KR20230097044A - 비브리오 콜레라에의 멀티플렉스 검출 및 형결정 - Google Patents
비브리오 콜레라에의 멀티플렉스 검출 및 형결정 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230097044A KR20230097044A KR1020237014941A KR20237014941A KR20230097044A KR 20230097044 A KR20230097044 A KR 20230097044A KR 1020237014941 A KR1020237014941 A KR 1020237014941A KR 20237014941 A KR20237014941 A KR 20237014941A KR 20230097044 A KR20230097044 A KR 20230097044A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- seq
- primer
- nos
- sequence
- probe
- Prior art date
Links
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 title claims abstract description 106
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 53
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 title description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 249
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 156
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 claims abstract description 113
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 81
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 claims abstract description 64
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 448
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 432
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 claims description 138
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 90
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 85
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 82
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 82
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 72
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 70
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 70
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 66
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 66
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 62
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 49
- 101150057202 ompW gene Proteins 0.000 claims description 47
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 claims description 44
- 101150028842 ctxA gene Proteins 0.000 claims description 40
- 101150024316 yaiO gene Proteins 0.000 claims description 40
- 101150088912 rfbN gene Proteins 0.000 claims description 31
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 26
- -1 saliva Substances 0.000 claims description 23
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 21
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 20
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 claims description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 11
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 claims description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 9
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 claims description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 7
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 6
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 6
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 5
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 claims description 5
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 5
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 5
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 4
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims description 4
- 206010040102 Seroma Diseases 0.000 claims description 4
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 4
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 4
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 claims description 3
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 claims description 3
- 239000002023 wood Substances 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 235
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 234
- 238000010998 test method Methods 0.000 abstract description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 96
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 94
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 83
- 238000001327 Förster resonance energy transfer Methods 0.000 description 37
- 239000002585 base Substances 0.000 description 37
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 24
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 24
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 24
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 24
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 18
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 18
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 14
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 14
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 10
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 9
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 9
- 101100248156 Salmonella typhimurium (strain LT2 / SGSC1412 / ATCC 700720) rfbN gene Proteins 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 7
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 7
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 7
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 6
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 5
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 5
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000002243 furanoses Chemical group 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 4
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 4
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 4
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 231100000683 possible toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- UFSCXDAOCAIFOG-UHFFFAOYSA-N 1,10-dihydropyrimido[5,4-b][1,4]benzothiazin-2-one Chemical compound S1C2=CC=CC=C2N=C2C1=CNC(=O)N2 UFSCXDAOCAIFOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WJFKNYWRSNBZNX-UHFFFAOYSA-N 10H-phenothiazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3SC2=C1 WJFKNYWRSNBZNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 10H-phenoxazine Chemical compound C1=CC=C2NC3=CC=CC=C3OC2=C1 TZMSYXZUNZXBOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical group NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEHVGBZKEYRQSX-UHFFFAOYSA-N 7-deaza-adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1C=CN2 PEHVGBZKEYRQSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000607528 Aeromonas hydrophila Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- IXQIUDNVFVTQLJ-UHFFFAOYSA-N Naphthofluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C(C=CC=1C3=CC=C(O)C=1)=C3OC1=C2C=CC2=CC(O)=CC=C21 IXQIUDNVFVTQLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001674048 Phthiraptera Species 0.000 description 2
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000033809 Suppuration Diseases 0.000 description 2
- 101100046504 Symbiobacterium thermophilum (strain T / IAM 14863) tnaA2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000607594 Vibrio alginolyticus Species 0.000 description 2
- 241000607291 Vibrio fluvialis Species 0.000 description 2
- 241000607253 Vibrio mimicus Species 0.000 description 2
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 2
- 241000607265 Vibrio vulnificus Species 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 2
- VYXSBFYARXAAKO-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=CC(=[NH+]CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- RDOWQLZANAYVLL-UHFFFAOYSA-N phenanthridine Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=NC2=C1 RDOWQLZANAYVLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950000688 phenothiazine Drugs 0.000 description 2
- 150000002991 phenoxazines Chemical class 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- PTFYZDMJTFMPQW-UHFFFAOYSA-N 1,10-dihydropyrimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2-one Chemical compound O1C2=CC=CC=C2N=C2C1=CNC(=O)N2 PTFYZDMJTFMPQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHUHBFMZVCOEOV-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazo[4,5-c]pyridin-4-amine Chemical compound NC1=NC=CC2=C1N=CN2 UHUHBFMZVCOEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 2',7'-difluorofluorescein Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(F)C(=O)C=C2OC2=CC(O)=C(F)C=C21 VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JNGRENQDBKMCCR-UHFFFAOYSA-N 2-(3-amino-6-iminoxanthen-9-yl)benzoic acid;hydrochloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[NH2+])C=C2OC2=CC(N)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O JNGRENQDBKMCCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAPTZHDIVAYRQU-UHFFFAOYSA-N 2-(dimethylaminodiazenyl)benzenesulfonic acid Chemical compound CN(C)N=NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O ZAPTZHDIVAYRQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- WKMPTBDYDNUJLF-UHFFFAOYSA-N 2-fluoroadenine Chemical compound NC1=NC(F)=NC2=C1N=CN2 WKMPTBDYDNUJLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMADWRYCYBUIKH-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 SMADWRYCYBUIKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PDBUTMYDZLUVCP-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydro-1,4-benzoxazin-2-one Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)CNC2=C1 PDBUTMYDZLUVCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-benzimidazol-2-yl)-7-(diethylamino)chromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2NC(C3=CC4=CC=C(C=C4OC3=O)N(CC)CC)=NC2=C1 GOLORTLGFDVFDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMBSZJBWYCGCJP-UHFFFAOYSA-N 3-(diethylamino)chromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C(N(CC)CC)=CC2=C1 SMBSZJBWYCGCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 4-thiouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=S)C=C1 ZLOIGESWDJYCTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KXBCLNRMQPRVTP-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1,5-dihydroimidazo[4,5-c]pyridin-4-one Chemical compound O=C1NC(N)=CC2=C1N=CN2 KXBCLNRMQPRVTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1h-pyrimidine-2-thione Chemical compound NC1=CC=NC(S)=N1 DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=C(C(O)=O)C=C2C21C1=CC(OC)=C(O)C(Cl)=C1OC1=C2C=C(OC)C(O)=C1Cl IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-x-rhodamine Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C([O-])=O)C=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 WQZIDRAQTRIQDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VWOLRKMFAJUZGM-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyrhodamine 6G Chemical compound [Cl-].C=12C=C(C)C(NCC)=CC2=[O+]C=2C=C(NCC)C(C)=CC=2C=1C1=CC(C(O)=O)=CC=C1C(=O)OCC VWOLRKMFAJUZGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJBMMMJOXRZENQ-UHFFFAOYSA-N 6H-pyrrolo[2,3-f]quinoline Chemical compound c1cc2ccc3[nH]cccc3c2n1 NJBMMMJOXRZENQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 7-deazaguanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1CC=N2 LOSIULRWFAEMFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 8-azaadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=NNN=C12 HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 1
- WNDDWSAHNYBXKY-UHFFFAOYSA-N ATTO 425-2 Chemical compound CC1CC(C)(C)N(CCCC(O)=O)C2=C1C=C1C=C(C(=O)OCC)C(=O)OC1=C2 WNDDWSAHNYBXKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YIXZUOWWYKISPQ-UHFFFAOYSA-N ATTO 565 para-isomer Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.C=12C=C3CCC[N+](CC)=C3C=C2OC=2C=C3N(CC)CCCC3=CC=2C=1C1=CC(C(O)=O)=CC=C1C(O)=O YIXZUOWWYKISPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWZJEXGKUHVUFP-UHFFFAOYSA-N ATTO 590 meta-isomer Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.C1=2C=C3C(C)=CC(C)(C)N(CC)C3=CC=2OC2=CC3=[N+](CC)C(C)(C)C=C(C)C3=CC2=C1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O PWZJEXGKUHVUFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLQQGEVQWLDVDF-UHFFFAOYSA-N ATTO 610-2 Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.C1=C2CCC[N+](CCCC(O)=O)=C2C=C2C1=CC1=CC=C(N(C)C)C=C1C2(C)C SLQQGEVQWLDVDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 description 1
- 208000010444 Acidosis Diseases 0.000 description 1
- 206010053555 Arthritis bacterial Diseases 0.000 description 1
- KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N Benzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1 KXDAEFPNCMNJSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- KQLDDLUWUFBQHP-UHFFFAOYSA-N Cordycepin Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OCC(CO)C1O KQLDDLUWUFBQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 101100028689 Drosophila melanogaster rho-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101100431505 Escherichia coli (strain K12) yaiO gene Proteins 0.000 description 1
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 241000224421 Heterolobosea Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010021138 Hypovolaemic shock Diseases 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010065042 Immune reconstitution inflammatory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000004575 Infectious Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 101100172630 Mus musculus Eri1 gene Proteins 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical class OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- MTVVRWVOXZSVBW-UHFFFAOYSA-M QSY21 succinimidyl ester Chemical compound [Cl-].C1CN(S(=O)(=O)C=2C(=CC=CC=2)C2=C3C=CC(C=C3OC3=CC(=CC=C32)N2CC3=CC=CC=C3C2)=[N+]2CC3=CC=CC=C3C2)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O MTVVRWVOXZSVBW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BDJDTKYGKHEMFF-UHFFFAOYSA-M QSY7 succinimidyl ester Chemical compound [Cl-].C=1C=C2C(C=3C(=CC=CC=3)S(=O)(=O)N3CCC(CC3)C(=O)ON3C(CCC3=O)=O)=C3C=C\C(=[N+](\C)C=4C=CC=CC=4)C=C3OC2=CC=1N(C)C1=CC=CC=C1 BDJDTKYGKHEMFF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PAOKYIAFAJVBKU-UHFFFAOYSA-N QSY9 succinimidyl ester Chemical compound [H+].[H+].[Cl-].C=1C=C2C(C=3C(=CC=CC=3)S(=O)(=O)N3CCC(CC3)C(=O)ON3C(CCC3=O)=O)=C3C=C\C(=[N+](\C)C=4C=CC(=CC=4)S([O-])(=O)=O)C=C3OC2=CC=1N(C)C1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 PAOKYIAFAJVBKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NOXMCJDDSWCSIE-DAGMQNCNSA-N [[(2R,3S,4R,5R)-5-(2-amino-4-oxo-3H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O NOXMCJDDSWCSIE-DAGMQNCNSA-N 0.000 description 1
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000007950 acidosis Effects 0.000 description 1
- 208000026545 acidosis disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000999 acridine dye Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003001 amoeba Anatomy 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000000436 anus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 1
- FOYVTVSSAMSORJ-UHFFFAOYSA-N atto 655 Chemical compound OC(=O)CCCN1C(C)(C)CC(CS([O-])(=O)=O)C2=C1C=C1OC3=CC4=[N+](CC)CCCC4=CC3=NC1=C2 FOYVTVSSAMSORJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHHMNDJIDRZZNT-UHFFFAOYSA-N atto 680 Chemical compound OC(=O)CCCN1C(C)(C)C=C(CS([O-])(=O)=O)C2=C1C=C1OC3=CC4=[N+](CC)CCCC4=CC3=NC1=C2 MHHMNDJIDRZZNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTZQAGJQAFMTAQ-UHFFFAOYSA-N benzoic acid ethyl ester Natural products CCOC(=O)C1=CC=CC=C1 MTZQAGJQAFMTAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 210000003103 bodily secretion Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000001217 buttock Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- OFEZSBMBBKLLBJ-BAJZRUMYSA-N cordycepin Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)C[C@H]1O OFEZSBMBBKLLBJ-BAJZRUMYSA-N 0.000 description 1
- OFEZSBMBBKLLBJ-UHFFFAOYSA-N cordycepine Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)CC1O OFEZSBMBBKLLBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 1
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 description 1
- 230000001808 coupling effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000000596 cyclohexenyl group Chemical group C1(=CCCCC1)* 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- ANCLJVISBRWUTR-UHFFFAOYSA-N diaminophosphinic acid Chemical compound NP(N)(O)=O ANCLJVISBRWUTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000741 diarrhetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- ZPTBLXKRQACLCR-XVFCMESISA-N dihydrouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)CC1 ZPTBLXKRQACLCR-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N dithiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000007848 endpoint PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000695 excitation spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000007849 hot-start PCR Methods 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N methyl adenine Natural products CN1C=NC2=NC=NC2=C1N HPZMWTNATZPBIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 1
- VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N pacific blue Chemical compound FC1=C(O)C(F)=C2OC(=O)C(C(=O)O)=CC2=C1 VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- 150000008299 phosphorodiamidates Chemical class 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- WHFQORJQTYYOBK-UHFFFAOYSA-N purine-6,6-diamine Chemical compound NC1(N)N=CN=C2N=CN=C12 WHFQORJQTYYOBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RXTQGIIIYVEHBN-UHFFFAOYSA-N pyrimido[4,5-b]indol-2-one Chemical compound C1=CC=CC2=NC3=NC(=O)N=CC3=C21 RXTQGIIIYVEHBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBUGYKMBLUTIS-UHFFFAOYSA-N pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=CC2=CC=NC2=N1 SRBUGYKMBLUTIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000009666 routine test Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 201000001223 septic arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 206010040560 shock Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 235000021092 sugar substitutes Nutrition 0.000 description 1
- IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N sulfamic acid Chemical group NS(O)(=O)=O IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical group 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical group 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000007862 touchdown PCR Methods 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000001018 xanthene dye Substances 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
- C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
- C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Bidet-Like Cleaning Device And Other Flush Toilet Accessories (AREA)
- Air Bags (AREA)
- Push-Button Switches (AREA)
Abstract
브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에를 검출하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 샘플에서 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에의 존재 또는 부재는 멀티플렉스 핵산-기반 시험 방법을 이용하여 결정된다.
Description
관련 출원
본 출원은 2020년 11월 5일에 출원된 PCT 출원 일련 번호 PCT/CN2020/126682의 이익을 주장하며, 이 관련 출원의 내용은 전체가 본원에 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 2021년 11월 2일에 생성된 68EB-298735-WO2라는 명칭의 파일로 제공되며, 크기는 16 kb이다. 서열 목록의 전자 형식의 정보는 전체가 참조로 본원에 포함된다.
배경
분야
본 개시내용은 샘플에서 브이. 콜레라에(V. cholerae)의 검출 및 형결정을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 대변 샘플과 같은 샘플에서 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상을 핵산-기반 시험 방법에 의해 검출하는 것에 관한 것이다.
관련 기술의 설명
비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae)는 콜레라 질환에 책임이 있는 병인적 병원체이다. 가장 심한 경우, 이 질환은 중증 콜레라로 공지되어 있으며, 심각한 탈수를 초래하는 다량의 쌀뜨물같은 대변의 통과와 함께 나타난다. 수분공급 및 전해질 요법이 신속하게 개시되지 않으면 질환은 저혈량 쇼크, 산증 및 사망으로 빠르게 진행될 수 있다. 세계보건기구는 매년 130만-400만건의 추정 사례 및 21,000-147,000건의 추정 사망이 있다고 공표한다. 브이. 콜레라에의 200개 초과의 혈청군 중에서, O1 및 O139 혈청군만이 전염병과 관련되었다. 콜레라 독소 (CT)는 전염성 및 산발성 형태의 심각한 콜레라-유사 질환에 책임이 있다. 브이. 콜레라에 단리물의 공중 보건 중요성을 평가할 때, CT 생성은 결정될 중요한 특성 중 하나이다. 설사에서 브이. 콜레라에에 감염된 환자를 적시에 확인하고 혈청형 및 독성 인자를 확인하는 것은 환자 치료 및 질환 제어에 중요하다. 따라서, 브이. 콜레라에를 검출 및 혈청형결정을 위한 보다 효율적이고 신속한 방법, 예를 들어 브이. 콜레라에의 검출, 혈청형결정 및 콜레라 독소 검출을 모두 단일 반응으로 수행할 수 있는 5개의 유전자 표적을 동시에 검출하는 멀티플렉스 실시간 PCR 방법을 개발할 필요가 있다. 비브리오 콜레라에의 잠재적 독성을 동시에 확인 및 결정하기 위한 멀티플렉스화된 조성물 및 방법이 필요하다.
본원에 개시된 것은 샘플에서 브이. 콜레라에를 검출하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 상기 샘플을 복수의 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 복수의 프라이머 쌍은 브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1-8의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 1-8의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 12-19의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 12-19의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 24-33의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 24-33의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 및 브이. 콜레라에의 ctxA (콜레라 독소) 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 39-48의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 39-48의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 프라이 쌍을 포함한다. 방법은 상기 샘플이 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상을 포함하는 경우, ompW 유전자 서열의 앰플리콘, rfbN 유전자 서열의 앰플리콘, wbfR 유전자 서열의 앰플리콘, ctxA 유전자 서열의 앰플리콘, 또는 이의 임의의 조합을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 상기 샘플에서 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상의 존재의 지표로서 하나 이상의 앰플리콘의 존재 또는 양을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 샘플을 이. 콜라이(E. coli)의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍과 접촉시키며, 여기서 상기 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 53-62의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 53-62의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 단계, 및 상기 샘플이 이. 콜라이를 포함하는 경우, 상기 샘플로부터 이. 콜라이의 yaiO 유전자 서열의 앰플리콘을 생성하는 단계; 및 상기 샘플에서 이. 콜라이의 존재의 지표로서 이. 콜라이의 yaiO 유전자 서열의 앰플리콘의 존재 또는 양을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 샘플은 복수의 프라이머 쌍 및 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍을 포함하는 조성물과 접촉된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 생물학적 샘플 또는 환경 샘플이다. 일부 실시양태에서, 환경 샘플은 식품 샘플, 음료 샘플, 종이 표면, 직물 표면, 금속 표면, 목재 표면, 플라스틱 표면, 토양 샘플, 담수 샘플, 폐수 샘플, 식염수 샘플, 대기 공기 또는 다른 기체 노출 샘플, 이의 배양물, 또는 이의 임의의 조합으로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플, 타액, 혈액, 혈장, 혈청, 대변, 소변, 객담, 점액, 림프, 윤활액, 뇌척수액, 복수, 흉수, 혈청종, 고름, 피부 또는 점막 표면의 면봉채취물, 이의 배양물, 또는 이의 임의의 조합으로부터 수득된다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 분변 샘플을 포함하거나 이로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 복수의 프라이머 쌍은 서열식별번호: 1, 3, 5 또는 7의 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열식별번호: 2, 4, 6 또는 8의 서열을 포함하는 제2 프라이머, 서열식별번호: 12, 14, 16 또는 18의 서열을 포함하는 제3 프라이머, 서열식별번호: 13, 15, 17 또는 19의 서열을 포함하는 제4 프라이머, 서열식별번호: 24, 26, 28, 30 또는 32의 서열을 포함하는 제5 프라이머, 서열식별번호: 25, 27, 29, 31 또는 33의 서열을 포함하는 제6 프라이머, 서열식별번호: 39, 41, 43, 45 또는 47의 서열을 포함하는 제7 프라이머, 및 서열식별번호: 40, 42, 44, 46 또는 48의 서열을 포함하는 제8 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 프라이머 쌍은 서열식별번호: 53, 55, 57, 59 또는 61의 서열을 포함하는 제9 프라이머, 및 서열식별번호: 54, 56, 58, 60 또는 62의 서열을 포함하는 제10 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머 쌍은 서열식별번호: 1 및 2, 서열식별번호: 3 및 4, 서열식별번호: 5 및 6, 또는 서열식별번호: 7 및 8이고; 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머 쌍은 서열식별번호: 12 및 13, 서열식별번호: 14 및 15, 서열식별번호: 16 및 17, 또는 서열식별번호: 18 및 19이고; 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머 쌍은 서열식별번호: 24 및 25, 서열식별번호: 26 및 27, 서열식별번호: 28 및 29, 서열식별번호: 30 및 31, 또는 서열식별번호: 32 및 33이고; 브이. 콜레라에의 ctxA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머 쌍은 서열식별번호: 39 및 40, 서열식별번호: 41 및 42, 서열식별번호: 43 및 44, 서열식별번호: 45 및 46, 또는 서열식별번호: 47 및 48이다. 일부 실시양태에서, 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 대조군 프라이머 쌍은 서열식별번호: 53 및 54, 서열식별번호: 55 및 56, 서열식별번호: 57 및 58, 서열식별번호: 59 및 60, 또는 서열식별번호: 61 및 62이다.
일부 실시양태에서, 상기 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 루프-매개된 등온 증폭 (LAMP), 가닥 대체 증폭 (SDA), 헬리카제-매개된 증폭, 면역-증폭, 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 자가-지속된 서열 복제 (3SR), 롤링 서클 증폭, 및 전사-매개된 증폭 (TMA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 상기 PCR은 실시간 PCR이다. 일부 실시양태에서, 상기 PCR은 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR)이다. 일부 실시양태에서, 각각의 프라이머는 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 앰플리콘의 존재 또는 양을 결정하는 것은 앰플리콘을 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각은 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각은 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각은 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 각각의 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에서 상보적 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 상보적 서열 중 하나는 형광 방출체 모이어티를 포함하고, 다른 상보적 서열은 형광 소광체 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 중 적어도 하나는 형광 방출체 모이어티 및 형광 소광체 모이어티를 포함한다.
본원에 개시된 것은 브이. 콜레라에를 검출하기 위한 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 1-8의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 1-8의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 12-19의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 12-19의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 24-33의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 24-33의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 및 브이. 콜레라에의 ctxA (콜레라 독소) 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 39-48의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 39-48의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍을 포함한다. 조성물은 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 53-62의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 53-62의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍은 서열식별번호: 1, 3, 5 또는 7의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호: 2, 4, 6 또는 8의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고; 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍은 서열식별번호: 12, 14, 16 또는 18의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호: 13, 15, 17 또는 19의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고; 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍은 서열식별번호: 24, 26, 28, 30 또는 32의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호: 25, 27, 29, 31 또는 33의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고; 브이. 콜레라에의 ctxA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍은 서열식별번호: 39, 41, 43, 45 또는 47의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호: 40, 42, 44, 46 또는 48의 서열을 포함하는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍은 서열식별번호: 53, 55, 57, 59 또는 61의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호: 54, 56, 58, 60 또는 62의 서열을 포함하는 프라이머를 포함한다.
조성물은 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함할 수 있으며, 여기서 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각은 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각은 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각은 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 복수의 프로브 중 적어도 하나는 형광 방출체 모이어티 및 형광 소광체 모이어티를 포함한다.
본원에 개시된 것은 브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진다.
본원에 개시된 것은 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진다.
본원에 개시된 것은 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진다.
본원에 개시된 것은 브이. 콜레라에의 ctxA (콜레라 독소) 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진다.
본원에 개시된 것은 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진다.
본원에 개시된 것은 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 프로브 및 프라이머 중 하나 이상 또는 2개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 핵산 연장 및/또는 증폭을 위한 하나 이상의 효소를 추가로 포함한다.
하기의 상세한 설명에서, 본원의 일부를 형성하는 첨부 도면을 참조한다. 도면에서 유사한 기호는 문맥상 달리 지시하지 않는 한 전형적으로 유사한 성분을 나타낸다. 상세한 설명, 도면 및 청구범위에 기재된 예시적인 실시양태는 제한하려는 것이 아니다. 본원에 제시된 대상의 취지 또는 범주를 벗어나지 않으면서 다른 실시양태가 활용될 수 있고, 다른 변경이 이루어질 수 있다. 본원에 일반적으로 기재되고 도면에 예시되는 바와 같이, 본 개시내용의 측면은 매우 다양한 상이한 구성으로 배열, 치환, 조합, 분리 및 설계될 수 있다는 것이 쉽게 이해될 것이며, 이들 모두는 본원에서 명시적으로 고려되고 본원의 개시내용의 일부가 된다.
모든 특허, 공개된 특허 출원, 다른 공개문, 진뱅크(GenBank)로부터의 서열, 및 본원에 언급된 다른 데이터베이스는 관련 기술과 관련하여 전체가 참조로 포함된다.
현재, 브이. 콜레라에의 검출 및 혈청형결정 방법은 기존 방법 및 PCR 기반 방법을 포함한다. 기존 방법은 배양 및 형태학적, 생화학적 및 면역학적 특징에 의한 확인을 포함한다. 이는 널리 사용되고 있음에도 불구하고 특이성이 부족하고 대규모의 복잡한 수작업이 필요하며 긴 검출 기간을 필요로 한다. 최근, 브이. 콜레라에 감염을 확인하기 위한 PCR-기반 방법이 표면화되기 시작하였다. PCR 방법, 특히 실시간 PCR 방법은 기존 방법과 비교하여 많은 이점이 있다: 이는 매우 민감하고 특이적이며, 결과를 얻는데 걸리는 시간이 짧고, 노동 집약적이지 않다. 그러나, 종래 기술에 적응된 PCR 방법은 일반적으로 브이. 콜레라에 확인, 혈청형결정 또는 콜레라 독소 검출 중 하나 또는 2가지만 달성할 수 있고 하나의 설정에서 3가지 목적 모두를 달성할 수는 없다. 문헌 (Lyon W J et al., Appl. Environ. Microbiol., 2001, 67(10): 4685-4693)은 순수 배양물, 굴 및 합성 해수에서 단지 브이. 콜레라에의 검출을 위한 택맨(Taqman) 프로브 실시간 PCR 방법을 기술하였다. 문헌 (Bhumiratana, Adisak, et al., Biochemistry research international 2014)은 비브리오 콜레라에 O1 및 O139 혈청군 검출을 위한 기존의 멀티플렉스 PCR을 기술하였다. 이 방법의 전제 조건은 브이. 콜레라에가 샘플에서 이미 확인되었다는 것이다. 따라서, 브이. 콜레라에의 검출 및 혈청형결정을 위한 보다 효율적이고 신속한 방법, 예를 들어 브이. 콜레라에의 검출, 혈청형결정 및 콜레라 독소 검출을 모두 단일 반응으로 수행할 수 있는 5개의 유전자 표적을 동시에 검출하는 멀티플렉스 실시간 PCR 방법을 개발할 필요가 있다. 비브리오 콜레라에의 잠재적 독성을 동시에 확인 및 결정하기 위한 멀티플렉스화된 조성물 및 방법이 필요하다.
샘플에서 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상을 검출하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 생물학적 샘플과 같은 샘플에서 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 브이. 콜레라에의 특정 유전자에 결합할 수 있는 프라이머 및 프로브가 제공된다. 일부 실시양태에서, 멀티플렉스 핵산 증폭은 단일 검정으로 상기 샘플에서 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상의 검출을 가능하게 하기 위해 수행될 수 있다.
본원에 개시된 것은 샘플에서 브이. 콜레라에를 검출하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 상기 샘플을 복수의 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 복수의 프라이머 쌍은 브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 1-8의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 1-8의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 12-19의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 12-19의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 24-33의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 24-33의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 및 브이. 콜레라에의 ctxA (콜레라 독소) 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 39-48의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 39-48의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 프라이 쌍을 포함한다. 방법은 상기 샘플이 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상을 포함하는 경우, ompW 유전자 서열의 앰플리콘, rfbN 유전자 서열의 앰플리콘, wbfR 유전자 서열의 앰플리콘, ctxA 유전자 서열의 앰플리콘, 또는 이의 임의의 조합을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 상기 샘플에서 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상의 존재의 지표로서 하나 이상의 앰플리콘의 존재 또는 양을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 샘플을 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍과 접촉시키며, 여기서 상기 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 53-62의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 53-62의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 단계, 및 상기 샘플이 이. 콜라이를 포함하는 경우, 상기 샘플로부터 이. 콜라이의 yaiO 유전자 서열의 앰플리콘을 생성하는 단계; 및 상기 샘플에서 이. 콜라이의 존재의 지표로서 이. 콜라이의 yaiO 유전자 서열의 앰플리콘의 존재 또는 양을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 복수의 프라이머 쌍 및 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍을 포함하는 조성물과 접촉된다.
본원에 개시된 것은 브이. 콜레라에를 검출하기 위한 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 1-8의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 1-8의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 12-19의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 12-19의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 24-33의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 24-33의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 및 브이. 콜레라에의 ctxA (콜레라 독소) 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 39-48의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 39-48의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍을 포함한다. 조성물은 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 53-62의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 53-62의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
조성물은 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함할 수 있으며, 여기서 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각은 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
본원에 개시된 것은 브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
본원에 개시된 것은 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
본원에 개시된 것은 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
본원에 개시된 것은 브이. 콜레라에의 ctxA (콜레라 독소) 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
본원에 개시된 것은 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
본원에 개시된 것은 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 프로브 및 프라이머 중 하나 이상, 또는 2개 이상, 및 임의적으로 핵산 연장 및/또는 증폭을 위한 효소 중 하나 이상을 포함한다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 지칭할 수 있다. 핵산은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 핵산은 세포에 대해 외인성 또는 내인성일 수 있다. 핵산은 무세포 환경에 존재할 수 있다. 핵산은 유전자 또는 이의 단편일 수 있다. 핵산은 DNA일 수 있다. 핵산은 RNA일 수 있다. 핵산은 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 변경된 백본, 슈가 또는 핵염기)를 포함할 수 있다. 유사체의 일부 비제한적 예는 5-브로모우라실, 펩티드 핵산, 제노 핵산, 모르폴리노, 잠금 핵산, 글리콜 핵산, 트레오스 핵산, 디데옥시뉴클레오티드, 코르디세핀, 7-데아자-GTP, 형광단 (예를 들어, 슈가에 연결된 로다민 또는 플루오레세인), 티올 함유 뉴클레오티드, 비오틴 연결된 뉴클레오티드, 형광 염기 유사체, CpG 섬, 메틸-7-구아노신, 메틸화된 뉴클레오티드, 이노신, 티오우리딘, 슈도우리딘, 디히드로우리딘, 케오신 및 와이오신을 포함한다. "핵산", "폴리뉴클레오티드", "표적 폴리뉴클레오티드", "표적 핵산" 및 "표적 서열"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "핵산"은 뉴클레오시드 또는 폴리뉴클레오티드를 형성하기 위해 핵산 백본 연결 (예를 들어, 포스포디에스테르 결합)에 의해 함께 연결된 질소성 헤테로시클릭 염기 또는 염기 유사체를 갖는 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 중합체 화합물을 지칭할 수 있다. 핵산의 비제한적 예는 RNA, DNA 및 이의 유사체를 포함한다. 핵산 백본은 다양한 연결, 예를 들어 하나 이상의 슈가-포스포디에스테르 연결, 펩티드-핵산 결합, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 연결 또는 단일 올리고뉴클레오티드에서 이러한 연결의 혼합물을 포함할 수 있다. 핵산의 슈가 모이어티는 리보스 또는 데옥시리보스, 또는 공지된 치환을 가진 유사한 화합물일 수 있다. 통상적인 질소성 염기 (예를 들어, A, G, C, T, U), 공지된 염기 유사체 (예를 들어, 이노신), 퓨린 또는 피리미딘 염기의 유도체 및 "무염기" 잔기 (즉, 하나 이상의 백본 위치에 대해 질소성 염기가 없음)가 핵산이라는 용어에 포함된다. 즉, 핵산은 RNA 및 DNA에서 발견되는 통상적인 슈가, 염기 및 연결만을 포함하거나, 통상적인 성분 및 치환체 (예를 들어, 메톡시 백본을 통해 연결된 통상적인 염기 및 유사체, 또는 RNA 또는 DNA 백본을 통해 연결된 통상적인 염기 및 하나 이상의 염기 유사체) 둘 다를 포함할 수 있다.
핵산은 하나 이상의 변형 (예를 들어, 염기 변형, 백본 변형)을 포함하여 핵산에 새롭거나 향상된 특색 (예를 들어, 개선된 안정성)을 제공할 수 있다. 핵산은 핵산 친화성 태그를 포함할 수 있다. 뉴클레오시드는 염기-슈가 조합일 수 있다. 뉴클레오시드의 염기 부분은 헤테로시클릭 염기일 수 있다. 이러한 헤테로시클릭 염기의 2개의 가장 일반적인 부류는 퓨린 및 피리미딘이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 슈가 부분에 공유 연결된 포스페이트기를 추가로 포함하는 뉴클레오시드일 수 있다. 펜토푸라노실 슈가를 포함하는 뉴클레오시드의 경우, 포스페이트기는 슈가의 2', 3', 또는 5' 히드록실 모이어티에 연결될 수 있다. 핵산 형성 시 포스페이트기는 인접한 뉴클레오시드를 서로 공유적으로 연결하여 선형 중합체 화합물을 형성할 수 있다. 차례로, 이 선형 중합체 화합물의 각각의 말단은 추가로 연결되어 원형 화합물을 형성할 수 있으나; 일반적으로 선형 화합물이 적합하다. 또한, 선형 화합물은 내부 뉴클레오티드 염기 상보성을 가질 수 있으므로 완전 또는 부분적 이중-가닥 화합물을 생성하는 방식으로 접힐 수 있다. 핵산 내에서 포스페이트기는 일반적으로 핵산의 뉴클레오시드간 백본을 형성하는 것으로 언급될 수 있다. 연결 또는 백본은 3'에서 5' 포스포디에스테르 연결일 수 있다.
핵산은 변형된 백본 및/또는 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함할 수 있다. 변형된 백본은 백본에 인 원자를 보유하는 것 및 백본에 인 원자를 갖지 않는 것을 포함할 수 있다. 내부에 인 원자를 함유하는 적합한 변형된 핵산 백본은, 예를 들어 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬 포스포트리에스테르, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 예컨대 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트, 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬 포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 포스포로디아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트, 및 정상 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 2'-5' 연결된 유사체, 및 반전된 극성을 갖는 것 (여기서, 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결은 3'에서 3', 5'에서 5' 또는 2'에서 2' 연결임)을 포함할 수 있다.
핵산은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 연결에 의해 형성되는 폴리뉴클레오티드 백본을 포함할 수 있다. 이들은 모르폴리노 연결 (뉴클레오시드의 슈가 부분으로부터 부분적으로 형성됨)을 갖는 것; 실록산 백본; 술피드, 술폭시드 및 술폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 리보아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 술파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 술포네이트 및 술폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 다른 것을 포함할 수 있다.
핵산은 핵산 모방체를 포함할 수 있다. 용어 "모방체"는 푸라노스 고리만 또는 푸라노스 고리 및 뉴클레오티드간 연결 둘 다가 비-푸라노스기로 대체된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 의도될 수 있으며, 푸라노스 고리만의 대체는 또한 슈가 대용물로 지칭될 수 있다. 헤테로시클릭 염기 모이어티 또는 변형된 헤테로시클릭 염기 모이어티는 적절한 표적 핵산과의 혼성화를 위해 유지될 수 있다. 이러한 핵산 중 하나는 펩티드 핵산 (PNA)일 수 있다. PNA에서, 폴리뉴클레오티드의 슈가-백본은 아미드 함유 백본, 특히 아미노에틸글리신 백본으로 대체될 수 있다. 뉴클레오티드는 보유될 수 있고, 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 백본은 PNA에 아미드 함유 백본을 제공하는 2개 이상의 연결된 아미노에틸글리신 단위를 포함할 수 있다. 헤테로시클릭 염기 모이어티는 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다.
핵산은 모르폴리노 백본 구조를 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 리보스 고리 대신에 6원 모르폴리노 고리를 포함할 수 있다. 이들 실시양태 중 일부에서, 포스포로디아미데이트 또는 다른 비-포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 연결을 대체할 수 있다.
핵산은 모르폴리노 고리에 부착된 헤테로시클릭 염기를 갖는 연결된 모르폴리노 단위 (예를 들어, 모르폴리노 핵산)를 포함할 수 있다. 연결기는 모르폴리노 핵산에서 모르폴리노 단량체 단위를 연결할 수 있다. 비-이온성 모르폴리노-기반 올리고머 화합물은 세포 단백질과 덜 바람직하지 않은 상호작용을 가질 수 있다. 모르폴리노-기반 폴리뉴클레오티드는 핵산의 비이온성 모방체일 수 있다. 모르폴리노 부류 내의 다양한 화합물은 상이한 연결기를 사용하여 연결될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 모방체의 추가 부류는 시클로헥세닐 핵산 (CeNA)으로 언급될 수 있다. 핵산 분자에 일반적으로 존재하는 푸라노스 고리는 시클로헥세닐 고리로 대체될 수 있다. CeNA DMT 보호된 포스포르아미다이트 단량체는 포스포르아미다이트 화학을 이용하여 올리고머 화합물 합성을 위해 제조 및 사용될 수 있다. 핵산 쇄에 CeNA 단량체를 통합하면 DNA/RNA 혼성물의 안정성을 높일 수 있다. CeNA 올리고아데닐레이트는 천연 복합체와 유사한 안정성으로 핵산 상보체와 복합체를 형성할 수 있다. 추가 변형은 2'-히드록실기가 슈가 고리의 4' 탄소 원자에 연결되어 2'-C, 4'-C-옥시메틸렌 연결을 형성함으로써 바이시클릭 슈가 모이어티를 형성하는 잠금 핵산 (LNA)을 포함할 수 있다. 연결은 n이 1 또는 2인 2' 산소 원자와 4' 탄소 원자를 브릿징하는 기인 메틸렌 (-CH2)일 수 있다. LNA 및 LNA 유사체는 상보적 핵산과 함께 매우 높은 듀플렉스 열 안정성 (Tm=+3 내지 +10℃), 3'-엑소핵용해적 분해에 대한 안정성 및 우수한 용해도 특성을 나타낼 수 있다.
핵산은 또한 핵염기 (종종 간단히 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "변형되지 않은" 또는 "천연" 핵염기는 퓨린 염기 (예를 들어, 아데닌 (A) 및 구아닌 (G)) 및 피리미딘 염기 (예를 들어, 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U))를 포함할 수 있다. 변형된 핵염기는 다른 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 히포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 (-C=C-CH3) 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함할 수 있다. 변형된 핵염기는 트리시클릭 피리미딘, 예컨대 페녹사진 시티딘 (1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘 (1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예컨대 치환된 페녹사진 시티딘 (예를 들어, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도(5,4-(b)(1,4)벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예컨대 치환된 페녹사진 시티딘 (예를 들어, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도(5,4-(b)(1,4)벤족사진-2(3H)-온), 카르바졸 시티딘 (2H-피리미도(4,5-b)인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘 (H-피리도(3',2':4,5)피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산을 단리하다"는 하나 이상의 세포 성분으로부터 핵산을 정제하는 것을 지칭할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이로부터 "핵산을 단리"하기 위해 처리된 샘플이 핵산 이외의 성분 및 불순물을 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 단리된 핵산을 포함하는 샘플은 관련 기술분야에 공지된 임의의 허용 가능한 방법을 이용하여 표본으로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 세포는 공지된 용해제를 사용하여 용해될 수 있고, 핵산은 다른 세포 성분으로부터 정제되거나 부분적으로 정제될 수 있다. DNA 및 RNA 추출에 적합한 시약 및 프로토콜은, 예를 들어 각각 미국 특허 출원 공개 번호 US 2010-0009351 및 US 2009-0131650에서 찾을 수 있다 (각각은 전체가 참조로 본원에 포함됨). 핵산 시험 (예를 들어, 하기에서 더 자세히 논의되는 증폭 및 혼성화 방법)에서, 추출된 핵산 용액은 본원에 개시된 실시양태에 따른 시험을 수행하는데 필요한 (예를 들어, 하기에서 더 자세히 논의되는 바와 같이, 액체 중의, 기체에 결합된, 동결건조된 형태 등의) 시약에 직접적으로 첨가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "템플릿"은 적어도 하나의 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머"는 핵산 쇄 연장 반응을 개시하는 역할을 할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. 프라이머의 길이는, 예를 들어 약 5 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 10 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 15 내지 약 40개 뉴클레오티드, 또는 약 20 내지 약 30개 뉴클레오티드로 다양할 수 있다. 프라이머의 길이는 약 10개 뉴클레오티드, 약 20개 뉴클레오티드, 약 25개 뉴클레오티드, 약 30개 뉴클레오티드, 약 35개 뉴클레오티드, 약 40개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드, 약 75개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 10 내지 약 50개의 뉴클레오티드, 즉 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 18 내지 32개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, "프로브"는 혼성화를 허용하는 조건 하에서 핵산 내의 표적 서열에 (예를 들어, 특이적으로) 혼성화하여 표적 서열 또는 증폭된 핵산의 검출을 가능하게 하는 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. 프로브의 "표적"은 일반적으로 표준 수소 결합 (즉, 염기 쌍 형성)에 의해 프로브 올리고머의 적어도 일부에 특이적으로 혼성화하는 증폭된 핵산 서열 내의 서열 또는 증폭된 핵산 서열의 서브세트를 지칭한다. 프로브는 프로브의 3차원 입체형태에 기여하는 표적-특이적 서열 및 다른 서열을 포함할 수 있다. 서열은 프로브의 표적-특이적 서열에 완전히 상보적이지 않은 표적 서열에 대한 프로브 올리고머의 적절한 혼성화 조건에서 안정한 혼성화를 허용하는 경우 "충분히 상보적"이다. 프로브의 길이는, 예를 들어 약 5개 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 10개 내지 약 50개 뉴클레오티드, 약 15개 내지 약 40개 뉴클레오티드, 또는 약 20개 내지 약 30개 뉴클레오티드로 다양할 수 있다. 프로브의 길이는 약 10개 뉴클레오티드, 약 20개 뉴클레오티드, 약 25개 뉴클레오티드, 약 30개 뉴클레오티드, 약 35개 뉴클레오티드, 약 40개 뉴클레오티드, 약 50개 뉴클레오티드, 약 100개 뉴클레오티드, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로브는 10 내지 약 50개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 예를 들어, 프라이머 및/또는 프로브는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50개 또는 그 초과의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로브는 비-서열 특이적일 수 있다.
바람직하게는, 프라이머 및/또는 프로브는 8 내지 45개 뉴클레오티드의 길이일 수 있다. 예를 들어, 프라이머 및/또는 프로브는 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 프라이머 및 프로브는 5' 또는 3' 말단 또는 둘 다에 추가 뉴클레오티드를 함유하도록 변형될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 증폭 프라이머 (반드시 프로브일 필요는 없음)의 3' 말단에 대한 추가 염기가 일반적으로 템플릿 서열에 대해 상보적임을 이해할 것이다. 프라이머 및 프로브 서열은 또한 변형되어 5' 또는 3' 말단에서 뉴클레오티드를 제거할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 증폭을 위해 기능하기 위해 프라이머 또는 프로브가 본원에 개시된 바와 같은 최소 길이 및 어닐링 온도를 가질 것임을 이해할 것이다.
프라이머 및 프로브는 용융 온도 (Tm)보다 낮은 온도인 어닐링 온도에서 표적에 결합할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "Tm" 및 "용융 온도"는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자 집단의 50%가 단일 가닥으로 해리되는 온도를 지칭하는 상호교환 가능한 용어이다. 폴리뉴클레오티드의 Tm을 계산하기 위한 공식은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, Tm은 하기 수학식에 의해 계산될 수 있다: Tm = 69.3+0.41 x (G+C)%-6- 50/L, 여기서 L은 뉴클레오티드에서 프로브의 길이이다. 혼성 폴리뉴클레오티드의 Tm은 또한 1 M 염에서의 혼성화 검정으로부터 채택된 공식을 이용하여 추정될 수 있으며, 일반적으로 PCR 프라이머에 대한 Tm을 계산하는데 이용된다: [(A+T의 수) x 2℃ + (G+C의 수) x 4℃]. 예를 들어, 문헌 (C. R. Newton et al. PCR, 2nd ed., Springer-Verlag (New York: 1997), p.24, 전체가 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. Tm의 계산을 위해 서열 특징 뿐만 아니라 구조적 특징을 고려하는 다른 보다 정교한 계산이 관련 기술분야에 존재한다. 올리고뉴클레오티드의 용융 온도는 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브와 결합 서열 사이의 상보성 및 염 조건에 의존할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브는 50 mM KCl, 10 mM 트리스-HCl 버퍼에서 약 90℃ 미만, 예를 들어 약 89℃, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39℃ 또는 그 미만 (나열된 값 중 임의의 2개 사이의 범위 포함)의 Tm의 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 프라이머, 예를 들어 증폭 프라이머는, 예를 들어 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 (제1 증폭 프라이머 및 제2 증폭 프라이머)를 포함하는 증폭 프라이머 쌍으로 제공될 수 있다. 바람직하게는, 정방향 및 역방향 프라이머는 10℃ 초과로 상이하지 않은, 예를 들어 10℃ 미만, 9℃ 미만, 8℃ 미만, 7℃ 미만, 6℃ 미만, 5℃ 미만, 4℃ 미만, 3℃ 미만, 2℃ 미만 또는 1℃ 미만으로 상이한 Tm을 갖는다.
프라이머 및 프로브 서열은, 올리고뉴클레오티드가 표적 핵산 서열에 특이적으로 혼성화하기에 충분한 상보성을 함유하는 경우, 올리고뉴클레오티드 서열 내에 (표적 서열에 비해) 뉴클레오티드 치환을 가짐으로써 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, 적어도 1, 2, 3, 4개 또는 최대 약 5개의 뉴클레오티드가 치환될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보적"은 2개의 폴리뉴클레오티드 가닥의 영역 사이 또는 동일한 폴리뉴클레오티드 가닥의 2개의 영역 사이의 서열 상보성을 지칭할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 제1 영역은, 2개의 영역이 역평행 방식으로 배열될 때 제1 영역의 적어도 하나의 뉴클레오티드가 제2 영역의 염기와 염기 쌍 형성을 할 수 있는 경우, 동일하거나 상이한 폴리뉴클레오티드의 제2 영역에 대해 상보적이다. 따라서, 2개의 상보적인 폴리뉴클레오티드가 모든 뉴클레오티드 위치에서 염기 쌍을 형성할 필요는 없다. "완전히 상보적"은 제2 폴리뉴클레오티드에 100% 또는 "완전히" 상보적이고 따라서 모든 뉴클레오티드 위치에서 염기 쌍을 형성하는 제1 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. "부분적으로 상보적"은 또한 100% 상보적이지 않고 (예를 들어, 90% 또는 80% 또는 70% 상보적) 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에서 미스매치 뉴클레오티드를 함유하는 제1 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 보편적 염기를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "외인성 뉴클레오티드 서열"은 증폭에 사용되는 프라이머 또는 프로브에 의해 도입되는 서열을 지칭할 수 있으므로, 증폭 산물은 외인성 뉴클레오티드 서열 및 표적 뉴클레오티드 서열을 표적 뉴클레오티드 서열이 복사되는 원래 템플릿에서는 발견되지 않는 배열로 함유할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산 분자에 적용되는 "서열 동일성" 또는 "동일성 백분율"은 최대 동일성 백분율을 달성하도록 서열을 정렬한 후 대상 핵산 분자 서열과 동일한 후보 핵산 분자 서열 내의 핵산 잔기의 백분율을 지칭할 수 있으며, 서열 동일성의 일부로 어떠한 핵산 잔기 치환도 고려하지 않는다. 핵산 서열 동일성은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 CLUSTALW, T-COFFEE, BLASTN을 이용하여 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "충분히 상보적"은 일련의 상보적 염기 사이의 수소 결합에 의해 또 다른 염기 서열에 혼성화할 수 있는 연속적인 핵산 염기 서열을 지칭할 수 있다. 상보적 염기 서열은 표준 염기 쌍 형성 (예를 들어, G:C, A:T 또는 A:U)을 사용하여 올리고머 서열의 각각의 위치에서 상보적일 수 있거나, 상보적이지 않지만 (무염기 위치 포함) 전체 상보적 염기 서열은 적절한 혼성화 조건에서 또 다른 염기 서열과 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 잔기를 함유할 수 있다. 인접 염기는 올리고머가 혼성화하려는 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 100% 상보적일 수 있다. 실질적으로 상보적인 서열은 참조 서열과 비교하여 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 75, 70 또는 그 미만, 또는 이들 사이의 임의의 수로부터의 동일성 백분율 범위의 서열을 지칭할 수 있다. 통상의 기술자는 염기 서열 조성을 기반으로 예측될 수 있거나 통상적인 시험을 이용하여 결정될 수 있는 적절한 혼성화 조건을 쉽게 선택할 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Green and Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4th ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012)) 참조).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "멀티플렉스 PCR"은 하나 초과의 프라이머 세트가 반응에 포함되어 하나의 단일 표적 또는 2개 이상의 상이한 표적이 단일 반응 용기 (예를 들어, 튜브)에서 증폭될 수 있는 PCR 유형을 지칭한다. 멀티플렉스 PCR은, 예를 들어 실시간 PCR일 수 있다.
올리고뉴클레오티드 및 이를 함유하는 조성물
본원에 기재된 바와 같이, 핵산 증폭은 샘플에서 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상의 존재, 부재, 유형 및/또는 수준을 결정하기 위해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상의 존재, 부재 및/또는 수준은 DNA 증폭과 같은 관련 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 표적 유기체 각각의 하나 이상의 표적 유전자를 검출함으로써 결정된다. 일부 실시양태에서, 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상의 존재, 부재 또는 수준을 검출하기 위해 멀티플렉스 PCR이 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 멀티플렉스 실시간 PCR (폴리머라제 연쇄 반응) 프라이머 및 프로브 조합 뿐만 아니라 비브리오 콜레라에의 잠재적 독성을 동시에 확인 및 결정하기 위한 검출 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 브이. 콜레라에의 모든 균주에 존재하고 종에 대한 마커로서 사용되는 종-특이적 ompW 유전자, O1 및 O139 체세포 항원을 코딩하는 rfbN 및 wbfR, 및 CT를 코딩하는 ctxA를 표적으로 하는 방법 (예를 들어, 멀티플렉스 RT PCR 검정) 및 조성물 (예를 들어, 프라이머 및 프로브)이 제공된다. 또한, 본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태에서, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 특이적 yaiO 유전자는 거짓-음성 결과 (예를 들어, PCR 억제제, 기기 또는 시약 부족으로 발생됨)를 나타내기 위해 멀티플렉스 PCR에 첨가되는 내부 대조군 마커로서 사용된다.
본원에 개시되는 것은 (1) 브이. 콜레라에 균주의 확인; (2) O1 및 O139 혈청형의 구별; (3) 콜레라 독소의 검출; (4) 분변 샘플의 품질 모니터링; 및/또는 (5) DNA 추출 및 실시간 PCR 공정의 품질 관리에 대해 신속하고 경제적인 해법을 제공하는 방법 및 조성물 (예를 들어, 형광발생 서열-특이적 혼성화 프로브를 활용하는 시약)을 포함한다. 본원에 제공된 방법은 브이. 콜레라에를 함유하는 것으로 의심되는 샘플 (예를 들어, 분변 샘플) 또는 배양물로부터의 DNA를 5개 세트의 농도 최적화된 프라이머 쌍 및 프로브를 활용하는 멀티플렉스 폴리머라제 연쇄 반응 증폭에 적용하는 단계; 최적의 열 조건 하에 반응 혼합물을 처리하는 단계, 및 각각의 사이클에서 가수분해 (택맨(TaqMan)®) 프로브의 형광 신호를 모니터링하고 프로그램 종료 시 데이터를 해석하여 최종 결과를 보고함으로써 증폭된 DNA 표적을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 것은 프라이머 설계 소프트웨어 프라이머 3(Primer 3) 및 비콘 디자이너(Beacon Designer)를 사용하여 설계되고 스크리닝된 멀티플렉스 PCR 프라이머 및 프로브를 포함한다. 5개 세트의 최적화된 프라이머 및 프로브는 표 1에 제시된 프라이머 및 프로브를 포함할 수 있다. 매우 중요한 설사 병원체의 신속하고 매우 민감한 검출 및 식별은 본원에 제공된 방법론에 의해 달성된다.
일부 실시양태에서 택맨 프로브-기반 실시간 멀티플렉스 PCR 조성물 및 방법이 제공된다. 본원에 개시된 것은 비브리오 콜레라에의 신속한 확인 및 형결정을 위한 택맨 프로브-기반 멀티플렉스 실시간 PCR 조성물 (예를 들어, 시약) 및 방법 (예를 들어, 검정)을 포함한다. 현재 이용 가능한 방법과 비교하여, 본 발명의 이점은 하기를 포함한다: (1) 5개의 유전자 표적을 브이. 콜레라에 확인, 혈청형결정 및 콜레라 독소 검출이 단일 PCR 반응으로 달성될 수 있는 확립된 멀티플렉스 PCR 검출 방법을 이용하여 동시에 검출할 수 있고; (2) 설계된 내부 대조군은 분변 샘플의 품질을 모니터링하고 주로 PCR 억제제, 기기 또는 시약 부족으로 인해 발생하는 거짓-음성 결과를 나타낼 수 있고; (3) 본원에 개시된 프라이머/프로브 조합 및 멀티플렉스 실시간 PCR 방법은 높은 민감도, 포괄성 및 특이성을 달성할 수 있다. 또한, 개시된 방법은 신속하면서도 수행하기 쉽다.
표적 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 각각은 DNA 증폭에서 별도의 채널을 사용하여 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 2개 이상의 존재, 부재 및/또는 수준을 검출하기 위해 단일 형광 채널을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 조합은 일부 실시양태에서 실험을 수행하는데 필요한 시약의 양을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 콜레라 결정이 평가될 수 있는 정확한 정성적 측정 기준을 제공할 수 있다.
(예를 들어, 표준 핵산 증폭 조건, 예를 들어 표준 PCR 조건 및/또는 엄격한 혼성화 조건 하에서) 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에의 표적 유전자 영역 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 증폭 프라이머 및 프로브)가 제공된다. 샘플 (예를 들어, 대변 샘플)에서 유기체의 표적 유전자 영역의 증폭은 일부 실시양태에서 샘플에서 유기체의 존재, 부재 및/또는 수준을 나타낼 수 있다.
표적 유전자 영역은 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 브이. 콜레라에의 모든 균주에 존재하는 종-특이적 ompW 유전자는 종에 대한 마커로서 사용된다. 일부 실시양태에서, (예를 들어, 표준 핵산 증폭 조건, 예를 들어 표준 PCR 조건 및/또는 엄격한 혼성화 조건 하에서) 브이. 콜레라에의 ompW를 코딩하는 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 증폭 프라이머 및 프로브)가 제공된다. 일부 실시양태에서, ompW 유전자는 샘플에서 브이. 콜레라에의 존재, 부재 및/또는 수준을 검출하기 위한 DNA 증폭을 위한 표적 유전자로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 브이. 콜레라에의 ompW 유전자 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 및 프로브는 생물학적 샘플에서 브이. 콜레라에의 존재, 부재 및/또는 수준의 검출에 사용된다. 브이. 콜레라에의 ompW 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 예는 표 1에 제공된 바와 같은 서열식별번호: 1-11 및 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, O1 체세포 항원을 코딩하는 rfbN은 브이. 콜레라에 혈청군 O1에 대한 마커로 사용된다. 일부 실시양태에서, (예를 들어, 표준 핵산 증폭 조건, 예를 들어 표준 PCR 조건 및/또는 엄격한 혼성화 조건 하에서) 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN을 코딩하는 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 증폭 프라이머 및 프로브)가 제공된다. 일부 실시양태에서, rfbN 유전자는 샘플에서 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 존재, 부재 및/또는 수준을 검출하기 위한 DNA 증폭을 위한 표적 유전자로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 및 프로브는 생물학적 샘플에서 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 존재, 부재 및/또는 수준의 검출에 사용된다. 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 예는 표 1에 제공된 바와 같은 서열식별번호: 12-23 및 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, O139 체세포 항원을 코딩하는 wbfR은 브이. 콜레라에 혈청군 O139에 대한 마커로서 사용된다. 일부 실시양태에서, (예를 들어, 표준 핵산 증폭 조건, 예를 들어 표준 PCR 조건 및/또는 엄격한 혼성화 조건 하에서) 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR을 코딩하는 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 증폭 프라이머 및 프로브)가 제공된다. 일부 실시양태에서, wbfR 유전자는 샘플에서 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 존재, 부재 및/또는 수준을 검출하기 위한 DNA 증폭을 위한 표적 유전자로 사용된다. 일부 실시양태에서, 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 및 프로브는 생물학적 샘플에서 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 존재, 부재 및/또는 수준의 검출에 사용된다. 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 예는 표 1에 제공된 바와 같은 서열식별번호: 24-38 및 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, ctxA는 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에에 대한 마커로서 사용된다. 일부 실시양태에서, (예를 들어, 표준 핵산 증폭 조건, 예를 들어 표준 PCR 조건 및/또는 엄격한 혼성화 조건 하에서) 브이. 콜레라에의 ctxA를 코딩하는 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 증폭 프라이머 및 프로브)가 제공된다. 일부 실시양태에서, ctxA 유전자는 샘플에서 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에의 존재, 부재 및/또는 수준을 검출하기 위한 DNA 증폭을 위한 표적 유전자로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 브이. 콜레라에의 ctxA 유전자 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 및 프로브는 생물학적 샘플에서 ctxA를 코딩하는 브이. 콜레라에의 존재, 부재 및/또는 수준의 검출에 사용된다. 브이. 콜레라에의 ctxA 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 예는 표 1에 제공된 바와 같은 서열식별번호: 39-52 및 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본원에 제공된 방법 및 조성물의 일부 실시양태에서, 에스케리키아 콜라이 특이적 yaiO 유전자는 거짓-음성 결과 (예를 들어, PCR 억제제, 기기 또는 시약 부족으로 야기됨)를 나타내기 위해 멀티플렉스 PCR에 첨가되는 내부 대조군의 마커로서 사용된다. 일부 실시양태에서, (예를 들어, 표준 핵산 증폭 조건, 예를 들어 표준 PCR 조건 및/또는 엄격한 혼성화 조건 하에서) 이. 콜라이의 yaiO를 코딩하는 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 증폭 프라이머 및 프로브)가 제공된다. 일부 실시양태에서, yaiO 유전자는 샘플에서 이. 콜라이의 존재, 부재 및/또는 수준을 검출하기 위한 DNA 증폭을 위한 표적 유전자로 사용된다. 일부 실시양태에서, 이. 콜라이의 yaiO 유전자 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 및 프로브는 생물학적 샘플에서 이. 콜라이의 존재, 부재 및/또는 수준의 검출에 (예를 들어, 내부 대조군으로서) 사용된다. 이. 콜라이의 yaiO 유전자 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드의 예는 표 1에 제공된 바와 같은 서열식별번호: 53-67 및 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
표 1.
브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에, 및 이. 콜라이의 검출을 위한 프라이머 및 프로브의 비제한적 예
또한, 서열식별번호: 1-67 또는 이의 상보체와 적어도 80% (예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위) 동일한 올리고뉴클레오티드를 포함하여 서열식별번호: 1-67 또는 이의 상보체에 대해 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 미스매치 또는 보편적 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 증폭 프라이머 또는 프로브)가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 1-67로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 1-67로부터 선택되는 서열과 적어도 약 85% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 1-67로부터 선택되는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 서열식별번호: 1-67로부터 선택되는 서열과 적어도 약 85% 동일하거나 적어도 약 95% 동일한 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 프라이머의 최종 반응 농도는 약 300 nM이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 프로브의 최종 반응 농도는 약 100 nM이다.
일부 실시양태에서, 프라이머/프로브 조합이 제공된다. 프라이머/프로브 조합은 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 및 프로브 (예를 들어, 탠덤 방식으로 A3-ompW-FP, A3-ompW-RP 및 A3-ompW-프로브)를 포함할 수 있다. 본원에 제공된 조성물 및 방법은 표 1에 제공된 프라이머/프로브 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법 또는 조성물은 프라이머/프로브 조합 A3 (예를 들어, 탠덤 방식으로 A3-ompW-FP, A3-ompW-RP, 및 A3-ompW-프로브)를 포함할 수 있다. 2개 이상의 프라이머/프로브 조합을 포함하는 방법 및 조성물 (예를 들어, 멀티플렉스화된 반응)이 본원에 개시된다. 예를 들어, 방법 또는 조성물은 프라이머/프로브 조합 A3, B3, C3 및 D3 (예를 들어, 탠덤 방식으로 A3-ompW-FP, A3-ompW-RP, A3-ompW-프로브, B3-rfbN-FP, B3-rfbN-RP, B3-rfbN-프로브, C3-wbfR-15F, C3-wbfR-15R, C3-wbfR-프로브, D3-ctxA-FP, D3-ctxA-RP, 및 D3-ctxA-프로브)을 포함할 수 있다. (1) 브이. 콜레라에의 ompW 유전자의 서열 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프라이머/프로브 조합 (예를 들어, A1, A2, A3, 및/또는 또는 A4); (2) 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자의 서열 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프라이머/프로브 조합 (예를 들어, B1, B2, B3, 및/또는 B4); (3) 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자의 서열 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프라이머/프로브 조합 (예를 들어, C1, C2, C3, C4, 및/또는 C5); (4) 브이. 콜레라에의 ctxA (콜레라 독소) 유전자의 서열 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프라이머/프로브 조합 (예를 들어, D1, D2, D3, D4, 및/또는 D5); 및/또는 (5) 이. 콜라이의 yaiO 유전자의 서열 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프라이머/프로브 조합 (예를 들어, E1, E2, E3, E4, 및/또는 E5)을 포함하는 방법 및 조성물이 본원에 개시된다. 표 2에 제공된 프라이머/프로브 조합 중 하나 이상을 포함하는 방법 및 조성물이 본원에 개시된다. 표 3에 제공된 프라이머/프로브 조합 중 하나 이상을 포함하는 방법 및 조성물이 본원에 개시된다.
표 2.
브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에의 검출을 위한 표 1에 제시된 프라이머/프로브 조합의 멀티플렉스화
표 3.
브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에, 및 이. 콜라이의 검출을 위한 표 1에 제시된 프라이머/프로브 조합의 멀티플렉스화
본원에 제공된 핵산은 다양한 형태일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 핵산은 용액, 예를 들어 버퍼에 (단독으로 또는 다양한 다른 핵산과 조합하여) 용해된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 단독으로 또는 다른 단리된 핵산과 조합하여 염으로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 재구성될 수 있는 동결건조된 형태로 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 단리된 핵산은 단독으로 동결건조된 펠릿으로, 또는 다른 단리된 핵산과 함께 동결건조된 펠릿으로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비드, 막 등과 같은 고체 물질에 부착된 핵산이 제공된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 숙주 세포, 예를 들어 플라스미드를 운반하는 세포주, 또는 안정적으로 통합된 서열을 운반하는 세포주에 제공된다.
일부 실시양태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 브이. 콜레라에의 ompW 유전자의 서열 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 증폭 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물, 반응 혼합물 및 키트는 브이. 콜레라에의 ompW 유전자의 서열 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프로브를 포함한다. 본원에 개시된 것은 브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 또는 적어도 약 95% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 또는 적어도 약 95% 동일성을 나타내는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자의 서열 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 증폭 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물, 반응 혼합물 및 키트는 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자의 서열 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프로브를 포함한다. 본원에 개시된 것은 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 또는 적어도 약 95% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 12-23로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 또는 적어도 약 95% 동일성을 나타내는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자의 서열 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 증폭 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물, 반응 혼합물 및 키트는 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자의 서열 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프로브를 포함한다. 본원에 개시된 것은 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 또는 적어도 약 95% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 또는 적어도 약 95% 동일성을 나타내는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 브이. 콜레라에의 ctxA (콜레라 독소) 유전자의 서열 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 증폭 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물, 반응 혼합물 및 키트는 브이. 콜레라에의 ctxA (콜레라 독소) 유전자의 서열 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프로브를 포함한다. 본원에 개시된 것은 브이. 콜레라에의 ctxA (콜레라 독소) 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 또는 적어도 약 95% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 또는 적어도 약 95% 동일성을 나타내는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 조성물, 반응 혼합물, 및 키트는 이. 콜라이의 yaiO 유전자의 서열 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 증폭 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물, 반응 혼합물 및 키트는 이. 콜라이의 yaiO 유전자의 서열 또는 이의 상보체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 하나 이상의 프로브를 포함한다. 본원에 개시된 것은 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 또는 적어도 약 95% 동일성을 나타내는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 또는 적어도 약 95% 동일성을 나타내는 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 프로브 및/또는 프라이머 중 하나 이상 또는 2개 이상을 포함하는 조성물이 제공된다.
올리고뉴클레오티드 프로브는 일부 실시양태에서 검출 가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 올리고뉴클레오티드 프로브는 방사성 표지를 포함할 수 있다. 방사성 표지의 비제한적 예는 3H, 14C, 32P, 및 35S를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 리간드, 형광단, 화학발광제, 효소 및 항체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 비-방사성 검출 가능한 마커 또는 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 민감도 증가를 가능하게 할 수 있는 프로브와 함께 사용하기 위한 다른 검출 가능한 마커는 비오틴 및 방사성-뉴클레오티드를 포함한다. 특정 표지의 선택이 프로브에 결합되는 방식을 지시한다는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브는 하나 이상의 염료로 표지되어 템플릿 핵산에 혼성화될 때 검출 가능한 형광 변화가 생성된다. 비-특이적 염료가 일부 적용에 바람직할 수 있지만, 서열-특이적 프로브는 보다 정확한 증폭 측정을 제공할 수 있다. 서열-특이적 프로브의 한 구성은 형광단에 테더링된 프로브의 한 말단 및 소광체에 테더링된 프로브의 다른 말단을 포함할 수 있다. 프로브가 혼성화되지 않은 경우, 형광단이 소광체에 의해 소광되어 형광단이 형광을 내는 것을 방지하는 스템-루프 구성을 유지할 수 있다. 프로브가 템플릿 핵산 서열에 혼성화되면 선형화되어 형광단을 소광체로부터 멀어지게 하여 형광단이 형광을 내도록 한다. 서열-특이적 프로브의 또 다른 구성은 FRET 쌍의 제1 형광단에 테더링된 제1 프로브 및 FRET 쌍의 제2 형광단에 테더링된 제2 프로브를 포함할 수 있다. 제1 프로브 및 제2 프로브는 제1 프로브 및 제2 프로브가 동일한 앰플리콘에 혼성화될 때 FRET에 의한 에너지 전달을 허용하기에 충분히 근접한 앰플리콘의 서열에 혼성화하도록 구성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브는 택맨 프로브이다. 택맨 프로브는 형광단 및 소광체를 포함할 수 있다. 소광체 분자는 푀르스터(Foerster) 공명 에너지 전달 (FRET)을 통해 사이클러의 광원에 의해 여기될 때 형광단에서 방출되는 형광을 소광할 수 있다. 형광단 및 소광체가 근접해 있는 한, 소광은 임의의 검출 가능한 (예를 들어, 형광) 신호를 억제할 수 있다. 본원에 제공된 택맨 프로브는 본원에 제공된 프라이머에 의해 증폭된 DNA 영역 내에서 어닐링하도록 설계될 수 있다. 어떠한 특정 이론에도 얽매이지 않고, 일부 실시양태에서, PCR 폴리머라제 (예를 들어, Taq)가 프라이머를 연장하고 단일-가닥 템플릿에서 초기 가닥을 합성함에 따라, PCR 폴리머라제의 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성은 템플릿에 어닐링된 프로브를 분해한다. 프로브의 분해는 이로부터 형광단을 방출하고 소광체에 대한 근접성을 깨뜨릴 수 있으므로 소광 효과를 완화하고 형광단의 형광을 허용한다. 따라서, 정량적 PCR 열 사이클러에서 검출된 형광은 일부 실시양태에서 방출된 형광단 및 PCR에 존재하는 DNA 템플릿의 양에 정비례할 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열 특이적 프로브는 형광단에 접합된 본원에 개시된 바와 같은 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 2개 이상의 형광단에 접합된다. 형광단의 예는 크산텐 염료, 예를 들어 플루오레세인 및 로다민 염료, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), 2-[에틸아미노)-3-(에틸이미노)-2-7-디메틸-3H-크산텐-9-일]벤조산 에틸 에스테르 모노히드로클로라이드 (R6G) (약 500 내지 560 nm 범위의 파장에서 반응 방사선을 방출), 1,1,3,3,3',3'-헥사메틸인도디카르보시아닌 아이오다이드 (HIDC) (약 600 내지 660 nm 범위의 파장에서 반응 방사선을 방출), 6-카르복시플루오레세인 (일반적으로 약어 FAM 및 F로 공지됨), 6-카르복시-2',4',7',4,7-헥사클로로플루오레세인 (HEX), 6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인 (JOE 또는 J), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민 (TAMRA 또는 T), 6-카르복시-X-로다민 (ROX 또는 R), 5-카르복시로다민-6G (R6G5 또는 G5), 6-카르복시로다민-6G (R6G6 또는 G6), 및 로다민 110; 시아닌 염료, 예를 들어 Cy3, Cy5 및 Cy7 염료; 쿠마린, 예를 들어 움벨리페론; 벤즈이미드 염료, 예를 들어 훽스트(Hoechst) 33258; 페난트리딘 염료, 예를 들어 텍사스 레드; 에티듐 염료; 아크리딘 염료; 카르바졸 염료; 페녹사진 염료; 포르피린 염료; 폴리메틴 염료, 예를 들어 Cy3 (약 540 내지 580 nm 범위의 파장에서 반응 방사선 방출), Cy5 (약 640 내지 680 nm 범위의 파장에서 반응 방사선 방출) 등과 같은 시아닌 염료; BODIPY 염료 및 퀴놀린 염료를 포함한다. 관심 있는 특정 형광단은 피렌, 쿠마린, 디에틸아미노쿠마린, FAM, 플루오레세인 클로로트리아지닐, 플루오레세인, R110, 에오신, JOE, R6G, HIDC, 테트라메틸로다민, TAMRA, 리사민, ROX, 나프토플루오레세인, 텍사스 레드, 나프토플루오레세인, Cy3, 및 Cy5, CAL 플루오르 오렌지 등을 포함한다. 플루오레세인 염료의 다른 예는 6-카르복시플루오레세인 (6-FAM), 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인 (TET), 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인 (HEX), 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시로다민 (JOE), 2'-클로로-5'-플루오로-7',8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 (NED), 및 2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 (VIC)를 포함한다. 프로브는 SpC6, 또는 이의 기능적 등가물 및 유도체를 포함할 수 있다. 프로브는 스페이서 모이어티를 포함할 수 있다. 스페이서 모이어티는 적어도 2개 탄소 내지 약 12개 탄소의 알킬기를 포함할 수 있다. 프로브는 무염기 단위를 포함하는 스페이서를 포함할 수 있다. 프로브는 idSp, iSp9, iS18, iSpC3, iSpC6, iSpC12, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 스페이서를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로브는 소광체에 접합된다. 소광체는 전자기 방사선을 흡수하고 이를 열로 발산하여 어두운 상태로 남을 수 있다. 예시적인 소광체는 다브실(Dabcyl), NFQ, 예컨대 BHQ-1 또는 BHQ-2 (바이오서치(Biosearch)), 아이오와 블랙(IOWA BLACK) FQ (IDT), 및 아이오와 블랙 RQ (IDT)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 소광체는 형광단에 의해 방출되는 전자기 방사선을 흡수하기 위해 형광단과 쌍을 이루도록 선택된다. 본원에 개시된 조성물 및 방법에 유용한 형광단/소광체 쌍은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 (Marras, "Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes", www.molecular-beacons.org/download/marras,mmb06%28335%293.pdf에서 이용 가능)에서 찾아질 수 있고, 예를 들어 이에 기재될 수 있다. 소광체 모이어티의 예는 다크 소광체, 블랙 홀 켄처(Black Hole Quencher)® (BHQ®) (예를 들어, BHQ-0, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3), Qxl 소광체, ATTO 소광체 (예를 들어, ATTO 540Q, ATTO 580Q 및 ATTO 612Q), 디메틸아미노아조벤젠술폰산 (다브실), 아이오와 블랙 RQ, 아이오와 블랙 FQ, IRDye QC-1, QSY 염료 (예를 들어, QSY 7, QSY 9, QSY 21), 앱솔루트켄처(AbsoluteQuencher), 이클립스(Eclipse), 및 금 나노 입자와 같은 금속 클러스터 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. ATTO 소광체의 예는 ATTO 540Q, ATTO 580Q 및 ATTO 612Q를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 블랙 홀 켄처® (BHQ®)의 예는 BHQ-0 (493 nm), BHQ-1 (534 nm), BHQ-2 (579 nm) 및 BHQ-3 (672 nm)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 검출 가능한 표지는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 염료 (예를 들어, 알렉사 플루오르® 350, 알렉사 플루오르® 405, 알렉사 플루오르® 430, 알렉사 플루오르® 488, 알렉사 플루오르® 500, 알렉사 플루오르® 514, 알렉사 플루오르® 532, 알렉사 플루오르® 546, 알렉사 플루오르® 555, 알렉사 플루오르® 568, 알렉사 플루오르® 594, 알렉사 플루오르® 610, 알렉사 플루오르® 633, 알렉사 플루오르® 635, 알렉사 플루오르® 647, 알렉사 플루오르® 660, 알렉사 플루오르® 680, 알렉사 플루오르® 700, 알렉사 플루오르® 750, 알렉사 플루오르® 790), ATTO 염료 (예를 들어, ATTO 390, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTO Rhol l, ATTO Rhol2, ATTO 티올 2, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rhol3, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rhol4, ATTO 633, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxal2, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740), 디파이트(DyFight) 염료, 시아닌 염료 (예를 들어, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy3b, Cy5, Cy5.5, Cy7, Cy7.5), 플루오프로브스(FluoProbes) 염료, 술포(Sulfo) Cy 염료, 세타(Seta) 염료, IRIS 염료, 세타우(SeTau) 염료, SR플루오르(SRfluor) 염료, 스퀘어(Square) 염료, 플루오레세인 (FITC), 테트라메틸로다민 (TRITC), 텍사스 레드, 오레곤 그린(Oregon Green), 퍼시픽 블루(Pacific Blue), 퍼시픽 그린(Pacific Green), 퍼시픽 오렌지(Pacific Orange), 양자점, 테더링된 형광 단백질로부터 선택되는 형광 표지이다.
일부 실시양태에서, 형광단은 프로브의 제1 말단에 부착되고 소광체는 프로브의 제2 말단에 부착된다. 일부 실시양태에서, 프로브는 2개 이상의 형광단을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로브는 2개 이상의 소광체 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로브는 하나 이상의 소광체 모이어티 및/또는 하나 이상의 형광단을 포함할 수 있다. 소광체 모이어티 또는 형광단은 프로브의 임의의 부분 (예를 들어, 프로브의 5' 말단, 3' 말단 및/또는 중간)에 부착될 수 있다. 임의의 프로브 뉴클레오티드는 형광단 또는, 예를 들어 BHQ1dT와 같은 소광체 모이어티를 포함할 수 있다. 부착은 공유 결합을 포함할 수 있고, 임의적으로 프로브와 형광단 또는 소광체 사이에 위치된 적어도 하나의 링커 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 형광단은 프로브의 5' 말단에 부착되고 소광체는 프로브의 3' 말단에 부착된다. 일부 실시양태에서, 형광단은 프로브의 3' 말단에 부착되고 소광체는 프로브의 5' 말단에 부착된다. 정량적 핵산 증폭에 사용될 수 있는 프로브의 예는 분자 비콘, 스코피온(SCORPION)™ 프로브 (시그마(Sigma)), 택맨™ 프로브 (라이프 테크놀로지즈(Life Technologies) 등을 포함한다. 본원에 개시된 실시양태에서 유용한 다른 핵산 검출 기술은 나노입자 프로브 기술 (Elghanian, et al. (1997) Science 277:1078-1081.) 및 앰플리플루오르(Amplifluor) 프로브 기술 (미국 특허 번호 5,866,366; 6,090,592; 6,117,635; 및 6,117,986)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 브이. 콜레라에를 검출하기 위한 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 1-8의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 1-8의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성 (예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위)을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 12-19의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 12-19의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성 (예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위)을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 24-33의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 24-33의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성 (예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위)을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 및 브이. 콜레라에의 ctxA (콜레라 독소) 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 39-48의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 39-48의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성 (예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위)을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍을 포함한다. 조성물은 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 53-62의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 53-62의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성 (예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위)을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍은 서열식별번호: 1, 3, 5 또는 7의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호: 2, 4, 6 또는 8의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고; 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍은 서열식별번호: 12, 14, 16 또는 18의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호: 13, 15, 17 또는 19의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고; 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍은 서열식별번호: 24, 26, 28, 30 또는 32의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호: 25, 27, 29, 31 또는 33의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고; 브이. 콜레라에의 ctxA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍은 서열식별번호: 39, 41, 43, 45 또는 47의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호: 40, 42, 44, 46 또는 48의 서열을 포함하는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍은 서열식별번호: 53, 55, 57, 59 또는 61의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호: 54, 56, 58, 60 또는 62의 서열을 포함하는 프라이머를 포함한다.
조성물은 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함할 수 있으며, 여기서 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각은 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성 (예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위)을 나타내는 서열을 포함한다. 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각은 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다. 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각은 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어질 수 있다. 복수의 프로브 중 적어도 하나는 형광 방출체 모이어티 및 형광 소광체 모이어티를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 프로브는 형광 방출체 모이어티, 형광 소광체 모이어티, 또는 둘 다를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같이, 반응 혼합물은 본원에 개시된 프라이머 중 하나 이상, 본원에 개시된 프로브 (예를 들어, 형광단-함유 프로브) 중 하나 이상, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 본원에 개시된 프라이머 및/또는 프로브-함유 조성물 중 하나 이상을 포함한다. 반응 혼합물은 또한 다양한 추가 성분을 포함할 수 있다. 반응 혼합물의 추가 성분의 예는 템플릿 DNA, DNA 폴리머라제 (예를 들어, Taq DNA 폴리머라제), 데옥시뉴클레오티드 (dNTP), 버퍼 용액, 2가 양이온, 1가 양이온 칼륨 이온, 및 이의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 실시간 PCR을 위한 마스터 믹스이다.
샘플
본원에 개시된 방법 및 조성물은 매우 다양한 샘플에서 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상을 검출하는데 적합하다. 본원에 사용된 바와 같이, "샘플"은 콜레라로 고통 받는 것으로 의심되는 1명 이상의 대상체로부터 취한 임의의 유형의 생물학적 기원 물질을 지칭할 수 있다. 샘플은, 예를 들어 유체, 조직 또는 세포를 포함할 수 있다. 샘플은 대상체로부터 직접적으로 취한 생물학적 물질, 배양된 세포 또는 조직, 또는 생물학적 물질로부터 생성되거나 유래된 임의의 분획 또는 생성물을 포함할 수 있다. 샘플은 정제, 부분 정제, 비정제, 농축 또는 증폭될 수 있다.
샘플은 생물학적 샘플, 예를 들어 임상 샘플일 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 질, 요도, 음경, 항문, 인후, 자궁경부, 발효액, 세포 배양액 등과 같은 생물학적 공급원에서 취해진다. 샘플은, 예를 들어 대변 샘플로부터의 유체 및 세포를 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 (i) 대상체 또는 공급원으로부터 수득된 대로 직접적으로 사용되거나 (ii) 샘플의 특징을 변형하기 위한 전-처리 후에 사용될 수 있다. 따라서, 시험 샘플은, 예를 들어 세포 또는 바이러스 입자를 파괴하고, 고체 물질로부터 액체를 제조하고, 점성 유체를 희석하고, 액체를 여과하고, 액체를 농축하고, 방해 성분을 비활성화하고, 시약을 첨가하고, 핵산을 정제하는 등에 의해 사용 전에 전-처리될 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 "생물학적 샘플"은 임상 또는 생물학적 표본으로부터 추출되는 핵산 (DNA, RNA 또는 총 핵산)을 포함한다. 샘플 제조는 또한 분석용 샘플을 제조하는데 사용되는 버퍼, 염, 세제 등을 함유하는 용액을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 분자 시험 전에 처리된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 직접적으로 분석되며 시험 전에 사전-처리되지 않는다. 샘플은, 예를 들어 대변 샘플일 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 콜레라의 임상 증상을 갖는 환자로부터의 대변 샘플이다.
대변 샘플은 종종 다수의 유기체로 감염된다. 개시된 프라이머 및 프로브는 대변 샘플의 혼합된 감염에 내성이 있다.
일부 실시양태에서, 시험될 샘플은 본원에 개시된 방법을 수행하기 전에 처리된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 샘플은 본원에 개시된 방법을 수행하기 전에 단리, 농축 또는 다양한 다른 처리 단계를 거칠 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 샘플은 본원에 개시된 바와 같이 샘플을 올리고뉴클레오티드와 접촉시키기 전에 샘플로부터 핵산을 단리하기 위해 처리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 샘플을 시험관내에서 배양하지 않고 샘플에 대해 수행된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 본원에 개시된 바와 같이 샘플을 올리고뉴클레오티드와 접촉시키기 전에 샘플로부터 핵산을 단리하지 않고 샘플에 대해 수행된다.
샘플은 하나 이상의 핵산 (예를 들어, 복수의 핵산)을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "복수"는 2개 이상을 지칭할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 샘플은 2개 이상 (예를 들어, 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상, 또는 5,000개 이상)의 핵산 (예를 들어, gDNA, mRNA)을 포함한다. 개시된 방법은 샘플 (예를 들어, gDNA와 같은 핵산의 복합 혼합물)에 존재하는 표적 핵산 (예를 들어, 브이. 콜레라에의 ompW 유전자)을 검출하기 위해 매우 민감한 방식으로 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 서열이 서로 상이한 5개 이상의 핵산 (예를 들어, 10개 이상, 20개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상 또는 5,000개 이상의 핵산)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 10개 이상, 20개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 500개 이상, 103개 이상, 5 x 103개 이상, 104개 이상, 5 x 104개 이상, 105개 이상, 5 x 105개 이상, 106개 이상, 5 x 106개 이상, 또는 107개 이상의 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 샘플은 10 내지 20, 20 내지 50, 50 내지 100, 100 내지 500, 500 내지 103, 103 내지 5 x 103, 5 x 103 내지 104, 104 내지 5 x 104, 5 x 104 내지 105, 105 내지 5 x 105, 5 x 105 내지 106, 106 내지 5 x 106, 또는 5 x 106 내지 107, 또는 107개 초과의 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 5 내지 107개의 핵산 (예를 들어, 서열이 서로 상이한 것) (예를 들어, 5 내지 106, 5 내지 105, 5 내지 50,000, 5 내지 30,000, 10 내지 106, 10 내지 105, 10 내지 50,000, 10 내지 30,000, 20 내지 106, 20 내지 105, 20 내지 50,000, 또는 20 내지 30,000개의 핵산, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 서열이 서로 상이한 20개 이상의 핵산을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "샘플"은 (예를 들어, 표적 핵산이 핵산 집단 중에 존재하는지의 여부를 결정하기 위해) 핵산을 포함하는 임의의 샘플을 의미할 수 있다. 샘플은 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어 샘플은 정제된 핵산의 합성 조합일 수 있고; 샘플은 세포 용해물, DNA-농축된 세포 용해물 또는 세포 용해물로부터 단리 및/또는 정제된 핵산일 수 있다. 샘플은 (예를 들어, 진단 목적을 위해) 환자로부터 수득될 수 있다. 샘플은 투과성 세포로부터 수득될 수 있다. 샘플은 가교된 세포로부터 수득될 수 있다. 샘플은 조직 절편에 있을 수 있다. 샘플은 균일한 굴절률을 만들기 위한 탈지 및 조정이 뒤따르는 가교에 의해 제조되는 조직으로부터의 것일 수 있다.
"샘플"은 표적 핵산 (예를 들어, 브이. 콜레라에의 ompW 유전자) 및 복수의 비-표적 핵산을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 10개의 비-표적 핵산당 1 카피, 20개의 비-표적 핵산당 1 카피, 25개의 비-표적 핵산당 1 카피, 50개의 비-표적 핵산당 1 카피, 100개의 비-표적 핵산당 1 카피, 500개의 비-표적 핵산당 1 카피, 103개의 비-표적 핵산당 1 카피, 5 x 103개의 비-표적 핵산당 1 카피, 104개의 비-표적 핵산당 1 카피, 5 x 104개의 비-표적 핵산당 1 카피, 105개의 비-표적 핵산당 1 카피, 5 x 105개의 비-표적 핵산당 1 카피, 106개의 비-표적 핵산당 1 카피, 106개의 비-표적 핵산당 1 카피 미만, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위로 샘플에 존재한다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 10개의 비-표적 핵산당 1 카피 내지 20개의 비-표적 핵산당 1 카피, 20개의 비-표적 핵산당 1 카피 내지 50개의 비 표적 핵산당 1 카피, 50개의 비-표적 핵산당 1 카피 내지 100개의 비-표적 핵산당 1 카피, 100개의 비-표적 핵산당 1 카피 내지 500개의 비-표적 핵산당 1 카피, 500개의 비 표적 핵산당 1 카피 내지 103개의 비-표적 핵산당 1 카피, 103개의 비-표적 핵산당 1 카피 내지 5 x 103개의 비-표적 핵산당 1 카피, 5 x 103개의 비-표적 핵산당 1 카피 내지 104 비 표적 핵산당 1 카피, 104개의 비-표적 핵산당 1 카피 내지 105개의 비-표적 핵산당 1 카피, 105개의 비-표적 핵산당 1 카피 내지 106개의 비-표적 핵산당 1 카피, 또는 106개의 비 표적 핵산당 1 카피 내지 107개의 비-표적 핵산당 1 카피, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위로 샘플에 존재한다.
적합한 샘플은 타액, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 흡인물 및 생검 샘플을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 환자에 관한 용어 "샘플"은 생물학적 기원의 혈액 및 다른 액체 샘플, 생검 표본 또는 조직 배양물과 같은 고형 조직 샘플 또는 이로부터 유래된 세포 및 이의 자손을 포괄한다. 이 정의는 또한 시약으로의 처리와 같이 조달 후 임의의 방식으로 조작되거나; 세척되거나; 암 세포와 같은 특정 세포 집단에 대해 농축된 샘플을 포함한다. 이 정의는 또한 특정 유형의 분자, 예를 들어, 핵산이 농축된 샘플을 포함한다. 용어 "샘플"은 혈액, 혈장, 혈청, 흡인물, 뇌척수액 (CSF)과 같은 임상 샘플과 같은 생물학적 샘플을 포괄하며, 또한 외과적 절제로 수득되는 조직, 생검에 의해 수득되는 조직, 배양 중인 세포, 세포 상층액, 세포 용해물, 조직 샘플, 기관, 골수 등을 포함한다. "생물학적 샘플"은 이로부터 (예를 들어, 암성 세포, 감염된 세포 등) 유래되는 생물학적 유체 , 예를 들어 이러한 세포로부터 수득되는 핵산을 포함하는 샘플 (예를 들어, 세포 용해물 또는 핵산을 포함하는 다른 세포 추출물)을 포함한다.
본원에 개시된 방법에 사용하기에 적합한 샘플은 식물, 동물, 박테리아 등과 같은 유기체 또는 이의 일부로부터 수득되는 임의의 통상적인 생물학적 샘플을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 인간 대상체와 같은 동물 대상체로부터 수득된다. 생물학적 샘플은 제한 없이 특히 박테리아, 효모, 원생동물 및 아메바와 같은 단세포 유기체, 다세포 유기체 (예컨대 식물 또는 건강하거나 외관상 건강한 인간 대상체 또는 병원성 박테리아 또는 바이러스와 같은 병원성 미생물로의 감염과 같이 진단 또는 조사될 병태 또는 질환에 의해 영향을 받는 인간 환자로부터 샘플을 포함하는 동물)를 포함한 임의의 살아 있는 유기체로부터 수득되거나, 이에 의해 배출되거나, 이에 의해 분비되는 임의의 고체 또는 유체 샘플이다. 예를 들어, 생물학적 샘플은, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 객담, 점액, 림프, 윤활액, 담즙, 복수, 흉수, 혈청종, 타액, 뇌척수액, 방수 또는 유리체액, 또는 임의의 신체 분비물, 누출액, 삼출물 (예를 들어, 농양 또는 감염 또는 염증의 임의의 다른 부위로부터 수득되는 유체), 또는 관절 (예를 들어, 정상 관절 또는 류마티스성 관절염, 골관절염, 통풍 또는 패혈성 관절염과 같은 질환에 의해 영향을 받는 관절)로부터 수득되는 유체, 또는 피부 또는 점막 표면의 면봉채취물로부터 수득되는 생물학적 유체일 수 있다.
샘플은 또한 임의의 기관 또는 조직 (종양 생검과 같은 생검 또는 부검 표본 포함)으로부터 수득되는 샘플일 수 있거나 세포 (1차 세포 또는 배양된 세포) 또는 임의의 세포, 조직 또는 기관에 의해 컨디셔닝된 매질을 포함할 수 있다. 예시적인 샘플은 제한 없이 세포, 세포 용해물, 혈액 도말물, 세포원심분리 제제, 세포학 도말물, 체액 (예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 객담, 소변, 기관지폐포 세척액, 정액 등), 조직 생검 (예를 들어, 종양 생검), 미세-바늘 흡인물, 및/또는 조직 절편 (예를 들어, 크리오스타트 조직 절편 및/또는 파라핀-포매된 조직 절편)을 포함한다. 다른 예에서, 샘플은 (세포 표면 마커에 의해 확인될 수 있는) 순환하는 종양 세포를 포함한다. 특정 예에서, 샘플은 직접적으로 사용되거나 (예를 들어, 신선 또는 냉동), 예를 들어 고정 (예를 들어, 포르말린 사용) 및/또는 왁스에 포매 (예컨대 포르말린-고정되고 파라핀-포매된 (FFPE) 조직 샘플)에 의해 사용 전에 조작될 수 있다. 대상체로부터 조직을 수득하는 임의의 방법이 활용될 수 있으며, 이용되는 방법의 선택은 조직의 유형, 대상체의 연령 또는 의사가 이용할 수 있는 절차와 같은 다양한 요인에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다. 이러한 샘플을 획득하기 위한 표준 기술은 관련 기술분야에서 이용 가능하다.
다른 실시양태에서, 샘플은 물, 토양 또는 산업 또는 의료 표면과 같은 표면과 같은 환경 샘플일 수 있다.
본원에 개시된 실시양태의 증가된 민감도로 인해, 특정 예의 실시양태에서, 검정 및 방법은 미정제 샘플 또는 검출될 표적 분자가 샘플로부터 더 이상 분획화되거나 정제되지 않는 샘플에서 실행될 수 있다.
샘플 추출
전형적인 샘플 추출에서, 미국 특허 번호 7,494,771 (전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 유리 비드로의 기계적 전단에 의해 세포를 용해시켜 표적 유기체를 용해시킨다. WO03/008636에 개시된 바와 같이, 이러한 일반적인 세포 용해 방법은 다양한 표적 유기체 및 표본 매트릭스에 효율적이다. 또한, 특정 종 또는 유기체 그룹을 특이적으로 표적으로 하도록 설계되거나 특정 효소 또는 화학적 활성을 활용하는 덜 보편적인 다른 용해 방법도 있다. 예를 들어, ACP 효소는 그람-양성 유기체 (Ezaki et al., J. Clin. Microbiol., 16(5):844-846 (1982); Paule et al., J. Mol. Diagn., 6(3):191-196 (2004); 미국 특허 번호 3,649,454; 모두 전체가 본원에 참조로 포함됨) 및 미코박테리아 (미국 특허 번호 5,185,242, 전체가 참조로 포함됨)의 용해에 통상적으로 사용되나, 일반적으로 이. 콜라이 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) (미국 특허 번호 3,649,454, 전체가 참조로 포함됨)와 같은 그람-음성 종의 용해와 관련하여 덜 효과적인 것으로 간주된다.
핵산 시험
본원에 기재된 방법은, 예를 들어 핵산 시험을 포함할 수 있다. 예를 들어, 시험은 샘플의 표적 핵산 서열에 대한 시험을 포함할 수 있다. 핵산 증폭을 수반하는 시험을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 다양한 형태의 핵산 시험이 본원에 개시된 실시양태에서 이용될 수 있다. 표적 핵산 (예를 들어, gDNA, mRNA)은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 표적 핵산의 공급원은 임의의 공급원 (예를 들어, 임의의 샘플)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 핵산은 박테리아 핵산 (예를 들어, 게놈 DNA (gDNA) 또는 박테리아의 mRNA)이다. 이와 같이, 본원에 제공된 조성물 및 방법은 (예를 들어, 샘플에서) 핵산 집단 중의 박테리아 핵산의 존재를 검출하기 위해 이용될 수 있다.
고도의 민감도로 상기 표적 핵산을 검출할 수 있는 샘플에서 표적 핵산 (예를 들어, 브이. 콜레라에의 ompW 유전자)을 검출하기 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 및 방법은 복수의 핵산 (표적 핵산 및 복수의 비-표적 핵산 포함)을 포함하는 샘플에 존재하는 표적 핵산을 검출하기 위해 이용될 수 있으며, 여기서 표적 핵산은 107개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피 (예를 들어, 106개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 105개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 104개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 103개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 102개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 50개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 20개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 10개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 또는 5개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피)로 존재한다. 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 복수의 핵산 (표적 핵산 및 복수의 비-표적 핵산 포함)을 포함하는 샘플에 존재하는 표적 핵산을 검출하기 위해 사용될 수 있으며, 여기서 표적 핵산은 1018개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피 (예를 들어, 1015개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 1012개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 109개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 106개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 105개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 104개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 103개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 102개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 50개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 20개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 10개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피, 또는 5개의 비-표적 핵산당 하나 이상의 카피)로 존재한다.
일부 실시양태에서, 샘플에서 표적 핵산 (예를 들어, 브이. 콜레라에의 ompW 유전자)을 검출하는 개시된 방법에 대한 검출 역치는 10 nM 이하이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "검출 역치"는 검출이 일어나기 위해 샘플에 존재해야 하는 표적 핵산의 최소량을 기술할 수 있다. 따라서, 예시적인 예로서, 검출 역치가 10 nM인 경우, 표적 핵산이 10 nM 이상의 농도로 샘플에 존재할 때 신호를 검출할 수 있다. 일부 실시양태에서, (개시된 방법에서 표적 핵산을 검출하기 위한) 검출 역치는 500 fM 내지 1 nM의 범위 (예를 들어, 500 fM 내지 500 pM, 500 fM 내지 200 pM, 500 fM 내지 100 pM, 500 fM 내지 10 pM, 500 fM 내지 1 pM, 800 fM 내지 1 nM, 800 fM 내지 500 pM, 800 fM 내지 200 pM, 800 fM 내지 100 pM, 800 fM 내지 10 pM, 800 fM 내지 1 pM, 1 pM 내지 1 nM, 1 pM 내지 500 pM, 1 pM 내지 200 pM, 1 pM 내지 100 pM, 또는 1 pM 내지 10 pM, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위)이다 (여기서 농도는 표적 핵산이 검출될 수 있는 표적 핵산의 역치 농도를 지칭함). 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 800 fM 내지 100 pM 범위의 검출 역치를 갖는다. 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 1 pM 내지 10 pM 범위의 검출 역치를 갖는다. 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 10 fM 내지 500 fM, 예를 들어 10 fM 내지 50 fM, 50 fM 내지 100 fM, 100 fM 내지 250 fM, 또는 250 fM 내지 500 fM의 범위, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위의 검출 역치를 갖는다.
일부 실시양태에서, 샘플에서 표적 핵산 (예를 들어, 브이. 콜레라에의 ompW 유전자)이 검출될 수 있는 최소 농도는 500 fM 내지 1 nM의 범위 (예를 들어, 500 fM 내지 500 pM, 500 fM 내지 200 pM, 500 fM 내지 100 pM, 500 fM 내지 10 pM, 500 fM 내지 1 pM, 800 fM 내지 1 nM, 800 fM 내지 500 pM, 800 fM 내지 200 pM, 800 fM 내지 100 pM, 800 fM 내지 10 pM, 800 fM 내지 1 pM, 1 pM 내지 1 nM, 1 pM 내지 500 pM, 1 pM 내지 200 pM, 1 pM 내지 100 pM, 또는 1 pM 내지 10 pM, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위)이다. 일부 실시양태에서, 샘플에서 표적 핵산이 검출될 수 있는 최소 농도는 800 fM 내지 100 pM 범위이다. 일부 실시양태에서, 샘플에서 표적 핵산이 검출될 수 있는 최소 농도는 1 pM 내지 10 pM 범위이다.
일부 실시양태에서, (개시된 방법에서 표적 핵산을 검출하기 위한) 검출 역치는 1 aM 내지 1 nM의 범위 (예를 들어, 1 aM 내지 500 pM, 1 aM 내지 200 pM, 1 aM 내지 100 pM, 1 aM 내지 10 pM, 1 aM 내지 1 pM, 100 aM 내지 1 nM, 100 aM 내지 500 pM, 100 aM 내지 200 pM, 100 aM 내지 100 pM, 100 aM 내지 10 pM, 100 aM 내지 1 pM, 250 aM 내지 1 nM, 250 aM 내지 500 pM, 250 aM 내지 200 pM, 250 aM 내지 100 pM, 250 aM 내지 10 pM, 250 aM 내지 1 pM, 500 aM 내지 1 nM, 500 aM 내지 500 pM, 500 aM 내지 200 pM, 500 aM 내지 100 pM, 500 aM 내지 10 pM, 500 aM 내지 1 pM, 750 aM 내지 1 nM, 750 aM 내지 500 pM, 750 aM 내지 200 pM, 750 aM 내지 100 pM, 750 aM 내지 10 pM, 750 aM 내지 1 pM, 1 fM 내지 1 nM, 1 fM 내지 500 pM, 1 fM 내지 200 pM, 1 fM 내지 100 pM, 1 fM 내지 10 pM, 1 fM 내지 1 pM, 500 fM 내지 500 pM, 500 fM 내지 200 pM, 500 fM 내지 100 pM, 500 fM 내지 10 pM, 500 fM 내지 1 pM, 800 fM 내지 1 nM, 800 fM 내지 500 pM, 800 fM 내지 200 pM, 800 fM 내지 100 pM, 800 fM 내지 10 pM, 800 fM 내지 1 pM, 1 pM 내지 1 nM, 1 pM 내지 500 pM, 1 pM 내지 200 pM, 1 pM 내지 100 pM, 또는 1 pM 내지 10 pM, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위)이다 (여기서 농도는 표적 핵산이 검출될 수 있는 표적 핵산의 역치 농도를 지칭함). 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 1 aM 내지 800 aM 범위의 검출 역치를 갖는다. 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 50 aM 내지 1 pM 범위의 검출 역치를 갖는다. 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 50 aM 내지 500 fM 범위의 검출 역치를 갖는다.
일부 실시양태에서, 샘플에서 표적 핵산 (예를 들어, 브이. 콜레라에의 ompW 유전자)이 검출될 수 있는 최소 농도는 1 aM 내지 1 nM의 범위 (예를 들어, 1 aM 내지 500 pM, 1 aM 내지 200 pM, 1 aM 내지 100 pM, 1 aM 내지 10 pM, 1 aM 내지 1 pM, 100 aM 내지 1 nM, 100 aM 내지 500 pM, 100 aM 내지 200 pM, 100 aM 내지 100 pM, 100 aM 내지 10 pM, 100 aM 내지 1 pM, 250 aM 내지 1 nM, 250 aM 내지 500 pM, 250 aM 내지 200 pM, 250 aM 내지 100 pM, 250 aM 내지 10 pM, 250 aM 내지 1 pM, 500 aM 내지 1 nM, 500 aM 내지 500 pM, 500 aM 내지 200 pM, 500 aM 내지 100 pM, 500 aM 내지 10 pM, 500 aM 내지 1 pM, 750 aM 내지 1 nM, 750 aM 내지 500 pM, 750 aM 내지 200 pM, 750 aM 내지 100 pM, 750 aM 내지 10 pM, 750 aM 내지 1 pM, 1 fM 내지 1 nM, 1 fM 내지 500 pM, 1 fM 내지 200 pM, 1 fM 내지 100 pM, 1 fM 내지 10 pM, 1 fM 내지 1 pM, 500 fM 내지 500 pM, 500 fM 내지 200 pM, 500 fM 내지 100 pM, 500 fM 내지 10 pM, 500 fM 내지 1 pM, 800 fM 내지 1 nM, 800 fM 내지 500 pM, 800 fM 내지 200 pM, 800 fM 내지 100 pM, 800 fM 내지 10 pM, 800 fM 내지 1 pM, 1 pM 내지 1 nM, 1 pM 내지 500 pM, 1 pM 내지 200 pM, 1 pM 내지 100 pM, 또는 1 pM 내지 10 pM, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위)이다. 일부 실시양태에서, 샘플에서 표적 핵산이 검출될 수 있는 최소 농도는 1 aM 내지 500 pM 범위이다. 일부 실시양태에서, 샘플에서 표적 핵산이 검출될 수 있는 최소 농도는 100 aM 내지 500 pM 범위이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물 또는 방법은 아토몰 (aM) 검출 민감도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 조성물 또는 방법은 펨토몰 (fM) 검출 민감도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 조성물 또는 방법은 피코몰 (pM) 검출 민감도를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 조성물 또는 방법은 나노몰 (nM) 검출 민감도를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산 증폭은 서열-특이적 방법을 이용하여 표적 핵산 서열 또는 이의 상보체 또는 단편의 다수의 카피를 수득하기 위한 임의의 공지된 절차를 지칭할 수 있다. 공지된 증폭 방법의 예는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 루프-매개된 등온 증폭 (LAMP), 가닥 대체 증폭 (SDA) (예를 들어, 다수의 대체 증폭 (MDA)), 헬리카제-매개된 증폭, 면역-증폭, 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 자가-지속된 서열 복제 (3SR), 롤링 서클 증폭, 및 전사-매개된 증폭 (TMA)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌 (Mullis, "Process for Amplifying, Detecting, and/or Cloning Nucleic Acid Sequences," 미국 특허 번호 4,683,195; Walker, "Strand Displacement Amplification," 미국 특허 번호 5,455,166; Dean et al., "Multiple displacement amplification," 미국 특허 번호 6,977,148; Notomi et al., "Process for Synthesizing Nucleic Acid," 미국 특허 번호 6,410,278; Landegren et al., 미국 특허 번호 4,988,617 "Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids"; Birkenmeyer, "Amplification of Target Nucleic Acids Using Gap Filling Ligase Chain Reaction," 미국 특허 번호 5,427,930; Cashman, "Blocked-Polymerase Polynucleotide Immunoassay Method and Kit," 미국 특허 번호 5,849,478; Kacian et al., "Nucleic Acid Sequence Amplification Methods," 미국 특허 번호 5,399,491; Malek et al., "Enhanced Nucleic Acid Amplification Process," 미국 특허 번호 5,130,238; Lizardi et al., BioTechnology, 6:1197 (1988); Lizardi et al., 미국 특허 번호 5,854,033 "Rolling circle replication reporter systems")을 참조한다. 일부 실시양태에서, 전술된 핵산 증폭 방법 중 2개 이상이, 예를 들어 순차적으로 수행될 수 있다.
예를 들어, LCR 증폭은 혼성화, 라이게이션 및 변성의 다수의 사이클을 사용하여 표적 및 이의 상보적 가닥을 증폭하기 위해 적어도 4개의 개별 올리고뉴클레오티드를 사용한다 (EP 특허 번호 0 320 308). SDA는 표적 서열을 포함하는 반변형된 DNA 듀플렉스의 한 가닥을 닉킹하는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 함유하는 프라이머를 사용하여 증폭한 후, 일련의 프라이머 연장 및 가닥 대체 단계에서 증폭한다 (Walker et al., 미국 특허 번호 5,422,252).
PCR은 핵산 증폭을 위해 관련 기술분야에 널리 공지된 방법이다. PCR은 표적 서열을 플랭킹하는 2개 이상의 연장 가능한 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 표적 서열을 증폭하는 것을 수반한다. 관심 있는 표적 서열을 함유하는 핵산은 프라이머, 내열성 DNA 폴리머라제 (예를 들어, Taq 폴리머라제) 및 다양한 dNTP의 존재 하에 다수 라운드의 열적 사이클링 프로그램 (변성, 어닐링 및 연장)에 적용되어 결과적으로 표적 서열이 증폭된다. PCR은 DNA 분자의 정의된 영역의 상보적 가닥이 내열성 DNA 폴리머라제에 의해 동시에 합성되는 다수 라운드의 프라이머 연장 반응을 사용한다. 각각의 사이클이 끝나면 새로 합성된 각각의 DNA 분자는 다음 사이클의 템플릿 역할을 한다. 이러한 반응의 반복되는 라운드 동안 새로 합성된 DNA 가닥의 수는 기하급수적으로 증가하여 20 내지 30회의 반응 사이클 후 초기 템플릿 DNA는 수천 배 또는 수백만 배 복제될 것이다. 상이한 유형 및 모드의 PCR을 수행하는 방법은 문헌 (예를 들어, "PCR Primer: A Laboratory Manual" Dieffenbach and Dveksler, eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995), 특허 (예를 들어, Mullis et al., 미국 특허 번호 4,683,195, 4,683,202 및 4,800,159) 및 과학 공개문 (예를 들어, Mullis et al. 1987, Methods in Enzymology, 155:335-350) (각각의 참조문헌의 내용은 전체가 참조로 본원에 포함됨)에 자세히 기재되어 있다.
PCR은 증폭 후 처리에 적합한 이중-가닥 증폭 생성물을 생성할 수 있다. 원하는 경우, 증폭 생성물은 아가로스 겔 전기영동으로의 시각화, 프로브-기반 비색 검출을 이용하는 효소 면역검정 포맷, 형광 방출 기술, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 검출 수단에 의해 검출될 수 있다.
다양한 PCR 방법이 많은 출처, 예를 들어 문헌 (Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Section 15, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994))에 기재되어 있다. PCR 방법의 예는 실시간 PCR, 종점 PCR, 증폭된 단편 길이 다형성 PCR (AFLP-PCR), Alu-PCR, 비대칭 PCR, 콜로니 PCR, DD-PCR, 디제너레이트(Degenerate) PCR, 핫-스타트 PCR, 제자리 PCR, 인버스 PCR 롱-PCR (Inverse PCR Long-PCR), 멀티플렉스 PCR, 네스티드(Nested) PCR, PCR-ELISA, PCR-RFLP, PCR-단일 가닥 입체형태 다형성 (PCR-SSCP), 정량 경쟁적 PCR (QC-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭-PCR (RACE-PCR), 다형성 DNA의 랜덤 증폭-PCR (RAPD-PCR), 실시간 PCR, 반복적 유전자외 회문-PCR (Rep-PCR), 역전사효소 PCR (RT-PCR), TAIL-PCR, 터치다운(Touchdown) PCR 및 벡터렛(Vectorette) PCR을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (QRT-PCR)으로도 불리는 실시간 PCR은 주어진 핵산 분자의 특정 부분을 동시에 정량화 및 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 이는 샘플에 특정 서열이 존재하는지의 여부를 결정하는데 사용될 수 있으며; 존재하는 경우, 존재하는 서열의 카피 수. 용어 "실시간"은 PCR 동안 주기적인 모니터링을 지칭할 수 있다. ABI 7700 및 7900HT 서열 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 캘리포니아주 포스터 시티)과 같은 특정 시스템은 미리 결정되거나 사용자 정의된 지점에서 각각의 열적 사이클 동안 모니터링을 수행한다. 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 프로브로의 PCR의 실시간 분석은 사이클 간 형광 염료 신호 변화를 측정하며, 바람직하게는 임의의 내부 제어 신호를 감한다. 실시간 절차는 PCR의 일반적인 패턴을 따르지만 핵산은 각각의 라운드의 증폭 후 정량화된다. 정량화 방법의 2가지 예는 이중-가닥 DNA에 삽입되는 형광 염료 (예를 들어, SYBR그린(SYBRGreen)) 및 상보적 DNA와 혼성화될 때 형광을 발하는 변형된 DNA 올리고뉴클레오티드 프로브의 사용이다. 삽입제는 결합되지 않은 경우 상대적으로 낮은 형광을 갖고, 이중-가닥 핵산에 결합하면 상대적으로 높은 형광을 갖는다. 이와 같이, 삽입제는 핵산 증폭 반응 동안 이중 변형된 핵산의 축적을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 실시양태에서 유용한 이러한 비-특이적 염료의 예는 SYBR 그린 I (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)), 아이오딘화프로피듐, 브로민화에티듐 등과 같은 삽입제를 포함한다.
대변 샘플은 종종 다수의 유기체로 감염된다. 개시된 프라이머 및 프로브는 대변의 혼합된 감염에 내성이 있다. 특정 표적 서열, 프라이머 및 프로브 때문에, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 샘플에서 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상의 존재/부재 또는 수준을 높은 민감도, 특이성 및 정확도로 검출하는데 사용될 수 있다.
본원에 개시된 프라이머는 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상의 검출을 위한 검정 패널을 제공하기 위해 균일한 화학 및 열적 PCR 프로필을 이용하여 추가 PCR 시스템과 쌍을 이루어 전체 검정 민감도 및 견고성을 개선할 수 있다.
일부 실시양태에서, 멀티플렉스 PCR은 하나의 시험으로 콜레라를 진단할 수 있도록 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상의 존재 또는 부재를, 예를 들어 직접 또는 간접적 수단에 의해 증폭 및 검출하기 위해 수행된다. 멀티플렉스 PCR에서, 브이. 콜레라에의 존재 또는 부재는 ompW 유전자의 존재 또는 부재를 증폭 및 검출함으로써 결정될 수 있고; 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 존재 또는 부재는 rfbN 유전자의 존재 또는 부재를 증폭 및 검출함으로써 결정될 수 있고; 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 존재 또는 부재는 wbfR 유전자의 존재 또는 부재를 증폭 및 검출함으로써 결정될 수 있고; 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에의 존재 또는 부재는 ctxA (콜레라 독소) 유전자의 존재 또는 부재를 증폭 및 검출함으로써 결정될 수 있다.
따라서, 샘플에서 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에의 검출 및/또는 확인을 위한 일부 실시양태는 시험 샘플을 제공하는 단계; 및 샘플을 표준 핵산 증폭 조건 및/또는 엄격한 혼성화 조건 하에서 (1) 브이. 콜레라에의 ompW 유전자, (2) 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자, (3) 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자, 및 (4) 브이. 콜레라에의 ctxA (콜레라 독소) 유전자를 특이적으로 혼성화 및 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머, 및 (1) 브이. 콜레라에의 ompW 유전자, (2) 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자, (3) 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자, 및 (4) 브이. 콜레라에의 ctxA (콜레라 독소) 유전자에 특이적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 샘플은 모든 프라이머 및 프로브와 한 번에 접촉될 수 있거나, 일부 프라이머 및 프로브와 먼저 접촉된 후 나머지 프라이머 및 프로브와 접촉될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 프로브는, 예를 들어 약 10 내지 약 45개 뉴클레오티드의 길이일 수 있고, 검출 가능한 모이어티 (예를 들어, 신호 모이어티, 검출 가능한 표지)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 접촉은 표적 유기체가 샘플에 존재하는 경우 상응하는 표적화된 유전자 영역에 대한 프라이머의 특이적 혼성화를 허용하는 조건 하에서 수행된다. 상응하는 표적화된 유전자 영역에 특이적으로 결합된 프로브의 존재 및/또는 양 (시험 중인 샘플에 존재하는 경우)이 결정될 수 있으며, 여기서 결합된 프로브는 샘플에서 상응하는 표적 유기체의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 결합된 프로브의 양은 샘플에서 상응하는 표적 유기체의 양을 결정하는데 사용된다.
결정 단계는 접촉 단계 후 제자리 혼성화를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 혼성 듀플렉스 (즉, 표적화된 유전자 영역에 특이적으로 결합된 프로브)의 검출은 다수의 방법에 의해 수행될 수 있다. 전형적으로, 혼성화 듀플렉스는 혼성화되지 않은 핵산으로부터 분리되고, 이어서 듀플렉스에 결합된 표지가 검출된다. 이러한 표지는 방사성, 형광, 생물학적 또는 효소 태그 또는 관련 기술분야에서 표준으로 사용되는 표지를 지칭한다. 표지는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 생물학적 샘플로부터 유래되는 핵산에 접합될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 과량의 샘플/표적 핵산 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 (및 적용 가능한 경우 결합되지 않은 접합체)를 세척하기 위해 세척 단계를 사용할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 표준 이종 검정 포맷은 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브에 존재하는 표지를 사용하여 혼성화물을 검출하는데 적합하다. 하나 이상의 앰플리콘의 존재 또는 양을 결정하는 것은 상기 앰플리콘을 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 중 적어도 하나는 형광 방출체 모이어티 및 형광 소광체 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 앰플리콘의 존재 또는 양을 결정하는 것은, 예를 들어 프로브로부터의 검출 가능한 신호와 같은 검출 가능한 신호를 측정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 앰플리콘의 존재 또는 양을 결정하는 것은 (예를 들어, PCR 폴리머라제 (예를 들어, Taq)의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성에 의한 프로브의 절단 후), 예를 들어 프로브로부터의 검출 가능한 신호와 같은 검출 가능한 신호를 측정하는 것을 포함한다. 하나 이상의 앰플리콘의 존재 또는 양을 결정하는 것은, 예를 들어 프로브로부터의 검출 가능한 신호와 같은 검출 가능한 신호를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 측정은 일부 실시양태에서, 예를 들어 검출되는 신호의 양이 샘플에 존재하는 표적 핵산 (예를 들어, 브이. 콜레라에의 ompW 유전자)의 양을 결정하는데 사용될 수 있다는 의미에서 정량적일 수 있다. 측정은 일부 실시양태에서, 예를 들어 검출 가능한 신호의 존재 또는 부재가 표적화된 DNA (예를 들어, 바이러스, SNP 등)의 존재 또는 부재를 나타낼 수 있다는 의미에서 정성적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화된 DNA(들) (예를 들어, 바이러스, SNP 등)가 특정 역치 농도 초과로 존재하지 않는 한, 검출 가능한 신호는 존재 (예를 들어, 주어진 역치 수준을 초과)하지 않을 것이다. 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 샘플 (예를 들어, 표적 핵산 및 복수의 비-표적 핵산을 포함하는 샘플)에서 표적 핵산 (예를 들어, 브이. 콜레라에의 ompW 유전자)의 양을 결정하기 위해 이용될 수 있다. 샘플 내 표적 핵산의 양을 결정하는 것은 시험 샘플로부터 생성되는 검출 가능한 신호의 양을 참조 샘플로부터 생성되는 검출 가능한 신호의 양과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 샘플에서 표적 핵산의 양을 결정하는 것은 시험 측정을 생성하기 위해 검출 가능한 신호를 측정하고; 참조 측정을 생성하기 위해 참조 샘플에 의해 생성되는 검출 가능한 신호를 측정하고; 시험 측정을 참조 측정과 비교하여 샘플에 존재하는 표적 핵산의 양을 결정하는 것을 포함한다. 샘플에서 표적 핵산의 양을 결정하는 것은 샘플에서 상기 표적 핵산을 포함하는 유기체의 존재 및/또는 양을 유도하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 측정되는 검출 가능한 신호는 프로브의 형광-방출 염료 쌍에 의해 생성된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 앰플리콘을 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 쌍 또는 소광체/플루오르 쌍, 또는 둘 다를 포함하는 프로브와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 앰플리콘을 FRET 쌍을 포함하는 프로브와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 개시된 방법은 앰플리콘을 플루오르/소광체 쌍을 포함하는 프로브와 접촉시키는 단계를 포함한다.
형광-방출 염료 쌍은 FRET 쌍 또는 소광체/플루오르 쌍을 포함한다. FRET 쌍 및 소광체/플루오르 쌍의 두 실시양태에서, 염료 중 하나의 방출 스펙트럼은 쌍에서 다른 염료의 흡수 스펙트럼 영역과 중첩된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "형광-방출 염료 쌍"은 "형광 공명 에너지 전달 (FRET) 쌍" 및 "소광체/플루오르 쌍" 둘 다를 포괄하기 위해 사용되는 일반 용어이며, 두 용어 모두 하기에서 보다 상세히 논의된다. 용어 "형광-방출 염료 쌍"은 어구 "FRET 쌍 및/또는 소광체/플루오르 쌍"과 상호교환적으로 사용된다.
일부 실시양태에서, (예를 들어, 프로브가 FRET 쌍을 포함하는 경우) 프로브는 절단되기 전에 검출 가능한 신호의 양을 생성하고, 측정되는 검출 가능한 신호의 양은 프로브가 절단될 때 감소된다. 일부 실시양태에서, 프로브는 절단되기 전에 (예를 들어, FRET 쌍으로부터) 제1의 검출 가능한 신호 및 프로브가 절단될 때 (예를 들어, 소광체/플루오르 쌍으로부터) 제2의 검출 가능한 신호를 생성한다. 이와 같이, 일부 실시양태에서, 프로브는 FRET 쌍 및 소광체/플루오르 쌍을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로브는 FRET 쌍을 포함한다. FRET는 여기된 상태의 형광단으로부터 가까이 근접한 제2 발색단으로 에너지의 무방사 전달이 발생하는 과정이다. 에너지 전달이 발생할 수 있는 범위는 대략 10 나노미터 (100 옹스트롬)로 제한되며, 전달 효율은 형광단 사이의 분리 거리에 매우 민감하다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "FRET" ("형광 공명 에너지 전달"; 또한 "푀르스터 공명 에너지 전달"로 공지됨)는, 도너의 방출 스펙트럼이 억셉터의 여기 스펙트럼과 중첩되도록 선택된, 또한 도너 및 억셉터가 서로 가까이 근접할 때 (보통 10 nm 이하) 에너지의 일부가 양자 커플링 효과를 통해 도너로부터 억셉터로 통과함에 따라 도너의 여기가 억셉터의 여기 및 이로부터 방출을 야기하도록 선택된, 도너 형광단 및 매칭 억셉터 형광단을 수반하는 물리적 현상을 지칭할 수 있다. 따라서, FRET 신호는 도너 및 억셉터의 근접 게이지 역할을 하고; 서로 가까이 근접할 때만 신호가 생성된다. FRET 도너 모이어티 (예를 들어, 도너 형광단) 및 FRET 억셉터 모이어티 (예를 들어, 억셉터 형광단)는 본원에서 집합적으로 "FRET 쌍"으로 지칭된다.
도너-억셉터 쌍 (FRET 도너 모이어티 및 FRET 억셉터 모이어티)은 본원에서 "FRET 쌍" 또는 "신호 FRET 쌍"으로 지칭된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 하나의 신호 파트너는 FRET 도너 모이어티이고 다른 신호 파트너는 FRET 억셉터 모이어티인 경우, 프로브는 2개의 신호 파트너 (신호 쌍)를 포함한다. 따라서, 이러한 FRET 쌍 (FRET 도너 모이어티 및 FRET 억셉터 모이어티)을 포함하는 프로브는 신호 파트너가 가까이 근접해 있을 때 (예를 들어, 동일한 RNA 분자에 있을 때) 검출 가능한 신호 (FRET 신호)를 나타낼 것이지만, 파트너가 분리될 때 (예를 들어, PCR 폴리머라제 (예를 들어, Taq)의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 프로브가 절단된 후) 신호는 감소될 (또는 부재일) 것이다. FRET 도너 및 억셉터 모이어티 (FRET 쌍)는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지될 것이며, 임의의 편리한 FRET 쌍 (예를 들어, 임의의 편리한 도너 및 억셉터 모이어티 쌍)이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 신호 소광 쌍의 하나의 신호 파트너는 검출 가능한 신호를 생성하고, 다른 신호 파트너는 제1 신호 파트너의 검출 가능한 신호를 소광하는 소광체 모이어티이다 (예를 들어, 소광체 모이어티는 신호 파트너가 서로 근접할 때, 예를 들어 신호 쌍의 신호 파트너가 가까이 근접할 때 신호 모이어티로부터의 신호가 감소되도록 (소광되도록) 신호 모이어티의 신호를 소광함).
예를 들어, 일부 실시양태에서, 검출 가능한 신호의 양은 프로브가 절단될 때 증가한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 두 신호 파트너가 PCR 폴리머라제 (예를 들어, Taq)의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 절단되기 전에 동일한 ssDNA 분자에 존재하는 경우, 하나의 신호 파트너 (신호 모이어티, 형광 방출체 모이어티)에 의해 나타나는 신호는 다른 신호 파트너 (소광체 신호 모이어티, 형광 소광체 모이어티)에 의해 소광된다. 이러한 신호 쌍은 본원에서 "소광체/플루오르 쌍", "소광 쌍" 또는 "신호 소광 쌍"으로 지칭된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 하나의 신호 파트너 (예를 들어, 제1 신호 파트너)는 제2 신호 파트너 (예를 들어, 소광체 모이어티)에 의해 소광되는 검출 가능한 신호를 생성하는 신호 모이어티이다. 따라서, 이러한 소광체/플루오르 쌍의 신호 파트너는 파트너가 분리될 때 (예를 들어, PCR 폴리머라제 (예를 들어, Taq)의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 프로브가 절단된 후) 검출 가능한 신호를 생성할 것이지만, 파트너가 가까이 근접해 있을 때 (예를 들어, PCR 폴리머라제 (예를 들어, Taq)의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 프로브가 절단되기 전) 신호가 소광될 것이다.
소광체 모이어티는 (예를 들어, PCR 폴리머라제 (예를 들어, Taq)의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 프로브가 절단되기 전) 신호 모이어티로부터 다양한 정도로 신호를 소광할 수 있다. 일부 실시양태에서, 소광체 모이어티는 신호 모이어티로부터의 신호를 소광하며, 소광체 모이어티의 존재 하에 (신호 파트너가 서로 근접할 때) 검출되는 신호는 소광체 모이어티의 부재 하에 (신호 파트너가 분리될 때) 검출되는 신호의 95% 이하이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 소광체 모이어티의 존재 하에 검출되는 신호는 소광체 모이어티 부재 하에 검출되는 신호의 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하일 수 있다. 일부 실시양태에서, 소광체 모이어티의 존재 하에 (예를 들어, 배경 초과의) 어떠한 신호도 검출되지 않는다.
일부 실시양태에서, 소광체 모이어티의 부재 하에 (신호 파트너가 분리될 때) 검출되는 신호는 소광체 모이어티의 존재 하에 (신호 파트너가 서로 근접할 때) 검출되는 신호보다 적어도 1.2배 (예를 들어, 적어도 1.3배, 적어도 1.5배, 적어도 1.7배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 7배, 적어도 10배, 적어도 20배, 또는 적어도 50배, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위) 더 크다.
일부 실시양태에서, 신호 모이어티는 형광 표지이다. 일부 이러한 실시양태에서, 소광체 모이어티는 (예를 들어, 표지의 방출 스펙트럼에서 에너지를 흡수함으로써) 형광 표지로부터의 신호 (예를 들어, 광 신호)를 소광한다. 따라서, 소광체 모이어티가 신호 모이어티과 근접하지 않은 경우, 신호는 소광체 모이어티에 의해 흡수되지 않기 때문에, 형광 표지로부터의 방출 (신호)을 검출할 수 있다. 임의의 편리한 도너 억셉터 쌍 (신호 모이어티 / 소광체 모이어티 쌍)이 사용될 수 있고, 많은 적합한 쌍이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 소광체 모이어티는 신호 모이어티 (본원에서 "검출 가능한 표지" 또는 "검출 가능한 모이어티"로 지칭됨)로부터 에너지를 흡수한 다음 신호 (예를 들어, 상이한 파장의 광)를 방출한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 소광체 모이어티는 그 자체로 신호 모이어티이고 (예를 들어, 신호 모이어티는 6-카르복시플루오레세인일 수 있고, 소광체 모이어티는 6-카르복시-테트라메틸로다민일 수 있음), 일부 이러한 실시양태에서, 쌍은 또한 FRET 쌍일 수 있다. 일부 실시양태에서, 소광체 모이어티는 다크 소광체이다. 다크 소광체는 여기 에너지를 흡수하고 에너지를 상이한 방식 (예를 들어, 열)으로 분산시킬 수 있다. 따라서, 다크 소광체는 자체 형광이 거의 없거나 전혀 없다 (형광을 방출하지 않음).
일부 실시양태에서, 프로브의 절단은 비색 판독을 측정함으로써 검출될 수 있다. 예를 들어, 형광단의 해방 (예를 들어, FRET 쌍으로부터의 해방, 소광체/플루오르 쌍으로부터의 해방 등)은 검출 가능한 신호의 파장 이동 (및 따라서 색상 이동)을 초래할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 프로브의 절단은 색상-이동에 의해 검출될 수 있다. 이러한 이동은 하나의 색상 (파장)의 신호량 손실, 또 다른 색상량의 증가, 하나의 색상 대 또 다른 색상의 비율 변화 등으로 표현될 수 있다.
본원에 개시된 것은 브이. 콜레라에의 검출, 혈청형결정 및 콜레라 독소 검출을 모두 단일 반응으로 달성할 수 있는 5개의 유전자 표적을 동시에 검출할 수 있는 멀티플렉스 실시간 PCR을 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플에서 브이. 콜레라에를 검출하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 상기 샘플을 복수의 프라이머 쌍과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 복수의 프라이머 쌍은 브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 1-8의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 1-8의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성 (예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위)을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 12-19의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 12-19의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성 (예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위)을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 24-33의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 24-33의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성 (예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위)을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 및 브이. 콜레라에의 ctxA (콜레라 독소) 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 39-48의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 39-48의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성 (예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위)을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍을 포함한다. 방법은 상기 샘플이 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상을 포함하는 경우 ompW 유전자 서열의 앰플리콘, rfbN 유전자 서열의 앰플리콘, wbfR 유전자 서열의 앰플리콘, ctxA 유전자 서열의 앰플리콘, 또는 이의 임의의 조합을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 상기 샘플에서 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상의 존재의 지표로서 하나 이상의 앰플리콘의 존재 또는 양을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 샘플을 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍과 접촉시키며, 여기서 상기 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 53-62의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 53-62의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성 (예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위)을 나타내는 서열을 포함하는 것인 단계, 및 상기 샘플이 이. 콜라이를 포함하는 경우, 상기 샘플로부터 이. 콜라이의 yaiO 유전자 서열의 앰플리콘을 생성하는 단계; 및 상기 샘플에서 이. 콜라이의 존재의 지표로서 이. 콜라이의 yaiO 유전자 서열의 앰플리콘의 존재 또는 양을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 복수의 프라이머 쌍 및 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍을 포함하는 조성물과 접촉된다.
샘플은 생물학적 샘플 또는 환경 샘플일 수 있다. 환경 샘플은 식품 샘플, 음료 샘플, 종이 표면, 직물 표면, 금속 표면, 목재 표면, 플라스틱 표면, 토양 샘플, 담수 샘플, 폐수 샘플, 식염수 샘플, 대기 공기 또는 다른 기체 노출 샘플, 이의 배양물, 또는 이의 임의의 조합으로부터 수득될 수 있다. 생물학적 샘플은 조직 샘플, 타액, 혈액, 혈장, 혈청, 대변, 소변, 객담, 점액, 림프, 윤활액, 뇌척수액, 복수, 흉수, 혈청종, 고름, 피부 또는 점막 표면의 면봉채취물, 이의 배양물, 또는 이의 임의의 조합으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물학적 샘플은 분변 샘플을 포함하거나 이로부터 유래된다.
복수의 프라이머 쌍은 서열식별번호: 1, 3, 5 또는 7의 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열식별번호: 2, 4, 6 또는 8의 서열을 포함하는 제2 프라이머, 서열식별번호: 12, 14, 16 또는 18의 서열을 포함하는 제3 프라이머, 서열식별번호: 13, 15, 17 또는 19의 서열을 포함하는 제4 프라이머, 서열식별번호: 24, 26, 28, 30 또는 32의 서열을 포함하는 제5 프라이머, 서열식별번호: 25, 27, 29, 31 또는 33의 서열을 포함하는 제6 프라이머, 서열식별번호: 39, 41, 43, 45 또는 47의 서열을 포함하는 제7 프라이머, 및 서열식별번호: 40, 42, 44, 46 또는 48의 서열을 포함하는 제8 프라이머를 포함할 수 있다. 복수의 프라이머 쌍은 서열식별번호: 53, 55, 57, 59 또는 61의 서열을 포함하는 제9 프라이머, 및 서열식별번호: 54, 56, 58, 60 또는 62의 서열을 포함하는 제10 프라이머를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머 쌍은 서열식별번호: 1 및 2, 서열식별번호: 3 및 4, 서열식별번호: 5 및 6, 또는 서열식별번호: 7 및 8이고; 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머 쌍은 서열식별번호: 12 및 13, 서열식별번호: 14 및 15, 서열식별번호: 16 및 17, 또는 서열식별번호: 18 및 19이고; 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머 쌍은 서열식별번호: 24 및 25, 서열식별번호: 26 및 27, 서열식별번호: 28 및 29, 서열식별번호: 30 및 31, 또는 서열식별번호: 32 및 33이고; 브이. 콜레라에의 ctxA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머 쌍은 서열식별번호: 39 및 40, 서열식별번호: 41 및 42, 서열식별번호: 43 및 44, 서열식별번호: 45 및 46, 또는 서열식별번호: 47 및 48이다. 일부 실시양태에서, 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 대조군 프라이머 쌍은 서열식별번호: 53 및 54, 서열식별번호: 55 및 56, 서열식별번호: 57 및 58, 서열식별번호: 59 및 60, 또는 서열식별번호: 61 및 62이다.
일부 실시양태에서, 상기 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 루프-매개된 등온 증폭 (LAMP), 가닥 대체 증폭 (SDA), 헬리카제-매개된 증폭, 면역-증폭, 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 자가-지속된 서열 복제 (3SR), 롤링 서클 증폭, 및 전사-매개된 증폭 (TMA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 수행된다. PCR은 실시간 PCR일 수 있다. PCR은 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR)일 수 있다. 각각의 프라이머는 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 앰플리콘의 존재 또는 양을 결정하는 것은 앰플리콘을 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각은 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성 (예를 들어, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 수 또는 범위)을 나타내는 서열을 포함한다. 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각은 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다. 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각은 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어질 수 있다. 각각의 프로브는 5' 말단과 3' 말단에서 상보적 서열에 의해 플랭킹될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상보적 서열 중 하나는 형광 방출체 모이어티를 포함하고 다른 상보적 서열은 형광 소광체 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 중 적어도 하나는 형광 방출체 모이어티 및 형광 소광체 모이어티를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 증폭은 실시간 PCR, 예를 들어 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR)에 의해 수행될 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기에 적합한 프라이머는 증폭 자체에 유의미한 영향을 미치지 않으면서 증폭 생성물의 증폭 후 조작을 가능하게 하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이머 및/또는 프로브는 5' 말단에 형광단을 포함하고 3' 말단에 형광 소광체를 포함하는 상보적 서열에 의해 플랭킹될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 올리고뉴클레오티드 프로브는 형광 방출체 모이어티, 형광 소광체 모이어티, 또는 둘 다를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 방법은 자동화로 개선 가능하여, 샘플에서 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상의 검출 및/또는 정량화를 위한 고처리량 옵션을 제공한다. 다양한 멀티플렉스 PCR 플랫폼, 예를 들어 BD MAX™, Viper™, 또는 Viper™ LT 플랫폼을 사용하여 개시된 방법의 하나 이상의 단계를 수행할 수 있다. 방법은 멀티플렉스 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 핵산 증폭 및/또는 검출은 일부 실시양태에서 멀티플렉스 PCR 수행을 포함한다.
실시예
하기 실시예는 이 기술이 적용될 수 있는 특정 상황 및 설정을 설명하기 위해 제공되며, 본 개시내용에 포함된 본 발명 및 청구범위의 범주를 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1
브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에의 멀티플렉스 검출
이 실시예에 기재된 연구는 BD MAX 완전 자동화된 시스템에서 본원에 제공된 조성물 및 방법의 구현 사례를 기재한다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 또한, 예를 들어 ABI 7500과 같은 다른 실시간 PCR 기기에서 구현될 수 있다.
재료 및 방법
총 63개의 박테리아 균주가 본원에 제공된 멀티플렉스 PCR 프라이머/프로브 조합의 검증을 위해 사용되었으며, 이러한 균주는 표 4에 제시되어 있다. 이러한 단리주는 브이. 콜레라에 (n=22), 브이. 파라헤몰리티쿠스(V. parahaemolyticus) (n=19), 브이. 플루비알리스(V. fluvialis) (n=1), 브이. 알기놀리티쿠스(V. alginolyticus) (n=1), 브이. 미미쿠스(V. mimicus) (n=1), 브이. 불니피쿠스(V. vulnificus) (n=1), 아에로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila) (n=1), 플레시노모나스 쉬겔로이데스(Plesinomonas shigelloides) (n=1), 설사유발성 에스케리키아 콜라이 (n=8), 살모넬라 종(Salmonella spp.) (n=6) 및 쉬겔라 종(Shigella spp.) (n=2)을 포함하였다. 이 연구에 사용된 2개의 대조군 균주는 (i) 브이. 콜레라에 N16961: O1; (ii) 브이. 콜레라에 MO45: O139였다. 이들 균주 모두는 중국 국립 CDC에 의해 제공되었다.
표 4.
멀티플렉스 PCR의 검증에 사용되는 박테리아 균주
BD MAX™ ExK™ TNA-2 추출 키트 및 5X qPCR 마스터믹스(Mastermix)가 이 연구에 사용되었다.
브이. 콜레라에 멀티플렉스 검출 검정 (BDM-VC)에 대해 표적화된 유전자는 ompW, ctxA, rfbN 및 wbfR이었고, 이. 콜라이 yaiO 유전자는 내부 대조군으로 선택되었다. 이들 유전자 서열은 NCBI의 nr 데이터베이스 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)에 기탁된 이용 가능한 서열의 정렬을 기반으로 한다. 모든 프라이머 및 프로브는 비콘 디자이너 V8.20을 사용하여 설계되었으며, 모두 산곤 바이오텍 (Sangon Biotech, 중국 상하이)에 의해 합성되었다. NCBI BLASTn을 사용하여 인 실리코 특이성 및 민감도를 점검하였다.
대변 샘플로부터 DNA 추출을 위해, 대변 샘플 (스파이킹된 임상 샘플)을 볼텍싱하고, 각각의 샘플에 대한 50 ul 분취량을 BD MAX 샘플 버퍼 튜브에 첨가하였다. BD MAX ExK TNA-2 추출 키트를 사용하여 BD MAX에서 키트 지침에 따라 DNA 자동 추출을 수행하였다.
멀티플렉스 PCR 반응을 위해, 표 5에 나타낸 작업 농도로 본원에 개시된 프라이머/프로브 조합을 포함하는 12.5 ul의 PCR 반응 혼합물을 각각의 원추형 튜브에서 제조하였다. 샘플 처리 대조군 (SPC)은 이. 콜라이의 yaiO 유전자를 포함할 수 있다.
표 5.
멀티플렉스 PCR 혼합물
12.5 ul 혼합물을 함유하는 원추형 튜브를 BD MAX TNA 추출 스트립에 끼웠다. 최종 PCR 반응 혼합물은 상기에서 기재된 바와 같이 제조된 12.5 ul의 정제된 DNA를 상기 원추형 튜브에 자동으로 첨가함으로써 BD MAX에 의해 제조되고 혼합되었다. PCR 열순환 프로필은 하기와 같다: 5분 동안 95℃ 변성; 및 95℃ 변성 15 s, 60℃ 어닐링 및 연장 43 s, 40회 사이클.
증폭 효율 시험
표 6에 제시된 바와 같이, 본원에 제공된 프라이머/프로브 조합은 본원에 개시된 멀티플렉스 PCR 방법에 사용될 때 균주 N16961 또는 MO45로 스파이킹된 대변 샘플에서 ompW, rfbN, wbfR, 및 ctxA 에 대해 우수한 증폭 효율을 생성하였다.
표 6.
균주 N16961 또는 MO45로 스파이킹된 대변 샘플에서
ompW, rfbN, wbfR,
및
ctxA
에 대한 멀티플렉스 PCR의 증폭 효율
분석 민감도 시험
최적화된 멀티플렉스 PCR의 검출 한계를 추정하기 위해, 10 ul의 VC 균주 N16961 및 MO45 배양 현탁액을 50 ul 음성 분변 표본으로 스파이킹하고, 추출하기 전에 볼텍싱하였다. 이들은 3개의 독립적인 실행에 대해 2.5의 맥팔랜드(McFarland) 표준으로부터 시작하여 실행당 5 레플리케이트로 6개의 상이한 박테리아 농도로 시험되었다. 콜로니 계수는 표준 플레이트 계수 절차를 이용하여 수행되었다. 역치 사이클 CT 값이 관찰된 최고 10배 희석액을 3회의 2배 희석 시리즈 (1:2, 1:4, 1:8)로 더 희석하여 CT 값이 검출되는 최저 농도를 찾았다. CT 값을 생성한 최저 농도는 표 7에 제시된 바와 같은 검정의 검출 한계 (LoD)를 결정하기 위해 12 레플리케이트로 시험되었다. 본원에 제공된 프라이머/프로브 조합을 사용하여 각각의 표적에 대해 견고한 분석 민감도가 관찰되었다.
표 7.
ompW, rfbN, wbfR,
및
ctxA
멀티플렉스 PCR의 분석 민감도
분석 특이성 시험
분석 특이성은 양성- 및 음성-대조군 단리주 패널로부터 추출된 DNA를 시험함으로써 측정되었다 (표 4). 이 패널은 표적 종과 밀접한 관련이 있거나 설사 환자의 분변 샘플에서 일반적으로 발견되고 배양 방법을 이용하여 확인되는 광범위한 병원성 단리주를 대표하는 63개의 대조군 단리주로 이루어졌다 (표 4). 검정은 모든 브이. 콜레라에 단리주를 정확하게 검출하였으며, 비-표적 단리주와의 교차 반응은 없다 (표 8). 본원에 제공된 프라이머/프로브 조합을 사용하여 각각의 표적에 대해 견고한 분석 특이성이 관찰되었다.
표 8.
ompW, rfbN, wbfR,
및
ctxA
멀티플렉스 PCR의 분석 특이성
용어
이전에 기재된 실시양태 중 적어도 일부에서, 실시양태에 사용된 하나 이상의 요소는 이러한 대체가 기술적으로 실현 가능하지 않은 경우가 아니면 또 다른 실시양태에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 청구된 대상의 범주를 벗어나지 않으면서 상기에 기재된 방법 및 구조에 대해 다양한 다른 생략, 추가 및 변형이 이루어질 수 있음을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 모든 이러한 변형 및 변화는 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 바와 같이 대상의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
본원에서 실질적으로 임의의 복수 및/또는 단수 용어의 사용과 관련하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 문맥 및/또는 적용에 적절하도록 복수에서 단수로 및/또는 단수에서 복수로 번역할 수 있다. 명확성을 위해 다양한 단수/복수 순열이 본원에 명시적으로 설명될 수 있다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 본원에서 "또는"에 대한 임의의 언급은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 포괄하는 것으로 의도된다.
일반적으로 본원, 특히 첨부된 청구범위 (예를 들어, 첨부된 청구범위의 본문)에서 사용된 용어는 일반적으로 "개방형" 용어로 의도된다는 것을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다 (예를 들어, 용어 "포함하는"은 "포함하지만 이에 제한되지는 않는"으로 해석되고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로 해석되고, 용어 "포함한다"는 "포함하지만 이에 제한되지는 않는다"로 해석되어야 함). 또한, 도입된 청구항 인용의 특정 번호가 의도된 경우 이러한 의도는 청구항에 명시적으로 인용될 것이며, 이러한 인용이 없을 경우 이러한 의도가 존재하지 않는다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 이해를 돕기 위해 하기의 첨부된 청구범위는 청구항 인용을 도입하기 위해 도입 어구 "적어도 하나" 및 "하나 이상"의 사용을 함유할 수 있다. 그러나, 이러한 어구의 사용은, 동일한 청구항이 도입 어구 "하나 이상" 또는 "적어도 하나" 및 단수형을 포함하는 경우라 하더라도, 단수형에 의한 청구항 인용의 도입이 이렇게 도입된 청구항 인용을 함유하는 특정 청구항을 단지 하나의 이러한 인용만을 함유하는 실시양태로 제한한다는 것을 의미하는 것으로 해석되어서는 안되며 (예를 들어, 단수형은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 해석되어야 하며); 청구항 인용을 도입하기 위해 사용되는 "상기"의 사용에 대해서도 마찬가지이다. 또한, 도입된 청구항 인용의 특정 번호가 명시적으로 인용되더라도, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이러한 인용이 적어도 인용된 번호를 의미하는 것으로 해석되어야 함을 인지할 것이다 (예를 들어, 다른 수식어 없이 "2개의 인용"의 단순 인용은 적어도 2개의 인용, 또는 2개 이상의 인용을 의미함). 또한 "A, B, C 등 중 적어도 하나"와 유사한 규칙이 사용되는 경우, 일반적으로 이러한 구성은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 규칙을 이해할 것이라는 의미에서 의도된다 (예를 들어, "A, B 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B를 함께, A와 C를 함께, B와 C를 함께, 및/또는 A와 B와 C를 함께 등으로 갖는 시스템을 포함하지만 이에 제한되지는 않음). "A, B 또는 C 등 중 적어도 하나"와 유사한 규칙이 사용되는 경우, 일반적으로 이러한 구성은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 규칙을 이해할 것이라는 의미에서 의도된다 (예를 들어, "A, B 또는 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A와 B를 함께, A와 C를 함께, B와 C를 함께, 및/또는 A와 B와 C를 함께 등으로 갖는 시스템을 포함하지만 이에 제한되지는 않음). 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 설명, 청구범위 또는 도면에 있든 관계없이 2개 이상의 대체 용어를 제시하는 거의 모든 분리 단어 및/또는 어구는 용어 중 하나, 용어 중 어느 하나, 또는 두 용어 모두를 포함할 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 한다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 어구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
또한, 본 개시내용의 특색 또는 측면이 마쿠시 그룹의 관점에서 기재되는 경우, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용이 또한 마쿠시 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위 그룹의 관점에서 기재된다는 것을 인식할 것이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 서면 설명을 제공하는 것과 같은 임의의 및 모든 목적을 위해, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 이의 임의의 및 모든 가능한 하위-범위 및 하위-범위의 조합을 포괄한다. 임의의 나열된 범위는 동일한 범위를 적어도 동일한 절반, 3분의 1, 4분의 1, 5분의 1, 10분의 1 등으로 나누는 것을 충분히 기술하고 가능하게 하는 것으로 쉽게 인식될 수 있다. 비제한적 예로서, 본원에서 논의되는 각각의 범위는 하위 3분의 1, 중간 3분의 1 및 상위 3분의 1 등으로 쉽게 나뉠 수 있다. 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, "최대", "적어도", "초과", "미만" 등과 같은 모든 언어는 인용된 숫자를 포함하고, 상기에서 논의되는 바와 같이 후속적으로 하위-범위로 나뉠 수 있는 범위를 지칭한다. 마지막으로, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 범위는 각각의 개별 구성원을 포함한다. 따라서, 예를 들어 1-3개의 물품을 갖는 그룹은 1, 2 또는 3개의 물품을 갖는 그룹을 지칭한다. 유사하게, 1-5개의 물품을 갖는 그룹은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 물품을 갖는 그룹을 지칭한다.
다양한 측면 및 실시양태가 본원에 개시되었지만, 다른 측면 및 실시양태가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본원에 개시된 다양한 측면 및 실시양태는 예시를 위한 것으로 제한하려는 의도가 아니며, 진정한 범주 및 취지는 하기의 청구범위에 의해 나타난다.
SEQUENCE LISTING
<110> BECTON, DICKINSON AND COMPANY
Zhang, Qiufeng
Fu, Manliang
Zhang, Chuanhui
<120> MULTIPLEX DETECTION AND TYPING OF VIBRIO CHOLERAE
<130> 68EB-298735-WO2
<150> PCT/CN2020/126682
<151> 2020-11-05
<160> 67
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 1
attgaaacaa cggcaaccta 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 2
accacccgcg atcataaat 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 3
gaaacaacgg caacctacaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 4
accacccgcg atcataaata 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 5
aacaacggca acctacaaag 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 6
ataaccaccc gcgatcataa 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 7
ctggttcctc aacgcttct 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 8
atccgtggat ttggcatct 19
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 9
caggtgcaga tgccaaatcc acggat 26
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 10
tgcagatgcc aaatccacgg atgttgaaat ca 32
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 11
ttgaaacaac ggcaacctac aaagcaggtg 30
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 12
gttgagaagg gcggtctaat aa 22
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 13
tgtctggtac ttgagttggt aag 23
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 14
tgacgtaatt attcgtgatg aatcg 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 15
cactcacaaa gactttcttc aatca 25
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 16
agcccactac cgcattcat 19
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 17
aacatcacca cagcctctta ct 22
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 18
gcaacgagat gtatcgcaaa 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 19
gcacaggtat gggtggaata 20
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 20
tacaagagcc ttatccattg ctgaggcaag ct 32
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 21
accaaggtca tctgtaagta caacattccc 30
<210> 22
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 22
ctttttttgc tcgtccaatg actttgaatc ttt 33
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 23
caacctcacc atcaaatacc aaagggtcaa at 32
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 24
ctgacttaac agaactttcc catc 24
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 25
cagcaatgcg gtggtctaac 20
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 26
tgctacgatg gcgtgttca 19
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 27
tccctttcca cctcggtatt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 28
ggcgggttcc cttgttagac 20
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 29
tccctttcca cctcggtatt tcaa 24
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 30
ctctctactc gtccggtcaa a 21
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 31
actcgacatg atccgttcct 20
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 32
cccatcgctg aatggttgag a 21
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 33
ccacaactgc gacgaccaat 20
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 34
aacccgccct tctaatgaac acgccatc 28
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 35
caaatggatc ggcaaactgg cagcaaactc a 31
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 36
cgcattgctg agtttgctgc cagtttgccg atc 33
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 37
cctttacgat cgggtttgac cacgcgg 27
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 38
tcgtttaccc gctaaatgtt cacgccactt ctt 33
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 39
atcatgcaag aggaactcag a 21
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 40
agtgggcact tctcaaact 19
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 41
agcagtcagg tggtcttatg 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 42
atccatcatc gtgcctaaca 20
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 43
tgaccgaggt actcaaatga a 21
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 44
atccatcatc gtgcctaaca a 21
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 45
cagattctag acctcctgat ga 22
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 46
ttgagtacct cggtcaaagt 20
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 47
gcagattcta gacctcctga t 21
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 48
cctcggtcaa agtactcact 20
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 49
aggtggaaac atatccatca tcgtgcc 27
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 50
tcccgtctga gttcctcttg catgatc 27
<210> 51
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 51
ctcactctgt cctcttggca taagaccacc t 31
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 52
tgtcctcttg gcataagacc acctgactgc 30
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 53
cagcgatgca ggtggtagtt 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 54
ggcgtccagt cataggtgta 20
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 55
gggcgtcgtg attatgaaac tg 22
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 56
gggcaaagac cggcgtatta 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 57
cgaacgggta ttgcctttgc 20
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 58
gcatcgactt cgacatcatc gtaa 24
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 59
atgccgggtt aacttcca 18
<210> 60
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 60
cagcgttgcg ttttcaac 18
<210> 61
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 61
cgatgatgtc gaagtcga 18
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 62
gccatagttg cgtataacc 19
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 63
cctgttccgc ggcttagcca tagttgc 27
<210> 64
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 64
acatttcaat gccactcgcg gtcagggt 28
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 65
atacgccggt ctttgcccgc cagga 25
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 66
tcgccaccag ttcagcatac gc 22
<210> 67
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Oligonucleotide
<400> 67
ctggcaaggc ggcgtatcac tctata 26
Claims (50)
- 하기 단계를 포함하는, 샘플에서 브이. 콜레라에(V. cholerae)를 검출하는 방법:
상기 샘플을 복수의 프라이머 쌍과 접촉시키며, 여기서 복수의 프라이머 쌍은
브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 1-8의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 1-8의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍;
브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 12-19의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 12-19의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍;
브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 24-33의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 24-33의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 및
브이. 콜레라에의 ctxA (콜레라 독소) 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 39-48의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 39-48의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍
을 포함하는 단계;
상기 샘플이 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상을 포함하는 경우, ompW 유전자 서열의 앰플리콘, rfbN 유전자 서열의 앰플리콘, wbfR 유전자 서열의 앰플리콘, ctxA 유전자 서열의 앰플리콘, 또는 이의 임의의 조합을 생성하는 단계; 및
상기 샘플에서 브이. 콜레라에, 브이. 콜레라에 혈청군 O1, 브이. 콜레라에 혈청군 O139, 및 콜레라 독소를 코딩하는 브이. 콜레라에 중 하나 이상의 존재의 지표로서 하나 이상의 앰플리콘의 존재 또는 양을 결정하는 단계. - 제1항에 있어서, 샘플을 이. 콜라이(E. coli)의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍과 접촉시키며, 여기서 상기 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 53-62의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 53-62의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 단계, 및
상기 샘플이 이. 콜라이를 포함하는 경우, 상기 샘플로부터 이. 콜라이의 yaiO 유전자 서열의 앰플리콘을 생성하는 단계; 및
상기 샘플에서 이. 콜라이의 존재의 지표로서 이. 콜라이의 yaiO 유전자 서열의 앰플리콘의 존재 또는 양을 결정하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제2항에 있어서, 샘플이 복수의 프라이머 쌍 및 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍을 포함하는 조성물과 접촉되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 생물학적 샘플 또는 환경 샘플인 방법.
- 제4항에 있어서, 환경 샘플이 식품 샘플, 음료 샘플, 종이 표면, 직물 표면, 금속 표면, 목재 표면, 플라스틱 표면, 토양 샘플, 담수 샘플, 폐수 샘플, 식염수 샘플, 대기 공기 또는 다른 기체 노출 샘플, 이의 배양물, 또는 이의 임의의 조합으로부터 수득되는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 생물학적 샘플이 조직 샘플, 타액, 혈액, 혈장, 혈청, 대변, 소변, 객담, 점액, 림프, 윤활액, 뇌척수액, 복수, 흉수, 혈청종, 고름, 피부 또는 점막 표면의 면봉채취물, 이의 배양물, 또는 이의 임의의 조합으로부터 수득되는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 생물학적 샘플이 분변 샘플을 포함하거나 이로부터 유래되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 프라이머 쌍이 서열식별번호: 1, 3, 5 또는 7의 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열식별번호: 2, 4, 6 또는 8의 서열을 포함하는 제2 프라이머, 서열식별번호: 12, 14, 16 또는 18의 서열을 포함하는 제3 프라이머, 서열식별번호: 13, 15, 17 또는 19의 서열을 포함하는 제4 프라이머, 서열식별번호: 24, 26, 28, 30 또는 32의 서열을 포함하는 제5 프라이머, 서열식별번호: 25, 27, 29, 31 또는 33의 서열을 포함하는 제6 프라이머, 서열식별번호: 39, 41, 43, 45 또는 47의 서열을 포함하는 제7 프라이머, 및 서열식별번호: 40, 42, 44, 46 또는 48의 서열을 포함하는 제8 프라이머를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 프라이머 쌍이 서열식별번호: 53, 55, 57, 59 또는 61의 서열을 포함하는 제9 프라이머 및 서열식별번호: 54, 56, 58, 60 또는 62의 서열을 포함하는 제10 프라이머를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머 쌍이 서열식별번호: 1 및 2, 서열식별번호: 3 및 4, 서열식별번호: 5 및 6, 또는 서열식별번호: 7 및 8이고;
브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머 쌍이 서열식별번호: 12 및 13, 서열식별번호: 14 및 15, 서열식별번호: 16 및 17, 또는 서열식별번호: 18 및 19이고;
브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머 쌍이 서열식별번호: 24 및 25, 서열식별번호: 26 및 27, 서열식별번호: 28 및 29, 서열식별번호: 30 및 31, 또는 서열식별번호: 32 및 33이고;
브이. 콜레라에의 ctxA 유전자에 혼성화할 수 있는 프라이머 쌍이 서열식별번호: 39 및 40, 서열식별번호: 41 및 42, 서열식별번호: 43 및 44, 서열식별번호: 45 및 46, 또는 서열식별번호: 47 및 48인
방법. - 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 대조군 프라이머 쌍이 서열식별번호: 53 및 54, 서열식별번호: 55 및 56, 서열식별번호: 57 및 58, 서열식별번호: 59 및 60, 또는 서열식별번호: 61 및 62인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭이 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 루프-매개된 등온 증폭 (LAMP), 가닥 대체 증폭 (SDA), 헬리카제-매개된 증폭, 면역-증폭, 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 자가-지속된 서열 복제 (3SR), 롤링 서클 증폭, 및 전사-매개된 증폭 (TMA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 수행되는 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 PCR이 실시간 PCR인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 PCR이 정량적 실시간 PCR (QRT-PCR)인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 프라이머가 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 앰플리콘의 존재 또는 양을 결정하는 것이 앰플리콘을 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각은 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각이 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제17항에 있어서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각이 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어지는 것인 방법.
- 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 프로브가 5' 말단 및 3' 말단에서 상보적 서열에 의해 플랭킹되는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 상보적 서열 중 하나가 형광 방출체 모이어티를 포함하고 다른 상보적 서열이 형광 소광체 모이어티를 포함하는 것인 방법.
- 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 중 적어도 하나가 형광 방출체 모이어티 및 형광 소광체 모이어티를 포함하는 것인 방법.
- 하기를 포함하는, 샘플에서 브이. 콜레라에를 검출하기 위한 조성물:
브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 1-8의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 1-8의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍;
브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 12-19의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 12-19의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍;
브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 24-33의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 24-33의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍; 및
브이. 콜레라에의 ctxA (콜레라 독소) 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 39-48의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 39-48의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 프라이머 쌍. - 제22항에 있어서, 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍을 추가로 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍의 각각의 프라이머는 서열식별번호: 53-62의 서열 중 어느 하나, 또는 서열식별번호: 53-62의 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제22항 또는 제23항에 있어서,
브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍이 서열식별번호: 1, 3, 5 또는 7의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호: 2, 4, 6 또는 8의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고;
브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍이 서열식별번호: 12, 14, 16 또는 18의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호: 13, 15, 17 또는 19의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고;
브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍이 서열식별번호: 24, 26, 28, 30 또는 32의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호: 25, 27, 29, 31 또는 33의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하고;
브이. 콜레라에의 ctxA 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 프라이머 쌍이 서열식별번호: 39, 41, 43, 45 또는 47의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호: 40, 42, 44, 46 또는 48의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하는 것인
조성물. - 제23항 또는 제24항에 있어서, 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 적어도 하나의 대조군 프라이머 쌍이 서열식별번호: 53, 55, 57, 59 또는 61의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호: 54, 56, 58, 60 또는 62의 서열을 포함하는 프라이머를 포함하는 것인 조성물.
- 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가로 포함하며, 여기서 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각은 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제26항에 있어서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각이 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 조성물.
- 제27항에 있어서, 복수의 올리고뉴클레오티드 프로브 각각이 서열식별번호: 9-11, 20-23, 34-38, 49-52, 및 63-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어지는 것인 조성물.
- 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 프로브 중 적어도 하나가 형광 방출체 모이어티 및 형광 소광체 모이어티를 포함하는 것인 조성물.
- 브이. 콜레라에의 ompW 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머로서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 제30항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열로 이루어지는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 제30항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 제30항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열식별번호: 1-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어지는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 브이. 콜레라에 혈청군 O1의 rfbN 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머로서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 제34항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열로 이루어지는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 제34항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 제34항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열식별번호: 12-23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어지는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 브이. 콜레라에 혈청군 O139의 wbfR 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머로서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 제38항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열로 이루어지는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 제38항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 제38항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열식별번호: 24-38로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어지는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 브이. 콜레라에의 ctxA (콜레라 독소) 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머로서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 제42항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열로 이루어지는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 제42항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 제42항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열식별번호: 39-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어지는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 이. 콜라이의 yaiO 유전자에 혼성화할 수 있는 최대 약 100개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머로서, 상기 프로브 또는 프라이머는 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 제46항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 또는 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 대해 적어도 약 85% 동일성을 나타내는 서열로 이루어지는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 제46항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 제46항에 있어서, 상기 프로브 또는 프라이머가 서열식별번호: 53-67로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열로 이루어지는 것인 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머.
- 제30항 내지 제49항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머 중 2개 이상을 포함하는 조성물.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNPCT/CN2020/126682 | 2020-11-05 | ||
| CN2020126682 | 2020-11-05 | ||
| PCT/CN2021/128618 WO2022095921A1 (en) | 2020-11-05 | 2021-11-04 | Multiplex detection and typing of vibrio cholerae |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230097044A true KR20230097044A (ko) | 2023-06-30 |
Family
ID=78820028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020237014941A KR20230097044A (ko) | 2020-11-05 | 2021-11-04 | 비브리오 콜레라에의 멀티플렉스 검출 및 형결정 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240011106A1 (ko) |
| EP (1) | EP4240876A1 (ko) |
| JP (1) | JP2023547442A (ko) |
| KR (1) | KR20230097044A (ko) |
| CN (1) | CN116507742A (ko) |
| AU (1) | AU2021374695A1 (ko) |
| CA (1) | CA3193878A1 (ko) |
| WO (1) | WO2022095921A1 (ko) |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1268173A (en) | 1969-01-18 | 1972-03-22 | Takeda Chemical Industries Ltd | Novel bacteriolytic enzyme and process for the production thereof |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
| US5849478A (en) | 1986-08-14 | 1998-12-15 | Cashman; Daniel P. | Blocked-polymerase polynucleotide immunoassay method and kit |
| CA1323293C (en) | 1987-12-11 | 1993-10-19 | Keith C. Backman | Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization |
| US4988617A (en) | 1988-03-25 | 1991-01-29 | California Institute Of Technology | Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids |
| US5130238A (en) | 1988-06-24 | 1992-07-14 | Cangene Corporation | Enhanced nucleic acid amplification process |
| CA2020958C (en) | 1989-07-11 | 2005-01-11 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification methods |
| US5427930A (en) | 1990-01-26 | 1995-06-27 | Abbott Laboratories | Amplification of target nucleic acids using gap filling ligase chain reaction |
| US5455166A (en) | 1991-01-31 | 1995-10-03 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification |
| US5185242A (en) | 1991-06-24 | 1993-02-09 | Becton Dickinson And Company | Method for lysing mycobacteria using achromopeptidase |
| US5422252A (en) | 1993-06-04 | 1995-06-06 | Becton, Dickinson And Company | Simultaneous amplification of multiple targets |
| US6090592A (en) | 1994-08-03 | 2000-07-18 | Mosaic Technologies, Inc. | Method for performing amplification of nucleic acid on supports |
| US5854033A (en) | 1995-11-21 | 1998-12-29 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
| US6117635A (en) | 1996-07-16 | 2000-09-12 | Intergen Company | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
| US5866366A (en) | 1997-07-01 | 1999-02-02 | Smithkline Beecham Corporation | gidB |
| US6117986A (en) | 1998-06-10 | 2000-09-12 | Intergen Company, L.P. | Pyrimidines linked to a quencher |
| ES2320814T3 (es) | 1998-11-09 | 2009-05-28 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | Procedimiento de sintesis de acido nucleico. |
| US7494771B2 (en) | 2001-07-19 | 2009-02-24 | Geneohm Sciences Canada, Inc. | Universal method and composition for the rapid lysis of cells for the release of nucleic acids and their detection |
| US6977148B2 (en) | 2001-10-15 | 2005-12-20 | Qiagen Gmbh | Multiple displacement amplification |
| EP3222733B1 (en) | 2007-07-13 | 2021-04-07 | Handylab, Inc. | Polynucleotide capture materials, and methods of using same |
| US20100009351A1 (en) | 2008-07-11 | 2010-01-14 | Handylab, Inc. | Polynucleotide Capture Materials, and Method of Using Same |
| CN102242216B (zh) * | 2011-07-14 | 2013-01-02 | 浙江省疾病预防控制中心 | 一种3群霍乱弧菌荧光pcr检测试剂盒及系统鉴定方法 |
-
2021
- 2021-11-04 AU AU2021374695A patent/AU2021374695A1/en active Pending
- 2021-11-04 CA CA3193878A patent/CA3193878A1/en active Pending
- 2021-11-04 EP EP21816317.8A patent/EP4240876A1/en active Pending
- 2021-11-04 US US18/251,529 patent/US20240011106A1/en active Pending
- 2021-11-04 WO PCT/CN2021/128618 patent/WO2022095921A1/en active Application Filing
- 2021-11-04 JP JP2023526008A patent/JP2023547442A/ja active Pending
- 2021-11-04 CN CN202180074741.2A patent/CN116507742A/zh active Pending
- 2021-11-04 KR KR1020237014941A patent/KR20230097044A/ko unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20240011106A1 (en) | 2024-01-11 |
| CA3193878A1 (en) | 2022-05-12 |
| JP2023547442A (ja) | 2023-11-10 |
| EP4240876A1 (en) | 2023-09-13 |
| AU2021374695A1 (en) | 2023-07-13 |
| WO2022095921A1 (en) | 2022-05-12 |
| CN116507742A (zh) | 2023-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2939810T3 (es) | Detección múltiple de la vaginosis bacteriana | |
| US11591659B2 (en) | Compositions and methods for detection of Mycoplasma genitalium | |
| US10724111B2 (en) | Molecular detection of enterovirus and parechovirus | |
| KR20230097143A (ko) | 박테리아 호흡기 병원체의 멀티플렉스 검출 | |
| KR20230097044A (ko) | 비브리오 콜레라에의 멀티플렉스 검출 및 형결정 | |
| KR20230097079A (ko) | 비브리오 파라헤몰리티쿠스의 신속 확인 및 형결정 | |
| US9994916B2 (en) | Detection of neisseria gonorrhoeaes | |
| WO2024028818A1 (en) | Method for detecting mycoplasma contamination | |
| WO2024003792A1 (en) | Viral detection assays | |
| WO2012075317A2 (en) | Compositions and methods for trichomonas vaginalis diagnostic testing | |
| US20240240273A1 (en) | Compositions and Methods for Detecting Hepatitis Delta Virus by a Dual-Target Assay | |
| JP2024517835A (ja) | 二重標的アッセイによりデルタ型肝炎ウイルスを検出するための組成物及び方法 | |
| JP2017521083A (ja) | リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を検出するための配列およびこの配列の使用 | |
| WO2020225231A1 (en) | Compositions and methods for detection of neisseria gonorroheae |