JPH06233681A - Ｒｎａ担体によるインビトロ遺伝子選択方法 - Google Patents
Ｒｎａ担体によるインビトロ遺伝子選択方法Info
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- JPH06233681A JPH06233681A JP5085871A JP8587193A JPH06233681A JP H06233681 A JPH06233681 A JP H06233681A JP 5085871 A JP5085871 A JP 5085871A JP 8587193 A JP8587193 A JP 8587193A JP H06233681 A JPH06233681 A JP H06233681A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
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Abstract
(57)【要約】
【目的】低頻度で転写される例外的な蛋白をコードする
遺伝子をインビトロで簡便に配列決定する。 【構成】遺伝子セグメントをＴ７ファージＲＮＡポリメ
ラーゼプロモーターの制御下にある酵母ｔＲＮＡLeu3遺
伝子の転写産物によって構成されるＲＮＡをコードする
遺伝子に挿入して、その遺伝子配列を同定する。
遺伝子をインビトロで簡便に配列決定する。 【構成】遺伝子セグメントをＴ７ファージＲＮＡポリメ
ラーゼプロモーターの制御下にある酵母ｔＲＮＡLeu3遺
伝子の転写産物によって構成されるＲＮＡをコードする
遺伝子に挿入して、その遺伝子配列を同定する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は例外的な遺伝子転写物の
同定および／または分離に関し、該方法は、遺伝子工学
的手法による新規なリボ核酸（ＲＮＡ）の使用に基づ
く。この方法は、ヒトの細胞、組織および器官内で、特
に非常に低頻度（総転写メッセンジャーＲＮＡに対する
その割合が＜１０-5）で転写される遺伝子配列の同定お
よび分離に利用することができる。
同定および／または分離に関し、該方法は、遺伝子工学
的手法による新規なリボ核酸（ＲＮＡ）の使用に基づ
く。この方法は、ヒトの細胞、組織および器官内で、特
に非常に低頻度（総転写メッセンジャーＲＮＡに対する
その割合が＜１０-5）で転写される遺伝子配列の同定お
よび分離に利用することができる。
【０００２】
【従来の技術】目下のところ、微生物中で組み換え遺伝
子クローンの集合物（コレクション）を製造し、選択す
ることによってヒト遺伝子を分離するいくつかの技術が
知られている。（Sambrook、Fritsch と Maniatis、 分
子クローニング(Molecular Cloning）、ニューヨーク、
1989）。そのような方法は、液体培地または平板培養中
で個々の細菌または酵母コロニーを増殖させ、個々の遺
伝子フラグメントを分離し、さらに放射性、蛍光性また
は化学発光性誘導体で化学的に修飾した核酸または蛋白
プローブとの相互作用によりそれらを選択することによ
って、遺伝子ライブラリーを構成する組み換えクローン
をインビボで複製させることが必要である。しかし、遺
伝子部分が非常に豊富には存在しない場合は、上記の方
法は効率が低く（インビボ複製の場合は特に）、分析に
は大量の組み換えクローン（＞１０ 8 〜１０9 ）が必要
となり、分析コストが高くなり、さらに分析も長期にわ
たる。その転写物がｃＤＮＡコレクション中にわずかし
か存在しない場合（そのようなことは、複雑な器官（例
えば脳）に存在するいくつかの機能のために生じる）
は、遺伝子のクローニングはめったに得ることができな
い（Sutcliffe、 Ann. Rev. Neurosci.、 2:157、 1988)
。他方、そのような遺伝子のヌクレオチド配列を分離
し、同定することは、そのような遺伝子がコードする蛋
白質の性状を調べるために基本的に重要である。これら
は、極めて様々な組織で構造的、調節的さらに酵素的役
割を果たしているかもしれない。このようなものは、細
胞生理のために基本的に重要であり、さらに通常は極め
て低い濃度でしか存在しない（Sutcliffe、 Ann. Rev. N
eurosci.、 2：157、 1988 ）。これらの蛋白の構造的お
よび機能的特性を知ることは極めて重要である。なぜな
らば、遺伝的または環境的因子により引き起こされるそ
れらの変化は、時機を得た診断方法も特効薬もしくは有
効な治療法も現時点では利用不可能な様々な疾患の基と
なっているからである。
子クローンの集合物（コレクション）を製造し、選択す
ることによってヒト遺伝子を分離するいくつかの技術が
知られている。（Sambrook、Fritsch と Maniatis、 分
子クローニング(Molecular Cloning）、ニューヨーク、
1989）。そのような方法は、液体培地または平板培養中
で個々の細菌または酵母コロニーを増殖させ、個々の遺
伝子フラグメントを分離し、さらに放射性、蛍光性また
は化学発光性誘導体で化学的に修飾した核酸または蛋白
プローブとの相互作用によりそれらを選択することによ
って、遺伝子ライブラリーを構成する組み換えクローン
をインビボで複製させることが必要である。しかし、遺
伝子部分が非常に豊富には存在しない場合は、上記の方
法は効率が低く（インビボ複製の場合は特に）、分析に
は大量の組み換えクローン（＞１０ 8 〜１０9 ）が必要
となり、分析コストが高くなり、さらに分析も長期にわ
たる。その転写物がｃＤＮＡコレクション中にわずかし
か存在しない場合（そのようなことは、複雑な器官（例
えば脳）に存在するいくつかの機能のために生じる）
は、遺伝子のクローニングはめったに得ることができな
い（Sutcliffe、 Ann. Rev. Neurosci.、 2:157、 1988)
。他方、そのような遺伝子のヌクレオチド配列を分離
し、同定することは、そのような遺伝子がコードする蛋
白質の性状を調べるために基本的に重要である。これら
は、極めて様々な組織で構造的、調節的さらに酵素的役
割を果たしているかもしれない。このようなものは、細
胞生理のために基本的に重要であり、さらに通常は極め
て低い濃度でしか存在しない（Sutcliffe、 Ann. Rev. N
eurosci.、 2：157、 1988 ）。これらの蛋白の構造的お
よび機能的特性を知ることは極めて重要である。なぜな
らば、遺伝的または環境的因子により引き起こされるそ
れらの変化は、時機を得た診断方法も特効薬もしくは有
効な治療法も現時点では利用不可能な様々な疾患の基と
なっているからである。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本出願人は、低頻度で転
写され、例外的な蛋白をコードする遺伝子のインビトロ
同定および／または分離のための新規な方法の開発に成
功した。この方法は、これまで予期されなかった結果を
もたらした。本発明はその最も広い局面において、遺伝
子配列の分離のための方法に関し、これは、以下の工程
を含む： (1) 遺伝子ライブラリーを構成する遺伝子セグメント
を、新規な担体ＲＮＡをコードする修飾遺伝子に挿入す
る； (2) 構築した遺伝子をインビトロで転写する； (3) 特異的な遺伝子挿入物を含む担体ＲＮＡ分子を、オ
リゴデオキシヌクレオチドプローブによって、インビト
ロで選択する； (4) 選択した担体ＲＮＡ分子をアフィニティー精製す
る； (5) 選択した分子に対応するＤＮＡを酵素的に合成す
る； (6) 選択したそのような分子を増やし配列を決定する。 本発明の方法は、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼプ
ロモーターの制御下に配置された、酵母のｔＲＮＡLeu3
遺伝子の転写産物で構成されたリボ核酸（ＲＮＡ）を担
体として用いることを特色とする（Otsukaら、 Mol.Cel
l.Biol. 1:269、1981; Baldiら、Science 255: 1404、 1
992)。本発明の方法は、微生物で組み換え遺伝子ライブ
ラリーを構築し、選択する従来用いられてきた方法より
はるかに簡便で、効果的な結果をもたらし、さらに従来
の方法の技術的制限の克服を可能にするものである。
写され、例外的な蛋白をコードする遺伝子のインビトロ
同定および／または分離のための新規な方法の開発に成
功した。この方法は、これまで予期されなかった結果を
もたらした。本発明はその最も広い局面において、遺伝
子配列の分離のための方法に関し、これは、以下の工程
を含む： (1) 遺伝子ライブラリーを構成する遺伝子セグメント
を、新規な担体ＲＮＡをコードする修飾遺伝子に挿入す
る； (2) 構築した遺伝子をインビトロで転写する； (3) 特異的な遺伝子挿入物を含む担体ＲＮＡ分子を、オ
リゴデオキシヌクレオチドプローブによって、インビト
ロで選択する； (4) 選択した担体ＲＮＡ分子をアフィニティー精製す
る； (5) 選択した分子に対応するＤＮＡを酵素的に合成す
る； (6) 選択したそのような分子を増やし配列を決定する。 本発明の方法は、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼプ
ロモーターの制御下に配置された、酵母のｔＲＮＡLeu3
遺伝子の転写産物で構成されたリボ核酸（ＲＮＡ）を担
体として用いることを特色とする（Otsukaら、 Mol.Cel
l.Biol. 1:269、1981; Baldiら、Science 255: 1404、 1
992)。本発明の方法は、微生物で組み換え遺伝子ライブ
ラリーを構築し、選択する従来用いられてきた方法より
はるかに簡便で、効果的な結果をもたらし、さらに従来
の方法の技術的制限の克服を可能にするものである。
【０００４】本発明は、ヒトの細胞、組織および器官で
非常に低頻度で転写される遺伝子配列の位置決定および
分離の目的のために非常に有効であることが立証され
た。特に本発明によって提案される方法は、以下の工程
を含む： (1) 酵母ｔＲＮＡLeu3遺伝子を修飾することによって得
られる新規な担体ＲＮＡを構築し、さらにヒトの器官お
よび組織の遺伝子ライブラリーを構成する遺伝子セグメ
ントを挿入する； (2) 特異的ＲＮＡポリメラーゼによる構築遺伝子の転写
によって担体ＲＮＡをインビトロで合成し、さらに担体
ＲＮＡを酵素的に環状化する； (3) オリゴデオキシヌクレオチドプローブとの相互作用
により、特異的遺伝子挿入物を含む担体ＲＮＡ分子をイ
ンビトロで選択し、さらに生じたＲＮＡ−ＤＮＡ異種複
合体をリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）Ｈにより線状化
する； (4) 選択した担体ＲＮＡ分子をアフィニティー精製し、
対応するＤＮＡを酵素的に合成し、さらに熱耐性ポリメ
ラーゼで環状合成することによってそれを増殖させる； (5) 増殖させた分子の配列決定および分析を行う。
非常に低頻度で転写される遺伝子配列の位置決定および
分離の目的のために非常に有効であることが立証され
た。特に本発明によって提案される方法は、以下の工程
を含む： (1) 酵母ｔＲＮＡLeu3遺伝子を修飾することによって得
られる新規な担体ＲＮＡを構築し、さらにヒトの器官お
よび組織の遺伝子ライブラリーを構成する遺伝子セグメ
ントを挿入する； (2) 特異的ＲＮＡポリメラーゼによる構築遺伝子の転写
によって担体ＲＮＡをインビトロで合成し、さらに担体
ＲＮＡを酵素的に環状化する； (3) オリゴデオキシヌクレオチドプローブとの相互作用
により、特異的遺伝子挿入物を含む担体ＲＮＡ分子をイ
ンビトロで選択し、さらに生じたＲＮＡ−ＤＮＡ異種複
合体をリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）Ｈにより線状化
する； (4) 選択した担体ＲＮＡ分子をアフィニティー精製し、
対応するＤＮＡを酵素的に合成し、さらに熱耐性ポリメ
ラーゼで環状合成することによってそれを増殖させる； (5) 増殖させた分子の配列決定および分析を行う。
【０００５】上記に述べたように、本発明は、ヒトの器
官および組織の遺伝子ライブラリーに由来する遺伝子セ
グメントの、新規な担体ＲＮＡをコードする遺伝子への
挿入を伴う。遺伝子フラグメントのサイズは、一般に５
００から１５００ｂｐである。ＤＮＡ操作は、慣用的な
手技に用いられるような通常の技術にしたがって実施さ
れた（サンブルック、 フリッチとマニアーティス、 分子
クローニング、 ニューヨーク、 １９８９）。ヒトｃＤＮ
Ａ遺伝子ライブラリーからの遺伝子セグメントは、Ｔ７
ファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下にあ
る、プラスミドｐＧＥＭ−１中の酵母プレ−ｔＲＮＡ
Leu3のイントロンのＨｐａＩ部位に挿入される( Otsuki
ら、Mol. Cell. Biol.、 1: 269, 1981; Baldiら、Scien
ce 255: 1404、 1992)。その後プラスミドは、ＸｈｏＩ
エンドヌクレアーゼを用いた制限酵素処理によりプレ−
ｔＲＮＡLeu3遺伝子の３'末端の下流で線状化され、さ
らにバルディーと共同研究者らにより記載されたように
（Baldi ら、Science 255: 1404、 1992）、Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼによりインビトロで転写される。この方法
で、１から５マイクログラムの転写線状ＲＮＡがインビ
トロで得られる。得られた転写物は、天然のプレ−ｔＲ
ＮＡの構造特性を保有しており、特にアフリカツメガエ
ル（Xenopus)スプライシングエンドヌクレアーゼ（プレ
−ｔＲＮＡの構造特性を特異的に認識する酵素）により
正確に切断される（Otsukaら、Mol. Cell. Biol. 1: 26
9、 1981; Mattocciaら、Cell. 55:731、 1988) 。
官および組織の遺伝子ライブラリーに由来する遺伝子セ
グメントの、新規な担体ＲＮＡをコードする遺伝子への
挿入を伴う。遺伝子フラグメントのサイズは、一般に５
００から１５００ｂｐである。ＤＮＡ操作は、慣用的な
手技に用いられるような通常の技術にしたがって実施さ
れた（サンブルック、 フリッチとマニアーティス、 分子
クローニング、 ニューヨーク、 １９８９）。ヒトｃＤＮ
Ａ遺伝子ライブラリーからの遺伝子セグメントは、Ｔ７
ファージＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下にあ
る、プラスミドｐＧＥＭ−１中の酵母プレ−ｔＲＮＡ
Leu3のイントロンのＨｐａＩ部位に挿入される( Otsuki
ら、Mol. Cell. Biol.、 1: 269, 1981; Baldiら、Scien
ce 255: 1404、 1992)。その後プラスミドは、ＸｈｏＩ
エンドヌクレアーゼを用いた制限酵素処理によりプレ−
ｔＲＮＡLeu3遺伝子の３'末端の下流で線状化され、さ
らにバルディーと共同研究者らにより記載されたように
（Baldi ら、Science 255: 1404、 1992）、Ｔ７ＲＮＡ
ポリメラーゼによりインビトロで転写される。この方法
で、１から５マイクログラムの転写線状ＲＮＡがインビ
トロで得られる。得られた転写物は、天然のプレ−ｔＲ
ＮＡの構造特性を保有しており、特にアフリカツメガエ
ル（Xenopus)スプライシングエンドヌクレアーゼ（プレ
−ｔＲＮＡの構造特性を特異的に認識する酵素）により
正確に切断される（Otsukaら、Mol. Cell. Biol. 1: 26
9、 1981; Mattocciaら、Cell. 55:731、 1988) 。
【０００６】したがって、当該プレ−ｔＲＮＡは、５０
０から１５００ｂｐのサイズの遺伝子セグメントを挿入
するために、担体ＲＮＡとしての使用に適していると同
時に、特にアクセプター領域における正確な相補的結合
の形成に関して正確な構造配置を保有している。そのよ
うな結合は、ウーレンベックおよび共同研究者らによっ
て報告された方法（Panら、Science 254:1361、1991)
にしたがって、 転写ＲＮＡ分子の５' および３' 末端の
空間近似性、並びにＴ４ファージＲＮＡリガーゼによる
それらのインビトロ環状化を可能にさせる。環状化反応
の効率は、32Ｐ−ＵＴＰの存在下で転写することによっ
て基質を標識した後、アフリカツメガエルのＲＮアーゼ
による環状プレ−ｔＲＮＡの特異的消化により確認し
（Carrara、Cell. 58:37、 1989)、さらに、環状分子を
ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動に付
し、収量７５％のオーダーで定量化される。個々の遺伝
子挿入物を含む担体ＲＮＡの環状分子の選択は、特異的
な合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、続い
て、ＲＮアーゼの存在下でＲＮＡ−ＤＮＡ異種複合体形
成部位での部位特異的線状化（Grossman、 Proc. Natl.
Acad.Sci USA、 70:3339、 1973)によって実施される。過
剰の非特異的転写ＲＮＡの存在下で計算された反応効率
は、１０-4〜１０-5のオーダーであることが示され、し
たがって、例外的な遺伝子転写物のインビトロ選択に適
している（ヒトの器官から得られるｃＤＮＡ収集物中の
その頻度は、およそ１０-5と概算されている(Sutcliff
e、 Ann. Rev. Neurosci. 2:157、 1988)）。
０から１５００ｂｐのサイズの遺伝子セグメントを挿入
するために、担体ＲＮＡとしての使用に適していると同
時に、特にアクセプター領域における正確な相補的結合
の形成に関して正確な構造配置を保有している。そのよ
うな結合は、ウーレンベックおよび共同研究者らによっ
て報告された方法（Panら、Science 254:1361、1991)
にしたがって、 転写ＲＮＡ分子の５' および３' 末端の
空間近似性、並びにＴ４ファージＲＮＡリガーゼによる
それらのインビトロ環状化を可能にさせる。環状化反応
の効率は、32Ｐ−ＵＴＰの存在下で転写することによっ
て基質を標識した後、アフリカツメガエルのＲＮアーゼ
による環状プレ−ｔＲＮＡの特異的消化により確認し
（Carrara、Cell. 58:37、 1989)、さらに、環状分子を
ポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動に付
し、収量７５％のオーダーで定量化される。個々の遺伝
子挿入物を含む担体ＲＮＡの環状分子の選択は、特異的
な合成オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、続い
て、ＲＮアーゼの存在下でＲＮＡ−ＤＮＡ異種複合体形
成部位での部位特異的線状化（Grossman、 Proc. Natl.
Acad.Sci USA、 70:3339、 1973)によって実施される。過
剰の非特異的転写ＲＮＡの存在下で計算された反応効率
は、１０-4〜１０-5のオーダーであることが示され、し
たがって、例外的な遺伝子転写物のインビトロ選択に適
している（ヒトの器官から得られるｃＤＮＡ収集物中の
その頻度は、およそ１０-5と概算されている(Sutcliff
e、 Ann. Rev. Neurosci. 2:157、 1988)）。
【０００７】選択分子は、 ポリＡポリメラーゼの存在下
で線状ＲＮＡ分子の３' 末端にポリアデノシン配列を酵
素的に合成することによって修飾される(Gethin 、Natu
re 287:301、 1980）。選択した担体ＲＮＡ分子中の遺伝
子挿入物は、特異的プライマーとしてポリチミジンおよ
び、担体プレーｔＲＮＡを該遺伝子に挿入する部位に隣
接するイントロン配列に対応するオリゴヌクレオチドを
用いて、ＰＣＲ環状合成（Saiki、 Science 29:487、 198
8)を行い、逆転写酵素により一本鎖の相補的ＤＮＡを合
成した後増殖させる（Okayamaら、 Methods Enzymol. 15
4:3、 1987) 。増やした遺伝子セグメントのヌクレオチ
ド配列は、自動塩基配列決定により求め、発現タンパク
のアミノ酸配列を推定し、さらに特別なコンピューター
支援プログラムにより分析される（BishopとRawlings、
核酸および蛋白の配列分析(Nucleic Acid and Protein
Sequence Analysis)、 オックスフォード、 1987）。本発
明により開示された開発方法を明示するために、以下の
実施例を報告する。以下の実施例は単に説明の目的で提
供するもので、添付した請求項のように、本発明の範囲
を制限するものと解してはならない。
で線状ＲＮＡ分子の３' 末端にポリアデノシン配列を酵
素的に合成することによって修飾される(Gethin 、Natu
re 287:301、 1980）。選択した担体ＲＮＡ分子中の遺伝
子挿入物は、特異的プライマーとしてポリチミジンおよ
び、担体プレーｔＲＮＡを該遺伝子に挿入する部位に隣
接するイントロン配列に対応するオリゴヌクレオチドを
用いて、ＰＣＲ環状合成（Saiki、 Science 29:487、 198
8)を行い、逆転写酵素により一本鎖の相補的ＤＮＡを合
成した後増殖させる（Okayamaら、 Methods Enzymol. 15
4:3、 1987) 。増やした遺伝子セグメントのヌクレオチ
ド配列は、自動塩基配列決定により求め、発現タンパク
のアミノ酸配列を推定し、さらに特別なコンピューター
支援プログラムにより分析される（BishopとRawlings、
核酸および蛋白の配列分析(Nucleic Acid and Protein
Sequence Analysis)、 オックスフォード、 1987）。本発
明により開示された開発方法を明示するために、以下の
実施例を報告する。以下の実施例は単に説明の目的で提
供するもので、添付した請求項のように、本発明の範囲
を制限するものと解してはならない。
【０００８】
【実施例】実施例１ ヒトアドレナリン作働性レセプターをコードする遺伝子
選択方法 ヒトのアルファ２−アドレナリン作働性レセプターを修
飾する、アルファ２Ｃ４およびアルファ２Ｃ１０遺伝子
のｃＤＮＡのＮｃｏＩ−ＳｍａＩおよびＰｓｔＩ−Ｐｓ
ｔＩフラグメント（サイズはそれぞれ１０６２および９
４８ｂｐ）を、プラスミドｐＧＥＭ−１に挿入されてい
る酵母のプレ−ｔＲＮＡLeu3のイントロンのただ一つの
ＨｐａＩ部位（Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーターの制御下にある）に連結する。構築遺伝子をＸｈ
ｏＩエンドヌクレアーゼで制限酵素処理し、続いてＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ（１２０Ｕ）で、４０マイクロリッ
トルの反応容積で、２．５ｍＭのＧＭＰの存在下で９０
分、３７℃で転写させることによって、直線状ＲＮＡ
（１〜５マイクログラム）がインビトロで得られる。得
られた転写物は天然のプレ−ｔＲＮＡの構造特性を保有
しており、特にアフリカツメガエルのスプライシングエ
ンドヌクレアーゼ（プレ−ｔＲＮＡの構造特性を特異的
に認識する酵素）によって正確に切断される。転写ＲＮ
Ａの環状化反応は、Ｔ４リガーゼ（１８Ｕ）および基質
ＲＮＡ（０．２−１マイクログラム）の存在下で、１０
マイクロリットルの反応容積で、３７℃で１２０分にわ
たって実施する。環状化反応の効率は、アルファ−32Ｐ
−ＵＴＰの存在下で転写して基質を標識した後、現在用
いられている方法（Carrara ら、Cell 58:37、 1989)に
したがい、アフリカツメガエルのＲＮアーゼＰで環状プ
レ−ｔＲＮＡを特異的に消化することによって確認す
る。個々の遺伝子挿入物を含む担体ＲＮＡの環状分子の
選択は、特異的な合成オリゴヌクレオチド（２．５pmo
l、長さ２４ヌクレオチド）と８０℃で３分、続いて６
５℃で１０分ハイブリダイゼーションし、さらに、それ
に続いてＲＮアーゼＨ（１Ｕ）の存在下で３７℃で６０
分間、２５マイクロリットルの反応容積中でハイブリダ
イゼーション部位の部位特異的線状化を行うことによっ
て実施する。選択分子は、既に記載された方法（Gethin
ら、 Nature 287:301、 1980）にしたがって、ポリＡポリ
メラーゼの存在下で、線状ＲＮＡ分子の３' 末端のポリ
アデノシン配列を酵素的に合成することによって修飾さ
れる。同じ方法が、ヒトの脳および他の組織で転写され
た遺伝子配列のｃＤＮＡ収集物の選択に用いることがで
きる。
選択方法 ヒトのアルファ２−アドレナリン作働性レセプターを修
飾する、アルファ２Ｃ４およびアルファ２Ｃ１０遺伝子
のｃＤＮＡのＮｃｏＩ−ＳｍａＩおよびＰｓｔＩ−Ｐｓ
ｔＩフラグメント（サイズはそれぞれ１０６２および９
４８ｂｐ）を、プラスミドｐＧＥＭ−１に挿入されてい
る酵母のプレ−ｔＲＮＡLeu3のイントロンのただ一つの
ＨｐａＩ部位（Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーターの制御下にある）に連結する。構築遺伝子をＸｈ
ｏＩエンドヌクレアーゼで制限酵素処理し、続いてＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ（１２０Ｕ）で、４０マイクロリッ
トルの反応容積で、２．５ｍＭのＧＭＰの存在下で９０
分、３７℃で転写させることによって、直線状ＲＮＡ
（１〜５マイクログラム）がインビトロで得られる。得
られた転写物は天然のプレ−ｔＲＮＡの構造特性を保有
しており、特にアフリカツメガエルのスプライシングエ
ンドヌクレアーゼ（プレ−ｔＲＮＡの構造特性を特異的
に認識する酵素）によって正確に切断される。転写ＲＮ
Ａの環状化反応は、Ｔ４リガーゼ（１８Ｕ）および基質
ＲＮＡ（０．２−１マイクログラム）の存在下で、１０
マイクロリットルの反応容積で、３７℃で１２０分にわ
たって実施する。環状化反応の効率は、アルファ−32Ｐ
−ＵＴＰの存在下で転写して基質を標識した後、現在用
いられている方法（Carrara ら、Cell 58:37、 1989)に
したがい、アフリカツメガエルのＲＮアーゼＰで環状プ
レ−ｔＲＮＡを特異的に消化することによって確認す
る。個々の遺伝子挿入物を含む担体ＲＮＡの環状分子の
選択は、特異的な合成オリゴヌクレオチド（２．５pmo
l、長さ２４ヌクレオチド）と８０℃で３分、続いて６
５℃で１０分ハイブリダイゼーションし、さらに、それ
に続いてＲＮアーゼＨ（１Ｕ）の存在下で３７℃で６０
分間、２５マイクロリットルの反応容積中でハイブリダ
イゼーション部位の部位特異的線状化を行うことによっ
て実施する。選択分子は、既に記載された方法（Gethin
ら、 Nature 287:301、 1980）にしたがって、ポリＡポリ
メラーゼの存在下で、線状ＲＮＡ分子の３' 末端のポリ
アデノシン配列を酵素的に合成することによって修飾さ
れる。同じ方法が、ヒトの脳および他の組織で転写され
た遺伝子配列のｃＤＮＡ収集物の選択に用いることがで
きる。
Claims (1)
- 【請求項１】 以下の工程： (1) 関連する遺伝子ライブラリーを含む遺伝子セグメン
トを、新規な担体ＲＮＡをコードする修飾遺伝子に挿入
する； (2) 得られた構築遺伝子をインビトロで転写する； (3) オリゴデオキシヌクレオチドプローブによって、担
体ＲＮＡの分子をインビトロで選択する； (4) 選択した担体ＲＮＡ分子をアフィニティー精製す
る； (5) 選択した分子に対応するＤＮＡを酵素的に合成す
る； (6) 選択した分子を増やし、配列決定を行う； ことを含む遺伝子配列の選択方法であって、前記担体と
して、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼプロモーター
の制御下に置かれた、酵母ｔＲＮＡLeu3遺伝子の転写産
物により構成されたリボ核酸（ＲＮＡ）を用いる選択方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITMI920892A IT1262937B (it) | 1992-04-13 | 1992-04-13 | Selezione genica in vitro mediante vettori ad rna |
| IT92A000892 | 1992-04-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06233681A true JPH06233681A (ja) | 1994-08-23 |
Family
ID=11362906
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5085871A Pending JPH06233681A (ja) | 1992-04-13 | 1993-04-13 | Ｒｎａ担体によるインビトロ遺伝子選択方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0566198A2 (ja) |
| JP (1) | JPH06233681A (ja) |
| IT (1) | IT1262937B (ja) |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1340807C (en) * | 1988-02-24 | 1999-11-02 | Lawrence T. Malek | Nucleic acid amplification process |
| ES2058893T3 (es) * | 1989-03-03 | 1994-11-01 | Genentech Inc | Procedimientos mejorados para la amplificacion de adn in vitro y para clonacion y cartografia de genomas. |
| US5194370A (en) * | 1990-05-16 | 1993-03-16 | Life Technologies, Inc. | Promoter ligation activated transcription amplification of nucleic acid sequences |
-
1992
- 1992-04-13 IT ITMI920892A patent/IT1262937B/it active IP Right Grant
-
1993
- 1993-04-13 EP EP93201054A patent/EP0566198A2/en not_active Ceased
- 1993-04-13 JP JP5085871A patent/JPH06233681A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ITMI920892A1 (it) | 1993-10-13 |
| EP0566198A2 (en) | 1993-10-20 |
| EP0566198A3 (ja) | 1994-08-03 |
| ITMI920892A0 (it) | 1992-04-13 |
| IT1262937B (it) | 1996-07-22 |
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