JP4220744B2 - ライゲーション阻害を用いてライブラリーを加工する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＲｅｃＡタンパク質を用いてＤＮＡライブラリーから所望の核酸以外の核酸を除去することにより、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡライブラリー、とりわけｃＤＮＡライブラリーは、遺伝子をクローニングするための極めて有用なツールである。これまでに、ｃＤＮＡライブラリーから多くの遺伝子がクローニングされている。クローニングされた遺伝子は、遺伝子自身の塩基配列を決定するのに用いられるのみならず、該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定したり、該タンパク質を細菌や酵母細胞内で大量に作らせるために用いられている。
【０００３】
しかしながら、ｃＤＮＡライブラリーから容易にクローニングし得るｃＤＮＡは、その鋳型となったｍＲＮＡが細胞中に大量に発現しているｃＤＮＡに限られるため、多くの遺伝子がクローニングされた現在では、クローニングし易いｃＤＮＡの多くは殆どクローニングされてしまい、新規なｃＤＮＡを効率よくクローニングすることが困難になりつつある。
【０００４】
ｃＤＮＡライブラリーから新規なｃＤＮＡを効率よくクローニングするためには、既にクローニングされたｃＤＮＡをライブラリーから除去することが必要であり、この目的のために、以下の従来技術が考案されている。
【０００５】
まず、この目的を達するために使用されている最も基本的な方法としては、差引きハイブリダイゼーションがある。
【０００６】
該方法では、目的の遺伝子を発現している細胞（又は組織）と目的の遺伝子を発現していない細胞からｍＲＮＡを調製し、一方からｃＤＮＡを合成した後、両者をハイブリダイゼーションさせるので、両細胞に共通するｃＤＮＡのみが除去され、ある組織や細胞に特異的に発現している遺伝子を濃縮、単離することが可能となる。
【０００７】
差引きハイブリダイゼーションを利用した方法としては、「Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １９９６ Ｓｅｐ；６（９）：７９１−８０６」が、ヒドロキシアパタイトカラムを用いた差引きハイブリダイゼーション法を開示している。該方法では、一本鎖ＤＮＡライブラリーをテンプレートとしてベクター由来の配列からのプライマーの伸長反応を行い、変性・再会合した後、再び二本鎖となるもののみをヒドロキシアパタイトカラムを用いて除去する。再会合する確率は濃度に依存するため、多数存在するクローンから優先的に除去される。
【０００８】
しかしながら、インサートサイズが３ｋｂを超えるような長い配列を含むｃＤＮＡライブラリーの場合、非特異的ハイブリダイゼーションが起こる可能性が高くなるので、該方法は、０．４〜２．５ｋｂ程度の比較的短いＤＮＡからなるｃＤＮＡにしか適用できない。長い配列は、多機能タンパクや複雑な構造のタンパク質をコードする機能的に重要な遺伝子を含む可能性が高いので、長い配列を含むライブラリーに適用し得ないことは、本方法の大きな欠点である。また、同一の遺伝子に由来し、３’末端と５’末端が共通であるが、中央が異なる配列は、短いｃＤＮＡであっても該方法では区別することができない。
【０００９】
また、同様の目的を達成するために多用される他の方法として、ディファレンシャルハイブリダイゼーションがある。
【００１０】
該方法では、特異的遺伝子の取得を目的とする細胞と対照の細胞から調製したｍＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡのプローブを合成する。続いて、目的の細胞から作成したｃＤＮＡライブラリーをプレートに播種し、同一プレートからコロニーを２枚のフィルターにレプリカする。一方のフィルターは目的の細胞由来のｃＤＮＡプローブを用いて、他方のフィルターは対照細胞由来のｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションを行い、結果を比較すれば、目的の細胞に特異的なｃＤＮＡを検出することができる。
【００１１】
しかしながら、この方法は、２つのフィルターのハイブリダイゼーションの差をコロニー毎に比較しなければならないため、多くのコロニーを処理することが難しく、ライブラリー全体の再構築には向いていない。また、該方法には、偽陽性もしくは偽陰性のシグナルが多くあるために、検討に時間を要するという欠点も存する。
【００１２】
このため、該方法のかかる欠点を克服するために、”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９９５； ２５４：３０４−３２１”は、従来のディファレンシャルハイブリダイゼーションとポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと称する）を組み合わせたディフェレンシャルディスプレー法を開示しているが、該方法は発現レベルの差が著しくないとパターンの差が見出せないのみならず、クローンを直接取得できないために、ＰＣＲ産物をもとに何らかの方法によってクローンを選択しなければならない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来技術に存する上記課題を解決するためになされたものであり、ＤＮＡライブラリーから、長いインサートサイズの所望のＤＮＡを特異的に濃縮することが可能であり、且つ該ＤＮＡのクローンを直接取得することができる方法を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の態様において、ＲｅｃＡタンパク質を用いて環状ＤＮＡライブラリーから特定のＤＮＡを除去することにより、所望の核酸の含有率が増加した環状ＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供する。
【００１５】
すなわち、含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含む環状ＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加した環状ＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、
（１） 前記環状ＤＮＡライブラリーの環状ＤＮＡを線状ＤＮＡにする工程と、
（２） 前記第二のｄｓＤＮＡに対応するｓｓＤＮＡを調製する工程と；
（３） 前記環状ＤＮＡライブラリーに、ＲｅｃＡタンパク質と工程（２）で調製した前記第二のｓｓＤＮＡを添加することにより、前記第二のｄｓＤＮＡに前記ＲｅｃＡタンパク質を介して前記第二のｓｓＤＮＡを結合させ、三本鎖構造にする工程と；
（４） 工程（３）で得られた三本鎖構造のＤＮＡを含む線状ＤＮＡをライゲーションすることによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
（５） 工程（４）の処理を施したＤＮＡから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
を備えた方法が提供される。
【００１６】
特に、前記方法であって、前記工程（４）の処理を施したＤＮＡからの線状ＤＮＡの除去が、前記工程（４）で得られたＤＮＡを宿主に形質転換して、環状ＤＮＡが形質転換された宿主のみを薬剤で選択することによって行われる方法が提供される。
【００１７】
本発明の第二の態様において、ＲｅｃＡタンパク質を用いてＤＮＡライブラリーから特定のＤＮＡを除去することにより、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供する。
【００１８】
すなわち、含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、
（１） 第一のｄｓDNAを含む線状DNAライブラリーを調製する工程と、
（２） 前記第二のｄｓＤＮＡの両端の配列に対応するｓｓＤＮＡをそれぞれ調製する工程と；
（３） 前記線状ＤＮＡに、ＲｅｃＡタンパク質と工程（２）で調製した前記第二のｓｓＤＮＡを添加することにより、前記第二のｄｓＤＮＡに前記ＲｅｃＡタンパク質を介して前記第二のｓｓＤＮＡを結合させ、三本鎖構造にする工程と；
（４） 工程（３）で得られた三本鎖構造のＤＮＡを含む線状ＤＮＡを所望のDNAとライゲーションする処理を施し、三本鎖構造を含まないｄｓＤＮＡのみを環状化する工程と；
（５） 工程（４）の処理を施したＤＮＡから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
を備えた方法が提供される。
【００１９】
特に、前記方法であって、前記工程（４）の処理を施したＤＮＡからの線状ＤＮＡの除去が、前記工程（４）で得られたＤＮＡを宿主に形質転換して、環状ＤＮＡが形質転換された宿主のみを薬剤で選択することによる除去である方法が提供される。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＲｅｃＡタンパク質を介して形成される三本鎖構造が標的核酸の末端領域に形成される場合には、前記三本鎖構造からＲｅｃＡタンパク質を解離させた後にも前記三本鎖構造が維持されるという本発明者らの発見に基づいてなされたものである。ＲｅｃＡタンパク質、及びＲｅｃＡタンパク質を介して三本鎖構造が形成されることは公知である。
【００２１】
ここで、ＲｅｃＡタンパク質について説明する。
【００２２】
ＲｅｃＡタンパク質は、相同的組換え、ＤＮＡの修復、又は大腸菌のＳＯＳ遺伝子の発現などに関与することが知られている。ＲｅｃＡタンパク質の中では、大腸菌やλファージのＲｅｃＡタンパク質が最も有名である。しかしながら、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質に類似した構造及び機能を有するタンパク質は、大腸菌以外の生物にも広く分布していることが知られており、これらのタンパク質は、一般に、ＲｅｃＡ類似タンパク質と呼称されている。
【００２３】
図１のように、ＲｅｃＡタンパク質は、一本鎖ＤＮＡに結合した後（ＲｅｃＡ−一本鎖ＤＮＡ繊維）、該一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに対合させて三元複合体（トリプレックス）を形成し、相同ＤＮＡの検索を行った後、ＡＴＰ存在下でＤＮＡ鎖交換反応を触媒する。ＤＮＡ鎖交換反応後には、前記一本鎖ＤＮＡが前記二本鎖ＤＮＡに取り込まれた雑種二本鎖ＤＮＡと前記二本鎖ＤＮＡから分離された一本鎖ＤＮＡが形成される。
【００２４】
前述のように、ＲｅｃＡタンパク質は、一本鎖核酸を二本鎖核酸にランダムに結合させるのではなく、二本鎖核酸の一方のストランド中に存在する相同な領域に結合させる。二つの核酸が「相同」であるということは、ＲｅｃＡタンパク質を介して特異的な三本鎖構造を形成し得る程度に、両核酸が同一である、又は類似していることを意味する。「類似」とは、例えば、二つの塩基配列が少なくとも５０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の同一性であり得る。
【００２５】
本発明の方法は、ＲｅｃＡタンパク質を介して一本鎖ＤＮＡと該一本鎖ＤＮＡに相同な二本鎖ＤＮＡを結合させて、三本鎖構造ＤＮＡが形成されることを利用して、ＤＮＡライブラリーから所定のＤＮＡを除去する方法である。
【００２６】
本明細書において、「ＲｅｃＡタンパク質」とは、二本鎖核酸の一方のストランド中の任意の領域に、該領域と相同な一本鎖核酸を結合させることにより、前記領域に三本鎖構造を形成させ得るタンパク質を意味する。
【００２７】
また、ＲｅｃＡタンパク質には、大腸菌やλファージのＲｅｃＡタンパク質のみならず、ＲｅｃＡ類似タンパク質も含まれる。上述のように、本発明の方法では、ＲｅｃＡタンパク質が相同なＤＮＡの対合を促進し、三本鎖構造ＤＮＡの形成を触媒する機能を有する限り、本発明の方法において、前記ＲｅｃＡ類似タンパク質も使用することができる。
【００２８】
本発明で使用するのに好ましいＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質である。
【００２９】
本明細書において、「ＤＮＡライブラリー」なる語は、多種類のDNA断片の集合体を意味し、主に遺伝子ライブラリーとｃＤＮＡライブラリーを総称する用語として使用する。「遺伝子ライブラリー」とは、ファージ又はコスミドに含まれる単一の生物種の全ゲノムＤＮＡ断片の集合体であり、「ゲノムＤＮＡライブラリー」と同義である。「ｃＤＮＡライブラリー」とは、ベクターに挿入された、特定の組織や細胞由来のｍＲＮＡから作成される相補的ＤＮＡ（以下ｃＤＮＡと称する）から作成される多種類のｃＤＮＡ分子種の集合体をいう。前記DNA断片は必ずしもファージ、コスミド、またはプラスミド中に含まれて環状化されている必要はなく、DNA断片のみからなっていてもよい。ＤＮＡライブラリーに含まれるDNA断片の種類は何種類でもよく、2種類であってもよい。
【００３０】
また、本明細書において、二本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＤＮＡは、それぞれｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡと略記する。
【００３１】
以下、本発明の方法の詳細について述べる。
【００３２】
本発明の第一の態様において、ＲｅｃＡタンパク質を用いて環状ＤＮＡライブラリーから特定のＤＮＡを除去することにより、所望の核酸の含有率が増加した環状ＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供する。本発明の方法の第一の工程では、環状ＤＮＡライブラリーの環状ＤＮＡを線状ＤＮＡにする操作を施す。環状ＤＮＡを線状ＤＮＡにする方法としては、たとえば、適切な制限酵素で環状ＤＮＡを切断すればよい。前記制限酵素は、前記環状ＤＮＡの一カ所のみを切断するものを選択することが好ましい。前記制限酵素による切断は、通常の方法を使用して行えばよい。 次に第二の工程において、前記ＤＮＡライブラリーから除去すべき第二のｄｓＤＮＡに対応するｓｓＤＮＡを調製する。
【００３３】
ここで、除去すべき第二のｄｓＤＮＡに「対応する」とは、何れかのストランド中に、第二のｄｓＤＮＡ全部又は一部と実質的に同じ塩基配列を有する部分を含んでいることをいう。「実質的に同じ塩基配列を有する」とは、ＲｅｃＡタンパク質による三本鎖構造ＤＮＡの形成がなされ得る程度に同等の塩基配列を有することをいう。
【００３４】
前記第二のｄｓＤＮＡのサイズは、３〜１３ｋｂであり得る。６ｋｂ以上でサイズ分画されたライブラリー中のＤＮＡであることが好ましい。
【００３５】
なお、ライブラリー中に含まれるこれらのｄｓＤＮＡは、プラスミドやウイルスベクターに担持されていることが通常であろう。
【００３６】
第二のｄｓＤＮＡに対応するｓｓＤＮＡを調製するためには、インビトロ転写系を使用することができる。たとえば、ＤＮＡライブラリーのインサートをインビトロ転写可能なベクターであるｐＳＰＯＲＴ１に載せ換えて、ＳＰ６転写システム（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用してＲＮＡ合成を行う。次に、適切なプライマー（Ｒｏｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ Ｎ６（宝社）など）、および逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）など）を使用してｃＤＮＡを合成した。最後にフェノール・クロロホルムによってタンパク質を除去して、ｃＤＮＡを精製することにより、ｓｓＤＮＡを得ることができる。上記のようなｃＤＮＡの調製方法は、当業者に周知である。
【００３７】
その他、ライブラリーのｄｓＤＮＡに対応するｓｓＤＮＡを作製するためには、ニッカーゼ等でｄｓＤＮＡにニック（切れ目）を導入した後に、ＥｘｏIII、Ｔ７ｇｅｎｅ６等のヌクレアーゼで処理してもよい。さらに、ｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡにする操作としては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ１１９等のファージミドベクターをファージ粒子として使用し、ｓｓＤＮＡを回収する操作もあるが、これらに限定されない。
【００３８】
続いて、第三の工程では、前記ＲｅｃＡタンパク質と前記第二のｓｓＤＮＡを、前記ＤＮＡライブラリーに添加する。
【００３９】
上記のようにして得られた第二のｄｓＤＮＡに対応するｓｓＤＮＡは、何れかのストランドが第二のｄｓＤＮＡの全部又は一部と同一の塩基配列を含むので、前記工程で得られた第二のｓｓＤＮＡとＲｅｃＡタンパク質を加えると、三本鎖構造ＤＮＡの形成反応が進行する（図２参照）。
【００４０】
ＲｅｃＡタンパク質が解離した後にも三本鎖構造が安定に維持されるためには、前記ｓｓＤＮＡの長さは、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは３０塩基以上、さらに好ましくは４０塩基以上、最も好ましくは６０塩基以上である。
【００４１】
安定な三本鎖構造を得るためには、三本鎖構造の両末端のうち、外側（すなわち、ｄｓＤＮＡの終末端側）に存在する末端が、ｄｓＤＮＡの終末端から５０番目の塩基、より好ましくは３０番目の塩基、さらに好ましくは２０番目の塩基、さらに好ましくは１０番目の塩基よりも外側に位置することが好ましい。
【００４２】
また、ＲｅｃＡタンパク質は、本来、ＡＴＰの存在下において、相同的な組換えを触媒するタンパク質なので、前記試料中にＡＴＰが存在すると相同的組換えが進行して、三本鎖構造は直ぐに消滅してしまう。
【００４３】
ＲｅｃＡタンパク質を介して三本鎖構造を形成させるためには、ＧＴＰ、ＩＴＰなどのＡＴＰの機能を代替し得る物質、またはＡＴＰγＳのような非分解性ＡＴＰ類似体を添加しなければならない。ＧＴＰ、ＩＴＰの存在下では、ＲｅｃＡタンパク質による交換反応は進行されないことが明らかとなっている。
【００４４】
次に、第四の工程では、前記工程で得られた三本鎖構造のＤＮＡを含むＤＮＡを自己ライゲーションする。このとき、前記三本鎖構造が形成されたＤＮＡは、自己ライゲーション反応が阻害されるが、前記三本鎖構造が形成されていないｄｓＤＮＡは、自己ライゲーションされて環状ＤＮＡとなる。
【００４５】
本明細書において、「自己ライゲーション」とは、一本の線状ＤＮＡの５‘末端と３’末端がライゲーションされて、環状ＤＮＡとなることを意味する。
【００４６】
前記ライゲーション反応は、通常の方法を使用して行えばよい。たとえば、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によってライゲーション反応（３７℃において３０分間）を行って環状ＤＮＡを構築することができる。また、その他の商業的に入手可能なライゲーションキット等を使用してもよい。
【００４７】
本発明において、さらに、上記第１から第四の工程からなるサイクルを２回以上繰り返えしてもよい。
【００４８】
第五の工程では、前記工程で得られたＤＮＡから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する。
【００４９】
除去すべき線状三本鎖構造ＤＮＡと含有率を増加させるべき環状ＤＮＡとを分離するには、例えば、アガロース電気泳動で分離する方法、臭化エチジウム存在下で遠心する方法、などを使用することができる。その他、使用したＤＮＡライブラリー内に薬剤耐性遺伝子が含まれている場合は、前記ＤＮＡを宿主に形質転換して、環状ＤＮＡが形質転換された宿主のみを薬剤で選択する方法を使用してもよいが、これらに限定されない。
【００５０】
また、本発明の方法において、前記ＲｅｃＡタンパク質を介して三本鎖構造を形成させる工程に続いて、前記三本鎖核酸に結合したＲｅｃＡタンパク質を解離させる工程を実施してもよい。
【００５１】
本発明の方法の説明において、図２及び上記の説明では、便宜上、２種類のｄｓＤＮＡの中から１種類のｄｓＤＮＡを除去する操作を記載したが、実際の操作では、数千〜数万種類のｄｓＤＮＡの中から数十〜数万種類のｄｓＤＮＡを同時に、又は順次に除去することもできる。
【００５２】
本発明の第二の態様において、第一の態様において示した方法よりも効率的にＤＮＡライブラリーから特定のＤＮＡを除去することにより、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供する。すなわち、核酸の両末端のライゲーション反応を阻害することによって、RecAタンパク質によるライゲーション阻害を効率化した方法を提供する。
【００５３】
本発明の方法の第一の工程では、線状ＤＮＡライブラリーを調製する。線状ＤＮＡを調製する方法としては、環状DNAからDNA断片を切り出すことによって、またはPCR法によって調製してもよい。また、mRNAを逆転写してcDNAを作製することによって調製してもよい。その他DNA断片を作製するために様々な方法を使用することができる。たとえば、ｃＤＮＡライブラリーであれば、ベクターに挿入されたインサートcDNAを切り出すことによって調製すればよい。
【００５４】
前記DNAの切断、PCRおよびmRNAからの逆転写、その他線状DNAの調製は、通常の方法を使用して行えばよい。
【００５５】
次に第二の工程において、前記ＤＮＡライブラリーから除去すべき第二のｄｓＤＮＡの両端の配列に対応するｓｓＤＮＡをそれぞれ調製する。「両端の配列」とは、前記第二のdsDNAの5’末端および3’末端の配列のそれぞれの配列を意味する。
【００５６】
また「両端の配列に対応する」とは、何れかのストランド中に、前記第二のｄｓＤＮＡの5’末端および3’末端の配列のそれぞれと、またはそれらの一部と実質的に同じ塩基配列を有する部分を含んでいることをいい、「実質的に同じ塩基配列を有する」とは、上述したとおり、ＲｅｃＡタンパク質による三本鎖構造ＤＮＡの形成がなされ得る程度に同等の塩基配列を有することをいう。
【００５７】
続いて、第三の工程では、前記ＲｅｃＡタンパク質と前記第二のｓｓＤＮＡを、前記ＤＮＡライブラリーに添加する。この工程により、上述の通り三本鎖構造ＤＮＡの形成反応が進行する（図３参照）。
【００５８】
次に、第四の工程では、前記工程で得られた三本鎖構造のＤＮＡを含むＤＮＡを所望のDNAとライゲーションする。このとき、前記三本鎖構造が形成されたＤＮＡは、ライゲーション反応が阻害されるが、前記三本鎖構造が形成されていないｄｓＤＮＡは、所望のDNAとライゲーションされて環状ＤＮＡとなる。
【００５９】
本方法において「所望のDNA」とは、主にライブラリーを構築するためのファージ、コスミド、プラスミドなどのベクターを意味するが、これに限定されない。
【００６０】
第五の工程では、前記工程で得られたＤＮＡから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する。
【００６１】
除去すべき線状三本鎖構造ＤＮＡと含有率を増加させるべき環状ＤＮＡとを分離する方法は、上述したとおりである。
【００６２】
なお、図に示されている具体的な反応や構造などは、あくまでも理解を容易にする目的で記載されているにすぎないので、実際には、それらの細部が図面と一致しない場合があり得る。
【００６３】
以下、実施例によって、本発明をさらに詳細に説明する。
【００６４】
【実施例】
実施例１
ＲｅｃＡを用いたライゲーション阻害反応により、二種類のプラスミド混合物から一方のプラスミドの除去を行った。クロラムフェニコール耐性のプラスミドｐＢＣ２３Ｃ１０、およびアンピシリン耐性のプラスミドｐＢＳ１Ｂ３を使用して、両者の混合物から一方のプラスミドの除去を行った。ｐＢＣ２３Ｃ１０およびｐＢＳ１Ｂ３を１０００：１で混合して、両プラスミドＤＮＡの一カ所のみを切断する制限酵素ＮｏｔＩによって消化し、線状二本鎖ＤＮＡにした。ｐＢＣ２３Ｃ１０をＳａｌＩとＮｏｔＩで切断したのち、インサートＤＮＡと、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩによって切断済みのｐＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をライゲーションした。インビトロ転写をすることが可能であるｐＳＰＯＲＴ１に載せ換えた後、ＳＰ６転写システム（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用してＲＮＡ合成を行った。得られたＲＮＡ５μｇにＲｏｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ Ｎ６（宝社）を６．２５μｇ添加し、熱変性後、氷水で急冷した。ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡社）４０ｕｎｉｔ、５×Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）４μｌ、０．１Ｍ ジチオスレイトール２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１μｌを添加した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を５μｌ添加した後、滅菌蒸留水を添加して全量２０μｌにした。３７℃において６０分間反応させてｃＤＮＡを合成した。フェノール・クロロホルムによってタンパク質を除去して、ｃＤＮＡを精製した。三本鎖形成反応溶液（１）は、３０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、合成したｐＢＣ２３Ｃ１０由来のｃＤＮＡを１００ｎｇ、ＲｅｃＡタンパク質（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）５μｇ、滅菌蒸留水を添加して全量を２０μｌにし、３７℃において１５分間保温する。三本鎖形成反応溶液（２）は、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ６．９）、２３ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、ＮｏｔＩ切断済みライブラリーを５０ｎｇ、滅菌蒸留水を添加して全量を１８μｌにした。これを三本鎖形成反応溶液（１）と混合して、３７℃において３０分間保温した。１００ｍＭ ＧＴＰ ２μｌを添加して、３７℃において３０分間反応させる。タンパク質分解操作をした後、ＤＮＡを精製する。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって３７℃において３０分間ライゲーション反応を行った。次に、ＤＮＡを精製して、大腸菌を形質転換することによってライブラリーを再構築した。除去を行いたいプラスミドのみが選択的に１／４００になっていることがわかる。
【００６５】
【表１】
【００６６】
実施例２
ＲｅｃＡを使用した三本鎖形成反応によって、既に得られていたプラスミド（３０００クローン）をプラスミドライブラリーから除去した。
【００６７】
ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫＩＩ（＋）内に作製したプラスミドライブラリーインサートをインビトロ転写可能なベクターである、ｐＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に載せ換えて、ＳＰ６転写システム（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用してＲＮＡ合成を行った。得られたＲＮＡ５μｇにＲｏｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒＮ６（宝社）を６．２５μｇ添加し、熱変性後、氷水で急冷した。ＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡社）４０ｕｎｉｔ、５×Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μｌ、０．１Ｍ ジチオスレイトール２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１μｌを添加した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を５μｌ添加した後、滅菌蒸留水を添加して全量２０μｌにする。３７℃において６０分間反応させてｃＤＮＡを合成した。フェノール・クロロホルムによってタンパク質を除去して、ｃＤＮＡを精製した。プラスミドライブラリーは、プラスミドＤＮＡの一カ所のみを切断する制限酵素ＮｏｔＩによって消化して、線状二本鎖ＤＮＡにした。三本鎖形成反応溶液（１）は、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸 （ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、合成したｃＤＮＡを１００ｎｇ、ＲｅｃＡタンパク質（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）５μｇ、滅菌蒸留水を添加して全量を２０μｌとし、３７℃において１５分間保温した。三本鎖形成反応溶液（２）は、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸 （ｐＨ６．９）、２３ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、ＮｏｔＩ切断済みライブラリーを５０ｎｇ、滅菌蒸留水を添加して全量を１８μｌにした。これを三本鎖形成反応溶液（１）と混合して、３７℃において３０分間保温する。１００ｍＭ ＧＴＰ ２μｌを添加して、３７℃において３０分間反応させる。タンパク質分解操作をした後、ＤＮＡを精製する。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって３７℃において３０分間ライゲーション反応を行った。次に、ＤＮＡを精製して、大腸菌を形質転換することによってライブラリーを再構築した。ランダムに９６クローンの塩基配列を決定して、配列を既知のクローンのデータベースと比較することによって、未知クローンの出現頻度を検討した。一回の既知クローン除去操作によって新規クローンの出現頻度は、約６０％から約８０％へと上昇していた。
【００６８】
【表２】
【００６９】
実施例3
RecAを用いたライゲーション阻害反応の効率化をめざし、遺伝子の両端のライゲーション阻害により、二種類のプラスミド混合物から一方のプラスミドの除去を行った。
【００７０】
挿入した遺伝子のそれぞれの末端を切断する制限酵素のNotIおよびMulIでプラスミドを消化した。消化されたプラスミドを鋳型として、T7転写システム（Ａｍｂｉｏｎ社）、T3転写システム（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用してＲＮＡ合成を行った。得られたＲＮＡ５μｇにＲｏｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ Ｎ６（宝社）を６．２５μｇ添加し、熱変性後、氷水で急冷した。ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡社）４０ｕｎｉｔ、５×Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）４μｌ、０．１Ｍ ジチオスレイトール２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１μｌを添加した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を５μｌ添加した後、滅菌蒸留水を添加して全量２０μｌにした。３７℃において６０分間反応させてｃＤＮＡを合成した。フェノール・クロロホルムによってタンパク質を除去して、ｃＤＮＡを精製した。挿入遺伝子の量末端を切断する前記制限酵素の組合せであるNotIおよびMulIでプラスミドを消化し、ベクターと挿入された遺伝子を分離する。三本鎖形成反応溶液（１）は、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、合成した各末端に対応するｃＤＮＡをそれぞれ１００ｎｇ、ＲｅｃＡタンパク質（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）５μｇ、滅菌蒸留水を添加して全量を２０μｌにし、３７℃において１５分間保温する。三本鎖形成反応溶液（２）は、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ６．９）、２３ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、ＮｏｔＩおよびMulIで切断済みプラスミドを５０ｎｇ、滅菌蒸留水を添加して全量を１８μｌにして、３７℃において３０分間保温した。１００ｍＭ ＧＴＰ ２μｌを添加して、３７℃において３０分間反応させる。タンパク質分解操作をした後、ＤＮＡを精製する。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって３７℃において３０分間ライゲーション反応を行った。次に、ＤＮＡを精製して、大腸菌を形質転換することによってライゲーション阻害効果を検討した。
【００７１】
挿入遺伝子末端の片方のcDNAを加えた場合と比較して、両方のcDNAを加えることによって相乗的な阻害効果があった。
【００７２】
【表３】
【００７３】
表中の数字はコロニー数を示し、下段の括弧内はライゲーション阻害反応を行っていない場合と比較して、阻害反応を行った場合のコロニー数の割合を示す。
【００７４】
【発明の効果】
本発明の方法を用いれば、ＤＮＡライブラリーから所望の核酸以外の核酸を除去することにより、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリーを直接構築することができる。上記の実施例で実証されているように、本発明の方法を用いれば、除去すべき既知のｄｓＤＮＡを９０％以上除去することも可能である。
【００７５】
さらに、dsDNAの両端を三本鎖構造としてライゲーションを阻害する方法では、片方の末端を阻害する方法と比較して、既知遺伝子の量を百分の一以下に除去することが可能となる。それ故、本発明を適用するライブラリーの種類に応じて、ライブラリーの新規クローンの出現率を１０％〜９９％増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲｅｃＡの作用機構の概略図。
【図２】本発明のライゲーション阻害の基本原理を示した図。
【図３】本発明のライゲーション阻害の基本原理を示した図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＲｅｃＡタンパク質を用いてＤＮＡライブラリーから所望の核酸以外の核酸を除去することにより、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡライブラリー、とりわけｃＤＮＡライブラリーは、遺伝子をクローニングするための極めて有用なツールである。これまでに、ｃＤＮＡライブラリーから多くの遺伝子がクローニングされている。クローニングされた遺伝子は、遺伝子自身の塩基配列を決定するのに用いられるのみならず、該遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定したり、該タンパク質を細菌や酵母細胞内で大量に作らせるために用いられている。
【０００３】
しかしながら、ｃＤＮＡライブラリーから容易にクローニングし得るｃＤＮＡは、その鋳型となったｍＲＮＡが細胞中に大量に発現しているｃＤＮＡに限られるため、多くの遺伝子がクローニングされた現在では、クローニングし易いｃＤＮＡの多くは殆どクローニングされてしまい、新規なｃＤＮＡを効率よくクローニングすることが困難になりつつある。
【０００４】
ｃＤＮＡライブラリーから新規なｃＤＮＡを効率よくクローニングするためには、既にクローニングされたｃＤＮＡをライブラリーから除去することが必要であり、この目的のために、以下の従来技術が考案されている。
【０００５】
まず、この目的を達するために使用されている最も基本的な方法としては、差引きハイブリダイゼーションがある。
【０００６】
該方法では、目的の遺伝子を発現している細胞（又は組織）と目的の遺伝子を発現していない細胞からｍＲＮＡを調製し、一方からｃＤＮＡを合成した後、両者をハイブリダイゼーションさせるので、両細胞に共通するｃＤＮＡのみが除去され、ある組織や細胞に特異的に発現している遺伝子を濃縮、単離することが可能となる。
【０００７】
差引きハイブリダイゼーションを利用した方法としては、「Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １９９６ Ｓｅｐ；６（９）：７９１−８０６」が、ヒドロキシアパタイトカラムを用いた差引きハイブリダイゼーション法を開示している。該方法では、一本鎖ＤＮＡライブラリーをテンプレートとしてベクター由来の配列からのプライマーの伸長反応を行い、変性・再会合した後、再び二本鎖となるもののみをヒドロキシアパタイトカラムを用いて除去する。再会合する確率は濃度に依存するため、多数存在するクローンから優先的に除去される。
【０００８】
しかしながら、インサートサイズが３ｋｂを超えるような長い配列を含むｃＤＮＡライブラリーの場合、非特異的ハイブリダイゼーションが起こる可能性が高くなるので、該方法は、０．４〜２．５ｋｂ程度の比較的短いＤＮＡからなるｃＤＮＡにしか適用できない。長い配列は、多機能タンパクや複雑な構造のタンパク質をコードする機能的に重要な遺伝子を含む可能性が高いので、長い配列を含むライブラリーに適用し得ないことは、本方法の大きな欠点である。また、同一の遺伝子に由来し、３’末端と５’末端が共通であるが、中央が異なる配列は、短いｃＤＮＡであっても該方法では区別することができない。
【０００９】
また、同様の目的を達成するために多用される他の方法として、ディファレンシャルハイブリダイゼーションがある。
【００１０】
該方法では、特異的遺伝子の取得を目的とする細胞と対照の細胞から調製したｍＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡのプローブを合成する。続いて、目的の細胞から作成したｃＤＮＡライブラリーをプレートに播種し、同一プレートからコロニーを２枚のフィルターにレプリカする。一方のフィルターは目的の細胞由来のｃＤＮＡプローブを用いて、他方のフィルターは対照細胞由来のｃＤＮＡプローブを用いてハイブリダイゼーションを行い、結果を比較すれば、目的の細胞に特異的なｃＤＮＡを検出することができる。
【００１１】
しかしながら、この方法は、２つのフィルターのハイブリダイゼーションの差をコロニー毎に比較しなければならないため、多くのコロニーを処理することが難しく、ライブラリー全体の再構築には向いていない。また、該方法には、偽陽性もしくは偽陰性のシグナルが多くあるために、検討に時間を要するという欠点も存する。
【００１２】
このため、該方法のかかる欠点を克服するために、”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １９９５； ２５４：３０４−３２１”は、従来のディファレンシャルハイブリダイゼーションとポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと称する）を組み合わせたディフェレンシャルディスプレー法を開示しているが、該方法は発現レベルの差が著しくないとパターンの差が見出せないのみならず、クローンを直接取得できないために、ＰＣＲ産物をもとに何らかの方法によってクローンを選択しなければならない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来技術に存する上記課題を解決するためになされたものであり、ＤＮＡライブラリーから、長いインサートサイズの所望のＤＮＡを特異的に濃縮することが可能であり、且つ該ＤＮＡのクローンを直接取得することができる方法を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一の態様において、ＲｅｃＡタンパク質を用いて環状ＤＮＡライブラリーから特定のＤＮＡを除去することにより、所望の核酸の含有率が増加した環状ＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供する。
【００１５】
すなわち、含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含む環状ＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加した環状ＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、
（１） 前記環状ＤＮＡライブラリーの環状ＤＮＡを線状ＤＮＡにする工程と、
（２） 前記第二のｄｓＤＮＡに対応するｓｓＤＮＡを調製する工程と；
（３） 前記環状ＤＮＡライブラリーに、ＲｅｃＡタンパク質と工程（２）で調製した前記第二のｓｓＤＮＡを添加することにより、前記第二のｄｓＤＮＡに前記ＲｅｃＡタンパク質を介して前記第二のｓｓＤＮＡを結合させ、三本鎖構造にする工程と；
（４） 工程（３）で得られた三本鎖構造のＤＮＡを含む線状ＤＮＡをライゲーションすることによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
（５） 工程（４）の処理を施したＤＮＡから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
を備えた方法が提供される。
【００１６】
特に、前記方法であって、前記工程（４）の処理を施したＤＮＡからの線状ＤＮＡの除去が、前記工程（４）で得られたＤＮＡを宿主に形質転換して、環状ＤＮＡが形質転換された宿主のみを薬剤で選択することによって行われる方法が提供される。
【００１７】
本発明の第二の態様において、ＲｅｃＡタンパク質を用いてＤＮＡライブラリーから特定のＤＮＡを除去することにより、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供する。
【００１８】
すなわち、含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、
（１） 第一のｄｓDNAを含む線状DNAライブラリーを調製する工程と、
（２） 前記第二のｄｓＤＮＡの両端の配列に対応するｓｓＤＮＡをそれぞれ調製する工程と；
（３） 前記線状ＤＮＡに、ＲｅｃＡタンパク質と工程（２）で調製した前記第二のｓｓＤＮＡを添加することにより、前記第二のｄｓＤＮＡに前記ＲｅｃＡタンパク質を介して前記第二のｓｓＤＮＡを結合させ、三本鎖構造にする工程と；
（４） 工程（３）で得られた三本鎖構造のＤＮＡを含む線状ＤＮＡを所望のDNAとライゲーションする処理を施し、三本鎖構造を含まないｄｓＤＮＡのみを環状化する工程と；
（５） 工程（４）の処理を施したＤＮＡから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
を備えた方法が提供される。
【００１９】
特に、前記方法であって、前記工程（４）の処理を施したＤＮＡからの線状ＤＮＡの除去が、前記工程（４）で得られたＤＮＡを宿主に形質転換して、環状ＤＮＡが形質転換された宿主のみを薬剤で選択することによる除去である方法が提供される。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＲｅｃＡタンパク質を介して形成される三本鎖構造が標的核酸の末端領域に形成される場合には、前記三本鎖構造からＲｅｃＡタンパク質を解離させた後にも前記三本鎖構造が維持されるという本発明者らの発見に基づいてなされたものである。ＲｅｃＡタンパク質、及びＲｅｃＡタンパク質を介して三本鎖構造が形成されることは公知である。
【００２１】
ここで、ＲｅｃＡタンパク質について説明する。
【００２２】
ＲｅｃＡタンパク質は、相同的組換え、ＤＮＡの修復、又は大腸菌のＳＯＳ遺伝子の発現などに関与することが知られている。ＲｅｃＡタンパク質の中では、大腸菌やλファージのＲｅｃＡタンパク質が最も有名である。しかしながら、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質に類似した構造及び機能を有するタンパク質は、大腸菌以外の生物にも広く分布していることが知られており、これらのタンパク質は、一般に、ＲｅｃＡ類似タンパク質と呼称されている。
【００２３】
図１のように、ＲｅｃＡタンパク質は、一本鎖ＤＮＡに結合した後（ＲｅｃＡ−一本鎖ＤＮＡ繊維）、該一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに対合させて三元複合体（トリプレックス）を形成し、相同ＤＮＡの検索を行った後、ＡＴＰ存在下でＤＮＡ鎖交換反応を触媒する。ＤＮＡ鎖交換反応後には、前記一本鎖ＤＮＡが前記二本鎖ＤＮＡに取り込まれた雑種二本鎖ＤＮＡと前記二本鎖ＤＮＡから分離された一本鎖ＤＮＡが形成される。
【００２４】
前述のように、ＲｅｃＡタンパク質は、一本鎖核酸を二本鎖核酸にランダムに結合させるのではなく、二本鎖核酸の一方のストランド中に存在する相同な領域に結合させる。二つの核酸が「相同」であるということは、ＲｅｃＡタンパク質を介して特異的な三本鎖構造を形成し得る程度に、両核酸が同一である、又は類似していることを意味する。「類似」とは、例えば、二つの塩基配列が少なくとも５０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の同一性であり得る。
【００２５】
本発明の方法は、ＲｅｃＡタンパク質を介して一本鎖ＤＮＡと該一本鎖ＤＮＡに相同な二本鎖ＤＮＡを結合させて、三本鎖構造ＤＮＡが形成されることを利用して、ＤＮＡライブラリーから所定のＤＮＡを除去する方法である。
【００２６】
本明細書において、「ＲｅｃＡタンパク質」とは、二本鎖核酸の一方のストランド中の任意の領域に、該領域と相同な一本鎖核酸を結合させることにより、前記領域に三本鎖構造を形成させ得るタンパク質を意味する。
【００２７】
また、ＲｅｃＡタンパク質には、大腸菌やλファージのＲｅｃＡタンパク質のみならず、ＲｅｃＡ類似タンパク質も含まれる。上述のように、本発明の方法では、ＲｅｃＡタンパク質が相同なＤＮＡの対合を促進し、三本鎖構造ＤＮＡの形成を触媒する機能を有する限り、本発明の方法において、前記ＲｅｃＡ類似タンパク質も使用することができる。
【００２８】
本発明で使用するのに好ましいＲｅｃＡタンパク質は、大腸菌のＲｅｃＡタンパク質である。
【００２９】
本明細書において、「ＤＮＡライブラリー」なる語は、多種類のDNA断片の集合体を意味し、主に遺伝子ライブラリーとｃＤＮＡライブラリーを総称する用語として使用する。「遺伝子ライブラリー」とは、ファージ又はコスミドに含まれる単一の生物種の全ゲノムＤＮＡ断片の集合体であり、「ゲノムＤＮＡライブラリー」と同義である。「ｃＤＮＡライブラリー」とは、ベクターに挿入された、特定の組織や細胞由来のｍＲＮＡから作成される相補的ＤＮＡ（以下ｃＤＮＡと称する）から作成される多種類のｃＤＮＡ分子種の集合体をいう。前記DNA断片は必ずしもファージ、コスミド、またはプラスミド中に含まれて環状化されている必要はなく、DNA断片のみからなっていてもよい。ＤＮＡライブラリーに含まれるDNA断片の種類は何種類でもよく、2種類であってもよい。
【００３０】
また、本明細書において、二本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＤＮＡは、それぞれｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡと略記する。
【００３１】
以下、本発明の方法の詳細について述べる。
【００３２】
本発明の第一の態様において、ＲｅｃＡタンパク質を用いて環状ＤＮＡライブラリーから特定のＤＮＡを除去することにより、所望の核酸の含有率が増加した環状ＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供する。本発明の方法の第一の工程では、環状ＤＮＡライブラリーの環状ＤＮＡを線状ＤＮＡにする操作を施す。環状ＤＮＡを線状ＤＮＡにする方法としては、たとえば、適切な制限酵素で環状ＤＮＡを切断すればよい。前記制限酵素は、前記環状ＤＮＡの一カ所のみを切断するものを選択することが好ましい。前記制限酵素による切断は、通常の方法を使用して行えばよい。 次に第二の工程において、前記ＤＮＡライブラリーから除去すべき第二のｄｓＤＮＡに対応するｓｓＤＮＡを調製する。
【００３３】
ここで、除去すべき第二のｄｓＤＮＡに「対応する」とは、何れかのストランド中に、第二のｄｓＤＮＡ全部又は一部と実質的に同じ塩基配列を有する部分を含んでいることをいう。「実質的に同じ塩基配列を有する」とは、ＲｅｃＡタンパク質による三本鎖構造ＤＮＡの形成がなされ得る程度に同等の塩基配列を有することをいう。
【００３４】
前記第二のｄｓＤＮＡのサイズは、３〜１３ｋｂであり得る。６ｋｂ以上でサイズ分画されたライブラリー中のＤＮＡであることが好ましい。
【００３５】
なお、ライブラリー中に含まれるこれらのｄｓＤＮＡは、プラスミドやウイルスベクターに担持されていることが通常であろう。
【００３６】
第二のｄｓＤＮＡに対応するｓｓＤＮＡを調製するためには、インビトロ転写系を使用することができる。たとえば、ＤＮＡライブラリーのインサートをインビトロ転写可能なベクターであるｐＳＰＯＲＴ１に載せ換えて、ＳＰ６転写システム（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用してＲＮＡ合成を行う。次に、適切なプライマー（Ｒｏｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ Ｎ６（宝社）など）、および逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ （ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）など）を使用してｃＤＮＡを合成した。最後にフェノール・クロロホルムによってタンパク質を除去して、ｃＤＮＡを精製することにより、ｓｓＤＮＡを得ることができる。上記のようなｃＤＮＡの調製方法は、当業者に周知である。
【００３７】
その他、ライブラリーのｄｓＤＮＡに対応するｓｓＤＮＡを作製するためには、ニッカーゼ等でｄｓＤＮＡにニック（切れ目）を導入した後に、ＥｘｏIII、Ｔ７ｇｅｎｅ６等のヌクレアーゼで処理してもよい。さらに、ｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡにする操作としては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ１１９等のファージミドベクターをファージ粒子として使用し、ｓｓＤＮＡを回収する操作もあるが、これらに限定されない。
【００３８】
続いて、第三の工程では、前記ＲｅｃＡタンパク質と前記第二のｓｓＤＮＡを、前記ＤＮＡライブラリーに添加する。
【００３９】
上記のようにして得られた第二のｄｓＤＮＡに対応するｓｓＤＮＡは、何れかのストランドが第二のｄｓＤＮＡの全部又は一部と同一の塩基配列を含むので、前記工程で得られた第二のｓｓＤＮＡとＲｅｃＡタンパク質を加えると、三本鎖構造ＤＮＡの形成反応が進行する（図２参照）。
【００４０】
ＲｅｃＡタンパク質が解離した後にも三本鎖構造が安定に維持されるためには、前記ｓｓＤＮＡの長さは、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは３０塩基以上、さらに好ましくは４０塩基以上、最も好ましくは６０塩基以上である。
【００４１】
安定な三本鎖構造を得るためには、三本鎖構造の両末端のうち、外側（すなわち、ｄｓＤＮＡの終末端側）に存在する末端が、ｄｓＤＮＡの終末端から５０番目の塩基、より好ましくは３０番目の塩基、さらに好ましくは２０番目の塩基、さらに好ましくは１０番目の塩基よりも外側に位置することが好ましい。
【００４２】
また、ＲｅｃＡタンパク質は、本来、ＡＴＰの存在下において、相同的な組換えを触媒するタンパク質なので、前記試料中にＡＴＰが存在すると相同的組換えが進行して、三本鎖構造は直ぐに消滅してしまう。
【００４３】
ＲｅｃＡタンパク質を介して三本鎖構造を形成させるためには、ＧＴＰ、ＩＴＰなどのＡＴＰの機能を代替し得る物質、またはＡＴＰγＳのような非分解性ＡＴＰ類似体を添加しなければならない。ＧＴＰ、ＩＴＰの存在下では、ＲｅｃＡタンパク質による交換反応は進行されないことが明らかとなっている。
【００４４】
次に、第四の工程では、前記工程で得られた三本鎖構造のＤＮＡを含むＤＮＡを自己ライゲーションする。このとき、前記三本鎖構造が形成されたＤＮＡは、自己ライゲーション反応が阻害されるが、前記三本鎖構造が形成されていないｄｓＤＮＡは、自己ライゲーションされて環状ＤＮＡとなる。
【００４５】
本明細書において、「自己ライゲーション」とは、一本の線状ＤＮＡの５‘末端と３’末端がライゲーションされて、環状ＤＮＡとなることを意味する。
【００４６】
前記ライゲーション反応は、通常の方法を使用して行えばよい。たとえば、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によってライゲーション反応（３７℃において３０分間）を行って環状ＤＮＡを構築することができる。また、その他の商業的に入手可能なライゲーションキット等を使用してもよい。
【００４７】
本発明において、さらに、上記第１から第四の工程からなるサイクルを２回以上繰り返えしてもよい。
【００４８】
第五の工程では、前記工程で得られたＤＮＡから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する。
【００４９】
除去すべき線状三本鎖構造ＤＮＡと含有率を増加させるべき環状ＤＮＡとを分離するには、例えば、アガロース電気泳動で分離する方法、臭化エチジウム存在下で遠心する方法、などを使用することができる。その他、使用したＤＮＡライブラリー内に薬剤耐性遺伝子が含まれている場合は、前記ＤＮＡを宿主に形質転換して、環状ＤＮＡが形質転換された宿主のみを薬剤で選択する方法を使用してもよいが、これらに限定されない。
【００５０】
また、本発明の方法において、前記ＲｅｃＡタンパク質を介して三本鎖構造を形成させる工程に続いて、前記三本鎖核酸に結合したＲｅｃＡタンパク質を解離させる工程を実施してもよい。
【００５１】
本発明の方法の説明において、図２及び上記の説明では、便宜上、２種類のｄｓＤＮＡの中から１種類のｄｓＤＮＡを除去する操作を記載したが、実際の操作では、数千〜数万種類のｄｓＤＮＡの中から数十〜数万種類のｄｓＤＮＡを同時に、又は順次に除去することもできる。
【００５２】
本発明の第二の態様において、第一の態様において示した方法よりも効率的にＤＮＡライブラリーから特定のＤＮＡを除去することにより、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法を提供する。すなわち、核酸の両末端のライゲーション反応を阻害することによって、RecAタンパク質によるライゲーション阻害を効率化した方法を提供する。
【００５３】
本発明の方法の第一の工程では、線状ＤＮＡライブラリーを調製する。線状ＤＮＡを調製する方法としては、環状DNAからDNA断片を切り出すことによって、またはPCR法によって調製してもよい。また、mRNAを逆転写してcDNAを作製することによって調製してもよい。その他DNA断片を作製するために様々な方法を使用することができる。たとえば、ｃＤＮＡライブラリーであれば、ベクターに挿入されたインサートcDNAを切り出すことによって調製すればよい。
【００５４】
前記DNAの切断、PCRおよびmRNAからの逆転写、その他線状DNAの調製は、通常の方法を使用して行えばよい。
【００５５】
次に第二の工程において、前記ＤＮＡライブラリーから除去すべき第二のｄｓＤＮＡの両端の配列に対応するｓｓＤＮＡをそれぞれ調製する。「両端の配列」とは、前記第二のdsDNAの5’末端および3’末端の配列のそれぞれの配列を意味する。
【００５６】
また「両端の配列に対応する」とは、何れかのストランド中に、前記第二のｄｓＤＮＡの5’末端および3’末端の配列のそれぞれと、またはそれらの一部と実質的に同じ塩基配列を有する部分を含んでいることをいい、「実質的に同じ塩基配列を有する」とは、上述したとおり、ＲｅｃＡタンパク質による三本鎖構造ＤＮＡの形成がなされ得る程度に同等の塩基配列を有することをいう。
【００５７】
続いて、第三の工程では、前記ＲｅｃＡタンパク質と前記第二のｓｓＤＮＡを、前記ＤＮＡライブラリーに添加する。この工程により、上述の通り三本鎖構造ＤＮＡの形成反応が進行する（図３参照）。
【００５８】
次に、第四の工程では、前記工程で得られた三本鎖構造のＤＮＡを含むＤＮＡを所望のDNAとライゲーションする。このとき、前記三本鎖構造が形成されたＤＮＡは、ライゲーション反応が阻害されるが、前記三本鎖構造が形成されていないｄｓＤＮＡは、所望のDNAとライゲーションされて環状ＤＮＡとなる。
【００５９】
本方法において「所望のDNA」とは、主にライブラリーを構築するためのファージ、コスミド、プラスミドなどのベクターを意味するが、これに限定されない。
【００６０】
第五の工程では、前記工程で得られたＤＮＡから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する。
【００６１】
除去すべき線状三本鎖構造ＤＮＡと含有率を増加させるべき環状ＤＮＡとを分離する方法は、上述したとおりである。
【００６２】
なお、図に示されている具体的な反応や構造などは、あくまでも理解を容易にする目的で記載されているにすぎないので、実際には、それらの細部が図面と一致しない場合があり得る。
【００６３】
以下、実施例によって、本発明をさらに詳細に説明する。
【００６４】
【実施例】
実施例１
ＲｅｃＡを用いたライゲーション阻害反応により、二種類のプラスミド混合物から一方のプラスミドの除去を行った。クロラムフェニコール耐性のプラスミドｐＢＣ２３Ｃ１０、およびアンピシリン耐性のプラスミドｐＢＳ１Ｂ３を使用して、両者の混合物から一方のプラスミドの除去を行った。ｐＢＣ２３Ｃ１０およびｐＢＳ１Ｂ３を１０００：１で混合して、両プラスミドＤＮＡの一カ所のみを切断する制限酵素ＮｏｔＩによって消化し、線状二本鎖ＤＮＡにした。ｐＢＣ２３Ｃ１０をＳａｌＩとＮｏｔＩで切断したのち、インサートＤＮＡと、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩによって切断済みのｐＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をライゲーションした。インビトロ転写をすることが可能であるｐＳＰＯＲＴ１に載せ換えた後、ＳＰ６転写システム（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用してＲＮＡ合成を行った。得られたＲＮＡ５μｇにＲｏｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ Ｎ６（宝社）を６．２５μｇ添加し、熱変性後、氷水で急冷した。ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡社）４０ｕｎｉｔ、５×Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）４μｌ、０．１Ｍ ジチオスレイトール２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１μｌを添加した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を５μｌ添加した後、滅菌蒸留水を添加して全量２０μｌにした。３７℃において６０分間反応させてｃＤＮＡを合成した。フェノール・クロロホルムによってタンパク質を除去して、ｃＤＮＡを精製した。三本鎖形成反応溶液（１）は、３０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、合成したｐＢＣ２３Ｃ１０由来のｃＤＮＡを１００ｎｇ、ＲｅｃＡタンパク質（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）５μｇ、滅菌蒸留水を添加して全量を２０μｌにし、３７℃において１５分間保温する。三本鎖形成反応溶液（２）は、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ６．９）、２３ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、ＮｏｔＩ切断済みライブラリーを５０ｎｇ、滅菌蒸留水を添加して全量を１８μｌにした。これを三本鎖形成反応溶液（１）と混合して、３７℃において３０分間保温した。１００ｍＭ ＧＴＰ ２μｌを添加して、３７℃において３０分間反応させる。タンパク質分解操作をした後、ＤＮＡを精製する。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって３７℃において３０分間ライゲーション反応を行った。次に、ＤＮＡを精製して、大腸菌を形質転換することによってライブラリーを再構築した。除去を行いたいプラスミドのみが選択的に１／４００になっていることがわかる。
【００６５】
【表１】
実施例２
ＲｅｃＡを使用した三本鎖形成反応によって、既に得られていたプラスミド（３０００クローン）をプラスミドライブラリーから除去した。
【００６７】
ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫＩＩ（＋）内に作製したプラスミドライブラリーインサートをインビトロ転写可能なベクターである、ｐＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に載せ換えて、ＳＰ６転写システム（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用してＲＮＡ合成を行った。得られたＲＮＡ５μｇにＲｏｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒＮ６（宝社）を６．２５μｇ添加し、熱変性後、氷水で急冷した。ＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡社）４０ｕｎｉｔ、５×Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μｌ、０．１Ｍ ジチオスレイトール２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１μｌを添加した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を５μｌ添加した後、滅菌蒸留水を添加して全量２０μｌにする。３７℃において６０分間反応させてｃＤＮＡを合成した。フェノール・クロロホルムによってタンパク質を除去して、ｃＤＮＡを精製した。プラスミドライブラリーは、プラスミドＤＮＡの一カ所のみを切断する制限酵素ＮｏｔＩによって消化して、線状二本鎖ＤＮＡにした。三本鎖形成反応溶液（１）は、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸 （ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、合成したｃＤＮＡを１００ｎｇ、ＲｅｃＡタンパク質（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）５μｇ、滅菌蒸留水を添加して全量を２０μｌとし、３７℃において１５分間保温した。三本鎖形成反応溶液（２）は、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸 （ｐＨ６．９）、２３ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、ＮｏｔＩ切断済みライブラリーを５０ｎｇ、滅菌蒸留水を添加して全量を１８μｌにした。これを三本鎖形成反応溶液（１）と混合して、３７℃において３０分間保温する。１００ｍＭ ＧＴＰ ２μｌを添加して、３７℃において３０分間反応させる。タンパク質分解操作をした後、ＤＮＡを精製する。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって３７℃において３０分間ライゲーション反応を行った。次に、ＤＮＡを精製して、大腸菌を形質転換することによってライブラリーを再構築した。ランダムに９６クローンの塩基配列を決定して、配列を既知のクローンのデータベースと比較することによって、未知クローンの出現頻度を検討した。一回の既知クローン除去操作によって新規クローンの出現頻度は、約６０％から約８０％へと上昇していた。
【００６８】
【表２】
実施例3
RecAを用いたライゲーション阻害反応の効率化をめざし、遺伝子の両端のライゲーション阻害により、二種類のプラスミド混合物から一方のプラスミドの除去を行った。
【００７０】
挿入した遺伝子のそれぞれの末端を切断する制限酵素のNotIおよびMulIでプラスミドを消化した。消化されたプラスミドを鋳型として、T7転写システム（Ａｍｂｉｏｎ社）、T3転写システム（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用してＲＮＡ合成を行った。得られたＲＮＡ５μｇにＲｏｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ Ｎ６（宝社）を６．２５μｇ添加し、熱変性後、氷水で急冷した。ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡社）４０ｕｎｉｔ、５×Ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）４μｌ、０．１Ｍ ジチオスレイトール２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１μｌを添加した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を５μｌ添加した後、滅菌蒸留水を添加して全量２０μｌにした。３７℃において６０分間反応させてｃＤＮＡを合成した。フェノール・クロロホルムによってタンパク質を除去して、ｃＤＮＡを精製した。挿入遺伝子の量末端を切断する前記制限酵素の組合せであるNotIおよびMulIでプラスミドを消化し、ベクターと挿入された遺伝子を分離する。三本鎖形成反応溶液（１）は、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ６．９）、１ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、合成した各末端に対応するｃＤＮＡをそれぞれ１００ｎｇ、ＲｅｃＡタンパク質（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社）５μｇ、滅菌蒸留水を添加して全量を２０μｌにし、３７℃において１５分間保温する。三本鎖形成反応溶液（２）は、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ６．９）、２３ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ジチオスレイトール、ＮｏｔＩおよびMulIで切断済みプラスミドを５０ｎｇ、滅菌蒸留水を添加して全量を１８μｌにして、３７℃において３０分間保温した。１００ｍＭ ＧＴＰ ２μｌを添加して、３７℃において３０分間反応させる。タンパク質分解操作をした後、ＤＮＡを精製する。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって３７℃において３０分間ライゲーション反応を行った。次に、ＤＮＡを精製して、大腸菌を形質転換することによってライゲーション阻害効果を検討した。
【００７１】
挿入遺伝子末端の片方のcDNAを加えた場合と比較して、両方のcDNAを加えることによって相乗的な阻害効果があった。
【００７２】
【表３】
表中の数字はコロニー数を示し、下段の括弧内はライゲーション阻害反応を行っていない場合と比較して、阻害反応を行った場合のコロニー数の割合を示す。
【００７４】
【発明の効果】
本発明の方法を用いれば、ＤＮＡライブラリーから所望の核酸以外の核酸を除去することにより、所望の核酸の含有率が増加したＤＮＡライブラリーを直接構築することができる。上記の実施例で実証されているように、本発明の方法を用いれば、除去すべき既知のｄｓＤＮＡを９０％以上除去することも可能である。
【００７５】
さらに、dsDNAの両端を三本鎖構造としてライゲーションを阻害する方法では、片方の末端を阻害する方法と比較して、既知遺伝子の量を百分の一以下に除去することが可能となる。それ故、本発明を適用するライブラリーの種類に応じて、ライブラリーの新規クローンの出現率を１０％〜９９％増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲｅｃＡの作用機構の概略図。
【図２】本発明のライゲーション阻害の基本原理を示した図。
【図３】本発明のライゲーション阻害の基本原理を示した図。
Claims (4)
- 含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含む環状ＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加した環状ＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、
（１） 前記環状ＤＮＡライブラリーの環状ＤＮＡを線状ＤＮＡにする工程と、
（２） 前記第二のｄｓＤＮＡに対応するｓｓＤＮＡを調製する工程と；
（３） 前記線状ＤＮＡライブラリーに、ＲｅｃＡタンパク質と工程（２）で調製した前記第二のｓｓＤＮＡを添加することにより、前記第二のｄｓＤＮＡに前記ＲｅｃＡタンパク質を介して前記第二のｓｓＤＮＡを結合させ、三本鎖構造にする工程と；
（４） 工程（３）で得られた三本鎖構造のＤＮＡを含む線状ＤＮＡに自己ライゲーション処理を施し、三本鎖構造を含まないｄｓＤＮＡのみを環状化する工程と；
（５） 工程（４）の処理を施したＤＮＡから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
を備えた方法。 - 請求項１に記載の方法であって、前記工程（４）の処理を施したＤＮＡからの線状ＤＮＡの除去が、前記工程（４）で得られたＤＮＡを宿主に形質転換して、環状ＤＮＡが形質転換された宿主のみを薬剤で選択することによる除去である方法。
- 含有率を増加せしめるべき第一のｄｓＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから、前記第一のｄｓＤＮＡとは異なる第二のｄｓＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する方法であって、
（１） 第一のｄｓDNAを含む線状DNAライブラリーを調製する工程と、
（２） 前記第二のｄｓＤＮＡの両端の配列に対応するｓｓＤＮＡをそれぞれ調製する工程と；
（３） 前記線状ＤＮＡに、ＲｅｃＡタンパク質と工程（２）で調製した前記第二のｓｓＤＮＡを添加することにより、前記第二のｄｓＤＮＡに前記ＲｅｃＡタンパク質を介して前記第二のｓｓＤＮＡを結合させ、三本鎖構造にする工程と；
（４） 工程（３）で得られた三本鎖構造のＤＮＡを含む線状ＤＮＡを所望のDNAとライゲーションする処理を施し、三本鎖構造を含まないｄｓＤＮＡのみを環状化する工程と；
（５） 工程（４）の処理を施したＤＮＡから線状ＤＮＡを除去することによって、前記第一のｄｓＤＮＡの含有率が増加したＤＮＡライブラリーを構築する工程と；
を備えた方法。 - 請求項３に記載の方法であって、前記工程（４）の処理を施したＤＮＡからの線状ＤＮＡの除去が、前記工程（４）で得られたＤＮＡを宿主に形質転換して、環状ＤＮＡが形質転換された宿主のみを薬剤で選択することによる除去である方法。
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