JP2003169672A - ライゲーション阻害を用いてライブラリーを加工する方法 - Google Patents
ライゲーション阻害を用いてライブラリーを加工する方法Info
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- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、ＤＮＡライブラリーから、長いイ
ンサートサイズの所望のＤＮＡを特異的に濃縮すること
が可能であり、且つ該ＤＮＡのクローンを直接取得する
ことができる方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明は、含有率を増加せしめるべき第
一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第
一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去する
ことによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加し
たＤＮＡライブラリーを構築する方法が提供される。
ンサートサイズの所望のＤＮＡを特異的に濃縮すること
が可能であり、且つ該ＤＮＡのクローンを直接取得する
ことができる方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 本発明は、含有率を増加せしめるべき第
一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第
一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去する
ことによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加し
たＤＮＡライブラリーを構築する方法が提供される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＲｅｃＡタンパク
質を用いてＤＮＡライブラリーから所望の核酸以外の核
酸を除去することにより、所望の核酸の含有率が増加し
たＤＮＡライブラリーを構築する方法に関する。
質を用いてＤＮＡライブラリーから所望の核酸以外の核
酸を除去することにより、所望の核酸の含有率が増加し
たＤＮＡライブラリーを構築する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡライブラリー、とりわけｃＤＮＡ
ライブラリーは、遺伝子をクローニングするための極め
て有用なツールである。これまでに、ｃＤＮＡライブラ
リーから多くの遺伝子がクローニングされている。クロ
ーニングされた遺伝子は、遺伝子自身の塩基配列を決定
するのに用いられるのみならず、該遺伝子によってコー
ドされるタンパク質のアミノ酸配列を決定したり、該タ
ンパク質を細菌や酵母細胞内で大量に作らせるために用
いられている。
ライブラリーは、遺伝子をクローニングするための極め
て有用なツールである。これまでに、ｃＤＮＡライブラ
リーから多くの遺伝子がクローニングされている。クロ
ーニングされた遺伝子は、遺伝子自身の塩基配列を決定
するのに用いられるのみならず、該遺伝子によってコー
ドされるタンパク質のアミノ酸配列を決定したり、該タ
ンパク質を細菌や酵母細胞内で大量に作らせるために用
いられている。
【０００３】しかしながら、ｃＤＮＡライブラリーから
容易にクローニングし得るｃＤＮＡは、その鋳型となっ
たｍＲＮＡが細胞中に大量に発現しているｃＤＮＡに限
られるため、多くの遺伝子がクローニングされた現在で
は、クローニングし易いｃＤＮＡの多くは殆どクローニ
ングされてしまい、新規なｃＤＮＡを効率よくクローニ
ングすることが困難になりつつある。
容易にクローニングし得るｃＤＮＡは、その鋳型となっ
たｍＲＮＡが細胞中に大量に発現しているｃＤＮＡに限
られるため、多くの遺伝子がクローニングされた現在で
は、クローニングし易いｃＤＮＡの多くは殆どクローニ
ングされてしまい、新規なｃＤＮＡを効率よくクローニ
ングすることが困難になりつつある。
【０００４】ｃＤＮＡライブラリーから新規なｃＤＮＡ
を効率よくクローニングするためには、既にクローニン
グされたｃＤＮＡをライブラリーから除去することが必
要であり、この目的のために、以下の従来技術が考案さ
れている。
を効率よくクローニングするためには、既にクローニン
グされたｃＤＮＡをライブラリーから除去することが必
要であり、この目的のために、以下の従来技術が考案さ
れている。
【０００５】まず、この目的を達するために使用されて
いる最も基本的な方法としては、差引きハイブリダイゼ
ーションがある。
いる最も基本的な方法としては、差引きハイブリダイゼ
ーションがある。
【０００６】該方法では、目的の遺伝子を発現している
細胞（又は組織）と目的の遺伝子を発現していない細胞
からｍＲＮＡを調製し、一方からｃＤＮＡを合成した
後、両者をハイブリダイゼーションさせるので、両細胞
に共通するｃＤＮＡのみが除去され、ある組織や細胞に
特異的に発現している遺伝子を濃縮、単離することが可
能となる。
細胞（又は組織）と目的の遺伝子を発現していない細胞
からｍＲＮＡを調製し、一方からｃＤＮＡを合成した
後、両者をハイブリダイゼーションさせるので、両細胞
に共通するｃＤＮＡのみが除去され、ある組織や細胞に
特異的に発現している遺伝子を濃縮、単離することが可
能となる。
【０００７】差引きハイブリダイゼーションを利用した
方法としては、「Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １９９６ Ｓ
ｅｐ；６（９）：７９１−８０６」が、ヒドロキシアパ
タイトカラムを用いた差引きハイブリダイゼーション法
を開示している。該方法では、一本鎖ＤＮＡライブラリ
ーをテンプレートとしてベクター由来の配列からのプラ
イマーの伸長反応を行い、変性・再会合した後、再び二
本鎖となるもののみをヒドロキシアパタイトカラムを用
いて除去する。再会合する確率は濃度に依存するため、
多数存在するクローンから優先的に除去される。
方法としては、「Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １９９６ Ｓ
ｅｐ；６（９）：７９１−８０６」が、ヒドロキシアパ
タイトカラムを用いた差引きハイブリダイゼーション法
を開示している。該方法では、一本鎖ＤＮＡライブラリ
ーをテンプレートとしてベクター由来の配列からのプラ
イマーの伸長反応を行い、変性・再会合した後、再び二
本鎖となるもののみをヒドロキシアパタイトカラムを用
いて除去する。再会合する確率は濃度に依存するため、
多数存在するクローンから優先的に除去される。
【０００８】しかしながら、インサートサイズが３ｋｂ
を超えるような長い配列を含むｃＤＮＡライブラリーの
場合、非特異的ハイブリダイゼーションが起こる可能性
が高くなるので、該方法は、０．４〜２．５ｋｂ程度の
比較的短いＤＮＡからなるｃＤＮＡにしか適用できな
い。長い配列は、多機能タンパクや複雑な構造のタンパ
ク質をコードする機能的に重要な遺伝子を含む可能性が
高いので、長い配列を含むライブラリーに適用し得ない
ことは、本方法の大きな欠点である。また、同一の遺伝
子に由来し、３’末端と５’末端が共通であるが、中央
が異なる配列は、短いｃＤＮＡであっても該方法では区
別することができない。
を超えるような長い配列を含むｃＤＮＡライブラリーの
場合、非特異的ハイブリダイゼーションが起こる可能性
が高くなるので、該方法は、０．４〜２．５ｋｂ程度の
比較的短いＤＮＡからなるｃＤＮＡにしか適用できな
い。長い配列は、多機能タンパクや複雑な構造のタンパ
ク質をコードする機能的に重要な遺伝子を含む可能性が
高いので、長い配列を含むライブラリーに適用し得ない
ことは、本方法の大きな欠点である。また、同一の遺伝
子に由来し、３’末端と５’末端が共通であるが、中央
が異なる配列は、短いｃＤＮＡであっても該方法では区
別することができない。
【０００９】また、同様の目的を達成するために多用さ
れる他の方法として、ディファレンシャルハイブリダイ
ゼーションがある。
れる他の方法として、ディファレンシャルハイブリダイ
ゼーションがある。
【００１０】該方法では、特異的遺伝子の取得を目的と
する細胞と対照の細胞から調製したｍＲＮＡを用いて、
ｃＤＮＡのプローブを合成する。続いて、目的の細胞か
ら作成したｃＤＮＡライブラリーをプレートに播種し、
同一プレートからコロニーを２枚のフィルターにレプリ
カする。一方のフィルターは目的の細胞由来のｃＤＮＡ
プローブを用いて、他方のフィルターは対照細胞由来の
ｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションを行
い、結果を比較すれば、目的の細胞に特異的なｃＤＮＡ
を検出することができる。
する細胞と対照の細胞から調製したｍＲＮＡを用いて、
ｃＤＮＡのプローブを合成する。続いて、目的の細胞か
ら作成したｃＤＮＡライブラリーをプレートに播種し、
同一プレートからコロニーを２枚のフィルターにレプリ
カする。一方のフィルターは目的の細胞由来のｃＤＮＡ
プローブを用いて、他方のフィルターは対照細胞由来の
ｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションを行
い、結果を比較すれば、目的の細胞に特異的なｃＤＮＡ
を検出することができる。
【００１１】しかしながら、この方法は、２つのフィル
ターのハイブリダイゼーションの差をコロニー毎に比較
しなければならないため、多くのコロニーを処理するこ
とが難しく、ライブラリー全体の再構築には向いていな
い。また、該方法には、偽陽性もしくは偽陰性のシグナ
ルが多くあるために、検討に時間を要するという欠点も
存する。
ターのハイブリダイゼーションの差をコロニー毎に比較
しなければならないため、多くのコロニーを処理するこ
とが難しく、ライブラリー全体の再構築には向いていな
い。また、該方法には、偽陽性もしくは偽陰性のシグナ
ルが多くあるために、検討に時間を要するという欠点も
存する。
【００１２】このため、該方法のかかる欠点を克服する
ために、”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
１９９５； ２５４：３０４−３２１”は、従来のデ
ィファレンシャルハイブリダイゼーションとポリメラー
ゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと称する）を組み合わせたディ
フェレンシャルディスプレー法を開示しているが、該方
法は発現レベルの差が著しくないとパターンの差が見出
せないのみならず、クローンを直接取得できないため
に、ＰＣＲ産物をもとに何らかの方法によってクローン
を選択しなければならない。
ために、”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
１９９５； ２５４：３０４−３２１”は、従来のデ
ィファレンシャルハイブリダイゼーションとポリメラー
ゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと称する）を組み合わせたディ
フェレンシャルディスプレー法を開示しているが、該方
法は発現レベルの差が著しくないとパターンの差が見出
せないのみならず、クローンを直接取得できないため
に、ＰＣＲ産物をもとに何らかの方法によってクローン
を選択しなければならない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来技術に
存する上記課題を解決するためになされたものであり、
ＤＮＡライブラリーから、長いインサートサイズの所望
のＤＮＡを特異的に濃縮することが可能であり、且つ該
ＤＮＡのクローンを直接取得することができる方法を提
供することを目的とする。
存する上記課題を解決するためになされたものであり、
ＤＮＡライブラリーから、長いインサートサイズの所望
のＤＮＡを特異的に濃縮することが可能であり、且つ該
ＤＮＡのクローンを直接取得することができる方法を提
供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明の第一の態様にお
いて、ＲｅｃＡタンパク質を用いて環状ＤＮＡライブラ
リーから特定のＤＮＡを除去することにより、所望の核
酸の含有率が増加した環状ＤＮＡライブラリーを構築す
る方法を提供する。
いて、ＲｅｃＡタンパク質を用いて環状ＤＮＡライブラ
リーから特定のＤＮＡを除去することにより、所望の核
酸の含有率が増加した環状ＤＮＡライブラリーを構築す
る方法を提供する。
【００１５】すなわち、含有率を増加せしめるべき第一
のｄｓＤＮＡを含む環状ＤＮＡライブラリーから、前記
第一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去す
ることによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加
した環状ＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、 （１） 前記環状ＤＮＡライブラリーの環状ＤＮＡを線
状ＤＮＡにする工程と、 （２） 前記第二のｄｓＤＮＡに対応するｓｓＤＮＡを
調製する工程と； （３） 前記環状ＤＮＡライブラリーに、ＲｅｃＡタン
パク質と工程（２）で調製した前記第二のｓｓＤＮＡを
添加することにより、前記第二のｄｓＤＮＡに前記Ｒｅ
ｃＡタンパク質を介して前記第二のｓｓＤＮＡを結合さ
せ、三本鎖構造にする工程と；（４） 工程（３）で得
られた三本鎖構造のＤＮＡを含む線状ＤＮＡをライゲー
ションすることによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有
率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と； （５） 工程（４）の処理を施したＤＮＡから線状ＤＮ
Ａを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含
有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と； を備えた方法が提供される。
のｄｓＤＮＡを含む環状ＤＮＡライブラリーから、前記
第一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去す
ることによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加
した環状ＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、 （１） 前記環状ＤＮＡライブラリーの環状ＤＮＡを線
状ＤＮＡにする工程と、 （２） 前記第二のｄｓＤＮＡに対応するｓｓＤＮＡを
調製する工程と； （３） 前記環状ＤＮＡライブラリーに、ＲｅｃＡタン
パク質と工程（２）で調製した前記第二のｓｓＤＮＡを
添加することにより、前記第二のｄｓＤＮＡに前記Ｒｅ
ｃＡタンパク質を介して前記第二のｓｓＤＮＡを結合さ
せ、三本鎖構造にする工程と；（４） 工程（３）で得
られた三本鎖構造のＤＮＡを含む線状ＤＮＡをライゲー
ションすることによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有
率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と； （５） 工程（４）の処理を施したＤＮＡから線状ＤＮ
Ａを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含
有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と； を備えた方法が提供される。
【００１６】特に、前記方法であって、前記工程（４）
の処理を施したＤＮＡからの線状ＤＮＡの除去が、前記
工程（４）で得られたＤＮＡを宿主に形質転換して、環
状ＤＮＡが形質転換された宿主のみを薬剤で選択するこ
とによって行われる方法が提供される。
の処理を施したＤＮＡからの線状ＤＮＡの除去が、前記
工程（４）で得られたＤＮＡを宿主に形質転換して、環
状ＤＮＡが形質転換された宿主のみを薬剤で選択するこ
とによって行われる方法が提供される。
【００１７】本発明の第二の態様において、ＲｅｃＡタ
ンパク質を用いてＤＮＡライブラリーから特定のＤＮＡ
を除去することにより、所望の核酸の含有率が増加した
ＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供する。
ンパク質を用いてＤＮＡライブラリーから特定のＤＮＡ
を除去することにより、所望の核酸の含有率が増加した
ＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供する。
【００１８】すなわち、含有率を増加せしめるべき第一
のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第一
のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去するこ
とによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加した
ＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、 （１） 第一のｄｓDNAを含む線状DNAライブラリーを調
製する工程と、 （２） 前記第二のｄｓＤＮＡの両端の配列に対応する
ｓｓＤＮＡをそれぞれ調製する工程と； （３） 前記線状ＤＮＡに、ＲｅｃＡタンパク質と工程
（２）で調製した前記第二のｓｓＤＮＡを添加すること
により、前記第二のｄｓＤＮＡに前記ＲｅｃＡタンパク
質を介して前記第二のｓｓＤＮＡを結合させ、三本鎖構
造にする工程と； （４） 工程（３）で得られた三本鎖構造のＤＮＡを含
む線状ＤＮＡを所望のDNAとライゲーションする処理を
施し、三本鎖構造を含まないｄｓＤＮＡのみを環状化す
る工程と； （５） 工程（４）の処理を施したＤＮＡから線状ＤＮ
Ａを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含
有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
を備えた方法が提供される。
のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第一
のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去するこ
とによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加した
ＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、 （１） 第一のｄｓDNAを含む線状DNAライブラリーを調
製する工程と、 （２） 前記第二のｄｓＤＮＡの両端の配列に対応する
ｓｓＤＮＡをそれぞれ調製する工程と； （３） 前記線状ＤＮＡに、ＲｅｃＡタンパク質と工程
（２）で調製した前記第二のｓｓＤＮＡを添加すること
により、前記第二のｄｓＤＮＡに前記ＲｅｃＡタンパク
質を介して前記第二のｓｓＤＮＡを結合させ、三本鎖構
造にする工程と； （４） 工程（３）で得られた三本鎖構造のＤＮＡを含
む線状ＤＮＡを所望のDNAとライゲーションする処理を
施し、三本鎖構造を含まないｄｓＤＮＡのみを環状化す
る工程と； （５） 工程（４）の処理を施したＤＮＡから線状ＤＮ
Ａを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含
有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
を備えた方法が提供される。
【００１９】特に、前記方法であって、前記工程（４）
の処理を施したＤＮＡからの線状ＤＮＡの除去が、前記
工程（４）で得られたＤＮＡを宿主に形質転換して、環
状ＤＮＡが形質転換された宿主のみを薬剤で選択するこ
とによる除去である方法が提供される。
の処理を施したＤＮＡからの線状ＤＮＡの除去が、前記
工程（４）で得られたＤＮＡを宿主に形質転換して、環
状ＤＮＡが形質転換された宿主のみを薬剤で選択するこ
とによる除去である方法が提供される。
【００２０】
【発明の実施の形態】本発明は、ＲｅｃＡタンパク質を
介して形成される三本鎖構造が標的核酸の末端領域に形
成される場合には、前記三本鎖構造からＲｅｃＡタンパ
ク質を解離させた後にも前記三本鎖構造が維持されると
いう本発明者らの発見に基づいてなされたものである。
ＲｅｃＡタンパク質、及びＲｅｃＡタンパク質を介して
三本鎖構造が形成されることは公知である。
介して形成される三本鎖構造が標的核酸の末端領域に形
成される場合には、前記三本鎖構造からＲｅｃＡタンパ
ク質を解離させた後にも前記三本鎖構造が維持されると
いう本発明者らの発見に基づいてなされたものである。
ＲｅｃＡタンパク質、及びＲｅｃＡタンパク質を介して
三本鎖構造が形成されることは公知である。
【００２１】ここで、ＲｅｃＡタンパク質について説明
する。
する。
【００２２】ＲｅｃＡタンパク質は、相同的組換え、Ｄ
ＮＡの修復、又は大腸菌のＳＯＳ遺伝子の発現などに関
与することが知られている。ＲｅｃＡタンパク質の中で
は、大腸菌やλファージのＲｅｃＡタンパク質が最も有
名である。しかしながら、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質
に類似した構造及び機能を有するタンパク質は、大腸菌
以外の生物にも広く分布していることが知られており、
これらのタンパク質は、一般に、ＲｅｃＡ類似タンパク
質と呼称されている。
ＮＡの修復、又は大腸菌のＳＯＳ遺伝子の発現などに関
与することが知られている。ＲｅｃＡタンパク質の中で
は、大腸菌やλファージのＲｅｃＡタンパク質が最も有
名である。しかしながら、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質
に類似した構造及び機能を有するタンパク質は、大腸菌
以外の生物にも広く分布していることが知られており、
これらのタンパク質は、一般に、ＲｅｃＡ類似タンパク
質と呼称されている。
【００２３】図１のように、ＲｅｃＡタンパク質は、一
本鎖ＤＮＡに結合した後（ＲｅｃＡ−一本鎖ＤＮＡ繊
維）、該一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに対合させて三元
複合体（トリプレックス）を形成し、相同ＤＮＡの検索
を行った後、ＡＴＰ存在下でＤＮＡ鎖交換反応を触媒す
る。ＤＮＡ鎖交換反応後には、前記一本鎖ＤＮＡが前記
二本鎖ＤＮＡに取り込まれた雑種二本鎖ＤＮＡと前記二
本鎖ＤＮＡから分離された一本鎖ＤＮＡが形成される。
本鎖ＤＮＡに結合した後（ＲｅｃＡ−一本鎖ＤＮＡ繊
維）、該一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに対合させて三元
複合体（トリプレックス）を形成し、相同ＤＮＡの検索
を行った後、ＡＴＰ存在下でＤＮＡ鎖交換反応を触媒す
る。ＤＮＡ鎖交換反応後には、前記一本鎖ＤＮＡが前記
二本鎖ＤＮＡに取り込まれた雑種二本鎖ＤＮＡと前記二
本鎖ＤＮＡから分離された一本鎖ＤＮＡが形成される。
【００２４】前述のように、ＲｅｃＡタンパク質は、一
本鎖核酸を二本鎖核酸にランダムに結合させるのではな
く、二本鎖核酸の一方のストランド中に存在する相同な
領域に結合させる。二つの核酸が「相同」であるという
ことは、ＲｅｃＡタンパク質を介して特異的な三本鎖構
造を形成し得る程度に、両核酸が同一である、又は類似
していることを意味する。「類似」とは、例えば、二つ
の塩基配列が少なくとも５０％、好ましくは８０％、よ
り好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の同
一性であり得る。
本鎖核酸を二本鎖核酸にランダムに結合させるのではな
く、二本鎖核酸の一方のストランド中に存在する相同な
領域に結合させる。二つの核酸が「相同」であるという
ことは、ＲｅｃＡタンパク質を介して特異的な三本鎖構
造を形成し得る程度に、両核酸が同一である、又は類似
していることを意味する。「類似」とは、例えば、二つ
の塩基配列が少なくとも５０％、好ましくは８０％、よ
り好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の同
一性であり得る。
【００２５】本発明の方法は、ＲｅｃＡタンパク質を介
して一本鎖ＤＮＡと該一本鎖ＤＮＡに相同な二本鎖ＤＮ
Ａを結合させて、三本鎖構造ＤＮＡが形成されることを
利用して、ＤＮＡライブラリーから所定のＤＮＡを除去
する方法である。
して一本鎖ＤＮＡと該一本鎖ＤＮＡに相同な二本鎖ＤＮ
Ａを結合させて、三本鎖構造ＤＮＡが形成されることを
利用して、ＤＮＡライブラリーから所定のＤＮＡを除去
する方法である。
【００２６】本明細書において、「ＲｅｃＡタンパク
質」とは、二本鎖核酸の一方のストランド中の任意の領
域に、該領域と相同な一本鎖核酸を結合させることによ
り、前記領域に三本鎖構造を形成させ得るタンパク質を
意味する。
質」とは、二本鎖核酸の一方のストランド中の任意の領
域に、該領域と相同な一本鎖核酸を結合させることによ
り、前記領域に三本鎖構造を形成させ得るタンパク質を
意味する。
【００２７】また、ＲｅｃＡタンパク質には、大腸菌や
λファージのＲｅｃＡタンパク質のみならず、ＲｅｃＡ
類似タンパク質も含まれる。上述のように、本発明の方
法では、ＲｅｃＡタンパク質が相同なＤＮＡの対合を促
進し、三本鎖構造ＤＮＡの形成を触媒する機能を有する
限り、本発明の方法において、前記ＲｅｃＡ類似タンパ
ク質も使用することができる。
λファージのＲｅｃＡタンパク質のみならず、ＲｅｃＡ
類似タンパク質も含まれる。上述のように、本発明の方
法では、ＲｅｃＡタンパク質が相同なＤＮＡの対合を促
進し、三本鎖構造ＤＮＡの形成を触媒する機能を有する
限り、本発明の方法において、前記ＲｅｃＡ類似タンパ
ク質も使用することができる。
【００２８】本発明で使用するのに好ましいＲｅｃＡタ
ンパク質は、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質である。
ンパク質は、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質である。
【００２９】本明細書において、「ＤＮＡライブラリ
ー」なる語は、多種類のDNA断片の集合体を意味し、主
に遺伝子ライブラリーとｃＤＮＡライブラリーを総称す
る用語として使用する。「遺伝子ライブラリー」とは、
ファージ又はコスミドに含まれる単一の生物種の全ゲノ
ムＤＮＡ断片の集合体であり、「ゲノムＤＮＡライブラ
リー」と同義である。「ｃＤＮＡライブラリー」とは、
ベクターに挿入された、特定の組織や細胞由来のｍＲＮ
Ａから作成される相補的ＤＮＡ（以下ｃＤＮＡと称す
る）から作成される多種類のｃＤＮＡ分子種の集合体を
いう。前記DNA断片は必ずしもファージ、コスミド、ま
たはプラスミド中に含まれて環状化されている必要はな
く、DNA断片のみからなっていてもよい。ＤＮＡライブ
ラリーに含まれるDNA断片の種類は何種類でもよく、2種
類であってもよい。
ー」なる語は、多種類のDNA断片の集合体を意味し、主
に遺伝子ライブラリーとｃＤＮＡライブラリーを総称す
る用語として使用する。「遺伝子ライブラリー」とは、
ファージ又はコスミドに含まれる単一の生物種の全ゲノ
ムＤＮＡ断片の集合体であり、「ゲノムＤＮＡライブラ
リー」と同義である。「ｃＤＮＡライブラリー」とは、
ベクターに挿入された、特定の組織や細胞由来のｍＲＮ
Ａから作成される相補的ＤＮＡ（以下ｃＤＮＡと称す
る）から作成される多種類のｃＤＮＡ分子種の集合体を
いう。前記DNA断片は必ずしもファージ、コスミド、ま
たはプラスミド中に含まれて環状化されている必要はな
く、DNA断片のみからなっていてもよい。ＤＮＡライブ
ラリーに含まれるDNA断片の種類は何種類でもよく、2種
類であってもよい。
【００３０】また、本明細書において、二本鎖ＤＮＡ及
び一本鎖ＤＮＡは、それぞれｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡ
と略記する。
び一本鎖ＤＮＡは、それぞれｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡ
と略記する。
【００３１】以下、本発明の方法の詳細について述べ
る。
る。
【００３２】本発明の第一の態様において、ＲｅｃＡタ
ンパク質を用いて環状ＤＮＡライブラリーから特定のＤ
ＮＡを除去することにより、所望の核酸の含有率が増加
した環状ＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供す
る。本発明の方法の第一の工程では、環状ＤＮＡライブ
ラリーの環状ＤＮＡを線状ＤＮＡにする操作を施す。環
状ＤＮＡを線状ＤＮＡにする方法としては、たとえば、
適切な制限酵素で環状ＤＮＡを切断すればよい。前記制
限酵素は、前記環状ＤＮＡの一カ所のみを切断するもの
を選択することが好ましい。前記制限酵素による切断
は、通常の方法を使用して行えばよい。 次に第二の工
程において、前記ＤＮＡライブラリーから除去すべき第
二のｄｓＤＮＡに対応するｓｓＤＮＡを調製する。
ンパク質を用いて環状ＤＮＡライブラリーから特定のＤ
ＮＡを除去することにより、所望の核酸の含有率が増加
した環状ＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供す
る。本発明の方法の第一の工程では、環状ＤＮＡライブ
ラリーの環状ＤＮＡを線状ＤＮＡにする操作を施す。環
状ＤＮＡを線状ＤＮＡにする方法としては、たとえば、
適切な制限酵素で環状ＤＮＡを切断すればよい。前記制
限酵素は、前記環状ＤＮＡの一カ所のみを切断するもの
を選択することが好ましい。前記制限酵素による切断
は、通常の方法を使用して行えばよい。 次に第二の工
程において、前記ＤＮＡライブラリーから除去すべき第
二のｄｓＤＮＡに対応するｓｓＤＮＡを調製する。
【００３３】ここで、除去すべき第二のｄｓＤＮＡに
「対応する」とは、何れかのストランド中に、第二のｄ
ｓＤＮＡ全部又は一部と実質的に同じ塩基配列を有する
部分を含んでいることをいう。「実質的に同じ塩基配列
を有する」とは、ＲｅｃＡタンパク質による三本鎖構造
ＤＮＡの形成がなされ得る程度に同等の塩基配列を有す
ることをいう。
「対応する」とは、何れかのストランド中に、第二のｄ
ｓＤＮＡ全部又は一部と実質的に同じ塩基配列を有する
部分を含んでいることをいう。「実質的に同じ塩基配列
を有する」とは、ＲｅｃＡタンパク質による三本鎖構造
ＤＮＡの形成がなされ得る程度に同等の塩基配列を有す
ることをいう。
【００３４】前記第二のｄｓＤＮＡのサイズは、３〜１
３ｋｂであり得る。６ｋｂ以上でサイズ分画されたライ
ブラリー中のＤＮＡであることが好ましい。
３ｋｂであり得る。６ｋｂ以上でサイズ分画されたライ
ブラリー中のＤＮＡであることが好ましい。
【００３５】なお、ライブラリー中に含まれるこれらの
ｄｓＤＮＡは、プラスミドやウイルスベクターに担持さ
れていることが通常であろう。
ｄｓＤＮＡは、プラスミドやウイルスベクターに担持さ
れていることが通常であろう。
【００３６】第二のｄｓＤＮＡに対応するｓｓＤＮＡを
調製するためには、インビトロ転写系を使用することが
できる。たとえば、ＤＮＡライブラリーのインサートを
インビトロ転写可能なベクターであるｐＳＰＯＲＴ１に
載せ換えて、ＳＰ６転写システム（Ａｍｂｉｏｎ社）を
使用してＲＮＡ合成を行う。次に、適切なプライマー
（Ｒｏｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ Ｎ６（宝社）など）、
および逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒ
Ｔ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）など）を使用してｃＤ
ＮＡを合成した。最後にフェノール・クロロホルムによ
ってタンパク質を除去して、ｃＤＮＡを精製することに
より、ｓｓＤＮＡを得ることができる。上記のようなｃ
ＤＮＡの調製方法は、当業者に周知である。
調製するためには、インビトロ転写系を使用することが
できる。たとえば、ＤＮＡライブラリーのインサートを
インビトロ転写可能なベクターであるｐＳＰＯＲＴ１に
載せ換えて、ＳＰ６転写システム（Ａｍｂｉｏｎ社）を
使用してＲＮＡ合成を行う。次に、適切なプライマー
（Ｒｏｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ Ｎ６（宝社）など）、
および逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒ
Ｔ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）など）を使用してｃＤ
ＮＡを合成した。最後にフェノール・クロロホルムによ
ってタンパク質を除去して、ｃＤＮＡを精製することに
より、ｓｓＤＮＡを得ることができる。上記のようなｃ
ＤＮＡの調製方法は、当業者に周知である。
【００３７】その他、ライブラリーのｄｓＤＮＡに対応
するｓｓＤＮＡを作製するためには、ニッカーゼ等でｄ
ｓＤＮＡにニック（切れ目）を導入した後に、ＥｘｏII
I、Ｔ７ｇｅｎｅ６等のヌクレアーゼで処理してもよ
い。さらに、ｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡにする操作として
は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ１１９
等のファージミドベクターをファージ粒子として使用
し、ｓｓＤＮＡを回収する操作もあるが、これらに限定
されない。
するｓｓＤＮＡを作製するためには、ニッカーゼ等でｄ
ｓＤＮＡにニック（切れ目）を導入した後に、ＥｘｏII
I、Ｔ７ｇｅｎｅ６等のヌクレアーゼで処理してもよ
い。さらに、ｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡにする操作として
は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ１１９
等のファージミドベクターをファージ粒子として使用
し、ｓｓＤＮＡを回収する操作もあるが、これらに限定
されない。
【００３８】続いて、第三の工程では、前記ＲｅｃＡタ
ンパク質と前記第二のｓｓＤＮＡを、前記ＤＮＡライブ
ラリーに添加する。
ンパク質と前記第二のｓｓＤＮＡを、前記ＤＮＡライブ
ラリーに添加する。
【００３９】上記のようにして得られた第二のｄｓＤＮ
Ａに対応するｓｓＤＮＡは、何れかのストランドが第二
のｄｓＤＮＡの全部又は一部と同一の塩基配列を含むの
で、前記工程で得られた第二のｓｓＤＮＡとＲｅｃＡタ
ンパク質を加えると、三本鎖構造ＤＮＡの形成反応が進
行する（図２参照）。
Ａに対応するｓｓＤＮＡは、何れかのストランドが第二
のｄｓＤＮＡの全部又は一部と同一の塩基配列を含むの
で、前記工程で得られた第二のｓｓＤＮＡとＲｅｃＡタ
ンパク質を加えると、三本鎖構造ＤＮＡの形成反応が進
行する（図２参照）。
【００４０】ＲｅｃＡタンパク質が解離した後にも三本
鎖構造が安定に維持されるためには、前記ｓｓＤＮＡの
長さは、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基
以上、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは３０塩
基以上、さらに好ましくは４０塩基以上、最も好ましく
は６０塩基以上である。
鎖構造が安定に維持されるためには、前記ｓｓＤＮＡの
長さは、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基
以上、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは３０塩
基以上、さらに好ましくは４０塩基以上、最も好ましく
は６０塩基以上である。
【００４１】安定な三本鎖構造を得るためには、三本鎖
構造の両末端のうち、外側（すなわち、ｄｓＤＮＡの終
末端側）に存在する末端が、ｄｓＤＮＡの終末端から５
０番目の塩基、より好ましくは３０番目の塩基、さらに
好ましくは２０番目の塩基、さらに好ましくは１０番目
の塩基よりも外側に位置することが好ましい。
構造の両末端のうち、外側（すなわち、ｄｓＤＮＡの終
末端側）に存在する末端が、ｄｓＤＮＡの終末端から５
０番目の塩基、より好ましくは３０番目の塩基、さらに
好ましくは２０番目の塩基、さらに好ましくは１０番目
の塩基よりも外側に位置することが好ましい。
【００４２】また、ＲｅｃＡタンパク質は、本来、ＡＴ
Ｐの存在下において、相同的な組換えを触媒するタンパ
ク質なので、前記試料中にＡＴＰが存在すると相同的組
換えが進行して、三本鎖構造は直ぐに消滅してしまう。
Ｐの存在下において、相同的な組換えを触媒するタンパ
ク質なので、前記試料中にＡＴＰが存在すると相同的組
換えが進行して、三本鎖構造は直ぐに消滅してしまう。
【００４３】ＲｅｃＡタンパク質を介して三本鎖構造を
形成させるためには、ＧＴＰ、ＩＴＰなどのＡＴＰの機
能を代替し得る物質、またはＡＴＰγＳのような非分解
性ＡＴＰ類似体を添加しなければならない。ＧＴＰ、Ｉ
ＴＰの存在下では、ＲｅｃＡタンパク質による交換反応
は進行されないことが明らかとなっている。
形成させるためには、ＧＴＰ、ＩＴＰなどのＡＴＰの機
能を代替し得る物質、またはＡＴＰγＳのような非分解
性ＡＴＰ類似体を添加しなければならない。ＧＴＰ、Ｉ
ＴＰの存在下では、ＲｅｃＡタンパク質による交換反応
は進行されないことが明らかとなっている。
【００４４】次に、第四の工程では、前記工程で得られ
た三本鎖構造のＤＮＡを含むＤＮＡを自己ライゲーショ
ンする。このとき、前記三本鎖構造が形成されたＤＮＡ
は、自己ライゲーション反応が阻害されるが、前記三本
鎖構造が形成されていないｄｓＤＮＡは、自己ライゲー
ションされて環状ＤＮＡとなる。
た三本鎖構造のＤＮＡを含むＤＮＡを自己ライゲーショ
ンする。このとき、前記三本鎖構造が形成されたＤＮＡ
は、自己ライゲーション反応が阻害されるが、前記三本
鎖構造が形成されていないｄｓＤＮＡは、自己ライゲー
ションされて環状ＤＮＡとなる。
【００４５】本明細書において、「自己ライゲーショ
ン」とは、一本の線状ＤＮＡの５‘末端と３’末端がラ
イゲーションされて、環状ＤＮＡとなることを意味す
る。
ン」とは、一本の線状ＤＮＡの５‘末端と３’末端がラ
イゲーションされて、環状ＤＮＡとなることを意味す
る。
【００４６】前記ライゲーション反応は、通常の方法を
使用して行えばよい。たとえば、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇ
ａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によってライゲー
ション反応（３７℃において３０分間）を行って環状Ｄ
ＮＡを構築することができる。また、その他の商業的に
入手可能なライゲーションキット等を使用してもよい。
使用して行えばよい。たとえば、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇ
ａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によってライゲー
ション反応（３７℃において３０分間）を行って環状Ｄ
ＮＡを構築することができる。また、その他の商業的に
入手可能なライゲーションキット等を使用してもよい。
【００４７】本発明において、さらに、上記第１から第
四の工程からなるサイクルを２回以上繰り返えしてもよ
い。
四の工程からなるサイクルを２回以上繰り返えしてもよ
い。
【００４８】第五の工程では、前記工程で得られたＤＮ
Ａから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一の
ｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構
築する。
Ａから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一の
ｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構
築する。
【００４９】除去すべき線状三本鎖構造ＤＮＡと含有率
を増加させるべき環状ＤＮＡとを分離するには、例え
ば、アガロース電気泳動で分離する方法、臭化エチジウ
ム存在下で遠心する方法、などを使用することができ
る。その他、使用したＤＮＡライブラリー内に薬剤耐性
遺伝子が含まれている場合は、前記ＤＮＡを宿主に形質
転換して、環状ＤＮＡが形質転換された宿主のみを薬剤
で選択する方法を使用してもよいが、これらに限定され
ない。
を増加させるべき環状ＤＮＡとを分離するには、例え
ば、アガロース電気泳動で分離する方法、臭化エチジウ
ム存在下で遠心する方法、などを使用することができ
る。その他、使用したＤＮＡライブラリー内に薬剤耐性
遺伝子が含まれている場合は、前記ＤＮＡを宿主に形質
転換して、環状ＤＮＡが形質転換された宿主のみを薬剤
で選択する方法を使用してもよいが、これらに限定され
ない。
【００５０】また、本発明の方法において、前記Ｒｅｃ
Ａタンパク質を介して三本鎖構造を形成させる工程に続
いて、前記三本鎖核酸に結合したＲｅｃＡタンパク質を
解離させる工程を実施してもよい。
Ａタンパク質を介して三本鎖構造を形成させる工程に続
いて、前記三本鎖核酸に結合したＲｅｃＡタンパク質を
解離させる工程を実施してもよい。
【００５１】本発明の方法の説明において、図２及び上
記の説明では、便宜上、２種類のｄｓＤＮＡの中から１
種類のｄｓＤＮＡを除去する操作を記載したが、実際の
操作では、数千〜数万種類のｄｓＤＮＡの中から数十〜
数万種類のｄｓＤＮＡを同時に、又は順次に除去するこ
ともできる。
記の説明では、便宜上、２種類のｄｓＤＮＡの中から１
種類のｄｓＤＮＡを除去する操作を記載したが、実際の
操作では、数千〜数万種類のｄｓＤＮＡの中から数十〜
数万種類のｄｓＤＮＡを同時に、又は順次に除去するこ
ともできる。
【００５２】本発明の第二の態様において、第一の態様
において示した方法よりも効率的にＤＮＡライブラリー
から特定のＤＮＡを除去することにより、所望の核酸の
含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法を
提供する。すなわち、核酸の両末端のライゲーション反
応を阻害することによって、RecAタンパク質によるライ
ゲーション阻害を効率化した方法を提供する。
において示した方法よりも効率的にＤＮＡライブラリー
から特定のＤＮＡを除去することにより、所望の核酸の
含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法を
提供する。すなわち、核酸の両末端のライゲーション反
応を阻害することによって、RecAタンパク質によるライ
ゲーション阻害を効率化した方法を提供する。
【００５３】本発明の方法の第一の工程では、線状ＤＮ
Ａライブラリーを調製する。線状ＤＮＡを調製する方法
としては、環状DNAからDNA断片を切り出すことによっ
て、またはPCR法によって調製してもよい。また、mRNA
を逆転写してcDNAを作製することによって調製してもよ
い。その他DNA断片を作製するために様々な方法を使用
することができる。たとえば、ｃＤＮＡライブラリーで
あれば、ベクターに挿入されたインサートcDNAを切り出
すことによって調製すればよい。
Ａライブラリーを調製する。線状ＤＮＡを調製する方法
としては、環状DNAからDNA断片を切り出すことによっ
て、またはPCR法によって調製してもよい。また、mRNA
を逆転写してcDNAを作製することによって調製してもよ
い。その他DNA断片を作製するために様々な方法を使用
することができる。たとえば、ｃＤＮＡライブラリーで
あれば、ベクターに挿入されたインサートcDNAを切り出
すことによって調製すればよい。
【００５４】前記DNAの切断、PCRおよびmRNAからの逆転
写、その他線状DNAの調製は、通常の方法を使用して行
えばよい。
写、その他線状DNAの調製は、通常の方法を使用して行
えばよい。
【００５５】次に第二の工程において、前記ＤＮＡライ
ブラリーから除去すべき第二のｄｓＤＮＡの両端の配列
に対応するｓｓＤＮＡをそれぞれ調製する。「両端の配
列」とは、前記第二のdsDNAの5’末端および3’末端の
配列のそれぞれの配列を意味する。
ブラリーから除去すべき第二のｄｓＤＮＡの両端の配列
に対応するｓｓＤＮＡをそれぞれ調製する。「両端の配
列」とは、前記第二のdsDNAの5’末端および3’末端の
配列のそれぞれの配列を意味する。
【００５６】また「両端の配列に対応する」とは、何れ
かのストランド中に、前記第二のｄｓＤＮＡの5’末端
および3’末端の配列のそれぞれと、またはそれらの一
部と実質的に同じ塩基配列を有する部分を含んでいるこ
とをいい、「実質的に同じ塩基配列を有する」とは、上
述したとおり、ＲｅｃＡタンパク質による三本鎖構造Ｄ
ＮＡの形成がなされ得る程度に同等の塩基配列を有する
ことをいう。
かのストランド中に、前記第二のｄｓＤＮＡの5’末端
および3’末端の配列のそれぞれと、またはそれらの一
部と実質的に同じ塩基配列を有する部分を含んでいるこ
とをいい、「実質的に同じ塩基配列を有する」とは、上
述したとおり、ＲｅｃＡタンパク質による三本鎖構造Ｄ
ＮＡの形成がなされ得る程度に同等の塩基配列を有する
ことをいう。
【００５７】続いて、第三の工程では、前記ＲｅｃＡタ
ンパク質と前記第二のｓｓＤＮＡを、前記ＤＮＡライブ
ラリーに添加する。この工程により、上述の通り三本鎖
構造ＤＮＡの形成反応が進行する（図３参照）。
ンパク質と前記第二のｓｓＤＮＡを、前記ＤＮＡライブ
ラリーに添加する。この工程により、上述の通り三本鎖
構造ＤＮＡの形成反応が進行する（図３参照）。
【００５８】次に、第四の工程では、前記工程で得られ
た三本鎖構造のＤＮＡを含むＤＮＡを所望のDNAとライ
ゲーションする。このとき、前記三本鎖構造が形成され
たＤＮＡは、ライゲーション反応が阻害されるが、前記
三本鎖構造が形成されていないｄｓＤＮＡは、所望のDN
Aとライゲーションされて環状ＤＮＡとなる。
た三本鎖構造のＤＮＡを含むＤＮＡを所望のDNAとライ
ゲーションする。このとき、前記三本鎖構造が形成され
たＤＮＡは、ライゲーション反応が阻害されるが、前記
三本鎖構造が形成されていないｄｓＤＮＡは、所望のDN
Aとライゲーションされて環状ＤＮＡとなる。
【００５９】本方法において「所望のDNA」とは、主に
ライブラリーを構築するためのファージ、コスミド、プ
ラスミドなどのベクターを意味するが、これに限定され
ない。
ライブラリーを構築するためのファージ、コスミド、プ
ラスミドなどのベクターを意味するが、これに限定され
ない。
【００６０】第五の工程では、前記工程で得られたＤＮ
Ａから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一の
ｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構
築する。
Ａから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一の
ｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構
築する。
【００６１】除去すべき線状三本鎖構造ＤＮＡと含有率
を増加させるべき環状ＤＮＡとを分離する方法は、上述
したとおりである。
を増加させるべき環状ＤＮＡとを分離する方法は、上述
したとおりである。
【００６２】なお、図に示されている具体的な反応や構
造などは、あくまでも理解を容易にする目的で記載され
ているにすぎないので、実際には、それらの細部が図面
と一致しない場合があり得る。
造などは、あくまでも理解を容易にする目的で記載され
ているにすぎないので、実際には、それらの細部が図面
と一致しない場合があり得る。
【００６３】以下、実施例によって、本発明をさらに詳
細に説明する。
細に説明する。
【００６４】
【実施例】実施例１
ＲｅｃＡを用いたライゲーション阻害反応により、二種
類のプラスミド混合物から一方のプラスミドの除去を行
った。クロラムフェニコール耐性のプラスミドｐＢＣ２
３Ｃ１０、およびアンピシリン耐性のプラスミドｐＢＳ
１Ｂ３を使用して、両者の混合物から一方のプラスミド
の除去を行った。ｐＢＣ２３Ｃ１０およびｐＢＳ１Ｂ３
を１０００：１で混合して、両プラスミドＤＮＡの一カ
所のみを切断する制限酵素ＮｏｔＩによって消化し、線
状二本鎖ＤＮＡにした。ｐＢＣ２３Ｃ１０をＳａｌＩと
ＮｏｔＩで切断したのち、インサートＤＮＡと、Ｓａｌ
ＩおよびＮｏｔＩによって切断済みのｐＳＰＯＲＴ１
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をライゲーションした。イ
ンビトロ転写をすることが可能であるｐＳＰＯＲＴ１に
載せ換えた後、ＳＰ６転写システム（Ａｍｂｉｏｎ社）
を使用してＲＮＡ合成を行った。得られたＲＮＡ５μｇ
にＲｏｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ Ｎ６（宝社）を６．２
５μｇ添加し、熱変性後、氷水で急冷した。ＲＮａｓｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡社）４０ｕｎｉｔ、５×
Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｉｎｖｉ
ｔｏｒｏｇｅｎ社）４μｌ、０．１Ｍ ジチオスレイト
ール２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ （Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ社）１μｌを添加した。ＳｕｐｅｒＳｃｒ
ｉｐｔ ＩＩ ＲＴ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を５
μｌ添加した後、滅菌蒸留水を添加して全量２０μｌに
した。３７℃において６０分間反応させてｃＤＮＡを合
成した。フェノール・クロロホルムによってタンパク質
を除去して、ｃＤＮＡを精製した。三本鎖形成反応溶液
（１）は、３０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ６．９）、１
ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、合
成したｐＢＣ２３Ｃ１０由来のｃＤＮＡを１００ｎｇ、
ＲｅｃＡタンパク質（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）５μｇ、
滅菌蒸留水を添加して全量を２０μｌにし、３７℃にお
いて１５分間保温する。三本鎖形成反応溶液（２）は、
３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ６．９）、２３ｍＭ酢
酸マグネシウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、Ｎｏｔ
Ｉ切断済みライブラリーを５０ｎｇ、滅菌蒸留水を添加
して全量を１８μｌにした。これを三本鎖形成反応溶液
（１）と混合して、３７℃において３０分間保温した。
１００ｍＭ ＧＴＰ ２μｌを添加して、３７℃におい
て３０分間反応させる。タンパク質分解操作をした後、
ＤＮＡを精製する。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ （Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって３７℃において３０分
間ライゲーション反応を行った。次に、ＤＮＡを精製し
て、大腸菌を形質転換することによってライブラリーを
再構築した。除去を行いたいプラスミドのみが選択的に
１／４００になっていることがわかる。
類のプラスミド混合物から一方のプラスミドの除去を行
った。クロラムフェニコール耐性のプラスミドｐＢＣ２
３Ｃ１０、およびアンピシリン耐性のプラスミドｐＢＳ
１Ｂ３を使用して、両者の混合物から一方のプラスミド
の除去を行った。ｐＢＣ２３Ｃ１０およびｐＢＳ１Ｂ３
を１０００：１で混合して、両プラスミドＤＮＡの一カ
所のみを切断する制限酵素ＮｏｔＩによって消化し、線
状二本鎖ＤＮＡにした。ｐＢＣ２３Ｃ１０をＳａｌＩと
ＮｏｔＩで切断したのち、インサートＤＮＡと、Ｓａｌ
ＩおよびＮｏｔＩによって切断済みのｐＳＰＯＲＴ１
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をライゲーションした。イ
ンビトロ転写をすることが可能であるｐＳＰＯＲＴ１に
載せ換えた後、ＳＰ６転写システム（Ａｍｂｉｏｎ社）
を使用してＲＮＡ合成を行った。得られたＲＮＡ５μｇ
にＲｏｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ Ｎ６（宝社）を６．２
５μｇ添加し、熱変性後、氷水で急冷した。ＲＮａｓｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡社）４０ｕｎｉｔ、５×
Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｉｎｖｉ
ｔｏｒｏｇｅｎ社）４μｌ、０．１Ｍ ジチオスレイト
ール２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ （Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ社）１μｌを添加した。ＳｕｐｅｒＳｃｒ
ｉｐｔ ＩＩ ＲＴ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を５
μｌ添加した後、滅菌蒸留水を添加して全量２０μｌに
した。３７℃において６０分間反応させてｃＤＮＡを合
成した。フェノール・クロロホルムによってタンパク質
を除去して、ｃＤＮＡを精製した。三本鎖形成反応溶液
（１）は、３０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ６．９）、１
ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、合
成したｐＢＣ２３Ｃ１０由来のｃＤＮＡを１００ｎｇ、
ＲｅｃＡタンパク質（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）５μｇ、
滅菌蒸留水を添加して全量を２０μｌにし、３７℃にお
いて１５分間保温する。三本鎖形成反応溶液（２）は、
３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ６．９）、２３ｍＭ酢
酸マグネシウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、Ｎｏｔ
Ｉ切断済みライブラリーを５０ｎｇ、滅菌蒸留水を添加
して全量を１８μｌにした。これを三本鎖形成反応溶液
（１）と混合して、３７℃において３０分間保温した。
１００ｍＭ ＧＴＰ ２μｌを添加して、３７℃におい
て３０分間反応させる。タンパク質分解操作をした後、
ＤＮＡを精製する。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ （Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって３７℃において３０分
間ライゲーション反応を行った。次に、ＤＮＡを精製し
て、大腸菌を形質転換することによってライブラリーを
再構築した。除去を行いたいプラスミドのみが選択的に
１／４００になっていることがわかる。
【００６５】
【表１】
【００６６】実施例２
ＲｅｃＡを使用した三本鎖形成反応によって、既に得ら
れていたプラスミド（３０００クローン）をプラスミド
ライブラリーから除去した。
れていたプラスミド（３０００クローン）をプラスミド
ライブラリーから除去した。
【００６７】ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫＩＩ（＋）内
に作製したプラスミドライブラリーインサートをインビ
トロ転写可能なベクターである、ｐＳＰＯＲＴ１（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に載せ換えて、ＳＰ６転写システ
ム（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用してＲＮＡ合成を行った。
得られたＲＮＡ５μｇにＲｏｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒＮ
６（宝社）を６．２５μｇ添加し、熱変性後、氷水で急
冷した。ＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡社）４
０ｕｎｉｔ、５×Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆ
ｅｒ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μｌ、０．１Ｍ
ジチオスレイトール２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉ
ｘ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１μｌを添加した。Ｓ
ｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ （Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ社）を５μｌ添加した後、滅菌蒸留水を添加して
全量２０μｌにする。３７℃において６０分間反応させ
てｃＤＮＡを合成した。フェノール・クロロホルムによ
ってタンパク質を除去して、ｃＤＮＡを精製した。プラ
スミドライブラリーは、プラスミドＤＮＡの一カ所のみ
を切断する制限酵素ＮｏｔＩによって消化して、線状二
本鎖ＤＮＡにした。三本鎖形成反応溶液（１）は、３０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸 （ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マ
グネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、合成したｃＤ
ＮＡを１００ｎｇ、ＲｅｃＡタンパク質（ＥＰＩＣＥＮ
ＴＲＥ社）５μｇ、滅菌蒸留水を添加して全量を２０μ
ｌとし、３７℃において１５分間保温した。三本鎖形成
反応溶液（２）は、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸 （ｐＨ
６．９）、２３ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ジチオ
スレイトール、ＮｏｔＩ切断済みライブラリーを５０ｎ
ｇ、滅菌蒸留水を添加して全量を１８μｌにした。これ
を三本鎖形成反応溶液（１）と混合して、３７℃におい
て３０分間保温する。１００ｍＭ ＧＴＰ ２μｌを添
加して、３７℃において３０分間反応させる。タンパク
質分解操作をした後、ＤＮＡを精製する。Ｔ４ ＤＮＡ
Ｌｉｇａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって
３７℃において３０分間ライゲーション反応を行った。
次に、ＤＮＡを精製して、大腸菌を形質転換することに
よってライブラリーを再構築した。ランダムに９６クロ
ーンの塩基配列を決定して、配列を既知のクローンのデ
ータベースと比較することによって、未知クローンの出
現頻度を検討した。一回の既知クローン除去操作によっ
て新規クローンの出現頻度は、約６０％から約８０％へ
と上昇していた。
に作製したプラスミドライブラリーインサートをインビ
トロ転写可能なベクターである、ｐＳＰＯＲＴ１（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に載せ換えて、ＳＰ６転写システ
ム（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用してＲＮＡ合成を行った。
得られたＲＮＡ５μｇにＲｏｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒＮ
６（宝社）を６．２５μｇ添加し、熱変性後、氷水で急
冷した。ＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡社）４
０ｕｎｉｔ、５×Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆ
ｅｒ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μｌ、０．１Ｍ
ジチオスレイトール２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉ
ｘ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１μｌを添加した。Ｓ
ｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ （Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ社）を５μｌ添加した後、滅菌蒸留水を添加して
全量２０μｌにする。３７℃において６０分間反応させ
てｃＤＮＡを合成した。フェノール・クロロホルムによ
ってタンパク質を除去して、ｃＤＮＡを精製した。プラ
スミドライブラリーは、プラスミドＤＮＡの一カ所のみ
を切断する制限酵素ＮｏｔＩによって消化して、線状二
本鎖ＤＮＡにした。三本鎖形成反応溶液（１）は、３０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸 （ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マ
グネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、合成したｃＤ
ＮＡを１００ｎｇ、ＲｅｃＡタンパク質（ＥＰＩＣＥＮ
ＴＲＥ社）５μｇ、滅菌蒸留水を添加して全量を２０μ
ｌとし、３７℃において１５分間保温した。三本鎖形成
反応溶液（２）は、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸 （ｐＨ
６．９）、２３ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ジチオ
スレイトール、ＮｏｔＩ切断済みライブラリーを５０ｎ
ｇ、滅菌蒸留水を添加して全量を１８μｌにした。これ
を三本鎖形成反応溶液（１）と混合して、３７℃におい
て３０分間保温する。１００ｍＭ ＧＴＰ ２μｌを添
加して、３７℃において３０分間反応させる。タンパク
質分解操作をした後、ＤＮＡを精製する。Ｔ４ ＤＮＡ
Ｌｉｇａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって
３７℃において３０分間ライゲーション反応を行った。
次に、ＤＮＡを精製して、大腸菌を形質転換することに
よってライブラリーを再構築した。ランダムに９６クロ
ーンの塩基配列を決定して、配列を既知のクローンのデ
ータベースと比較することによって、未知クローンの出
現頻度を検討した。一回の既知クローン除去操作によっ
て新規クローンの出現頻度は、約６０％から約８０％へ
と上昇していた。
【００６８】
【表２】
【００６９】実施例3
RecAを用いたライゲーション阻害反応の効率化をめざ
し、遺伝子の両端のライゲーション阻害により、二種類
のプラスミド混合物から一方のプラスミドの除去を行っ
た。
し、遺伝子の両端のライゲーション阻害により、二種類
のプラスミド混合物から一方のプラスミドの除去を行っ
た。
【００７０】挿入した遺伝子のそれぞれの末端を切断す
る制限酵素のNotIおよびMulIでプラスミドを消化した。
消化されたプラスミドを鋳型として、T7転写システム
（Ａｍｂｉｏｎ社）、T3転写システム（Ａｍｂｉｏｎ
社）を使用してＲＮＡ合成を行った。得られたＲＮＡ５
μｇにＲｏｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ Ｎ６（宝社）を
６．２５μｇ添加し、熱変性後、氷水で急冷した。ＲＮ
ａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡社）４０ｕｎｉ
ｔ、５×Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ
（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）４μｌ、０．１Ｍ ジチ
オスレイトール２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１μｌを添加した。Ｓｕｐ
ｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ社）を５μｌ添加した後、滅菌蒸留水を添加して全量
２０μｌにした。３７℃において６０分間反応させてｃ
ＤＮＡを合成した。フェノール・クロロホルムによって
タンパク質を除去して、ｃＤＮＡを精製した。挿入遺伝
子の量末端を切断する前記制限酵素の組合せであるNotI
およびMulIでプラスミドを消化し、ベクターと挿入され
た遺伝子を分離する。三本鎖形成反応溶液（１）は、３
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マ
グネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、合成した各末
端に対応するｃＤＮＡをそれぞれ１００ｎｇ、ＲｅｃＡ
タンパク質（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）５μｇ、滅菌蒸留
水を添加して全量を２０μｌにし、３７℃において１５
分間保温する。三本鎖形成反応溶液（２）は、３０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ６．９）、２３ｍＭ酢酸マグネ
シウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、ＮｏｔＩおよび
MulIで切断済みプラスミドを５０ｎｇ、滅菌蒸留水を添
加して全量を１８μｌにして、３７℃において３０分間
保温した。１００ｍＭ ＧＴＰ ２μｌを添加して、３
７℃において３０分間反応させる。タンパク質分解操作
をした後、ＤＮＡを精製する。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａ
ｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって３７℃にお
いて３０分間ライゲーション反応を行った。次に、ＤＮ
Ａを精製して、大腸菌を形質転換することによってライ
ゲーション阻害効果を検討した。
る制限酵素のNotIおよびMulIでプラスミドを消化した。
消化されたプラスミドを鋳型として、T7転写システム
（Ａｍｂｉｏｎ社）、T3転写システム（Ａｍｂｉｏｎ
社）を使用してＲＮＡ合成を行った。得られたＲＮＡ５
μｇにＲｏｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ Ｎ６（宝社）を
６．２５μｇ添加し、熱変性後、氷水で急冷した。ＲＮ
ａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡社）４０ｕｎｉ
ｔ、５×Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ
（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）４μｌ、０．１Ｍ ジチ
オスレイトール２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１μｌを添加した。Ｓｕｐ
ｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ社）を５μｌ添加した後、滅菌蒸留水を添加して全量
２０μｌにした。３７℃において６０分間反応させてｃ
ＤＮＡを合成した。フェノール・クロロホルムによって
タンパク質を除去して、ｃＤＮＡを精製した。挿入遺伝
子の量末端を切断する前記制限酵素の組合せであるNotI
およびMulIでプラスミドを消化し、ベクターと挿入され
た遺伝子を分離する。三本鎖形成反応溶液（１）は、３
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マ
グネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、合成した各末
端に対応するｃＤＮＡをそれぞれ１００ｎｇ、ＲｅｃＡ
タンパク質（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）５μｇ、滅菌蒸留
水を添加して全量を２０μｌにし、３７℃において１５
分間保温する。三本鎖形成反応溶液（２）は、３０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ６．９）、２３ｍＭ酢酸マグネ
シウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、ＮｏｔＩおよび
MulIで切断済みプラスミドを５０ｎｇ、滅菌蒸留水を添
加して全量を１８μｌにして、３７℃において３０分間
保温した。１００ｍＭ ＧＴＰ ２μｌを添加して、３
７℃において３０分間反応させる。タンパク質分解操作
をした後、ＤＮＡを精製する。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａ
ｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって３７℃にお
いて３０分間ライゲーション反応を行った。次に、ＤＮ
Ａを精製して、大腸菌を形質転換することによってライ
ゲーション阻害効果を検討した。
【００７１】挿入遺伝子末端の片方のcDNAを加えた場合
と比較して、両方のcDNAを加えることによって相乗的な
阻害効果があった。
と比較して、両方のcDNAを加えることによって相乗的な
阻害効果があった。
【００７２】
【表３】
【００７３】表中の数字はコロニー数を示し、下段の括
弧内はライゲーション阻害反応を行っていない場合と比
較して、阻害反応を行った場合のコロニー数の割合を示
す。
弧内はライゲーション阻害反応を行っていない場合と比
較して、阻害反応を行った場合のコロニー数の割合を示
す。
【００７４】
【発明の効果】本発明の方法を用いれば、ＤＮＡライブ
ラリーから所望の核酸以外の核酸を除去することによ
り、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリー
を直接構築することができる。上記の実施例で実証され
ているように、本発明の方法を用いれば、除去すべき既
知のｄｓＤＮＡを９０％以上除去することも可能であ
る。
ラリーから所望の核酸以外の核酸を除去することによ
り、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリー
を直接構築することができる。上記の実施例で実証され
ているように、本発明の方法を用いれば、除去すべき既
知のｄｓＤＮＡを９０％以上除去することも可能であ
る。
【００７５】さらに、dsDNAの両端を三本鎖構造として
ライゲーションを阻害する方法では、片方の末端を阻害
する方法と比較して、既知遺伝子の量を百分の一以下に
除去することが可能となる。それ故、本発明を適用する
ライブラリーの種類に応じて、ライブラリーの新規クロ
ーンの出現率を１０％〜９９％増加させることができ
る。
ライゲーションを阻害する方法では、片方の末端を阻害
する方法と比較して、既知遺伝子の量を百分の一以下に
除去することが可能となる。それ故、本発明を適用する
ライブラリーの種類に応じて、ライブラリーの新規クロ
ーンの出現率を１０％〜９９％増加させることができ
る。
【図１】ＲｅｃＡの作用機構の概略図。
【図２】本発明のライゲーション阻害の基本原理を示し
た図。
た図。
【図３】本発明のライゲーション阻害の基本原理を示し
た図。
た図。
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(72)発明者 大石 道夫
千葉県木更津市かずさ鎌足２−６−７ 財
団法人かずさディー・エヌ・エー研究所内
(72)発明者 小原 收
千葉県木更津市かずさ鎌足２−６−７ 財
団法人かずさディー・エヌ・エー研究所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA03 CA04 DA06 EA04
GA11 HA20
Claims (4)
- 【請求項１】 含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤ
ＮＡを含む環状ＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄ
ｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去することに
よって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加した環状
ＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、 （１） 前記環状ＤＮＡライブラリーの環状ＤＮＡを線
状ＤＮＡにする工程と、 （２） 前記第二のｄｓＤＮＡに対応するｓｓＤＮＡを
調製する工程と； （３） 前記線状ＤＮＡライブラリーに、ＲｅｃＡタン
パク質と工程（２）で調製した前記第二のｓｓＤＮＡを
添加することにより、前記第二のｄｓＤＮＡに前記Ｒｅ
ｃＡタンパク質を介して前記第二のｓｓＤＮＡを結合さ
せ、三本鎖構造にする工程と； （４） 工程（３）で得られた三本鎖構造のＤＮＡを含
む線状ＤＮＡに自己ライゲーション処理を施し、三本鎖
構造を含まないｄｓＤＮＡのみを環状化する工程と； （５） 工程（４）の処理を施したＤＮＡから線状ＤＮ
Ａを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含
有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
を備えた方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、前記工
程（４）の処理を施したＤＮＡからの線状ＤＮＡの除去
が、前記工程（４）で得られたＤＮＡを宿主に形質転換
して、環状ＤＮＡが形質転換された宿主のみを薬剤で選
択することによる除去である方法。 - 【請求項３】 含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤ
ＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄｓＤ
ＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去することによっ
て、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡラ
イブラリーを構築する方法であって、 （１） 第一のｄｓDNAを含む線状DNAライブラリーを調
製する工程と、 （２） 前記第二のｄｓＤＮＡの両端の配列に対応する
ｓｓＤＮＡをそれぞれ調製する工程と； （３） 前記線状ＤＮＡに、ＲｅｃＡタンパク質と工程
（２）で調製した前記第二のｓｓＤＮＡを添加すること
により、前記第二のｄｓＤＮＡに前記ＲｅｃＡタンパク
質を介して前記第二のｓｓＤＮＡを結合させ、三本鎖構
造にする工程と； （４） 工程（３）で得られた三本鎖構造のＤＮＡを含
む線状ＤＮＡを所望のDNAとライゲーションする処理を
施し、三本鎖構造を含まないｄｓＤＮＡのみを環状化す
る工程と； （５） 工程（４）の処理を施したＤＮＡから線状ＤＮ
Ａを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含
有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
を備えた方法。 - 【請求項４】 請求項３に記載の方法であって、前記工
程（４）の処理を施したＤＮＡからの線状ＤＮＡの除去
が、前記工程（４）で得られたＤＮＡを宿主に形質転換
して、環状ＤＮＡが形質転換された宿主のみを薬剤で選
択することによる除去である方法。
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| JP2002265911A JP4220744B2 (ja) | 2001-09-25 | 2002-09-11 | ライゲーション阻害を用いてライブラリーを加工する方法 |
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| EP02020849A EP1295942B1 (en) | 2001-09-25 | 2002-09-18 | Method for processing a library using ligation inhibition |
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