DE4319468C1 - Verfahren zum Herstellen eines zu einem Ribonukleinsäure (RNA)-Molekül komplementären Desoxyribonukleinsäure(DNA)-Stranges (cDNA-Stranges), sowie die Verwendung des Verfahrens zur Analyse von RNA-Molekülen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines zu einem Ribonukleinsäure(RNA)-Molekül komplementären Desoxy­ ribonukleinsäure(DNA)-Stranges (cDNA-Stranges) sowie die Verwendung des Verfahrens zur Analyse von RNA-Molekülen.

Mangels geeigneter Verfahren wird eine direkte Analyse von RNA-Molekülen in modernen Gentechnik-Labors kaum noch durch­ geführt. Das Arbeiten mit RNA erfordert zudem besondere, zeitaufwendige Vorkehrungen, um die RNA vor einem Abbau durch Ribonukleasen zu schützen. Heutzutage wird deshalb RNA mit Hilfe einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase in komplementäre DNA (cDNA) übersetzt. cDNA ist die Bezeichnung für die einzel- bzw. doppelsträngige DNA-Kopie eines RNA-Moleküls. Die vorstehend erwähnte RNA-abhängige DNA-Polymerase wird auch als "Reverse Transkriptase" bezeichnet. Sie verwendet Desoxyribonukleosid-Triphosphate als Substrate und benutzt die RNA als Matrize für die Synthese des DNA-Stranges.

Für die Synthese des ersten cDNA-Stranges sind verschiedene Verfahren entwickelt worden. Diese Verfahren basieren auf der Verwendung von kurzen Oligonukleotiden, die komplementär zu einem Teilbereich eines RNA-Moleküles sind. Durch Hybridisie­ rung des Oligonukleotids an die RNA entsteht ein kurzer, dop­ pelsträngiger Nukleinsäurebereich, der von der Reversen Transkriptase als Primer (Starter) für die Synthese des er­ sten DNA-Stranges benötigt wird. Als Primer wird beispiels­ weise Oligo(dT) verwendet, das an den poly(A)-Schwanz von be­ stimmten mRNA-Molekülen (poly(A)⁺-RNA) hybridisieren kann. Soll nichtpolyadenylierte RNA, wie z. B. ribosomale RNA, in DNA umgeschrieben werden, so kann nachträglich mit poly(A)- Polymerase ein poly(A)-Schwanz an das 3′-Ende der RNA ansyn­ thetisiert werden. Dieser kann dann wiederum mit Oligo(dT) eine doppelsträngige Startregion ausbilden.

Weiterhin können als Primer Mischungen kurzer DNA-Hexanu­ kleotide aller theoretisch denkbarer Sequenzabfolgen verwen­ det werden. Bei diesem als "Random-Priming" bezeichneten Ver­ fahren werden einige dieser Hexanukleotide an RNA hybridisie­ ren und als Starter für die cDNA-Synthese fungieren können. Ein Nachteil ist jedoch, daß meist der Anteil vollständig ko­ pierter RNA-Moleküle sinkt.

Falls ein Teil der Sequenz eines zu untersuchenden RNA-Mole­ küls bekannt ist, kann ein spezifisches Oligonukleotid, das zu der bekannten Sequenz komplementär ist, als Primer einge­ setzt werden.

Für die Synthese des zweiten DNA-Stranges gibt es ebenfalls mehrere Strategien. Beim sogenannten "Selbst-Priming" wird nach der Synthese des ersten cDNA-Stranges der RNA-Anteil aus dem gebildeten DNA/RNA-Hybrid durch Behandlung mit Alkali oder durch Hitzedenaturierung entfernt. Man nutzt nun die Tatsache aus, daß die gebildete, einzelsträngige cDNA am 3′-Ende, also demjenigen Ende, das dem 5′-Ende der kopierten RNA entspricht, vorübergehend sogenannte Haarnadelstrukturen ausbildet. Diese kurzen doppelsträngigen Bereiche können wie­ derum von der DNA-Polymerase als Primer für die Synthese des zweiten DNA-Stranges verwendet werden. Der Haarnadelbereich wird durch die nachfolgende Synthese stabilisiert, so daß einseitig kovalent geschlossene, doppelsträngige cDNA-Mole­ küle entstehen. Durch vorsichtige Behandlung mit Desoxyribo­ nukleasen, wie z. B. S1-Nuklease oder Mung bean-Nuclease kön­ nen diese Moleküle geöffnet werden. Es besteht jedoch immer die Gefahr, daß man Sequenzen vom 5′-Ende der RNA verliert.

Eine weitere Technik geht von einzelsträngiger cDNA aus, an deren 3′-Ende mit terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase ein homopolymerer Oligo(dC)-Schwanz angelagert wird. Der für die Synthese des zweiten cDNA-Stranges benötigte, doppel­ strängige Primerbereich entsteht durch Reaktion des am ersten cDNA-Strang vorhandenen Oligo(dC)-Schwanzes mit einem komple­ mentären Oligo(dG)-Primer.

Beim Gubler-Hoffman-Verfahren handelt es sich um "RNA-Pri­ ming". Hierbei verzichtet man auf die Entfernung des RNA- Stranges aus dem nach der Synthese des ersten cDNA-Stranges gebildeten RNA/DNA-Hybridmolekül. Unter kontrollierten Bedin­ gungen wird der RNA-Strang im intakten Hybridmolekül mit ei­ ner spezifischen Ribonuklease (RNAse H) behandelt, so daß kurze RNA-Primer mit freiem Hydroxyl-Ende an der einzelsträn­ gigen cDNA verbleiben. Diese dienen dann in einer gleichzei­ tig laufenden Reaktion als Primer für die Synthese des zwei­ ten DNA-Stranges durch DNA-Polymerase.

Obwohl es möglich ist, die nach der Synthese des ersten cDNA- Stranges entstandenen RNA/DNA-Hybridmoleküle direkt zu klo­ nieren, wird meist mit doppelsträngiger cDNA gearbeitet. Die­ se kann in weiteren Experimenten in einen geeigneten Klonie­ rungsvektor eingebaut werden. Da die cDNA-Moleküle, bedingt durch die Syntheseschritte, meist undefinierte Enden aufwei­ sen, müssen sie nach der Synthese mit Enden versehen werden, die den gezielten Einbau in einen Klonierungsvektor erlauben. Für diesen Zweck verwendet man homopolymere Nukleotidschwänze oder doppelsträngige als "Linker" bezeichnete Oligonukleoti­ de, die die Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonukle­ ase tragen. Zum Anhängen der Linker werden die Enden der cDNA enzymatisch so bearbeitet, daß glatte DNA-Enden entstehen.

Verschiedene Techniken der cDNA-Synthese kombinieren die ein­ zelnen Syntheseschritte und die nachfolgenden Klonierungsre­ aktionen. Beispielsweise werden beim Heidecker-Messing-Ver­ fahren an ein Vektormolekül angebrachte Oligo(dT)-Schwänze zur Anlagerung von poly(A)⁺-RNA und zum Primen der cDNA-Syn­ these verwendet. Eine relativ aufwendige Abfolge von Reak­ tionen führt nach der Synthese des ersten cDNA-Stranges zur Klonierung einer doppelsträngigen cDNA.

Es ist weiterhin bekannt, cDNA-Stränge mittels geeigneter Primer durch die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction; PCR) zu amplifizieren. Als Primer kommen Oligonu­ kleotide in Frage, die entweder an den cDNA-Strang direkt hy­ bridisieren oder an einen an den cDNA-Strang angelagerten ho­ mopolymeren Nukleotid-Schwanz oder Linker. Die amplifizierten cDNA-Fragmente können danach in einen Vektor kloniert oder auch direkt sequenziert werden.

Für die DNA-Sequenzierung, d. h. die Bestimmung der Abfolge von Basen in einem DNA-Molekül, werden heute meist zwei me­ thodisch unterschiedliche Verfahren angewendet: die Maxam- Gilbert-Technik, auch als chemische DNA-Sequenzierung be­ zeichnet, und das Kettenabbruch-Verfahren nach Sanger, auch enzymatische DNA-Sequenzierung oder die Didesoxy-Sequenzie­ rung genannt.

Von der Sequenz der cDNA kann man direkt auf die ursprüngli­ che RNA-Sequenz schließen.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zum Herstellen eines zu einem RNA-Mo­ lekül komplementären DNA-Stranges zur Verfügung zu stellen, welches im Vergleich zu bekannten Verfahren erhöhte Ausbeuten an cDNA-Molekülen liefert.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 15 gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet den großen Vorteil, daß es ausgehend von subnanomolaren Konzentrationen von sowohl polyadenylierten als auch nicht-polyadenylierten RNA-Molekü­ len durchführbar ist, und auf diese Weise indirekt RNA-Mole­ küle sehr effizient analysiert werden können.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung des Verfah­ rens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Analyse von RNA-Molekülen.

Die Erfindung wird nachstehend mit Bezug auf die Zeichnungen im einzelnen erläutert.

Die Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens:

• 1) Verknüpfung des 5′-Phosphat-Endes (P5′) eines doppel­ strängigen DNA-Moleküls mit 5′- überhängendem Ende mit dem 3′-Hydroxyl-Ende (3′OH) eines RNA-Moleküls ((+)RNA X),
• 2) cDNA-Synthese ausgehend vom 3′-Hydroxyl-Ende des DNA-Moleküls,
• 3) PCR-Amplifikation der cDNA mittels eines ersten Pri­ mers, der an den 3′-5′-Strang des DNA-Moleküls hybridisiert (Vektor-Primer), und eines zweiten, biotinylierten Primers, der an den ersten cDNA-Strang hybridisiert (-Primer), und
• 4) Festphasen-Didesoxy-Sequenzierung des zweiten cDNA- Stranges mittels Streptavidin-beschichteter magnetischer Kügelchen.

Die Fig. 2 stellt schematisch die Schritte der Fig. 1 dar, mit dem Unterschied, daß nach der Synthese des ersten cDNA- Stranges an diesen ein homopolymerer Nukleotid-Schwanz ange­ fügt wird (2.1) und der zweite biotinylierte Primer an die­ sen homopolymeren Nukleotid-Schwanz hybridisiert.

In die Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens nach An­ spruch 1 können sowohl einzel- als auch, zumindest teil­ weise, doppelsträngige DNA-Moleküle, deren 5′-Phosphat-Ende ein 5′-überhängendes Ende ist, eingesetzt werden. Das 5′-überhängende Ende kann durch Spalten des DNA-Moleküls mit Hilfe einer Restriktionsendonuklease, wie z. B. EcoRI, erzeugt werden.

Vorzugsweise verwendet man einen gängigen, kommerziell er­ hältlichen DNA-Vektor, der mit einer geeigneten Restriktions­ endonuklease linearisiert wird.

Die Verknüpfung des 5′-Phosphat-Endes des DNA-Stranges mit dem 3′-Hydroxyl-Ende des einzelsträngigen RNA-Moleküls ("tagging") wird vorzugsweise enzymatisch mittels einer Liga­ se durchgeführt.

Als Ligase eignet sich eine RNA-Ligase, wie z. B. T4-RNA-Li­ gase, die in Gegenwart von Mn²⁺ DNA- und RNA-Moleküle kova­ lent miteinander verbindet.

Falls ein einzelsträngiges DNA-Molekül in Stufe (a) einge­ setzt wird, wird vorzugsweise nach dem Verknüpfen des DNA-Stranges mit dem einzelsträngigen RNA-Molekül ein Oligo­ nukleotid als Primer für die cDNA-Synthese verwendet, das an den DNA-Strang hybridisiert. Für die Auswahl eines geeig­ neten Oligonukleotids ist es wünschenswert, die Sequenz des eingesetzten einzelsträngigen DNA-Moleküls zumindest teil­ weise zu kennen.

Bei Verwendung eines doppelsträngigen DNA-Moleküls fungiert das 3′-Hydroxyl-Ende des nicht mit dem RNA-Molekül verknüpf­ ten DNA-Stranges direkt als Primer für die cDNA-Synthese.

Die cDNA-Synthese wird enzymatisch mittels Reverser Trans­ kriptase, welche kommerziell erhältlich ist, durchgeführt.

Der so erhaltene erste cDNA-Strang kann nachfolgend durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert werden. Dabei werden zwei Fälle unterschieden:

• (i) eine Teilsequenz aus dem zu analysierenden RNA-Mole­ kül ist bereits bekannt, und
• (ii) das RNA-Molekül, welches analysiert werden soll, ist völlig unbekannt, d. h. es steht keine Sequenzinforma­ tion zur Verfügung.

Im ersten Fall kann man für die PCR einen ersten Primer ver­ wenden, dessen Sequenz komplementär zu einer Teilsequenz des mit dem RNA-Molekül verknüpften DNA-Stranges ist (plus-Strang-Primer) und einen zweiten Primer, der komple­ mentär zu dem ersten cDNA-Strang ist (minus-Strang-Primer), d. h. dessen Sequenz einer Teilsequenz des RNA-Moleküls ent­ spricht.

Im zweiten Fall, d. h. wenn keine Sequenzinformation bezüglich des zu analysierenden RNA-Moleküls zur Verfügung steht, wird nach der Synthese des ersten cDNA-Stranges an dessen 3′-Ende ein Oligonukleotid angefügt ("tailing"). Vorzugsweise werden mittels terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT) homo­ polymere, einzelsträngige Nukleotid-Schwänze ansynthetisiert. Das Enzym katalysiert die Anlagerung von Desoxynukleosid-Triphosphaten an die 3′-Enden eines DNA-Fragments, ohne hierfür eine Matrize zu benötigen. An dem vorliegenden DNA-RNA/cDNA- Hybridmolekül verläuft die Reaktion effizienter an glatten Enden als an Enden, an denen aufgrund einer nur partiellen reversen Transkription das 5′-Hydroxyl-Ende des RNA-Moleküls noch übersteht. Diese Tat­ sache begünstigt die Selektion auf cDNA, die der vollen Länge des zu analysierenden RNA-Moleküls entspricht. Alternativ können unter Verwendung von T4-DNA-Ligase Oligonukleotide, wie z. B. Linker, an den synthetisierten ersten cDNA-Strang angefügt werden. Dieses Enzym akzeptiert ebenfalls DNA/RNA-Hybridmoleküle als Substrat. Als Linker bezeichnet man chemisch synthetisierte, kurzkettige Oligonukleotide von 6 bis 12 Basen Länge, die die Erkennungssequenz für eine oder mehrere Restriktionsendonukleasen enthalten. Als minus-Strang-Primer können somit Oligonukleotide verwendet werden, die komplementär zu dem an den cDNA-Strang angefügten homopolymeren Nukleotid-Schwanz bzw. zu dem angefügten Linker sind.

Die PCR wird in an sich bekannter Weise durchgeführt, z. B. mittels Taq-DNA-Polymerase.

Die durch PCR amplifizierten cDNA-Moleküle können anschlie­ ßend sequenziert oder kloniert werden.

Falls die cDNA sequenziert werden soll, ist es bevorzugt, in die PCR einen am 5′-Ende biotinylierten minus-Strang-Primer einzusetzen. Dies erlaubt eine schnelle Isolierung der an diesen Primer ansynthetisierten cDNA-Moleküle aus der Reakti­ onsmischung mit Hilfe von Streptavidin-beschichteten mag­ netischen Kügelchen (magnetic beads). Die isolierten, einzel­ strängigen cDNA-Moleküle können anschließend unter Verwendung eines geeigneten Sequenzierungs-Primers (plus-Strang-Primer) z. B. durch die Didesoxy-Kettenabbruch-Methode mittels T7-DNA- Polymerase sequenziert werden. Obwohl diese direkte Festpha­ sensequenzierung bevorzugt ist, können alle bekannten Sequen­ zierungsverfahren verwendet werden. Aus der Sequenz des cDNA- Moleküls kann man direkt auf die Sequenz des zu analysieren­ den RNA-Moleküls schließen.

Wenn die durch die PCR amplifizierte cDNA kloniert werden soll, ist es bevorzugt, sowohl als plus-Strang-Primer als auch als minus-Strang-Primer biotinylierte Oligonukleotide zu verwenden, die die Erkennungssequenz einer Restriktionsendo­ nuklease enthalten. Die amplifizierten cDNA-Moleküle können dann mit Hilfe von mit Streptavidin-beschichteten magne­ tischen Kügelchen aus der Reaktionsmischung gereinigt werden. Die an die magnetischen Kügelchen über den Streptavidin/Biotin-Komplex gebundenen cDNA-Moleküle können anschließend mit Hilfe einer Restriktionsendonuklease, die für die in den Primern enthaltene Erkennungssequenz spezi­ fisch ist, freigesetzt werden. Dieses Verfahren erlaubt eine Selektion auf cDNA-Moleküle, die an beiden Enden von der verwendeten Restriktionsendonuklease geschnitten sind, wo­ durch die Klonierungsausbeute erhöht wird.

Für die in der PCR amplifizierten cDNA-Moleküle können weite­ re bekannte Klonierungssysteme verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, RNA-Moleküle zu analysieren. Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorzugsweise für die in vitro-Diagnostik von genetischen Defekten ver­ wendet werden. Dazu werden dem Patienten beispielsweise Blut­ zellen entnommen, aus denen anschließend die zelluläre RNA isoliert wird. Nach Durchführung des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens können beispielsweise Erkenntnisse erhalten werden, ob und in welchem Ausmaß ein bestimmtes Gen translatiert wird. Weiterhin können Spleiß-Defekte in RNA-Molekülen sowie post-transkriptionale RNA-Modifikationen (z. B. die Insertion oder Deletion von Nukleotiden (RNA-Editing) nach Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erkannt werden. Das er­ findungsgemäße Verfahren erleichtert somit die genetische Diagnostik.

Außerdem ist das erfindungsgemäße Verfahren bestens dazu ge­ eignet, cDNA-Banken zu erstellen. Dazu können kommerziell er­ hältliche Klonierungsvektoren verwendet werden, die passende Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen besitzen. Nach Linearisieren des Vektors durch Schneiden mittels einer Restriktionsendonuklease kann an den überhängenden 5′ -Phosphat-Enden die erfindungsgemäße cDNA-Synthese durchge­ führt werden. Nach wahlweiser Modifikation des 3′OH-Endes der erzeugten cDNA und Ausnutzen weiterer Restriktionsendonukleaseschnittstellen im Vektor können Vektor plus cDNA religiert werden. Dieses Verfahren führt zu hohen Ausbeuten an cDNA-Klonen und kann sowohl ausgehend von poly(A)⁺- als auch von poly(A)⁻-RNA durchgeführt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

(1) Tagging: Gel-gereinigte einzelsträngige RNA (0,1 bis 10 pMol) wurde über Nacht bei 4°C mit 0,1 pMol eines mit EcoRI gespaltenen Plasmids (BS/bI1; Augustin, S., Müller, M.W., Schweyen, R.J. (1990) Nature 343, 383-385)) im Vorhandensein von 5 Einheiten T4-RNA-Ligase (Pharmacia) in 20 µl Endvolumen unter den folgenden Reaktionsbedingungen inkubiert: 50 mM HEPES (pH 8,0), 3 mM DTT, 20 mM MgCl₂, 20 mM MnCl₂, 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 mM ATP.

(2) Direkte Initiierung der cDNA-Synthese: 2 µl der Reakti­ onsmischung wurden direkt in die cDNA-Synthesereaktion ein­ gesetzt, die für 15 min bei 40°C unter Verwendung von 10 Einheiten SuperScript Reverse Transcriptase (RT; Gibco BRL) in 20 µl durchgeführt wurde: 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 40 mM KCl, 6 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA, 0,3 mM dNTPs.

(3) PCR-Amplifizierung der cDNA: 2,5 µl der cDNA-Synthesere­ aktionsmischung wurden direkt in eine Standard-PCR eingesetzt (1′ 94°C, 30′′ 58°C, 1′ 72°C; 35 Zyklen), die in 50 µl Reak­ tionsvolumen unter Verwendung von 1 Einheit Taq-DNA-Poly­ merase (Stratagene) und unter den vom Hersteller (Stratagene) beschriebenen Pufferbedingungen durchgeführt wurde. Amplifi­ zierte PCR-Produkte: 424 bp bis 428 bp. Verwendete PCR-Primer: BS/bI1-spezifischer plus-Strang-Primer

(5′ GATTAATGTGAAAGCATGCTAACTTC; 25 pMol);

5′-terminal biotinylierter Primer

(5′ AAATCTGGTACCGGGAACAAAGGAAGAC; 25 pMol),

partiell komplementär (unterstrichen) zum 3′-Teil der cDNA-Sequenz.

(4) Direkte Festphasen-Sequenzierung der PCR-Produkte: Die Reinigung der PCR-Produkte und die Didesoxy-Sequenzierung un­ ter Verwendung von magnetischen Kügelchen als Festphase wur­ den durchgeführt wie beschrieben in Holtman, S., Staahl, E., Hornes, M., Uhlen, L., (1989) Nucl. Acids Res. 17, 4937-4939. Verwendeter Sequenzierungs-Primer:

GAATATCTTATATTAATTAAGAGTATAG; plus-Strang BS/bI1.

Beispiel 2

(1): Tagging und (2) direkte Initiierung der cDNA-Synthese: wie in Beispiel 1.

(2.1) Tailing: 2,5 µl der cDNA-Synthesereaktionsmischung wur­ den für das Tailing mit einem homopolymeren dCTP-Schwanz in 20 µl Endvolumen im Vorhandensein von 10 Einheiten terminaler Transferase (Boehringer, Mannheim) unter den vom Hersteller (Boehringer; Mannheim) beschriebenen Bedingungen eingesetzt.

(3) PCR-Amplifizierung der verlängerten cDNA-Produkte: 2,5 µl der Tagging-Reaktionsmischung wurden direkt in eine Standard- PCR (1′ 94°C, 30′′ 58°C, 1′ 72°C; 35 Zyklen) eingesetzt, die in einem 50 µl Reaktionsvolumen unter Verwendung von 1 Ein­ heit Taq-DNA-Polymerase (Stratagene) und unter den vom Her­ steller (Stratagene) beschriebenen Pufferbedingungen durchge­ führt wurde. Verwendete PCR-Primer: BS/bI1 spezifischer plus- Strang-Primer

(5′ GATTAATGTGAAAGCATGCTAACTTC; 25 pMol);

5′-terminal biotinylierter Primer

(5′ GGGGGGGGGGGGGGG; 25 pMol),

komplementär oder teilweise komplementär zum 3′-terminalen dC_(n)-Schwanz der cDNA-Sequenz.

(4) Direkte Festphasen-Sequenzierung der PCR-Produkte: wie in Beispiel 1.

Claims (17)

1. Verfahren zum Herstellen eines zu einem RNA-Molekül komplementären DNA-Stranges (cDNA-Stranges), gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

• a) Verknüpfen des 5′-Phosphat-Endes eines einzelsträngigen DNA-Stranges oder eines zumindest teilweise doppelsträngigen DNA-Moleküls, dessen 5′-Phosphat-Ende ein 5′-überhängendes Ende ist, mit dem 3′-Hydroxyl-Ende eines RNA-Moleküls und
• b) Synthetisieren des cDNA-Stranges, ausgehend von dem 3′-Hydroxyl-Ende eines weiteren DNA-Stranges oder Oligo­ nukleotids, welcher(s) zu dem mit dem RNA-Molekül verknüpf­ ten DNA-Strang komplementär ist, mittels Reverser Transkrip­ tase.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das 5′-überhängende Ende durch Spalten des DNA-Moleküls mittels einer Restriktionsendonuklease erzeugt worden ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als DNA-Molekül ein Plasmid eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verknüpfen in Stufe a) mittels einer Ligase durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Ligase RNA-Ligase eingesetzt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das 3′-Ende des cDNA-Stranges verlängert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Oligonukleotid an ein doppelsträngiges cDNA/RNA-Hybrid mit glattem Ende angefügt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß zur Verlängerung terminale Desoxynukleotidyl-Transferase eingesetzt wird und homopolymere Nukleotid-Schwänze angefügt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß zur Verlängerung DNA-Ligase eingesetzt wird und Linker angefügt werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der cDNA-Strang durch Polymerase-Ketten­ reaktion (PCR) amplifiziert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein erster Primer eingesetzt wird, dessen Sequenz komplemen­ tär zu einer Teilsequenz des mit dem RNA-Molekül verknüpften DNA-Stranges ist, und ein zweiter Primer eingesetzt wird, der komplementär zu dem erzeugten cDNA-Strang oder komple­ mentär zu dem an den cDNA-Strang angefügten Oligonukleotid oder homopolymeren Nukleotid-Schwanz ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das amplifizierte cDNA-Molekül an­ schließend sequenziert wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß in die PCR als zweiter Primer ein biotinylierter Primer ein­ gesetzt wird, und die an diesen Primer synthetisierten cDNA-Stränge vor der Sequenzierung mittels Streptavidin­ beschichteter magnetischer Kügelchen gereinigt werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das amplifizierte cDNA-Molekül kloniert wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß (i) in die PCR als erster und zweiter Primer biotinylierte Primer eingesetzt werden, die die Erkennungssequenz einer Restriktionsendonuklease umfassen, (ii) die amplifizierten cDNA-Moleküle mittels Streptavidin-beschichteter magneti­ scher Kügelchen gereinigt werden, (iii) die an die magneti­ schen Kügelchen gebundenen cDNA-Moleküle einer Restrik­ tionsendonuklease ausgesetzt werden, die für die in den Primern enthaltene Erkennungssequenz spezifisch ist und (iv) die von den magnetischen Kügelchen freigesetzten cDNA-Moleküle kloniert werden.

16. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Analyse von RNA-Molekülen.

17. Verwendung nach Anspruch 16 zur in vitro-Diagnostik von genetischen Defekten, pathogenen RNA-Viren sowie zur Erzeu­ gung von cDNA-Banken.