DE69412540T2

DE69412540T2 - Gleichzeitige Amplifikation von Vielfachzielen

Info

Publication number: DE69412540T2
Application number: DE69412540T
Authority: DE
Inventors: Michael C. Raleigh North Carolina 27610 Little; James G. Chapel Hill North Carolina 27514 Nadeau; George Terrance Chapel Hill North Carolina 27514 Walker
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1993-06-04
Filing date: 1994-05-26
Publication date: 1998-12-24
Anticipated expiration: 2014-05-27
Also published as: US5624825A; CA2125004A1; EP0628640B1; CA2125004C; SG52767A1; US5422252A; JPH0819394A; DE69412540D1; AU673424B2; EP0628640A1; BR9402174A; AU6453794A; MX9404063A; JP2703183B2; ES2122083T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die isothermische Amplifizierung von Nucleinsäure- Zielsequenzen, insbesondere die gleicbzeitige Amplifizierung mehrfacher Ziel-Sequenzen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die in vitro Nucleinsäure-Amplifizierungsverfahren lieferten kräftige Werkzeuge für die Feststellung und Analyse geringer Mengen von Nucleinsäuren. Die außerordentliche Empfindlichkeit dieser Verfahren führte zu Versuchen, sie für die Diagnose von infektiösen und genetischen Erkrankungen, für die Isolierung von Genen zum Zweck der Analyse und für die Feststellung spezieller Nucleinsäuren, wie etwa in der forensischen Medizin, zu entwickeln. Die Nucleinsäure-Amplifizierungsverfahren können je nach den Temperaturanforderungen des Verfahrens in Gruppen eingeteilt werden. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR; R. K. Salki et al., 1985, Science 230, 1350-1354), die Ligase-Kettenreaktion (LCR; D. Y. Wu et al. 1989, Genomics 4, 560-569; K. Barringer et al. 1990, Gene 89, 117-122; F. Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 189-193) und die auf Transkription basierende Amplifizierung (D. Y. Kwoh et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177) erfordern eine zyklische Temperaturänderung. Im Gegensatz dazu sind Verfahren, wie etwa die Strangverdrängungsamplifizierung (SDA; G. T. Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396; G. T. Walker et al. 1992. Nuc. Acids. Res. 20, 1691-1696), die selbsterhaltende Sequenz:replikation (35R; J. C. Guatelli et al. 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874-1878) und das Qß Replikasesystem (P. M. Lizardi et al., 1988, Biotechnology 6, 1197-1202) isothermische Reaktionen. Zusätzlich dazu beschreiben die WO 90/10064 und die WO 91/03573 die Verwendung des Replikationsursprungs des Bakteriophagen phi29 für die isothermische Replikation von Nucleinsäuren.
Im allgemeinen waren Diagnose und Screenen auf spezielle Nucleinsäuren unter Verwendung von Nucleinsäure-Ainplifizierungsverfahren durch die Notwendigkeit beschränkt, zu einer bestimmten Zeit jeweils nur eine einzige Ziel-Sequenz zu amplifizieren. Bei Fällen, wo beliebige mehrfache mögliche Nucleinsäuresequenzen vorliegen können (z.B. bei der Diagnose infektiöser Erkrankungen), ist die Durchführung mehrfacher getrennter Assays nach diesem Verfahren mühselig und zeitaufwendig. Die US-PSen 4,683.195, 4,683.202 und 4,800.159 beschreiben die PCR. Obwohl diese Erfinder angeben, daß mehrfache Sequenzen festgestellt werden können, wird doch kein Verfahren zur gleichzeitigen Amplifizierung mehrfacher Ziel-Sequenzen geoffenbart Wenn mehrfache Ziel-Sequenzen amplifiziert werden, erfolgt dies durch aufeinanderfolgende Amplifizierung einzelner Ziele in getrennten PCRs. Tatsächlich produziert die Reaktion, wenn mehrfache Paare von Primern, die auf unterschiedliche Ziel-Sequenzen gerichtet sind, zu einer einzigen PCR zugesetzt werden, unakzeptabel hohe Ausmaße von nicht-spezifischer Amplifizierung und von Hintergrund. Eine Verbesserung in der PCR, die angeblich die gleichzeitige Amplifizierung mehrfacher Ziel-Sequenzen erlaubt, ist in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 0364255 beschrieben. Dieser Vorgang wird als multiplexe DNA-Amplifizierung bezeichnet. Bei diesem Verfahren werden mehrfache Paare von Primern zu der die Ziel-Sequenzen enthaltenden Nucleinsäure zugesetzt. Jedes Primer-Paar hybridisiert mit einer unterschiedlichen ausgewählten Ziel-Sequenz, die anschließend in einer Reaktion mit zyklischem Temperaturverlauf, die ähnlich einer PCR ist, amplifiziert wird.
Bestimmte Verfahren zur Nucleinsäure-Amplifizierung bedienten sich der Addition definierter Sequenzen an die Enden von Nucleinsäure-Fragmenten, bevor die Amplifizierung vorgenommen wurde. Die US-PS 5,104.792 beschreibt eine Modifikation der PCR, die die Amplifizierung von Nucleinsäure-Fragmenten, deren Sequenz nicht bekannt ist, ermöglicht. Die Primer für die Amplifizierungsreaktion enthalten statistische Degenerat-Sequenzen an ihren 3'-Enden und eine definierte Sequenz an ihren 5'-Enden. Die Extension der Primer produziert Fragmente, die unbekannte Sequenzen enthalten, die von der definierten Sequenz flankiert sind. Diese Fragmente können dann in einer konventionellen PCR unter Verwendung von Primem amplifiziert werden, die mit der bekannten Flankierungssequenz hybridisieren. Ein anderes Verfahren zur PCR-Amplifizierung einer unbekannten DNA, die eine bekannte Sequenz flankiert, ist von D. H. Jones und S. C. Winistorfer (1992, Nuc. Acids. Res. 20, 595-600, "Pfannenstiel (panhandle) PCR") beschrieben. Bei einer Pfannenstiel-PCR wird ein einzelstrangiges Oligonucleotid, das zu einer Sequenz in der bekanunten DNA komplementär ist, an die 3'-Enden eines doppelstrangigen Fragmentes ligiert. Bei der Denaturierung und beim Intrastrang-Reannealing hybridisieren die komplementären Sequenzen und das zurückgesetzte 3'-Ende wird mit Polymerase extendiert, wodurch die unbekannte Sequenz mit einer Flankierung durch die bekannte Sequenz produziert wird. Die bekannte Sequenz kann dann zur Herstellung von Primern für die Amplifizierung der unbekannten Sequenz verwendet werden. Ähnliche Methoden zur Schaffung einer Haarnadelstrukrur und zur Einzelprimer-Amplifizierung sind in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 0379369 beschrieben. Die WO 90/09457 beschreibt eine sequenzunabhängige Methode zur Amplifizierung von DNA-Sequenzen, die vollständig unbekannt sind. Universelle Oligonucleotid-Primerpaare werden durch stumpfendige Ligation an die Ziel-DNA ligiert, sodaß die PCR-Amplifizierung unter Verwendung dieser bekannten Primer primiert werden kann.
Es sind mehrere Verfahren bekannt, die die Amplifizierung von Ziel-Sequenzen erlauben, wenn nur eine teilweise Sequenzinformation bekannt ist. A. R. Shuldiner et al. (1990, Gene 91, 139-142) beschreiben eine Modifikation von reverser Transkriptions-PCR, in welcher eine einzigartige Sequenz während einer reversen Transkription an das 5'-Ende des ersten Stranges angehängt wird. Die Synthese des ersten Stranges wird durch einen hybriden Primer primiert, der komplementär zu dem RNA-Ziel am 3'-Ende ist und die einzigartige Sequenz am 5'-Ende enthält. Die cDNA wird dann unter Verwendung eines auf die einzigartige Sequenz gerichteten Prirners sowie eines auf eine zielspezifische Sequenz gerichteten Primers amplifiziert. Es wird berichtet, daß dadurch die Amplifizierung von eingeschleppten Verunreinigungen vermindert wird. Die veröffentlichte Europäische Patentanmeldung 0469 755 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einzelstrangiger Polynudeotide mit zwei Segmenten, die nicht aneinander angrenzend und komplementär sind. Eine Sequenz, die zu einer in dem Polynucleotid existierenden Sequenz komplementär ist, wird durch Extension eines Primers eingeführt, welcher an das Polynucleotid an seinem 3'-Ende hybridisiert und das Komplement der existierenden Sequenz an seinem 5'-Ende enthält. Nach der Extension des Primers kann das Polynucleotid unter Verwendung eines einzigen Primers amplifiziert werden. V. Shyamala und G. F. L. Ames (1989, Gene 84, 1-8) lehren ein Verfahren zur PCR-Amplifizierung von DNA, wenn die Sequenz von nur einem Ende verftigbar ist (SSP-PCR). Das unbekannte Ende wird an eine generische Vektor-Sequenz ligiert und das Fragment wird unter Verwendung eines genspezifischen Primers und eines generischen Vektor-Primers amplifiziert. Ähnliche Methoden sind in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 0356021 geoffenbart Die WO 90/01064 beschreibt die Amplifizierung einer Sequenz durch die Synthese eines komplementären Stranges, der mit einem sequenzspezifischen Primer primiert ist, welcher auf einen bekannten Abschnitt der Sequenz gerichtet ist. Ein Homopolymer wird an das 3'-Ende des Komplements angesetzt und die Sequenz wird unter Verwendung eines homopolymeren Primers und eines Primers, der homolog zu einem Bereich des sequenzspezifischen Primers ist, amplifiziert. Die Anpassung der PCR an das Footprinting wird von P. R. Mueller und B. Wold (1989, Science 246, 780-786) gelehrt. Für das Footprinting wird eine allgemeine Oligonucleotidsequenz an das einzigartige Ende jedes Fragments der Footprint-Leiter ligiert. Die Fragmente werden unter Verwendung eines Priiners, der zu der allgemeinen Sequenz komplementär ist, und eines Primers, der zu der bekannten Sequenz des fixen Endes komplementär ist, amplifiziert.
Die vorliegenden Methoden schaffen ein Mittel zum Anhängen einer beliebigen Adapter- Sequenz oder eines beliebigen Paares von Adapter-Sequenzen an ein beliebiges Ziel vor der Amplifizierung durch Primer-Extension. Die Adapter-Sequenzen reduzieren die Anzahl der spezifischen Primer, die fur die gleichzeitige Amplifizierung von zwei oder mehr Ziel- Sequenzen in einer einzigen Primer-Extensions-Amplifizierungsreaktion (die hierin als "multiplexe Amplifizierung" oder "Multiplexierung" bezeichnet wird) erforderlich sind. Übliches Multiplexieren bedingt die Tatsache, daß Primer in die Reaktion eingebracht werden, die für die Amplifizierung jeder Ziel-Sequenz spezifisch sind, d.h. jedes Ziel wird durch einen spezifischen Primer oder ein spezifisches Prirnerpaar amplifiziert. Das übliche Multiplexieren liefert unter bestinnnten Bedingungen zufriedenstellende Resultate, zeigt jedoch Nachteile insofern, als mehrfache spezifische Primer für jede multiplexe Reaktion hergestellt werden müssen. Jedoch können bei Verwendung üblicher Multiplexierung mehrfache Sequenzen oft nicht leicht amplifiziert und festgestellt werden, da ein hohes Ausmaß an unspezifischer Hintergrundamplifizierung gebildet wird. Die durch den Adapter meduerte Multiplexierung gemaß der Erfindung ist eine Alternative zur üblichen Multiplexierung, die in bestimmten Fällen verbesserte Ergebnisse liefert. Unter den oben genannten Veröffentlichungen sind es nur die EP-0 364 255 und Mueller und Wold, die das Problem der gleichzeitigen Amplifizierung mehrfacher Ziel-Sequenzen ansprechen. Beide lehren die gleichzeitige Amplifizierung für die PCR, die zum Teil wegen ihrer Temperaturzyklen deutlich unterschiedliche Reaktionsbedingungen im Vergleich zu isothermischen Amplifizierungen, wie etwa SDA, ergibt. Obwohl manche der oben genannten Veröffentlichungen das Anhängen definierter Sequenzen an beide Enden eines Fragmentes vor der Amplifizierung beschreiben, werden doch das Anhängen des definierten Endes und die Amplifizierung in getrennten Reaktionen vorgenommen. Weiters schafft die vorliegende Erfindung zum ersten Mal Methoden zur gleichzeitigen Amplifizierung mehrfacher Ziel- Sequenzen durch SDA, ohne daß die Schaffüng getrennter spezifischer Primer für jedes Ziel notwendig wäre. Die erfinderischen Methoden sind besonders vorteilhaft dadurch, daß die Addition der definierten Adapter-Sequenzen an die Enden der Ziel-Sequenzen und die Amplifizierungsreaktion in einer einzigen Reaktionsmischung vor sich gehen und für den Praktiker als ein einziger Schritt erscheinen.

DAS WESEN DER ERFINDUNG

Gemaß der vorliegenden Erfindung kann ein einziger Primer oder ein Primerpaar zur Co- Amplifizierung mehrfacher Ziel-Nucleinsäuresequenzen verwendet werden. Definierte Adapter-Sequenzen werden innerhalb des Rahmens der Amplifizierungsreaktion an die Enden der Ziel-Sequenzen angehängt, sodaß keine zusätzlichen Manipulationen zum Anhängen der Adapter-Sequenzen notwendig sind. Das heißt, daß die Ziel-Sequenzen mit den angehängten Adapter-Sequenzen vor der Amplifizierung nicht isoliert werden müssen. Bei einer Ausführungsform der Co-Amplifizierung von zwei Ziel-Sequenzen wird eine Sequenz, die einem endständigen Segment eines der beiden Stränge der ersten Ziel-Sequenz entspricht, an das 5'-Ende eines der beiden Stränge der zweiten Ziel-Sequenz angehängt und eine Sequenz, die einem endständigen Segment eines der beiden Stränge der zweiten Ziel- Sequenz entspricht, wird an das 5'-Ende eines der beiden Stränge der ersten Ziel-Sequenz angehängt. Amplifizierung der beiden modifizierten Ziele erfordert dann nur ein einziges Paar von Amplifikations-Primem. Einer der Amplifikations-Primer dieses Paares hybridisiert an eine Sequenz, die dem ersten Ziel entspricht, und der andere Amplifikations- Primer hybridisiert an eine Sequenz, die dem zweiten Ziel entspricht. Andererseits kann ein einziges Paar von Sequenzen aus einem Ziel an die 5'- und 3'-Enden jedes Stranges einer beliebigen Anzahl von Zielen angehängt werden. In einer anderen Ausführungsform können zwei beliebige "universelle" Adapter-Sequenzen an die Enden einer beliebigen Anzahl von Zielen angehängt werden. Alle solchen modifizierten Ziel-Sequenzen können dann unter Verwendung eines einzigen Paares von "universellen" Primern amplifiziert werden, die an die angehängten Endsequenzen hybridisieren.
Die erfindungsgemäßen Methoden sind besonders vorteilhaft für die SDA, da die erforderliche Anzahl von Paaren von Amplifikations-Primern, die Erkennungsstellen für Restriktionsenyyme enthalten, von emem Paar/Ziel auf ein einziges Paar oder, anders gesagt, auf einen einzigen Amplifikations-Primer reduziert wird. Mit weniger Amplifikations-Primeipaaren wird die Bildung von Primer-Dimeren und unspezifischer Hintergrundamplifizierung vermindert. Die erfinderischen Methoden erlauben auch eine Reduktion der Konzentration der Primer, da der Adapter-Primer, der die definierte Sequenz enthält, in einer wesentlich geringeren Konzentration vorliegt als der Amplifikations-Primer, den er ersetzt.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist ein Schema, das das erfindungsgemäße Verfahren zum Anhängen von Adapter- Sequenzen an beide Enden einer Ziel-Sequenz erläutert.
Fig. 2 ist ein Schema, das das erfindungsgemäße Verfahren zur Co-Amplifizierung von zwei Ziel-Sequenzen erläutert.
Fig. 3 ist ein Autoradiagramm, das die Ergebnisse des Experiments von Beispiel 1 zeigt.
Fig. 4 ist ein Autoradiagramm, das die Ergebnisse des Experiments von Beispiel 2 zeigt.
Fig. 5 ist ein Autoradiogramm, das die Ergebnisse des Experiments von Beispiel 3 zeigt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur gleichzeitigen Amplifizierung von mehrfachen Ziel-Sequenzen durch Primer-Extension, insbesondere durch SDA (multiplexe SDA) zur Verfügung. Die Verfahren verwenden ein einziges Paar von Amplifikations- Primem oder einen einzigen SDA-Amplifikations-Primer zur Co-Amplifizierung der mehrfachen Ziel-Sequenzen. Das wird erreicht, indem eine definierte Adapter-Sequenz an die Ziele angehängt und durch Primer-Extension amplifiziert wird. Die erfindungsgemäßen Verfahren werden hierin als "Adapater-mediierte Multiplexierung" bezeichnet. Das steht im Gegensatz zu der "üblichen Multiplexierung", bei welcher mehrere Paare von zielspezifischen Primem verwendet werden, uni die mehrfachen Ziele ohne Addition von Adapter- Sequenzen zu co-amplifizieren.
Die folgenden Ausdrücke werden hierin wie folgt definiert:
Ein Amplifikations-Primer ist ein Primer zur Amplifizierung einer Ziel-Sequenz durch Primer-Extension. Für die SDA hybridisiert das 3'-Ende des Amplifikations-Primers (die Ziel-Bindungssequenz) an das 3'-Ende der Ziel-Sequenz und umfaßt eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym nahe seinem 5'-Ende. Die Erkennungsstelle ist eine solche für ein Restriktionsenzym, welches einen Strang eines DNA-Duplex nicken wird, wenn die Erkennungsstelle hemimodifiziert ist, wie von Walker et al. (1992, PNAS 89, 392-396) und in der EP-A-0 497 272 beschrieben wird. Eine hemimodifizierte Erkennungsstelle ist eine doppeistrangige Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym, in welchem ein Strang mindestens ein derivatisiertes Nucleotid enthält, welches das Schneiden dieses Stranges durch das Restriktionsenzym verhindert. Der andere Strang der hemimodifizierten Erkennungsstelle enthält keine derivatisierten Nudeotide und wird durch das Restriktionsenzym genickt. Die bevorzugten hemimodifizierten Erkennungsstellen sind hemiphosphorthioatisierte Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme HincII, HincII, AvaI, NciI und Fnu4HI. Beim Großteil der SDA-Reaktion ist der Amplifikations-Primer für die exponentielle Amplifizierung der Ziel-Sequenz verantwortlich.
Ein Adapter-Primer hat eine Sequenz an seinem 3'-Ende (die Ziel-Bindungssequenz), die an die Ziel-Sequenz hybridisiert. Am 5'-Ende des Adapter-Primers liegt eine Adapter- Sequenz vor. Die Adapter-Sequenz kann eine Sequenz sein, die im wesentlichen identisch mit dem 3'-Ende eines der Amplifikations-Primer ist, oder sie kann eine beliebige defmierte Sequenz sein, für welche Amplifikations-Primer mit komplementären Ziel-Bindungssequenzen hergestellt werden können.
Ein Bumper-Primer ist ein Primer, der an eine Ziel-Sequenz stromaufwärts entweder eines Adapters oder eines Amplifikations-Primers annealt, sodaß die Extension des Bumper- Primers den Stromabwärts-Primer und sein Extensionsprodukt verdrängt. Die Extension von Bumper-Primern ist ein Verfahren zur Verdrängung der Extensionsprodukte von Adapterund Amplifikations-Primem, jedoch ist das Erwärmen ebenso geeignet.
Identische Sequenzen werden an die gleiche komplementäre Nucleotidsequenz hybridisieren. Im wesentlichen identische Sequenzen sind ausreichend ähnlich in ihrer Nucleotidsequenz, sodaß sie auch an die gleiche Nucleotidsequenz hybridisieren.
Die Ausdrücke Ziel oder Ziel-Sequenz beziehen sich auf Nucleinsäuresequenzen, die amplifiziert werden sollen. Diese inkludieren die ursprüngliche Nucleinsäuresequenz, die amplifiziert werden soll, sowie deren komplementären zweiten Strang (vor dem Anhängen von Adapter-Sequenzen), beide Stränge einer Adapter-modifizierten Kopie der ursprünglichen Sequenz, die hierin beschrieben ist, und beide Stränge einer Kopie der ursprünglichen Sequenz, welche ein Zwischenprodukt der Reaktionen darstellt, in welchen Adapter- Sequenzen an die ursprüngliche Sequenz angehängt werden.
Bei der Adapter-medijerten Multiplexierung gemäß der Erfmdung werden Adapter- Sequenzen an die Enden der Ziel-Sequenzen mit Hilfe von Adapter-Primem angehängt und es erfolgt eine Reihe von Extensions- und Strangverdrängungsschritten, wie sie weiter unten beschrieben werden. Ein Adapter-Primer ist ein Oligonucleotid, welches (i) eine Adapter- Sequenz an seinem 5'-Ende und (ii) eine Ziel-Bindungssequenz an seinem 3'-Ende umfaßt. Die 5'-Adapter-Sequenz kann eine beliebige Sequenz sein, für welche ein geeigneter Amplifikations-Primer hergestellt werden kann. Die Adapter-Sequenz kann eine beliebige sein oder sie kann einem Segment einer der Ziel-Sequenzen entsprechen. Die Adapter- und Ziel-Bindungsregionen eines Adapter-Primers können aneinander anliegen oder sie können durch ein Segment einer nicht verwandten Sequenz getrennt sein. Verschiedene Adapter- Primer können gegebenenfalls allgemeine 5'-Adapter-Sequenzen (gemäß folgender Beschreibung) aufweisen, jedoch werden sie im allgemeinen unterschiedliche 3'-Ziel-Bindungssequenzen haben, um Hybridisierung an die verschiedenen Ziele zu erreichen. Es wird daher in der Regel ein einzigartiger Adapter-Primer für jedes Zielende, das durch Anhängen einer Adapter-Sequenz modifiziert werden soll, erforderlich sein. Eines oder beide Enden einer Ziel-Sequenz können durch Anhängen von Adapter-Sequenzen modifiziert werden. Wenn beide Enden einer Ziel-Sequenz modifiziert werden, können die beiden angehängten Sequenzen, je nach der Auswahl der Adapter-Primer, identisch oder unterschiedlich sein.
In beispielhafter Weise richtet sich die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung auf eine Primer-Extensionsamplifizierung durch SDA. Für den Fachmann auf diesem Gebiet wird es eindeutig sein, daß diese Verfahren leicht auf beliebige Methoden der DNA- Amplifizierung anwendbar sind, die auf der Extension von Primern durch Polymerase beruhen. Diese inkludieren zum Beispiel die 3SR- und PCR-Amplifizierungsmethoden, die oben besprochen wurden. Zur Anpassung der erfinderischen Methoden an diese Amplifizierungsreaktionen würden die SDA-Amplifikations-Primer durch solche Amplifikations- Primer ersetzt, die für die ausgewählte Primer-Extensionsamplifizierungsreaktion geeignet sind, wie sie in der Fachwelt bekannt ist. Die Adapter-Primer wären, unabhängig von dem ausgewählten Verfahren der Primer-Extensionsamplifizierung, im wesentlichen unverändert.
Fig. 1 erläutert eine bevorzugte Methode zur Modifizierung beider Enden einer Ziel- Sequenz durch Anhängen von definierten Adapter-Sequenzen. Ein erster Adapter-Primer (A&sub1;) wird an eine Ziel-DNA am 3'-Ende der Ziel-DNA-Sequenz hybridisiert. Die Ziel-Bindungssequenz von A&sub1; befindet sich an dem 3'-Ende und die ausgewählte Adapter-Sequenz an dem 5'-Ende. Ein erster Bumper-Primer (B&sub1;) gemäß der Beschreibung von Walker et al. (1992, Nuc. Acids Res. 20, 1691-1696) wird an die Ziel-DNA stromaufwärts des ersten Adapter-Primers hybridisiert. Der erste Adapter-Primer und der erste Pumper-Primer werden mit Polymerase extendiert. Die Extension des Stromaufwärts-Bumper-Primers verdrängt das Extensionsprodukt des ersten Adapter-Primers (A&sub1;-ext), welches die Adapter-Sequenz an seinem 5'-Ende einschließt, sonst aber komplementär zu der ursprünglichen Ziel-DNA- Sequenz ist. Die Ziel-Bindungssequenz (3'-Ende) eines zweiten Adapter-Primers (A&sub2;) wird dann an das erste Adapter-Extensionsprodukt (A&sub1;-ext) an einer Stelle hybridisiert, die dem 3'-Ende der zu der ursprünglichen Ziel-Sequenz komplementären Sequenz entspricht. Das 5'- Ende von A&sub2; umfaßt eine zweite Adapter-Sequenz, die die gleiche wie die Adapter-Sequenz A&sub1; oder unterschiedlich von ihr sein kann. Die Polymerisation und Verdrängung durch Extension eines zweiten Bumper-Primers (B&sub2;), wie oben, ergibt eine einzeistrangige Kopie der ursprünglichen Ziel-Sequenz mit Adapter-Sequenzen, die an die 5'- und 3'-Enden angehängt sind. Insbesondere stammt das 5'-Ende dieses modifizierten Ziels direkt von dem zweiten Adapter-Primer, während das 3'-Ende des modifizierten Ziels (das indirekt von dem ersten Adapter herrührt) aus einer Sequenz besteht, die komplementär zu der ersten Adapter- Sequenz ist.
Aus Gründen der Kürze stellt Fig. 1 die Zielbildung von nur einem der beiden komplementären Zielstränge dar, die normalerweise in einer Probe vorliegen. Die Bildung von modifizierten Zielen aus dem zweiten Strang ist analog der Bildung modifizierter Ziele aus dem ersten Strang, wie sie in Fig. 1 gezeigt ist, mit der Ausnahme, daß die Reihenfolge von Bindung und Extension des ersten und zweiten Adapter-Primers umgekehrt ist. Das heißt, daß A&sub2; zuerst gebunden und extendiert wird und A&sub1; an das Extensionsprodukt von A&sub2; bindet und extendiert wird. Die Bindung und Extension des ersten und zweiten Bumper- Primers ist in ähnlicher Weise umgekehrt. Das reine Ergebnis der entsprechenden Extensions- und Verdrängungsreaktionen für den zweiten Strang ist ein modifiziertes Ziel-Fragment, das eine Sequenz, die zu der ersten Adapter-Sequenz an dem 5'-Ende identisch ist, und eine Sequenz, die zu der zweiten Adapter-Sequenz an dem 3'-Ende komplementär ist, aufweist. Alle Stränge der Ziel-Sequenzen, die endständig mit Adapter-Sequenzen modifiziert sind, können dann exponentiell durch Amplifikations-Primer amplifiziert werden, deren Ziel-Bindungssequenzen (am 3'-Ende des Primers) im wesentlichen identisch mit den ersten und zweiten Adapter-Sequenzen an den 5'-Enden der Adapter-Primer sind, die zur Schaffung der modifizierten Ziele verwendet wurden.
Das in Fig. 1 erläuterte Verfahren kann zur Modifizierung mehrfacher Ziel-Sequenzen gleichzeitig innerhalb einer einzigen Reaktionsmischung verwendet werden, sofern die Mischung einen geeigneten Adapter-Primer für jedes zu modifizierende Ziel enthält. Die verschiedenen Adapter-Primer können so ausgerichtet sein, daß alle geschaffenen modifizierten Ziel-Sequenzen das gleiche Paar angehängter Sequenzen enthalten. Alle endständig modifizierten Ziel-Stränge können dann durch das gleiche Paar von Amplifikations-Primem amplifiziert werden. Anders gesagt ist, wenn alle Adapter-Primer die gleiche 5'-Adapter- Sequenz enthalten, nur ein einziger Amplifikations-Primer zur Amplifizierung aller modifizierten Ziel-Stränge notwendig.
Fig. 2 erläutert eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in welcher zwei Ziel-Sequenzen unter Verwendung eines einzigen Paares von Amplifizierungsprimem coamplifiziert werden. Wieder ist aus Gründen der Klarheit die Modifikation nur eines Stranges jeder Ziel-Sequenz erläutert. In dieser Ausführungsform wird ein Ende jedes Ziel- Stranges durch Anhängen einer Sequenz modifiziert, die im wesentlichen identisch mit einem terminalen Segment des anderen Ziels ist. Das andere Ende jedes Ziel-Stranges bleibt unmodifiziert und behält seine ursprüngliche Komplementarität zu einem der beiden Amplifikations-Primerpaare bei. Wie weiter unten detailliert besprochen wird, können die entstehenden modifizierten Ziele dann beide durch ein einziges Paar von Amplifikations- Primem amplifiziert werden, wobei einer der beiden komplementar zu emer der beiden ursprünglichen Ziel-Sequenzen ist und der andere komplementär zu der anderen der beiden ursprünglichen Ziel-Sequenzen ist. Für das erste Ziel (A) wird ein A-spezifischer Amplifikations-Primer (SA) an das 3'-Ende der Ziel-Sequenz hybridisiert und mit Polymerase extendiert. Die Nick-Enzym-Erkennungsstelle des Amplifikations-Primers ist in Fig. 2 als ein erhabender Abschnitt des Primers dargestellt. Das entstehende Extensionsprodukt wird durch Extension eines Bumper-Primers (BA1) verdrängt, der an das Ziel stromaufwärts von SA hybridisiert. Das verdrängte SA-Extensionsprodukt (SA-ext) wird an einen Adapter-Primer (AA) hybridisiert, der an SA-ext am 3'-Ende des Komplements der ursprünglichen Ziel- Sequenz bindet. Das 5'-Ende von AA umfaßt die Adapter-Sequenz (fester Abschnitt), die im wesentlichen identisch mit der Ziel-Bindungssequenz am 3'-Ende von &sup5;8 ist, einem Amplifikations-Primer, der spezifisch an das zweite Ziel (B) bindet. Die Extension von AA und die Verdrängung des AA-Extensionsproduktes (AA-ext) ergibt eine einzelstrangige Kopie der A-Ziel-Sequenz mit einer Nick-Enyym-Erkennungsstelle und der A-Ziel-Sequenz an ihrem 3'-Ende und der SB-Ziel-Bindungssequenz an ihrem 5'-Ende.
Das zweite Ziel (B) wird ähnlich behandelt, wobei zuerst ein B-spezifischer Amplifikations-Primer (SB) gebunden und extendiert wird, dann ein Adapter-Primer (AB) an das Extensionsprodukt (SB-ext) hybridisiert wird. SB hybridisiert an B an einem 3'-terminalen Segment von B, welches komplementär sowohl zu der Ziel-Bindungssequenz von &sup5;8 als auch der Adapter-Sequenz von AA ist. Das 3'-Ende des Adapter-Primers AB hybridisiert mit dem 3'-Ende des Komplements des ursprünglichen Ziels und das 5'-Ende von AB (offener Abschnitt) ist im wesentlichen identisch mit der Ziel-Bindungssequenz von SA. Die Extension und die Verdrängung des AB-Extensionsprodukts (AB-ext) ergeben eine Kopie der zweiten Ziel-Sequenz mit einer Nick-Enzym-Erkennungsstelle (erhabener Abschnitt) und der B-Ziel-Sequenz an ihrem 3'-Ende sowie der SA-Ziel-Bindungssequenz an ihrem 5'- Ende. Die beiden Adapter-modifizierten Kopien der Ziel-Sequenzen sind durch SDA amplifizierbar, wobei nur die SA- und SB-Amplifikations-Primer, die bereits in der Reaktion vorhanden sind, verwendet werden. Um die SDA zu beginnen, hybridisieren AA-ext und AB-ext an ihre jeweiligen Amplifikations-Primer, die extendiert werden, um das Komplement des modifizierten Stranges zu produzieren (d.h. Extension von SA auf dem modifizierten Strang A und Extension von SB auf dem modifizierten Strang B), wobei das Komplement der Adapter-Sequenz am 3'-Ende inkludiert ist. Nach dem Nicken und Verdrängen kann der Amplifikations-Primer des gegenüberliegenden Ziels dann an das 3'-Ende dieses Extensionsprodukts binden (d.h. SB an den A-derivierten Strang und SA an den B-derivierten Strang) und wird extendiert, um ein Fragment mit einer Nick-Enzym-Erkennungsstelle an jedem Ende zu bilden. Dieses Fragment wird durch übliche SDA nach der Beschreibung von Walker et al., supra, amplifiziert.
Die doppelstrangigen Reaktionsprodukte, die nach der Verdrängung von AA-ext und AB- ext gebildet wurden, können ebenfalls in einer Reaktionsschleife teilnehmen, die zusätzliche Kopien von AA-ext und AB-ext hervorruft. Das Nicken der Restriktionsenzym- Erkennungsstelle des Bodenstranges, die Extension mit Polymerase und die Verdrängung des Bodenstranges produzieren Ziele, die ähnlich wie SA-ext und SB-ext sind, jedoch mit der Hälfte einer Restriktionsenzym-Erkennungsstelle an dem 5'-Ende. Die Adapter-Primer können an diese Fragmente binden, wie in Fig. 2 gezeigt ist, und können extendiert und verdrängt werden, um zusätzliche Kopien von AA-ext und AB-ext zu bilden (auch mit der Hälfte einer Restriktionsenzym-Erkennungsstelle an dem 5'-Ende), die in den SDA-Reaktionszyklus eintreten, wie oben beschrieben wurde.
Fig. 2 stellt die Bildung eines modifizierten Ziels aus nur einem der beiden komplementären Stränge dar, die normalerweise für jede Ziel-Sequenz vorliegen. Verfahren, die mit diesen gezeigten ähnlich sind, beginnen auch am zweiten Strang jedes Ziels. Im Fall des zweiten Stranges ist jedoch die Reihenfolge von Bindung und Extension der Primer umgekehrt. Die Adapter-Primer binden zuerst direkt an den zweiten Ziel-Strang und werden an dieser Schablone extendiert. Nach seiner anschließenden Verdrängung hybridisiert das entstehende Adapter-Extensionsprodukt an den Amplifikations-Primer, welcher seinerseits extendiert und verdrängt wird, um ein Produkt zu ergeben, welches die ursprüngliche Ziel- Sequenz des zweiten Stranges mit einer Erkennungsstelle für ein Nick-Restriktionsenzym an seinem 5'-Ende und eine Sequenz enthält, die mit der Adapter-Sequenz an seinem 3'-Ende komplementär ist. Dieses modifizierte Fragment tritt in die übliche SDA-Amplifizierung durch Bindung und Extension des für das gegenüberliegende Ziel spezifischen Amplifikations-Primers ein (d.h. SB bindet an den A-derivierten Strang und SA bindet an den B- derivierten Strang), wodurch ein Fragment für jeden Ziel-Zweitstrang mit einer Nick-Enzym-Erkennungsstelle an jedem Ende gebildet wird.
Alle Reaktionsstufen, die an der Anhängung der Adapter-Sequenzen und der Amplifizierung des Ziels beteiligt sind, können gleichzeitig in einer einzigen Reaktionsmischung stattfmden. Das heißt, daß, sobald die Adapter-Sequenzen an ein Ziel-Molekül angehängt sind, Amplifizierung dieses Ziel-Moleküls innerhalb der gleichen Reaktionsmischung stattfinden kann, bevor die Adapter-Sequenzen an beliebige andere vorliegende Ziel-Moleküle angehängt werden, und ohne daß das modifizierte Ziel isoliert wird. Die Reaktionsbedingungen für die erfmdungsgemaßen Verfahren entsprechen im wesentlichen der Beschreibung von Walker et al., supra, für SDA, mit einigen Modifikationen. Zuerst enthält die anfängliche Reaktionsmischung sowohl die Amplifikations-Primer als auch die Adapter- Primer ebenso wie die Ziel-DNA. Zusätzlich dazu liegen die Amplifikations-Primer in etwa 10-fachem Überschuß gegenüber den Adapter-Primem vor. Jedoch werden, wie bei üblicher SDA, das Nick-Restriktionsenzym und die exo Klenow-Polymerase nach einer Hitze- Denaturierung der Ziel-DNA und dem Annealen der Primer zugesetzt. Nach der Denaturierung der Ziel-DNA gehen das Annealen der Primer und die Zugabe der Polymerase, die Verfahren des Anhängens der Adapter-Sequenzen und der Amplifizierung automatisch in einer einzigen Reaktionsmischung vor sich, ohne daß der Praktiker weiter intervenieren muß. Das heißt, daß, nachdem die Adapter-Sequenzen angehängt sind, eine modifizierte Ziel- Sequenz automatisch in den SDA-Reaktionszyklus eintritt. Erforderlichenfalls können universelle Primer an dem 3'-Ende eine Kappe aufweisen, um eine Extension durch Polymerase zu verhindern und Hintergrundreaktionen zu reduzieren, die aus der Bildung von Primer-Dimeren entstehen.

BEISPIEL 1

Es wurde die Co-Amplifizierung an zwei Ziel-Sequenzen verglichen, wobei übliche Multiplexierung und Adapter-meduerte Multiplexierung vorgenommen wurden. Das erste Ziel war das Insertionselement IS6110 von Mycobacterium tuberculosis (Ziel "A", Thierry et al. 1990). Das zweite Ziel war das ribosomale Gen 165 von Mycobacterium tuberculosis (Ziel "B"). Beim üblichen Multiplexieren wird ein voller Satz von vier Primern für jede Ziel- Sequenz verwendet (S&sub1;, S&sub2;, B&sub1; und B&sub2;, wie von Walker et al., Nuc. Acids Res., supra beschrieben ist), d.h. eine Gesaintheit von acht Primem für die beiden Ziel-Sequenzen. Für die Adapter-meduerte Multiplexierung, wie sie in Fig. 2 dargestellt ist, wurde einer der 5- Primer für jede Ziel-Sequenz durch einen Adapter-Primer mit einer 10-fach geringeren Konzentration als der Konzentration des ersetzten S-Primers ersetzt.
Die SDA wurde im allgemeinen nach der Beschreibung von Walker et al., Nuc. Acids Res., supra, vorgenommen. Die endgültigen Konzentrationen der Bestandteile waren 45 mM KiPO&sub4;, pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 0,5 mM dUTP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dCTP, 0,2 mM dATPαS, 0,1 mg/ml acetyliertes BSA, 12 % (v/v) Dimethylsulfoxid, 3 % (v/v) Glycerin (erhalten aus den Ansatzlösungen von exo Klenow und HincII), 250 ng humane placentale DNA, 2,5 Einheiten exo Klenow (United States Biochemical, Cleveland, OH), 150 Einheiten HincII (New England Biolabs, Beverly, MA) und 0, 50, 500 oder 5.000 Mycobacterium tuberculosis Genome (Moleküle). Für eine übliche Multiplex-Amplifizierung enthielten die Proben auch die folgenden Primer: 500 nM jeweils von SEQ ID NO: 1 (S2A), SEQ ID NO:2 (S1A), SEQ ID NO:3 (S1B) und SEQ ID NO:4 (S2B); 25 nM jeweils von SEQ ID NO:5 (B1A), SEQ ID NO:6 (B2A), SEQ ID NO:7 (B1B) und SEQ ID NO:8 (B2B) Für eine Adapter-mediierte Multiplexierung enthielten die Proben die folgenden Primer: 500 nM jeweils von SEQ ID NO:2 (SA in Fig. 2) und SEQ ID NO:3 (SB in Fig. 2); 50 nM jeweils von SEQ ID NO:10 (AA) und SEQ ID NO:9 (AB); 25 nM jeweils von SEQ ID NO:5 (B1A), SEQ ID NO:6 (B2A), SEQ ID NO:7 (B1B) und SEQ ID NO:8 (B2B).
Jede 47 ul Probe wurde zusammengesetzt, um alle Reagenzien, mit Ausnahme von exo Klenow und HincII, zu enthalten, wobei 10-fach konzentrierte Ansatzlösungen von jedem Reagens verwendet wurden. Das MgCl&sub2; wurde nach Zugabe und Mischung aller anderen Reagenzien (mit Ausnahme von exo Klenow und HincII) zugesetzt, um eine Ausfällung zu verrneiden, die stattfindet, wenn KiPO&sub4;, Dimethylsulfoxid und MgCl&sub2; bei Konzentrationen gemischt werden, die deutlich höher sind als 45 mM, 12 % (v/v) bzw. 6 mM. Die Proben wurden dann zwei Minuten im siedenden Wasserbad erhitzt, um die Mycobacterium tuberculosis DNA zu denaturieren. Es wurde ein Niederschlag unmittelbar nach der Entnahme aus dem siedenden Wasserbad beobachtet. Durch Inkubation während 2 Minuten bei 40ºC und Mischen mit einem Vortex-Mischer löste sich der Großteil des Hochtemperaturniederschlags wieder auf Exo Klenow (1 ul einer Ansatzlösung mit 2,5 Einheiten pro ul) und HincII (2 ul einer Ansatzlösung mit 75 Einheiten pro ul) wurden zugesetzt und die Proben wurden 2 Stunden bei 40ºC inkubiert.
Die Amplifikationsprodukte wurden durch Primer-Extension nach der Beschreibung von Waiker et al., Nuc. Acids Res., supra, festgestellt. Ein aliquoter Anteil von 5 ul jeder Probe wurde mit 5 ul 45 mM KiPO&sub4;, pH 7,5, 6 mM MgCl&sub2;, 0,5 mM dUTP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dCTP, 0,2 mM dATPαS, 0,1 mg/ml acetyliertes BSA und 2 ul von einer 5'-³²P- Ansatzlösung der Detektorsonde (50 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM MgCl&sub2;, 1 uM 5'-³²P- Detektorsonde) gemischt. Die Detektorsonde für Ziel A war SEQ ID NO: 11 und die Detektorsonde für Ziel B war SEQ ID NO: 12. Die 12 ul Proben wurden dann 1 Minute in einern siedenden Wasserbad erhitzt. Nach 2 Minuten Inkubation bei 37ºC wurden 2 ul von exo Klenow mit 1 Einheit/ul zugesetzt und die Proben wurden 15 Minuten bei 37ºC inkubiert, worauf Zugabe von 14 ul 50 % Harnstoff in 0,5 X TBE folgte.
Die Proben wurden 1 Minute auf 95ºC erhitzt und analysiert, wobei eine 8 % Denaturierungsgel-Elektrophorese und Autoradiografie verwendet wurden (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt. Die Spuren 1-8 stellen die SDA der Sequenz IS6110 dar und die Spuren 9-16 stellen die SDA der Gensequenz 165 dar. Amplifiziertes IS6110 (Ziel A) zeigt sich durch Extension der Detektorsonde SEQ ID NO:11 auf ein 35- und 56-mer für übliche Multiplexierung (Spuren 5-8) und auf ein 44-, 47- und 68-mer für Adapter-meduerte Multiplexierung (Spuren 14). Arnplifiziertes 165 (Ziel B) zeigt sich durch Extension der Detektorsonde SEQ ID NO:12 auf ein 27- und 48-mer für übliche Multiplexierung (Spuren 13-16) und auf ein 39-, 42- und 63-mer für Adaptermediierte Multiplexierung (Spuren 9-12).
Nur Adapter-mediierte Multiplex-Amplifizierung ergab eine wirksame Amplifizierung beider Ziele IS6110 und 165. Man vergleiche zum Beispiel die Adapter-meduerte Amplifizierung von 50 Mycobacterium tuberculosis Genomen für beide Ziel-Sequenzen (Spuren 3 und 11) mit der üblichen Multiplexierung (Spuren 7 und 15).

BEISPIEL 2

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung von Adapter-mediierter Multiplex-SDA, wie sie in Fig. 2 erläutert ist, zur Schaffung von zwei Zielen, die unter Verwendung eines einzigen Paares von SDA-Primern amplifiziert werden können. Die erste Ziel-Sequenz (Ziel "A") war das Segment des Insertionselements IS6110 von Mycobacterium tuberculosis, das in Beispiel 1 verwendet wurde. Die zweite Ziel-Sequenz (Ziel "B") war eine von Mycobacterium avium abgeleitete Sequenz, die in dem Plasmid pMAv29 enthalten ist (3. W. U. Fries et al., 1990, Molec. Cell. Probes 4, 87-105). Das Plasmid pMAv29 wurde mit der Restriktionsendonuclease EcoRI geschnitten, um es in lineare Form urnzuwandeln, bevor es in den Amplifizierungsreaktionen verwendet wurde.
Die SDA wurde allgemein nach der Beschreibung von Walker et al., Nuc. Acids Res., supra, dargestellt. Die endgültigen Konzentrationen der Bestandteile in jeder 67 ul Amplifizierungsreaktion waren: 48,3 mM KiPO&sub4; (pH 7,5); 5,8 mM MgCl&sub2;; 0,96 mM jeweils von dCTP, dGTP, dTTP, dATPαS; 0,09 mg/ml acetyliertes BSA; 3 % (v/v) Glycerin (erhalten aus den Ansatzlösungen von exo Klenow und HincII); 0,85 ng/ul humane placentale DNA; 5,2 Einheiten exo Klenow (United States Biochemical, Cleveland, OH); 154 Einheiten HincII (New England Biolabs, Beverly, MA); 0, 8, 83, 830 oder 8300 Kopien sowohl von genomischer DNA von Mycobacterium tubereulosis als auch von Plasmid pMAv29-DNA. In allen Reaktionen lagen die genomische DNA von Mycobacterium tuberculosis und die DNA des Plasmids pMAv29 in äquimolaren Verhältnissen vor. Die Reaktionsmischungen enthielten auch die folgenden Primer: 450 nM jeweils von SEQ ID NO:13 (SA in Fig.2) und SEQ ID NO: 14 (SB); 45 nM jeweils von SEQ ID NO:15 (AB) und SEQ ID NO:16 (AA); 9 nM SEQ ID NO:5 (BA1), SEQ ID NO:6 (BA2), SEQ ID NO:17 (BB1) und SEQ ID NO:18 (BB2).
Alle Reaktionsbestandteile mit Ausnahme von Hinell und exo Klenow wurden vereinigt und die Mischungen wurden zwei Minuten auf 95ºC erhitzt und dann 3-5 Minuten in ein Wasserbad mit 37ºC eingesetzt. Die Enzyme HincII und exo Klenow wurden dann zugesetzt und die Amplifizierungsmischung wurde 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Reaktionen abgebrochen, indem die Proben 2 Minuten auf 95ºC erhitzt wurden.
Nach dem Abkühlen wurden die Reaktionsmischungen auf die Anwesenheit von spezifischen IS6110- oder pMAv29-Amplifikationsprodukten untersucht, wobei 5'-³²P-gekennzeichnete Primer-Extension wie in Beispiel 1 verwendet wurde. Ein aliquoter Anteil von 15 ul jeder Probe wurde mit 2 ul Sondenansatzlösung gemischt (die 0,66 uM 5'-³²P- gekennzeichnete Detektorsonde, 16 mM Tris-HCl pH 8,0 und 3,3 mM MgCl&sub2; enthielt). Die Detektorsonde für das Ziel IS6110 war SEQ ID NO:11 und die Sonde für die Sequenz von Mycobacterium avium war SEQ ID NO: 19. Die Mischungen wurden 2 Minuten auf 95ºC erhitzt und dnnn in ein Wasserbad mit 37ºC eingesetzt. Nach 3-5 Minuten wurden 3 ul einer Lösung, die die folgenden Bestandteile enthielt, zu jeder Probe zugesetzt: 0,25 Einheiten/ul exo Klenow; 9 mM Tris-HCl (pH 8,0); 1,8 mM MgCl&sub2;; und 0,9 mM jeweils von dCTP, dGTP, dTRP, dATPαS. Die Mischungen wurden 45 Minuten bei 37ºC inkubiert und die Extensionsreaktionen durch Zugabe von 30 ul 50 %-igem Harnstoff in 0,5X TBE beendet. Dann wurden die Proben 2 Minuten auf 95ºC erhitzt und aliquote Anteile von 20 ul wurden durch Denaturierungsgel-Elektrophorese auf einem 10 % Polyacrylamidgel mit anschließender Autoradiografie (Maniatis et al., supra) analysiert.
Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Fig. 4 gezeigt. Die mit 35 und 56 nt in den Spuren 1-5 gekennzeichneten Banden entsprechen der Extension des IS6110-spezifischen Detektor- Primers SEQ ID NO:11. Diese Spuren zeigen Amplifizierung der IS6110-Ziele bis zu feststellbaren Niveaus ausgehend von einer so geringen Menge wie 8 Genom-Kopien von Mycobacterium tuberculosis bei Verwendung von Adapter-mediierter Multiplex-SDA. In den Spuren 6-10 entsprechen die mit 51 und 72 nt markierten Banden der Extension der pMAv29-spezifischen Detektorsonde SEQ ID NO:19. Diese Spuren zeigen Amplifizierung von so geringen Eingangskopien von pMAv29 wie 83 bis zu feststellbaren Niveaus (vgl. die schwache Bande in Spur 8). Obwohl die Amplifizierungsreaktionen aquimolare Mengen von pMAv29-DNA und genomischer DNA von Mycobacterium tuberculosis enthielten, war das von jeder eingesetzten genomischen DNA von Mycobacterium tuberculosis erzeugte Signal deutlich stärker als jenes, das von jedem pMAv29-Molekül hervorgerufen wurde, da die DNA von Mycobacterium tuberculosis etwa 10 Kopien der Sequenz IS6110 pro Genom enthält, während pMAv29 nur eine Ziel-Kopie pro Plasmid-Molekül enthält. Gemeinsam genommen zeigen die Spuren 3 und 8 (die getrennte Analysen der gleichen Amplifizierungsmischung sind) erfolgreiche Adapter-mediierte Co-Amplifizierung von Zielen, die nur so wenige wie 83 Eingangskopien von pMAv29 und genomischer DNA von Mycobacterium tuberculosis enthielten. Beide Ziele wurden somit leicht co-amplifiziert, wenn höhere Mengen von Eingangs-Ziel-DNA vorlagen, wie in den Spuren 1 und 6 sowie 2 und 7 gezeigt ist. Die Co-Amplifizierung dieser gleichen Ziele unter Verwendung von üblicher SDA-Multiplexierung war etwa 10-fach weniger wirksam als die Co-Amplifizierung unter Verwendung von Adapter-mediierter Multiplex-SDA.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel zeigt die Co-Amplifizierung einer pMAv29 Ziel-Sequenz und eines Segments des Insertionselements IS6110 mit einem einzigen Paar von für IS6110 spezifischen Amplifikations-Primem (SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO:2), wobei das in Fig. 1 erläuterte Verfahren verwendet wurde. Die Adapter-Primer SEQ ID NO:20 und SEQ ID NO:21 wurden verwendet, um Kopien der Ziel-Sequenz von pMAv29, welche IS6110-spezifische Sequenzen an beiden Enden enthielt, zu schaffen. Diese endständig modifizierten pMAv29-Ziele wurden dann mit IS6110 unter Verwendung der IS6110-spezifischen Primer co-amplifiziert.
Die SDA wurde allgemein nach der Beschreibung in den vorhergehenden Beispielen durchgeführt. Die endgültigen Konzentrationen der Bestandteile jeder 50 ul Reaktion waren 50 mM KiPO&sub4;, pH 7,5; 6 mM MgCl&sub2;; 1 mM jeweils von dTTP, dCTP, dGTP und dATPαS; 0,1 mg/ml acetyliertes BSA, 3 % (v/v) 1-Methyl-2-pyrrolidinon (NMP), 3 % (v/v) Glycerin (erhalten aus den Ausgangslösungen von Exo Klenow und HincII), 300 ng humane placentale DNA, 3,0 Einheiten exo Klenow (United States Biochemical, Cleveland, OH), 150 Einheiten HincII (New England Biolabs, Beverly, MA); 1.000 Kopien von genomischer DNA von Mycobacterium tuberculosis und 100.000 Kopien von Plasmid pMAv29 (hergestellt nach der Beschreibung in Beispiel 2). Die Reaktionsmischungen enthielten auch die folgenden Primer: 500 nM jeweils von SEQ ID NO:1 (S&sub1; in Fig. 1) und SEQ ID NO:2 (52); 50 nM jeweils von SEQ ID NO:20 (A&sub1;) und SEQ ID NO:21 (A&sub2;) und 25 nM jeweils von SEQ ID NO:18 (B&sub1;); SEQ ID NO:17 (B&sub2;), SEQ ID NO:5 und SEQ ID NO:6. SEQ ID NO:5 und SEQ ID NO:6 dienten als Bumper-Primer für die Schaffimg des IS6110 Ziels gemaß obiger Beschreibung. Die Adapter-Primer (SEQ ID NO:20 und SEQ ID NO:21) wurden an Vergleichsreaktionen gehindert, die in Fig. 5 mit "Adapter-" bezeichnet sind.
Alle Reaktionsbestandteile mit Ausnahme von HincII und exo Klenow wurden vereinigt und die Mischungen wurden 2 Minuten auf 95ºC erhitzt und dann 3-5 Minuten in ein Wasserbad mit 37ºC eingetaucht. Nach der Zugabe der Enzyme HincII und exo Klenow wurden die Amplifizierungsmischungen zwei Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Amplifizierung wurde dadurch beendet, daß die Proben 2 Minuten auf 95ºCerhitzt wurden.
Nach der Abkühlung wurden die Reaktionsmischungen auf die Anwesenheit von Amplikationsprodukten durch Primer-Extension gemäß obiger Beschreibung untersucht. Ein aliquoter Anteil von 5 ul jeder Probe wurde gemischt mit (i) 10 ul einer Lösung, die enthielt: 42,5 mM Tris-HCl (pH 8,0); 8,5 mM MgCl&sub2;; 0,2 mM jeweils von dCTP, dGTP, dTTP, dATPαS; und (ii) 3 ul von ³²P-gekennzeichneter Detektorsonden-Ansatzlösung (die 0,66 uM 5'-³²P-gekennzeichneter Sonde, 16 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 3,3 mM MgCl&sub2; enthielt). Die Detektorsonde für das Ziel IS6110 war SEQ D NO: 11 und die pMAv29- spezifische Sonde war SEQ D NO: 19. Die Mischungen wurden vereinigt und in einem Wasserbad bei 95ºC 2 Minuten erhitzt. Nach der Inkubation in einem Wasserbad von 37ºC während 3-5 Minuten wurden 3 ul exo Klenow mit 0,34 Einheiten pro ul zu jeder Mischung zugesetzt und die Proben wurden 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Extensionsreaktionen wurden durch Zugabe von 30 ul 50 %igem Harnstoff in 0,5X ThE abgebrochen.
Die Proben wurden 2 Minuten auf 95ºC erhitzt und aliquote Anteile von 20 ul wurden analysiert, indem zuerst ³²P-gekennzeichnete Produkte durch Denaturierungsgel- Elektrophorese auf einem 10 % Polyacrylamidgel mit anschließender Autoradiografie des Geis gemäß vorhergehender Beschreibung abgetrennt wurden. Fig. 5 zeigt das Autoradiogramm des Gels. Die mit 35 und 36 nt in den Spuren 1 und 2 gekennzeichneten Banden entsprechen der Extension der IS6110-spezifischen Detektorsonde SEQ ID NO:11. Die mit 51 und 72 nt in den Spuren 3 und 4 gekennzeichneten Banden entsprechen der Extension der pMAv29-spezifischen Detektorsonde SEQ ID NO:19. Die Spuren 1 und 3 sind getrennte Analysen der gleichen (Adapter-enthaltenden) Amplifizierungsreaktion und die Spuren 2 und 4 sind getrennte Analysen der gleichen (Adapter-freien) Amplifizierungsreaktion.
Die Anwesenheit von starken IS6110-spezifischen Banden in beiden Spuren 1 und 2 wurde erwartet, da beide "Adapter+" und Adapter-" Amplifizierungsreaktionsmischungen Primer enthielten, die zur Amplifizierung der IS6110 Ziel-Sequenz notwendig waren. Die starken Produktbanden in der "Adapter-"-Spur deuten darauf hin, daß die Adapter-Sequenzen für die IS6110-Amplifizierung nicht erforderlich sind, und entsprechende Produktbanden von nahezu gleicher Intensität in der "Adapter+"-Spur zeigen, daß die Anwesenheit des Adapters die IS6110-Amplifizierung nicht deutlich stört.
Im Gegensatz dazu waren Adapter eindeutig notwendig für die Amplifizierung der pMAv29 Ziel-Sequenz, wie durch die Anwesenheit von pMAv29-spezifischen Produktbanden in Spur 3 ("Adapter+"), jedoch nicht in Spur 4 ("Adapater-") gezeigt ist. Das demonstriert Adapter-meduerte Amplifizierung der pMAv29 Ziel-Sequenz mit einem Paar von Ampfifizierungs-Primem, die für IS6110 spezifisch sind. Zusätzlich dazu demonstrieren die Spuren 1 und 3 gemeinsam die erfolgreiche Co-Amplifizierung der pMAv29- und IS6110- Ziel-Sequenzen. SEQUENZLISTE

Claims

1. Ein Verfahren zur gleichzeitigen Amplifizierung von zwei Ziel-Nucleinsäuresequenzen durch Strangverdrängungsamplifikation (SDA), welches Verfahren umfaßt:

a) Hybridisierung eines ersten Amplifikations-Primers an das 3'-Ende einer ersten Ziel- Sequenz, wobei der erste Amplifikations-Primer eine 3'-Ziel-Bindungssequenz und eine 5'- Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym, das zum Nicken eines Stranges einer doppelstrangigen hemimodifizierten Erkennungsstelle für das Enzyin befähigt ist, umfaßt, Extension des ersten Amplifikations-Primers mit Polymerase zur Bildung eines ersten Extensionsproduktes, das zu der ersten Ziel-Sequenz komplementär ist, und Verdrängung des ersten Extensionsproduktes,

b) Hybridisierung eines ersten Adapter-Priiners an das erste Extensionsprodukt am 3'- Ende des Komplements der ersten Ziel-Sequenz, wobei das 3'-Ende des ersten Adapter- Primers eine Ziel-Bindungssequenz umfaßt, die imstände ist, an das erste Extensionsprodukt zu hybridisieren, und das 5'-Ende des ersten Adapter-Primers im wesentlichen identisch mit einer 3'-Ziel-Bindungssequenz eines zweiten Amplifikations-Primers ist, die zur Hybridisierung an eine zweite Ziel-Sequenz befähigt ist;

c) Extension des ersten Adapter-Primers mit Polymerase zur Bildung eines zweiten Extensionsproduktes und Verdrängung des zweiten Extensionsproduktes;

d) Hybridisierung des zweiten Amplifikations-Primers an das 3'-Ende der zweiten Ziel- Sequenz, wobei der zweite Amplifikations-Primer die 3'-Ziel-Bindungssequenz und eine 5'- Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym, das zum Nicken eines Stranges einer doppelstrangigen hemimodifizierten Erkennungsstelle für das Enzym befähigt ist, umfaßt, Extension des zweiten Amplifikations-Primers mit Polymerase zur Bildung eines dritten Extensionsproduktes, das zu der zweiten Ziel-Sequenz komplementär ist, und Verdrängung des dritten Extensionsproduktes;

e) Hybridisierung eines zweiten Adapter-Priiners an das dritte Extensionsprodukt am 3'- Ende des Komplements der zweiten Ziel-Sequenz, wobei das 3'-Ende des zweiten Adapter- Primers eine zur Hybridisierung an das dritte Extensionsprodukt befähigte Ziel- Bindungssequenz umfaßt und das 5'-Ende des zweiten Adapter-Primers im wesentlichen mit der Ziel-Bindungssequenz des ersten Amplifikations-Primers identisch ist;

f) Extension des zweiten Adapter-Primers mit Polymerase zur Bildung eines vierten Extensionsproduktes und Verdrängung des vierten Extensionsproduktes und

g) gleichzeitige Amplifizierung des zweiten und vierten Extensionsproduktes in einer SDA-Reaktion unter Verwendung der ersten und zweiten Amplifikations-Primer.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die ersten, zweiten, dritten und vierten Extensionsprodukte durch Extension von Bumper-Primem verdrängt werden.

3. Das Verfahren nach Anspruch 1, das weiters folgende Schritte umfaßt:

a) Hybridisierung des ersten Adapter-Primers an das 3'-Ende eines zweiten Stranges der ersten Ziel-Sequenz, Extension des ersten Adapter-Primers zur Bildung eines fünften Extensionsproduktes, das zu dem zweiten Strang der ersten Ziel-Sequenz komplementär ist, und Verdrängung des fünften Extensionsproduktes;

b) Hybridisierung des ersten Amplifikations-Primers an das fünfte Extensionsprodukt am 3'-Ende des Komplements des zweiten Stranges der ersten Ziel-Sequenz, Extension des ersten Amplifikations-Primers mit Polymerase zur Bildung eines siebenten Extensionsproduktes und Verdrängung des siebenten Extensionsproduktes;

c) Hybridisierung des zweiten Adapter-Primers an das 3'-Ende eines zweiten Stranges der zweiten Ziel-Sequenz, Extension des zweiten Adapter-Primers zur Bildung eines sechsten Extensionsproduktes, das zu dem zweiten Strang der zweiten Ziel-Sequenz komplementär ist, und Verdrängung des sechsten Extensionsproduktes;

d) Hybridisierung des zweiten Amplifikations-Prirners an das sechste Extensionsprodukt am 3'-Ende des Komplements des zweiten Stranges der zweiten Ziel-Sequenz, Extension des zweiten Amplifikations-Primers mit Polymerase zur Bildung eines achten Extensionsproduktes und Verdrängung des achten Extensionsproduktes sowie

e) gleichzeitige Amplifizierung der siebenten und achten Extensionsprodukte in der SDA- Reaktion unter Verwendung der ersten und zweiten Amplifikations-Primer.

4. Ein Verfahren zur gleichzeitigen Amplifizierung mehrfacher Ziel-Nucleinsäuresequenzen durch Strangverdrängungsamplifizierung (SDA), welches Verfahren umfaßt:

a) Hybridisierung eines ersten Adapter-Primers an das 3'-Ende jeder Ziel-Sequenz, wobei das 3'-Ende des Adapter-Primers eine zur Hybridisierung an die Ziel-Sequenz befähigte Ziel- Bindungssequenz umfaßt und das 5'-Ende des Adapter-Primers eine erste Adapter-Sequenz umfaßt;

b) Extension des ersten Adapter-Primers mit Polymerase zur Bildung eines ersten Extensionsproduktes für jede Ziel-Sequenz, das zu jeder Ziel-Sequenz komplementär ist, und Verdrängung des ersten Extensionsproduktes;

c) Hybridisierung eines zweiten Adapter-Primers an das erste Extensionsprodukt jeder Ziel-Sequenz am 3'-Ende des Komplements jeder Ziel-Sequenz, wobei das 3'-Ende des zweiten Adapter-Primers eine zur Hybridisierung an das erste Extensionsprodukt befähigte Ziel-Bindungssequenz umfaßt und das 5'-Ende des zweiten Adapter-Primers eine zweite Adapter-Sequenz umfaßt;

d) Extension des zweiten Adapter-Primers mit Polymerase zur Bildung eines zweiten Extensionsproduktes für jede Ziel-Sequenz, Verdrängung des zweiten Extensionsproduktes und

e) gleichzeitige Amplifizierung des zweiten Extensionsproduktes der Ziel-Sequenzen in einer SDA-Reaktion unter Verwendung von Amplifikations-Primem, welche 3'-Ziel-Bindungssequenzen, die im wesentlichen mit den ersten und zweiten Adapter-Sequenzen identisch sind, und 5'-Erkennungsstellen für ein Restriktionsenzym, das zum Nicken eines Stranges einer hemimodifizierten doppelstrangigen Erkennungsstelle für das Enzym befähigt ist, umfassen.

5. Das Verfahren nach Anspruch 4, in welchem die ersten und zweiten Adapter-Sequenzen im wesentlichen identisch sind und das zweite Extensionsprodukt jeder Ziel-Sequenz unter Verwendung eines einzigen Amplifikations-Primers amplifiziert wird.

6. Das Verfahren nach Anspruch 4, in welchem die ersten und zweiten Adapter-Sequenzen im wesentlichen nicht identisch sind und das zweite Extensionsprodukt jeder Ziel- Sequenz unter Verwendung eines Paars von Amplifikations-Primem amplifiziert wird, wobei einer der beiden eine Ziel-Bindungssequenz aufweist, die im wesentlichen mit der ersten Adapter-Sequenz identisch ist, und der andere der beiden eine Ziel-Bindungssequenz aufweist, die im wesentlichen mit der zweiten Adapter-Sequenz identisch ist.

7. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, in welchem die ersten und zweiten Extensionsprodukte durch Extension von Bumper-Primem verdrängt werden.

8. Das Verfahren nach Anspruch 4, das weiters folgende Schritte umfaßt:

a) Hybridisierung des zweiten Adapter-Primers an das 3'-Ende eines zweiten Stranges jeder Ziel-Sequenz, Extension des zweiten Adapter-Primers zur Bildung eines dritten Extensionsproduktes, das zu dem zweiten Strang jeder Ziel-Sequenz komplementär ist, und Verdrängung des dritten Extensionsproduktes;

b) Hybridisierung des ersten Adapter-Primers an das dritte Extensionsprodukt jeder Ziel- Sequenz am 3'-Ende des Komplements jeder Ziel-Sequenz, Extension des ersten Adapter- Primers zur Bildung eines vierten Extensionsproduktes und Verdrängung des vierten Extensionsproduktes und

c) gleichzeitige Amplifizierung des vierten Extensionsproduktes der Ziel-Sequenzen in der SDA-Reaktion unter Verwendung der Amplifikations-Primer.

9. Ein Verfahren zur gleichzeitigen Amplifizierung von zwei Ziel-Nucleinsäuresequenzen in einer Primer-Extensionsamplifizierungsreaktion, welches Verfahren umfaßt:

a) Hybridisierung eines ersten Amplifikations-Primers an das 3'-Ende einer ersten Ziel- Sequenz, wobei der erste Amplifikations-Primer eine 3'-Ziel-Bindungssequenz umfaßt, Extension des ersten Amplifikations-Primers mit Polymerase zur Bildung eines ersten Extensionsproduktes, das zu der ersten Ziel-Sequenz komplementär ist, und Verdrängung des ersten Extensionsproduktes;

b) Hybridisierung eines ersten Adapter-Primers an das erste Extensionsprodukt am 3'- Ende des Komplements der ersten Ziel-Sequenz, wobei das 3'-Ende des ersten Adapter- Primers eine zur Hybridisierung an das erste Extensionsproduktes befähigte Ziel-Bindungssequenz umfaßt und das 5'-Ende des ersten Adapter-Primers im wesentlichen mit einer 3'- Ziel-Bindungssequenz eines zweiten, zur Hybridisierung an eine zweite Ziel-Sequenz befähigten Amplifikations-Primers identisch ist;

c) Extension des ersten Adapter-Prirners mit Polymerase zur Bildung eines zweiten Extensionsproduktes und Verdrängung des zweiten Extensionsproduktes;

d) Hybridisierung der 3'-Ziel-Bindungssequenz des zweiten Amplifikations-Primers an das 3'-Ende der zweiten Ziel-Sequenz, Extension des zweiten Amplifikations-Primers mit Polymerase zur Bildung eines dritten Extensionsproduktes, das zu der zweiten Ziel-Sequenz komplementär ist, und Verdrängung des dritten Extensionsproduktes;

e) Hybridisierung eines zweiten Adapter-Primers an das dritte Extensionsprodukt am 3'- Ende des Komplements der zweiten Ziel-Sequenz, wobei das 3'-Ende des zweiten Adapter- Primers eine zur Hybridisierung an das dritte Extensionsprodukt befähigte Ziel- Bindungssequenz umfaßt und das 5'-Ende des zweiten Adapter-Primers im wesentlichen mit der Ziel-Bindungssequenz des ersten Amplifikations-Primers identisch ist;

f) Extension des zweiten Adapter-Primers mit Polymerase zur Bildung eines vierten Extensionsproduktes und Verdrängung des vierten Extensionsproduktes sowie

g) gleichzeitige Amplifizierung der zweiten und vierten Extensionsprodukte in einer Primer-Extensionsamplifizierungsreaktion unter Verwendung der ersten und zweiten Arnplifikations-Primer.

10. Ein Verfahren zur gleichzeitigen Amplifizierung mehrfacher Ziel-Nucleinsäuresequenzen in einer Primer-Extensionsamplifizierungsreaktion, welches Verfahren umfaßt:

b) Extension des ersten Adapter-Prlmers mit Polymerase zur Bildung eines ersten Extensionsproduktes für jede Ziel-Sequenz, das zu jeder Ziel-Sequenz komplementär ist, und Verdrängung des ersten Extensionsproduktes;

e) gleichzeitige Amplifizierung der zweiten Extensionsprodukte der Ziel-Sequenzen in einer Primer-Extensionsamplifizierungsreaktion unter Verwendung von Amplifikations- Primern, welche 3'-Ziel-Bindungssequenzen umfassen, die im wesentlichen mit den ersten und zweiten Adapter-Sequenzen identisch sind.