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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erstellen einer
DNA-Bibliothek mit erhöhtem
Anteil einer gewünschten
Nucleinsäure,
indem unter Verwendung eines RecA-Proteins eine andere als die gewünschte Nucleinsäure aus
einer ursprünglichen
DNA-Bibliothek entfernt
wird.
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DNA-Bibliotheken,
insbesondere cDNA-Bibliotheken, sind äußerst nützliche Werkzeuge zum Klonieren
von Genen. Bis heute sind verschiedene Gene aus cDNA-Bibliotheken
kloniert worden. Klonierte Gene werden dazu verwendet, um eine Aminosäuresequenz
eines von dem Gen codierten Proteins zu ermitteln und um eine große Menge
des Proteins in Bakterien- oder Hefezellen zu produzieren sowie
um seine Nucleotidsequenz zu bestimmen.
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cDNAs,
die sich leicht aus einer cDNA-Bibliothek klonieren lassen, sind
jedoch auf solche cDNAs beschränkt,
deren Matrizen-mRNAs in einer Zelle im Überfluss exprimiert werden.
Das Klonieren einer neuen cDNA mit hoher Effizienz wird schwieriger,
da leicht zu klonierende cDNAs meistens schon geklont worden sind.
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Um
neue cDNAs aus einer cDNA-Bibliothek effizient zu klonieren, ist
es nötig,
bereits geklonte cDNAs aus der Bibliothek zu entfernen. Zu diesem
Zweck ist der folgende Stand der Technik erfunden worden.
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Anfangs
ist zu diesem Zweck eine subtraktive Hybridisierung eingesetzt worden.
In diesem Verfahren werden mRNAs aus Zellen (oder Geweben) gewonnen,
welche sowohl die fraglichen Gene exprimieren als auch aus solchen,
die sie nicht exprimieren. Sodann werden DNAs aus den mRNAs in beiden
Zellen synthetisiert. Durch Hybridisierung der synthetisierten cDNAs
mit den mRNAs werden die cDNAs, die in beiden Zellen vorkommen,
selektiv entfernt. Dadurch lassen sich Gene, die in einem besonderen
Gewebe oder einer Zelle spezifisch exprimiert werden, anreichern
und isolieren.
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In "Genome Res. 1996
Sep: 6(9): SS. 791–906" wird eine subtraktive
Hybridisierung unter Einsatz einer Hydroxyapatitsäule beschrieben.
In diesem Verfahren werden Primer mit von Vektoren stammenden Sequenzen
unter Verwendung einer Bibliothek aus einsträngiger DNA als Matrize verlängert. Nach
Denaturierung und Anelierung werden DNAs, die einen Doppelstrang
bilden wieder spezifisch von der Säule entfernt. Da die Wahrscheinlichkeit
der Anelierung von der Konzentration abhängt, werden vorzugsweise reichlich
vorkommende Klone entfernt.
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Dieses
Verfahren lässt
sich jedoch nur auf relativ kurze cDNAs mit einer Größe von annähernd 0,4 – 2,5 kb
anwenden, weil eine unspezifische Hybridisierung auftreten kann,
wenn cDNA-Bibliotheken verwendet werden, welche lange Sequenzen
mit einer Insertgröße von über 3 kb
enthalten. Es stellt sich oft heraus, dass lange Sequenzen funktionell
wichtige Gene darstellen, welche ein multifunktionelles Protein
oder ein Protein mit komplexer Konformation codieren. Daher besteht
der hauptsächliche
Nachteil dieses Verfahrens darin, dass es sich nicht auf eine Bibliothek
anwenden lässt,
die eine lange Sequenz enthält.
Ferner kann dieses Verfahren selbst zwischen kurzen DNAs nicht unterscheiden,
wenn deren Sequenzen von einem identischen Gen stammen, die an ihrem
3'- und 5'-Ende, nicht jedoch
in ihren zentral gelegenen Abschnitten, gemeinsame Sequenzen aufweisen.
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Ein
anderes in breitem Umfang für ähnliche
Zwecke eingesetztes Verfahren ist die differentielle Hybridisierung.
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In
diesem Verfahren werden cDNA-Sonden mit mRNAs synthetisiert, welche
sowohl aus Kontrollzellen als auch aus in Frage stehenden Zellen
gewonnen wurden, aus denen ein spezifisches Gen erhalten wird. Eine aus
den in Frage stehenden Zellen erzeugte cDNA-Bibliothek wird dann ausplattiert und
Kolonien auf derselben Platte werden auf zwei Filter Replica-plattiert.
Für einen
Filter erfolgt die Hybridisierung mit cDNA-Sonden aus den interessierenden
Zellen. Für
den anderen wird eine Hybridisierung mit cDNA-Sonden aus den Kontrollzellen
durchgeführt.
Für die
interessierenden Zellen spezifische cDNAs lassen sich über einen
Vergleich der Ergebnisse nachweisen.
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In
diesem Verfahren jedoch müssen
von Kolonie zu Kolonie Unterschiede bei der Hybridisierung zwischen
zwei Filtern verglichen werden. Demgemäß ist es schwierig, mit diesem
Verfahren zahlreiche Kolonien zu behandeln. Dieses Verfahren ist
somit nicht für
eine Rekonstruktion einer ganzen Bibliothek geeignet. Dieses Verfahren
weist einen zusätzlichen
Nachteil auf, indem es für
die Untersuchung vieler möglicher
pseudo-positiver und pseudo-negativer
Signale einen großen
Zeitaufwand erfordert.
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Um
solche Nachteile dieses Verfahrens zu beheben, wird in 'Methods in Enzymology
1995: 254: SS. 304–321" das Differential
Display-Verfahren beschrieben, welches eine Kombination einer herkömmlichen
differentiellen Hybridisierung mit der Polymerasekettenreaktion
(im Folgenden als "PCR" bezeichnet) ist.
Dieses Verfahren kann jedoch einen Unterschied in einem Muster nur
dann erkennen, wenn der Unterschied im Expressionsniveau signifikant
ist. Darüber
hinaus ist es notwendig, Klone nach jedem auf einem PCR-Produkt beruhenden
Verfahren auszuwählen,
da sich mit diesem Verfahren Klone nicht direkt gewinnen lassen.
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Die
vorliegende Erfindung wurde gemacht, um die obigen Probleme des
Standes der Technik zu lösen. Demgemäß ist es
die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu
stellen, das in der Lage ist, eine gewünschte DNA mit einem langen
Insert in einer DNA-Bibliothek
spezifisch anzureichern und direkt einen Klon der DNA zu liefern.
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Eine
erste Ausführungsform
der Erfindung besteht aus einem Verfahren zur Konstruktion einer
Bibliothek aus ringförmiger
DNA mit einem erhöhten
Anteil an einer ersten doppelsträngigen
DNA, deren Anteil erhöht
werden soll, durch Entfernen einer zweiten doppelsträngigen DNA,
die mit der ersten doppelsträngigen DNA
nicht identisch ist aus einer ursprünglichen Bibliothek aus ringförmiger DNA,
wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst;
- (1) Linearisieren einer ringförmigen DNA in der ursprünglichen
Bibliothek aus ringförmiger
DNA, wodurch eine Bibliothek aus linearer DNA erhalten wird;
- (2) Herstellen einer einzelsträngigen DNA, die der zweiten
doppelsträngigen
entspricht;
- (3) Zufügen
von RecA-Protein zu der Bibliothek aus linearer DNA und der in Schritt
(2) hergestellten zweiten einzelsträngigen DNA, wodurch durch Bindung
der zweiten einzelsträngigen
DNA an die zweite doppelsträngige
DNA mit Hilfe des RecA Proteins eine Triplex-DNA entsteht;
- (4) Selbstligation der linearen DNA, welche die Triplex-DNA,
die in Schritt (3) hergestellt wurde, enthält, um die doppelsträngige DNA,
die keine Triplex-Struktur aufweist, selektiv zu zirkularisieren;
- (5) Entfernen der linearen DNA aus der DNA, welche der Behandlung
von Schritt (4) unterzogen worden ist, wodurch eine DNA-Bibliothek
konstruiert wird, welche einen erhöhten Anteil an der ersten doppelsträngigen DNA
aufweist.
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Insbesondere
werden Verfahren zur Verfügung
gestellt, in denen die linearen DNAs von den DNAs, welche der Behandlung
des Schritts (4) unterzogen worden waren, entfernt werden, indem
ein Wirt mit den aus Schritt (4) erhaltenen DNAs transformiert wird,
um einen Wirt, welcher mit ringförmiger
DNA transformiert wurde, unter Einsatz eines Arzneimittels zu selektionieren.
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Eine
zweite Ausführungsform
der Erfindung besteht aus einem Verfahren zur Herstellung einer
DNA Bibliothek mit einem erhöhten
Anteil an einer ersten doppelsträngigen
DNA, deren Anteil erhöht
werden soll, durch Entfernung einer zweiten doppelsträngigen DNA,
die nicht mit der ersten doppelsträngigen DNA identisch ist, aus
einer ursprünglich
Bibliothek aus ringförmiger
DNA, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst;
- (1) Herstellen einer Bibliothek aus linearer
DNA, welche die erste doppelsträngige
DNA enthält;
- (2) Herstellen von einzelsträngigen
DNAs, die beiden Enden der zweiten doppelsträngigen DNA entsprechen;
- (3) Hinzufügen
von RecA Protein zu der linearen DNA und der in Schritt (2) hergestellten
zweiten einzelsträngigen
DNA, wodurch mit Hilfe des RecA Proteins eine Triplex-DNA durch
Binden der zweiten einzelsträngigen
DNA an die zweite doppelsträngige
DNA hergestellt wird;
- (4) Ligation der linearen DNA, welche die in Schritt (3) hergestellte
Triplex-DNA enthält,
mit einer gewünschten
DNA, um doppelsträngige
DNA, welche keine Triplex-Struktur aufweist, selektiv zu zirkularisieren,
- (5) Entfernen der linearen DNA von der DNA, die der Behandlung
in Schritt (4) unterzogen worden war, wodurch eine DNA Bibliothek
konstruiert wird, die einen erhöhten
Anteil an der ersten doppelsträngigen
DNA aufweist.
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Insbesondere
wird das Verfahren zur Verfügung
gestellt, in dem die linearen DNAs von der DNA, welche der Behandlung
des Schritts (4) unterzogen worden war, entfernt werden, indem ein
Wirt mit den aus Schritt (4) erhaltenen DNAs transformiert wird,
um einen Wirt, welcher mit ringförmiger
DNA transformiert wurde, unter Einsatz eines Arzneimittels zu selektionieren.
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Diese
Zusammenfassung der Erfindung beschreibt nicht notwendigerweise
alle erforderlichen Merkmale, so dass die Erfindung auch eine Unterkombination
dieser beschriebenen Merkmale sein kann.
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Die
Erfindung wird aus der folgenden genauen Beschreibung besser verstanden,
wenn sie zusammen mit den angefügten
Zeichnungen gelesen wird:
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1 ist
ein schematisches Diagramm der Wirkungsweise des RecA-Proteins.
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2 veranschaulicht
ein Grundprinzip einer Ligations-Hemmung in der Erfindung.
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3 veranschaulicht
ein Grundprinzip einer Ligations-Hemmung in der Erfindung.
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Diese
Erfindung erfolgte auf Grundlage der Erkenntnis seitens der Erfinder,
dass die Triplexstruktur selbst nach Abdissoziation des RecA-Proteins
von der Struktur beibehalten wird, wenn die Struktur mit Hilfe des
RecA-Proteins in einem endständigen
Bereich einer Zielnucleinsäure
gebildet wird. Das RecA-Protein und die Bildung der Triplexstruktur
durch das RecA-Protein sind bekannt.
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Hier
erfolgt nun eine Beschreibung des RecA-Proteins.
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Vom
RecA-Protein ist bekannt, dass es bei der homologen Rekombination,
der DNA-Reparatur
und der Expression des SOS-Gens in E. coli eine Rolle spielt. Die
RecA-Proteine aus E. coli und dem Lambda-Phagen sind am meisten
bekannt. Es ist jedoch auch bekannt, dass Proteine mit ähnlicher
Struktur und Funktion wie die des RecA-Proteins von E. coli in anderen
Organismen als E. Coli weit verbreitet sind und im Allgemeinen als
RecA-ähnliches
Protein bezeichnet werden.
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Wie
in 1 gezeigt, bindet das RecA-Protein an eine einzelsträngige DNA
(RecA-ssDNA-Faser)
und vereinigt die einzelsträngige
DNA mit einer doppelsträngigen
DNA zu einem Triplex. Dann sucht es nach einer homologen DNA und
katalysiert eine DNA-Strangaustausch-Reaktion
in Gegenwart von ATP. Nach der Reaktion werden eine Hybrid-dsDNA, die aus der
dsDNA besteht, in welche die ssDNA eingebaut ist, und eine aus der
dsDNA herausgeschnittene ssDNA gebildet.
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Wie
oben beschrieben, bindet das RecA-Protein eine einsträngige Nucleinsäure nicht
wahllos an eine doppelsträngige
Nucleinsäure,
sondern an einen auf jedem Strang der doppelsträngigen DNA sitzenden homologen
Abschnitt. Der hier verwendete Ausdruck, dass zwei Nucleinsäuren homolog
sind, bedeutet, dass sie äquivalent
oder ähnlich
genug sind, damit sich mit Hilfe des RecA-Proteins eine spezifische
Triplexstruktur ausbilden kann. Der hier verwendete Ausdruck "ähnlich" bezieht sich auf eine Identität von beispielsweise
mindestens 50% oder mehr, vorzugsweise 80% oder mehr, mehr bevorzugt
90% oder mehr und noch mehr bevorzugt 95% oder mehr zwischen den
beiden Nucleinsäuren.
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Die
vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur Entfernung einer definierten
DNA aus einer DNA-Bibliothek, wobei die Bildung einer DNA-Triplexstruktur
durch die Bindung einer einzelsträngigen DNA an eine homologe
doppelsträngige
DNA mit Hilfe des RecA-Proteins ausgenutzt wird.
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Der
hier verwendete Ausdruck "RecA-Protein" bezeichnet ein Protein
mit der Fähigkeit,
eine einzelsträngige
Nucleinsäure
an jeden Abschnitt auf einem Strang einer doppelsträngigen Nucleinsäure zu binden, der
homolog zu der einzelsträngigen
Nucleinsäure
ist, und in dem Abschnitt die Bildung einer Triplexstruktur vermittelt.
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Der
Ausdruck "RecA-Protein" umfasst daher sowohl
das dem RecA ähnliche
Protein als auch von E. coli und dem Lambdaphagen stammende RecA-Proteine.
Wie oben beschrieben, lässt
sich das dem RecA ähnliche
Protein im vorliegenden Verfahren einsetzen, so lang es nur über die
Funktion verfügt,
die das Ankoppeln an homologe DNAs fördert und die Ausbildung einer
Triplex-DNA katalysiert.
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Das
in der Erfindung bevorzugt eingesetzte RecA-Protein ist das von
E. coli stammende.
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Der
Ausdruck "DNA-Bibliothek" bedeutet eine Gruppe
verschiedener DNA-Fragmente und wird hier im Allgemeinen als ein
allgemeiner Ausdruck benutzt, der sich sowohl auf eine Gen-Bibliothek
als auch auf eine cDNA-Bibliothek bezieht. " Gen-Bibliothek" bedeutet eine Liste von ganzen DNA-Fragmenten
in einer in Phagen oder Cosmiden enthaltenen einzelnen Spezies und
ist gleichbedeutend mit dem Ausdruck "genomische DNA-Bibliothek". "cDNA-Bibliothek" bezeichnet eine
Liste von verschiedenen cDNA-Spezies, die durch Insertion von komplementären DNAs
(im Folgenden als cDNAs bezeichnet) in Vektoren erhalten wurden,
wobei die komplementären
DNAs von mRNAs erzeugt wurden, die von einem gegebenen Gewebe oder
Zellen stammen. Die DNA-Fragmente brauchen nicht ringförmig zu
sein, da sie in Phagen, Cosmide oder Plasmide eingebaut werden,
weshalb die Bibliothek nur aus den DNA-Fragmenten bestehen kann.
Die DNA-Bibliothek kann alle Arten, z.B. zwei Arten, von DNA-Fragmenten
enthalten.
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Doppelsträngige DNA
und einzelsträngige
DNA werden in dieser Beschreibung als dsDNA bzw. ssDNA abgekürzt.
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Im
Folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren
genauer beschrieben.
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Eine
erste Ausführungsform
der Erfindung besteht aus einem Verfahren zur Herstellung einer
Bibliothek aus ringförmiger
DNA mit einem erhöhten
Anteil an einer erwünschten
Nucleinsäure
durch Entfernung einer vorgegebenen DNA aus einer ursprünglich Bibliothek
aus ringförmiger
DNA unter Einsatz des RecA-Proteins. Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird eine ringförmige
DNA in der ursprünglichen Bibliothek
in eine linearisierte DNA überführt. Zur Überführung einer
ringförmigen
DNA in eine linearisierte DNA kann z.B. die ringförmige DNA
mit einem passenden Restriktionsenzym gespalten werden. Vorzugsweise spaltet
das Restriktionsenzym die ringförmige
DNA nur an einer Stelle. Zur Spaltung mit dem Restriktionsenzym
lassen sich allgemeine Verfahren einsetzen. Sodann wird im zweiten
Schritt eine ssDNA gewonnen, die einer zweiten dsDNA entspricht,
welche aus der DNA-Bibliothek entfernt werden muss.
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Der
hier verwendete Ausdruck "entsprechend" einer zweiten DNA,
die entfernt werden muss bedeutet, dass die ssDNA in jedem Strang
einen Abschnitt mit einer Nucleotidsequenz aufweist, die im Wesentlichen gleich
ist mit der ganzen oder einem Teil der zweiten dsDNA. Der Ausdruck "mit einer im Wesentlichen
gleichen Sequenz" bedeutet,
dass eine gegebene DNA eine Nucleotidsequenz aufweist, die ausreichend äquivalent
ist, damit sich mit Hilfe des RecA-Proteins eine Trplex-DNA ausbilden
kann.
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Die
zweite dsDNA kann 1–13
kb groß sein.
Vorzugsweise weist sie einen Umfang von 6 kb oder mehr auf und ist
in einer nach der Größe fraktionierten
Bibliothek enthalten.
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Diese
dsDNAs in der Bibliothek sitzen gewöhnlich auf Plasmiden oder Virusvektoren.
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Zur
Gewinnung einer der zweiten dsDNA entsprechenden ssDNA kann ein
in vitro-Transkriptionssystem
eingesetzt werden. Das SP6-Transkriptionssystem (Ambion Co.) wird
an Inserts in einer DNA.Bibliothek benutzt, die auf pSPORT1, einen
in vitro-Transkriptionsvektor
transferiert worden war, um RNA zu synthetisieren. Sodann wird cDNA
mit passenden Primern wie dem Random-Primer N6 (Takara Syuzo Co.
Ltd.) und reverser Transkriptase wie Superscript II RT (Invitrogen
Co.) synthetisiert. Schließlich
ergibt die Reinigung der cDNA durch Entfernung der Proteine mit
Phenol/Chloroform ssDNA. Das oben beschriebene Verfahren der cDNA-Gewinnung
ist dem Fachmann gut bekannt.
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Um
eine ssDNA zu erzeugen, die einer dsDNA in einer Bibliothek entspricht,
kann dsDNA auch mit Nuclease wie Exo III und T7 Gen 6 behandelt
werden, gefolgt von der Einführung
eines Nicks in die dsDNA mit Nickase und dergl. Verfahrensweisen
zur Überführung einer
dsDNA in eine ssDNA sind, jedoch nicht ausschließlich die Gewinnung von ssDNA
mit Phagemid-Vektoren wie pBluescript, pGEM und pUC119 als Phagenpartikel.
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Nachher
werden im dritten Schritt das RecA-Protein und die zweite ssDNA
zu der DNA-Bibliothek
gegeben.
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Wie
oben beschrieben enthält
die der erzeugten zweiten dsDNA entsprechende ssDNA in jedem Strang
eine Nucleotidsequenz, die mit der ganzen oder einem Teil der zweiten
ds-DNA identisch ist. Demgemäß verursacht
die Zugabe der im vorhergehenden Schritt gewonnen ssDNA und des
RecA-Proteins zur zweiten dsDNA ein Fortschreiten der Bildungsreaktion
von Triplex-DNA (siehe 2).
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Für die Länge der
ssDNA sind mindestens 10 oder mehr, vorzugsweise 15 oder mehr, vorzugsweise 20
oder mehr, mehr bevorzugt 30 oder mehr, noch mehr bevorzugt 40 oder
mehr, am meisten bevorzugt 60 Basenpaare oder mehr erwünscht, um
die Triplexstruktur nach dem Abdissoziieren des RecA-Proteins aus
der Struktur stabil zu halten.
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Für eine stabile
Ausbildung der Triplexstruktur liegt das außenliegende (d.h. die abschließende Endseite
der dsDNA) der beiden Enden der Triplexstruktur vorzugsweise außerhalb
der fünfzigsten,
mehr bevorzugt dreißigsten,
mehr bevorzugt zwanzigsten und noch mehr bevorzugt zehnten Base,
vom abschließenden Ende
der dsDNA aus gerechnet.
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Die
Gegenwart von ATP in einer Probe hat das Fortschreiten der homologen
Rekombination sowie den augenblicklichen Zusammenbruch der erzeugten
Triplexstruktur zur Folge, da das RecA-Protein normalerweise eine
homologe Rekombination in Gegenwart von ATP katalysiert.
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Die
Zugabe einer Alternative für
ATP wie z.B. GTP und ITP oder eines nicht abbaubaren Analogen von ATP
wie z.B. ATPγS
wird zur Ausbildung einer Triplexstruktur durch das RecA-Protein
benötigt.
Es ist bekannt, dass die vom RecA-Protein vermittelte Austauschreaktion
in Gegenwart von GTP oder ITP nicht fortschreitet.
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Dann
erfolgt im vierten Schritt die Selbstligationsreaktion an DNAs,
welche die im vorausgegangenen Schritt erzeugte Triplex-DNA enthalten.
Während
eine Selbstligation an einer DNA, mit der die Triplexstruktur gebildet
worden war, nicht vorkommt, tritt sie an einer dsDNA, mit der die
Triplexstruktur nicht gebildet wurde, auf und ergibt eine ringförmige DNA.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Selbstligation" bezeichnet die Bildung
einer ringförmigen
DNA durch Ligation der 5'-
und 3'-Enden einer
gegebenen linearen DNA.
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Die
Ligationsreaktion kann mit allgemeinen Verfahren durchgeführt werden.
Eine Ligation (37°C,
30 Minuten) mit einer T4 DNA-Ligase (Invitrogen Co.) kann eine ringförmige DNA
erzeugen. Andere im Handel erhältliche
Ligations-Kits können
ebenfalls eingesetzt werden.
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In
der Erfindung kann ein Zyklus vom obigen ersten bis zum vierten
Schritt mehr als einmal wiederholt werden.
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Im
fünften
Schritt werden die linearen DNAs von den im vorherigen Schritt erzeugten
DNAs entfernt, um eine DNA-Bibliothek mit einem erhöhtem Anteil
an der ersten dsDNA zu erstellen.
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Um
eine lineare Triplex-DNA von einer ringförmigen DNA, deren Anteil erhöht werden
soll, zu trennen, kann die Trennung mittels Elektrophorese auf Agarosegel
und Zentrifugation in Gegenwart von Ethidiumbromid eingesetzt werden.
Falls eine verwendete DNA-Bibliothek ein Gen für Arzneimittelresistenz aufweist,
kann die DNA, jedoch nicht ausschließlich, in Wirte transformiert
werden, um unter Einsatz des Arzneimittels einen mit ringförmiger DNA
transformierten Wirt zu selektieren.
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Im
vorliegenden Verfahren kann auf den Schritt zur Triplexbildung durch
das RecA-Protein ein Schritt zur Abdissoziation des RecA-Protein
von der Triplexstruktur folgen.
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Der
Einfachheit halber wird in 2 und der
obigen Beschreibung eine von zwei dsDNAs entfernt. Es ist jedoch
darauf hinzuweisen, dass verfahrensgemäß Dutzende unter Tausend dsDNAs
gleichzeitig oder nacheinander aus Abertausenden von dsDNAs entfernt
werden können.
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In
der zweiten Ausführungsform
der Erfindung wird ein Verfahren zur Einrichtung einer DNA-Bibliothek mit
erhöhtem
Anteil einer gewünschten
Nucleinsäure
zur Verfügung
gestellt, indem eine spezifische DNA aus einer DNA-Bibliothek effizienter
entfernt wird als durch den Einsatz des Verfahrens der ersten Ausführungsform.
Genauer gesagt wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, in welchem die
Effizienz der Ligationshemmung durch das RecA-Protein verbessert
wird, indem die Ligationsreaktion an beiden Enden einer Nucleinsäure gehemmt
wird.
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Im
ersten Schritt des Verfahrens wird eine Bibliothek aus linearer
DNA eingerichtet. Lineare DNA lässt sich
gewinnen, indem ein DNA-Fragment aus einer ringförmigen DNA herausgeschnitten
wird oder mittels PCR. Auch die Erzeugung von cDNA durch reverse
Transkription von mRNA kann zur Erzeugung von linearer DNA verwendet
werden. Um ein DNA-Fragment zu erhalten, können verschiedene andere Verfahren
eingesetzt werden. Für
den Fall von cDNA-Bibliotheken können
diese erstellt werden, indem in einen Vektor insertierte Insert-cDNA
herausgeschnitten wird.
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Für das Herausschneiden
von DNA, die PCR, die reverse Transkription von mRNA und andere
Erzeugungen von linearer DNA lassen sich allgemeine Verfahren einsetzen.
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Im
zweiten Schritt werden folglich ssDNAs gewonnen, die beiden endständigen Sequenzen
in der aus der DNA-Bibliothek entfernten dsDNA entsprechen. Der
hier verwendete Begriff "beide
endständigen
Sequenzen" bezieht
sich auf die Sequenzen am 5'-
und 3'-Ende der
zweiten dsDNA.
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Der
hier verwendete Begriff "entsprechend
beiden endständigen
Sequenzen" bedeutet
dass jede ssDNA in irgendeinem Bereich über die 5'-terminale und 3'-terminale Sequenz der zweiten dsDNA
verfügt
oder über
eine Nukleotidsequenz, die im Wesentlichen identisch zu Teilbereichen
derselben sind. Der Ausdruck "mit einer
im Wesentlichen identischen Nukleotidsequenz" bedeutet, wie oben beschrieben, dass
die Sequenz soviel Äquivalenz
aufweist, dass sich mit Hilfe des RecA-Proteins eine Troplex-DNA
bilden kann.
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Sodann
werden im dritten Schritt das RecA-Protein und die zweite ssDNA
zu der DNA-Bibliothek
gegeben. Wie oben beschrieben, bewirkt dieser Schritt das Fortschreiten
der Triplex-DNA-Bildungsreaktion.
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Als
nächstes
werden im vierten Schritt die DNAs, welche die im vorausgegangenen
Schritt erhaltene Triplex-DNA enthalten, mit einer gewünschten
DNA ligiert. Während
an Triplex-DNA keine
Ligation auftritt, erfolgt eine Ligation an dsDNA ohne Triplexstruktur
und ergibt eine ringförmige
DNA.
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In
diesem Verfahren bezeichnet "eine
gewünschte
DNA" allgemein,
jedoch nicht notwendigerweise, einen Vektor zum Erstellen einer
Bibliothek wie z.B. Phagen, Cosmide und Plasmide.
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Im
fünften
Schritt sorgt die Entfernung von linearer DNA aus den im vorhergehenden
Schritt gewonnenen DNAs für
eine DNA-Bibliothek mit einem erhöhten Anteil an der ersten dsDNA.
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Lineare
Triplex-DNA, die entfernt werden soll, kann, wie oben beschrieben,
von der ringförmigen
DNA deren Anteil erhöht
werden soll, abgetrennt werden.
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Die
in den Zeichnungen gezeigten spezifischen Reaktionen und Strukturen
sollen nur dem besseren Verständnis
dienen. Demgemäß kann es
sein, dass deren genaue Merkmale nicht mit den in den Figuren gezeigten übereinstimmen.
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Die
Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele genauer veranschaulicht.
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Beispiele
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Beispiel 1
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In
diesem Beispiel entfernten wir ein Plasmid aus einer Mischung von
zwei Plasmiden durch Ligationshemmung unter Verwendung des RecA-Proteins.
Wir verwendeten ein Plasmid pBC23C10 mit Chloramphenicol-Resistenz
und eine Plasmid pBS1B3 mit Ampicillin-Resistenz und entfernten ein Plasmid
aus der Mischung der beiden Plasmide. pBC23C10 und pBS1B3 wurden
im Verhältnis
1000 : 1 miteinander vermischt und an einer Stelle mit dem Restriktionsenzym
NotI verdaut, um lineare dsDNA zu erhalten. Es folgte die Spaltung
von pBC23C10 mit SalI und NotI, das bereits mit SalI und NotI gespaltene
pSPORT1 (Invitrogen Co.) und die Insert-DNA wurden ligiert. Nach
dem Transfer auf das für
eine in vitro-Transkription
befähigte
pSPORT1 synthetisierten wir RNA unter Verwendung des Transskriptionssystems
SP6 (Ambion Inc.). 6,25 μg
des Random-Primers N6 (Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden zu 5 μg der erhaltenen
RNA gegeben, in der Hitze denaturiert und mit Eiswasser schnell
abgekühlt.
Es wurden 40 Einheiten RNAse-Inhibitor (Toyobo Co., Ltd.), 4 μl 5× First Strand
Buffer (Invitrogen Co.), 2 μl
0,1 M Dithiothreitol und 1 μl
10 mM dNTP-Mix (Invitrogen
Co.) zugegeben. Nach Zugabe von 5 μl SuperScript II RT (Invitrogen
Co.), wurde sterilisiertes destilliertes Wasser bis zu 20 μl zugesetzt.
Es wurde durch eine Reaktion bei 37°C über 60 Minuten cDNA synthetisiert.
Die cDNA wurde durch das Entfernen von Protein mit Phenol/Chloroform
gereinigt. Die Reaktionsmischung I zur Triplexbildung enthielt in
einem Volumen von insgesamt 20 μl
30 mM Trisacetat ((pH 6,9), 1 mM Magnesiumacetat, 1 mM Dithiothreitol,
100 ng synthetisierter von pBC23C10 stammender cDNA, 5 μg RecA-Protein
(EPICENTRE Co.) und sterilisiertes destilliertes Wasser und wurde
bei 37°C
15 Minuten lang erwärmt.
Die Reaktionsmischung II zur Triplexbildung enthielt in einem Volumen
von insgesamt 18 μl
30 mM Trisacetat ((pH 6,9), 23 mM Magnesiumacetat, 1 mM Dithiothreitol,
50 ng der mit NotI gespaltenen Bibliothek und sterilisiertes destilliertes
Wasser. Sie wurde mit der Reaktionsmischung I zur Triplexbildung
vermischt und bei 37°C
30 Minuten lang erwärmt.
Nach Zugabe von 2 μl
einer 100 mM GTP-Lösung wurde
die Reaktion bei 37°C
30 Minuten lang durchgeführt.
Nach einer Proteolyse wird die DNA gereinigt. Die Ligation erfolgte
30 Minuten lang bei 37°C
mit T4 DNA-Ligase (Invitrogen Co.). Sodann wurde die DNA gereinigt
und durch Transformation von E. coli mit der gereinigten DNA eine
Bibliothek wiedererstellt. Es zeigte sich, dass nur ein zu entfernendes
Plasmid selektiv auf 1/400 abgenommen hat.
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Tabelle
1 Selektive
Entfernung von einem Plasmid aus einer Mischung von zwei Plasmiden
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Beispiel 2
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Wir
entfernten zuvor geklonte Plasmide (3000 Klone) aus einer Plasmid-Bibliothek
durch Triplexbildung unter Verwendung des RecA-Proteins. In pBlueScript
SKII (+) Inserts aus einer Plasmidbibliothek wurden auf pSPORT1
(Invitrogen Co.), einen in vitro-Transkriptions-Vektor, transferriert, um mit dem SP6-Transskriptionssystem
(Ambion Inc.) RNA zu synthetisieren. 6,25 μg des Random-Primers N6 (Takara
Shuzo Co., Ltd.) wurden zu 5 μg
der erhaltenen RNA gegeben, in der Hitze denaturiert und mit Eiswasser
schnell abgekühlt.
Es wurden 40 Einheiten RNAse-Inhibitor (Toyobo Co., Ltd.), 4 μl 5× First
Strand Buffer (Invitrogen Co.), 2 μl 0,1 M Dithiothreitol und 1 μl 10 mM dNTP-Mix
(Invitrogen Co.) zugegeben. Nach Zugabe von 5 μl SuperScript II RT (Invitrogen
Co.), wurde sterilisiertes destilliertes Wasser bis zu 20 μl zugesetzt.
Es wurde durch eine Reaktion bei 37°C über 60 Minuten cDNA synthetisiert.
Das Entfernen von Protein mit Phenol/Chloroform ergab eine gereinigte
DNA. Die Plasmid-Bibliothek wurde mit dem Restriktionsenzym NotI,
welches Plasmid-DNA nur an einer Stelle spaltet, zu linearer DNA
verdaut Die Reaktionsmischung I zur Triplexbildung enthielt in einem
Volumen von insgesamt 20 μl
30 mM Trisacetat ((pH 6,9), 1 mM Magnesiumacetat, 1 mM Dithiothreitol,
100 ng synthetisierte cDNA, 5 μg
RecA-Protein (EPICENTRE
Co.) und sterilisiertes destilliertes Wasser und wurde bei 37°C 15 Minuten
lang erwärmt.
Die Reaktionsmischung II zur Triplexbildung enthielt in einem Volumen
von insgesamt 18 μl
30 mM Trisacetat ((pH 6,9), 23 mM Magnesiumacetat, 1 mM Dithiothreitol,
50 ng der mit NotI gespaltenen Bibliothek und sterilisiertes destilliertes
Wasser, wurde mit der Reaktionsmischung I zur Triplexbildung vermischt
und dann bei 37°C
30 Minuten lang erwärmt.
Nach Zugabe von 2 μl
einer 100 mM GTP-Lösung
wurde die Reaktion bei 37°C
30 Minuten lang durchgeführt.
Nach einer Proteolyse wurde die DNA gereinigt. Die Ligation erfolgte
30 Minuten lang bei 37°C
mit T4 DNA-Ligase (Invitrogen Co.). Sodann wurde die DNA gereinigt
und durch Transformation von E. coli mit der gereinigten DNA eine
Bibliothek wiedererstellt. Wir sequenzierten zufällig ausgesuchte 96 Klone und
bestimmten die Häufigkeit
des Auftretens von unbekannten Klonen über einen Vergleich ihrer Sequenzen
mit denen von bekannten Klonen in einer Datenbank. Ein einziger
Durchlauf des Verfahrens zur Entfernung bekannter Klone erhöhte die
Häufigkeit
von ca. 60% auf ca. 80%.
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Tabelle
2 Auftreten
eines neuen Klons nach dem Entfernen
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Beispiel 3
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Zum
Zweck der Verbesserung der Effizienz der Ligationshemmung unter
Verwendung von RecA-Protein entfernten wir ein Plasmid aus einer
Mischung von zwei Plasmiden, indem die Ligation beider Enden eines Gens
gehemmt wurde.
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Die
Plasmide wurden mit den Restriktionsenzymen NotI und MulI verdaut,
welche beide Enden von insertierten Genen spalten. Um RNA mit den
verdauten Plasmiden als Matrizen zu synthetisieren, wurden das T7-Transskriptionssystem
(Ambion Co.) und das T3-Transskriptionssystem
(Ambion Co.) verwendet. 6,25 μg des
Random-Primers N6 (Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden zu 5 μg der erhaltenen
RNA gegeben, in der Hitze denaturiert und mit Eiswasser schnell
abgekühlt.
Es wurden 40 Einheiten RNAse-Inhibitor (Toyobo Co., Ltd.), 4 μl 5× First
Strand Buffer (Invitrogen Co.), 2 μl 0,1 M Dithiothreitol und 1 μl 10 mM dNTP-Mix
(Invitrogen Co.) zugegeben. Nach Zugabe von 5 μl SuperScript II RT (Invitrogen
Co.), wurde sterilisiertes destilliertes Wasser bis zu 20 μl zugesetzt.
Es wurde durch eine Reaktion bei 37°C über 60 Minuten cDNA synthetisiert.
Das Entfernen von Protein mit Phenol/Chloroform ergab eine gereinigte
DNA. Um die insertierten Gene auszuschneiden, wurden die Plasmide
mit NotI und MulI verdaut, einer Kombination von Restriktionsenzymen,
die beide Enden der insertierten Gene spalten. Die Reaktionsmischung
I zur Triplexbildung enthielt in einem Volumen von insgesamt 20 μl 30 mM Trisacetat
((pH 6,9), 1 mM Magnesiumacetat, 1 mM Dithiothreitol, jeweils 100
ng von jedem Ende entsprechenden cDNAs, 5 μg RecA-Protein (EPICENTRE Co.)
und sterilisiertes destilliertes Wasser und wurde bei 37°C 15 Minuten
lang erwärmt.
Die Reaktionsmischung II zur Triplexbildung enthielt in einem Volumen
von insgesamt 18 μl
30 mM Trisacetat ((pH 6,9), 23 mM Magnesiumacetat, 1 mM Dithiothreitol, 50
ng der mit NotI und MulI gespaltenen Plasmide und sterilisiertes
destilliertes Wasser, wurde dann bei 37°C 30 Minuten lang erwärmt. Sie
wurde mit der Mischung I zur Triplexbildung vermischt und bei 37°C 30 Minuten lang
erwärmt.
Nach Zugabe von 2 μl
einer 100 mM GTP-Lösung
wurde die Reaktion bei 37°C
30 Minuten lang durchgeführt.
Nach einer Proteolyse wurde die DNA gereinigt. Die Ligation erfolgte
30 Minuten lang bei 37°C mit
T4 DNA-Ligase (Invitrogen Co.). Sodann wurde die DNA gereinigt und
E. coli mit der gereinigten DNA transformiert, um die Wirkungen
auf die Ligationshemmung zu ermitteln.
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Die
Zugabe von cDNAs, die jeweils einem Ende der insertierten Gene entsprachen,
zeigte einen synergistischen Hemmeffekt, wenn sie mit der Zugabe
von nur einer cDNA verglichen wurden.
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Tabelle
3 Ergebnis
der selektiven Entfernung eines Klons unter Einsatz einer Ligationhshemmung
durch Ausbildung einer Triplexstruktur an beiden Enden
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Die
Zahlen in der Tabelle 3 geben die Anzahl der Kolonien wieder. In
den Klammern im unteren Teil ist das Verhältnis der mit Ligationshemmung
erhaltenen Anzahl zu der ohne Ligationshemmung erhaltenen Anzahl
von Kolonien angegeben.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt die direkte Erstellung
einer DNA-Bibliothek
mit einem erhöhten
Anteil einer gewünschten
Nucleinsäure,
indem andere als die gewünschte
Nucleinsäuren
aus der ursprünglichen
DNA-Bibliothek entfernt werden. Wie in den obigen Beispielen gezeugt,
lassen sich 90% oder mehr bekannte dsDNA mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
entfernen.
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Darüber hinaus
lässt sich
mit einem Verfahren, in welchem die Triplex-Struktur an beiden Enden
einer dsDNA eingeführt
wird, der Gehalt an bekannten Genen auf ein hundertstel senken,
im Gegensatz zu einem Verfahren, bei dem die Struktur nur an einem
der beiden Enden eingeführt
wird. Je nach dem Typ der Bibliothek, der in der Erfindung verwendet
wird, erhöht
sich die Häufigkeit
des Auftretens eines neuen Klons in der Bibliothek um 10%–99%.
