JP2022120043A - 単一方向デュアルプローブプライマー伸長による標的濃縮 - Google Patents
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Abstract
Description
[0008]別の態様では、第1のオリゴヌクレオチドは、捕捉部分を含む。
[0009]別の態様では、第1のプライマー伸長複合体を捕捉することは、固体支持体上に捕捉部分を捕捉することを含む。
[0011]別の態様では、第1のオリゴヌクレオチドは標的核酸にハイブリダイズする前に、第1のオリゴヌクレオチドを固体支持体に結合しており、第1のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズし、ハイブリダイズした第1のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼで伸長することが、それにより、固体支持体上の第1のプライマー伸長複合体を捕捉する。
[0013]別の態様では、本方法は、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを、第1のプライマー伸長複合体中の伸長された第1のオリゴヌクレオチド及び第2のプライマー伸長複合体中の伸長された第2のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つに組み込むことをさらに含む。
[0015]別の態様では、本方法は、第1のプライマー伸長複合体中の伸長された第1のオリゴヌクレオチドに少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを組み込むことをさらに含み、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドは捕捉部分を有する。
[0017]別の態様では、本方法は、少なくとも1つのウラシルを第1のプライマー伸長複合体の伸長された第1のオリゴヌクレオチド及び第2のプライマー伸長複合体の伸長された第2のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つに組み込むこと、それによりウラシル含有オリゴヌクレオチド産物を形成することをさらに含む。
[0019]別の態様では、ウラシル含有オリゴヌクレオチド産物の消化は、ウラシルDNAグリコシラーゼ及びDNAグリコシラーゼリアーゼのうちの少なくとも1つを用いて達成される。
[0021]別の態様では、本方法は、核酸のライブラリーをブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させることをさらに含む。
[0023]別の態様では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチドである。
[0025]別の態様では、第1のアダプター及び第2のアダプターは、異なる核酸配列を有する。
[0027]別の態様では、第1のアダプター及び第2のアダプターは、少なくとも1つのウラシルを含む。
[0029]別の態様では、第3のポリメラーゼは、ウラシル適合性ポリメラーゼである。
[0031]別の態様では、第3のポリメラーゼは、ウラシル不適合性ポリメラーゼである。
[0038]別の態様では、少なくとも1つの捕捉部分は、伸長された第1のオリゴヌクレオチドの5’末端に位置する。
[0040]別の態様では、伸長された第1のオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのウラシル及び少なくとも1つのチミンをさらに含む。
[0042]別の態様では、第1のアダプター及び第2のアダプターの少なくとも1つは、少なくとも1つのウラシル及び少なくとも1つのチミンを含む。
[0053]本出願では、文脈からそうでないことが明らかでない限り、(i)「a」という用語は、「少なくとも1つ」を意味すると理解され得る;(ii)「又は」という用語は、「及び/又は」を意味すると理解され得る;(iii)「含む(comprising、including)」という用語は、それ自体で提示されるか、1つ又は複数の追加の成分又はステップと一緒に提示されるかにかかわらず、項目化された成分又はステップを包含すると理解され得る;並びに(iv)「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解される標準的な変動を許容するものと理解され得る;及び(v)範囲が指定されている場合、エンドポイントが含まれる。
[0072]多くの核酸濃縮技術において、最初に核酸のショットガンライブラリーを提供することは有用であり得、それにより、サンプルに由来するより長い核酸配列が、短いリード配列決定技術と互換性のあるより小さいフラグメントに細分される(すなわち、約50~500ヌクレオチド)。ショットガンライブラリーを準備するために、高分子量の核酸鎖(典型的には、cDNA又はゲノムDNA)は、ランダムなフラグメントに剪断され、場合により、共通の末端配列(すなわちアダプター)のライゲーションによって修飾され、下流の処理及び分析のためにサイズ選択される。例えば、ショットガンライブラリーの核酸のサブセットを選択的に捕捉することは有用であり得る。
ラーゼによって伸長され、それにより、標的核酸を含む第2のプライマー伸長産物又は複合体を生成する。伸長された第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸鋳型の少なくとも一部の逆相補体を含む3’領域を含む。一態様では、第2のポリメラーゼでの第2のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長は、伸長された第1のオリゴヌクレオチドプライマーを標的核酸との複合体から遊離させる。第1のプライマー伸長複合体から伸長された第1のオリゴヌクレオチドを遊離させることは、1つ又は複数の鎖置換(例えば、ポリメラーゼによる)、又は消化(例えば、ヌクレアーゼによる)を含み得る。例えば、伸長された第1のオリゴヌクレオチドの遊離は、鎖置換活性、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性、及びフラップエンドヌクレアーゼ活性の少なくとも1つを有する酵素で達成することができる。
ルヌクレオチドを有さない標的核酸を増幅できる;しかしながら、ウラシル不適合性ポリメラーゼは、ウラシルを含む伸長されたオリゴヌクレオチドプライマーの複製が不可能であろう。或いは、又はさらに、ウラシルを含む産物は、選択的に消化されるか、さもなければ分解され得、それによって、核酸のライブラリーからの元の分子のみが残る。
[0103]プライマー伸長ステップは、核酸ポリメラーゼによって行われる。分析される核酸の種類に依存して、ポリメラーゼはDNA依存性DNAポリメラーゼ(「DNAポリメラーゼ」)又はRNA依存性DNAポリメラーゼ(「逆転写酵素」)であってもよい。
noninvasive prenatal testing、PNAS USA 2014年;111(23):8583~8頁。健常者や癌患者の血漿中で見られる無細胞DNAの長さの中央値は、約185~200bpである。Giacona,M.B.ら、Cell-free DNA in human blood plasma:length measurements in patients with pancreatic cancer and healthy controls、Pancreas 1998年;17(1):89~97頁。保存が不十分であるか又は化学的に処理されたサンプルは、化学的又は物理的に分解された核酸を含む場合がある。例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋組織(FFPET)は、典型的には、平均150bpの長さの核酸を生成する。
よい。
決定するために必要な配列読み取りの数を決定することができるであろう。一部の実施形態では、関連する数は、正確な定量的結果のために必要であるUID(「配列深度」)あたりの読み取りである。一部の実施形態では、所望の深さは、UIDあたり5~50回の読み取りである。
は、第1のオリゴヌクレオチド308の標的核酸300へのハイブリダイゼーションの前又は同時に、固体支持体318上に捕捉される。固体支持体318は、溶液相支持体(例えば、ビーズ又は他の類似の粒子)、又は固相支持体(例えば、シリコンウエハー、ガラススライドなど)であってもよい。図3Aに示される実施形態では、第1のオリゴヌクレオチド308は、捕捉部分312を介して固体支持体318上に捕捉される。図2Bを見ると、ハイブリダイズされた第1のオリゴヌクレオチド308は、第1のポリメラーゼ(図示せず)で伸長され、それにより、標的核酸300及び伸長された第1のオリゴヌクレオチド316を含む第1のプライマー伸長複合体314を生成する(伸長された第1のオリゴヌクレオチド316の伸長された部分を破線で示す)。特に、第1のプライマー伸長複合体314は、固体支持体318上に捕捉され、核酸のライブラリーに対する標的核酸300の濃縮を可能にする。その後、第2のプライマーハイブリダイゼーション及び伸長反応は、図2C及び2Dに図示されるように実行することができ、その後、図2Eに図示されるような増幅ステップが続く。
ができる。しかしながら、これには、マッチングするブロッキングオリゴヌクレオチドの使用が必要である。多数のサンプルインデックス(例えば、24、96など)を使用する場合、1つの「ユニバーサル」ブロッキングオリゴヌクレオチドを使用することは1つの可能性である。ユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチドは、多数の異なるサンプルインデックス配列に結合できる非天然ヌクレオチドを含むユニーク配列を持っている。その結果、単一のブロッキングオリゴヌクレオチドのみが核酸サンプルに追加される。或いは(又はさらに)、単一のユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチドは、ユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチド組成物を集合的に構成するオリゴヌクレオチドの混合物であり得る。
溶液中プライマー媒介捕捉(PETE-Cap)によるプライマー伸長標的濃縮
[0149]溶液中プライマー媒介捕捉によるプライマー伸長標的濃縮は、以下のプロトコルに従って行われた。製造業者の取扱説明書に従って、KAPA HYPERPLUSライブラリー調製キットを使用して、最大0.8Xのライゲーション後クリーンアップステップを含む、10ng及び100ngのNA12878ヒトゲノムDNA(CORIELL)から、核酸の重複ライブラリーを調製した(図6A)。その後、核酸のライブラリー中の標的核酸は、図2に図示されている実施形態に従って、溶液中プライマー媒介捕捉を含むプライマー伸長標的濃縮によって濃縮された。標的核酸のプラス又はマイナス鎖に相補的なプライマーは、各目的遺伝子(すなわち、標的)の同じエクソン用に設計されている。第1の(内側)オリゴヌクレオチドプライマーは20~25ヌクレオチド長で、第2の(外側)オリゴヌクレオチドプライマーは50~60ヌクレオチド長であった。第2のオリゴヌクレオチドプライマーに付随する追加の長さ(第1のオリゴヌクレオチドプライマーと比較した)は、5’非相補的テール配列が含まれていたためであった。特に、5’非相補的テール配列を省略することで、第2のオリゴヌクレオチドプライマーの全長を低減することができる。
[0158]
Claims (15)
- 核酸のライブラリー中の少なくとも1つの標的核酸を濃縮するための方法であって、以下のステップ:
第1のオリゴヌクレオチドを、核酸のライブラリー中の標的核酸にハイブリダイズするステップであって、核酸のライブラリー中の各核酸が、第1のアダプターを含む第1の末端及び第2のアダプターを含む第2の末端を有するステップ;
ハイブリダイズした第1のオリゴヌクレオチドを第1のポリメラーゼで伸長し、それにより標的核酸及び伸長された第1のオリゴヌクレオチドを含む第1のプライマー伸長複合体を生成するステップ;
第1のプライマー伸長複合体を捕捉するステップ;
第1のプライマー伸長複合体を、核酸のライブラリーに対して濃縮するステップ;
第2のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズするステップ;
ハイブリダイズした第2のオリゴヌクレオチドを第2のポリメラーゼで伸長し、それにより、標的核酸及び伸長された第2のオリゴヌクレオチドを含む第2のプライマー伸長複合体を生成し、それにより、伸長された第1のオリゴヌクレオチドを第1のプライマー伸長複合体から遊離させるステップ;並びに
標的核酸を第3のポリメラーゼ、第1の増幅プライマー、及び第2の増幅プライマーで増幅するステップであって、第1の増幅プライマーが、第1のアダプターに相補的な3’末端を持ち、第2の増幅プライマーが、第2のアダプターに相補的な3’末端を持つステップ
を含む方法。 - 増幅された標的核酸を、配列決定するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 第1のオリゴヌクレオチドが、捕捉部分を含む、請求項1に記載の方法。
- 第1のオリゴヌクレオチドが、第1のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズする前に固体支持体に結合しており、並びに第1のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズし、及びハイブリダイズした第1のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼで伸長することが、それにより、固体支持体上の第1のプライマー伸長複合体を捕捉する、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを、第1のプライマー伸長複合体中の伸長された第1のオリゴヌクレオチド及び第2のプライマー伸長複合体中の伸長された第2のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つに組み込むステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 第1のプライマー伸長複合体中の伸長された第1のオリゴヌクレオチドに少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを組み込むステップをさらに含み、少なくとも1つの修飾ヌクレオチドは捕捉部分を有する、請求項1に記載の方法。
- 第1のプライマー伸長複合体における伸長された第1のオリゴヌクレオチド、及び
第2のプライマー伸長複合体における伸長された第2のオリゴヌクレオチド
の少なくとも1つに、少なくとも1つのウラシルを組み込むステップをさらに含み、
それにより、ウラシル含有オリゴヌクレオチド産物を形成する、請求項1に記載の方法。 - 核酸のライブラリーを、ブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 第1のアダプター及び第2のアダプターが、フォーク型アダプターである、請求項1に
記載の方法。 - 第1のアダプター及び第2のアダプターが、少なくとも1つのウラシルを含む、請求項1に記載の方法。
- 第2のオリゴヌクレオチドが、第1のオリゴヌクレオチドに対して5’位で標的核酸にハイブリダイズする、請求項1に記載の方法。
- 第1のアダプター、第2のアダプター、第1の増幅プライマー、及び第2の増幅プライマーのうちの少なくとも1つが、固有識別子(UID)配列、分子識別子(MID)配列のうちの少なくとも1つを含む、請求項1に記載の方法。
- 核酸のライブラリー中の少なくとも1つの標的核酸の濃縮のためのキットであって、前記キットが:
核酸のライブラリー中の標的核酸に相補的な第1のオリゴヌクレオチドであって、核酸のライブラリー中の各核酸が、第1のアダプターを含む第1の末端及び第2のアダプターを含む第2の末端を有する、第1のオリゴヌクレオチド;
標的核酸に相補的な第2のオリゴヌクレオチド;
第1の増幅プライマー;及び
第2の増幅プライマー
を含み、
ここで、第1のオリゴヌクレオチドが捕捉部分を含み、
ここで、第2のオリゴヌクレオチドが、第1のオリゴヌクレオチドに対して5’位で標的核酸にハイブリダイズし、
ここで、第1の増幅プライマーが、第1のアダプターに相補的な3’末端を有し、第2の増幅プライマーが、第2のアダプターに相補的な3’末端を有する、キット。 - 核酸のライブラリー中の少なくとも1つの標的核酸の濃縮のためのキットであって、前記キットが:
核酸のライブラリー中の標的核酸に相補的な第1のオリゴヌクレオチドであって、核酸のライブラリー中の各核酸が、第1のアダプターを含む第1の末端及び第2のアダプターを含む第2の末端を有する、第1のオリゴヌクレオチド;
捕捉部分を有する修飾ヌクレオチド;
標的核酸に相補的な第2のオリゴヌクレオチド;
第1の増幅プライマー;及び
第2の増幅プライマー
を含み、
ここで、第2のオリゴヌクレオチドが、第1のオリゴヌクレオチドに対して5’位で標的核酸にハイブリダイズし、
ここで、第1の増幅プライマーが、第1のアダプターに相補的な3’末端を有し、第2の増幅プライマーが、第2のアダプターに相補的な3’末端を有する、キット。 - 少なくとも1つの標的核酸を含む核酸のライブラリーであって、核酸のライブラリー中の各核酸が、第1のアダプターを含む第1の末端、第2のアダプターを含む第2の末端、及び第1のアダプター及び第2のアダプターの中間の目的領域を有する、核酸のライブラリー;
標的核酸の目的領域にハイブリダイズした伸長された第1のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも1つの捕捉部分を含む伸長された第1のオリゴヌクレオチド;
少なくとも1つの捕捉部分に結合した固体支持体;
第1の伸長されたオリゴヌクレオチドに対して5’位で標的核酸にハイブリダイズした第
2のオリゴヌクレオチド;並びに
第2のオリゴヌクレオチドの3’末端に会合したポリメラーゼ
を含む組成物。
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