JPH0819394A - 複数標的の同時増幅 - Google Patents

複数標的の同時増幅

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JPH0819394A
JPH0819394A JP6123817A JP12381794A JPH0819394A JP H0819394 A JPH0819394 A JP H0819394A JP 6123817 A JP6123817 A JP 6123817A JP 12381794 A JP12381794 A JP 12381794A JP H0819394 A JPH0819394 A JP H0819394A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、ただ一対のプライマーを用いた複
数標的核酸配列の同時増幅法を提供する。 【構成】 規定された配列を増幅反応物の一部として複
数の標的配列の末端に付加することにより、増幅以外の
工程が不要になる。付加された規定配列を含む標的は増
幅前に単離する必要がない。２つの標的配列の共増幅に
関するひとつの態様において、第１標的配列の末端セグ
メントに対応する配列を第２標的配列の一方の末端に付
加し、そして第２標的配列の末端セグメントに対応する
配列を第１標的配列の一方の末端に付加する。次に、２
つの標的の増幅はただ一対のプライマーのみを必要とす
る。別法としては、単一の規定された配列を選択された
必要とするの５’および３’末端に付加してよい。その
ような修飾されたすべての標的配列は、次に、規定され
た末端配列にハイブリダイズするただ一対のプライマー
を用いて増幅される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸の標的配列の恒温
増幅に関し、特定すれば、複数標的配列の同時増幅に関
する。
【０００２】
【従来の技術】インビトロ核酸増幅技術は、少量の核酸
の検出および分析のための強力な手段を提供してきた。
そのような方法の究極の感度は、感染性および遺伝的疾
患の診断、分析のための遺伝子の単離、および法医学に
おける特定の核酸の検出のためのそれらの開発の企画に
通じてきた。核酸増幅技術は、その方法における温度要
求性に従い分類されうる。ポリメラーゼチェインリアク
ション（ＰＣＲ；Ｒ．Ｋ．Ｓａｉｋｉ，ｅｔ ａｌ．１
９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５
４）、ライゲースチェインリアクション（ＬＣＲ；Ｄ．
Ｙ．Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃ
ｓ，４，５６０−５６９；Ｋ．Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ，ｅ
ｔ ａｌ．，１９９０，Ｇｅｎｅ，８９，１１７−１２
２；Ｆ．Ｂａｒａｎｙ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１８９−１９
３）および転写に基づく増幅（Ｄ．Ｙ．Ｋｗｏｈ，ｅｔ
ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６、１１７３−１１７７）は、温度
の循環を必要とする。対照的に、鎖置換増幅のような方
法（ＳＤＡ；Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１
９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８９，３９２−３９６；Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒ，ｅ
ｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ
ｓ．，２０，１６９１−１６９６）、自己維持配列増幅
（３ＳＲ；Ｊ．Ｃ．Ｇｕａｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，
１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８７，１８７４−１８７８）およびＱβレプリカ
ーゼシステム（Ｐ．Ｍ．Ｌｉｚａｒｄｉ，ｅｔａｌ．，
１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１１９７
−１２０２）は恒温反応である。さらに、国際公開第９
０／１００６４号および国際公開第９１／０３５７３号
は、核酸の恒温複製におけるバクテリオファージ、ファ
イ２９の複製開始点の使用を記載している。
【０００３】通常、核酸増幅技術を用いた特定の核酸の
診断およびスクリーニングは、一度に一つの標的配列を
増幅する必然性により制限されてきた。複数の核酸配列
が存在する場合（例えば、感染性疾患の診断）、この方
法による複数の別々のアッセイの実施は煩わしく、か
つ、時間を消費する。米国特許第４，６８３，１９５
号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１５
９号はＰＣＲを記載する。これらの発明者らは、複数の
配列が検出されると述べているが、同時に複数の標的配
列を増幅するための方法を何ら開示していない。複数の
標的配列を増幅する場合、それは、別々のＰＣＲによる
単一の標的の連続的増幅による。事実、別々の標的配列
のための複数のプライマー対を単一のＰＣＲに添加する
場合、その反応は受容不可能なほどの高いレベルの非特
異的増幅およびバックグラウンドを生じる。複数の標的
配列を同時に増幅することに関して報告されたＰＣＲの
改良は、欧州特許出願第０３６４２５５号に記載されて
いる。これは、複数ＤＮＡ増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ
ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と呼ばれる。こ
の方法においては、複数対のプライマーを、標的核酸を
含む核酸に添加する。各プライマー対は、別々の選択さ
れた標的配列にハイブリダイズし、ＰＣＲと同様の温度
循環反応において連続的に増幅される。
【０００４】特定の核酸増幅法は、増幅前に核酸断片の
末端に対する規定された配列を付加してきた。米国特許
第５，１０４，７９２号は、配列が公知でない核酸断片
を増幅させるＰＣＲの修飾法を記載している。該増幅反
応のためのプライマーは、それらの３’末端にランダム
な変成（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）配列を、そして５’末
端に規定された配列を含む。プライマーの伸長により、
規定された配列を周囲に有する、未知の配列を含む断片
が生成される。次に、これらの断片は、公知のそれら周
辺配列にハイブリダイズするプライマーを用いて慣用的
ＰＣＲにより増幅される。公知の配列を周囲に有する未
知のＤＮＡのＰＣＲ増幅に関する他の方法は、Ｄ．Ｈ．
ＪｏｎｅｓおよびＳ．Ｃ．Ｗｉｎｉｓｔｏｒｆｅｒ（１
９９２，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０，５９５−
６００，「パンハンドルＰＣＲ」）により記載されてい
る。パンハンドルＰＣＲにおいては、公知ＤＮＡの配列
に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを、二本鎖断片の
３’末端に連結する。変成および鎖間のリアニーリング
により、相補鎖はハイブリダイズし、そして退行してい
る３’末端はポリメラーゼにより伸長され、公知配列を
周辺に有する未知配列が生成される。次に、公知配列を
用いて未知配列の増幅のためのプライマーを製造する。
ヘアピン構造の生成および単一プライマー増幅のための
同様な方法は、欧州特許出願第０３７９３６９号に記載
されている。国際公開第９０／０９４５７号は、全く知
られていないＤＮＡ配列の増幅のための、配列非依存性
方法を記載している。ユニバーサルオリゴヌクレオチド
プライマー対を平滑末端連結により標的ＤＮＡに連結し
て、これらの公知プライマーを用いてＰＣＲ増幅が開始
される。
【０００５】部分的な配列情報のみが公知の場合の標的
配列増幅に関するいくつかの方法が知られている。Ａ．
Ｒ．Ｓｈｕｌｄｉｎｅｒら（１９９０，Ｇｅｎｅ，９
１，１３９−１４２）は、唯一の配列を第１鎖の５’末
端に付加することによる逆転写ＰＣＲの修飾法を記載し
ている。第１鎖の合成は、３’末端においてＲＮＡ標的
に相補的であり、かつ、５’末端に上記唯一の配列を含
むハイブリッドプライマーにより開始される。次に、上
記唯一の配列に対するプライマーおよび標的特異的配列
に対するプライマーを用いて、ｃＤＮＡを増幅する。こ
れは、記録的に持ち越し汚染物の増幅を低下させる。欧
州特許出願第０４６９７５５号は、隣接していない非相
補的２つのセグメントを有する一本鎖ポリヌクレオチド
の生産法を開示している。該ポリヌクレオチド中に存在
する配列に相補的な配列は、その３’末端において上記
ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、かつ、その５’
末端において上記存在配列に相補的なプライマーの伸長
により導入される。プライマーの伸長後、ポリヌクレオ
チドは単一のプライマーを用いて増幅されうる。Ｖ．Ｓ
ｈｙａｍａｌａおよびＧ．Ｆ．Ｌ．Ａｍｅｓ（１９８
９、Ｇｅｎｅ，８４，１−８）は、一方の末端の配列の
みが利用可能な場合のＤＮＡのＰＣＲ増幅法（ＳＳＰ−
ＰＣＲ）を教示している。未知の末端は一般的ベクター
配列に連結され、そしてその断片は遺伝子特異的プライ
マーおよび一般的ベクタープライマーを用いて増幅され
る。同様な方法は、欧州特許出願第０３５０６２１号に
開示されている。国際公開第９０／０１０６４号は、配
列の公知部分に対する配列特異的プライマーを用いて合
成開始された相補鎖の合成による配列増幅法を記載して
いる。ホモポリマーを該相補体の３’末端に付加し、そ
して配列は、ホモポリマープライマーおよび配列特異的
プライマーの領域に相同なプライマーを用いて増幅され
る。フットプリンティングへのＰＣＲの適用は、Ｐ．
Ｒ．ＭｕｅｌｌｅｒおよびＢ．Ｗｏｌｄ（１９８９，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２４６，７８０−７８６）により教示さ
れている。フットプリンティングに関して、共通のオリ
ゴヌクレオチド配列をフットプリントのラダーの各断片
の唯一の末端に連結させる。断片は該共通配列に相補的
なプライマーおよび固定された末端の公知配列に相補的
なプライマーを用いて増幅される。
【０００６】本発明の方法は、プライマー伸長による増
幅の前にあらゆる標的にあらゆるアダプター配列または
あらゆるアダプター配列対を付加するための手段を提供
する。アダプター配列は、単一プライマー伸長増幅反応
（本明細書中では複数化増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａ
ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎまたはｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉ
ｎｇ）と呼ぶ）において２つ以上の標的反応の同時増幅
に必要な特異的プライマーの数を減少させる。慣用的複
数増幅は、各標的配列の増幅に特異的な反応プライマー
を用いることを含み、即ち、各標的は特異的プライマー
またはプライマー対により増幅される。慣用的な複数増
幅は、特定の状況において満足のゆく結果を提供する
が、しかし、複数の特異的プライマーを各複数反応のた
めに調製しなければならない点で不利である。しばし
ば、しかしながら、複数配列は、高いレベルの非特異的
バックグラウンド増幅のために、慣用的複数増幅を用い
て容易に増幅および検出されない。本発明の複数増幅に
おけるアダプターは、特定の場合に改良された結果をも
たらす慣用的複数増幅に対して選択的である。前記文献
のうち、ＥＰＯ第０３６４２５５号およびＭｕｅｌｌｅ
ｒおよびＷｏｌｄのみが、複数標的配列の同時増幅の問
題に立ち向かっている。両開示は、一部その温度循環に
より、ＳＤＡのような恒温増幅と比較した場合に顕著に
異なる反応条件を提供する同時ＰＣＲ増幅を教示する。
前記文献の特定のものは、増幅前に断片のいずれかの末
端に規定された配列を付加することを記載しているが、
規定された末端の付加および増幅は別々の反応において
実施される。さらに、本発明は最初に、各標的に対する
別々の特異的プライマーの必要性なしに、ＳＤＡにより
複数の標的配列を同時に増幅する方法を提供する。本発
明の方法は、標的配列の末端への規定されたアダプター
配列の付加および増幅反応が単一反応混合物において生
じ、そして使用者にとって単一の工程ですむ点において
特に有利である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明によれば、単一
のプライマーまたはプライマー対を用いることにより、
複数の標的核酸配列を共に増幅することができる。規定
されたアダプター配列は、増幅反応の関係において標的
配列の末端に付加され、それにより、アダプター配列に
付加するための付加的操作を含まない。即ち、付加的ア
ダプター配列を含む標的配列を増幅前に単離する必要が
ない。２つの標的配列を共に増幅するためのひとつの態
様において、第１標的配列の２つの鎖の一方の末端セグ
メントに対応する配列を第２標的配列の２つの鎖の一方
の５’末端に付加し、そして、第２標的配列の２つの鎖
の一方の末端セグメントに対応する配列を第１標的配列
の２つの鎖の一方の５’末端に付加する。次に、２つの
修飾された標的の増幅は、増幅プライマーたった一対の
みを必要とする。該対の一つの増幅プライマーは、第２
標的の対応する配列にハイブリダイズする。別法とし
て、一つの標的に由来する配列の一対は、あらゆる数の
標的の各鎖の５’および３’末端に付加してよい。他の
態様において、２つの任意の「ユニバーサル」アダプタ
ー配列は、あらゆる数の標的の末端に付加してよい。そ
のような修飾された標的配列のすべては、次に、付加さ
れた末端配列にハイブリダイズする一対のユニバーサル
プライマーを用いて増幅してよい。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明の方法は、ＳＤＡ
に関して特に有利であるが、制限酵素認識部位を含む増
幅プライマー対の必要な数は、一対／標的から一対に減
り、あるいは、１増幅プライマーに減る。少ない数の増
幅プライマー対を用いるため、プライマーダイマーの形
成および非特異的バックグラウンド増幅が減る。本発明
の方法は、プライマーの濃度を低下させ、規定された配
列を含むアダプタープライマーは、置換されるべき増幅
プライマーに比較してはるかに低い濃度で存在する。
【０００９】本発明は、プライマー伸長、特定すればＳ
ＤＡ（複数化ＳＤＡ）による複数の標的配列の同時増幅
法を提供する。該方法は、複数の標的配列を共に増幅す
るために、一対の増幅プライマーまたはひとつのＳＤＡ
増幅プライマーを用いる。これは、規定されたアダプタ
ー配列を標的に付加し、かつ、プライマー伸長により共
に増幅することにより達成される。本発明の方法は、本
明細書中で「アダプター介在複数化」と呼ばれる。この
言葉は、複数対の標的特異的プライマーを用いて、アダ
プターの付加なしに複数の標的を共に増幅する「慣用的
複数化」に対するものである。
【００１０】以下の言葉は、以下のとおりに規定され
る。
【００１１】増幅プライマーは、プライマー伸長による
標的配列の増幅のためのプライマーである。ＳＤＡに関
して、増幅プライマーの３’末端（標的結合配列）は、
標的配列の３’末端にハイブリダイズし、かつ、その
５’末端付近に制限酵素の認識部位を含む。認識部位
は、半修飾（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）の場合に、Ｄ
ＮＡ二本鎖の一方の鎖にニックを入れる制限酵素のため
のものであり、Ｗａｌｋｅｒら（１９９２，ＰＮＡＳ，
８９，３９２−３９６）および米国特許出願第０７／８
１９，３５８号（１９９２年１月９日出願）に記載され
ており、これら文献の内容は引用により本明細書の一部
をなす。半修飾（ｈｅｍｉｍｏｄｉｆｉｅｄ）認識部位
は、一方の鎖が制限酵素によるその鎖の切断を妨害する
少なくともひとつの誘導化ヌクレオチドを含む、制限酵
素のための二本鎖認識部位である。半修飾認識部位の他
方の鎖は、誘導化ヌクレオチドを含まず、かつ、制限酵
素によりニックを入れられる。好ましい半修飾認識部位
は、制限酵素、ＨｉｎｃＩＩ，ＡｖａＩ，ＮｃｉＩおよ
びＦｎｕ４ＨＩの半ホスホロチオエート化認識部位であ
る。ＳＤＡ反応の大部分に関して、増幅プライマーは標
的配列の対数的増幅に必須である。
【００１２】アダプタープライマーは、標的配列にハイ
ブリダイズする配列（標的結合配列）をその３’末端に
有する。アダプタープライマーの５’末端は、アダプタ
ー配列である。アダプター配列は、増幅プライマーの一
方の３’末端と実質的に同一の配列であるか、または、
相補的標的結合配列を有する増幅プライマーが調製され
うるためのあらゆる規定された配列を含む。
【００１３】バンパープライマーは、バンパープライマ
ーの伸長により下流のプライマーおよびその伸長産物が
置換されるような、アダプターまたは増幅プライマーの
いずれかの標的配列上流にアニールするプライマーであ
る。バンパープライマーの伸長は、アダプターおよび増
幅プライマーの伸長産物の置換のための一つの方法であ
るが、加熱も適切である。
【００１４】同一配列は、同一の相補的ヌクレオチド配
列にハイブリダイズする。実質的に同一な配列は、同じ
ヌクレオチド配列にもハイブリダイズするそれらのヌク
レオチド配列に十分類似のものである。
【００１５】単語、標的または標的配列は、増幅される
核酸配列を意味する。これらは、増幅される起源核酸配
列およびその相補的第２鎖（アダプター配列の付加前
の）、上記起源配列のアダプター修飾コピーのいずれか
の鎖、および、アダプター配列が起源配列に付加された
場合の反応中間産物である起源配列のコピーのいずれか
の鎖を含む。
【００１６】本発明のアダプター介在複数化において、
アダプター配列は、下記のアダプタープライマー手段お
よび伸長および鎖置換工程により標的配列の末端に付加
される。アダプタープライマーは、（ｉ）その５’末端
にアダプター配列を、そして（ｉｉ）その３’末端に標
的結合配列を含むオリゴヌクレオチドである。５’アダ
プター配列は、適切な増幅プライマーが調製されうるた
めのあらゆる配列でありうる。アダプター配列は、任意
であるか、または標的配列のひとつのセグメントに相当
する。アダプタープライマーのアダプターおよび標的結
合領域は接続されるか、または、非関連配列のセグメン
トにより分断される。別々のアダプタープライマーは、
共通な５’アダプター配列を含んでも含まなくてもよい
が（下記）、さまざまな標的へのハイブリダイズを達成
するために異なる３’標的結合配列を有するのが一般的
である。唯一のアダプタープライマーは、したがって、
各標的末端がアダプター配列の付着により修飾されるた
めに通常必要である。標的配列の一方または両方の末端
は、アダプター配列の付着により修飾されていてよい。
標的配列の両方の末端を修飾する場合、２つの付加され
た配列は同一であるか、または異なっていてよく、アダ
プタープライマーの選択に依存する。
【００１７】実施例により、本発明の以下の詳細な説明
は、ＳＤＡによるプライマー伸長増幅に向けられる。当
業者には、これらの方法がポリメラーゼによるプライマ
ーの伸長に基づくあらゆるＤＮＡ増幅法に容易に適用可
能であることは明らかであろう。例えば、これらは、上
記の３ＳＲおよびＰＣＲを含む。本発明の方法をこれら
増幅法に適用するためには、ＳＤＡ増幅プライマーは選
択されたプライマー伸長増幅反応に適切な増幅プライマ
ーで置換されるはずであることは、当業界において明ら
かである。アダプタープライマーは、選択されたプライ
マー伸長増幅法にかかわらず、本質的に変化しない。
【００１８】図１は、規定されたアダプター配列による
標的配列の両方の末端の修飾のための好ましい方法を例
示する。第１アダプタープライマー（Ａ1）は標的ＤＮ
Ａ配列の３’末端において標的ＤＮＡにハイブリダイズ
する。Ａ1の標的結合配列は３’末端にあり、そして選
択されたアダプター配列は５’末端にある。上記Ｗａｌ
ｋｅｒら（１９９２，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２
０，１６９１−１６９６）により記載された第１バンパ
ープライマー（Ｂ1）は、上記第１アダプタープライマ
ーの標的ＤＮＡの上流にハイブリダイズする。上流バン
パープライマーの伸長は第１バンパープライマーの伸長
産物を置換し（Ａ1−ｅｘｔ）、その５’末端にアダプ
ター配列を含むが、その他の点では起源標的ＤＮＡ配列
に相補的である。第２アダプタープライマー（Ａ2）の
標的結合配列（３’末端）を次に、起源標的配列に相補
的な配列の３’末端に対応する位置において、第１アダ
プター伸長産物（Ａ1−ｅｘｔ）にハイブリダイズさせ
る。Ａ2の５’末端は第２アダプター配列からなり、Ａ1
アダプター配列と同一であっても異なってもよい。前記
のような第２バンパープライマー（Ｂ2）の伸長による
重合および置換は、５’および３’末端に付加されたア
ダプター配列を有する起源標的配列の一本鎖コピーを生
成する。特定すれば、修飾された標的の５’末端は第２
アダプタープライマーに直接由来し、修飾された標的の
３’末端（間接的に第１プライマーに由来する）は第１
アダプター配列に相補的な配列からなる。
【００１９】簡潔には、図１は、サンプル中に通常存在
する２つの相補的標的鎖のただ一方のみからの標的生成
物を示す。第２鎖からの修飾された標的の生成は、第１
および第２アダプタープライマーの結合と伸長の順序が
逆になっている以外は、図１に示される第１鎖からの修
飾標的の生成と同一である。即ち、Ａ2が結合して最初
に伸長し、そしてＡ1がＡ2の伸長生成物に結合して伸長
される。第１および第２バンパープライマーの結合およ
び伸長は同様に逆である。第２鎖に関して対応する伸長
および置換反応の正味の結果物は、その５’末端に第１
アダプター配列と同一の配列を有し、そしてその３’末
端に第２アダプター配列に相補的な配列を有する、修飾
された標的断片である。アダプター配列で末端が修飾さ
れた標的配列のすべての鎖は、次に、修飾された標的の
生成に用いられるアダプタープライマーの５’末端の第
１および第２アダプター配列に実質的に同一な標的結合
配列をその３’末端に有する増幅プライマーにより対数
的に増幅されうる。
【００２０】図１に示される工程を用いて、一回の反応
混合物中で同時に複数の標的配列を修飾することができ
るが、その際、該混合物は修飾される各標的末端のため
の適切なアダプタープライマーを含む。さまざまなアダ
プタープライマーをデザインすることにより、生成され
るすべての修飾標的配列は同じ対の付加配列を含む。次
に、すべての末端修飾標的鎖を同じ対の増幅プライマー
により増幅する。別法として、すべてのアダプタープラ
イマーが同じ５’アダプター配列を含むならば、たった
ひとつの増幅プライマーのみがすべての修飾標的鎖の増
幅に必要なだけである。
【００２１】図２は、一対の増幅プライマーを用いた２
つの標的配列の共増幅に関する、本発明の別の態様を示
す。再び、明確化のために、各標的配列の一方の鎖のみ
の修飾を例示する。この態様においては、各標的鎖の一
方の末端は、他の標的の末端セグメントに実質的に同一
な配列を付加することにより修飾される。各標的の他方
の末端は未修飾のままであり、増幅プライマー対の一方
のメンバーへの最初の相補性を残している。以下に詳細
に説明されるとおり、次に、その結果得られる、修飾さ
れた標的を一対の増幅プライマーにより増幅することが
できるが、その際、該対の一方のメンバーは２つの起源
標的配列の一方に相補的であり、かつ、該対の他方のメ
ンバーは２つの起源標的配列の一つに相補的である。第
１標的（Ａ）に関して、Ａ特異的増幅プライマー
（ＳA）を標的の３’末端にハイブリダイズさせ、そし
て、ポリメラーゼにより伸長合成する。増幅プライマー
のニッキング酵素認識部位は、図２において、プライマ
ーの持ち上がった部分として示される。その結果得られ
る伸長産物は、ＳAの上流において標的にハイブリダイ
ズするバンパープライマー（ＢA1）の伸長により置換さ
れる。置換されたＳA伸長産物は、起源標的配列の相補
体の３’末端においてＳA−ｅｘｔに結合するアダプタ
ープライマー（ＡA）にハイブリダイズする。ＡAの５’
末端はアダプター配列（太線部分）を含むが、該配列は
ＳBの３’末端の標的結合配列に実質的に同一であり、
増幅プライマーは第２標的（Ｂ）に特異的に結合する。
ＡAの伸長およびＡA伸長産物（ＡA−ｅｘｔ）の置換
は、ニッキング酵素認識部位を有するＡ標的配列、およ
びその３’末端にＡ標的配列、およびその５’末端にＳ
B標的結合配列を有する一本鎖コピーを生成する。
【００２２】第２標的（Ｂ）は同様に処理され、最初に
Ｂ特異的増幅プライマー（ＳB）を結合および伸長さ
せ、次に、伸長産物（ＳB−ｅｘｔ）にアダプタープラ
イマー（ＡB）をハイブリダイズさせる。ＳBは、ＳBの
標的結合配列およびＡAのアダプター配列の両者に相補
的なＢの３’末端セグメントにおいてＢにハイブリダイ
ズする。アダプタープライマーＡBの３’末端は起源標
的の相補的３’末端にハイブリダイズし、そして、ＡB
の５’末端（白枠部分）は、ＳAの標的結合配列に実質
的に同一である。ＡB伸長産物（ＡB−ｅｘｔ）の伸長お
よび置換は、ニッキング酵素認識部位を有する第２の標
的配列（持ち上がった部分）、およびその３’末端にＢ
標的配列、およびその５’末端にＳA標的結合配列を有
するコピーを生成する。標的配列の２つのアダプター修
飾コピーは、通常反応に存在するＳAおよびＳB増幅プラ
イマーのみを用いて、ＳＤＡにより増幅可能である。Ｓ
ＤＡを始めるために、ＡA−ｅｘｔおよびＡB−ｅｘｔは
各々の増幅プライマーにハイブリダイズするが、該プラ
イマーは伸長されて、３’末端にアダプター配列の相補
部分を含む修飾鎖の物（即ち、Ａ修飾鎖上でのＳAの伸
長、およびＢ修飾鎖上でのＳBの伸長）を生成する。ニ
ッキングおよび置換の後、次に、反対の標的の増幅プラ
イマーはこの伸長産物の３’末端に結合し（即ち、Ａ由
来の鎖に対してＳB、そしてＢ由来の鎖に対してＳA）、
そして伸長により各末端にニッキング酵素認識部位を有
する断片を生成する。この断片は、Ｗａｌｋｅｒら（前
記）に記載されているとおりに、慣用的ＳＤＡにより増
幅される。
【００２３】ＡA−ｅｘｔおよびＡB−ｅｘｔの置換後に
生成された二本鎖反応産物は、ＡA−ｅｘｔおよびＡB−
ｅｘｔの付加的コピーを生じる反応ループにも関与す
る。底の鎖の制限酵素認識部位にニックを入れ、ポリメ
ラーゼにより伸長し、そして、底の鎖の置換により、Ｓ
A−ｅｘｔおよびＳB−ｅｘｔと類似しているが５’末端
に制限酵素の認識部位の半分を有する標的を生成する。
アダプタープライマーは図２に示されたこれら断片に結
合でき、かつ、伸長および置換されて、上記ＳＤＡ反応
サイクルに入るＡA−ｅｘｔおよびＡB−ｅｘｔ（５’末
端に制限酵素の認識部位の半分を有する）の付加的コピ
ーを生成する。
【００２４】図２は、各標的配列に通常存在する２つの
相補的鎖の一方のみからの修飾標的の生成を示す。この
ように示された工程は、各標的の第２鎖から開始する。
第２鎖の場合、しかしながら、プライマーの結合および
伸長の順序は逆である。アダプタープライマーは、最初
に標的第２鎖に直接結合し、そしてその鋳型上を伸長す
る。その次の置換の後、その結果の伸長産物は増幅プラ
イマーに結合するが、その際、該プライマーはひるがえ
って伸長および置換されることにより、その５’末端に
ニッキング制限酵素の認識部位およびその３’末端にア
ダプター配列に相補的な配列を有する起源第２鎖の標的
配列を含む産物を生じる。この修飾された断片は、反対
の標的に特異的な増幅プライマーの結合および伸長によ
り慣用的ＳＤＡ増幅にはいり（即ち、ＳBはＡ由来の鎖
に結合し、そしてＳAはＢ由来の鎖に結合する）、各末
端にニッキング制限酵素部位を有する各標的第２鎖のた
めの断片を生成する。
【００２５】アダプター配列を付加し、そして標的を増
幅することに関与するすべての反応工程は、単一反応混
合物中で同時に生じる。即ち、アダプター配列が標的配
列に付加されたならば、その標的分子の増幅は、存在す
る他のあらゆる標的分子にアダプター配列を付加する前
に同じ反応混合物中で、修飾標的の単離なしに生じう
る。本発明の方法の反応条件は、本質的には、ＳＤＡに
関してＷａｌｋｅｒら（前記）により記載されたものに
いくつかの修飾を加えたものである。第１に、最初の反
応混合物は、増幅プライマーおよびアダプタープライマ
ーの両者、並びに標的ＤＮＡを含む。さらに、増幅プラ
イマーはアダプタープライマーの約１０倍過剰に存在す
る。しかしながら、慣用的ＳＤＡのように、標的ＤＮＡ
の加熱変成およびプライマーのアニーリングの後に、ニ
ッキング制限酵素およびｅｘｏ-クレノーポリメラーゼ
を添加する。標的ＤＮＡの変成、プライマーのアニーリ
ングおよびポリメラーゼの添加の後に、アダプター配列
を付加して増幅する工程は、単一反応混合物中で、使用
者によるさらなる干渉なしに自動的に進行する。即ち、
アダプター配列を付加した後は、修飾された標的配列は
ＳＤＡ反応サイクルに自動的にはいる。必要であれば、
ユニバーサルプライマーを３’末端に付加（ｃａｐｐｅ
ｄ）してポリメラーゼによる伸長を阻害し、そしてプラ
イマーダイマーの形成によるバックグラウンド反応を減
少させてよい。
【００２６】
【実施例】 実施例１ ２つの標的配列の共増幅は、慣用的複数化およびアダプ
ター介在複数化により比較された。第１の標的は、マイ
コバクテリウムツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＩＳ６１１０イ
ンサーションエレメントであった（標的「Ａ」、Ｔｈｉ
ｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。第２の標的は、
マイコバクテリウムツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の１６Ｓリボ
ソーマル遺伝子であった（標的「Ｂ」）。慣用的複数化
法は、各標的配列のための４つのプライマーのフルセッ
ト（Ｓ1，Ｓ2，Ｂ1およびＢ2、Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕ
ｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，前記）、即ち、２つの標的
配列のための合計８つのプライマーであった。アダプタ
ー介在複数化法に関しては、図２に示すとおり、各標的
配列のためのＳプライマーのひとつをアダプタープライ
マーに代えたが、その際、アダプタープライマーは交換
されたＳプライマーの濃度より１０倍低い濃度で用い
た。
【００２７】ＳＤＡは、Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．（前記）に記載されたとおりに実施し
た。成分の最終濃度は、４５ｍＭ ＫiＰＯ4、ｐＨ７．
５、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ ｄＵＴＰ、０．
２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭｄＣＴＰ、０．２ｍＭ
ｄＡＴＰαＳ、０．１ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ、１
２％（ｖ／ｖ）ヂメチルスルフォキシド、３％（ｖ／
ｖ）グリセロール（ｅｘｏ-クレノーおよびＨｉｎｃＩ
Ｉの保存溶液により供給）、２５０ｍｇヒト胎盤ＤＮ
Ａ、２．５ユニットｅｘｏ-クレノー（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、
および０、５０、５００または５，０００マイコバクテ
リウムツベルクロシスゲノム（分子）であった。慣用的
複数化増幅法に関しては、サンプルは、以下のプライマ
ーを含んだ：各５００ｎＭの配列番号１（Ｓ2A）、配列
番号２（Ｓ1A）、配列番号３（Ｓ1B）、配列番号４（Ｓ
2B）；および各２５ｎＭの配列番号５（Ｂ1A）、配列番
号６（Ｂ2A）、配列番号７（Ｂ1B）および配列番号８
（Ｂ2B）。アダプター介在複数化法に関しては、サンプ
ルは以下のプライマーを含んだ：各５００ｎＭの配列番
号２（図２のＳA）および配列番号３（図２のＳB）；各
５０ｎＭの配列番号１０（ＡA）および配列番号９
（ＡB）；各２５ｎＭの配列番号５（Ｂ1A）、配列番号
６（Ｂ2A）、配列番号７（Ｂ1B）および配列番号８（Ｂ
2B）。
【００２８】各４７μｌのサンプルを混合して、ｅｘｏ
-クレノーおよびＨｉｎｃＩＩ以外のすべての試薬を各
試薬の１０×濃縮溶液を用いて含ませた。ＭｇＣｌ
2は、すべての他の試薬（ｅｘｏ-クレノーおよびＨｉｎ
ｃＩＩ以外）の添加および混合後に添加してＫiＰＯ4、
ジメチルスルフォキシドおよびＭｇＣｌ2がそれぞれ４
５ｎＭ、１２％（ｖ／ｖ）および６ｍＭ以上の濃度で混
合された場合に生じる沈殿が起きないようにした。次
に、サンプルを温浴バス中で２分間加熱し、マイコバク
テリウムツベルクロシスＤＮＡを変成させた。温浴バス
から取り出した直後に沈殿が観察された。２分間、４０
℃においてインキュベートしてから渦巻き撹拌すること
により、高温沈殿物の大半は溶解した。ｅｘｏ-クレノ
ー（２．５ユニット／μｌ保存溶液を１μｌ）およびＨ
ｉｎｃＩＩ（７５ユニット／μｌ保存溶液を２μｌ）を
添加し、そしてサンプルを２時間４０℃においてインキ
ュベートした。
【００２９】増幅産物は、Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（前記）に記載されたとおり、プラ
イマー伸長により検出した。各サンプルの５μｌのアリ
コートを５μｌの４５ｍＭ ＫiＰＯ4、ｐＨ７．５，６
ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ ｄＵＴＰ、０．２ｍＭ
ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＡ
ＴＰαＳ、０．１ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡおよび２
μｌの５’−32Ｐ検出用プローブ保存溶液（５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１
μｌの５’−32Ｐ検出用プローブ）と混合した。標的Ａ
のための検出用プローブは配列番号１１であり、そして
標的Ｂのための検出用プローブは配列番号１２であっ
た。次に、１２μｌのサンプルを温浴バス中で１分間加
熱した。２分間、３７℃においてインキュベートした
後、２μｌの１ユニット／μｌｅｘｏ-クレノーを添加
し、そしてサンプルを１５分間、３７℃においてインキ
ュベートし、そして、０．５×ＴＢＥ中の５０％尿素を
１４μｌ加えた。
【００３０】サンプルを１分間、９５℃において加熱
し、８％変成ゲル電気泳動およびオートラジオグラフィ
ーにより分析した（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，
１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。結果を図
３に示す。レーン１〜８はＩＳ６１１０のＳＤＡを示
し、レーン９〜１６は１６Ｓ遺伝子配列のＳＤＡを示
す。増幅されたＩＳ６１１０（標的Ａ）は、配列番号１
１の検出用プローブの伸長による、慣用的複数化法に関
する３５マーおよび５６マー（レーン５〜８）およびア
ダプター介在複数化法に関する４４、４７および６８マ
ー（レーン１〜４）を示す。増幅されたＩ６Ｓ（標的
Ｂ）は、配列番号１２の検出用プローブの伸長による、
慣用的複数化法に関する２７マーおよび４８マー（レー
ン１３〜１６）およびアダプター介在複数化法に関する
３９、４２および６３マー（レーン９〜１２）を示す。
【００３１】アダプター介在複数化増幅法のみが、ＩＳ
６１１０および１６Ｓ標的の両方の十分な増幅物を生成
した。例えば、両標的配列に関するマイコバクテリウム
ツベルクロシス５０ゲノムのアダプター介在増幅（レー
ン３および１１）と、慣用的複数化（レーン７および１
５）を比較されたい。
【００３２】実施例２ この実施例は、図２に示されたアダプター介在複数化Ｓ
ＤＡを用いて、単一対のＳＤＡプライマーを用いて増幅
しうる２つの標的の生成を示す。第１標的配列（標的
「Ａ」）は、実施例１において用いられたマイコバクテ
リウムツベルクロシスのＩＳ６１１０インサーションエ
レメントのセグメントであった。第２標的配列（標的
「Ｂ」）は、プラスミドｐＭＡｖ２９（Ｊ．Ｗ．Ｕ．Ｆ
ｒｉｅｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，４，８７−１０５）に含まれるマ
イコバクテリウムアビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ ａｖｉｕｍ）由来の配列であった。増幅反応に供す
る前に、プラスミドｐＭＡｖ２９を制限酵素により切断
し、直鎖状にした。
【００３３】ＳＤＡは、Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，前記により記載されたとおりに通常
どおりに実施した。６７μｌの増幅反応物中の成分の最
終濃度は：４８．３ｍＭ ＫiＰＯ4（ｐＨ７．５）；
５．８ｍＭ ＭｇＣｌ2；０．９６ｍＭ各ｄＣＴＰ，ｄ
ＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＡＴＰαＳ；０．０９ｍｇ／ｍｌ
アセチル化ＢＳＡ；３％（ｖ／ｖ）グリセロール（ｅｘ
ｏ-クレノーおよびＨｉｎｃＩＩの保存溶液により供
給）、０．８５ｎｇ／μｌヒト胎盤ＤＮＡ；５．２ユニ
ットｅｘｏ-クレノー（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏ
Ｈ）；１５４ユニットＨｉｎｃＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）；
０，８，８３，８３０または８３００コピーのマイコバ
クテリウムツベルクロシスゲノミックＤＮＡおよびプラ
スミドｐＭＡｖ２９ＤＮＡであった。すべての反応物に
おいて、ゲノミックマイコバクテリウムツベルクロシス
およびプラスミドｐＭＡｖ２９のＤＮＡが等しい分子比
で存在した。反応混合物は、以下のプライマーも含ん
だ：各４５０ｎＭの配列番号１３（図２のＳA）および
配列番号１４（ＳB）；各４５ｎＭの配列番号１５
（ＡB）および配列番号１６（ＡA）；９ｎＭの配列番号
５（ＢA1）、配列番号６（ＢA2）、配列番号１７
（ＢB1）および配列番号１８（ＢB2）。
【００３４】ＨｉｎｃＩＩおよびｅｘｏ-クレノー以外
のすべての反応成分を混合し、そして９５℃において２
分間加熱し、そして３７℃の温浴バス中に３−５分間お
いた。酵素ＨｉｎｃＩＩおよびｅｘｏ-を次に添加し、
そして増幅混合物を３７℃において２時間インキュベー
トした。インキュベート後、サンプルを９５℃において
２時間加熱することにより反応を停止した。
【００３５】冷却後、反応混合物は、実施例１のとおり
に、５’32−Ｐ標識プライマー伸長を用いたＩＳ６１１
０またはｐＭＡｖ２９増幅産物の存在に関して分析し
た。各サンプルの１５μｌのアリコートを２μｌのプロ
ーブ保存溶液（０．６６μｌの５’32−Ｐ標識検出用プ
ローブ、１６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）お
よび３．３ｍＭ ＭｇＣｌ2）と混合した。ＩＳ６１１
０のための検出用プローブは配列番号１１であり、そし
てマイコバクテリウムアビウムのためのプローブは配列
番号１９であった。混合物を９５℃において２分間加熱
し、そして次に、３７℃の温浴バス中においた。３−５
分後、以下の成分を含む溶液３μｌを各サンプルに加え
た：０．２５ユニット／μｌ ｅｘｏ-クレノー；９ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）；１．８ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ2；および０．９ｍＭの各ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，
ｄＴＴＰ，ｄＡＴＰαＳ。混合物を３７℃において４５
分間インキュベートし、３０μｌの５０％尿素（０．５
×ＴＢＥ）の添加により伸長反応を停止した。次に、サ
ンプルを９５℃において２分間加熱し、そして２０μｌ
のアリコートに関して、１０％ポリアクリルアミドゲル
を用いた変成ゲル電気泳動、続くオートラジオグラフィ
ーにより分析した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前記）。
【００３６】この分析の結果を図４に示す。レーン１−
５において３５および５６ｎｔに示されたバンドは、Ｉ
Ｓ６１１０特異的検出用プライマー（配列番号１１）の
伸長に対応する。これらのレーンは、アダプター介在複
数化ＳＤＡを用いたわずか８マイコバクテリウムツベル
クロシスゲノムコピーからの検出可能なレベルにＩＳ６
１１０標的を増幅することを示す。レーン６〜１０にお
いて、顕著な５１および７２ｎｔのバンドはｐＭＡｖ２
９特異的検出用プローブ（配列番号１９）の伸長に対応
する。これらのレーンは、添加されたわずか８３コピー
のｐＭＡｖ２９が検出可能なレベルに増幅されたことを
示す（レーン８の薄いバンドを参照されたい）。増幅反
応は等モル量のｐＭＡｖ２９およびゲノミックマイコバ
クテリウムツベルクロシスＤＮＡを含んだが、各添加さ
れたゲノミックマイコバクテリウムツベルクロシスＤＮ
Ａから生じたシグナルは、各ｐＭＡｖ２９分子から生じ
たシグナルより実質的に大きかった。それは、マイコバ
クテリウムツベルクロシスＤＮＡがゲノムあたり約１０
コピーのＩＳ６１１０配列を含むのに対して、ｐＭＡｖ
２９はプラスミド分子あたりただひとつの標的コピーを
含むからである。このことを考慮すると、レーン３およ
び８（同じ増幅混合物の別の分析）は、添加されたわず
か８３コピーのｐＭＡｖ２９およびゲノミックマイコバ
クテリウムツベルクロシスＤＮＡからの、標的のアダプ
ター介在共増幅の成功を示す。両方の標的は、レーン１
および６、および２および７に示すとおり、高いレベル
の添加標的ＤＮＡが存在した場合にも容易に共増幅され
た。慣用的ＳＤＡ複数化法を用いたこれら同じ標的の共
増幅は、アダプター介在複数化ＳＤＡを用いた共増幅の
１０倍以下の効率であった。
【００３７】実施例３ この実施例は、ＩＳ６１１０に特異的な一対の増幅プラ
イマー（配列番号１および配列番号２）を用いた、図１
に示された方法による、ｐＭＡｖ２９標的配列およびＩ
Ｓ６１１０セグメントの共増幅を示す。アダプタープラ
イマー（配列番号２０および配列番号２１）を用いて、
両末端にＩＳ６１１０特異的配列を含むｐＭＡｖ２９標
的配列のコピーを生成した。これらの末端修飾ｐＭＡｖ
２９標的は、次に、ＩＳ６１１０特異的プライマーを用
いてＩＳ６１１０と共に共増幅された。
【００３８】ＳＤＡは、前の実施例により記載されたと
おりに通常どおりに実施した。５０μｌの増幅反応物中
の成分の最終濃度は、５０ｍＭ ＫiＰＯ4（ｐＨ７．
５）、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭの各ｄＴＴＰ，ｄＣ
ＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰαＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ
アセチル化ＢＳＡ、３％（ｖ／ｖ）１−メチル−２−ピ
ロリジノン（ＮＭＰ）、３％（ｖ／ｖ）グリセロール
（ｅｘｏ-クレノーおよびＨｉｎｃＩＩの保存溶液によ
り供給）、３００ｎｇヒト胎盤ＤＮＡ、３．０ユニット
ｅｘｏ-クレノー（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）；１
５０ユニットＨｉｎｃＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）；１，０００
コピーのマイコバクテリウムツベルクロシスのゲノミッ
クＤＮＡおよび１００，０００コピーのプラスミドｐＭ
Ａｖ２９ＤＮＡであった（実施例２のとおりに調製し
た）。反応混合物は、以下のプライマーも含んだ：各５
００ｎＭの配列番号１（図１のＳ1）および配列番号２
（Ｓ2）；各５０ｎＭの配列番号２０（Ａ1）および配列
番号２１（Ａ2）および各２５ｎＭの配列番号１８
（Ｂ1）、配列番号１７（Ｂ2）、配列番号５および配列
番号６。配列番号５および配列番号６は前記のとおり、
ＩＳ６１１０標的の生成のためのバンパープライマーと
して機能した。アダプタープライマー（配列番号２０お
よび配列番号２１）は、図５において「アダプター−」
と示された対照の反応から差し引かれた。
【００３９】ＨｉｎｃＩＩおよびｅｘｏ-クレノー以外
のすべての反応成分を混合し、そして９５℃において２
分間加熱し、そして３７℃の温浴バス中に３−５分間お
いた。酵素ＨｉｎｃＩＩおよびｅｘｏ-を添加した後、
増幅混合物を３７℃において２時間インキュベートし
た。サンプルを９５℃において２時間加熱することによ
り反応を停止した。
【００４０】冷却後、反応混合物は、前記のとおりに、
プライマー伸長による増幅産物の存在に関して分析し
た。各サンプルの５μｌのアリコートを（ｉ）４２．５
ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）；８．５ｍＭの
ＭｇＣｌ2；０．２ｍＭの各ｄＣＴＰ，ｃＧＴＰ，ｄＴ
ＴＰｄＡＴＰαＳを含む１０μｌの溶液；および（ｉ
ｉ）３μｌの32Ｐ−標識検出用プローブ保存溶液（０．
６６μＭ５’−32Ｐ−標識プローブ、１６ｍＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、および３．３ｍＭのＭｇＣ
ｌ2を含む）と混合した。ＩＳ６１１０のための検出用
プローブは配列番号１１であり、そしてｐＭＡｖ２９特
異的プローブは配列番号１９であった。これら混合物を
混合し、９５℃の温浴バス中で加熱した。３７℃温浴バ
ス中で３−５分間インキュベートした後、３μｌの０．
３４ユニット／μｌのｅｘｏ-クレノーを各混合物に添
加し、サンプルを３７℃において１５分間インキュベー
トした。伸長反応は、０．５×ＴＢＥ中の５０％尿素３
０μｌの添加により停止した。
【００４１】サンプルを９５℃において２分間加熱し、
そして２０μｌのアリコートに関して、前記のとおり、
最初に１０％ポリアクリルアミドゲルを用いた変成ゲル
電気泳動、そしてオートラジオグラフィーにより分析し
た。図５は、ゲルのオートラジオグラフィーを示す。レ
ーン１および２において３５おおび５６ｎｔと示された
バンドは、ＩＳ６１１０特異的プローブ（配列番号１
１）の伸長に対応する。レーン３および４において５１
および７２ｎｔと示されたバンドは、ｐＭＡｖ２９特異
的検出用プローブ（配列番号１９）の伸長に対応する。
レーン１および３は同じ（アダプター含有）増幅反応の
別の分析を示し、レーン２および４は同じ（アダプター
不含）増幅反応を示す。
【００４２】「アダプター＋」および「アダプター−」
両者の増幅反応混合物はＩＳ６１１０標的配列の増幅に
必要なプライマーを含んだので、レーン１および２の両
方における強いＩＳ６１１０特異的バンドの存在が期待
される。「アダプター−」レーン中の、生成物による強
いバンドは、アダプター配列がＩＳ６１１０の増幅に不
要であることを示し、そして、「アダプター＋」レーン
中のほぼ同じ強度の対応する生成物バンドは、アダプタ
ーの存在がＩＳ６１１０の増幅を顕著に妨害しないこと
を示す。
【００４３】対照的に、アダプターは明らかにｐＭＡｖ
２９標的配列の増幅に必要であり、レーン４（「アダプ
ター−」）ではなく、レーン３（「アダプター＋」）中
のｐＭＡｖ２９特異的生成物のバンドの存在により示さ
れる。このことは、ＩＳ６１１０に特異的な一対の増幅
プライマーを用いたｐＭＡｖ２９標的配列のアダプター
介在増幅を示す。さらに、レーン１と３を共に考察する
と、ｐＭＡｖ２９とＩＳ６１１０標的配列の共増幅が示
される。
【００４４】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTGAAGTAAC CGACTATTGT TGACACTGAG ATCCCCT 37 配列番号：２ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACGGCGTA CTCGACC 37 配列番号：３ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTCTATAGTC GGTTACTTGT TGACGTCGCG TTGTTC 36 配列番号：４ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTCCATAGTC CCAATCTTGT TGACGCTCAC AGTTA 35 配列番号：５ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TGGACCCGCC AAC 13 配列番号：６ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CGCTGAACCG GAT 13 配列番号：７ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CGGAATTACT GGG 13 配列番号：８ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AGTCTGCCCG TATC 14 配列番号：９ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GGCGTACTCG ACCACGCTCA CAGTTA 26 配列番号：１０ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GTCGCGTTGT TCACTGAGAT CCCCT 25 配列番号：１１ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CGTTATCCAC CATAC 15 配列番号：１２ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AAATCTCACG GCT 13 配列番号：１３ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GCATTATAGT ACCTGTCTGT TGACACTGAG ATCCCCT 37 配列番号：１４ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TTGAATAGTA GGTAAGTTGT TGACACTTGT AAGAGCC 37 配列番号：１５ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GACACTGAGA TCCCCTTGCG AGTGGGAAC 29 配列番号：１６ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GACACTTGTA AGAGCCAGGC GTACTCGACC 30 配列番号：１７ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TCCTCGGGCT CCA 13 配列番号：１８ 配列の長さ：１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TGGCCAAACT GTG 13 配列番号：１９ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CGCAAGGTTT TTGGAG 16 配列番号：２０ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GACACTGAGA TCCCCTTGCG AGTGGGAAC 29 配列番号：２１ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GACGGCGTAC TCGACCACTT GTAAGAGCC 29
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、標的配列の両方の末端にアダプター配
列を付加するための本発明の方法を示す。
【図２】図２は、本発明の２つの標的配列の共増幅法を
示す。
【図３】図３は、実施例１の実験の結果を示すオートラ
ジオグラフィーである。
【図４】図４は、実施例２の実験の結果を示すオートラ
ジオグラフィーである。
【図５】図５は、実施例３の実験の結果を示すオートラ
ジオグラフィーである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/566 (72)発明者 ジェームズ・ジー・ナデュー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27514，チャペル・ヒル，コーカー・レイ ン 710 (72)発明者 マイケル・シー・リトル アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27610，ラレイ，ウィンウェイ・ドライブ 1729

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）第１増幅プライマーを第１標的配列
    の３’末端にハイブリダイズさせ、ポリメラーゼにより
    該第１増幅プライマーを伸長させて上記第１標的配列に
    相補的な第１伸長産物を形成させ、そして該第１伸長産
    物を置換するが、その際、上記第１増幅プライマーは
    ３’に標的結合配列を有し、かつ、５’に二本鎖のうち
    の一方の鎖が修飾されている部位において一方の鎖にニ
    ックを入れることができる制限酵素の認識部位を有する
    ものであり； （ｂ）上記第１標的配列に相補的な３’末端部分を有す
    る第１アダプタープライマーをその３’部分において上
    記第１伸長産物にハイブリダイズさせるが、その際、上
    記第１アダプタープライマーの３’末端は、第１伸長産
    物にハイブリダイズすることができる標的結合配列を含
    み、そして上記第１アダプタープライマーの５’末端
    は、第２標的配列にハイブリダイズすることができる第
    ２増幅プライマーの３’標的結合配列と実質的に同一で
    あり； （ｃ）ポリメラーゼにより上記第１アダプタープライマ
    ーを伸長して第２伸長産物を形成し、そして第２伸長産
    物を置換し； （ｄ）第２増幅プライマーを第２標的配列の３’末端に
    ハイブリダイズさせ、ポリメラーゼにより該第２増幅プ
    ライマーを伸長させて上記第２標的配列に相補的な第３
    伸長産物を形成させ、そして該第３伸長産物を置換する
    が、その際、上記第２増幅プライマーは３’に標的結合
    配列を有し、かつ、５’に二本鎖のうちの一方の鎖が修
    飾されている部位において一方の鎖にニックを入れるこ
    とができる制限酵素の認識部位を有するものであり； （ｅ）上記第２標的配列に相補的な３’末端部分を有す
    る第２アダプタープライマーをその３’部分において上
    記第３伸長産物にハイブリダイズさせるが、その際、上
    記第２アダプタープライマーの３’末端は、第３伸長産
    物にハイブリダイズすることができる標的結合配列を含
    み、そして上記第２アダプタープライマーの５’末端
    は、上記第１増幅プライマーの標的結合配列と実質的に
    同一であり； （ｆ）ポリメラーゼにより上記第２アダプタープライマ
    ーを伸長して第４伸長産物を形成し、そして第４伸長産
    物を置換し；そして （ｇ）上記第１および第２増幅プライマーを用いてＳＤ
    Ａ（鎖置換反応）反応において上記第２および第４伸長
    産物を同時に増幅する； 工程からなる、ＳＤＡによる２つの標的核酸配列の同時
    増幅法。
  2. 【請求項２】第１、第２、第３および第４伸長産物がバ
    ンパープライマーの伸長により置換される、請求項１記
    載の方法。
  3. 【請求項３】さらに、 （ａ）第１アダプタープライマーを第１標的配列の第２
    鎖の３’末端にハイブリダイズさせ、該第１プライマー
    を伸長させて第１標的配列の第２鎖に相補的な第５伸長
    産物を形成させ、そして該第５伸長産物を置換し； （ｂ）第１標的配列の第２鎖の相補鎖の３’末端におい
    て第１増幅プライマーを第５伸長産物にハイブリダイズ
    させ、ポリメラーゼにより該第１増幅プライマーを伸長
    させて第７伸長産物を形成させ、そして該第７伸長産物
    を置換し； （ｃ）第２標的配列の第２鎖の３’末端に第２アダプタ
    ー配列をハイブリダイズさせ、該第２アダプタープライ
    マーを伸長して第２標的配列の第２鎖に相補的な第６伸
    長産物を置換し、そして該第６伸長産物を置換し； （ｄ）第２標的配列の第２鎖に相補的な３’末端におい
    て第２増幅プライマーを第６伸長産物にハイブリダイズ
    させ、ポリメラーゼにより該第２増幅プライマーを伸長
    して第８伸長産物を形成させ、そして該第８伸長産物を
    置換し；そして （ｅ）第１および第２増幅プライマーを用いてＳＤＡに
    より第７および第８伸長産物を同時に増幅する； 工程を含む、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】（ａ）第１アダプタープライマーを各標的
    配列の３’末端にハイブリダイズさせるが、その際、該
    アダプタープライマーの３’末端は、標的配列にハイブ
    リダイズすることができる標的結合配列を含み、そして
    該アダプタープライマーの５’末端は、第１アダプター
    配列を含み； （ｂ）ポリメラーゼにより上記第１アダプタープライマ
    ーを伸長して各標的配列に相補的な、各標的配列に関す
    る第１伸長産物を生成し、そして該第１伸長産物を置換
    し； （ｃ）各標的配列に相補的な３’末端において第２アダ
    プタープライマーを各標的配列の第１伸長産物にハイブ
    リダイズさせるが、その際、該第２アダプタープライマ
    ーの３’末端は、第１伸長産物にハイブリダイズするこ
    とができる標的結合配列を含み、そして該第１アダプタ
    ープライマーの５’末端は、第２アダプター配列を含
    み； （ｄ）ポリメラーゼにより上記第２アダプタープライマ
    ーを伸長して各標的配列に関する第２伸長産物を生成
    し、そして該第２伸長産物を置換し；そして （ｇ）上記第１および第２アダプター配列に実質的に同
    一の３’標的結合配列および制限酵素の認識部位の一方
    の鎖が修飾されている二本鎖の一方の鎖にニックを入れ
    ることができる制限酵素の５’認識部位を含む増幅プラ
    イマーを用いて、ＳＤＡ反応において標的配列の第２伸
    長産物を同時に増幅する； 工程からなる、ＳＤＡによる複数の標的核酸配列の同時
    増幅法。
  5. 【請求項５】第１および第２アダプター配列が実質的に
    同一であり、かつ、各標的配列の第２伸長産物が単一の
    増幅プライマーを用いて増幅される、請求項４記載の方
    法。
  6. 【請求項６】第１および第２アダプター配列が実質的に
    同一でなく、かつ、各標的配列の第２伸長産物が一対の
    増幅プライマーを用いて増幅されるが、その際、標的結
    合配列を有する上記プライマー対の一方が第１アダプタ
    ー配列と実質的に同一であり、かつ、上記プライマー対
    の他方が第２アダプター配列に実質的に同一な標的結合
    配列を有する、請求項４記載の方法。
  7. 【請求項７】上記第１および第２伸長産物が、バンパー
    プライマーの伸長により置換される、請求項５または６
    記載の方法。
  8. 【請求項８】（ａ）第２アダプタープライマーを各標的
    配列の第２鎖の３’末端にハイブリダイズさせ、第２ア
    ダプタープライマーを伸長させて各標的ハイブリダイズ
    の第２鎖に相補的な第３伸長産物を形成し、そして、該
    第３伸長産物を置換し； （ｂ）各標的ハイブリダイズに相補的な３’末端におい
    て第１アダプタープライマーを各標的配列の第３伸長産
    物にハイブリダイズさせ、第１アダプタープライマーを
    伸長して第４伸長産物を形成し、そして該第４伸長産物
    を置換し；そして （ｃ）増幅プライマーを用いてＳＤＡ反応により標的配
    列の第４伸長産物を同時に増幅する工程をさらに含む、
    請求項４記載の方法。
  9. 【請求項９】（ａ）３’標的結合配列を含む第１増幅プ
    ライマーを第１標的配列の３’末端にハイブリダイズさ
    せ、ポリメラーゼにより該第１増幅プライマーを伸長さ
    せて上記第１標的配列に相補的な第１伸長産物を形成さ
    せ、そして該第１伸長産物を置換し； （ｂ）上記第１標的配列に相補的な３’末端部分を有す
    る第１アダプタープライマーをその３’部分において上
    記第１伸長産物にハイブリダイズさせるが、その際、上
    記第１アダプタープライマーの３’末端は、第１伸長産
    物にハイブリダイズすることができる標的結合配列を含
    み、そして上記第１アダプタープライマーの５’末端
    は、第２標的配列にハイブリダイズすることができる第
    ２増幅プライマーの３’標的結合配列と実質的に同一で
    あり； （ｃ）ポリメラーゼにより上記第１アダプタープライマ
    ーを伸長して第２伸長産物を形成し、そして第２伸長産
    物を置換し； （ｄ）第２増幅プライマーの３’標的結合配列を第２標
    的配列の３’末端にハイブリダイズさせ、ポリメラーゼ
    により該第２増幅プライマーを伸長させて上記第２標的
    配列に相補的な第３伸長産物を形成させ、そして該第３
    伸長産物を置換し； （ｅ）上記第２標的配列に相補的な３’末端部分を有す
    る第２アダプタープライマーをその３’部分において上
    記第３伸長産物にハイブリダイズさせるが、その際、上
    記第２アダプタープライマーの３’末端は、第３伸長産
    物にハイブリダイズすることができる標的結合配列を含
    み、そして上記第２アダプタープライマーの５’末端
    は、上記第１増幅プライマーの標的結合配列と実質的に
    同一であり； （ｆ）ポリメラーゼにより上記第２アダプタープライマ
    ーを伸長して第４伸長産物を形成し、そして第４伸長産
    物を置換し；そして （ｇ）上記第１および第２増幅プライマーを用いてプラ
    イマー伸長増幅反応において上記第２および第４伸長産
    物を同時に増幅する； 工程からなる、プライマー伸長増幅反応による２つの標
    的核酸配列の同時増幅法。
  10. 【請求項１０】（ａ）第１アダプタープライマーを各標
    的配列の３’末端にハイブリダイズさせるが、その際、
    アダプタープライマーの３’末端は、標的配列にハイブ
    リダイズすることができる標的結合配列を含み、そして
    アダプタープライマーの５’末端は第１アダプター配列
    を含み； （ｂ）ポリメラーゼにより上記第１アダプタープライマ
    ーを伸長して各標的配列に相補的な、各標的配列に関す
    る第１伸長産物を生成し、そして第１伸長産物を置換
    し； （ｃ）各標的配列に相補的な３’末端において第２アダ
    プタープライマーを各標的配列の第１伸長産物にハイブ
    リダイズさせるが、その際、第２アダプタープライマー
    の３’末端は、第１伸長産物にハイブリダイズすること
    ができる標的結合配列を含み、そして第２アダプタープ
    ライマーの５’末端は、第２アダプター配列を含み； （ｄ）ポリメラーゼにより該第２増幅プライマーを伸長
    させて各標的配列に関する第２伸長産物を形成させ、そ
    して該第２伸長産物を置換し；そして （ｅ）上記第１および第２アダプター配列の実質的に同
    一な３’標的結合配列を含む増幅プライマーを用いてプ
    ライマー伸長増幅反応において上記標的配列の第２産物
    を同時に増幅する； 工程からなる、プライマー伸長増幅反応による複数の標
    的核酸配列の同時増幅法。
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