu erstellen. Dazu können kommerziell er¬ hältliche Klonierungsvektoren verwendet werden, die passende
Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen besitzen. Nach Linearisieren des Vektors durch Schneiden mittels einer Restriktionsendonuklease kann an den überhängenden 5'-Phosphat-Enden die erfindungsgemäße cDNA-Synthese durchge¬ führt werden. Nach wahlweiser Modifikation des 3 OH-Endes der erzeugten cDNA und Ausnutzen weiterer
Restriktionsendonukleaseschnittstellen im Vektor können Vektor plus cDNA religiert werden. Dieses Verfahren führt zu hohen Ausbeuten an cDNA-Klonen und kann sowohl ausgehend von poly(A) - als auch von poly(A)~-RNA durchgeführt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:
Beispiel 1
(1) Tagging: Gel-gereinigte einzelsträngige RNA (0,1 bis 10 pMol) wurde über Nacht bei 4°C mit 0,1 pMol eines mit EcoRI gespaltenen Plasmids (BS/bll; Augustin, S. , Müller, M.W. , Schweyen, R.J. (1990) Nature 343, 383-385)) im Vorhandensein von 5 Einheiten T4-RNA-Ligase (Pharmacia) in 20 μl Endvolumen unter den folgenden Reaktionsbedingungen inkubiert: 50 mM HEPES (pH 8,0), 3 mM DTT, 20 mM MgCl2, 20 mM MnCl2, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 M ATP.
(2) Direkte Initiierung der cDNA-Synthese: 2 μl der Reakti¬ onsmischung wurden direkt in die cDNA-Synthesereaktion ein¬ gesetzt, die für 15 min bei 40°C unter Verwendung von 10 Einheiten SuperScript Reverse Transcriptase (RT; Gibco BRL) in 20 μl durchgeführt wurde: 50 mM Tris-HCl, pH 8, 3 , 40 mM KC1, 6 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA, 0,3 mM dNTPs.
(3) PCR-Amplifizierung der cDNA: 2 , 5 μl der cDNA-Synthesere- aktionsmischung wurden direkt in eine Standard-PCR eingesetzt (1' 94°C, 30" 58°C, 1' 72°C; 35 Zyklen) , die in 50 μl Reak¬ tionsvolumen unter Verwendung von 1 Einheit Taq-DNA-Poly- merase (Stratagene) und unter den vom Hersteller (Stratagene) beschriebenen Pufferbedingungen durchgeführt wurde. A plifi- zierte PCR-Produkte: 424 bp bis 428 bp. Verwendete PCR-Primer: BS/bll-spezifischer plus-Strang-Primer (5' GATTAATGTGAAAGCATGCTAACTTC; 25 pMol) ; 5'-terminal biotiny- lierter Primer (5' AAATCTGGTACCGGGAACAAAGGAAGAC: 25 pMol) , partiell komplementär (unterstrichen) zum 3'-Teil der cDNA-Sequenz.
(4) Direkte Festphasen-Sequenzierung der PCR-Produkte: Die Reinigung der PCR-Produkte und die Didesoxy-Sequenzierung un¬ ter Verwendung von magnetischen Kügelchen als Festphase wur¬ den durchgeführt wie beschrieben in Holtman, S., Staahl, E. , Hornes, M. , Uhlen, L. , (1989) Nucl. Acids Res. 17, 4937- 4939. Verwendeter Sequenzierungs-Primer: GAATATCTTATATTAATT-
AAGAGTATAG; plus-strang BS/bll.
Beispiel 2
(1) : Tagging und (2) direkte Initiierung der cDNA-Synthese: wie in Beispiel l.
(2.1) Tailing: 2,5 μl der cDNA-Synthesereaktionsmischung wur¬ den für das Tailing mit einem homopolymeren dCTP-Schwanz in 20 μl Endvolumen im Vorhandensein von 10 Einheiten terminaler Transferase (Boehringer, Mannheim) unter den vom Hersteller (Boehringer; Mannheim) beschriebenen Bedingungen eingesetzt.
(3) PCR-Amplifizierung der verlängerten cDNA-Produkte: 2,5 μl der Tagging-Reaktionsmischung wurden direkt in eine Standard- PCR (l' 94°C, 30" 58°C, l' 72°C; 35 Zyklen) eingesetzt, die in einem 50 μl Reaktionsvolumen unter Verwendung von 1 Ein¬ heit Taq-DNA-Polymerase (Stratagene) und unter den vom Her¬ steller (Stratagene) beschriebenen Pufferbedingungen durchge¬ führt wurde. Verwendete PCR-Primer: BS/bll spezifischer plus- Strang-Primer (5' GATTAATGTGAAAGCATGCTAACTTC; 25 pMol) ; 5'- ter inal biotinylierter Primer (5' GGGGGGGGGGGGGGG; 25 pMol) , komplementär oder teilweise komplementär zum 3'-terminalen dC, ■ -Schwanz der cDNA-Sequenz.
(4) Direkte Festphasen-Sequenzierung der PCR-Produkte: ie in Beispiel 1.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Herstellen eines zu einem RNA-Molekül komple¬ mentären DNA-Stranges (cDNA-Stranges) , gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
a) Verknüpfen des 5'-Phosphat-Endes eines beliebigen, ersten DNA-Stranges mit dem 3'-Hydroxyl-Ende eines RNA-Moleküls und
b) Synthetisieren des cDNA-Stranges, ausgehend von dem 3'-Hydroxyl-Ende eines zweiten DNA-Stranges oder Oligonukleo- tids, welcher(s) zu dem mit dem RNA-Molekül verknüpften DNA-Strang komplementär ist, mittels Reverser Transkriptase.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe a) ein zumindest teilweise doppelsträngiges DNA-Molekül eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein doppelsträngiges DNA-Molekül, dessen 5'-Phosphat-Ende ein 5'-überhängendes Ende ist, eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das 5'-überhängende Ende durch Spalten des DNA-Moleküls mittels einer Restriktionsendonuklease erzeugt worden ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß als DNA-Molekül ein Plasmid eingesetzt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verknüpfen in Stufe a) mittels einer Ligase durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Ligase RNA-Ligase eingesetzt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß das 3'-Ende des cDNA-Stranges verlängert wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid an ein doppelsträngiges cDNA/RNA-Hybrid mit glattem Ende angefügt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Verlängerung terminale Desoxynukleotidyl-Transferase eingesetzt wird und homopolymere Nukleotid-Schwänze angefügt werde .
11. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Verlängerung DNA-Ligase eingesetzt wird und Linker an¬ gefügt werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der cDNA-Strang durch Polymerase-Ketten- reaktion (PCR) amplifiziert wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß ein erster Primer eingesetzt wird, dessen Sequenz komplementär zu einer Teilsequenz des mit dem RNA-Molekül verknüpften DNA-Stranges ist, und ein zweiter Primer eingesetzt wird, der komplementär zu dem erzeugten cDNA-Strang oder komplementär zu dem an den cDNA-Strang angefügten Oligonukleotid oder homo¬ polymeren Nukleotid-Schwanz ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß das amplifizierte cDNA-Molekül anschließend sequenziert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß in die PCR als zweiter Primer ein biotinylierter Primer einge¬ setzt wird, und die an diesen Primer synthetisierten cDNA-Stränge vor der Sequenzierung mittels Streptavidin- beschichteter magnetischer Kügelchen gereinigt werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß das amplifizierte cDNA-Molekül kloniert wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß (i) in die PCR als erster und zweiter Primer biotinylierte Primer eingesetzt werden, die die Erkennungssequenz einer Restriktionsendonuklease umfassen, (ii) die amplifizierten cDNA-Moleküle mittels Streptavidin-beschichteter magnetischer Kügelchen gereinigt werden, (iii) die an die magnetischen Kügelchen gebundenen cDNA-Moleküle einer Restriktionsendo¬ nuklease ausgesetzt werden, die für die in den Primern enthal¬ tene Erkennungssequenz spezifisch ist und (iv) die von den magnetischen Kügelchen freigesetzten cDNA-Moleküle kloniert werden.
18. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Analyse von RNA-Molekülen.
19. Verwendung nach Anspruch 18 zur in vitro-Diagnostik von genetischen Defekten, pathogenen RNA-Viren sowie zur Erzeugung von cDNA-Banken.
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