CN111757934A - 通过单向双重探针引物延伸的靶标富集 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于富集核酸文库中的至少一种靶标核酸的方法。第一寡核苷酸与具有第一和第二衔接子的核酸文库中的靶标核酸杂交。用第一聚合酶延伸杂交的第一寡核苷酸，由此产生包括所述靶标核酸和延伸的第一寡核苷酸的第一引物延伸复合物。捕获所述第一引物延伸复合物，其相对于所述核酸文库富集，且第二寡核苷酸与所述靶标核酸杂交。用第二聚合酶延伸杂交的第二寡核苷酸，由此产生包括所述靶标核酸和延伸的第二寡核苷酸的第二引物延伸复合物，且进一步从所述第一引物延伸复合物释放延伸的第一寡核苷酸。

Description

通过单向双重探针引物延伸的靶标富集
发明领域
本发明通常涉及富集样品中的核酸靶标，并且更具体地涉及富集用于核酸测序(包括高通量测序)的靶标。
背景
本发明属于一类允许使用者聚焦于待测序核酸内的目标区域的技术。这降低了与测序反应和随后的数据分析相关的成本。目前有三种一般类型的选择性捕获样品中存在的核酸内的目标区域的技术。第一种技术是杂交捕获，其中通过可以选择性结合至捕获表面的探针的杂交来捕获目标区域。该捕获允许除去非靶标核酸，随后释放和收集捕获的靶标分子。这种类型的技术具有优点，包括捕获外显子组大小的区域和包含未知结构变异的区域的能力。缺点包括长而复杂的方案，其倾向于花费超过8小时来完成。复杂性主要由在杂交前制备随机片段化的鸟枪文库的需求所引起。单独的杂交步骤可能需要三天来完成。这种类型的技术的实例包括SECAP EZ靶标富集系统(ROCHE)和SURESELECT靶标富集系统(AGILENT)。
靶标富集的另一种方法是基于双重靶标引物的扩增。在该方法中，在靶标的边界上使用两个探针来富集目标区域。所述方法倾向于花费少于8小时来完成，并且比杂交捕获方法更简单。然而，基于双重引物的技术不能富集具有未知结构变异的序列。最成熟的双重引物方法是多重聚合酶链式反应(PCR)。这是一个非常简单的单一过程，但在每个反应管只能扩增数十种靶标。目前可用其他更新的技术，包括TRUSEQ扩增子测序试剂盒(ILLUMINA)和ION TORRENT AMPLISEQ测序试剂盒(LIFE TECHNOLOGIES)产品，其能够在单个反应管中扩增数百至数千种靶标，并且仅需要几个处理步骤。
第三种技术是基于单靶标引物的扩增。在该方法中，通过扩增由单个靶标引物和末端连接的通用引物限定的区域来富集靶标。类似于基于杂交的方法；这些技术需要在靶标寡核苷酸的选择性杂交之前产生随机片段化的鸟枪文库。然而，不是使用该寡核苷酸来捕获靶标并洗掉非靶标分子，而是采用扩增步骤，其选择性扩增随机产生的末端和靶标特异性寡核苷酸之间的区域。该技术的优点在于，不同于双重引物技术，其允许检测具有未知结构变异的序列。它比基于杂交的技术更快且更简单。然而，这种类型的技术仍比基于双重引物的方法更慢且更复杂。这种类型的技术的实例是ARCHER的锚定多重PCR (ARCHER DX)和OVATION靶标富集系统(NUGEN)。
对于也将容纳靶标序列中未知的结构变异的快速和简单的靶标富集的方法，仍然存在未满足的需求。
概述
根据一个实施方案，本发明提供了用于富集核酸文库中的至少一种靶标核酸的方法。所述方法包括将第一寡核苷酸与核酸文库中的靶标核酸杂交。所述核酸文库中的核酸各自具有包含第一衔接子的第一末端和包含第二衔接子的第二末端。所述方法进一步包括用第一聚合酶延伸杂交的第一寡核苷酸，由此产生包含所述靶标核酸和延伸的第一寡核苷酸的第一引物延伸复合物。所述方法进一步包括捕获所述第一引物延伸复合物，相对于所述核酸文库富集所述第一引物延伸复合物，将第二寡核苷酸与所述靶标核酸杂交，和用第二聚合酶延伸杂交的第二寡核苷酸，由此产生包含所述靶标核酸和延伸的第二寡核苷酸的第二引物延伸复合物，由此从所述第一引物延伸复合物释放延伸的第一寡核苷酸。所述方法进一步包括用第三聚合酶、第一扩增引物和第二扩增引物扩增所述靶标核酸，所述第一扩增引物具有与第一衔接子互补的3’末端，且所述第二扩增引物具有与第二衔接子互补的3’末端。
在一个方面，所述方法进一步包括对扩增的靶标核酸进行测序。
在另一个方面，所述第一寡核苷酸包含捕获部分。
在另一个方面，捕获所述第一引物延伸复合物包括在固体支持物上捕获所述捕获部分。
在另一个方面，所述捕获部分是生物素，且所述固体支持物包含链霉抗生物素蛋白。
在另一个方面，在将所述第一寡核苷酸与靶标核酸杂交之前将所述第一寡核苷酸结合至固体支持物，并且将所述第一寡核苷酸与所述靶标核酸杂交和用聚合酶延伸杂交的第一寡核苷酸，由此将所述第一引物延伸复合物捕获在所述固体支持物上。
在另一个方面，在延伸杂交的第一寡核苷酸之后进行捕获所述第一引物延伸复合物。
在另一个方面，所述方法进一步包括将至少一个修饰的核苷酸并入所述第一引物延伸复合物中的延伸的第一寡核苷酸和所述第二引物延伸复合物中的延伸的第二寡核苷酸中的至少一个。
在另一个方面，所述修饰的核苷酸选自dUTP和具有捕获部分的核苷酸。
在另一个方面，所述方法进一步包括将至少一个修饰的核苷酸并入所述第一引物延伸复合物中的延伸的第一寡核苷酸，所述至少一个修饰的核苷酸具有捕获部分。
在另一个方面，捕获所述第一引物延伸复合物包括在固体支持物上捕获所述捕获部分。
在另一个方面，所述方法进一步包括将至少一个尿嘧啶并入所述第一引物延伸复合物中的延伸的第一寡核苷酸和所述第二引物延伸复合物中的延伸的第二寡核苷酸中的至少一个，由此形成含有尿嘧啶的寡核苷酸产物。
在另一个方面，所述方法进一步包括消化所述含有尿嘧啶的寡核苷酸产物。
在另一个方面，用尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂合酶中的至少一种来消化所述含有尿嘧啶的寡核苷酸产物。
在另一个方面，所述DNA糖基化酶-裂合酶选自核酸内切酶IV和核酸内切酶VIII。
在另一个方面，所述方法进一步包括使所述核酸文库与阻断寡核苷酸接触。
在另一个方面，所述阻断寡核苷酸与所述第一衔接子和所述第二衔接子中的至少一个至少部分互补。
在另一个方面，所述阻断寡核苷酸是通用阻断寡核苷酸。
在另一个方面，所述第一衔接子和所述第二衔接子具有相同的核酸序列。
在另一个方面，所述第一衔接子和所述第二衔接子具有不同的核酸序列。
在另一个方面，所述第一衔接子和所述第二衔接子是分叉的衔接子。
在另一个方面，所述第一衔接子和所述第二衔接子包含至少一个尿嘧啶。
在另一个方面，所述第一聚合酶和所述第二聚合酶中的至少一种是尿嘧啶不相容的聚合酶。
在另一个方面，所述第三聚合酶是尿嘧啶相容的聚合酶。
在另一个方面，所述第二寡核苷酸在所述第一寡核苷酸的5’位置处与所述靶标核酸杂交。
在另一个方面，所述第三聚合酶是尿嘧啶不相容的聚合酶。
在另一个方面，所述第一衔接子、所述第二衔接子、所述第一扩增引物和所述第二扩增引物中的至少一种包含独特标识符(UID)序列、分子标识符(MID)序列中的至少一种。
根据另一个实施方案，本发明提供了用于富集核酸文库中的至少一种靶标核酸的试剂盒。所述试剂盒包括与核酸文库中的靶标核酸互补的第一寡核苷酸，所述核酸文库中的核酸各自具有包括第一衔接子的第一末端和包括第二衔接子的第二末端。所述试剂盒进一步包括与所述靶标核酸互补的第二寡核苷酸、第一扩增引物和第二扩增引物。所述第一寡核苷酸包含捕获部分，所述第二寡核苷酸在所述第一寡核苷酸的5’位置处与所述靶标核酸杂交，且所述第一扩增引物具有与所述第一衔接子互补的3’末端，且所述第二扩增引物具有与第二衔接子互补的3’末端。
根据另一个实施方案，本发明提供了用于富集核酸文库中的至少一种靶标核酸的试剂盒。所述试剂盒包括与核酸文库中的靶标核酸互补的第一寡核苷酸，所述核酸文库中的核酸各自具有包括第一衔接子的第一末端和包括第二衔接子的第二末端。所述试剂盒进一步包括具有捕获部分的修饰核苷酸、与所述靶标核酸互补的第二寡核苷酸、第一扩增引物和第二扩增引物。所述第二寡核苷酸在所述第一寡核苷酸的5’位置处与所述靶标核酸杂交，且所述第一扩增引物具有与所述第一衔接子互补的3’末端，且所述第二扩增引物具有与第二衔接子互补的3’末端。
在一个方面，所述试剂盒进一步包括尿嘧啶核苷酸、尿嘧啶相容的聚合酶、尿嘧啶不相容的聚合酶和阻断寡核苷酸中的至少一种。
根据另一个实施方案，本发明提供了包括核酸文库的组合物，所述核酸文库包括至少一种靶标核酸。所述核酸文库中的核酸各自具有包含第一衔接子的第一末端、包含第二衔接子的第二末端和在所述第一衔接子和所述第二衔接子之间的目标区域。所述组合物进一步包括与所述靶标核酸的目标区域杂交的延伸的第一寡核苷酸。所述延伸的第一寡核苷酸包括至少一个捕获部分。所述组合物进一步包括与所述至少一个捕获部分结合的固体支持物、在第一延伸的寡核苷酸的5’位置处与所述靶标核酸杂交的第二寡核苷酸，和与所述第二寡核苷酸的3’末端缔合的聚合酶。
在一个方面，所述组合物进一步包括与所述第一衔接子和所述第二衔接子各自杂交的阻断寡核苷酸。
在另一个方面，所述至少一个捕获部分位于所述延伸的第一寡核苷酸的5’末端。
在另一个方面，将所述至少一个捕获部分并入所述延伸的第一寡核苷酸的延伸部分。
在另一个方面，所述延伸的第一寡核苷酸进一步包含至少一个尿嘧啶和至少一个胸腺嘧啶。
在另一个方面，所述聚合酶是尿嘧啶不相容的聚合酶。
在另一个方面，所述第一衔接子和所述第二衔接子中的至少一个包含至少一个尿嘧啶和至少一个胸腺嘧啶。
在另一个方面，用具有选自链置换活性、5’至3’核酸外切酶活性和侧翼核酸内切酶活性的活性的酶实现从所述第一引物延伸复合物释放所述延伸的第一寡核苷酸。
本发明的前述和其他方面以及优点将从以下描述显而易见。在说明书中，参考形成其一部分的附图，并且在附图中通过举例说明的方式显示本发明的优选实施方案。然而，此类实施方案不一定代表本发明的全部范围，并且因此，参考权利要求和本文用于解释本发明的范围。
附图简述
图1是举例说明根据本发明的用于富集核酸文库中的至少一种靶标核酸的方法的一个实施方案的示意性流程图。
图2是根据本发明的用于富集核酸文库中的至少一种靶标核酸的方法的第一个实施方案的示意图。在举例说明的实施方案中，第一寡核苷酸包括用于溶液相捕获靶标核酸的捕获部分。
图3是根据本发明的用于富集核酸文库中的至少一种靶标核酸的方法的又第二个实施方案的示意图。在举例说明的实施方案中，第一寡核苷酸结合至固相支持物上用于原位捕获靶标核酸。
图4是根据本发明的用于富集核酸文库中的至少一种靶标核酸的方法的又第三个实施方案的示意图。在举例说明的实施方案中，在与靶标核酸杂交的第一寡核苷酸的延伸期间并入一个或多个捕获部分，由此使得能够在固体支持物上捕获包括靶标核酸和延伸的第一寡核苷酸的复合物。
图5是表现出分子间衔接子-衔接子杂交的文库分子中的多种核酸的示意图。
图6A是来自电泳DNA分析仪的源自人基因组DNA并使用市售文库制备试剂盒用通用衔接子末端序列调整的核酸文库的荧光输出迹线。在1 µL 10 ng文库和1 µL 100 ng文库分别标准PCR扩增5和12个循环后，收集数据。根据本发明，对核酸文库进行采样并富集靶标核酸。
图6B是在根据本发明的引物延伸靶标富集和扩增后图6A的核酸文库的基于荧光的大小分析。
图7是条形图，其描绘图6B的富集的核酸文库的高水平测序指标。超过99%的测序读数映射至已知存在于文库中的序列，且约一半的测序读数映射至富集的靶标核酸。对于60℃和65℃的第一寡核苷酸引物退火温度，文库的80倍碱基罚分分别是1.4和1.5。在三个条形的每个簇中，显示映射的修剪读数百分比(左)、填补的靶标核酸的碱基百分比(中心)和映射的非重复读数中靶百分比(右)的数据。
详述
I. 定义
在本申请中，除非另外从上下文清楚，否则(i)术语“一个/种”可以理解为意指“至少一个/种”；(ii)术语“或”可以理解为意指“和/或”；(iii)术语“包含”和“包括”可以理解为涵盖逐项列出的组分或步骤，无论它们是单独呈现还是与一种或多种额外组分或步骤一起呈现；且(iv)术语“约”和“近似”可以理解为允许如本领域普通技术人员将理解的标准变异；且(v)在提供范围的情况下，包括端点。
衔接子：如本文所用，“衔接子”意指可以被添加至另一序列、以便将额外的特性输入该序列的核苷酸序列。衔接子可以是单链或双链的，或者可以同时具有单链部分和双链部分。
近似：如本文所用，如应用于一个或多个目标值的术语“近似”或“约”，是指类似于所述参考值的值。在某些实施方案中，术语“近似”或“约”是指落入所述参考值的任一方向(大于或小于)的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小内的值的范围，除非另有说明或另外从上下文明显(除了此类数字会超过可能值的100%)。
与…相关：当该术语在本文中使用时，如果一个事件或实体的存在、水平和/或形式与另一个事件或实体的存在、水平和/或形式相关，则两个事件或实体与彼此“相关”。例如，如果特定实体(例如，多肽、遗传标记、代谢产物等)的存在、水平和/或形式与疾病、病症或病况(例如，在相关人群间)的发生和/或对疾病、病症或病况(例如，在相关人群间)的易感性相关，则认为该特定实体(例如，多肽、遗传标记、代谢产物等)与特定疾病、病症或病况相关。在一些实施方案中，如果两个或更多个实体直接或间接地相互作用，则它们在物理上与彼此“相关”，使得它们与彼此物理接近和/或保持与彼此物理接近。在一些实施方案中，与彼此物理相关的两个或更多个实体与彼此共价连接；在一些实施方案中，与彼此物理相关的两个或更多个实体不与彼此共价连接，但例如借助氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、磁性及其组合非共价相关。
条形码：如本文所用，“条形码”意指为分子赋予身份的核苷酸序列。条形码可以为单个分子(及其拷贝)赋予独特身份。此条形码是独特ID (UID)。条形码可以为来自相同来源(例如，患者)的整个分子群体(及其拷贝)赋予身份。此条形码是多重ID (MID)。
生物样品：如本文所用，术语“生物样品”通常是指如本文所述获得自或源自目标生物来源(例如，组织、生物体或细胞培养物)的样品。在一些实施方案中，目标来源包含生物体、诸如动物或人，或由其组成。在一些实施方案中，生物样品包含生物组织或流体，或由其组成。在一些实施方案中，生物样品可以是或包含骨髓；血液；血液细胞；腹水；组织或细针活检样本；含细胞的体液；游离漂浮的核酸；痰液；唾液；尿液；脑脊液，腹膜液；胸膜液；粪；淋巴液；妇科液；皮肤拭子；阴道拭子；口腔拭子；鼻拭子；洗涤液或灌洗液，诸如导管灌洗液或支气管肺泡灌洗液；穿刺物；刮擦物；骨髓样本；组织活检样本；手术样本；其他体液，分泌物和/或排泄物；和/或来自其的细胞，等。在一些实施方案中，生物样品包含获得自个体的细胞，或由其组成。在一些实施方案中，获得的细胞是或包括来自从其获得样品的个体的细胞。在一些实施方案中，样品是通过任何适当的手段直接获得自目标来源的“原代样品”。例如，在一些实施方案中，通过选自活检(例如，细针穿刺或组织活检)、手术、收集体液(例如，血液、淋巴液、粪便等)等的方法获得原代生物样品。在一些实施方案中，如从上下文中将显而易见，术语“样品”是指通过处理(例如，通过除去其中的一种或多种组分和/或通过向齐志红添加一种或多种试剂)原代样品获得的制备物。例如，使用半透膜过滤。此类“处理的样品”可以包括例如从样品提取的或通过使原代样品经受技术诸如mRNA的扩增或逆转录、某些组分的分离和/或纯化而获得的核酸或蛋白。
阻断寡核苷酸：与反应混合物中存在的另一种核酸互补且能够与这种核酸杂交以防止这种核酸的不期望的杂交的寡核苷酸。这种另一种核酸可以是合成核酸，例如，引物或衔接子。当将所述引物或衔接子并入文库核酸分子中时，可以发生待防止的不期望的杂交。所述阻断寡核苷酸不必与待保护免于不期望的杂交的核酸完美互补，但必须形成足够稳定的杂交体，以防止不期望的杂交发生。为此，所述阻断寡核苷酸可以包含通用碱基或Tm-修饰的碱基。
包含：本文描述为“包含”一个或多个命名要素或步骤的组合物或方法是开放式的，意味着命名要素或步骤是必不可少的，但在所述组合物或方法的范围内可以添加其他要素或步骤。应当理解，描述为“包含(comprising)”(或其“包含(comprises)”)一个或多个命名要素或步骤的组合物或方法还描述相应的、更有限的组合物或方法“基本上由相同的命名要素或步骤组成”(或其“基本上由相同的命名要素或步骤组成”)，意味着所述组合物或方法包括命名的基本要素或步骤，并且还可以包括不实质性影响所述组合物或方法的基本和新型特征的额外要素或步骤。还应理解，本文描述为“包含一个或多个命名要素或步骤”或“基本上由一个或多个命名要素或步骤组成”的任何组合物或方法也描述相应的、更有限的和封闭式的组合物或方法“由命名要素或步骤组成”(或“由命名要素或步骤组成”)，以排除任何其他未命名要素或步骤。在本文公开的任何组合物或方法中，任何命名的必要要素或步骤的已知或公开的等同物可以置换该要素或步骤。
设计的：如本文所用，术语“设计的”是指这样的试剂，(i)其结构由人工选择，(ii)通过需要人工的方法产生；和/或(iii)与天然物质和其他已知试剂不同。
测定：阅读本说明书的本领域普通技术人员将理解，“测定”可以利用或通过使用本领域技术人员可用的各种技术(包括例如本文明确提及的特定技术)中的任一种来完成。在一些实施方案中，测定涉及操纵物理样品。在一些实施方案中，测定涉及考虑和/或操纵数据或信息，例如利用适于执行相关分析的计算机或其他处理单元。在一些实施方案中，测定涉及从来源接收相关信息和/或材料。在一些实施方案中，测定涉及将样品或实体的一种或多种特征与可比较的参考进行比较。
同一性：如本文所用，术语“同一性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合分子的序列至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一，则它们被认为与彼此“基本上同一”。例如，两个核酸或多肽序列的同一性百分比计算可以通过出于最佳比较目的比对两个序列来进行(例如，可以为了最佳比对在第一和第二序列中的一个或两个中引入空位，并且出于比较目的，可以忽略不相同的序列)。在某些实施方案中，为了比较目的比对的序列的长度是参考序列的长度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或基本上100%。然后比较相应位置处的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的残基(例如核苷酸或氨基酸)占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的百分比同一性是所述序列共有的相同位置的数目的函数，其考虑空位的数目以及每个空位的长度，其需要引入以用于两个序列的最佳比对。两个序列之间的序列比较和百分比同一性的确定可以使用数学算法来完成。例如，可以使用已被并入ALIGN程序(2.0版)的Meyers和Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17)的算法确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。在一些示例性实施方案中，用ALIGN程序进行的核酸序列比较使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。或者，可以使用GCG软件包中的GAP程序使用NWSgapdna.CMP矩阵确定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。
连接位点：如本文所用，“连接位点”是可以便于连接的核酸分子的一部分(不同于双链分子的平末端)。存在于两个分子上的“相容连接位点”使得两个分子能够与彼此优先结合。
样品：如本文所用，术语“样品”是指作为或含有目标组合物用于定性和/或定量评价的物质。在一些实施方案中，样品是生物样品(即，来自生物(例如，细胞或生物体)。在一些实施方案中，样品来自地质、水生、天文或农业来源。在一些实施方案中，目标来源包含生物体、诸如动物或人，或由其组成。在一些实施方案中，用于法医分析的样品是或包含生物组织、生物流体、有机或非有机物质，诸如例如衣物、污垢、塑料、水。在一些实施方案中，农业样品包含有机物质，诸如叶子、花瓣、树皮、木材、种子、植物、果实等。
单链连接：如本文所用，“单链连接”是以至少一个单链底物开始并且通常涉及一个或多个双链或部分双链衔接子的连接程序。
固体支持物：如本文所用，“固体支持物”是指能够与捕获部分相互作用的任何固体材料。固体支持物可以是能够悬浮于溶液中的溶液相支持物(例如，玻璃珠、磁珠或其他类似的颗粒)或固相支持物(例如硅晶片、载玻片等)。溶液相支持物的实例包括超顺磁性球形聚合物颗粒，诸如来自INVITROGEN的DYNABEADS磁珠，或磁性玻璃颗粒，诸如在美国专利656568、6274386、7371830、6870047、6255477、6746874和6255851中所述。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出目标特征或特性的总的或接近总的程度或等级的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果有的话)去完成和/或继续完成或达到或避免绝对结果。因此，在本文中使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学现象中固有的完整性的潜在缺失。
合成的：如本文所用，词语“合成的”意指由人工产生，并且因此呈自然界中不存在的形式，因为其具有自然界中不存在的结构，或者因为其与其在自然界中不与之相关的一种或多种其他组分相关，或者不与其在自然界中不与之相关的一种或多种其他组分相关。
通用引物：如本文所用，“通用引物”和“通用引发位点”是指不是天然存在于靶标序列中的引物和引发位点。通常，所述通用引发位点存在于衔接子或靶标特异性引物中。所述通用引物可以结合至通用引发位点并指导从通用引发位点的引物延伸。
变体：如本文所用，术语“变体”是指这样的实体，其显示与参考实体的显著的结构同一性，但与参考实体相比在一个或多个化学部分的存在或水平上与参考实体在结构上不同。在许多实施方案中，变体在功能上也与其参考实体不同。通常，是否将特定实体适当地视为参考实体的“变体”基于其与参考实体的结构同一性的程度。如本领域技术人员将理解，任何生物或化学参考实体都具有某些特征性结构要素。根据定义，变体是共有一个或多个此类特征性结构要素的独特化学实体。仅举几个实例，小分子可以具有特征性核心结构要素(例如，大环核心)和/或一个或多个特征性侧基部分，使得小分子的变体是共有核心结构要素和特征性侧基部分、但在其他侧基部分和/或在核心内存在的键的类型(单键 vs 双键，E vs Z等)方面不同的变体，多肽可以具有由在线性或三维空间中相对于彼此具有指定的位置和/或有助于特定生物功能的多个氨基酸构成的特征性序列要素，核酸可以具有由在线性或三维空间中相对于另一者具有指定的位置的多个核苷酸残基构成的特征性序列要素。例如，由于氨基酸序列中的一个或多个差异和/或共价连接至多肽骨架的化学部分(例如，碳水化合物、脂质等)中的一个或多个差异，变体多肽可以与参考多肽不同。在一些实施方案中，变体多肽显示与参考多肽的总体序列同一性为至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%。可替代地或另外地，在一些实施方案中，变体多肽不与参考多肽共有至少一个特征性序列要素。在一些实施方案中，所述参考多肽具有一种或多种生物活性。在一些实施方案中，变体多肽共有参考多肽的生物活性中的一种或多种。在一些实施方案中，变体多肽缺乏参考多肽的生物活性中的一种或多种。在一些实施方案中，与参考多肽相比，变体多肽显示降低水平的一种或多种生物活性。在许多实施方案中，如果目标多肽具有的氨基酸序列除了在特定位置处的少量序列改变以外与亲本的氨基酸序列相同，则认为目标多肽是亲本或参考多肽的“变体”。通常，与亲本相比，变体中的残基的少于20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%被置换。在一些实施方案中，变体与亲本相比具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个置换的残基。通常，变体具有非常少数目(例如，少于5、4、3、2或1个)的置换的功能残基(即，参与特定生物活性的残基)。此外，与亲本相比，变体通常具有不超过5、4、3、2或1个添加或缺失，并且经常不具有添加或缺失。此外，任何添加或缺失通常少于约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约10、约9、约8、约7、 6个残基，且通常少于约5、约4、约3或约2个残基。在一些实施方案中，变体也可以具有一种或多种功能缺陷和/或可以另外被认为是“突变体”。在一些实施方案中，所述亲本或参考多肽是自然界中发现的多肽。如本领域普通技术人员将理解，在自然界中通常可以发现特定目标多肽的多种变体，特别是当目标多肽是感染剂多肽时。
II. 某些实施方案的详述
对于许多核酸富集技术，可能有用的是，首先提供鸟枪核酸文库，由此将源自样品的更长的核酸序列细分为与短读取测序技术相容的较小片段(即，约50-500个核苷酸)。为了制备鸟枪文库，将高分子量核酸链(通常为cDNA或基因组DNA)剪切成随机片段，任选地通过连接共有末端序列(即，衔接子)进行修饰，并选择大小用于下游处理和分析。例如，在鸟枪文库中选择性捕获核酸子集可能是有用的。
目前，存在两种通用类别的捕获技术：基于杂交的捕获和基于扩增的捕获。基于杂交的捕获方法提供以下优点：与仅复制和回收原始文库片段的子集相比，使得能够回收整个原始鸟枪文库片段。然而，与基于扩增的方法相比，与基于杂交的捕获相关的中靶率通常较低。值得注意的是，由于需要对脱靶捕获产物进行测序，较低的中靶率导致测序能力的浪费。此外，相对于基于扩增的方法，与基于杂交的捕获方法相关的工作流程可能复杂，其具有长周转时间。相比之下，尽管基于扩增的方法(诸如锚定多重PCR方法)相对于基于杂交的方法提供工作流程简单、周转时间更快和靶向率更高的优点，但仍然有几个缺点。例如，扩增后并入文库片段的靶标特异性引物序列导致测序能力浪费。此外，文库片段不一定代表原始鸟枪文库，因为模板必需在靶标特异性引物结合位点处截短。因此，对于也将容纳靶标序列中未知的结构变异的快速和简单的靶标富集的方法，仍然存在未满足的需求。
可以用根据本发明的通过单向双重探针引物延伸的靶标富集的方法克服这些和其他挑战。在一个方面，本发明描述了基于单向双重探针引物延伸的富集的一般方法及其改进。为此，本发明提供了引物延伸和基于杂交的捕获至固体支持物上用于从靶标核酸文库富集一种或多种靶标核酸的组合。本发明进一步提供了总体工作流程，其具有基于锚定的多重扩增的富集方法和杂交捕获方法的许多前述优点，而没有许多前述的缺点。相对于许多现有的基于杂交的捕获方法和基于锚定的多重扩增的捕获方法，本发明的试剂盒、组合物和方法的优点包括回收源自整个鸟枪分子的文库分子，简单的工作流程(例如，更少的总步骤和更少的动手时间)，快速的周转时间，更高的中靶率，和更低的总体材料成本。
在一个实施方案中，本发明是用于富集核酸文库中的至少一种靶标核酸的方法。所述方法可以包括将第一寡核苷酸与所述核酸文库中的靶标核酸杂交。所述核酸文库中的核酸各自被提供为具有包含第一衔接子的第一末端和包含第二衔接子的第二末端。所述方法进一步包括用第一聚合酶延伸杂交的第一寡核苷酸，由此产生包括所述靶标核酸和延伸的第一寡核苷酸的第一引物延伸复合物。
在一个方面，所述方法可以进一步包括捕获所述第一引物延伸复合物，和相对于所述核酸文库富集所述第一引物延伸复合物。在另一个方面，所述方法可以包括将第二寡核苷酸与所述靶标核酸杂交，和用第二聚合酶延伸杂交的第二寡核苷酸，由此产生包含所述靶标核酸和延伸的第二寡核苷酸的第二引物延伸复合物，由此从所述第一引物延伸复合物释放延伸的第一寡核苷酸。所述方法可以进一步包括用第三聚合酶、第一扩增引物和第二扩增引物扩增所述靶标核酸。所述第一扩增引物具有与第一衔接子互补的3’末端，且所述第二扩增引物具有与第二衔接子互补的3’末端。
所述第一、第二和第三聚合酶可以是任何合适的聚合酶。一种实例聚合酶是Taq或Taq-衍生的聚合酶(例如，来自KAPA BIOSYSTEMS的KAPA 2G聚合酶)。另一种实例聚合酶是B-家族DNA聚合酶(例如，来自KAPA BIOSYSTEMS的KAPA HIFI聚合酶)。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于富集核酸文库中的至少一种靶标核酸的试剂盒。所述试剂盒可以包括与所述核酸文库中的靶标核酸互补的第一寡核苷酸。所述核酸文库中的核酸各自具有包含第一衔接子的第一末端和包含第二衔接子的第二末端。所述试剂盒可以进一步包括与所述靶标核酸互补的第二寡核苷酸、第一扩增引物和第二扩增引物。所述第一寡核苷酸可以包括捕获部分。所述第二寡核苷酸可以在所述第一寡核苷酸的5’位置处与所述靶标核酸杂交。所述第一扩增引物具有与所述第一衔接子互补的3’末端，且所述第二扩增引物具有与第二衔接子互补的3’末端。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于富集核酸文库中的至少一种靶标核酸的试剂盒。所述试剂盒可以包括与核酸文库中的靶标核酸互补的第一寡核苷酸。所述核酸文库中的核酸各自可以具有包含第一衔接子的第一末端和包含第二衔接子的第二末端。所述试剂盒可以进一步包括具有捕获部分的修饰核苷酸、与所述靶标核酸互补的第二寡核苷酸、第一扩增引物和第二扩增引物。所述第二寡核苷酸在所述第一寡核苷酸的5’位置处与所述靶标核酸杂交，且所述第一扩增引物具有与所述第一衔接子互补的3’末端，且所述第二扩增引物具有与第二衔接子互补的3’末端。
在又另一个实施方案中，本发明提供了包括核酸文库的组合物，所述核酸文库包括至少一种靶标核酸。所述核酸文库中的核酸各自具有包含第一衔接子的第一末端、包含第二衔接子的第二末端和在所述第一衔接子和所述第二衔接子之间的目标区域。所述组合物进一步包括与所述靶标核酸的目标区域杂交的延伸的第一寡核苷酸。所述延伸的第一寡核苷酸包括至少一个捕获部分。所述组合物进一步包括与所述至少一个捕获部分结合的固体支持物、在第一延伸的寡核苷酸的5’位置处与所述靶标核酸杂交的第二寡核苷酸，和与所述第二寡核苷酸的3’末端缔合的聚合酶。
本发明的方法可以用作测序方案(包括高通量单分子测序方案)的一部分。本发明的方法产生待测序的靶标核酸的文库。文库中的靶标核酸可以并入用于分子鉴定和样品鉴定的条形码。
本发明包括至少一个用靶标特异性引物的线性引物延伸步骤。所述线性延伸步骤与本领域中实施的指数扩增相比具有几个优点。每种靶标核酸的特征在于独特的合成速率，其取决于靶标特异性引物的退火速率和聚合酶可以通过特定靶标序列读取的速率。延伸速率和合成速率的差异造成了偏差，其可导致单轮合成的轻微差异。然而，在PCR期间，所述轻微差异变得指数扩增。所得差距被称为PCR偏差。所述偏差可掩盖样品中每个序列的初始数量的任何差异，并排除任何定量分析。
本发明将靶标特异性引物(包括基因特异性引物和偶然对基因组内的结合位点特异性的简并引物)的延伸限定至单个步骤。任何指数扩增都用不受模板依赖性偏差影响或者比靶标特异性引物受偏差影响更小的通用引物进行。
现在参考图1，通过单向双重探针引物延伸的靶标富集的方法100包括制备核酸文库片段的步骤102。在一个方面，所述核酸文库片段可以从包括一种或多种靶标核酸的任何核酸来源制备。通常，靶标核酸将包括目标区域或序列，并且方法100使得能够相对于核酸文库中的非靶标核酸优先富集一种或多种靶标核酸，用于那些目标区域或序列的下游检测和分析。
继续参考步骤102，任选地将核酸片段化，并将衔接子连接至核酸的每个末端。用于制备用于本发明使用的核酸片段文库的实例方法包括转座子介导的片段化和标记，机械剪切，酶促消化，突出端(例如，T/A)或平末端连接，模板转换介导的衔接子连接，等及其组合。最终，制备核酸文库片段的步骤102的产物可以产生核酸文库，其中所述核酸文库中的核酸各自具有包含第一衔接子的第一末端和包含第二衔接子的第二末端。值得注意的是，所述第一和第二衔接子可以相同或不同，并且可以进一步呈现各种形态，包括但不限于具有互补部分和非互补部分的分叉或Y-形衔接子，平末端衔接子，突出端衔接子，发夹衔接子等及其组合。通常，前述衔接子的至少一部分是双链的；然而，其他衔接子构型也可以用于制备根据本发明的核酸片段的文库。此外，在发夹衔接子的情况下，包括阻断元件(例如，3’双脱氧核苷酸或磷酸酯基团)以防止自引发事件可能是有用的。
方法100的下一步骤104可以包括将第一寡核苷酸引物与核酸文库中存在的靶标核酸杂交，由此形成未延伸的第一引物-靶标复合物。在一个实施方案中，所述第一寡核苷酸引物是具有与靶标核酸的序列互补的限定序列的靶标特异性引物。靶标特异性引物的一个实例是基因特异性引物，其经设计为与目标基因(例如，cDNA、基因组DNA)杂交或在其附近(例如，其上游或5’侧)。所述靶标核酸可以是RNA、DNA或其组合。所述第一寡核苷酸引物可以是由核糖核酸、脱氧核糖核酸、修饰的核酸(例如，生物素化的，锁定的核酸，肌苷，Seela碱基等)或本领域中已知的其他核酸类似物构成的寡核苷酸引物。
在本发明的各个实施方案中，所述第一寡核苷酸引物可以包括一个或多个修饰的碱基、捕获部分或其组合。在所述第一寡核苷酸引物包括捕获部分的情况下，在将所述第一寡核苷酸引物与靶标核酸杂交的步骤104之前，可以将所述第一寡核苷酸引物附接至固体支持物或在溶液中游离(即，未结合或以其他方式附接至固体支持物)。在其中包括捕获部分的第一寡核苷酸引物不经由所述捕获部分附接至固体支持物的实施方案中，步骤104可以在溶液中实施。在其中包括捕获部分的第一寡核苷酸引物经由所述捕获部分附接至固体支持物的实施方案中，步骤104可以原位实施。值得注意的是，在原位反应的情况下，所得未延伸的引物-靶标复合物将附接至固体支持物。通过将溶液与结合引物-靶标复合物的固相支持物分开，可以除去溶液中保留的任何非靶标核酸或未与第一寡核苷酸引物退火的靶标核酸。
方法100的下一步骤106包括进行第一引物延伸反应。在一个方面，步骤106包括用第一聚合酶延伸杂交的第一寡核苷酸引物。在步骤104中将第一寡核苷酸引物与靶标核酸模板杂交后，通过第一聚合酶延伸第一寡核苷酸引物，由此生成包括延伸的第一寡核苷酸引物的3’区域的第一引物延伸产物或复合物，所述3’区域包含靶标核酸模板的至少一部分的反向互补物。如本文所述，杂交和延伸反应任选地同时进行，而在其他实施方案中，杂交和延伸反应分别(例如，依次)进行并且可以通过从反应混合物除去未退火且未被捕获的靶标核酸的洗涤步骤来分离。而且，步骤104可以进一步包括终止引物延伸反应，以控制延伸的第一寡核苷酸引物的长度。值得注意的是，所述延伸的第一寡核苷酸引物产物的长度可以通过技术诸如使步骤104中添加的聚合酶失活的技术来主动地控制，或者通过使得反应能够完成诸如通过消耗限制性反应物或通过控制/选择方法100的步骤102中的核酸文库中的核酸片段的大小来被动地控制。
方法100进一步包括捕获所述第一引物延伸复合物的步骤108。第一引物延伸复合物的捕获可以以如本文公开的各种方式实现，并且可以在方法100的步骤104和步骤106中的任一个之前、同时或之后实现。如上所述，所述第一寡核苷酸可以包括捕获部分，其可以用于在方法100的步骤104或步骤106之前、期间或之后将第一寡核苷酸引物捕获至固体支持物上。在另一个实例中，在与靶标核酸杂交后延伸第一寡核苷酸引物包括并入一个或多个修饰的核苷酸。修饰的核苷酸可以包括捕获部分，或者可以被配置为使得能够对修饰的核苷酸进行下游修饰，以将捕获部分附接或以其他方式并入第一引物延伸复合体的延伸部分中。因此，可以通过与一个或多个修饰的核苷酸缔合的捕获部分，在步骤106期间或之后捕获第一引物延伸复合物。是否捕获靶标核酸、退火的引物-靶标复合物或靶标延伸的引物复合物的选择进一步确定该方法的步骤104和步骤106在溶液中还是原位进行。
方法100的下一步骤110可以包括富集第一引物延伸复合物。在一个方面，步骤110包括一个或多个纯化和富集步骤，其用于从文库中的非靶标核酸和其他分子、诸如未使用的反应组分(例如，核苷酸、引物分子、ATP等)、酶、缓冲液等回收第一引物延伸复合物。在一些实施方案中，步骤110包括酶促消化、基于大小排阻的纯化、基于亲和力的纯化等或其组合。值得注意的是，可以相对于核酸文库的整体来测量第一引物延伸产物的富集。在一个方面，富集涉及通过耗竭(即，除去)不是靶标核酸的核酸文库的其他成员来增加靶标核酸的浓度。
方法100的下一步骤112可以包括将第二寡核苷酸引物与核酸文库中存在的靶标核酸杂交。在一个方面，第二寡核苷酸引物是结合靶标核酸内的目标区域(和与第一衔接子和第二衔接子中的一者或两者杂交或互补相反)的靶标特异性引物。在另一个方面，靶标核酸是在步骤112期间第一引物延伸复合物的一部分。例如，第二寡核苷酸引物可以在相对于第一引物延伸复合物中的延伸的第一寡核苷酸引物的5’位置(即，上游)处与靶标核酸杂交。在这种情况下，所得的未延伸的第二引物-靶标复合物包括第一延伸的寡核苷酸引物、与第一延伸的寡核苷酸引物杂交的靶标核酸和第二(未延伸的)寡核苷酸引物。在第一引物延伸产物在步骤112期间附接至固体支持物的情况下，未延伸的第二引物-靶复合物将类似地附接至固体支持物。在其他实施方案中，在步骤112中，(例如，在从反应混合物除去非靶标核酸之后)，第一引物延伸产物从固体支持物游离并且在溶液中以使得第二寡核苷酸引物能够溶液杂交。
方法100的下一步骤114包括进行第二引物延伸反应。在步骤112中第二寡核苷酸引物与靶标核酸模板杂交后，通过第二聚合酶延伸第二寡核苷酸引物，由此生成包括靶标核酸的第二引物延伸产物或复合物。延伸的第二寡核苷酸引物包括3’区域，所述3’区域包含靶标核酸模板的至少一部分的反向互补物。在一个方面，用第二聚合酶延伸第二寡核苷酸引物从具有靶标核酸的复合物释放延伸的第一寡核苷酸引物。从第一引物延伸复合物释放延伸的第一寡核苷酸可以包括链置换(例如，通过聚合酶)或消化(例如，通过核酸酶)中的一种或多种。例如，可以用具有链置换活性、5’至3’核酸外切酶活性和侧翼核酸内切酶活性中的至少一种的酶来释放延伸的第一寡核苷酸。
如本文所述，步骤112和步骤114任选地同时执行，而在其他实施方案中，步骤112和步骤114分开(例如，依次)进行。而且，步骤114可以进一步包括终止引物延伸反应，以控制延伸的第二寡核苷酸引物的长度。值得注意的是，所述延伸的第二寡核苷酸引物产物的长度可以通过技术诸如使步骤114中添加的聚合酶失活的技术来主动地控制，或者通过使得反应能够完成诸如通过消耗限制性反应物或通过控制/选择核酸文库中的核酸片段的大小来被动地控制。
在延伸的第一引物包括附接至固体支持物的一个或多个捕获部分的情况下，在步骤114中延伸的第一寡核苷酸的释放导致产生第二引物延伸复合物，其在溶液中游离，而不是附接至固体支持物。因此，如方法100的步骤110中所述，可以在步骤114后实施一种或多种纯化技术，以便从支持物附接的第一延伸寡核苷酸引物、第二聚合酶、其他反应组分等及其组合回收未结合的包括靶标核酸的第二延伸产物或复合物。
方法100进一步包括扩增的步骤116。步骤116可以涉及线性或指数扩增(例如，PCR)。通常，步骤116包括用第三聚合酶、第一扩增引物和第二扩增引物扩增所述靶标核酸。在一个方面，将第一和第二扩增引物设计为与步骤102中并入核酸文库中的靶标核酸的衔接子的序列互补。例如，所述第一扩增引物可以具有与所述第一衔接子互补的3’末端，且所述第二扩增引物可以具有与所述第二衔接子互补的3’末端。然而，用于扩增的引物可以包括所扩增的靶标核酸内存在的任何序列(例如，基因/靶标特异性引物、通用引物等)，并且可以支持一条或两条链的合成(即，对应于扩增反应的模板的双链核酸的顶部和底部链两者)。
在一些实施方案中，步骤116使得能够从核酸文库选择性扩增靶标核酸，而不是扩增源自靶标核酸的第一或第二延伸寡核苷酸引物中的任一者。在一个实例中，在步骤106和步骤114中实施的一个或两个延伸反应中包括尿嘧啶相容的聚合酶和dUTP。由该反应产生的延伸的寡核苷酸引物将包括至少一个尿嘧啶核苷酸，而靶标核酸模板可以是不具有尿嘧啶核苷酸的DNA模板。此后，在步骤116中包括尿嘧啶不相容的聚合酶，用于扩增靶标核酸。尿嘧啶不相容的聚合酶可以扩增没有尿嘧啶核苷酸的靶标核酸；然而，尿嘧啶不相容的聚合酶将不能复制含有尿嘧啶的延伸的寡核苷酸引物。可替代地或另外，可以选择性消化或以其他方式降解含有尿嘧啶的产物，由此仅留下来自核酸文库的原始分子。
在扩增的步骤116之后，方法100可以包括分析扩增的靶标核酸的步骤118。步骤116可以包括用于测定方法100的一种或多种产物的核酸序列的任何方法。步骤116可以进一步包括序列比对，序列变异的鉴定，独特引物延伸产物的计数等，或其组合。
除了在方法100中概述的本发明的要素之外，在实施本文所述的试剂盒、组合物和方法时，考虑许多额外考量也可能是有用的。在一个方面，所述引物杂交步骤由引物的靶标特异性区域介导。在一些实施方案中，所述靶标特异性区域能够与位于基因的外显子、内含子或非翻译部分或基因的未转录部分(例如启动子或增强子)中的基因的区域杂交。在一些实施方案中，所述基因是蛋白编码基因，但在其他实施方案中，所述基因不是蛋白编码基因，诸如RNA编码基因或假基因。在还有其他实施方案中，所述靶标特异性区域位于基因间区域中。对于mRNA或cDNA靶标，所述引物可以包含寡聚-dT序列。
替代预先设计的靶标特异性区域，引物可以含有简并序列(即随机引入核苷酸串)。此引物也可以在基因组内找到结合位点，并且充当该结合位点的靶标特异性引物。值得注意的是，每个核苷酸位置都是简并的完全简并引物可能不用于靶向富集。然而，其中仅一部分核苷酸位置是简并的部分简并引物可用于根据本发明的用途。例如，在单个核苷酸位置处具有部分简并性的引物可用于捕获包括一个或多个单核苷酸多态性(SNP)的靶标序列。
除了靶标特异性区域之外，所述引物可以包含额外的序列。在一些实施方案中，这些序列位于所述靶标特异性区域的5’-末端。在其他实施方案中，可以在引物内别处包括这些序列，只要靶标特异性区域能够与靶标杂交并驱动引物延伸反应，如下所述。所述引物内的额外序列可以包括一个或多个条形码序列，诸如独特的分子鉴定序列(UID)或多重样品鉴定序列(MID)。所述条形码序列可以作为单个序列或两个或更多个序列存在。
在一些实施方案中，所述额外序列包括便于连接至引物的5’-末端的序列。所述引物可以含有通用连接序列，其使得能够连接如以下部分中所述的衔接子。
在一些实施方案中，所述额外序列包括一个或多个通用扩增引物的一个或多个结合位点。
所述引物延伸步骤通过核酸聚合酶进行。取决于所分析的核酸的类型，所述聚合酶可以是DNA依赖性DNA聚合酶(“DNA聚合酶”)或RNA依赖性DNA聚合酶(“逆转录酶”)。
在一些实施方案中，期望控制在引物延伸反应中合成的核酸链的长度。如下所述，该链的长度决定经受该方法的后续步骤和任何下游应用的核酸的长度。延伸反应可以通过本领域已知的任何方法来终止。例如，所述反应可以通过温度转换或添加聚合酶抑制剂物理停止。在一些实施方案中，所述反应通过将反应物置于冰上来停止。在其他实施方案中，所述反应通过提高温度以使非热稳定聚合酶失活来终止。在还有其他实施方案中，通过添加能够螯合酶的关键辅因子的螯合剂(诸如EDTA)或能够可逆地或不可逆地使酶失活的另一种化学或生物物质化合物来终止反应。
控制引物延伸产物的长度的另一种方法是通过限制关键组分(例如，dNTP)以直接限制延伸长度或限制Mg2+以减慢延伸速率并改善控制延伸停止点的能力来限制(starving)延伸反应。本领域技术人员能够在实验上或理论上确定允许有限引物延伸以主要产生所需长度产物的关键组分的适当量。
控制引物延伸产物的长度的另一种方法是添加终止子核苷酸，包括可逆的终止子核苷酸。本领域技术人员能够在实验上或理论上确定允许有限引物延伸以主要产生所需长度产物的终止子和非终止子核苷酸的适当比率。终止子核苷酸的实例包括双脱氧核苷酸，如Gelfand等人的美国专利号8,163,487中所述的2'-磷酸核苷酸，3’-O-置换的可逆终止子，和如例如Zhuo等人的美国专利申请公开号2014/0242579和Guo, J.,等人, Four-color DNA sequencing with 3′-O-modified nucleotide reversible terminators and chemically cleavable fluorescent dideoxynucleotides, P.N.A.S. 2008 105 (27)9145-9150中所述的 3’未置换的可逆终止子。控制引物延伸产物的长度的又另一种方法是向引物延伸反应中添加有限量的尿嘧啶(dUTP)。含尿嘧啶的DNA然后可以用尿嘧啶-N-DNA糖基化酶处理以产生无碱基位点。具有无碱基位点的DNA可通过以任选添加碱进行热处理而降解，以改善降解效率，如Gupta等人的美国专利号8,669,061中所述。本领域技术人员能够在实验上或理论上确定扩增反应中dUTP与dTTP的适当比例，其允许在核酸内切酶处理后有限地包括dUTP以主要产生期望长度产物。
在一些实施方案中，延伸产物的长度固有地受输入核酸的长度限制。例如，存在于母体血浆中的无细胞DNA长度低于200bp，其中大部分长度为166bp。Yu, S.C.Y., 等人, Size-based molecular diagnostics using plasma DNA for noninvasive prenatal testing, PNAS USA 2014; 111(23):8583-8。在健康个体和癌症患者的血浆中发现的无细胞DNA的中值长度为约185-200bp。Giacona, M.B.,等人, Cell-free DNA in human blood plasma: length measurements in patients with pancreatic cancer and healthy controls, Pancreas 1998; 17(1):89-97。保存不佳或化学处理的样品可含有化学或物理降解的核酸。例如，福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPET)通常产生平均长度为150bp的核酸。
在一些实施方案中，本发明的方法在通过DNA聚合酶或逆转录酶进行引物延伸之后包括一个或多个纯化步骤。所述纯化将除去未使用的引物分子和用于产生引物延伸产物的模板分子。在一些实施方案中，通过外切核酸酶消化来除去模板核酸和除了延伸的引物以外的所有核酸片段。在该实施方案中，用于引物延伸的引物可以具有使得引物和任何延伸产物对外切核酸酶消化具有抗性的5’-末端修饰。此修饰的实例包括硫代磷酸酯键。在其他实施方案中，可以通过节约DNA的酶促处理，诸如RNase消化，包括RNA酶H消化来除去RNA模板。在还有其他实施方案中，通过尺寸排阻方法，例如凝胶电泳、色谱或等速电泳或差速电泳(epitachophoresis)，将引物和大尺寸模板DNA与延伸产物分开。
在一些实施方案中，纯化是通过亲和结合。在该实施方案的变型中，亲和力针对特定靶标序列(序列捕获)。在其他实施方案中，所述引物包含亲和标签。可以使用本领域已知的任何亲和标签，诸如生物素或抗体或特异性抗体存在的抗原。亲和标签的亲和配偶体可以存在于溶液中，例如溶液相固体支持物、诸如悬浮的颗粒或珠粒上，或者结合至固相支持物。在亲和纯化的过程中，反应混合物的未结合组分被洗掉。在一些实施方案中，采取额外步骤来除去未使用的引物。在一些实施方案中，亲和力捕获改变引物延伸产物的电荷。例如，包括一个或多个生物素化的核苷酸并使之结合链霉抗生物素蛋白在新生核酸链上产生改变的电荷。改变的电荷可用于通过等速电泳或差速电泳分离新生链(引物延伸产物)。
值得注意的是，本发明的方法不需要连接步骤(例如，将共有序列添加至延伸的第一或第二寡核苷酸引物)。然而，在一些实施方案中，本发明包括连接步骤。例如，可以将均聚物尾部添加至核酸的3’末端。在该实施方案中，所述均聚物可以充当反向互补均聚物的结合位点(类似于具有用于mRNA的聚-T引物的聚-A尾部)。所述连接将一个或多个衔接子序列添加至前一步骤中产生的引物延伸产物。所述衔接子序列提供一个或多个通用引发位点(用于扩增或测序)以及任选一个或多个条形码。连接衔接子的确切模式是不重要的，只要所述衔接子变得与引物延伸产物缔合并且能够实现下面描述的后续步骤。
在上面描述的一些实施方案中，所述方法涉及包括通用引发序列(“引发位点”)的靶标特异性引物并产生具有单一引发位点的引物延伸产物。在此类实施方案中，仅需要提供一个额外的引发序列(“引发位点”)以实现指数扩增。在其他实施方案中，所述靶标特异性引物不包括通用引发位点。在此类实施方案中，需要提供两个引发位点以实现指数扩增。具有通用引发位点的衔接子可以通过本领域可用的任何单链连接方法添加。
在延伸引物包含通用连接位点的实施方案中，可以使用单链连接方法的一个实例。在此类实施方案中，具有与引物中的通用连接位点互补的双链区和单链突出端的衔接子可以退火并连接。衔接子的单链3’-突出端与引物的5’-末端的通用连接位点的退火产生在含有引物延伸产物的链中具有缺口的双链区域。两条链可以通过DNA连接酶或另一种酶或可以催化引物延伸产物的5’-磷酸酯和衔接子的3’-OH之间的反应的非酶促试剂在切口处连接。通过连接衔接子，所述连接在引物延伸产物的一个末端提供通用引发位点。
单链连接方法的另一个实例可用于将通用引发位点添加至引物延伸产物的相对末端(或者在延伸引物不包含通用连接位点的实施方案中，添加至延伸产物的两侧)。对于该实施方案，待连接的引物延伸产物的一个或两个末端不具有通用连接位点。此外，在一些实施方案中，待连接的引物延伸产物的至少一个末端具有未知序列(例如，由于随机终止事件或未知序列变异)。在此类实施方案中，采用序列非依赖性的单链连接方法。一种示例性方法描述于美国申请公开号20140193860中。本质上，该方法使用其中单链3’-末端突出端不具有通用连接位点的衔接子群体具有随机序列，例如随机六聚体序列。在该方法的一些实施方案中，所述衔接子也具有发夹结构。另一个实例是由ACCEL-NGS 1S DNA文库试剂盒(Swift Biosciences, Ann Arbor, Mich.)实现的方法。
该方法的连接步骤利用连接酶或具有相似活性的另一种酶或非酶试剂。所述连接酶可以是例如病毒或细菌来源的DNA或RNA连接酶，诸如T4或大肠杆菌连接酶，或热稳定连接酶Afu、Taq、Tfl或Tth。在一些实施方案中，可以使用替代酶，例如拓扑异构酶。此外，非酶促试剂可用于在引物延伸产物的5’-磷酸酯和衔接子的3’-OH之间形成磷酸二酯键，如Bevilacqua等人的美国专利申请公开2014/0193860中所述和参考。
在该方法的一些实施方案中，所述衔接子的第一连接随后为任选的引物延伸。连接的衔接子具有游离的3’-末端，其可以延伸以产生双链核酸。与衔接子相对的末端则将变得适合于另一衔接子的平末端连接。为了避免需要单链连接程序，分子的该双链末端可通过任何连接酶或另一种酶促或非酶促方式连接至双链衔接子。所述双链衔接子序列提供一个或多个通用引发位点(用于扩增或测序)以及任选一个或多个条形码。
在一些实施方案中，本发明的方法包括在连接步骤之后的一个或多个纯化步骤。所述纯化将除去未使用的衔接子分子。通过尺寸排阻方法，例如凝胶电泳、色谱或等速电泳，将衔接子和大尺寸连接产物与延伸产物分开。
在一些实施方案中，纯化是通过亲和结合。在该实施方案的变型中，亲和力针对特定靶标序列(序列捕获)。在其他实施方案中，所述衔接子包含亲和标签。可以使用本领域已知的任何亲和标签（例如生物素或抗体或其特异性抗体存在的抗原）。亲和标签的亲和配偶体可以与溶液相支持物(例如在悬浮的颗粒或珠粒上)缔合，或者结合至固相支持物。在亲和纯化的过程中，反应混合物的未结合组分被洗掉。在一些实施方案中，采取额外步骤来除去未使用的衔接子。
在一些实施方案中，本发明包括扩增步骤。该步骤可以涉及线性或指数扩增(例如PCR)。用于扩增的引物可以包括存在于所扩增的核酸内的任何序列，并且可以支持一条或两条链的合成。扩增可能是等温的或涉及热循环。
在一些实施方案中，所述扩增是指数的并涉及PCR。期望减少PCR扩增偏差。如果使用一种或多种基因特异性引物以降低偏差，则该方法涉及有限数量的扩增循(例如约10个或更少的循环)。在这些实施方案中的其他变型中，使用通用引物来合成两条链。所述通用引物序列可以是一个或两个连接的衔接子的原始延伸引物的一部分。可以使用一个或两个通用引物。上述延伸引物和一个或两个衔接子可以被工程改造成具有相同的引物结合位点。在该实施方案中，可以使用单个通用引物来合成两条链。在其他实施方案中，待扩增的分子的一侧的延伸引物(或衔接子)和另一侧的衔接子含有不同的通用引物结合位点。通用引物可以与另一个通用引物(具有相同或不同的序列)配对。在其他实施方案中，所述通用引物可以与基因特异性引物配对。因为使用通用引物的PCR具有降低的序列偏差，所以扩增循环的数量不需要在与使用基因特异性引物的PCR相同的程度上被限制。使用通用引物的扩增循环数可以是低的，但也可以高达约20、30或更多个循环。
本发明包括使用分子条形码。所述条形码通常由4至36个核苷酸组成。在一些实施方案中，条形码被设计成具有在彼此的10℃或更少内的解链温度。条形码可以设计成形成最低限度的交叉杂交集合，即在期望的反应条件下尽可能少地与彼此形成稳定的杂交体的序列的组合。用于序列鉴定和计数的条形码的设计、放置和使用是本领域已知的。参见例如美国专利号7,393,665、8,168,385、8,481,292、8,685,678和8,722,368。
条形码可用于鉴定样品中的每个核酸分子及其子代(即，使用原始核酸分子产生的核酸分子的集合)。此类条形码是“独特的ID”(UID)。
条形码也可用于鉴定所分析的核酸分子来源的样品。此类条形码是“多重样品ID”(“MID”)。源自相同样品的所有分子都共有相同的MID。
条形码包含每个条形码特征性的核苷酸的独特序列。在一些实施方案中，条形码的序列是预先设计的。在其他实施方案中，所述条形码序列是随机的。条形码内的全部或一些核苷酸可以是随机的。已知序列内的随机序列和随机核苷酸碱基分别被称为“简并序列”和“简并碱基”。在一些实施方案中，分子包含两个或更多个条形码：一个用于分子鉴定(UID)，一个用于样品鉴定(MID)。有时，UID或MID每个都包含几个条形码，其当一起使用时可以鉴定分子或样品。
在一些实施方案中，反应中UID的数量可以超过待标记的分子的数量。在一些实施方案中，使用一个或多个条形码来将序列分组或归仓(bin)。例如，在一些实施方案中，使用一个或多个UID来将序列分组或归仓(bin)，其中每个仓中的序列含有相同的UID，即是衍生自单个靶标分子的扩增子。在一些实施方案中，使用UID来比对序列。在其他实施方案中，所述靶标特异性区域用于比对序列。在本发明的一些实施方案中，在初始引物延伸事件中引入UID，而在连接的衔接子中引入样品条形码(MID)。
已进行连接之后，核酸产物可以被测序。可以通过本领域已知的任何方法进行测序。特别有利的是高通量单分子测序。此类技术的实例包括454 LIFE SCIENCES GS FLX平台(454 LIFE SCIENCES)、ILLUMINA HISEQ平台(ILLUMINA)、ION TORRENT平台(LIFETECHNOLOGIES)、利用SMRT测序技术的PACIFIC BIOSCIENCES平台(PACIFIC BIOSCIENCES)以及任何其他目前存在的或未来的单分子测序技术，其涉及或不涉及边测序边合成。在这些实施方案的变型中，所述测序利用存在于一个或两个衔接子序列中或一个或两个引物序列中的通用引物位点。在这些实施方案中的还有的其他变型中，基因特异性引物被用于测序。然而，应注意的是，与基因特异性引物相比，通用引物与降低的测序偏差有关。
在一些实施方案中，所述测序步骤涉及序列比对。在一些实施方案中，使用比对来确定来自多个序列(例如具有相同的独特分子ID (UID)的多个序列)的共有序列。在一些实施方案中，使用比对来鉴定序列变异，例如单核苷酸变异(SNV)。在一些实施方案中，从全部具有相同UID的多个序列确定共有序列。在其他实施方案中，使用UID来消除人为结果，即存在于单个分子(特征在于特定UID)的子代中的变异。可以使用UID来消除由PCR误差或测序误差导致的这些人为结果。
在一些实施方案中，可以通过定量具有相同多重样品ID (MID)的群体中的具有每个UID的序列的相对数量来定量样品中的每个序列的数量。每个UID代表原始样品中的单个分子，并且计数与每个序列变体相关的不同UID可以确定原始样品中每个序列变体的分数，其中所有分子都共有相同的MID。本领域技术人员将能够确定测定共有序列所必需的序列读数的数目。在一些实施方案中，相关数目是精确定量结果所必需的每个UID的读数(“序列深度”)。在一些实施方案中，期望深度是每个UID 5-50个读数。
在本发明的方法中使用的样品包含含有核酸的任何个体(例如人，患者)或环境样品。所述多核苷酸可以从样品中提取，或者样品可以直接进行本发明的方法。起始样品也可以是提取或分离的核酸、DNA或RNA。所述样品可以构成从生物体获得的任何组织或流体。例如，所述样品可以是肿瘤活检样品或血液或血浆样品。在一些实施方案中，所述样品是福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)样品。所述样品可以包含来自一种或多种来源(例如一个或多个患者)的核酸。在一些实施方案中，所述组织可以被病原体感染，并因此含有宿主和病原体的核酸。
DNA提取的方法是本领域众所周知的。参见J. Sambrook等人, "MolecularCloning: A Laboratory Manual," 1989, 第2版, Cold Spring Harbor LaboratoryPress: New York, N.Y.)。各种试剂盒可商售用于从生物样品提取核酸(DNA或RNA)(例如，BD BIOSCIENCES CLONTECH (Palo Alto, Cal.)，EPICENTRE TECHNOLOGIES (Madison,Wisc.)；GENTRA SYSTEMS, INC. (Minneapolis, Minn.)；和QIAGEN, INC. (Valencia,Cal.)，AMBION, INC. (Austin, Tex.)；BIORAD LABORATORIES (Hercules, Cal.)；等等。
在一些实施方案中，本发明的方法中使用的起始样品是文库，例如包含多种多核苷酸的基因组文库或表达文库。在其他实施方案中，通过本发明的方法产生文库。在起始材料是生物样品的情况下，该方法产生扩增文库或代表各种或序列的扩增子集合。文库可以被储存和使用多次，用于进一步扩增或测序文库中的核酸。
根据本发明的一个实施方案，用于引物延伸靶标富集的方法可以包括溶液中引物介导的靶标核酸的捕获。现在转向图2A-2E，核酸文库包括靶标核酸200，所述靶标核酸200包括目标区域(ROI) 202 (图2A)。靶标核酸200进一步包括包含第一衔接子204的第一末端和包含第二衔接子206的第二末端。在图2A-2E中，靶标核酸200作为单链核酸举例说明，所述单链核酸具有位于靶标核酸200的3’末端(即，第一末端)的第一衔接子204和位于靶标核酸200的5’末端(即，第二末端)的第二衔接子206。第一寡核苷酸208与核酸文库中的靶标核酸200杂交。第一寡核苷酸208包括与靶标核酸互补的3’靶标-特异性区域210和捕获部分212。在举例说明的实施方案中，靶标-特异性区域210与ROI 202互补。
如图2B中所示，用第一聚合酶(未显示)延伸杂交的第一寡核苷酸208，由此产生包含靶标核酸200和延伸的第一寡核苷酸216的第一引物延伸复合物214(其中虚线指示延伸的第一寡核苷酸216的延伸部分)。第一引物延伸复合物214被捕获在固体支持物218上。固体支持物可以是溶液相支持物(例如，珠粒或另一种类似的颗粒)，或固相支持物(例如，硅晶片、载玻片等)。例如，可以使用在美国专利656568、6274386、7371830、6870047、6255477、6746874和6255851中描述的磁性玻璃颗粒和采用其的装置。在图2B中举例说明的实施方案中，第一引物延伸复合物214经由捕获部分212捕获在固体支持物上。捕获后，相对于核酸文库富集第一引物延伸复合物214。
转向图2C，第二寡核苷酸220与靶标核酸200杂交。第二寡核苷酸220与靶标核酸200互补，并且在相对于第一寡核苷酸208的靶标特异性区域210的5’位置处与靶标核酸200杂交。在举例说明的实施方案中，第二寡核苷酸220在刚刚ROI 202之外的位置处与靶标核酸200互补并杂交；然而，应理解，第一寡核苷酸208和第二寡核苷酸220可以被设计为在沿着靶标核酸200的长度的任何限定位置处杂交，其中所述第二寡核苷酸220在相对于第一寡核苷酸208的靶标特异性区域210的5’位置处与靶标核酸200杂交。从图2C可以看出，第一延伸寡核苷酸216(其附接至固体支持物218)和第二寡核苷酸220两者均与靶标核酸200杂交。
参考图2D，用第二聚合酶(未显示)延伸杂交的第二寡核苷酸220，由此产生包括靶标核酸200和延伸的第二寡核苷酸224的第二引物延伸复合物222(其中虚线指示延伸的第二寡核苷酸224的延伸部分)。在一个方面，杂交的第二寡核苷酸220的延伸从第一引物延伸复合物214释放延伸的第一寡核苷酸216。在另一个方面，延伸的第一寡核苷酸216(包括第一寡核苷酸引物208)保持附接至固体支持物218。
如图2E中所举例说明，用第三聚合酶(未显示)、第一扩增引物226和第二扩增引物228扩增靶标核酸200。第一扩增引物226包括与第一衔接子204互补的3’末端，且第二扩增引物228包括与第二衔接子206互补的3’末端。
根据本发明的另一个实施方案，用于引物延伸靶标富集的方法可以包括原位引物介导的靶标核酸的捕获。参考图3A和3B，核酸文库包括靶标核酸300，所述靶标核酸300包括目标区域(ROI) 302 (图3A)。靶标核酸300进一步包括包含第一衔接子304的第一末端和包含第二衔接子306的第二末端。在图3A和3B中，靶标核酸300作为单链核酸举例说明，所述单链核酸具有位于靶标核酸200的3’末端(即，第一末端)的第一衔接子304和位于靶标核酸300的5’末端(即，第二末端)的第二衔接子306。第一寡核苷酸308与核酸文库中的靶标核酸300杂交。第一寡核苷酸308包括与靶标核酸300互补的3’靶标-特异性区域310和捕获部分312。在举例说明的实施方案中，靶标-特异性区域310与ROI 302互补。
与图2A-2E中举例说明的实施方案相比，在第一寡核苷酸308与靶标核酸300杂交之前或同时，第一寡核苷酸308被捕获在固相支持物318上。固体支持物318可以是溶液相支持物(例如，珠粒或另一种类似的颗粒)，或固相支持物(例如，硅晶片、载玻片等)。在图3A中举例说明的实施方案中，第一寡核苷酸308经由捕获部分312被捕获在固体支持物318上。转向图2B，用第一聚合酶(未显示)延伸杂交的第一寡核苷酸308，由此产生包含靶标核酸300和延伸的第一寡核苷酸316的第一引物延伸复合物314(其中虚线指示延伸的第一寡核苷酸316的延伸部分)。值得注意的是，第一引物延伸复合物314被捕获在固体支持物318上，使得能够相对于核酸文库富集靶标核酸300。此后，可以如图2C和2D中所举例说明实施第二引物杂交和延伸反应，随后如图2E中所举例说明进行扩增步骤。
根据本发明的又另一个实施方案，用于引物延伸靶标富集的方法可以包括延伸介导的靶标核酸的捕获。参考图4A-4D，核酸文库包括靶标核酸400，所述靶标核酸400包括目标区域(ROI) 402 (图4A)。靶标核酸400进一步包括包含第一衔接子404的第一末端和包含第二衔接子406的第二末端。在图4A-4D中，靶标核酸400作为单链核酸举例说明，所述单链核酸具有位于靶标核酸400的3’末端(即，第一末端)的第一衔接子404和位于靶标核酸400的5’末端(即，第二末端)的第二衔接子406。第一寡核苷酸408与核酸文库中的靶标核酸400杂交。第一寡核苷酸408与靶标核酸400互补。值得注意的是，与图2A中包括捕获部分212的第一寡核苷酸208相比，第一寡核苷酸408不一定包括捕获部分。在图4A中举例说明的实施方案中，第一寡核苷酸408与ROI 402的部分互补。
如图4B中所示，用第一聚合酶(未显示)延伸杂交的第一寡核苷酸408，由此产生包含靶标核酸400和延伸的第一寡核苷酸416的第一引物延伸复合物414(其中虚线指示延伸的第一寡核苷酸416的延伸部分)。根据图4A-4D中举例说明的实施方案，在一个或多个修饰的核酸412存在的情况下进行第一寡核苷酸408的延伸。每个修饰的核酸包括捕获部分412a或者可以经历修饰以便在第一寡核苷酸416的延伸的同时或之后添加捕获部分412a。包括捕获部分412a的一个或多个修饰的核酸412的并入实现靶标核酸400在固体支持物418上的延伸介导的捕获。固体支持物418可以是溶液相支持物(例如，珠粒或另一种类似的颗粒)，或固相支持物(例如，硅晶片、载玻片等)。在图4B中举例说明的实施方案中，第一引物延伸复合物414经由包括捕获部分412a的修饰的核酸412被捕获在固体支持物418上。捕获后，相对于核酸文库富集第一引物延伸复合物414。
转向图4C，第二寡核苷酸420与靶标核酸400杂交。第二寡核苷酸420与靶标核酸400互补，并且在相对于第一寡核苷酸408的5’位置处与靶标核酸400杂交。在举例说明的实施方案中，第二寡核苷酸420在刚刚ROI 402之内的位置处与靶标核酸400互补并杂交；然而，应理解，第一寡核苷酸408和第二寡核苷酸420可以被设计为在沿着靶标核酸400的长度的任何限定位置处杂交，其中所述第二寡核苷酸420在相对于第一寡核苷酸408的靶标特异性区域410的5’位置处与靶标核酸400杂交。
继续参考图4C，用第二聚合酶(未显示)延伸杂交的第二寡核苷酸420，由此产生包括靶标核酸400和延伸的第二寡核苷酸424的第二引物延伸复合物422(其中虚线指示延伸的第二寡核苷酸224的延伸部分)。在用第二聚合酶延伸第二寡核苷酸420之前，第一延伸的寡核苷酸416(其附接至固相支持物418)和第二寡核苷酸420各自与靶标核酸400杂交。杂交的第二寡核苷酸420的延伸从第一引物延伸复合物414释放延伸的第一寡核苷酸416。在另一个方面，延伸的第一寡核苷酸416(包括第一寡核苷酸引物408和修饰的核酸412)保持附接至固体支持物418。
如图4D中所举例说明，用第三聚合酶(未显示)、第一扩增引物426和第二扩增引物428扩增靶标核酸400。第一扩增引物426包括与第一衔接子404互补的3’末端，且第二扩增引物428包括与第二衔接子406互补的3’末端。
在一个方面，核酸文库中的靶标和非靶标核酸可以表现出产生菊花链结构的分子间相互作用。如图5中所示，靶标核酸200(也参见图2A)包括ROI、第一衔接子204和第二衔接子206。第一寡核苷酸208与靶标核酸200杂交。第一寡核苷酸208包括3’靶标-特异性区域210和捕获部分212。核酸文库可以进一步包括一种或多种非靶标核酸，其包括第一非靶标核酸500和第二非靶标核酸500’。类似于靶标核酸200，第一非靶标核酸500和第二非靶标核酸500’各自包括分别包含第一衔接子504和504’的第一末端以及分别包含第二衔接子506和506’的第二末端。在一个方面，第一衔接子204与第一衔接子504至少部分互补，且第二衔接子506与第二衔接子506’至少部分互补。因此，靶标核酸200可以与非靶标核酸500和非靶标核酸500’形成菊花链，如图5中所举例说明。
在各种情况下，使菊花链结构的形成最小化或消除可能是有用的。例如，通过第一寡核苷酸208的杂交和延伸对靶标核酸200的捕获可以通过缔合来捕获非靶标核酸500和非靶标核酸500，其可以导致捕获和富集方法的特异性降低。为了减少核酸文库中的靶标和非靶标核酸的衔接子末端之间的分子间相互作用，可以将阻断寡核苷酸与衔接子末端序列杂交。
为了便于脱靶杂交的减少，阻断寡核苷酸具有与衔接子(例如，第一衔接子204和第二衔接子206)互补的序列，并且优先与这些衔接子序列杂交。阻断寡核苷酸可以以单重和多重形式使用。在期望多重化的情况下，可以将各种样品索引序列并入衔接子中。然而，这需要使用匹配的阻断寡核苷酸。在使用大量样品索引的情况下(例如，24、96等)，一种可能性是使用一种“通用”阻断寡核苷酸。所述通用阻断寡核苷酸具有独特的序列，包括能够结合大量不同样品索引序列的非天然核苷酸。作为结果，仅单个阻断寡核苷酸被添加至核酸样品。可替代地(或另外)，单个通用阻断寡核苷酸可以是共同构成通用阻断寡核苷酸组合物的寡核苷酸的混合物。
在一个方面，通用阻断寡核苷酸包括侧接第一和第二特异性区域的非特异性区域。非特异性区域包括例如当通用阻断寡核苷酸与靶标衔接子序列杂交时与样品索引序列对齐的一连串肌苷。通用阻断寡核苷酸的特异性区域与衔接子序列的不变部分互补，并且包括一个或多个解链温度(Tm)修饰的碱基，以增加阻断寡核苷酸-衔接子双链体的Tm。Tm-修饰的碱基替代物的实例在表1中举例说明。
表 1：
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在另一个方面，如果衔接子末端不彼此杂交，则可以在没有阻断寡核苷酸的情况下处理用两种不同的衔接子序列制备的未扩增的核酸文库。适用于该方法的衔接子类型包括分叉和Y-形衔接子。
实施例
实施例1：用溶液中引物介导的捕获的引物延伸靶标富集(PETE-Cap)
根据以下方案实施用溶液中引物介导的捕获的引物延伸靶标富集。根据制造商的说明，使用KAPA HYPERPLUS文库制备试剂盒，从10 ng和100 ng NA12878人类基因组DNA(CORIELL)制备重复的核酸文库，直至并包括0.8X连接后清洁步骤(图6A)。其后，根据图2中举例说明的实施方案，通过引物延伸靶标富集(包括溶液中引物介导的捕获)来富集核酸文库中的靶标核酸。对于每种目标基因(即，靶标)的相同外显子设计与靶标核酸的正链或负链互补的引物。第一(内部)寡核苷酸引物长20-25个核苷酸，且第二(外部)寡核苷酸引物长50-60个核苷酸。与第二寡核苷酸引物(与第一寡核苷酸引物相比)相关的额外长度是由于包括5’非互补尾序列。值得注意的是，可以省略5’非互补尾序列以减少第二寡核苷酸引物的全长。
根据表2设置第一寡核苷酸(内部)引物杂交和延伸反应。核酸文库由用如上所述的KAPA HYPERPLUS文库制备试剂盒制备的未扩增产物组成。反应中包括0.8X连接后清洁步骤后洗脱后回收的核酸文库的总体积；核酸文库的最终浓度尚未确定(n. d.)。主要混合物（Mastermix）由定制的KAPA 2G聚合酶PCR主要混合物组成。引物混合物由以等摩尔浓度存在的一组377种第一寡核苷酸靶标特异性内部引物组成。值得注意的是，第一寡核苷酸靶标特异性内部引物各自包括5’生物素捕获部分。
表 2：
Figure 297711DEST_PATH_IMAGE002
将第一寡核苷酸引物与核酸文库中的靶标核酸杂交，并根据表3中的热概况用聚合酶延伸约1小时的总时间。值得注意的是，表3中的方案省略了热循环的使用。
表 3
Figure DEST_PATH_IMAGE003
在用生物素化的第一寡核苷酸引物杂交并延伸后，将样品与DYNABEADS MYONE链霉抗生物素蛋白T1捕获珠粒(THERMO FISHER SCIENTIFIC)以1:1比率混合。在添加至DNA样品前，通过用1X结合和洗涤缓冲液洗涤两次和重悬浮于2X结合和洗涤缓冲液中，制备捕获珠粒。结合和洗涤缓冲液的组成列于表4中。
表 4
Figure 746009DEST_PATH_IMAGE004
在自动样品旋转器上，将样品与50μL MYONE捕获珠粒在室温下孵育10分钟。一旦生物素化的DNA已经与珠粒结合，将样品置于磁体上3分钟以捕获珠粒，并移取并丢弃上清液。将珠粒洗涤两次，用表3中描述的1X结合和洗涤缓冲液洗涤一次，并用10 mM Tris-HCl(pH 8.0)洗涤一次，以除去未生物素化的DNA。然后将珠粒重悬浮于20 μL 10 mM Tris-Cl(pH 8.0)中。
根据表5，将重悬浮的珠粒添加至第二寡核苷酸(外部)引物杂交反应混合物中。
表 5
Figure DEST_PATH_IMAGE005
将表5中列出的反应混合物在55℃下孵育165分钟，以使得第二寡核苷酸引物能够与核酸文库中的靶标核酸杂交，允许增加靶标捕获的特异性。
然后如先前所述洗涤和洗脱样品(即，用1x结合和洗涤缓冲液单次洗涤以及用10mM Tris-HCl单次洗涤，随后重悬浮于20 μL 10 mM Tris-HCl中)。
将重悬浮的珠粒添加至第二延伸反应中，导致第二寡核苷酸引物的延伸以及靶标核酸分子释放至溶液中。第二延伸反应的组成列于表6中。
表 6
Figure 56905DEST_PATH_IMAGE006
在第二延伸反应后，将样品在50℃下孵育2分钟，且然后直接置于冰上的磁体上1分钟。从样品移取上清液(不干扰珠粒)，并添加至等体积的KAPA PURE BEADS捕获珠粒(KAPA BIOSYSTEMS)中。进行1X清洁，并将样品洗脱于15μL 10 mM Tris-Cl (pH 8.0)中。
根据制造商对于KAPA HYPERPLUS文库制备试剂盒的说明，靶标富集方案的下一步骤是扩增反应和KAPA PURE BEAD捕获珠粒(KAPA BIOSYSTEMS)清洁。最终产物洗脱于25 μLTris-HCl中。然后根据制造商的说明，使用KAPA HYPERPLUS文库制备试剂盒(KAPABIOSYSTEMS)扩增和纯化富集的靶标核酸(图6B)。使用中等输出试剂盒在MINISEQ DNA测序仪(ILLUMINA)上对富集的扩增文库进行测序，其具有2×150 bp读数、1.6 pM负载浓度和1%PhiX DNA。使用开发用于分析SEQCAP EZ靶标富集系统(ROCHE)数据的管线处理所得测序数据，以评价靶标富集的程度(图7)。
在一个或多个实施方案中，本发明的所述特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合。在以下描述中，记载许多具体细节以提供系统的实施方案的透彻理解。然而，相关领域的技术人员将认识到，可以在没有特定细节中的一个或多个的情况下，或者在具有其他方法、组分、材料等等的情况下实践系统和方法。在其他情况下，没有详细显示或描述众所周知的结构、材料或操作，以避免使本发明的各方面不清楚。因此，前述描述意欲是示例性的，并且不限制本发明构思的范围。

Claims (15)

1.用于富集核酸文库中的至少一种靶标核酸的方法，所述方法包括：
将第一寡核苷酸与核酸文库中的靶标核酸杂交，所述核酸文库中的核酸各自具有包含第一衔接子的第一末端和包含第二衔接子的第二末端；
用第一聚合酶延伸杂交的第一寡核苷酸，由此产生包含所述靶标核酸和延伸的第一寡核苷酸的第一引物延伸复合物；
捕获所述第一引物延伸复合物；
相对于所述核酸文库富集所述第一引物延伸复合物；
将第二寡核苷酸与所述靶标核酸杂交；
用第二聚合酶延伸杂交的第二寡核苷酸，由此产生包含所述靶标核酸和延伸的第二寡核苷酸的第二引物延伸复合物，由此从所述第一引物延伸复合物释放延伸的第一寡核苷酸；和
用第三聚合酶、第一扩增引物和第二扩增引物扩增所述靶标核酸，所述第一扩增引物具有与所述第一衔接子互补的3’末端，且所述第二扩增引物具有与所述第二衔接子互补的3’末端。
2.权利要求1的方法，其进一步包括对扩增的靶标核酸进行测序。
3.权利要求1的方法，其中所述第一寡核苷酸包含捕获部分。
4.权利要求1的方法，在将所述第一寡核苷酸与靶标核酸杂交之前，将所述第一寡核苷酸与固相支持物结合，且其中将所述第一寡核苷酸与所述靶标核酸杂交和用聚合酶延伸杂交的第一寡核苷酸，由此将所述第一引物延伸复合物捕获在所述固体支持物上。
5.权利要求1的方法，其进一步包括将至少一个修饰的核苷酸并入所述第一引物延伸复合物中的延伸的第一寡核苷酸和所述第二引物延伸复合物中的延伸的第二寡核苷酸中的至少一个。
6.权利要求1的方法，其进一步包括将至少一个修饰的核苷酸并入所述第一引物延伸复合物中的延伸的第一寡核苷酸，所述至少一个修饰的核苷酸具有捕获部分。
7.权利要求1的方法，其进一步包括将至少一个尿嘧啶并入以下中的至少一个中：
所述第一引物延伸复合物中的延伸的第一寡核苷酸，和
所述第二引物延伸复合物中的延伸的第二寡核苷酸，
由此形成含有尿嘧啶的寡核苷酸产物。
8.权利要求1的方法，其进一步包括使所述核酸文库与阻断寡核苷酸接触。
9.权利要求1的方法，其中所述第一衔接子和所述第二衔接子是分叉的衔接子。
10.权利要求1的方法，其中所述第一衔接子和所述第二衔接子包含至少一个尿嘧啶。
11.权利要求1的方法，其中所述第二寡核苷酸在所述第一寡核苷酸的5’位置处与所述靶标核酸杂交。
12.权利要求1的方法，其中所述第一衔接子、所述第二衔接子、所述第一扩增引物和所述第二扩增引物中的至少一种包含独特标识符(UID)序列、分子标识符(MID)序列中的至少一种。
13.用于富集核酸文库中的至少一种靶标核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
与核酸文库中的靶标核酸互补的第一寡核苷酸，所述核酸文库中的核酸各自具有包含第一衔接子的第一末端和包含第二衔接子的第二末端；
与所述靶标核酸互补的第二寡核苷酸；
第一扩增引物；和
第二扩增引物，
其中所述第一寡核苷酸包含捕获部分，
其中所述第二寡核苷酸在所述第一寡核苷酸的5’位置处与所述靶标核酸杂交，且
其中所述第一扩增引物具有与所述第一衔接子互补的3’末端，且所述第二扩增引物具有与第二衔接子互补的3’末端。
14.用于富集核酸文库中的至少一种靶标核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
与核酸文库中的靶标核酸互补的第一寡核苷酸，所述核酸文库中的核酸各自具有包含第一衔接子的第一末端和包含第二衔接子的第二末端；
具有捕获部分的修饰的核苷酸；
与所述靶标核酸互补的第二寡核苷酸；
第一扩增引物；和
第二扩增引物，
其中所述第二寡核苷酸在所述第一寡核苷酸的5’位置处与所述靶标核酸杂交，且
其中所述第一扩增引物具有与所述第一衔接子互补的3’末端，且所述第二扩增引物具有与第二衔接子互补的3’末端。
15.组合物，其包含：
包含至少一种靶标核酸的核酸文库，所述核酸文库中的核酸各自具有包含第一衔接子的第一末端、包含第二衔接子的第二末端和在所述第一衔接子和所述第二衔接子之间的目标区域；
与所述靶标核酸的目标区域杂交的延伸的第一寡核苷酸，所述延伸的第一寡核苷酸包括至少一个捕获部分；
与至少一个捕获部分结合的固体支持物；
在第一延伸的寡核苷酸的5’位置处与所述靶标核酸杂交的第二寡核苷酸；和
与所述第二寡核苷酸的3’末端缔合的聚合酶。
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