CN116507742A - 霍乱弧菌的多重检测和分型 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于检测霍乱弧菌(V.cholerae)、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139和编码霍乱毒素的霍乱弧菌的方法和组合物。在一些实施方案中，使用基于多重核酸的测试方法确定样品中霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139和编码霍乱毒素的霍乱弧菌的存在或不存在。

Description

霍乱弧菌的多重检测和分型
相关申请
本申请要求2020年11月5日提交的PCT申请序号PCT/CN 2020/126682的权益，该相关申请的内容以其整体并入本文。
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背景
领域
本公开内容涉及用于样品中霍乱弧菌(V.cholerae)的检测和分型的方法和组合物。更具体地，本公开内容涉及通过基于核酸的测试方法，检测样品(诸如粪便样品)中的以下一种或更多种：霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、以及编码霍乱毒素的霍乱弧菌。
对相关技术的描述
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是导致疾病霍乱的病因病原体。在其最严重的时候，该疾病被称为重症霍乱，并表现为排出大量米水粪便(rice water stools)，导致严重脱水。如果不迅速开始补水和电解质治疗，该疾病会快速发展为低血容量性休克、酸中毒和死亡。世界卫生组织(World Health Organization)指出，每年估计有130万-400万例病例和估计有21,000-147,000例死亡。在霍乱弧菌的超过200个血清组中，只有O1和O139血清组与流行病相关。霍乱毒素(CT)是造成流行和散发形式的严重霍乱样疾病的原因。在评估霍乱弧菌分离株的公共卫生意义时，CT的产生是要确定的关键特性之一。及时鉴定感染腹泻患者的霍乱弧菌，并鉴定血清型和毒力因子，对患者治疗和疾病控制是重要的。因此，需要开发更高效、更快速的用于霍乱弧菌检测和血清分型的方法，例如多重实时PCR方法同时检测5个基因靶，可以在单次反应完成霍乱弧菌的检测、血清分型和霍乱毒素检测的全部检测。需要用于同时鉴定和确定霍乱弧菌的潜在毒力的多重组合物和方法。
概述
本文公开的包括检测样品中霍乱弧菌的方法。在一些实施方案中，方法包括：使所述样品与多于一对引物接触，其中多于一对引物包含：能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:1-8的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:1-8的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQID NO:12-19的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:12-19的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:24-33的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:24-33的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；以及能够与霍乱弧菌的ctxA(霍乱毒素)基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:39-48的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:39-48的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列。方法可以包括：如果所述样品包含霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139和编码霍乱毒素的霍乱弧菌中的一种或更多种，则产生ompW基因序列的扩增子、rfbN基因序列的扩增子、wbfR基因序列的扩增子、ctxA基因序列的扩增子或其任何组合。方法可以包括：确定一种或更多种扩增子的存在或量，作为所述样品中霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139和编码霍乱毒素的霍乱弧菌中的一种或更多种的存在的指示。方法可以包括：使样品与能够与大肠杆菌(E.coli)的yaiO基因杂交的至少一对对照引物接触，其中所述至少一对对照引物中的每种引物包含SEQ ID NO:53-62的序列中的任一个，或与SEQ IDNO:53-62的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；并且如果所述样品包含大肠杆菌，则从所述样品产生大肠杆菌的yaiO基因序列的扩增子；以及确定大肠杆菌的yaiO基因序列的扩增子的存在或量，作为所述样品中大肠杆菌的存在的指示。
在一些实施方案中，样品与包含多于一对引物和能够与大肠杆菌的yaiO基因杂交的至少一对对照引物的组合物接触。在一些实施方案中，样品是生物样品或环境样品。在一些实施方案中，环境样品从以下获得：食品样品、饮料样品、纸张表面、织物表面、金属表面、木材表面、塑料表面、土壤样品、淡水样品、废水样品、盐水样品、暴露于环境空气或其他气体的样品、其培养物或其任何组合。在一些实施方案中，生物样品从以下获得：组织样品、唾液、血液、血浆、血清、粪便、尿液、痰、黏液、淋巴、滑液、脑脊液、腹水、胸腔积液、血清肿、脓、皮肤或黏膜表面的拭子、其培养物或其任何组合。在一些实施方案中，生物样品包括粪便样品或来源于粪便样品。
在一些实施方案中，多于一对引物包含含有SEQ ID NO:1、3、5或7的序列的第一引物，含有SEQ ID NO:2、4、6或8的序列的第二引物，含有SEQ ID NO:12、14、16或18的序列的第三引物，含有SEQ ID NO:13、15、17或19的序列的第四引物，含有SEQ ID NO:24、26、28、30或32的序列的第五引物，含有SEQ ID NO:25、27、29、31或33的序列的第六引物，含有SEQ IDNO:39、41、43、45或47的序列的第七引物，以及含有SEQ ID NO:40、42、44、46或48的序列的第八引物。在一些实施方案中，多于一对引物包含含有SEQ ID NO:53、55、57、59或61的序列的第九引物和含有SEQ ID NO:54、56、58、60或62的序列的第十引物。在一些实施方案中，能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交的该对引物为SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO:3和4、SEQ IDNO:5和6、或SEQ ID NO:7和8；能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交的该对引物为SEQID NO:12和13、SEQ ID NO:14和15、SEQ ID NO:16和17、或SEQ ID NO:18和19；能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交的该对引物为SEQ ID NO:24和25、SEQ ID NO:26和27、SEQID NO:28和29、SEQ ID NO:30和31、或SEQ ID NO:32和33；以及能够与霍乱弧菌的ctxA基因杂交的该对引物为SEQ ID NO:39和40、SEQ ID NO:41和42、SEQ ID NO:43和44、SEQ ID NO:45和46、或SEQ ID NO:47和48。在一些实施方案中，能够与大肠杆菌的yaiO基因杂交的该对对照引物为SEQ ID NO:53和54、SEQ ID NO:55和56、SEQ ID NO:57和58、SEQ ID NO:59和60、或SEQ ID NO:61和62。
在一些实施方案中，所述扩增使用选自由以下组成的组的方法进行：聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、复制酶介导的扩增、免疫扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自主序列复制(3SR)、滚环扩增和转录介导的扩增(TMA)。在一些实施方案中，所述PCR是实时PCR。在一些实施方案中，所述PCR是定量实时PCR(QRT-PCR)。在一些实施方案中，每种引物包含外源核苷酸序列。
在一些实施方案中，确定一种或更多种扩增子的存在或量包括使扩增子与多于一种寡核苷酸探针接触，其中多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针中的每一种由选自由SEQ IDNO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列组成。在一些实施方案中，每种探针在5'末端和3'末端的侧翼为互补序列。在一些实施方案中，互补序列中的一个包含荧光发射物部分，并且另一个互补序列包含荧光猝灭物部分。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针中的至少一种包含荧光发射物部分和荧光猝灭物部分。
本文公开的包括用于检测霍乱弧菌的组合物。在一些实施方案中，组合物包含：能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:1-8的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:1-8的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:12-19的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:12-19的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:24-33的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:24-33的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；以及能够与霍乱弧菌的ctxA(霍乱毒素)基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:39-48的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:39-48的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列。组合物可以包含：能够与大肠杆菌的yaiO基因杂交的至少一对对照引物，其中所述至少一对对照引物中的每种引物包含SEQ ID NO:53-62的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:53-62的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列。
在一些实施方案中，能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交的至少一对引物包含含有SEQ ID NO:1、3、5或7序列的引物和含有SEQ ID NO:2、4、6或8序列的引物；能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交的至少一对引物包含含有SEQ ID NO:12、14、16或18序列的引物和含有SEQ ID NO:13、15、17或19序列的引物；能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交的至少一对引物包含含有SEQ ID NO:24、26、28、30或32序列的引物和含有SEQ ID NO:25、27、29、31或33序列的引物；并且能够与霍乱弧菌的ctxA基因杂交的至少一对引物包含含有SEQ ID NO:39、41、43、45或47序列的引物和含有SEQ ID NO:40、42、44、46或48序列的引物。在一些实施方案中，能够与大肠杆菌的yaiO基因杂交的至少一对对照引物包含含有SEQ IDNO:53、55、57、59或61序列的引物和含有SEQ ID NO:54、56、58、60或62序列的引物。
组合物可以包含：多于一种寡核苷酸探针，其中多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针中的每一种由选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列组成。在一些实施方案中，多于一种探针中的至少一种包含荧光发射物部分和荧光猝灭物部分。
本文公开的包括长度为至多约100个核苷酸，能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交的探针或引物。在一些实施方案中，探针或引物包含：选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的序列组成，或由与选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列组成。在一些实施方案中，所述探针或引物包含选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的序列组成。
本文公开的包括长度为至多约100个核苷酸，能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交的探针或引物。在一些实施方案中，探针或引物包含：选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的序列组成，或由与选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列组成。在一些实施方案中，所述探针或引物包含选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的序列组成。
本文公开的包括长度为至多约100个核苷酸，能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交的探针或引物。在一些实施方案中，探针或引物包含：选自由SEQ ID NO:24-38组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:24-38组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:24-38组成的组的序列组成，或由与选自由SEQ ID NO:24-38组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列组成。在一些实施方案中，所述探针或引物包含选自由SEQ ID NO:24-38组成的组的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:24-38组成的组的序列组成。
本文公开的包括长度为至多约100个核苷酸，能够与霍乱弧菌的ctxA(霍乱毒素)基因杂交的探针或引物。在一些实施方案中，探针或引物包含：选自由SEQ ID NO:39-52组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:39-52组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:39-52组成的组的序列组成，或由与选自由SEQ ID NO:39-52组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列组成。在一些实施方案中，所述探针或引物包含选自由SEQ ID NO:39-52组成的组的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:39-52组成的组的序列组成。
本文公开的包括长度为至多约100个核苷酸，能够与大肠杆菌的yaiO基因杂交的探针或引物。在一些实施方案中，探针或引物包含：包含选自由SEQ ID NO:53-67组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:53-67组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:53-67组成的组的序列组成，或由与选自由SEQ ID NO:53-67组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列组成。在一些实施方案中，所述探针或引物包含选自由SEQ ID NO:53-67组成的组的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:53-67组成的组的序列组成。
本文公开的包括组合物。在一些实施方案中，组合物包含一种或更多种，或两种或更多种本文公开的寡核苷酸探针和引物。在一些实施方案中，组合物还包含一种或更多种用于核酸延伸和/或扩增的酶。
详述
以下详述中参考了形成本文的一部分的附图。在附图中，除非上下文另外指示，否则相似的符号通常标识相似的组成部分。在详述、附图和权利要求书中描述的说明性实施方案不意味着是限制性的。在不脱离本文提供的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以做出其他改变。将容易理解的是，如本文一般描述的以及附图中图示的本公开内容的方面能够以各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计，所有这些都在本文中明确考虑并且构成本公开内容的一部分。
本文提及的所有专利、公布的专利申请、其他出版物和来自GenBank以及其他数据库的序列关于相关技术通过引用以其整体并入本文。
目前，用于霍乱弧菌的检测和血清分型的方法包括常规方法和基于PCR的方法。常规方法包括培养和通过形态学、生化和免疫学特征鉴定。尽管它已被广泛使用，但它缺乏特异性，需要大量复杂的手动操作，并且涉及长的检测周期。最近，用于霍乱弧菌感染的鉴定的基于PCR的方法已经开始出现。与常规方法相比，PCR方法特别是实时PCR方法具有许多优点：它是高度灵敏和特异性的，获得结果的时间更短且劳动强度更低。然而，现有技术适用的PCR方法通常只能实现霍乱弧菌鉴定、血清分型或霍乱毒素检测中的一种或两种，而不能在一个设置中实现所有三个目的。Lyon W J等人(Appl.Environ.Microbiol.,2001,67(10):4685-4693.)描述了一种Taqman探针实时PCR方法，该方法仅用于纯培养物、牡蛎和合成海水中霍乱弧菌的检测。Bhumiratana,Adisak等人(Biochemistry researchinternational 2014)描述了用于霍乱弧菌O1和O139血清组检测的常规多重PCR。这种方法的前提是已经在样品中鉴定了霍乱弧菌。因此，需要开发更高效、更快速的用于霍乱弧菌检测和血清分型的方法，例如多重实时PCR方法同时检测5个基因靶，可以在单次反应完成霍乱弧菌的检测、血清分型和霍乱毒素检测的全部检测。需要用于同时鉴定和确定霍乱弧菌的潜在毒力的多重组合物和方法。
本文提供了用于检测样品中的以下一种或更多种的方法和组合物：霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、以及编码霍乱毒素的霍乱弧菌。例如，提供可以结合霍乱弧菌的特定基因的引物和探针以确定样品(诸如生物样品)中存在或不存在以下一种或更多种：霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、以及编码霍乱毒素的霍乱弧菌。在一些实施方案中，可进行多重核酸扩增以允许在单次测定中检测所述样品中的以下的一种或更多种：霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、以及编码霍乱毒素的霍乱弧菌。
本文公开的包括检测样品中霍乱弧菌的方法。在一些实施方案中，该方法包括：使所述样品与多于一对引物接触，其中多于一对引物包含：能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:1-8的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:1-8的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:12-19的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:12-19的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:24-33的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:24-33的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；以及能够与霍乱弧菌的ctxA(霍乱毒素)基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:39-48的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:39-48的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列。方法可以包括：如果所述样品包含霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139和编码霍乱毒素的霍乱弧菌中的一种或更多种，则产生ompW基因序列的扩增子、rfbN基因序列的扩增子、wbfR基因序列的扩增子、ctxA基因序列的扩增子或其任何组合。方法可以包括：确定一种或更多种扩增子的存在或量，作为所述样品中霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139和编码霍乱毒素的霍乱弧菌中的一种或更多种的存在的指示。方法可以包括：使样品与能够与大肠杆菌(E.coli)的yaiO基因杂交的至少一对对照引物接触，其中所述至少一对对照引物中的每种引物包含SEQ ID NO:53-62的序列中的任一个，或与SEQ IDNO:53-62的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列，并且如果所述样品包含大肠杆菌，则从所述样品产生大肠杆菌的yaiO基因序列的扩增子；以及确定大肠杆菌的yaiO基因序列的扩增子的存在或量，作为所述样品中大肠杆菌的存在的指示。在一些实施方案中，样品与包含多于一对引物和能够与大肠杆菌的yaiO基因杂交的至少一对对照引物的组合物接触。
本文公开的包括用于检测霍乱弧菌的组合物。在一些实施方案中，组合物包含：能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:1-8的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:1-8的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:12-19的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:12-19的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:24-33的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:24-33的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；以及能够与霍乱弧菌的ctxA(霍乱毒素)基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:39-48的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:39-48的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列。组合物可以包含：能够与大肠杆菌的yaiO基因杂交的至少一对对照引物，其中所述至少一对对照引物中的每种引物包含SEQ ID NO:53-62的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:53-62的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列。
组合物可以包含：多于一种寡核苷酸探针，其中多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列，或与选自由SEQID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
本文公开的包括长度为至多约100个核苷酸，能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交的探针或引物。在一些实施方案中，探针或引物包含：选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
本文公开的包括长度为至多约100个核苷酸，能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交的探针或引物。在一些实施方案中，探针或引物包含：选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
本文公开的包括长度为至多约100个核苷酸，能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交的探针或引物。在一些实施方案中，探针或引物包含：选自由SEQ ID NO:24-38组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:24-38组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
本文公开的包括长度为至多约100个核苷酸，能够与霍乱弧菌的ctxA(霍乱毒素)基因杂交的探针或引物。在一些实施方案中，探针或引物包含：选自由SEQ ID NO:39-52组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:39-52组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
本文公开的包括长度为至多约100个核苷酸，能够与大肠杆菌的yaiO基因杂交的探针或引物。在一些实施方案中，探针或引物包含：选自由SEQ ID NO:53-67组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:53-67组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
本文公开的包括组合物。在一些实施方案中，组合物包含一种或更多种，或两种或更多种本文公开的寡核苷酸探针和引物，以及任选地一种或更多种用于核酸延伸和/或扩增的酶。
定义
如本文使用的，术语“核酸”可以指多核苷酸序列或其片段。核酸可以包括核苷酸。核酸对于细胞可以是外源的或内源的。核酸可以存在于无细胞环境中。核酸可以是基因或其片段。核酸可以是DNA。核酸可以是RNA。核酸可以包括一种或更多种类似物(例如，改变的主链、糖或核碱基)。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、非天然核酸(xeno nucleicacid)、吗啉代核酸(morpholinos)、锁核酸、二醇核酸、苏糖核酸、二脱氧核苷酸、虫草菌素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如，罗丹明或与糖连接的荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化的核苷酸、肌苷、硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷(queuosine)以及怀俄苷(wyosine)。“核酸”、“多核苷酸”、“靶多核苷酸”、“靶核酸”和“靶序列”可以互换使用。如本文使用的，“核酸”可以指包含核苷或具有含氮杂环碱基或碱基类似物的核苷类似物的聚合化合物，核苷或核苷类似物通过核酸主链连键(linkage)(例如，磷酸二酯键)连接在一起形成多核苷酸。核酸的非限制性实例包括RNA、DNA及其类似物。核酸主链可以包括多种连键，例如以下中的一种或更多种：糖-磷酸二酯连键、肽-核酸键、硫代磷酸酯或甲基膦酸酯连键，或在单个寡核苷酸中这样的连键的混合。核酸中的糖部分可以是核糖或脱氧核糖，或具有已知取代的类似化合物。术语核酸中包括常规含氮碱基(例如，A、G、C、T、U)、已知的碱基类似物(例如，肌苷)、嘌呤碱基或嘧啶碱基的衍生物和“无碱基”残基(即一个或更多个主链位置没有含氮碱基)。也就是说，核酸可以仅包括可见于RNA和DNA的常规糖、碱基和连键，或者包括常规组分和取代物二者(例如，通过甲氧基主链连接的常规碱基和类似物，或者通过RNA或DNA主链连接的常规碱基和一个或更多个碱基类似物)。
核酸可以包括一种或更多种修饰(例如，碱基修饰、主链修饰)，以为核酸提供新的或增强的特征(例如，改进的稳定性)。核酸可以包含核酸亲和标签。核苷可以是碱基-糖组合。核苷的碱基部分可以是杂环碱基。此类杂环碱基的两个最常见的类别是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是还包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包括呋喃戊糖的那些核苷，磷酸基团可以连接到糖的2'、3'或5'羟基部分。在形成核酸时，磷酸基团可以将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性聚合化合物。继而，此线性聚合化合物的各端可以进一步连接而形成环状化合物；然而，线性化合物通常是合适的。此外，线性化合物可以具有内部核苷酸碱基互补性，并且因此可以按产生完全或部分双链化合物的方式折叠。在核酸中，磷酸基团通常可以称为形成核酸的核苷间主链。连键(linkage)或主链可以是3'到5'磷酸二酯连键。
核酸可以包括修饰的主链和/或修饰的核苷间连键。修饰的主链可以包括那些在主链中保留磷原子的主链和那些在主链中没有磷原子的主链。合适的其中含磷原子的修饰的核酸主链可以包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基(alkyl)膦酸酯诸如3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯、亚膦酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidate)(包括3'-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、磷酸二酰胺酯(phosphorodiamidates)、硫代磷酰胺酯(thionophosphoramidates))、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼磷酸酯，具有正常3'-5'连接、2'-5'连接的类似物以及具有反向极性的类似物(其中一个或更多个核苷酸间连接是3'至3'、5'至5'或2'至2'连接)。
核酸可以包括由短链烷基或环烷基核苷间连键，混合杂原子，和烷基或环烷基核苷间连键，或者一个或更多个短链杂原子的或杂环的核苷间连键形成的多核苷酸主链。这些可以包括具有吗啉代(morpholino)连键的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基主链；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链；核糖乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其他的那些。
核酸可以包括核酸模拟物。术语“模拟物”可以意图包括其中仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间连键二者被非呋喃糖基团替代的多核苷酸，仅呋喃糖环的替代也可以称为糖替代物(surrogate)。可以维持杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分，以与适当的靶核酸杂交。一种这样的核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸的糖主链可以被含酰胺的主链替代，特别是被氨基乙基甘氨酸主链替代。核苷酸可以被保留，并且直接或间接与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。PNA化合物中的主链可以包含两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元，这使得PNA具有含酰胺的主链。杂环碱基部分可以直接或间接与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。
核酸可以包括吗啉代主链结构。例如，核酸可以包含替代核糖环的6元吗啉代环。在这些实施方案的一些中，磷酸二酰胺酯或其他非磷酸二酯核苷间连键可以替代磷酸二酯连键。
核酸可以包括具有附接至吗啉代环的杂环碱基的连接的吗啉代单元(例如，吗啉代核酸)。连接基团可以连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。基于非离子吗啉代的寡聚化合物与细胞蛋白可以具有较少的不期望的相互作用。基于吗啉代的多核苷酸可以是核酸的非离子模拟物。吗啉代类别内的各种化合物可以使用不同的连接基团来连接。另外类别的多核苷酸模拟物可以称为环己烯基核酸(CeNA)。核酸分子中通常存在的呋喃糖环可以被环己烯基环替代。使用亚磷酰胺化学可以制备CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体并用于寡聚化合物合成。将CeNA单体掺入核酸链可以增加DNA/RNA杂合体的稳定性。CeNA寡腺苷酸酯可以与核酸互补物形成复合体，具有与天然复合体相似的稳定性。另外的修饰可以包括锁核酸(LNA)，其中2'-羟基基团与糖环的4'碳原子连接，从而形成2'-C,4'-C-氧亚甲基连键，从而形成双环糖部分。连接可以是亚甲基(-CH2)，桥接2'氧原子和4'碳原子的基团，其中n是1或2。LNA和LNA类似物可以显示与互补核酸的非常高的双链体热稳定性(Tm＝+3℃至+10℃)、对3'-外切核酸裂解降解的稳定性和良好的溶解性。
核酸还可以包括核碱基(通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文使用的，“未修饰的”或“天然的”核碱基可以包括嘌呤碱基(例如，腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))，以及嘧啶碱基(例如，胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))。经修饰的核碱基可以包括其他合成以及天然的核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤素尿嘧啶(5-halouracil)和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶，8-卤素、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤素特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。修饰的核碱基可以包括三环嘧啶，诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-钳(G-clamps)诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-钳诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并(3',2':4,5)吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。
如本文使用的，术语“分离核酸”可以指从一种或更多种细胞组分中纯化核酸。本领域技术人员将理解，被处理以从中“分离核酸”的样品可以包括核酸以外的组分和杂质。包含分离的核酸的样品可以使用本领域已知的任何可接受的方法从样本制备。例如，可以使用已知的裂解剂裂解细胞，并且可以从其他细胞组分纯化或部分纯化核酸。用于DNA和RNA提取的合适的试剂和方案可以分别在例如美国专利申请公布第US 2010-0009351号和第US 2009-0131650号中找到(其中每一个通过引用以其整体并入本文)。在核酸测试(例如，下面进一步详细讨论的扩增和杂交方法)中，提取的核酸溶液可以直接添加到根据本文公开的实施方案进行测试所需的试剂中(例如，以液体形式、结合至底物、以冻干形式等，如下面进一步详细讨论的)。
如本文使用的，“模板”可以指包含至少一种靶核苷酸序列的多核苷酸的全部或部分。
如本文使用的，“引物”可以指可用于起始核酸链延伸反应的多核苷酸。引物的长度可以变化，例如从约5个到约100个核苷酸，从约10个到约50个核苷酸，从约15个到约40个核苷酸，或者从约20个到约30个核苷酸。引物的长度可以是约10个核苷酸、约20个核苷酸、约25个核苷酸、约30个核苷酸、约35个核苷酸、约40个核苷酸、约50个核苷酸、约75个核苷酸、约100个核苷酸，或者在这些值中的任何两个之间的范围。在一些实施方案中，引物具有10个至约50个核苷酸的长度，即10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，引物具有18个至32个核苷酸的长度。
如本文使用的，“探针”可以指在允许杂交的条件下能够与核酸中的靶序列杂交(例如，特异性地)，从而允许检测靶序列或扩增的核酸的多核苷酸。探针的“靶”通常是指通过标准氢键合(即碱基配对)与探针寡聚物的至少一部分特异性杂交的扩增的核酸序列内的序列或扩增的核酸序列的子集。探针可以包含靶特异性序列和有助于探针三维构象的其他序列。如果序列允许探针寡聚物在适当的杂交条件下与探针的靶特异性序列不完全互补的靶序列稳定杂交，则序列是“充分互补的”。探针的长度可以变化，例如从约5个到约100个核苷酸，从约10个到约50个核苷酸，从约15个到约40个核苷酸，或者从约20个到约30个核苷酸。探针的长度可以是约10个核苷酸、约20个核苷酸、约25个核苷酸、约30个核苷酸、约35个核苷酸、约40个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸，或者在这些值中的任何两个之间的范围。在一些实施方案中，探针具有10个至约50个核苷酸的长度。例如，引物和/或探针可以是至少10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，探针可以是非序列特异性的。
优选地，引物和/或探针的长度可以在8个和45个核苷酸之间。例如，引物和/或探针的长度可以是至少8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个或更多个核苷酸。引物和探针可以被修饰为在5'末端或3'末端或二者含有另外的核苷酸。本领域技术人员将理解，扩增引物(不必需是探针)的3'末端的另外的碱基通常与模板序列互补。引物和探针序列也可以被修饰以去除5'末端或3'末端处的核苷酸。本领域技术人员将理解，为了发挥扩增功能，引物或探针具有如本文公开的最小长度和退火温度。
引物和探针可以在退火温度(其是低于解链温度(Tm)的温度)与它们的靶结合。如本文使用的，“Tm”和“解链温度”是可互换的术语，指50％的双链多核苷酸分子群体解离成单链的温度。计算多核苷酸的Tm的公式是本领域熟知的。例如，Tm可通过以下等式计算：Tm＝69.3+0.41×(G+C)％-6-50/L，其中L为核苷酸中探针的长度。杂交多核苷酸的Tm也可以使用从1M盐的杂交测定中采用的公式来估计，并且该公式通常用于计算PCR引物的Tm：[(A+T的数量)×2℃+(G+C的数量)×4℃]。参见，例如，C.R.Newton等人PCR,第二版,Springer-Verlag(New York:1997),第24页(通过引用以其整体并入本文)。在本领域中存在其他更复杂的计算，其在计算Tm时考虑结构以及序列特征。寡核苷酸的解链温度可以取决于寡核苷酸引物或探针与结合序列之间的互补性，以及盐条件。在一些实施方案中，本文提供的寡核苷酸引物或探针在50mM KCl、10mM Tris-HCl缓冲液中具有小于约90℃的Tm，例如约89℃，88℃、87℃、86℃、85℃、84℃、83℃、82℃、81℃、80℃、79℃、78℃、77℃、76℃、75℃、74℃、73℃、72℃、71℃、70℃、69℃、68℃、67℃、66℃、65℃、64℃、63℃、62℃、61℃、60℃、59℃、58℃、57℃、56℃、55℃、54℃、53℃、52℃、50℃、49℃、48℃、47℃、46℃、45℃、44℃、43℃、42℃、41℃、40℃、39℃或更低，包括所列值中任何两个之间的范围的Tm。
在一些实施方案中，本文公开的引物，例如扩增引物，可以作为扩增引物对提供，例如包含正向引物和反向引物(第一扩增引物和第二扩增引物)。优选地，正向和反向引物具有相差不超过10℃，例如，相差小于10℃、小于9℃、小于8℃、小于7℃、小于6℃、小于5℃、小于4℃、小于3℃、小于2℃或小于1℃的Tm。
引物序列和探针序列可以通过在寡核苷酸序列内进行核苷酸取代(相对于靶序列)来修饰，条件是寡核苷酸包含足以与靶核酸序列特异性杂交的互补性。以这种方式，至少1个、2个、3个、4个或多达约5个核苷酸可以被取代。如本文使用的，术语“互补”可以指两条多核苷酸链的区域之间或同一多核苷酸链的两个区域之间的序列互补性。如果当多核苷酸的第一区域与同一或不同多核苷酸的第二区域以反向平行方式排列时，第一区域的至少一个核苷酸能够与第二区域的碱基进行碱基配对，则两个区域互补。因此，不需要两个互补的多核苷酸在每个核苷酸位置处都碱基配对。“完全互补”可以指第一多核苷酸与第二多核苷酸100％或“完全”互补并因此在每个核苷酸位置处形成碱基对。“部分互补”也可以指第一多核苷酸不是100％互补(例如，90％、80％或70％互补)并且在一个或更多个核苷酸位置处含有错配核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含通用碱基。
如本文使用的，“外源核苷酸序列”可以指这样的序列，其通过用于扩增的引物或探针引入，使得扩增产物将含有外源核苷酸序列和靶核苷酸序列，外源核苷酸序列和靶核苷酸序列以未见于从中复制靶核苷酸序列的原始模板的方式排列。
如本文所使用的，应用于核酸分子的“序列同一性”或“百分比同一性”可以指在序列对齐以实现最大百分比同一性之后，并且不考虑任何核酸残基取代作为序列同一性的一部分，候选核酸分子序列中与受试核酸分子序列相同的核酸残基的百分比。核酸序列同一性可以使用本领域已知的任何方法，例如，CLUSTALW、T-COFFEE、BLASTN来确定。
如本文使用的，术语“充分互补”可以指连续的核酸碱基序列能够通过一系列互补碱基之间的氢键合与另一碱基序列杂交。互补碱基序列可以通过使用标准碱基配对(例如，G:C、A:T或A:U)在寡聚物序列中的每个位置处互补，或者可以包含一个或更多个不互补的残基(包括无碱基位置)，但其中整个互补碱基序列能够在适当的杂交条件下与另一个碱基序列特异性杂交。连续的碱基可以与寡聚物意图杂交的序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％互补。基本上互补的序列可以指与参考序列相比，百分比同一性范围在100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、75、70或更少，或其间的任何数字的序列。本领域技术人员可以容易地选择适当的杂交条件，该条件可以基于碱基序列组成进行预测，或者通过使用常规测试来确定(参见例如Green和Sambrook,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第4版(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2012))。
如本文使用的，术语“多重PCR”是指其中多于一组引物被包含在反应中，允许在单个反应容器(例如，管)中扩增单个靶或两个或更多个不同靶的PCR类型。多重PCR可以是例如实时PCR。
寡核苷酸及包含其的组合物
如本文描述的，可进行核酸扩增以确定样品中以下一种或更多种的存在、不存在、类型和/或水平：霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、以及编码霍乱毒素的霍乱弧菌。在一些实施方案中，通过使用本领域已知的方法，诸如DNA扩增，检测每种靶生物体的一个或更多个靶基因来确定以下一种或更多种的存在、不存在和/或水平：霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、以及编码霍乱毒素的霍乱弧菌。在一些实施方案中，可以进行多重PCR以检测以下一种或更多种的存在、不存在或水平：霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、以及编码霍乱毒素的霍乱弧菌。
在一些实施方案中，提供了多重实时PCR(聚合酶链式反应)引物和探针组合以及用于同时鉴定和确定霍乱弧菌的潜在毒力的检测方法。在一些实施方案中，提供了靶向存在于霍乱弧菌的所有菌株中的物种特异性ompW基因和用作物种标志物的编码O1和O139体细胞抗原的rfbN和wbfR，以及编码CT的ctxA的方法(例如，多重RT PCR测定)和组合物(例如，引物和探针)。此外，在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，大肠杆菌特异性yaiO基因被用作添加到多重PCR中指示假阴性结果(例如，由PCR抑制剂、仪器或试剂失效引起的)的内部对照的标志物。
本文公开的包括方法和组合物(例如，利用发荧光的序列特异性杂交探针的试剂)，其提供对以下的快速和经济的解决方案：(1)霍乱弧菌菌株的鉴定；(2)O1和O139血清型的鉴别；(3)霍乱毒素的检测；(4)粪便样品的质量监测；和/或(5)DNA提取和实时PCR过程的质量控制。本文提供的方法可以包括：利用5组浓度优化的引物对和探针，对来自怀疑包含霍乱弧菌的样品(例如，粪便样品)或培养物的DNA进行多重聚合酶链反应扩增；在最佳热条件下处理反应混合物，并在每个循环中通过监测水解()探针的荧光信号检测扩增的DNA靶，并在程序结束时解释数据以报告最终结果。本文公开的包括使用引物设计软件Primer 3和Beacon Designer设计和筛选的多重PCR引物和探针。5组优化的引物和探针可以包括在表1中示出的引物和探针。通过本文提供的方法实现了对非常重要的腹泻病原体的快速和高度灵敏的检测和区分。
在一些实施方案中，提供了基于Taqman探针的实时多重PCR组合物和方法。本文公开的包括用于霍乱弧菌的快速鉴定和分型的基于TaqMan探针的多重实时PCR组合物(例如试剂)和方法(例如测定)。与目前可用的方法相比，本发明的优点包括：(1)通过使用建立的多重PCR检测方法可同时检测5个基因靶，霍乱弧菌鉴定、血清分型和霍乱毒素检测可以在单次PCR反应中实现；(2)设计的内部对照可以监测粪便样品的质量，并指示主要由PCR抑制剂、仪器或试剂失效引起的假阴性结果；以及(3)本文公开的引物/探针组合和多重实时PCR方法可以实现高灵敏度、包容性和特异性。此外，所公开的方法既快速又容易进行。
靶霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、以及编码霍乱毒素的霍乱弧菌中的每一个可以使用DNA扩增中的单独的通道来检测。在一些实施方案中，可以期望使用单个荧光通道来检测以下两种或更多种的存在、不存在和/或水平：霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、以及编码霍乱毒素的霍乱弧菌。在一些实施方案中，这样的组合可以减少进行实验所需的试剂量，以及提供准确的定性度量，在此基础上可以评估霍乱确定。
提供了能够与霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、以及编码霍乱毒素的霍乱弧菌中的靶基因区域或其互补物特异性杂交(例如，在标准核酸扩增条件下，例如标准PCR条件和/或严格的杂交条件下)的寡核苷酸(例如扩增引物和探针)。在一些实施方案中，样品(例如粪便样品)中生物体的靶基因区域的扩增可以指示样品中生物体的存在、不存在和/或水平。
靶基因区域可以不同。在一些实施方案中，存在于霍乱弧菌的所有菌株中的物种特异性ompW基因被用作物种的标志物。在一些实施方案中，提供了能够与霍乱弧菌中编码ompW的基因区域特异性杂交(例如，在标准核酸扩增条件下，例如标准PCR条件和/或严格的杂交条件下)的寡核苷酸(例如，扩增引物和探针)。在一些实施方案中，ompW基因被用作DNA扩增的靶基因以检测样品中霍乱弧菌的存在、不存在和/或水平。在一些实施方案中，可以特异性结合霍乱弧菌的ompW基因区域的引物和探针用于检测生物样品中霍乱弧菌的存在、不存在和/或水平。能够特异性地与霍乱弧菌中ompW基因区域杂交的寡核苷酸的实例包括但不限于表1中提供的SEQ ID NO:1-11和与选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
在一些实施方案中，编码O1体细胞抗原的rfbN被用作用于霍乱弧菌O1血清组的标志物。在一些实施方案中，提供了能够与霍乱弧菌血清组O1中编码rfbN的基因区域特异性杂交(例如，在标准核酸扩增条件下，例如标准PCR条件和/或严格的杂交条件下)的寡核苷酸(例如，扩增引物和探针)。在一些实施方案中，rfbN基因被用作DNA扩增的靶基因以检测样品中霍乱弧菌血清组O1的存在、不存在和/或水平。在一些实施方案中，可以特异性结合霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因区域的引物和探针用于检测生物样品中霍乱弧菌血清组O1的存在、不存在和/或水平。能够特异性地与霍乱弧菌血清组O1中rfbN基因区域杂交的寡核苷酸的实例包括但不限于表1中提供的SEQ ID NO:12-23和与选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
在一些实施方案中，编码O139体细胞抗原的wbfR被用作用于霍乱弧菌O139血清组的标志物。在一些实施方案中，提供了能够与霍乱弧菌血清组O139中编码wbfR的基因区域特异性杂交(例如，在标准核酸扩增条件下，例如标准PCR条件和/或严格的杂交条件下)的寡核苷酸(例如，扩增引物和探针)。在一些实施方案中，wbfR基因被用作DNA扩增的靶基因以检测样品中霍乱弧菌血清组O139的存在、不存在和/或水平。在一些实施方案中，可以特异性结合霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因区域的引物和探针用于检测生物样品中霍乱弧菌血清组O139的存在、不存在和/或水平。能够特异性地与霍乱弧菌血清组O139中wbfR基因区域杂交的寡核苷酸的实例包括但不限于表1中提供的SEQ ID NO:24-38和与选自由SEQID NO:24-38组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
在一些实施方案中，ctxA被用作用于编码霍乱毒素的霍乱弧菌的标志物。在一些实施方案中，提供了能够与霍乱弧菌中编码ctxA的基因区域特异性杂交(例如，在标准核酸扩增条件下，例如标准PCR条件和/或严格的杂交条件下)的寡核苷酸(例如，扩增引物和探针)。在一些实施方案中，ctxA基因被用作DNA扩增的靶基因以检测样品中编码霍乱毒素的霍乱弧菌的存在、不存在和/或水平。在一些实施方案中，可以特异性结合霍乱弧菌的ctxA基因区域的引物和探针用于检测生物样品中编码ctxA的霍乱弧菌的存在、不存在和/或水平。能够特异性地与霍乱弧菌中ctxA基因区域杂交的寡核苷酸的实例包括但不限于表1中提供的SEQID NO:39-52和与选自由SEQ ID NO:39-52组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
此外，在本文提供的方法和组合物的一些实施方案中，大肠杆菌特异性yaiO基因被用作添加到多重PCR中指示假阴性结果(例如，由PCR抑制剂、仪器或试剂失效引起的)的内部对照的标志物。在一些实施方案中，提供了能够与大肠杆菌中编码yaiO的基因区域特异性杂交(例如，在标准核酸扩增条件下，例如标准PCR条件和/或严格的杂交条件下)的寡核苷酸(例如，扩增引物和探针)。在一些实施方案中，yaiO基因被用作DNA扩增的靶基因以检测样品中大肠杆菌的存在、不存在和/或水平。在一些实施方案中，可以特异性地结合大肠杆菌的yaiO基因区域的引物和探针用于检测生物样品中大肠杆菌的存在、不存在和/或水平(例如，作为内部对照)。能够特异性地与大肠杆菌中yaiO基因区域杂交的寡核苷酸的实例包括但不限于表1中提供的SEQ ID NO:53-67和与选自由SEQ ID NO:53-67组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
表1.用于检测霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、编码霍乱毒素 的霍乱弧菌以及大肠杆菌的引物和探针的非限制性实例
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本文还提供了相对于SEQ ID NO:1-67或其互补物包含1个、2个、3个、4个或更多个错配或通用核苷酸的寡核苷酸(例如扩增引物或探针)，包括与SEQ ID NO:1-67或其互补物至少80％相同(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些值中任何两个之间的数字或范围)的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含选自SEQ ID NO:1-67的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸包含与选自SEQ ID NO:1-67的序列至少约85％相同的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸由选自SEQ ID NO:1-67的序列组成。在一些实施方案中，寡核苷酸由与选自SEQ ID NO:1-67的序列至少约85％相同或至少约95％相同的序列组成。在一些实施方案中，本文提供的引物的最终反应浓度为约300nM。在一些实施方案中，本文提供的探针的最终反应浓度为约100nM。
在一些实施方案中，提供了引物/探针组合。引物/探针组合可包含正向引物、反向引物和探针(例如串联的A3-ompW-FP、A3-ompW-RP和A3-ompW-探针)。本文提供的组合物和方法可以包括表1中提供的一种或更多种引物/探针组合。例如，方法或组合物可以包含引物/探针组合A3(例如串联的A3-ompW-FP、A3-ompW-RP和A3-ompW-探针)。本文公开了包含两种或更多种引物/探针组合(例如多重化反应)的方法和组合物。例如，方法或组合物可以包含引物/探针组合A3、B3、C3和D3(例如，串联的A3-ompW-FP、A3-ompW-RP、A3-ompW-探针、B3-rfbN-FP、B3-rfbN-RP、B3-rfbN-探针、C3-wbfR-15F、C3-wbfR-15R、C3-wbfR-探针、D3-ctxA-FP、D3-ctxA-RP和D3-ctxA-探针)。本文公开了方法和组合物，包括：(1)能够特异性地与霍乱弧菌的ompW基因序列或其互补物杂交的一种或更多种引物/探针组合(例如，A1、A2、A3和/或A4)；(2)能够特异性地与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因序列或其互补物杂交的一种或更多种引物/探针组合(例如，B1、B2、B3和/或B4)；(3)能够特异性地与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因序列或其互补物杂交的一种或更多种引物/探针组合(例如C1、C2、C3、C4和/或C5)；(4)能够特异性地与霍乱弧菌的ctxA(霍乱毒素)基因序列或其互补物杂交的一种或更多种引物/探针组合(例如，D1、D2、D3、D4和/或D5)；和/或(5)能够特异性地与大肠杆菌的yaiO基因序列或其互补物杂交的一种或更多种引物/探针组合(例如，E1、E2、E3、E4和/或E5)。本文公开了包含表2中提供的一种或更多种引物/探针组合的方法和组合物。本文公开了包含表3中提供的一种或更多种引物/探针组合的方法和组合物。
表2.表1中示出的用于检测霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、 以及编码霍乱毒素的霍乱弧菌的引物/探针组合的多重化
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表3.表1中示出的用于检测霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、 编码霍乱毒素的霍乱弧菌以及大肠杆菌的引物/探针组合的多重化
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本文提供的核酸可以是各种形式的。例如，在一些实施方案中，核酸溶解在溶液(例如缓冲液)中(单独或与各种其他核酸组合)。在一些实施方案中，核酸被作为盐单独或与其他分离的核酸组合提供。在一些实施方案中，核酸以可重构的冻干形式提供。例如，在一些实施方案中，本文公开的分离的核酸可以单独以冻干沉淀提供，或者与其他分离的核酸一起以冻干沉淀提供。在一些实施方案中，核酸被固定到固体物质诸如珠、膜等来提供。在一些实施方案中，核酸在宿主细胞，例如携带质粒的细胞系或携带稳定整合序列的细胞系中提供。
在一些实施方案中，组合物、反应混合物和试剂盒包含能够特异性地与霍乱弧菌的ompW基因序列或其互补物杂交的一对或更多对扩增引物。在一些实施方案中，组合物、反应混合物和试剂盒包含能够特异性地与霍乱弧菌的ompW基因序列或其互补物杂交的一种或更多种探针。本文公开的包括长度为至多约100个核苷酸，能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交的探针或引物。在一些实施方案中，探针或引物包含：选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的序列显示至少约85％同一性、至少约90％同一性或至少约95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ IDNO:1-11组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的序列显示至少约85％同一性、至少约90％同一性或至少约95％同一性的序列组成。在一些实施方案中，所述探针或引物包含选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的序列组成。
在一些实施方案中，组合物、反应混合物和试剂盒包含能够特异性地与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因序列或其互补物杂交的一对或更多对扩增引物。在一些实施方案中，组合物、反应混合物和试剂盒包含能够特异性地与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因序列或其互补物杂交的一种或更多种探针。本文公开的包括长度为至多约100个核苷酸，能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交的探针或引物。在一些实施方案中，探针或引物包含：选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的序列显示至少约85％同一性、至少约90％同一性或至少约95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的序列显示至少约85％同一性、至少约90％同一性或至少约95％同一性的序列组成。在一些实施方案中，所述探针或引物包含选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的序列组成。
在一些实施方案中，组合物、反应混合物和试剂盒包含能够特异性地与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因序列或其互补物杂交的一对或更多对扩增引物。在一些实施方案中，组合物、反应混合物和试剂盒包含能够特异性地与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因序列或其互补物杂交的一种或更多种探针。本文公开的包括长度为至多约100个核苷酸，能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交的探针或引物。在一些实施方案中，探针或引物包含：选自由SEQ ID NO:24-38组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:24-38组成的组的序列显示至少约85％同一性、至少约90％同一性或至少约95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:24-38组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:24-38组成的组的序列显示至少约85％同一性、至少约90％同一性或至少约95％同一性的序列组成。在一些实施方案中，所述探针或引物包含选自由SEQ ID NO:24-38组成的组的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:24-38组成的组的序列组成。
在一些实施方案中，组合物、反应混合物和试剂盒包含能够特异性地与霍乱弧菌的ctxA(霍乱毒素)基因序列或其互补物杂交的一对或更多对扩增引物。在一些实施方案中，组合物、反应混合物和试剂盒包含能够特异性地与霍乱弧菌的ctxA(霍乱毒素)基因序列或其互补物杂交的一种或更多种探针。本文公开的包括长度为至多约100个核苷酸，能够与霍乱弧菌的ctxA(霍乱毒素)基因杂交的探针或引物。在一些实施方案中，探针或引物包含：选自由SEQ ID NO:39-52组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:39-52组成的组的序列显示至少约85％同一性、至少约90％同一性或至少约95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:39-52组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:39-52组成的组的序列显示至少约85％同一性、至少约90％同一性或至少约95％同一性的序列组成。在一些实施方案中，所述探针或引物包含选自由SEQ ID NO:39-52组成的组的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:39-52组成的组的序列组成。
在一些实施方案中，组合物、反应混合物和试剂盒包含能够特异性地与大肠杆菌的yaiO基因序列或其互补物杂交的一对或更多对扩增引物。在一些实施方案中，组合物、反应混合物和试剂盒包含能够特异性地与大肠杆菌的yaiO基因序列或其互补物杂交的一种或更多种探针。本文公开的包括长度为至多约100个核苷酸，能够与大肠杆菌的yaiO基因杂交的探针或引物。在一些实施方案中，探针或引物包含：选自由SEQ ID NO:53-67组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:53-67组成的组的序列显示至少约85％同一性、至少约90％同一性或至少约95％同一性的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ IDNO:53-67组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:53-67组成的组的序列显示至少约85％同一性、至少约90％同一性或至少约95％同一性的序列组成。在一些实施方案中，所述探针或引物包含选自由SEQ ID NO:53-67组成的组的序列。在一些实施方案中，所述探针或引物由选自由SEQ ID NO:53-67组成的组的序列组成。
在一些实施方案中，提供了包含一种或更多种、或者两种或更多种本文公开的寡核苷酸探针和/或引物的组合物。
在一些实施方案中，寡核苷酸探针可以包含可检测部分。例如，本文公开的寡核苷酸探针可以包含放射性标记。放射性标记的非限制性实例包括3H、14C、32P和35S。在一些实施方案中，寡核苷酸探针可以包含一种或更多种非放射性可检测标志物或部分，包括但不限于配体、荧光团、化学发光剂、酶和抗体。与探针一起使用的可以实现本发明方法的灵敏度增加的其他可检测标志物包括生物素和放射性核苷酸。普通技术人员将明白，特定标记的选择决定了它与探针结合的方式。例如，用一种或更多种染料标记的寡核苷酸探针，使得在与模板核酸杂交时，产生可检测的荧光变化。虽然非特异性染料对于一些应用可能是期望的，但序列特异性探针可以提供更准确的扩增测量。序列特异性探针的一种配置可以包括探针的一端被拴系到荧光团，并且探针的另一端被拴系到猝灭物。当探针未杂交时，它可以保持茎环配置，其中荧光团被猝灭物猝灭，从而阻止荧光团发荧光。当探针与模板核酸序列杂交时，它被线性化，使荧光团与猝灭物拉开距离，并且从而允许荧光团发荧光。序列特异性探针的另一种配置可以包括第一探针被拴系到FRET对的第一荧光团，并且第二探针被拴系到FRET对的第二荧光团。第一探针和第二探针可以被配置成与扩增子的当第一探针和第二探针与该同一扩增子杂交时在足够近的距离内以允许通过FRET进行能量传递的序列杂交。
在一些实施方案中，探针是TaqMan探针。TaqMan探针可以包含荧光团和猝灭物。猝灭物分子可以通过共振能量转移(FRET)来猝灭由荧光团在被循环仪的光源激发时发射的荧光。只要荧光团和猝灭物接近，猝灭就能够抑制任何可检测的(例如荧光)信号。本文提供的TaqMan探针可以被设计为使得它们在由本文提供的引物扩增的DNA区域内退火。不受任何特定理论的约束，在一些实施方案中，当PCR聚合酶(例如，Taq)延伸引物并在单链模板上合成新生链时，PCR聚合酶的5'至3'核酸外切酶活性使已与模板退火的探针降解。探针的降解可以使荧光团从探针释放并破坏与猝灭物的接近，从而减轻猝灭效应并允许荧光团发荧光。因此，在一些实施方案中，定量PCR热循环仪中检测到的荧光可以与PCR中释放的荧光团和存在的DNA模板量成正比。
在一些实施方案中，序列特异性探针包含与荧光团缀合的如本文所公开的寡核苷酸。在一些实施方案中，探针与两个或更多个荧光团缀合。荧光团的实例包括：呫吨染料，例如，荧光素和罗丹明染料，诸如异硫氰酸荧光素(FITC)、2-[乙基氨基)-3-(乙基亚氨基)-2-7-二甲基-3H-呫吨-9-基]苯甲酸乙酯单盐酸盐(R6G)(在约500nm至560nm范围的波长发射响应辐射)、1,1,3,3,3',3'-六甲基吲哚二碳菁碘化物(HIDC)(在约600nm至660nm范围的波长发射响应辐射)、6-羧基荧光素(通常称为缩写FAM和F)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)、6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)和罗丹明110；花青染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；香豆素，例如伞形酮；苯甲亚胺染料，例如Hoechst 33258；菲啶类染料，例如德克萨斯红；乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲炔(polymethine)染料，例如花青染料，诸如Cy3(在约540nm至580nm范围的波长发射响应辐射)、Cy5(在约640nm至680nm范围的波长发射响应辐射)等；BODIPY染料和喹啉染料。感兴趣的特定荧光团包括：芘、香豆素、二乙基氨基香豆素、FAM、氯三嗪基荧光素、荧光素、R110、曙红、JOE、R6G、HIDC、四甲基罗丹明、TAMRA、Lissamine、ROX、萘基荧光素、德克萨斯红、萘基荧光素、Cy3和Cy5、CAL荧光橙等。荧光素染料的其他实例包括6-羧基荧光素(6-FAM)、2',4',1,4-四氯荧光素(TET)、2',4',5',7',1,4-六氯荧光素(HEX)、2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基罗丹明(JOE)、2'-氯-5'-氟-7',8'-稠合苯基-1,4-二氯-6-羧基荧光素(NED)、和2'-氯-7'-苯基-1,4-二氯-6-羧基荧光素(VIC)。探针可以包含SpC6，或其功能等同物及其衍生物。探针可以包含间隔物部分。间隔物部分可以包含至少2个碳至约12个碳的烷基基团。探针可以包含含有无碱基单元的间隔物。探针可以包含选自包含以下的组的间隔物：idSp、iSp9、iS18、iSpC3、iSpC6、iSpC12或其任何组合。
在一些实施方案中，探针与猝灭物缀合。猝灭物可以吸收电磁辐射并将其作为热量耗散，从而保持黑暗。实例猝灭物包括Dabcyl、NFQ，诸如BHQ-1或BHQ-2(Biosearch)、IOWABLACK FQ(IDT)和IOWA BLACK RQ(IDT)。在一些实施方案中，猝灭物被选择成与荧光团配对，以便吸收荧光团发射的电磁辐射。可用于本文公开的组合物和方法的荧光团/猝灭物对是本领域熟知的，并且可以见于例如描述于在www.molecular-beacons.org/download/marras,mmb06％28335％293.pdf可得的Marras,“Selection of Fluorophore andQuencher Pairs for Fluorescent Nucleic Acid Hybridization Probes”。猝灭物部分的实例包括但不限于：暗猝灭物、黑洞猝灭物(Black Hole Quencher)(例如BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3)、Qxl猝灭物、ATTO猝灭物(例如ATTO 540Q、ATTO 580Q和ATTO612Q)、二甲基氨基偶氮苯磺酸(Dabsyl)、Iowa Black RQ、Iowa Black FQ、IRDye QC-1、QSY染料(例如QSY 7、QSY 9、QSY 21)、绝对猝灭物(AbsoluteQuencher)、Eclipse和金属簇诸如金纳米颗粒，等等。ATTO猝灭物的实例包括但不限于：ATTO 540Q、ATTO 580Q和ATTO 612Q。的实例包括但不限于：BHQ-0(493nm)、BHQ-1(534nm)、BHQ-2(579nm)和BHQ-3(672nm)。
在一些实施方案中，可检测标记是选自以下的荧光标记：Alexa染料(例如，Alexa/>350、Alexa/>405、Alexa/>430、Alexa/>488、Alexa500、Alexa/>514、Alexa/>532、Alexa/>546、Alexa/>555、Alexa/>568、Alexa/>594、Alexa/>610、Alexa/>633、Alexa/>635、Alexa/>647、Alexa/>660、Alexa/>680、Alexa/>700、Alexa750、Alexa/>790)，ATTO染料(例如，ATTO 390、ATTO 425、ATTO 465、ATTO488、ATTO 495、ATTO 514、ATTO 520、ATTO 532、ATTO Rho6G、ATTO 542、ATTO 550、ATTO565、ATTO Rho3B、ATTO Rhol l、ATTO Rhol2、ATTO Thiol 2、ATTO 590、ATTO 594、ATTORhol3、ATTO 610、ATTO 620、ATTO Rhol4、ATTO 633、ATTO 647、ATTO 647N、ATTO 655、ATTOOxal2、ATTO 665、ATTO 680、ATTO 700、ATTO 725、ATTO 740)、DyFight染料、花青染料(例如Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy3b、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5)、FluoProbes染料、磺基Cy染料、Seta染料、IRIS染料、SeTau染料、SRfluor染料、Square染料、荧光素(FITC)、四甲基罗丹明(TRITC)、德克萨斯红(Texas Red)、俄勒冈绿(Oregon Green)、太平洋蓝(Pacific Blue)、太平洋绿(Pacific Green)、太平洋橙(Pacific Orange)、量子点和拴系的荧光蛋白。
在一些实施方案中，荧光团附接到探针的第一末端，并且猝灭物附接到探针的第二末端。在一些实施方案中，探针可以包含两个或更多个荧光团。在一些实施方案中，探针可以包含两个或更多个猝灭物部分。在一些实施方案中，探针可以包含一个或更多个猝灭物部分和/或一个或更多个荧光团。猝灭物部分或荧光团可以附接到探针的任何部分(例如，在探针的5'末端、在3'末端和/或在探针的中间)。任何探针核苷酸都可以包含荧光团或猝灭物部分，诸如，例如BHQ1dT。附接可以包括共价键合，并且可以任选地包括位于探针和荧光团或猝灭物之间的至少一个接头分子。在一些实施方案中，荧光团附接到探针的5'末端，并且猝灭物附接到探针的3'末端。在一些实施方案中，荧光团附接到探针的3'末端，并且猝灭物附接到探针的5'末端。可以在定量性核酸扩增中使用的探针的实例包括分子信标、SCORPIONTM探针(Sigma)、TAQMANTM探针(Life Technologies)等。在本文公开的实施方案中有用的其他核酸检测技术包括但不限于纳米颗粒探针技术(参见Elghanian等人(1997)Science 277:1078-1081.)和Amplifluor探针技术(参见美国专利第5,866,366号；第6,090,592号；第6,117,635号；和第6,117,986号)。
在一些实施方案中，提供了用于检测霍乱弧菌的组合物。在一些实施方案中，组合物包含：能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:1-8的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:1-8的序列中的任一个显示至少约85％同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些值中任何两个之间的数字或范围)的序列；能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:12-19的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:12-19的序列中的任一个显示至少约85％同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些值中任何两个之间的数字或范围)的序列；能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:24-33的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:24-33的序列中的任一个显示至少约85％同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些值中任何两个之间的数字或范围)的序列；以及能够与霍乱弧菌的ctxA(霍乱毒素)基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:39-48的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:39-48的序列中的任一个显示至少约85％同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些值中任何两个之间的数字或范围)的序列。组合物可以包含：能够与大肠杆菌的yaiO基因杂交的至少一对对照引物，其中所述至少一对对照引物中的每种引物包含SEQ ID NO:53-62的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:53-62的序列中的任一个显示至少约85％同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些值中任何两个之间的数字或范围)的序列。
在一些实施方案中，能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交的至少一对引物包含含有SEQ ID NO:1、3、5或7的序列的引物和含有SEQ ID NO:2、4、6或8的序列的引物；能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交的至少一对引物包含含有SEQ ID NO:12、14、16或18的序列的引物和含有SEQ ID NO:13、15、17或19的序列的引物；能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交的至少一对引物包含含有SEQ ID NO:24、26、28、30或32的序列的引物和含有SEQ ID NO:25、27、29、31或33的序列的引物；并且能够与霍乱弧菌的ctxA基因杂交的至少一对引物包含含有SEQ ID NO:39、41、43、45或47的序列的引物和含有SEQ ID NO:40、42、44、46或48的序列的引物。在一些实施方案中，能够与大肠杆菌的yaiO基因杂交的至少一对对照引物包含含有SEQID NO:53、55、57、59或61的序列的引物和含有SEQ ID NO:54、56、58、60或62的序列的引物。
组合物可以包含：多于一种寡核苷酸探针，其中多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列显示至少约85％同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些值中任何两个之间的数字或范围)的序列。多于一种寡核苷酸探针中的每一种可以包含选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列。多于一种寡核苷酸探针中的每一种可以由选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列组成。多于一种探针中的至少一种包含荧光发射物部分和荧光猝灭物部分。
本文描述的任何探针可以包含荧光发射物部分、荧光猝灭物部分或两者。
如本文公开的，反应混合物可以包含一种或更多种本文公开的引物、一种或更多种本文公开的探针(例如，包含荧光团的探针)或其任何组合。在一些实施方案中，反应混合物包含一种或更多种本文公开的包含引物和/或探针的组合物。反应混合物还可以包含各种另外的组分。反应混合物中的另外组分的实例包括但不限于模板DNA、DNA聚合酶(例如Taq DNA聚合酶)、脱氧核苷酸(dNTP)、缓冲溶液、二价阳离子、单价阳离子钾离子及其任何组合。在一些实施方案中，反应混合物是用于实时PCR的主混合物。
样品
本文公开的方法和组合物适用于在各种各样的样品中检测以下一种或更多种：霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、以及编码霍乱毒素的霍乱弧菌。如本文使用的，“样品”可以指取自一个或更多个被怀疑罹患霍乱的受试者的任何类型的生物来源的材料。样品可以包括例如流体、组织或细胞。样品可以包括直接取自受试者的生物材料，或培养的细胞或组织，或由生物材料产生或衍生的任何级分或产物。样品可以是纯化的、部分纯化的、未纯化的、富集的或扩增的。
样品可以是生物样品，例如临床样品。在一些实施方案中，样品取自生物来源，诸如阴道、尿道、阴茎、肛门、喉咙、子宫颈、发酵液、细胞培养物等。样品可以包括例如来自粪便样品的流体和细胞。生物样品可以(1)按从受试者或来源获得的直接使用或(2)在修改样品的特征的预处理后使用。因此，可以在使用前对测试样品进行预处理，例如，通过破坏细胞或病毒颗粒、从固体材料制备液体、稀释黏性流体、过滤液体、浓缩液体、使干扰组分失活、添加试剂、纯化核酸等。因此，如本文使用的“生物样品”包括从临床或生物样本中提取的核酸(DNA、RNA或总核酸)。样品制备还可以包括使用包含用于制备用于分析的样品的缓冲液、盐、去污剂和/或类似物的溶液。在一些实施方案中，在分子测试之前处理样品。在一些实施方案中，直接分析样品，并且在测试之前不进行预处理。样品可以是例如粪便样品。在一些实施方案中，样品是来自具有霍乱临床症状的患者的粪便样品。
粪便样品经常感染多于一种生物体。所公开的引物和探针对粪便样品的混合感染是耐受的。
在一些实施方案中，在进行本文公开的方法之前处理待测试的样品。例如，在一些实施方案中，在进行本文公开的方法之前，样品可以被分离、浓缩或经历各种其他处理步骤。例如，在一些实施方案中，如本文公开的，在使样品与寡核苷酸接触之前，可以对样品进行处理以从样品中分离核酸。在一些实施方案中，在不对样品进行体外培养的情况下对样品进行本文公开的方法。在一些实施方案中，对样品进行本文公开的方法而不在使样品与本文公开的寡核苷酸接触之前，从样品中分离核酸。
样品可以包含一种或更多种核酸(例如，多于一种核酸)。如本文使用的术语“多于一种”可以指两种或更多种。因此，在一些实施方案中，样品包含两种或更多种(例如，3种或更多种、5种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、500种或更多种、1,000种或更多种或5,000种或更多种)核酸(例如，gDNA、mRNA)。公开的方法可用作检测存在于样品(例如，核酸诸如gDNA的复杂混合物)中靶核酸(例如，霍乱弧菌的ompW基因)的非常灵敏的方法。在一些实施方案中，样品包含序列彼此不同的5种或更多种核酸(例如，10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种，100种或更多种、500种或更多种、1,000种或更多种、或5,000种或更多种核酸)。在一些实施方案中，样品包含10种或更多种、20种或更多种、50种或更多种、100种或更多种、500种或更多种、103种或更多种、5x 103种或更多种、104种或更多种、5x 104种或更多种、105种或更多种、5x 105种或更多种、106种或更多种、5x 106种或更多种、或者107种或更多种核酸。
在一些实施方案中，样品包含10种至20种、20种至50种、50种至100种、100种至500种、500种至103种、103种至5x 103种、5x 103种至104种、104种至5x 104种、5x 104种至105种、105种至5x 105种、5x105种至106种、106种至5x 106种、或5x 106种至107种、或超过107种核酸。在一些实施方案中，样品包含5种至107种核酸(例如，序列彼此不同)(例如，5种至106种、5种至105种、5种至50,000种、5种至30,000种、10种至106种、10种至105种、10种至50,000种、10种至30,000种、20种至106种、20种至105种、20种至50,000种或20种至30,000种核酸，或这些值中任何两个之间的数字或范围)。在一些实施方案中，样品包含序列彼此不同的20种或更多种核酸。
如本文使用的术语“样品”可以意指包含核酸的任何样品(例如，为了确定靶核酸是否存在于核酸群体中)。样品可以源自任何来源，例如，样品可以是纯化核酸的合成组合；样品可以是细胞裂解物、富集DNA的细胞裂解物或从细胞裂解物中分离和/或纯化的核酸。样品可以来自患者(例如，为了诊断的目的)。样品可以来自透化的细胞。样品可以来自交联的细胞。样品可以是组织切片。样品可以来自通过交联然后通过去脂化和调节以形成均匀折射率制备的组织。
“样品”可以包含靶核酸(例如霍乱弧菌的ompW基因)和多于一种非靶核酸。在一些实施方案中，靶核酸以每10个非靶核酸一个拷贝、每20个非靶核酸一个拷贝、每25个非靶核酸一个拷贝、每50个非靶核酸一个拷贝、每100个非靶核酸一个拷贝、每500个非靶核酸一个拷贝、每103个非靶核酸一个拷贝、每5x 103个非靶核酸一个拷贝、每104个非靶核酸一个拷贝、每5x 104个非靶核酸一个拷贝、每105个非靶核酸一个拷贝、每5x 105个非靶核酸一个拷贝、每106个非靶核酸一个拷贝、每106个非靶核酸少于一个拷贝，或这些值中任何两个之间的数字或范围存在于样品中。在一些实施方案中，靶核酸以每10个非靶核酸1个拷贝至每20个非靶核酸1个拷贝、每20个非靶核酸1个拷贝至每50个非靶核酸1个拷贝、每50个非靶核酸1个拷贝至每100个非靶核酸1个拷贝、每100个非靶核酸1个拷贝至每500个非靶核酸1个拷贝、每500个非靶核酸1个拷贝至每103个非靶核酸1个拷贝、每103个非靶核酸1个拷贝至每5x103个非靶核酸1个拷贝、每5x 103个非靶核酸1个拷贝至每104个非靶核酸1个拷贝、每104个非靶核酸1个拷贝至每105个非靶核酸1个拷贝、每105个非靶核酸1个拷贝至每106个非靶核酸1个拷贝、或每106个非靶核酸1个拷贝至每107个非靶核酸1个拷贝、或这些值中任何两个之间的数字或范围存在于样品中。
合适的样品包括但不限于唾液、血液、血清、血浆、尿液、抽吸物和活检样品。因此，与患者相关的术语“样品”涵盖血液和生物来源的其他液体样品、固体组织样品诸如活检样本或组织培养物或源自其的细胞及其后代。该定义还包括在其获得后以任何方式被操作，诸如通过用试剂处理、洗涤或富集某些细胞群体诸如癌细胞的样品。该定义还包括已经富集特定类型的分子(例如核酸)的样品。术语“样品”涵盖生物样品，诸如临床样品，诸如血液、血浆、血清、抽吸物、脑脊液(CSF)，并且还包括通过手术切除获得的组织、通过活检获得的组织、培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、组织样品、器官、骨髓等。“生物样品”包括从其衍生的生物流体(例如，癌性细胞、感染细胞等)，例如从这样的细胞获得的包含核酸的样品(例如，包含核酸的细胞裂解物或其他细胞提取物)。
用于本文公开的方法的适当的样品包括从生物体或其部分(诸如植物、动物、细菌等)获得的任何常规生物样品。在特定实施方案中，生物样品从动物受试者诸如人类受试者获得。生物样品是从任何活生物体获得、由任何活生物体排泄或分泌的任何固体或流体样品，包括但不限于单细胞生物体，诸如细菌、酵母、原生动物和变形虫等，多细胞生物体(诸如植物或动物，包括来自健康或看上去健康的人类受试者或受待诊断或研究的状况或疾病影响的人类患者的样品，待诊断或研究的状况或疾病诸如病原微生物诸如病原细菌或病毒的感染)。例如，生物样品可以是从以下获得的生物流体：例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰、黏液、淋巴液、滑液、胆汁、腹水、胸腔积液、血清肿、唾液、脑脊液、房水或玻璃体液、或任何身体分泌物、漏出液、渗出物(例如，从脓肿或任何其他感染或炎症部位获得的流体)或从关节(例如，正常关节，或受疾病诸如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风或脓毒性关节炎影响的关节)获得的流体，或皮肤或黏膜表面的拭子。
样品也可以是从任何器官或组织(包括活检或尸检样本，诸如肿瘤活检)获得的样品，或者可以包括细胞(无论是原代细胞还是培养细胞)或由任何细胞、组织或器官调节的培养基。示例性样品包括但不限于细胞、细胞裂解物、血液涂片、细胞离心制品、细胞学涂片、体液(例如，血液、血浆、血清、唾液、痰、尿液、支气管肺泡灌洗液、精液等)、组织活检(例如，肿瘤活检)、细针抽吸物和/或组织切片(例如，恒冷箱组织切片和/或石蜡包埋组织切片)。在其他实例中，样品包括循环肿瘤细胞(其可通过细胞表面标志物鉴定)。在特定实例中，样品被直接使用(例如，新鲜的或冷冻的)，或者可以在使用之前进行操作，例如，通过固定(例如，使用福尔马林)和/或包埋在蜡中(诸如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品)。将理解，可以利用从受试者获得组织的任何方法，并且对所用方法的选择将取决于多种因素，诸如组织的类型、受试者的年龄或从业人员可用的程序。用于获取这样的样品的标准技术是本领域可用的。
在其他实施方案中，样品可以是环境样品，诸如水、土壤或表面，诸如工业或医疗表面。
由于本文公开的实施方案的增加的灵敏度，在某些实例实施方案中，可以对粗样品或未从样品中进一步分级或纯化待检测靶分子的样品运行测定和方法。
样品提取
在典型的样品提取中，如美国专利第7,494,771号中描述的，通过用玻璃珠的机械剪切来裂解细胞，以裂解靶生物体，该专利通过引用以其整体并入本文。如WO 03/008636中所公开的，这样的通用的细胞裂解方法对于各种各样的靶生物和样本基质是高效的。还有其他一些不太普遍的裂解方法，它们是针对某一生物体物种或一组生物体专门设计的，或者它们利用特定的酶活性或化学活性。例如，ACP酶通常用于裂解革兰氏阳性生物体(Ezaki等人,J.Clin.Microbiol.,16(5):844-846(1982)；Paule等人,J.Mol.Diagn.,6(3):191-196(2004)；美国专利第3,649,454号；全部通过引用以其整体并入本文)和分枝杆菌(美国专利第5,185,242号，通过引用以其整体并入)，但一般认为，对裂解革兰氏阴性物种(诸如大肠杆菌和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(美国专利第3,649,454号，通过引用以其整体并入)的效果较差。
核酸测试
本文描述的方法可包括例如核酸测试。例如，测试可以包括测试样品中的靶核酸序列。在本文公开的实施方案中可以使用各种形式的核酸测试，包括但不限于涉及核酸扩增的测试。靶核酸(例如gDNA、mRNA)可以是单链的或双链的。靶核酸的来源可以是任何来源(例如，任何样品)。在一些实施方案中，靶核酸是细菌核酸(例如，细菌的基因组DNA(gDNA)或mRNA)。因此，本文提供的组合物和方法可以被用于检测核酸群体中(例如样品中)细菌核酸的存在。
本文提供了用于检测样品中的靶核酸(例如，霍乱弧菌的ompW基因)的组合物和方法，其可以以高灵敏度检测所述靶核酸。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法可用于检测存在于包含多于一种核酸的样品(包含靶核酸和多于一种非靶核酸)中的靶核酸，其中靶核酸以每107个非靶核酸一个或更多个拷贝(例如，每106个非靶核酸一个或更多个拷贝、每105个非靶核酸一个或更多个拷贝、每104个非靶核酸一个或更多个拷贝、每103个非靶核酸一个或更多个拷贝、每102个非靶核酸一个或更多个拷贝、每50个非靶核酸一个或更多个拷贝、每20个非靶核酸一个或更多个拷贝、每10个非靶核酸一个或更多个拷贝、或每5个非靶核酸一个或更多个拷贝)存在。在一些实施方案中，所公开的方法可用于检测存在于包含多于一种核酸的样品(包含靶核酸和多于一种非靶核酸)中的靶核酸，其中靶核酸以每1018个非靶核酸一个或更多个拷贝(例如，每1015个非靶核酸一个或更多个拷贝、每1012个非靶核酸一个或更多个拷贝、每109个非靶核酸一个或更多个拷贝、每106个非靶核酸一个或更多个拷贝、每105个非靶核酸一个或更多个拷贝、每104个非靶核酸一个或更多个拷贝、每103个非靶核酸一个或更多个拷贝、每102个非靶核酸一个或更多个拷贝、每50个非靶核酸一个或更多个拷贝、每20个非靶核酸一个或更多个拷贝、每10个非靶核酸一个或更多个拷贝、或每5个非靶核酸一个或更多个拷贝)存在。
在一些实施方案中，对于所公开的检测样品中靶核酸(例如，霍乱弧菌的ompW基因)的方法，检测阈值是10nM或更小。如本文使用的术语“检测阈值”可以描述为了检测发生而必须存在于样品中的靶核酸的最小量。因此，作为说明性实例，当检测阈值为10nM时，则可以在靶核酸以10nM或更高的浓度存在于样品中时，检测到信号。在一些实施方案中，检测阈值(用于在所公开的方法中检测靶核酸的检测阈值)，在从500fM至1nM(例如，从500fM至500pM、从500fM至200pM、从500fM至100pM、从500fM至10pM、从500fM至1pM、从800fM至1nM、从800fM至500pM、从800fM至200pM、从800fM至100pM、从800fM至10pM、从800fM至1pM、从1pM至1nM、从1pM至500pM、从1pM至200pM、从1pM至100pM、或从1pM至10pM，或者这些值中的任何两个之间的数字或范围)的范围内(其中浓度是指可以检测到靶核酸的靶核酸的阈值浓度)。在一些实施方案中，所公开的方法具有从800fM至100pM范围内的检测阈值。在一些实施方案中，所公开的方法具有从1pM至10pM范围内的检测阈值。在一些实施方案中，所公开的方法具有从10fM至500fM(例如，从10fM至50fM、从50fM至100fM、从100fM至250fM、或从250fM至500fM，或者这些值中的任何两个之间的数字或范围)的范围内的检测阈值。
在一些实施方案中，可以在样品中检测到靶核酸(例如霍乱弧菌的ompW基因)的最低浓度在从500fM至1nM(例如，从500fM至500pM、从500fM至200pM、从500fM至100pM、从500fM至10pM、从500fM至1pM、从800fM至1nM、从800fM至500pM、从800fM至200pM、从800fM至100pM、从800fM至10pM、从800fM至1pM、从1pM至1nM、从1pM至500pM、从1pM至200pM、从1pM至100pM、或从1pM至10pM，或者这些值中的任何两个之间的数字或范围)的范围内。在一些实施方案中，可以在样品中检测到靶核酸的最低浓度在从800fM至100pM的范围内。在一些实施方案中，可以在样品中检测到靶核酸的最低浓度在从1pM至10pM的范围内。
在一些实施方案中，检测阈值(用于在所公开的方法中检测靶核酸的检测阈值)，在从1aM至1nM(例如，从1aM至500pM、从1aM至200pM、从1aM至100pM、从1aM至10pM、从1aM至1pM、从100aM至1nM、从100aM至500pM、从100aM至200pM、从100aM至100pM、从100aM至10pM、从100aM至1pM、从250aM至1nM、从250aM至500pM、从250aM至200pM、从250aM至100pM、从250aM至10pM、从250aM至1pM、从500aM至1nM、从500aM至500pM、从500aM至200pM、从500aM至100pM、从500aM至10pM、从500aM至1pM、从750aM至1nM、从750aM至500pM、从750aM至200pM、从750aM至100pM、从750aM至10pM、从750aM至1pM、从1fM至1nM、从1fM至500pM、从1fM至200pM、从1fM至100pM、从1fM至10pM、从1fM至1pM、从500fM至500pM、从500fM至200pM、从500fM至100pM、从500fM至10pM、从500fM至1pM、从800fM至1nM、从800fM至500pM、从800fM至200pM、从800fM至100pM、从800fM至10pM、从800fM至1pM、从1pM至1nM、从1pM至500pM、从1pM至200pM、从1pM至100pM、或从1pM至10pM，或者这些值中的任何两个之间的数字或范围)的范围内(其中浓度是指可以检测到靶核酸的靶核酸的阈值浓度)。在一些实施方案中，所公开的方法具有从1aM至800aM范围内的检测阈值。在一些实施方案中，所公开的方法具有从50aM至1pM范围内的检测阈值。在一些实施方案中，所公开的方法具有从50aM至500fM范围内的检测阈值。
在一些实施方案中，可以在样品中检测到靶核酸(例如霍乱弧菌的ompW基因)的最低浓度在1aM至1nM范围内(例如，从1aM至500pM、从1aM至200pM、从1aM至100pM、从1aM至10pM、从1aM至1pM、从100aM至1nM、从100aM至500pM、从100aM至200pM、从100aM至100pM、从100aM至10pM、从100aM至1pM、从250aM至1nM、从250aM至500pM、从250aM至200pM、从250aM至100pM、从250aM至10pM、从250aM至1pM、从500aM至1nM、从500aM至500pM、从500aM至200pM、从500aM至100pM、从500aM至10pM、从500aM至1pM、从750aM至1nM、从750aM至500pM、从750aM至200pM、从750aM至100pM、从750aM至10pM、从750aM至1pM、从1fM至1nM、从1fM至500pM、从1fM至200pM、从1fM至100pM、从1fM至10pM、从1fM至1pM、从500fM至500pM、从500fM至200pM、从500fM至100pM、从500fM至10pM、从500fM至1pM、从800fM至1nM、从800fM至500pM、从800fM至200pM、从800fM至100pM、从800fM至10pM、从800fM至1pM、从1pM至1nM、从1pM至500pM、从1pM至200pM、从1pM至100pM、或从1pM至10pM，或者这些值中的任何两个之间的数字或范围)。在一些实施方案中，可以在样品中检测到靶核酸的最低浓度在从1aM至500pM的范围内。在一些实施方案中，可以在样品中检测到靶核酸的最低浓度在从100aM至500pM的范围内。在一些实施方案中，本文提供的组合物或方法显示阿托摩尔(aM)的检测灵敏度。在一些实施方案中，主题组合物或方法显示飞摩尔(fM)的检测灵敏度。在一些实施方案中，主题组合物或方法显示皮摩尔(pM)的检测灵敏度。在一些实施方案中，主题组合物或方法显示纳摩尔(nM)的检测灵敏度。
如本文使用的，核酸扩增可以指使用序列特异性方法获得靶核酸序列或其互补物或其片段的多于一个拷贝的任何已知程序。已知扩增方法的实例包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)(例如，多重置换扩增(MDA))、复制酶介导的扩增、免疫扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自主序列复制(3SR)、滚环扩增和转录介导的扩增(TMA)。参见例如Mullis,“Process forAmplifying,Detecting,and/or Cloning Nucleic Acid Sequences”，美国专利第4,683,195号；Walker,“Strand Displacement Amplification”，美国专利第5,455,166号；Dean等人,“Multiple displacement amplification”，美国专利第6,977,148号；Notomi等人,“Process for Synthesizing Nucleic Acid”，美国专利第6,410,278号；Landegren等人,美国专利第4,988,617号“Method of detecting a nucleotide change in nucleicacids”；Birkenmeyer,“Amplification of Target Nucleic Acids Using Gap FillingLigase Chain Reaction”，美国专利第5,427,930号；Cashman,“Blocked-PolymerasePolynucleotide Immunoassay Method and Kit”，美国专利第5,849,478号；Kacian等人,“Nucleic Acid Sequence Amplification Methods”，美国专利第5,399,491号；Malek等人,“Enhanced Nucleic Acid Amplification Process”，美国专利第5,130,238号；Lizardi等人,BioTechnology,6:1197(1988)；Lizardi等人,美国专利第5,854,033号“Rolling circle replication reporter systems”。在一些实施方案中，可以例如顺序进行上述核酸扩增方法中的两种或更多种。
例如，LCR扩增使用至少四种单独的寡核苷酸通过使用杂交、连接和变性的多于一个循环来扩增靶及其互补链(EP专利第0 320 308号)。SDA通过使用包含限制性核酸内切酶识别位点的引物进行扩增，限制性核酸内切酶使包含靶序列的半修饰(hemimodified)的DNA双链体的一条链产生切口，然后在一系列引物延伸和链置换步骤中进行扩增(Walker等人的美国专利第5,422,252号)。
PCR是本领域中熟知的用于核酸扩增的方法。PCR涉及使用两种或更多种位于靶序列侧翼的可延伸的序列特异性寡核苷酸引物来扩增靶序列。在存在引物、热稳定的DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)和各种dNTP的情况下，使包含感兴趣的靶序列的核酸经历多轮热循环(变性、退火和延伸)程序，导致靶序列的扩增。PCR使用多轮引物延伸反应，其中DNA分子限定区域的互补链由热稳定的DNA聚合酶同时合成。在每个循环结束时，每个新合成的DNA分子充当下一个循环的模板。在这些反应的重复轮次期间，新合成的DNA链的数目指数地增加，使得在20个到30个反应循环后，初始模板DNA将被复制几千倍或几百万倍。进行不同类型和模式PCR的方法在文献中详细描述，例如在“PCR Primer:A Laboratory Manual”Dieffenbach和Dveksler编著,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995中，和由Mullis等人在专利(例如，美国专利第4,683,195号、第4,683,202号和第4,800,159号)和科学出版物(例如，Mullis等人,1987,Methods in Enzymology,155:335-350)中，其中每个参考文献的内容特此通过引用以其整体并入。
PCR可以产生适于扩增后处理的双链扩增产物。如果期望，可以通过琼脂糖凝胶电泳可视化、通过使用基于探针的比色检测的酶免疫测定格式、通过荧光发射技术或通过本领域技术人员已知的其他检测手段来检测扩增产物。
各种各样的PCR方法已在许多来源中描述，例如，Ausubel等人(编著),CurrentProtocols in Molecular Biology,第15章,John Wiley&Sons,Inc.,New York(1994)。PCR方法的实例包括但不限于实时PCR、终点PCR、扩增片段长度多态性PCR(AFLP-PCR)、Alu-PCR、不对称PCR、集落PCR、DD-PCR、简并PCR、热启动PCR、原位PCR、反向PCR、长PCR(Long-PCR)、多重PCR、巢式PCR、PCR-ELISA、PCR-RFLP、PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)、定量竞争PCR(QC-PCR)、cDNA末端快速扩增PCR(RACE-PCR)、多态性DNA随机扩增PCR(RAPD-PCR)、实时PCR、重复基因外回文PCR(Rep-PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、TAIL-PCR、降落PCR(touchdownPCR)和Vectorette PCR。
实时PCR又称实时定量聚合酶链式反应(QRT-PCR)，可用于同时定量和扩增给定核酸分子的特定部分。它可以用于确定样品中是否存在特定的序列；并且如果其存在，则确定存在的序列的拷贝数。术语“实时”可以指在PCR期间的周期性监测。某些系统，诸如ABI7700和7900HT序列检测系统(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)在每个热循环期间，在预先确定的或用户定义的点进行监测。具有荧光共振能量转移(FRET)探针的实时PCR分析测量循环到循环(cycle-to-cycle)的荧光染料信号变化，优选地减去任何内部对照信号。实时程序按照PCR的一般模式，但核酸在每轮扩增后被定量。定量方法的两个实例是使用嵌入双链DNA的荧光染料(例如SYBRGreen)和当与互补DNA杂交时发荧光的修饰的DNA寡核苷酸探针。嵌入剂在未结合时具有相对低的荧光，并且在与双链核酸结合时具有相对高的荧光。因此，嵌入剂可用于在核酸扩增反应期间监测双链核酸的积累。可用于本文公开的实施方案的这样的非特异性染料的实例包括嵌入剂，诸如SYBR Green I(MolecularProbes)、碘化丙锭、溴化乙锭等。
粪便样品经常感染多于一种生物体。所公开的引物和探针对粪便的混合感染是耐受的。由于特异性靶序列、引物和探针，本文公开的方法和组合物可用于以高灵敏度、特异性和准确性检测样品中的以下一种或更多种的存在/不存在或水平：霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、以及编码霍乱毒素的霍乱弧菌。
本文公开的引物可以与另外的PCR系统配对，使用一致的化学和热PCR谱(profile)来提供用于检测以下一种或更多种的一组测定：霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、以及编码霍乱毒素的霍乱弧菌，以改善整体测定灵敏度和稳健性。
在一些实施方案中，进行多重PCR以扩增和检测(例如通过直接或间接方式)以下一种或更多种的存在或不存在：霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、以及编码霍乱毒素的霍乱弧菌，以允许使用一种测试来诊断霍乱。在多重PCR中，霍乱弧菌的存在或不存在可以通过扩增和检测ompW基因的存在或不存在来确定；霍乱弧菌血清组O1的存在或不存在可以通过扩增和检测rfbN基因的存在或不存在来确定；霍乱弧菌血清组O139的存在或不存在可以通过扩增和检测wbfR基因的存在或不存在来确定；并且编码霍乱毒素的霍乱弧菌的存在或不存在可以通过扩增和检测ctxA(霍乱毒素)基因的存在或不存在来确定。
因此，用于检测和/或鉴定样品中的霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、以及编码霍乱毒素的霍乱弧菌的一些实施方案包括以下步骤：提供测试样品；以及在标准核酸扩增条件和/或严格杂交条件下使样品与能够特异性杂交并扩增以下的寡核苷酸引物接触：(1)霍乱弧菌的ompW基因、(2)霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因、(3)霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因、以及(4)霍乱弧菌的ctxA(霍乱毒素)基因，和与能够特异性地与以下杂交的寡核苷酸探针接触：(1)霍乱弧菌的ompW基因、(2)霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因、(3)霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因、以及(4)霍乱弧菌的ctxA(霍乱毒素)基因。如本文描述的，样品可以一次与所有的引物和探针接触，或者可以首先与一些引物和探针接触，并且随后与剩余的引物和探针接触。
寡核苷酸探针的长度可以例如在约10个和约45个核苷酸之间，并包含可检测部分(例如，信号部分、可检测标记)。在一些实施方案中，如果样品中存在靶生物体，则在允许引物与对应的靶向的基因区域特异性杂交的条件下进行接触。可以确定与对应的靶向的基因区域(如果被测试的样品中存在的话)特异性结合的探针的存在和/或量，其中结合的探针指示样品中对应的靶生物体的存在。在一些实施方案中，结合的探针的量用于确定样品中对应的靶生物体的量。
在接触步骤之后，确定步骤可以使用本领域技术人员已知的任何方法，包括但不限于，原位杂交来实现。杂交双链体(即与靶向的基因区域特异性结合的探针)的检测可以通过许多方法进行。通常，将杂交双链体与未杂交核酸分离，并且然后检测与双链体结合的标记。这样的标记是指本领域标准使用的放射性的、荧光的、生物的或酶的标签或标记。标记可以与寡核苷酸探针或源自生物样品的核酸缀合。本领域技术人员将理解，洗涤步骤可用于洗去过量的样品/靶核酸或寡核苷酸探针(以及在适用的情况下未结合的缀合物)。此外，标准异质性测定格式适于使用寡核苷酸引物和探针上存在的标记来检测杂交体。确定一种或更多种扩增子的存在或量可以包括使所述扩增子与多于一种寡核苷酸探针接触。多于一种寡核苷酸探针中的至少一种包含荧光发射物部分和荧光猝灭物部分。在一些实施方案中，确定一种或更多种扩增子的存在或量包括测量可检测信号，诸如例如，来自探针的可检测信号。
在一些实施方案中，确定一种或更多种扩增子的存在或量包括测量可检测信号，诸如例如，来自探针的可检测信号(例如，在探针被PCR聚合酶(例如，Taq)的5'-3'核酸外切酶活性裂解之后)。确定一种或更多种扩增子的存在或量可以包括测量可检测信号，诸如例如，来自探针的可检测信号。在一些实施方案中，例如，在检测到的信号的量可以用于确定样品中存在的靶核酸(例如，霍乱弧菌的ompW基因)的量的意义上，测量可以是定量的。在一些实施方案中，例如，在可检测信号的存在或不存在可以指示靶向的DNA(例如，病毒、SNP等)的存在或不存在的意义上，测量可以是定性的。在一些实施方案中，除非靶向的一种或更多种DNA(例如，病毒、SNP等)高于特定阈值浓度存在，否则将不存在可检测信号(例如，高于给定阈值水平)。在一些实施方案中，所公开的方法可用于确定样品(例如，包含靶核酸和多于一种非靶核酸的样品)中靶核酸(例如，霍乱弧菌的ompW基因)的量。确定样品中靶核酸的量可以包括将从测试样品产生的可检测信号的量与从参考样品产生的可检测信号的量进行比较。确定样品中靶核酸的量可以包括：测量可检测信号以产生测试测量结果；测量由参考样品产生的可检测信号以产生参考测量结果；以及将测试测量结果与参考测量结果进行比较，以确定样品中存在的靶核酸的量。确定样品中靶核酸的量可用于得出样品中包含所述靶核酸的生物体的存在和/或量。
在一些实施方案中，测量的可检测信号由探针的荧光发射染料对产生。例如，在一些实施方案中，所公开的方法包括使扩增子与包含荧光共振能量转移(FRET)对或猝灭物/荧光物对(quencher/fluor pair)或二者的探针接触。在一些实施方案中，所公开的方法包括使扩增子与包含FRET对的探针接触。在一些实施方案中，所公开的方法包括使扩增子与包含荧光物/猝灭物对的探针接触。
荧光发射染料对包括FRET对或猝灭物/荧光物对。在FRET对和猝灭物/荧光物对这两种实施方案中，所述对中的染料中的一个的发射光谱与该对中另一个染料的吸收光谱的区域重叠。如本文使用的，术语“荧光发射染料对”是用于涵盖“荧光共振能量转移(FRET)对”和“猝灭物/荧光物对”二者的通用术语，这两个术语将在下文更详细地讨论。术语“荧光发射染料对”可与措辞“FRET对和/或猝灭物/荧光物对”互换使用。
在一些实施方案中(例如，当探针包含FRET对时)，探针在被裂解之前产生一定量的可检测信号，并且当探针被裂解时，被测量的可检测信号的量减少。在一些实施方案中，探针在被裂解之前产生第一可检测信号(例如，来自FRET对)，并且当探针被裂解时产生第二可检测信号(例如，来自猝灭物/荧光物对)。因此，在一些实施方案中，探针包含FRET对和猝灭物/荧光物对。
在一些实施方案中，探针包含FRET对。FRET是通过其发生从激发态荧光团到紧密接近的第二发色团的无辐射能量转移过程。能量转移可以发生的范围被限制在大约10纳米(100埃)，并且转移效率对荧光团之间的分离距离极端敏感。因此，如本文使用的，术语“FRET”(“荧光共振能量转移”；也称为“福斯特共振能量转移”)可以指这样的物理现象，其涉及供体荧光团和匹配的受体荧光团，它们被选择为使得供体的发射光谱与受体的激发光谱重叠，并且还被选择为使得当供体和受体彼此紧密接近(通常10nm或更小)时，供体的激发将引起受体的激发和发射，因为一些能量通过量子耦合效应从供体传递到受体。因此，FRET信号用作供体和受体接近的量器(gauge)；只有当它们彼此紧密接近时，才产生信号。FRET供体部分(例如，供体荧光团)和FRET受体部分(例如，受体荧光团)在本文中统称为“FRET对”。
供体-受体对(FRET供体部分和FRET受体部分)在本文中称为“FRET对”或“信号FRET对”。因此，在一些实施方案中，当一个信号配偶体是FRET供体部分并且另一个信号配偶体是FRET受体部分时，探针包含两个信号配偶体(信号对)。因此，当信号配偶体紧密接近时(例如，同时在同一RNA分子上)，包含这样的FRET对(FRET供体部分和FRET受体部分)的探针将显示可检测的信号(FRET信号)，但当配偶体分离时(例如，在探针被PCR聚合酶(例如，Taq)的5'-3'核酸外切酶活性裂解后)，信号将减少(或不存在)。FRET供体部分和受体部分(FRET对)对本领域普通技术人员将是已知的，并且可以使用任何方便的FRET对(例如，任何方便的供体和受体部分对)。
在一些实施方案中，信号猝灭对中的一个信号配偶体产生可检测信号，并且另一个信号配偶体是猝灭第一信号配偶体的可检测信号的猝灭物部分(例如，猝灭物部分猝灭信号部分的信号，使得当信号配偶体彼此接近时，例如当信号对的信号配偶体紧密接近时，来自信号部分的信号减少(猝灭))。
例如，在一些实施方案中，当探针被裂解时，可检测信号的量增加。例如，在一些实施方案中，例如，当两个信号配偶体在被PCR聚合酶(例如，Taq)的5'-3'核酸外切酶活性裂解之前存在于同一ssDNA分子上时，由一个信号配偶体(信号部分、荧光发射物部分)显示的信号被另一个信号配偶体(猝灭物信号部分、荧光猝灭物部分)猝灭。这样的信号对在本文中称为“猝灭物/荧光物对”、“猝灭对”或“信号猝灭对”。例如，在一些实施方案中，一个信号配偶体(例如，第一信号配偶体)是产生被第二信号配偶体(例如，猝灭物部分)猝灭的可检测信号的信号部分。因此，这样的猝灭物/荧光物对的信号配偶体在配偶体分离时(例如，在探针被PCR聚合酶(例如，Taq)的5'-3'外切酶活性裂解之后)将产生可检测的信号，但是当配偶体紧密接近时(例如，在探针被PCR聚合酶(例如，Taq)的5'-3'核酸外切酶活性裂解之前)，信号将被猝灭。
猝灭物部分可以将来自信号部分的信号(例如，在探针被PCR聚合酶(例如，Taq)的5'-3'核酸外切酶活性裂解之前)猝灭到不同程度。在一些实施方案中，猝灭物部分猝灭来自信号部分的信号，其中在存在猝灭物部分的情况下(当信号配偶体彼此接近时)检测到的信号是在不存在猝灭物部分的情况下(当信号配偶体分开时)检测到的信号的95％或更少。例如，在一些实施方案中，在存在猝灭物部分的情况下检测到的信号可以是在不存在猝灭物部分的情况下检测到的信号的90％或更少、80％或更少、70％或更少、60％或更少、50％或更少、40％或更少、30％或更少、20％或更少、15％或更少、10％或更少或5％或更少。在一些实施方案中，在存在猝灭物部分的情况下没有检测到信号(例如，高于背景的信号)。
在一些实施方案中，在不存在猝灭物部分的情况下(当信号配偶体分离时)检测到的信号是在存在猝灭物部分的情况下(当信号配偶体彼此接近时)检测到的信号的至少1.2倍大(例如，至少1.3倍、至少1.5倍、至少1.7倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍、至少20倍或至少50倍大，或这些值中的任何两个之间的数字或范围)。
在一些实施方案中，信号部分是荧光标记。在一些这样的实施方案中，猝灭物部分猝灭来自荧光标记的信号(例如，光信号)(例如，通过吸收标记的发射光谱中的能量)。因此，当猝灭物部分与信号部分不接近时，由于信号不被猝灭物部分吸收，所以可以检测到来自荧光标记的发射(信号)。可以使用任何方便的供体受体对(信号部分/猝灭物部分对)，并且许多合适的对是本领域已知的。
在一些实施方案中，猝灭物部分从信号部分(在本文中也称为“可检测标记”或“可检测部分”)吸收能量，并且然后发射信号(例如，不同波长的光)。因此，在一些实施方案中，猝灭物部分自身是信号部分(例如，信号部分可以是6-羧基荧光素，而猝灭物部分可以是6-羧基-四甲基罗丹明)，并且在一些这样的实施方案中，该对也可以是FRET对。在一些实施方案中，猝灭物部分是暗猝灭物。暗猝灭物可以吸收激发能量，并以不同的方式(例如，作为热量)耗散能量。因此，暗猝灭物自身的荧光很少至没有(不发射荧光)。
在一些实施方案中，探针的裂解可以通过测量比色读出来检测。例如，荧光团的释放(例如，从FRET对释放、从猝灭物/荧光物对释放等)可导致可检测信号的波长偏移(以及因此的颜色位移)。因此，在一些实施方案中，探针的裂解可以通过颜色位移来检测。这样的位移可以表示为一种颜色(波长)的信号量的损失、另一种颜色的量的增益、一种颜色对另一种颜色的比的变化等。
本文公开的包括用于能够同时检测5个基因靶的多重实时PCR的方法和组合物，其能够在单次反应完成霍乱弧菌的检测、血清分型和霍乱毒素检测的全部检测。在一些实施方案中，提供了检测样品中霍乱弧菌的方法。在一些实施方案中，该方法包括：使所述样品与多于一对引物接触，其中多于一对引物包含：能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:1-8的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:1-8的序列中的任一个显示至少约85％同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些值中任何两个之间的数字或范围)的序列；能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:12-19的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:12-19的序列中的任一个显示至少约85％同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些值中任何两个之间的数字或范围)的序列；能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:24-33的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:24-33的序列中的任一个显示至少约85％同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些值中任何两个之间的数字或范围)的序列；以及能够与霍乱弧菌的ctxA(霍乱毒素)基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:39-48的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:39-48的序列中的任一个显示至少约85％同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些值中任何两个之间的数字或范围)的序列。方法可以包括：如果所述样品包含霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139和编码霍乱毒素的霍乱弧菌中的一种或更多种，则产生ompW基因序列的扩增子、rfbN基因序列的扩增子、wbfR基因序列的扩增子、ctxA基因序列的扩增子或其任何组合。方法可以包括：确定一种或更多种扩增子的存在或量，作为所述样品中霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139和编码霍乱毒素的霍乱弧菌中的一种或更多种的存在的指示。方法可以包括：使样品与能够与大肠杆菌(E.coli)的yaiO基因杂交的至少一对对照引物接触，其中所述至少一对对照引物中的每种引物包含SEQ ID NO:53-62的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:53-62的序列中的任一个显示至少约85％同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些值中任何两个之间的数字或范围)的序列，并且如果所述样品包含大肠杆菌，则从所述样品产生大肠杆菌的yaiO基因序列的扩增子；以及确定大肠杆菌的yaiO基因序列的扩增子的存在或量，作为所述样品中大肠杆菌的存在的指示。在一些实施方案中，样品与包含多于一对引物和能够与大肠杆菌的yaiO基因杂交的至少一对对照引物的组合物接触。
样品可以是生物样品或环境样品。环境样品可以从以下获得：食品样品、饮料样品、纸张表面、织物表面、金属表面、木材表面、塑料表面、土壤样品、淡水样品、废水样品、盐水样品、暴露于环境空气或其他气体的样品、其培养物或其任何组合。生物样品可以从以下获得：组织样品、唾液、血液、血浆、血清、粪便、尿液、痰、黏液、淋巴、滑液、脑脊液、腹水、胸腔积液、血清肿、脓、皮肤或黏膜表面的拭子、其培养物或其任何组合。在一些实施方案中，生物样品包括粪便样品或来源于粪便样品。
多于一对引物可以包含含有SEQ ID NO:1、3、5或7的序列的第一引物，含有SEQ IDNO:2、4、6或8的序列的第二引物，含有SEQ ID NO:12、14、16或18的序列的第三引物，含有SEQ ID NO:13、15、17或19的序列的第四引物，含有SEQ ID NO:24、26、28、30或32的序列的第五引物，含有SEQ ID NO:25、27、29、31或33的序列的第六引物，含有SEQ ID NO:39、41、43、45或47的序列的第七引物，以及含有SEQ ID NO:40、42、44、46或48的序列的第八引物。多于一对引物可以包含含有SEQ ID NO:53、55、57、59或61的序列的第九引物，和含有SEQID NO:54、56、58、60或62的序列的第十引物。
在一些实施方案中，能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交的该对引物为SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO:3和4、SEQ ID NO:5和6、或SEQ ID NO:7和8；能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交的该对引物为SEQ ID NO:12和13、SEQ ID NO:14和15、SEQ ID NO:16和17、或SEQ ID NO:18和19；能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交的该对引物为SEQ ID NO:24和25、SEQ ID NO:26和27、SEQ ID NO:28和29、SEQ ID NO:30和31、或SEQ ID NO:32和33；并且能够与霍乱弧菌的ctxA基因杂交的该对引物为SEQ ID NO:39和40、SEQ ID NO:41和42、SEQ ID NO:43和44、SEQ ID NO:45和46、或SEQ ID NO:47和48。在一些实施方案中，能够与大肠杆菌的yaiO基因杂交的该对对照引物为SEQ ID NO:53和54、SEQ ID NO:55和56、SEQID NO:57和58、SEQ ID NO:59和60、或SEQ ID NO:61和62。
在一些实施方案中，所述扩增使用选自由以下组成的组的方法进行：聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、复制酶介导的扩增、免疫扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自主序列复制(3SR)、滚环扩增和转录介导的扩增(TMA)。PCR可以是实时PCR。PCR可以是定量实时PCR(QRT-PCR)。每种引物可以包含外源核苷酸序列。
在一些实施方案中，确定一种或更多种扩增子的存在或量包括使扩增子与多于一种寡核苷酸探针接触，其中多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列显示至少约85％同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或这些值中任何两个之间的数字或范围)的序列。多于一种寡核苷酸探针中的每一种可以包含选自由SEQ IDNO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列。多于一种寡核苷酸探针中的每一种可以由选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列组成。每种探针在5'末端和3'末端的侧翼可以为互补序列。在一些实施方案中，互补序列中的一个包含荧光发射物部分，并且另一个互补序列包含荧光猝灭物部分。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针中的至少一种包含荧光发射物部分和荧光猝灭物部分。
如本文描述的，扩增可以通过实时PCR，例如定量实时PCR(QRT-PCR)来进行。适用于本文描述的方法和组合物的引物可以包含外源核苷酸序列，其允许扩增产物的扩增后操作，而对扩增本身没有显著影响。在一些实施方案中，引物和/或探针的侧翼可以是互补序列，其包含5'末端的荧光团和3'末端的荧光猝灭物。
本文公开的任何寡核苷酸探针可以包含荧光发射物部分、荧光猝灭物部分或两者。
本文公开的方法可适于自动化，从而为检测和/或定量样品中的以下一种或更多种提供高通量选项：霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、以及编码霍乱毒素的霍乱弧菌。可以使用各种多重PCR平台，例如BD MAXTM、ViperTM、或ViperTM LT平台进行所公开方法的一个或更多个步骤。方法可以以多重方式进行。例如，在一些实施方案中，核酸扩增和/或检测包括进行多重PCR。
实施例
提供以下实施例以展示其中可以应用本技术的特定情况和设置，并且不意图限制本发明和包含在本公开内容中的权利要求的范围。
实施例1
霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139、以及编码霍乱毒素的霍乱弧 菌的多重检测
本实施例中描述的研究描述了本文提供的组合物和方法在BD MAX全自动系统上的实施实例。本文公开的组合物和方法也可以在其他实时PCR仪器(诸如，例如ABI 7500)上实施。
材料和方法
总共63个细菌菌株用于本文提供的多重PCR引物/探针组合的验证，并且在表4中呈现这些菌株。这些分离株包括霍乱弧菌(n＝22)、副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)(n＝19)、河流弧菌(V.fluvialis)(n＝1)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)(n＝1)、拟态弧菌(V.mimicus)(n＝1)、创伤弧菌(V.vulnificus)(n＝1)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)(n＝1)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)(n＝1)、腹泻性大肠杆菌(n＝8)、沙门氏菌属物种(n＝6)和志贺氏菌属物种(n＝2)。本研究中使用的两个对照菌株是(i)霍乱弧菌N16961：O1；(ii)霍乱弧菌MO45：O139。这些菌株均由中国疾病预防控制中心提供。
表4.用于多重PCR验证的细菌菌株
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本研究采用BD MAXTM ExKTM TNA-2提取试剂盒和5X qPCR Mastermix。
靶向霍乱弧菌多重检测测定(BDM-VC)的基因为ompW、ctxA、rfbN和wbfR，选择大肠杆菌yaiO基因作为内部对照。这些基因序列基于保存在NCBI nr数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)中的可用序列的比对。所有引物和探针都使用Beacon Designer V8.20设计，并且都由Sangon Biotech(中国上海)合成。NCBI BLASTn用于检查计算机(in silico)特异性和灵敏度。
为了从粪便样品中提取DNA，将粪便样品(加标和临床样品)涡旋，并将每个样品的50ul等分试样添加到BD MAX样品缓冲液管中。按照试剂盒说明，使用BD MAX ExK TNA-2提取试剂盒在BD MAX上进行DNA自动提取。
对于多重PCR反应，在每个锥形管中制备12.5ul PCR反应混合物，该混合物包含本文公开的引物/探针组合，工作浓度在表5中指示。样品处理对照(SPC)可以包括大肠杆菌的yaiO基因。
表5.多重PCR混合物
将包含12.5ul混合物的锥形管卡入BD MAX TNA提取条中。最终的PCR反应混合物由BD MAX通过将如以上描述制备的12.5ul纯化的DNA自动添加到以上所述锥形管中并混合来制备。PCR热循环谱如下：95℃变性5min；和95℃变性15s，60℃退火和延伸43s，40个循环。
扩增效率测试
如表6中示出，当用于本文公开的多重PCR方法时，本文提供的引物/探针组合在掺有菌株N16961或MO45的粪便样品中产生了ompW、rfbN、wbfR、和ctxA的极好的扩增效率。
表6.在掺有菌株N16961或MO45的粪便样品中ompW、rfbN、wbfR、和ctxA的多重PCR 扩增效率
分析灵敏度测试
为了估计优化的多重PCR的检测限，将10ul VC菌株N16961和MO45培养物悬浮液与50ul阴性粪便样本一起掺入，并在提取前进行涡旋。在六种不同的细菌浓度测试这些，每次运行5次重复，从McFarland标准2.5开始，进行三次独立运行。使用标准板计数程序进行菌落计数。观察到阈值循环CT值的最高10倍稀释液以一系列三个2倍稀释(1:2、1:4和1:8)进一步稀释，以找到检测到CT值的最低浓度。在12次重复中测试产生CT值的最低浓度，以确定测定的检测限(LoD)，如表7中呈现。使用本文提供的引物/探针组合观察到每个靶的稳健分析灵敏度。
表7.ompW、rfbN、wbfR、和ctxA多重PCR的分析灵敏度
M045 ompW ctxA O139-wbfR
LoD(SBT中CFU/mL) 6.5(91.7％) 6.5(91.7％) 13(83％)
LoD(粪便中CFU/mL) 195(91.7％) 195(91.7％) 390(83％)
N16961 ompW ctxA O1-rfbN
LoD(SBT中CFU/mL) 10.92(91.7％) 10.92(91.7％) 10.92(83％)
LoD(粪便中CFU/mL) 327.5(91.7％) 327.5(91.7％) 327.5(83％)
分析特异性测试
通过测试从阳性和阴性对照分离株组中提取的DNA来测量分析特异性(表4)。该组由63个对照分离株组成，这些分离株要么与靶物种密切相关，要么代表宽范围的通常在腹泻患者的粪便样品中发现并使用培养方法进行鉴定的致病分离株(表4)。该测定正确地检测到所有霍乱弧菌分离株，并且与非靶分离株没有交叉反应(表8)。使用本文提供的引物/探针组合观察到每个靶的稳健分析特异性。
表8.ompW、rfbN、wbfR、和ctxA多重PCR的分析特异性
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术语
在至少一些先前描述的实施方案中，在一种实施方案中使用的一个或更多个要素可以可互换地在另一种实施方案中使用，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其他的省略、添加和修改。所有此类修改和改变都旨在落在由所附权利要求书限定的主题的范围内。
关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，在对于上下文和/或应用适当的情况下，本领域技术人员可以从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见，可以在本文明确阐述各种单数/复数排列。如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确指示。除非另外说明，否则在本文中对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”。
本领域技术人员将理解，通常，本文使用的术语，并且特别是所附权利要求书(例如，所附权利要求书的主体)中的术语，通常旨在作为“开放式”术语(例如，术语“包括/包含(including)”应解释为“包括但不限于(including but not limited to)”，术语“具有(having)”应解释为“具有至少(having at least)”，术语“包括/包含(includes)”应解释为“包括但不限于(includes but is not limited to)”等)。本领域技术人员还将理解，如果意图所介绍的权利要求陈述的特定数字，则这样的意图将明确地陈述于权利要求中，并且在不存在这种陈述的情况下，不存在这种意图。例如，为了帮助理解，所附权利要求书可以包含介绍性措辞“至少一种”和“一种或更多种”的使用，以介绍权利要求陈述。然而，此类措辞的使用不应解读为意味着由不定冠词“一(a)”或“一(an)”介绍权利要求陈述会将任何包含这种介绍的权利要求陈述的特定权利要求限制到包含仅一种这种陈述的实施方案中，甚至当相同的权利要求包括介绍性措辞“一种或更多种”或“至少一种”以及不定冠词诸如“一(a)”或“一(an)”时也是如此(例如，“一(a)”和/或“一(an)”应解释为意指“至少一种”或“一种或更多种”)；这对于使用定冠词来介绍权利要求陈述同样适用。此外，即使明确地陈述了介绍的权利要求陈述的特定数字，本领域技术人员将认识到，这种陈述应解释为意指至少所陈述的数字(例如，仅陈述“两种陈述”而没有其他修饰词意指至少两种陈述或两种或更多种陈述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意图为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有A、B和C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一种”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意图为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有A、B或C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等的系统)。本领域技术人员还将理解，实际上，无论在说明书、权利要求书还是在附图中，呈现两个或更多个替代术语的任何分离性词语和/或措辞应被理解为考虑到包括术语之一、任一术语或两个术语的可能性。例如，措辞“A或B”应被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
此外，当本公开内容的特征或方面以马库什组(Markush group)描述时，本领域技术人员将意识到本公开内容还由此以马库什组的任何个体成员或成员子组描述。
如本领域技术人员将理解的，为了任何和所有目的，诸如在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的该范围的子范围和子范围组合。任何列举的范围可以被容易地认为充分地描述了并且使得相同范围能够被分成至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可以被容易地分成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言文字诸如“至多(up to)”、“至少”、“大于”、“少于”等包括所引述的数字并且指随后可以被分成如以上讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个个体成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，等等。
尽管本文已经公开了各种方面和实施方案，但其他方面和实施方案对本领域技术人员将是明显的。本文公开的各种方面和实施方案用于说明的目的而并不意在限制，并且由所附权利要求书指出的实际范围和精神。
序列表
<110> 贝克顿迪金森公司
张秋凤
付满良
张传慧
<120> 霍乱弧菌的多重检测和分型
<130> 68EB-298735-WO2
<150> PCT/CN2020/126682
<151> 2020-11-05
<160> 67
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 合成寡核苷酸
<400> 1
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 24
ctgacttaac agaactttcc catc 24
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 25
cagcaatgcg gtggtctaac 20
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 26
tgctacgatg gcgtgttca 19
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 27
tccctttcca cctcggtatt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 28
ggcgggttcc cttgttagac 20
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 29
tccctttcca cctcggtatt tcaa 24
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 30
ctctctactc gtccggtcaa a 21
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 31
actcgacatg atccgttcct 20
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 32
cccatcgctg aatggttgag a 21
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 33
ccacaactgc gacgaccaat 20
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 34
aacccgccct tctaatgaac acgccatc 28
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 35
caaatggatc ggcaaactgg cagcaaactc a 31
<210> 36
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 36
cgcattgctg agtttgctgc cagtttgccg atc 33
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 37
cctttacgat cgggtttgac cacgcgg 27
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 38
tcgtttaccc gctaaatgtt cacgccactt ctt 33
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 39
atcatgcaag aggaactcag a 21
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 40
agtgggcact tctcaaact 19
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 41
agcagtcagg tggtcttatg 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 42
atccatcatc gtgcctaaca 20
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 43
tgaccgaggt actcaaatga a 21
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 44
atccatcatc gtgcctaaca a 21
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 45
cagattctag acctcctgat ga 22
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 46
ttgagtacct cggtcaaagt 20
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 47
gcagattcta gacctcctga t 21
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 48
cctcggtcaa agtactcact 20
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 49
aggtggaaac atatccatca tcgtgcc 27
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 50
tcccgtctga gttcctcttg catgatc 27
<210> 51
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 51
ctcactctgt cctcttggca taagaccacc t 31
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 52
tgtcctcttg gcataagacc acctgactgc 30
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 53
cagcgatgca ggtggtagtt 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 54
ggcgtccagt cataggtgta 20
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 55
gggcgtcgtg attatgaaac tg 22
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 56
gggcaaagac cggcgtatta 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 57
cgaacgggta ttgcctttgc 20
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 58
gcatcgactt cgacatcatc gtaa 24
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 59
atgccgggtt aacttcca 18
<210> 60
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 60
cagcgttgcg ttttcaac 18
<210> 61
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 61
cgatgatgtc gaagtcga 18
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 62
gccatagttg cgtataacc 19
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 63
cctgttccgc ggcttagcca tagttgc 27
<210> 64
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 64
acatttcaat gccactcgcg gtcagggt 28
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 65
atacgccggt ctttgcccgc cagga 25
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 66
tcgccaccag ttcagcatac gc 22
<210> 67
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 67
ctggcaaggc ggcgtatcac tctata 26

Claims (50)

1.一种检测样品中霍乱弧菌(V.cholerae)的方法，所述方法包括：
使所述样品与多于一对引物接触，其中所述多于一对引物包含：
能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:1-8的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:1-8的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；
能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:12-19的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:12-19的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；
能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:24-33的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:24-33的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；以及
能够与霍乱弧菌的ctxA(霍乱毒素)基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:39-48的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:39-48的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；
如果所述样品包含霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139和编码霍乱毒素的霍乱弧菌中的一种或更多种，则产生ompW基因序列的扩增子、rfbN基因序列的扩增子、wbfR基因序列的扩增子、ctxA基因序列的扩增子或其任何组合；以及
确定一种或更多种扩增子的存在或量，作为所述样品中霍乱弧菌、霍乱弧菌血清组O1、霍乱弧菌血清组O139和编码霍乱毒素的霍乱弧菌中的一种或更多种的存在的指示。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括使所述样品与能够与大肠杆菌(E.coli)的yaiO基因杂交的至少一对对照引物接触，其中所述至少一对对照引物中的每种引物包含SEQ ID NO:53-62的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:53-62的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列，并且
如果所述样品包含大肠杆菌，则从所述样品产生大肠杆菌的yaiO基因序列的扩增子；以及
确定大肠杆菌的yaiO基因序列的扩增子的存在或量，作为所述样品中大肠杆菌的存在的指示。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述样品与包含所述多于一对引物和能够与大肠杆菌的yaiO基因杂交的所述至少一对对照引物的组合物接触。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述样品是生物样品或环境样品。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述环境样品从以下获得：食品样品、饮料样品、纸张表面、织物表面、金属表面、木材表面、塑料表面、土壤样品、淡水样品、废水样品、盐水样品、暴露于环境空气或其他气体的样品、其培养物或其任何组合。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述生物样品从以下获得：组织样品、唾液、血液、血浆、血清、粪便、尿液、痰、黏液、淋巴、滑液、脑脊液、腹水、胸腔积液、血清肿、脓、皮肤或黏膜表面的拭子、其培养物或其任何组合。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述生物样品包括粪便样品或来源于粪便样品。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述多于一对引物包含含有SEQ IDNO:1、3、5或7的序列的第一引物，含有SEQ ID NO:2、4、6或8的序列的第二引物，含有SEQ IDNO:12、14、16或18的序列的第三引物，含有SEQ ID NO:13、15、17或19的序列的第四引物，含有SEQ ID NO:24、26、28、30或32的序列的第五引物，含有SEQ ID NO:25、27、29、31或33的序列的第六引物，含有SEQ ID NO:39、41、43、45或47的序列的第七引物，以及含有SEQ ID NO:40、42、44、46或48的序列的第八引物。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述多于一对引物包含含有SEQ IDNO:53、55、57、59或61的序列的第九引物和含有SEQ ID NO:54、56、58、60或62的序列的第十引物。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中
能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交的该对引物为SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO:3和4、SEQID NO:5和6、或SEQ ID NO:7和8；
能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交的该对引物为SEQ ID NO:12和13、SEQ IDNO:14和15、SEQ ID NO:16和17、或SEQ ID NO:18和19；
能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交的该对引物为SEQ ID NO:24和25、SEQ IDNO:26和27、SEQ ID NO:28和29、SEQ ID NO:30和31、或SEQ ID NO:32和33；并且
能够与霍乱弧菌的ctxA基因杂交的该对引物为SEQ ID NO:39和40、SEQ ID NO:41和42、SEQ ID NO:43和44、SEQ ID NO:45和46、或SEQ ID NO:47和48。
11.根据权利要求2-10中任一项所述的方法，其中能够与大肠杆菌的yaiO基因杂交的该对对照引物为SEQ ID NO:53和54、SEQ ID NO:55和56、SEQ ID NO:57和58、SEQ ID NO:59和60、或SEQ ID NO:61和62。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述扩增使用选自由以下组成的组的方法进行：聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、复制酶介导的扩增、免疫扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自主序列复制(3SR)、滚环扩增和转录介导的扩增(TMA)。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述PCR是实时PCR。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述PCR是定量实时PCR(QRT-PCR)。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中每种引物包含外源核苷酸序列。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中确定一种或更多种扩增子的存在或量包括使扩增子与多于一种寡核苷酸探针接触，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的每种由选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列组成。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其中每种探针在5'末端和3'末端的侧翼为互补序列。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述互补序列中的一个包含荧光发射物部分，并且另一个互补序列包含荧光猝灭物部分。
21.根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的至少一种包含荧光发射物部分和荧光猝灭物部分。
22.一种组合物，所述组合物用于检测样品中的霍乱弧菌，包含：
能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:1-8的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:1-8的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；
能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:12-19的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:12-19的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；
能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:24-33的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:24-33的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；以及
能够与霍乱弧菌的ctxA(霍乱毒素)基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:39-48的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:39-48的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列。
23.根据权利要求22所述的组合物，所述组合物还包含能够与大肠杆菌(E.coli)的yaiO基因杂交的至少一对对照引物，其中所述至少一对对照引物中的每种引物包含SEQ IDNO:53-62的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:53-62的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列。
24.根据权利要求22-23中任一项所述的组合物，其中
能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交的所述至少一对引物包含含有SEQ ID NO:1、3、5或7序列的引物和含有SEQ ID NO:2、4、6或8序列的引物；
能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交的所述至少一对引物包含含有SEQ ID NO:12、14、16或18序列的引物和含有SEQ ID NO:13、15、17或19序列的引物；
能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交的所述至少一对引物包含含有SEQ IDNO:24、26、28、30或32序列的引物和含有SEQ ID NO:25、27、29、31或33序列的引物；并且
能够与霍乱弧菌的ctxA基因杂交的所述至少一对引物包含含有SEQ ID NO:39、41、43、45或47序列的引物和含有SEQ ID NO:40、42、44、46或48序列的引物。
25.根据权利要求23-24中任一项所述的组合物，其中能够与大肠杆菌的yaiO基因杂交的所述至少一对对照引物包含含有SEQ ID NO:53、55、57、59或61序列的引物和含有SEQ IDNO:54、56、58、60或62序列的引物。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的组合物，所述组合物还包含多于一种寡核苷酸探针，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的每种由选自由SEQ ID NO:9-11、20-23、34-38、49-52和63-67组成的组的序列组成。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的组合物，其中所述多于一种探针中的至少一种包含荧光发射物部分和荧光猝灭物部分。
30.一种寡核苷酸探针或引物，所述寡核苷酸探针或引物的长度为至多约100个核苷酸，能够与霍乱弧菌的ompW基因杂交，其中所述探针或引物包含选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
31.根据权利要求30所述的寡核苷酸探针或引物，其中所述探针或引物由选自由SEQID NO:1-11组成的组的序列组成，或由与选自由SEQ ID NO:1-11组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列组成。
32.根据权利要求30所述的寡核苷酸探针或引物，其中所述探针或引物包含选自由SEQID NO:1-11组成的组的序列。
33.根据权利要求30所述的寡核苷酸探针或引物，其中所述探针或引物由选自由SEQID NO:1-11组成的组的序列组成。
34.一种寡核苷酸探针或引物，所述寡核苷酸探针或引物的长度为至多约100个核苷酸，能够与霍乱弧菌血清组O1的rfbN基因杂交，其中所述探针或引物包含选自由SEQ IDNO:12-23组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
35.根据权利要求34所述的寡核苷酸探针或引物，其中所述探针或引物由选自由SEQID NO:12-23组成的组的序列组成，或由与选自由SEQ ID NO:12-23组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列组成。
36.根据权利要求34所述的寡核苷酸探针或引物，其中所述探针或引物包含选自由SEQID NO:12-23组成的组的序列。
37.根据权利要求34所述的寡核苷酸探针或引物，其中所述探针或引物由选自由SEQID NO:12-23组成的组的序列组成。
38.一种寡核苷酸探针或引物，所述寡核苷酸探针或引物的长度为至多约100个核苷酸，能够与霍乱弧菌血清组O139的wbfR基因杂交，其中所述探针或引物包含选自由SEQ IDNO:24-38组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:24-38组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
39.根据权利要求38所述的寡核苷酸探针或引物，其中所述探针或引物由选自由SEQID NO:24-38组成的组的序列组成，或由与选自由SEQ ID NO:24-38组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列组成。
40.根据权利要求38所述的寡核苷酸探针或引物，其中所述探针或引物包含选自由SEQID NO:24-38组成的组的序列。
41.根据权利要求38所述的寡核苷酸探针或引物，其中所述探针或引物由选自由SEQID NO:24-38组成的组的序列组成。
42.一种寡核苷酸探针或引物，所述寡核苷酸探针或引物的长度为至多约100个核苷酸，能够与霍乱弧菌的ctxA(霍乱毒素)基因杂交，其中所述探针或引物包含选自由SEQ IDNO:39-52组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:39-52组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
43.根据权利要求42所述的寡核苷酸探针或引物，其中所述探针或引物由选自由SEQID NO:39-52组成的组的序列组成，或由与选自由SEQ ID NO:39-52组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列组成。
44.根据权利要求42所述的寡核苷酸探针或引物，其中所述探针或引物包含选自由SEQID NO:39-52组成的组的序列。
45.根据权利要求42所述的寡核苷酸探针或引物，其中所述探针或引物由选自由SEQID NO:39-52组成的组的序列组成。
46.一种寡核苷酸探针或引物，所述寡核苷酸探针或引物的长度为至多约100个核苷酸，能够与大肠杆菌的yaiO基因杂交，其中所述探针或引物包含选自由SEQ ID NO:53-67组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:53-67组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。
47.根据权利要求46所述的寡核苷酸探针或引物，其中所述探针或引物由选自由SEQID NO:53-67组成的组的序列组成，或由与选自由SEQ ID NO:53-67组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列组成。
48.根据权利要求46所述的寡核苷酸探针或引物，其中所述探针或引物包含选自由SEQID NO:53-67组成的组的序列。
49.根据权利要求46所述的寡核苷酸探针或引物，其中所述探针或引物由选自由SEQID NO:53-67组成的组的序列组成。
50.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求30-49中任一项所述的寡核苷酸探针或引物中的两种或更多种。
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