JP2022545280A - Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍを検出するための組成物、方法、およびキット - Google Patents

Abstract

梅毒の原因物質であるＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ、プライマーセット、方法、反応混合物、およびキットが提示される。開示されるアッセイは、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ核酸の検出に対して高感度かつ特異的である。Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸配列は、３０コピー／ｍｌのみのモデルインビトロ転写物を有する試験試料を使用して、１００％陽性のレベルで検出することができる。交差反応する可能性のある非標的微生物の存在は、アッセイ結果に悪影響を与えない。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願
本出願は、２０１９年８月２３日に出願された、米国仮特許出願第６２／８９１，１８１号の利益を主張する。上記先行出願の開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本開示は、核酸診断に関する。さらにより具体的には、本開示は、梅毒を引き起こす感染性病原体であるＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を検出するためのアッセイに関する。

梅毒は、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍというスピロヘータによって引き起こされる性感染症である。この運動性細菌はまた、妊娠後期の経胎盤通過によって胎児に感染し、先天性梅毒を引き起こす可能性がある。無症候性の潜伏期間は３～９０日間（平均２１日間）続く可能性があり、曝露と検出可能な感染との間にかなりのウィンドウ期間が残る。（Ｈｅｎａｏ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｅｒｏｌ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ．４（２）：１１４－１２２（２０１４））

従来の診断検査は、臨床所見および血清学的アッセイの組み合わせに依存してきた。これは、例えば、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍタンパク質に対抗する抗体を検出することを伴う場合がある。異なる手順は、暗視野顕微鏡検査、ＰＣＲ、およびＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに対する直接蛍光抗体検査を伴う場合がある。これらのツールが利用可能である臨床試験センターはほとんどないが、血清学的変換の前に梅毒の診断を受けることは可能である。（Ｈｅｎａｏ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，（２０１４））

Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの完全なゲノム配列の分析は、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：３７５－３８８（１９９８）においてＦｒａｓｅｒらによって公開されている。興味深いことに、ゲノム全体は、わずか約１．１４Ｍｂｐで構成されており、１０４１個のオープンリーディングフレームを含む。この小型のゲノムサイズは、哺乳類の宿主によって提供される多くの機能へのこの生物の依存を反映している可能性が高い。
梅毒の臨床症状は大きく異なり得、他の感染症と混同されることもあり、他の状態（妊娠を含む）について偽陽性の非トレポネーマ検査が報告されていることを考えると、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに特異的な高感度アッセイが必要である。

Ｈｅｎａｏ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｅｒｏｌ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ．４（２）：１１４－１２２（２０１４） Ｆｒａｓｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：３７５－３８８（１９９８）

第１の態様では、本開示は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブに関する。このハイブリダイゼーションプローブは、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、配列番号１９の少なくとも１３個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列またはその相補体と、それに結合した検出可能な標識とを含む。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、最大４７塩基の長さである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、フルオロフォア部分と、クエンチャー部分と、２’－Ｏ－メチル置換を有するリボフラノシル部分を含む少なくとも１つのヌクレオチド類似体とをさらに含む。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、非ヌクレオチドリンカーおよび一対の相互作用標識をさらに含んでもよい。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、分子トーチハイブリダイゼーションプローブであり得る。例えば、相互作用標識の対は、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含み得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの非ヌクレオチドリンカーは、Ｃ９リンカーである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７のいずれかであり、これらの配列のそれぞれは、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする。いくつかの実施形態において、配列番号１９の少なくとも１３個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列は、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、配列番号２１の１３～２２個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列またはその相補体である。例えば、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２６および配列番号２７のいずれかであり得、これらの配列のそれぞれが、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、２’－Ｏ－メチル置換を有するリボフラノシル部分を有する少なくとも１つのヌクレオチド類似体をさらに含む。

第２の態様では、本開示は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ２３Ｓリボソーム核酸配列を増幅するためのプライマーセットに関する。プライマーセットは、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の少なくとも１８個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列を有する第１のプライマーであって、最大５０塩基の長さの第１のプライマーを含む。プライマーセットはさらに、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５の少なくとも１７個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列を有する第２のプライマーを含み、この第２のプライマーは、最大５０塩基の長さであり、また第１および第２のプライマーのうちの少なくとも１つが、それぞれの標的ハイブリダイズ配列の上流に結合したファージプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のプライマーは、第１の標的ハイブリダイズ配列の上流に結合したファージプロモーター配列を含む。例えば、ファージプロモーター配列は、Ｔ７プロモーター配列を含み得る。いくつかの実施形態において、第１のプライマーの標的ハイブリダイズ配列は、その３’末端が配列番号７で終わる。いくつかの実施形態において、第１のプライマーの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号７および配列番号８のいずれかである。いくつかの実施形態において、第１のプライマーの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号６、配列番号７、および配列番号８のいずれかである。いくつかの実施形態において、第１のプライマーは、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群から選択されるプロモーター－プライマーである。いくつかの実施形態において、第２のプライマーの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１３の１７～２０個の連続する塩基である。いくつかの実施形態において、第２のプライマーの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１６である。いくつかの実施形態において、第２のプライマーの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１４の１７～２０個の連続する塩基である。いくつかの実施形態において、第２のプライマーの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１７または配列番号１６である。いくつかの実施形態において、第２のプライマーの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１５の１７～２０個の連続する塩基である。例えば、第２のプライマーの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１８または配列番号１７であり得る。いくつかの実施形態において、第１のプライマーは配列番号１１であり、第２のプライマーは配列番号１８である。いくつかの実施形態において、第１のプライマーは配列番号１２であり、第２のプライマーは配列番号１８である。

第３の態様では、本開示は、試料がＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を含むかどうかを決定するための方法に関する。この方法は、（ａ）試料をプライマーのセットと接触させるステップと、（ｂ）インビトロ核酸増幅反応においてプライマーのセットを使用して試料中に存在し得る任意のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を増幅させ、それにより、試料がＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を含む場合、増幅産物が産生されるステップと、（ｃ）検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを使用して、ステップ（ｂ）で産生された任意の増幅産物を検出するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の結果から、試料がＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を含むかどうかの指標として、ステップ（ｂ）において増幅産物が産生されたかどうかを決定するステップと、を含む。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブは、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、配列番号１９の少なくとも１３個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列またはその相補体を含み、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブが最大４７塩基の長さである検出可能な標識をさらに含む。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブは、非ヌクレオチドリンカーおよび一対の相互作用標識を含む分子トーチハイブリダイゼーションプローブである。いくつかの実施形態において、分子トーチハイブリダイゼーションプローブの一対の相互作用標識は、フルオロフォアおよびクエンチャーを含む。いくつかの実施形態において、分子トーチハイブリダイゼーションプローブの非ヌクレオチドリンカーは、標的ハイブリダイゼーション配列の１つの末端に位置付けられたＣ９リンカーである。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブは、フルオロフォア部分、クエンチャー部分、および２’－Ｏ－メチル置換を有するリボフラノシル部分を含む少なくとも１つのヌクレオチド類似体をさらに含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）のプライマーのセットは、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、第１のプライマーは、最大５０塩基の長さであり、配列番号３の少なくとも１８個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列を含み、第２のプライマーは最大５０塩基の長さであり、配列番号１３の少なくとも１７個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列を含み、第１および第２のプライマーの少なくとも１つは、それぞれの標的ハイブリダイズ配列の上流に結合したファージプロモーター配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）および（ｂ）は同時に起こり、増幅反応はリアルタイム増幅反応である。いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）で検出された増幅産物は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの２３Ｓ ｒＲＮＡとは反対のセンスのＲＮＡアンプリコンである。

第４の態様では、本開示は、試験試料中に存在し得るＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を検出するための反応混合物に関する。反応混合物は、それぞれ、試験試料と、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマーセットであって、第１のプライマーは、配列番号３の少なくとも１８個の連続する塩基に相補的な塩基配列を含み、第２のプライマーは、ポリメラーゼ媒介プライマー伸長反応において配列番号１をテンプレートとして使用する場合に第１のプライマーの伸長産物に相補的な塩基配列を含む、オリゴヌクレオチドプライマーセットと、検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブであって、このプローブが、オリゴヌクレオチドプライマーセットおよび配列番号１の塩基配列を含むテンプレートを使用して実施される核酸増幅反応において産生されるアンプリコンに相補的な塩基配列を含む、ハイブリダイゼーションプローブとを含み得る。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブは、フルオロフォア、クエンチャー、および非ヌクレオチドリンカーのそれぞれを含む分子トーチハイブリダイゼーションプローブである。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブは、２’－Ｏ－メチル置換を有するリボフラノシル部分を有する少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態において、アンプリコンに相補的な塩基配列は、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基置換を可能にし、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１のプライマーは、配列番号８、配列番号７、および配列番号６からなる群から選択される３’末端配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のプライマーは、最大５０塩基の長さであり、配列番号３の少なくとも１８個の連続する塩基に相補的な配列の上流にプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモーター配列は、Ｔ７プロモーター配列である。いくつかの実施形態において、第２のプライマーは、最大５０塩基の長さであり、配列番号１３の少なくとも１７個の連続した塩基を含む。いくつかの実施形態において、第２のプライマーは、配列番号１８、配列番号１７、および配列番号１６からなる群から選択される３’末端を含む。いくつかの実施形態において、アンプリコンは、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの２３Ｓ ｒＲＮＡと反対の極性を有するＲＮＡアンプリコンであり、その結果、ＲＮＡアンプリコンは、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的である。いくつかの実施形態において、反応混合物は、分子トーチハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズされたＲＮＡアンプリコンを含む。いくつかの実施形態において、核酸増幅反応は、転写関連増幅反応である。いくつかの実施形態において、転写関連増幅反応は、転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応である。

第５の態様では、本開示は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を検出するための試薬のキットに関する。キットは、オリゴヌクレオチドプライマーのセットを含んでもよく、セットの第１のプライマーは、配列番号３の少なくとも１８個の連続する塩基に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含み、セットの第２のプライマーは、ポリメラーゼ媒介プライマー伸長反応において配列番号１をテンプレートとして使用する場合に第１のプライマーの伸長産物に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む。キットはさらに、配列番号１９の少なくとも１３個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列またはその相補体を含み、フルオロフォア部分、クエンチャー部分、非ヌクレオチドリンカー、および２’－Ｏ－メチル置換を有するリボフラノシル部分を含む少なくとも１つのヌクレオチド類似体のそれぞれをさらに含む、最大５０塩基の長さの分子トーチハイブリダイゼーションプローブを含み得る。プライマーのセットを使用してインビトロ核酸増幅反応を実施するための１つ以上の試薬もあり得る。いくつかの実施形態において、配列番号１９の少なくとも１３個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列またはその相補体は、配列番号２１の１３～２２個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列またはその相補体である。いくつかの実施形態において、分子トーチハイブリダイゼーションプローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２６および配列番号２７からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、分子トーチハイブリダイゼーションプローブの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１および第２のプライマーの各々は、最大５０塩基の長さである。いくつかの実施形態において、第１のプライマーの標的ハイブリダイズ配列の上流に結合したファージプロモーター配列が存在する。いくつかの実施形態において、ファージプロモーター配列は、Ｔ７プロモーター配列である。いくつかの実施形態において、第１のプライマーの標的ハイブリダイズ配列は、その３’末端が配列番号７で終わる。いくつかの実施形態において、第１のプライマーの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１のプライマーの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１のプライマーは、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群から選択されるプロモーター－プライマーである。いくつかの実施形態において、第２のプライマーの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号１３の１７～２０個の連続する塩基である。いくつかの実施形態において、１つ以上の試薬は、逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのそれぞれを含む。

図１Ａ～１Ｆは、反応時間（ｘ軸）の関数としてバックグラウンドを差し引いた蛍光性（ｙ軸）を示す図式的なリアルタイム実行曲線である。図１Ａは、システムＳ２の結果を示している。図１Ｂは、システムＳ３の結果を示している。図１Ｃは、システムＳ４の結果を示している。 図１Ａ～１Ｆは、反応時間（ｘ軸）の関数としてバックグラウンドを差し引いた蛍光性（ｙ軸）を示す図式的なリアルタイム実行曲線である。図１Ａは、システムＳ２の結果を示している。図１Ｂは、システムＳ３の結果を示している。図１Ｃは、システムＳ４の結果を示している。 図１Ａ～１Ｆは、反応時間（ｘ軸）の関数としてバックグラウンドを差し引いた蛍光性（ｙ軸）を示す図式的なリアルタイム実行曲線である。図１Ａは、システムＳ２の結果を示している。図１Ｂは、システムＳ３の結果を示している。図１Ｃは、システムＳ４の結果を示している。 図１Ａ～１Ｆは、反応時間（ｘ軸）の関数としてバックグラウンドを差し引いた蛍光性（ｙ軸）を示す図式的なリアルタイム実行曲線である。図１Ｄは、システムＳ５の結果を示している。図１Ｅは、システムＳ６の結果を示している。図１Ｆは、システムＳ７の結果を示している。すべての場合において、「Ｔｐａｌ」はＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ標的核酸を使用して得られた結果を指し、「Ｔｄｅｎｔ」はＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ標的核酸を使用して得られた結果を指す。 図１Ａ～１Ｆは、反応時間（ｘ軸）の関数としてバックグラウンドを差し引いた蛍光性（ｙ軸）を示す図式的なリアルタイム実行曲線である。図１Ｄは、システムＳ５の結果を示している。図１Ｅは、システムＳ６の結果を示している。図１Ｆは、システムＳ７の結果を示している。すべての場合において、「Ｔｐａｌ」はＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ標的核酸を使用して得られた結果を指し、「Ｔｄｅｎｔ」はＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ標的核酸を使用して得られた結果を指す。 図１Ａ～１Ｆは、反応時間（ｘ軸）の関数としてバックグラウンドを差し引いた蛍光性（ｙ軸）を示す図式的なリアルタイム実行曲線である。図１Ｄは、システムＳ５の結果を示している。図１Ｅは、システムＳ６の結果を示している。図１Ｆは、システムＳ７の結果を示している。すべての場合において、「Ｔｐａｌ」はＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ標的核酸を使用して得られた結果を指し、「Ｔｄｅｎｔ」はＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ標的核酸を使用して得られた結果を指す。 図２Ａ～２Ｂは、反応時間（ｘ軸）の関数としてバックグラウンドを差し引いた蛍光性（ｙ軸）を示す図式的なリアルタイム実行曲線である。図２Ａは、システムＳ５のオリゴヌクレオチドを使用した二相性増幅の結果を示している。図２Ｂは、システムＳ７のオリゴヌクレオチドを使用した二相性増幅の結果を示している。 図２Ａ～２Ｂは、反応時間（ｘ軸）の関数としてバックグラウンドを差し引いた蛍光性（ｙ軸）を示す図式的なリアルタイム実行曲線である。図２Ａは、システムＳ５のオリゴヌクレオチドを使用した二相性増幅の結果を示している。図２Ｂは、システムＳ７のオリゴヌクレオチドを使用した二相性増幅の結果を示している。 図３Ａ～３Ｂは、反応時間（ｘ軸）の関数としてバックグラウンドを差し引いた蛍光性（ｙ軸）を示す図式的なリアルタイム実行曲線である。図３Ａは、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ検出アッセイの感度を示している。図３Ｂは、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ核酸の検出が非常に特異的であることを示している。すべての場合において、「Ｔｐａｌ」は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ標的核酸を使用して得られた結果を指す。 図３Ａ～３Ｂは、反応時間（ｘ軸）の関数としてバックグラウンドを差し引いた蛍光性（ｙ軸）を示す図式的なリアルタイム実行曲線である。図３Ａは、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ検出アッセイの感度を示している。図３Ｂは、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ核酸の検出が非常に特異的であることを示している。すべての場合において、「Ｔｐａｌ」は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ標的核酸を使用して得られた結果を指す。

序文および概要
本開示は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに特異的な高感度アッセイの臨床的必要性に対する解決策を提供する。例えば、この細菌について試験されている個体から採取されたスワブから得られる試験試料中にＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍが存在するかを決定するために有用な方法を特徴とする。Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの存在を決定するための標本は、生殖管、培養物、細菌溶解物、および他のサンプル培地から入手することができる。

本開示はまた、例えば、ヒトの尿道、肛門管、気道、または下部生殖管から得られる試験試料中にＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍが存在するかを決定するために有用なオリゴヌクレオチドを特徴とすることによって、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに特異的なアッセイの臨床的必要性に対する解決策を提供する。特徴とするオリゴヌクレオチドは、試験試料中のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する標的核酸配列を検出、固定化、および／または増幅するためのハイブリダイゼーションアッセイプローブ、捕捉プローブ、および／または増幅プライマーであり得る。特に開示されるのは、２３Ｓ ｒＲＮＡまたはその相補体に由来する配列中のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍを検出するための標的領域である。

本開示の一実施形態では、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸、またはその相補体に存在する２３Ｓ ｒＲＮＡ標的領域にハイブリダイズして、試験試料中のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの存在を示す検出可能なプローブ：標的ハイブリッドを形成するハイブリダイゼーションアッセイプローブが提供される。この実施形態のプライマーおよびプローブは、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドであって、標的結合領域の塩基配列が（配列番号１）の塩基配列またはその相補体内に含まれ、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基置換を可能にするオリゴヌクレオチドと、バックボーン修飾または類似体とを含む。

オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ（または単に「プローブ」）は、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、非Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ生物に由来する核酸よりも、特にＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａに由来する核酸よりも、標的核酸を優先的に検出するために使用することができる。

好ましいプローブの標的結合領域は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせを含み得るか、または核酸類似体（例えば、ペプチド核酸）もしくは１つ以上の修飾ヌクレオシド（例えば、２’－Ｏ－メチル置換を有するリボフラノシル部分を有するリボヌクレオシド）を含み得る。本開示のプローブは、好ましくは、少なくとも１３個の塩基、および最大２２、２５、５０、またはさらに１００個の塩基の長さのオリゴヌクレオチドである。最も好ましくは、本開示のハイブリダイゼーションプローブは、列挙された配列からなる核酸または核酸類似体であり、任意に検出可能な標識またはレポーター基を含む。

必要ではないが、プローブは、検出可能な標識または相互作用する標識の群を含むことができる。標識は、放射性同位体、酵素、酵素補因子、酵素基質、色素、ハプテン、化学発光分子、蛍光分子、リン光分子、電気化学発光分子、クロモフォア、記載された条件下で標的核酸に安定して結合することができない塩基配列領域、およびこれらの混合物を含むが、これらに限定されない任意の好適な標識物質であり得る。使用可能な相互作用する標識の群には、酵素／基質、酵素／補因子、フルオロフォア／クエンチャー、発光物／付加物、色素二量体、およびＦｏｒｒｅｓｔｅｒエネルギー移動対が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、プローブは、均一なアッセイ形式で検出することができる化学発光標識などの均一な検出可能な標識を含む。好ましい化学発光標識の例には、アクリジニウムエステル標識が含まれる。

本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、標的結合領域の塩基配列に加えて、ストリンジェントな条件下で標的生物（すなわち、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ）に由来する核酸に安定して結合しない１つ以上の塩基配列を含み得る。例として、追加の塩基配列は、捕捉プローブの固定化プローブ結合領域を構成し得、固定化プローブ結合領域は、例えば、ストリンジェントな条件下で固体支持体に直接的または間接的に結合したポリヌクレオチドの５’ポリ（ｄＴ）領域にハイブリダイズする３’ポリ（ｄＡ）領域で構成される。追加の塩基配列はまた、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７プロモーター）による開始もしくは伸長を増強する５’配列であり得る。第１の配列が、例えば、「分子ビーコン」プローブに組み込まれる場合、複数の追加の塩基配列が含まれ得る。分子ビーコンは、Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔａｂｌｙ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｄｕａｌ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ，Ａｓｓａｙｓ ａｎｄ Ｋｉｔｓ”、米国特許第５，９２５，５１７号によって開示されており、少なくとも部分的に互いに相補的な領域を有する２つの塩基配列によって結合される標的結合領域を含む。「分子トーチ」は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸配列またはＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの存在を示す増幅産物を検出するために使用できる二重標識構造化ハイブリダイゼーションプローブのさらに別の例である。本明細書の他の場所で考察しているように、分子トーチハイブリダイゼーションプローブは、Ｂｅｃｋｅｒらによって、米国特許第６，３６１，９４５号で開示されている。分子トーチは、例えば、非ヌクレオチド（例えば、Ｃ９）リンカーによって標的結合領域に直接結合した追加の塩基配列を含み得る。

核酸ハイブリダイゼーションまたは核酸増幅を可能にする条件下で、１つ以上のオリゴヌクレオチドと核酸増幅産物との間に形成される安定な核酸二本鎖を含む組成物も企図される。例えば、天然に存在するｒＲＮＡテンプレートまたは標的と反対の極性を有するＲＮＡ増幅産物が存在し得、増幅産物は、合成オリゴヌクレオチド（例えば、プライマーまたは検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブ）にハイブリダイズされ得る。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションプローブは、フルオロフォアおよびクエンチャーを含む二重標識ハイブリダイゼーションプローブであり得る。このようなプローブは、分子ビーコン、分子トーチ、および加水分解プローブを含む。

別の実施形態では、本開示は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ生物が試験試料中に存在するかを決定するために有用なプローブ混合物を企図する。例えば、これらの生物の存在を決定するために、プローブミックスは、本明細書に記載のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍプローブのうちの１つ以上を含むことができる。

さらなる実施形態では、本開示は、固定化プローブ結合領域および標的結合領域を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む捕捉プローブを提供する。捕捉プローブの固定化プローブ結合領域は、ストリンジェントな条件下で試験試料中に存在する固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドに安定してハイブリダイズすることができる任意の塩基配列を含み得る。好ましくは、固定化プローブ結合領域は、捕捉プローブの３’末端に位置するポリ（ｄＡ）、ホモポリマーテールである。この実施形態では、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドは、アッセイ条件下で捕捉プローブのポリ（ｄＡ）テールに安定して結合するのに十分な長さの５’ポリ（ｄＴ）テールを含むであろう。好ましい実施形態では、固定化プローブ結合領域は、約３０個のアデニンの長さであるポリ（ｄＡ）テールを含み、捕捉プローブは、標的結合領域および固定化プローブ結合領域を互いに結合するための約３個のチミンの長さであるスペーサー領域を含む。

本開示はまた、増幅アッセイにおいてＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ核酸の存在を検出するために有用な増幅プライマーを特徴とする。１つの好ましい実施形態において、各増幅プライマーは、オリゴヌクレオチドを含み、プライマーの標的結合領域の塩基配列は、配列番号３、配列番号４、または配列番号５中に含まれる塩基配列を有するか、または実質的にそれに対応する。核酸合成をプライミングするために使用される標的相補的オリゴヌクレオチド配列の特定の例は、配列番号６、配列番号７、および配列番号８によって与えられる。本開示の増幅プライマーは、任意に、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する５’プロモーター配列を含む。含まれる場合、ＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号９）などのＴ７プロモーターが好ましい。本明細書に開示されるＴ７プロモーター－プライマーの特定の例は、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２を含む。

本開示の増幅プライマーは、好ましくは、少なくとも２つの増幅プライマーのセットで使用される。好ましいセットは、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含む第１の増幅プライマーを含み、標的結合領域の塩基配列は、配列番号３、配列番号４、および配列番号５からなる群から選択される標的配列に存在する少なくとも１８個の連続する塩基領域に少なくとも約８０％相補的である（より好ましくは少なくとも約９０％相補的であり、最も好ましくは１００％相補的である）少なくとも１８個の連続する塩基領域を含む。任意に、第１の増幅プライマーは、標的ハイブリダイズ配列の上流に（例えば、その５’末端で）結合したプロモーター配列を含む。これらの好ましいセットの第２の増幅プライマーは、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、標的結合領域の塩基配列は、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５からなる群から選択される標的配列に存在する少なくとも１７個の連続する塩基領域に少なくとも約８０％相補的である（より好ましくは少なくとも約９０％相補的であり、最も好ましくは１００％相補的である）少なくとも１７個の連続する塩基領域を含む。

第１および第２の増幅プライマーの併用によって合成された核酸増幅産物（すなわち、「アンプリコン」）は、標識されたハイブリダイゼーションプローブの使用によって検出することができる。特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションプローブは、それぞれがその相補体ならびにＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、配列番号１９、配列番号２０、および配列番号２１のいずれかの配列の少なくとも１３、１４、１６、または２２個の隣接する塩基の配列を含む。

本開示はさらに、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍが試験試料中に存在するかを決定するための方法を特徴とする。一実施形態では、この方法は、（ａ）試験試料を、プローブがＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する標的核酸に優先的にハイブリダイズすることを可能にする条件下で、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍを検出するための上記ハイブリダイゼーションアッセイプローブのうちの１つと接触させ（例えば、核酸増幅産物を含む）、それによって検出のために安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成するステップ、および（ｂ）ハイブリッドが試験試料中のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの存在または不在の指標として試験試料中に存在するかを決定するステップを含む。この方法は、試験試料中に存在するＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの量を推定するための手段として、試験試料中に存在するハイブリッドの量を定量化するステップをさらに含み得る。好ましくは、プローブは、検出可能な標識を含み、標識は、プローブが別の種ではなくＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸にハイブリダイズされることを示す検出可能なシグナルを産生する。例えば、シグナルは、プローブがＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸にハイブリダイズされる場合と比較して、プローブがＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸にハイブリダイズされる場合、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも５００倍強くなり得る。

本開示はまた、試験試料中に存在するＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸に存在する標的核酸配列を増幅するための方法を特徴とし、方法は、（ａ）試験試料を、増幅条件下で、上記増幅プライマーのうちの少なくとも１つと接触させるステップ、および（ｂ）標的核酸配列を増幅するステップを含む。好ましい増幅法は、上記増幅プライマーのうちの少なくとも２つのセットを含むであろう。

一実施形態では、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸に存在する標的核酸配列を増幅するための方法は、（ａ）試験試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸配列、またはその相補体に優先的にハイブリダイズするハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させ、それによって検出のための安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成するステップ、および（ｂ）ハイブリッドが試験試料中のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの存在または不在の指標として試験試料中に存在するかを決定するステップをさらに含むであろう。これは、本開示に従ってプライマーを使用して核酸増幅産物が合成されるかどうかを決定することを含み得る。上記ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、この方法に特に好ましい。

本開示はまた、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を検出するために使用することができる反応混合物を特徴とする。これらの反応混合物は、試験中のサンプル、プライマーのセット、および検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブを含み得る。プライマーおよびプローブは、本明細書の開示および特許請求の範囲に従った配列を有する。

本開示はまた、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸に存在する標的核酸配列を増幅するためのキットを特徴とし、キットは、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を検出するための上記増幅プライマーのうちの少なくとも１つおよび１つ以上のハイブリダイゼーションプローブを含む。さらなる実施形態では、これらのキットは、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーションプローブに加えて、上記捕捉プローブのうちの少なくとも１つを含み得る。そのようなキットは、捕捉プローブを試験試料中に固定化するための固体支持体材料をさらに含み得る。

詳細な説明
Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸を標的とするオリゴヌクレオチドが本明細書に開示され、オリゴヌクレオチドは、試験試料中のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの存在または不在を決定するために有用である。オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、捕捉プローブ、および／または増幅プライマーとして機能することなどによって、異なる方法でＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの検出を補助することができる。本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸に存在する標的核酸配列に優先的にハイブリダイズして、試験試料中のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの存在を示す検出可能な二本鎖を形成することができる。好ましいプローブは、標的生物とその最も近い既知の系統発生的隣接生物とを区別することができる。本開示の捕捉プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸中に存在する標的核酸配列にハイブリダイズすることができ、臨床検体から標的核酸を分離するために使用することができる。本開示の増幅プライマーは、増幅条件下でＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸中に存在する標的核酸配列にハイブリダイズすることができ、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ由来の核酸を産生するために増幅反応においてプライマーとして使用することができる。プローブおよび増幅プライマーは、試験サンプル中のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍを検出および／または定量化するためのアッセイで使用することができる。

当業者は、本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブが、増幅プライマーまたは捕捉プローブとして使用され得ること、本開示の増幅プライマーの標的結合領域が、特定のアッセイによって必要とされる特異性の程度に応じて、ハイブリダイゼーションアッセイプローブまたは捕捉プローブとして使用され得ること、本開示の捕捉プローブの標的結合領域が、特定のアッセイによって必要とされる特異性の程度に応じて、ハイブリダイゼーションアッセイプローブまたは増幅プライマーとして使用され得ることを理解するであろう。よって、本開示は、任意選択で１つ以上のヌクレオチド類似体を含む、本明細書に開示された任意のヌクレオチド塩基配列を含むか、本質的にそれからなるか、それからなる、試験試料中のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの存在または不存在の決定における使用のためのオリゴヌクレオチドを企図する。

定義
以下の用語は、異なる意味を有することが明示的に示されない限り、本明細書で指定された意味を有する。

「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、本明細書で使用される「核酸」は、１つ以上の核酸を表すと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書で互換的に使用され得る。

「試料」または「試験試料」とは、標的生物または標的生物に由来する核酸を含むことが疑われる任意の物質を意味する。この物質は、例えば、痰または尿道検体などの未処理の臨床検体、その検体を含む緩衝媒体、その検体および標的生物に属する核酸を放出するための溶解剤を含む媒体、あるいは反応容器中または反応材料もしくは装置上で単離および／または精製された標的生物に由来する核酸を含む媒体であり得る。本明細書で使用される場合、「試料」および「試験試料」という用語は、その未加工形態の検体、または検体中の標的生物に由来する核酸を放出、単離、および精製するための任意の処理段階を指し得る。

本明細書で使用される「ヌクレオチド」とは、リン酸基、５炭素糖、および窒素含有塩基（本明細書では「核酸塩基」とも称される）からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡに見られる５炭素糖は、リボースである。ＤＮＡでは、５炭素糖は、２’－デオキシリボースである。この用語は、リボースの２’位にあるメトキシ基（本明細書では代替的に「２’－Ｏ－メチル」または「２’－Ｏ－Ｍｅ」または「２’－メトキシ」または「２’－ＯＭｅ」とも称される）などのかかるサブユニットの類似体も含む。

「アナログ」とは、２つ以上の化合物であって、類似または関連する化学的構造を示す化合物を指す。共通の構造的類似性を示すにもかかわらず、各類似体は大きく異なる生化学的特性を有する可能性がある。

「核酸」および「ポリヌクレオチド」とは、従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ－ＤＮＡ、およびそれらの類縁体であるポリマーを含むポリヌクレオチドを形成するために一緒に連結された窒素複素環塩基または塩基類縁体を有するヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体を含む多量体化合物を指す。核酸「骨格」は、糖－ホスホジエステル結合、ペプチド－核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ、ＰＣＴ公開第９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む様々な結合で構成され得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換（例えば、２’メトキシもしくは２’ハロゲン化物置換）を有する同様の化合物であり得る。窒素含有塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、それらの類似体（例えば、イノシンまたは他のもの、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５－３６，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１１^ｔｈ ｅｄ．，１９９２を参照されたい）、プリンまたはピリミジン誘導体（例えば、Ｎ^４－メチルデオキシグアノシン、デアザまたはアザプリン、デアザまたはアザピリミジン、５位または６位に置換基を有するピリミジン塩基、２位、６位、または８位に置換基を有するプリン塩基、２－アミノ－６－メチルアミノプリン、Ｏ^６－メチルグアニン、４－チオ－ピリミジン、４－アミノ－ピリミジン、４－ジメチルヒドラジン－ピリミジン、およびＯ^４－アルキル－ピリミジン、米国特許第５，３７８，８２５号およびＰＣＴ公開第９３／１３１２１号）であり得る。核酸は、骨格がポリマーの位置に窒素含有塩基を含まない１つ以上の「非塩基性」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来のＲＮＡもしくはＤＮＡ糖、塩基、および結合のみを含み得るか、または従来の成分および置換の両方（例えば、２’メトキシ骨格を有する従来の塩基、または従来の塩基および１つ以上の塩基類似体の両方を含むポリマー）を含み得る。核酸は、「ロックド核酸」（ＬＮＡ）、糖立体配置を模倣するＲＮＡ中にロックされた二環式フラノース単位を有する１つ以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含む類似体を含み、これは、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性を増強する（Ｖｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３（４２）：１３２３３－４１）。ハイブリダイゼーション複合体の安定性に影響を及ぼし得るオリゴマーの実施形態には、ＰＮＡオリゴマー、２’－メトキシもしくは２’－フルオロ置換ＲＮＡを含むオリゴマー、または荷電結合（例えば、ホスホロチオエート）もしくは中性基（例えば、メチルホスホネート）を含むオリゴマーを含む、ハイブリダイゼーション複合体の全電荷、電荷密度、もしくは立体会合に影響を及ぼすオリゴマーが含まれる。別途指示さない限り、５－メチルシトシンは、ＲＮＡ骨格またはＤＮＡ骨格（またはそれらの混合物）を含む前述の骨格／糖／結合のうちのいずれかとともに使用され得る。オリゴヌクレオチド、アンプリコン、または他の核酸の長さの範囲について言及する場合、その範囲がすべての整数を含む（例えば、１９～２５の連続するヌクレオチドの長さには、１９、２０、２１、２２、２３、２４、および２５が含まれる）ことが理解される。

「オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」、または「オリゴ」とは、一般に、１，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の核酸を指し、約２～５ヌクレオチドの下限および約５００～９００ヌクレオチドの上限を有するサイズ範囲のものを含む。いくつかの特定の実施形態は、約１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチドの下限および約５０～６０ヌクレオチドの上限を有するサイズ範囲のオリゴマーであり、他の特定の実施形態は、約１０～２０ヌクレオチドの下限および約２２～１００ヌクレオチドの上限を有するサイズ範囲である。オリゴマーは、天然に存在する源から精製されてもよいが、任意の周知の酵素的または化学的方法を使用して合成されてもよい。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬の任意の特定の機能を意味せず、むしろ、本明細書に記載のすべてのかかる試薬を網羅するために一般的に使用される。オリゴヌクレオチドは、様々な異なる機能を果たし得る。例えば、オリゴヌクレオチドが相補鎖に特異的であり、それにハイブリダイズすることができ、かつ核酸ポリメラーゼの存在下でさらに伸長され得る場合、プライマーとして機能し得、オリゴヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列を含み、かつ転写を可能にする場合、プライマーとして機能し、プロモーターを提供し得（例えば、Ｔ７プライマー）、オリゴヌクレオチドが標的核酸またはそのアンプリコンにハイブリダイズすることができ、かつ検出可能な部分（例えば、アクリジニウム－エステル化合物）をさらに提供する場合、標的核酸を検出するように機能し得る。オリゴマーは、機能名（例えば、捕捉プローブ、プライマー、またはプロモーター－プライマー）で呼ばれ得るが、当業者であれば、かかる用語がオリゴマーを指すことを理解するであろう。

定義された配列のオリゴヌクレオチドは、当業者に既知の技法によって、例えば、化学合成または生化学合成によって、かつ組換え核酸分子（例えば、細菌またはレトロウイルスベクター）からのインビトロまたはインビボ発現によって産生され得る。本開示によって意図されるように、オリゴヌクレオチドは、野生型染色体ＤＮＡまたはそのインビボ転写産物からならない場合がある。例えば、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、天然に存在する核酸には見られない非ヌクレオチドリンカーおよび／または検出可能な標識を含むことができる。

「検出プローブオリゴマー」、「検出プローブ」、または「プローブ」とは、標的核酸の検出のために、核酸ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、増幅配列を含む標的配列に特異的にハイブリダイズするオリゴマーを指す。検出は、直接的（すなわち、標的またはその増幅産物に直接ハイブリダイズされたプローブ）または間接的（すなわち、プローブを標的またはその増幅産物に結合する中間構造体にハイブリダイズされたプローブ）のいずれかであり得る。検出プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの類似体、またはそれらの組み合わせ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ）であってもよく、それらは、標識または非標識であってもよい。検出プローブは、代替の骨格結合（例えば、２’－Ｏ－メチル結合）をさらに含み得る。プローブの標的配列は、一般に、プローブがそれに特異的にハイブリダイズする、より大きい配列内の特異的な配列を指す。検出プローブは、標的特異的配列および非標的特異的配列を含み得る。かかる非標的特異的配列は、検出および／または増幅を容易にするために使用することができるヘアピン構造などの所望の二次または三次構造を付与するであろう配列を含み得る（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第６，８３５，５４２号、および同第６，８４９，４１２号を参照されたい）。定義された配列のプローブは、当業者に既知の技術によって、例えば、化学合成によって、かつ組換え核酸分子からのインビトロまたはインビボ発現などによる当業者に既知の技術によって産生され得る。

「標識」または「検出可能な標識」とは、検出されるか、または検出可能なシグナルをもたらすプローブに直接的または間接的に結合した部分または化合物を指す。直接的結合が、共有結合または非共有相互作用（例えば、水素結合、疎水性またはイオン性相互作用、およびキレートまたは配位錯体形成）を使用し得る一方で、間接的結合は、架橋部分またはリンカーを（例えば、抗体または追加のオリゴヌクレオチドを介して）使用し得る。放射性核種、リガンド、例えば、ビオチンもしくはアビジン、またはさらにはポリヌクレオチド配列、酵素、酵素基質、反応性基、発色団、例えば、検出可能な色を付与する色素または粒子（例えば、ラテックスまたは金属ビーズ）、発光化合物（例えば、生物発光、リン光、または化学発光化合物）、および蛍光化合物または部分（すなわち、フルオロフォア）を含む、任意の検出可能な部分が使用され得る。フルオロフォアの実施形態は、約４９５～６５０ｎｍの範囲の光を吸収し、約５２０～６７０ｎｍの範囲の光を放出するものを含み、これらは、ＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＣＡＬ ＦＬＵＯＲ（商標）（ＯｒａｎｇｅまたはＲｅｄ）、およびＱＵＡＳＡＲ（商標）化合物として既知のものが含まれる。フルオロフォアは、フルオロフォアに近接したときに光を吸収してバックグラウンド蛍光を減少させるクエンチャー分子と組み合わせて使用され得る。かかるクエンチャーは、当該技術分野で周知であり、例えば、ＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）（もしくはＢＨＱ（商標））化合物またはＴＡＭＲＡ（商標）化合物を含む。特定の実施形態は、混合物中の結合標識プローブが非結合標識プローブと比較して検出可能な変化を呈する均一系で検出可能な「均一な検出可能な標識」を含み、これは、ハイブリダイズされていない標識プローブからハイブリダイズされたものを物理的に除去することなく標識を検出することを可能にする（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、同第５，６５６，２０７号、および同第５，６５８，７３７号）。特定の均一な検出可能な標識には、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば、周知の標準ＡＥまたはＡＥ誘導体を含む、化学発光化合物が含まれる（米国特許第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、および同第５，６３９，６０４号）。標識を合成する方法、標識を核酸に結合する方法、および標識からのシグナルを検出する方法が周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）第１０章、および米国特許第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，２８３，１７４号、および同第４，５８１，３３３号、ならびに欧州特許出願第０ ７４７ ７０６号）。ＡＥ化合物を核酸に結合する特定の方法が既知である（例えば、米国特許第Ｎｏ．５，５８５，４８１号および米国特許第５，６３９，６０４号、第１０列第６行～第１１列第３行、および実施例８を参照されたい）。特定のＡＥ標識位置は、プローブの中央領域およびＡ／Ｔ塩基対の領域付近、プローブの３’もしくは５’末端、または所望の標的配列と比較したプローブが検出すべきではない既知の配列とのミスマッチ部位もしくはその付近である。他の検出可能に標識されたプローブには、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、分子トーチ、および分子ビーコンが含まれる。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、ドナーおよびアクセプター標識を含み、そこで、クエンチャーの存在からフルオロフォアを放出するために増幅中にプローブを酵素的に分解したときに蛍光が検出される。分子トーチおよびビーコンは、開放配置および閉鎖配置で存在し、閉鎖配置は、フルオロフォアを消光し、開放位置は、フルオロフォアをクエンチャーから分離して蛍光を可能にする。標的核酸へのハイブリダイゼーションは、さもなければ閉鎖されているプローブを開放する。

「安定して」、「安定した」、または「検出のために安定した」とは、反応混合物の温度が核酸二本鎖の融解温度よりも少なくとも２℃低いことを意味する。反応混合物の温度は、より好ましくは、二本鎖核酸の融解温度よりも少なくとも５℃低く、さらにより好ましくは、反応混合物の融解温度よりも少なくとも１０℃低い。

「実質的に相同性」、「実質的に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」、または「実質的に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ）」とは、対象オリゴヌクレオチドが、参照塩基配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物を除く）に存在する少なくとも１０個の連続する塩基領域と少なくとも約８０％相同性、好ましくは少なくとも約９０％相同性、最も好ましくは１００％相同性である、少なくとも１０個の連続する塩基領域を含む塩基配列を有することを意味する。（当業者は、標的核酸の検出に干渉するのに十分な非特異的ハイブリダイゼーションのレベルを防止しながら、オリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションを可能にするために、相同性の様々なパーセンテージでのハイブリダイゼーションアッセイ条件に行うことができる適切な変更を容易に理解するであろう。）類似性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較することによって決定され、構造的な差が相補塩基との水素結合を防止しない限り、２つの配列間に存在し得る他の構造的な差を考慮しない。２つの配列間の相同性の程度は、比較される少なくとも１０個の連続する塩基の各セット間の塩基差の数を用いて表すこともでき、これは、０、１、または２つの塩基差であり得る。

「実質的に相補的な」とは、対象オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列（ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物を除く）に存在する少なくとも１０個の連続する塩基領域に、少なくとも８０％相補的、好ましくは少なくとも９０％相補的、最も好ましくは１００％相補的である、少なくとも１０個の連続する塩基領域を含む塩基配列を有することを意味する。当業者は、標的核酸の検出に干渉するのに十分な非特異的ハイブリダイゼーションのレベルを防止しながら、オリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションを可能にするために、相補性の様々なパーセンテージでのハイブリダイゼーションアッセイ条件に行うことができる適切な変更を容易に理解するであろう。相補性の程度は、２つの配列を構成する核酸塩基の順序を比較することによって決定され、それらの２つの配列間に存在し得る他の構造差を考慮しないが、但し、その構造差が相補塩基との水素結合を防止しないことを条件とする。２つの配列間の相補性の程度は、比較される少なくとも１０個の連続する塩基の各セットに存在する塩基ミスマッチの数を用いて表すこともでき、これは、０、１、または２つの塩基ミスマッチであり得る。

本開示で論じられる温度、濃度、および時間の前に暗黙の「約」があり、わずかな非実質的な逸脱が、本教示の範囲内であることが理解されるであろう。一般に、「約」という用語は、組成物の活性または安定性に任意の有意な効果を有しない組成物の成分の量における非実質的な変動を示す。すべての範囲は、「端点を含まない」などの明示的除外がない場合に端点を包含すると解釈されるべきであり、それ故に、例えば、「１０～１５以内」には、１０および１５の値が含まれる。

「ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物」とは、本質的に同じ相補的塩基対ハイブリダイゼーション特性を有するＲＮＡおよびＤＮＡ分子を意味する。ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物は、異なる糖部分（すなわち、リボース対デオキシリボース）を有し、さらにＲＮＡ中のウラシルおよびＤＮＡ中のチミンの存在によって異なり得る。ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物が特定の配列に対して同程度の相補性を有するため、ＲＮＡ等価物とＤＮＡ等価物との間の差異は相同性の差異には寄与しない。

「ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡに同じ相補的塩基対ハイブリダイゼーション特性を有するヌクレオチド塩基を意味する。ここでは、塩基チミンの代わりに塩基ウラシルを使用することができ、またはその逆も可能であり、それ故に、ウラシルおよびチミンがＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基である。ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするポリヌクレオチド塩基配列５’－ＡＧＣＴ－３’は、配列５’－ＡＧＣＵ－３’も説明するであろう。ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物が特定の配列に対して同程度の相補性を有するため、ＲＮＡ等価塩基とＤＮＡ等価塩基との間の差異は相同性の差異には寄与しない。

「相補体」という用語は、別の核酸分子の連続する核酸配列に相補的な連続する核酸配列を含む核酸分子（標準ヌクレオチドの場合、Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｃ：Ｇ）を指す。例えば、５’－ＡＡＣＴＧＵＣ－３’は、５’－ＧＡＣＡＧＴＴ－３’の相補体である。

本明細書で使用される場合、「標的核酸」（場合によっては単に「標的」）は、増幅および／または検出されるべき配列を含む核酸である。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。標的核酸は、増幅されない場合がある標的配列以外の他の配列を含んでもよい。標的核酸の例には、１６Ｓ ｒＲＮＡおよび２３Ｓ ｒＲＮＡが含まれる。特許請求の範囲は、標的配列を列挙された配列の特定の意味に限定し得るが、但し、相補配列を除外することを条件とする。

本明細書で使用される「標的配列」という用語は、増幅および／または検出される標的核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。「標的配列」は、増幅プロセス（例えば、ＰＣＲ、ＴＭＡ）中にオリゴヌクレオチド（例えば、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモーターオリゴヌクレオチド）が複合体化する複合体化配列を含む。標的核酸が元来一本鎖である場合、「標的配列」という用語は、標的核酸中に存在する「標的配列」に相補的な配列も指すであろう。標的核酸が元来二本鎖である場合、「標的配列」という用語は、センス（＋）鎖およびアンチセンス（－）鎖の両方を指す。

「塩基の標的ハイブリダイズ配列」または「標的ハイブリダイズ配列」または「標的特異的配列」は、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成されたオリゴマーの一部分を指すために本明細書で使用される。好ましくは、標的ハイブリダイズ配列は、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズするように構成される。標的ハイブリダイズ配列は、それらがハイブリダイズするように構成された標的配列の一部分に１００％相補的であってもよいが、必ずしもそうでなくてもよい。標的ハイブリダイズ配列は、標的配列と比較して挿入された、欠失した、および／または置換されたヌクレオチド残基も含み得る。標的配列に対する標的ハイブリダイズ配列の１００％未満の相補性は、例えば、配列バリアントにハイブリダイズするように構成されたオリゴマーの場合のように、標的核酸がある種内の複数の株である場合に生じ得る。標的核酸に対して１００％未満の相補性を有するように標的ハイブリダイズ配列を構成する他の理由が存在することが理解される。

「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」とは、平行配向または逆平行配向で指定されたハイブリダイゼーションアッセイ条件下で一緒になって二本鎖領域を有する安定した構造を形成する２つの完全にまたは部分的に相補的な核酸鎖の能力を意味する。ハイブリッドと呼ばれることもあるこの二本鎖構造の２つの構成鎖は、水素結合によって結び付いている。これらの水素結合は、最も一般的には、単一核酸鎖上に塩基アデニンおよびチミンもしくはウラシル（ＡおよびＴもしくはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含むヌクレオチド間に形成されるが、塩基対合は、これらの「カノニカル」対のメンバーではない塩基間に形成される可能性もある。非カノニカル塩基対合は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｒ．Ｌ．Ｐ．Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（１１ｔｈ ｅｄ．１９９２）を参照されたい。

「優先的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが、それらの標的核酸にハイブリダイズして、少なくとも１つの目的の生物の存在を示す安定なプローブ：標的ハイブリッド（「検出可能なハイブリッド」）を形成することができ、非標的化生物（「非検出可能なハイブリッド」）、特に系統発生学的に密接に関連する生物の存在を示すのに十分な数の検出可能な安定なプローブ：非標的ハイブリッドが形成されていないことを意味する。したがって、プローブは、非標的核酸よりも十分に大きい程度に標的核酸にハイブリダイズして、当業者が、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ由来の核酸の存在（または不在）を正確に検出し、その存在を試験試料中の系統発生学的に密接に関連する生物の存在と区別することを可能にする。概して、オリゴヌクレオチド配列とその標的配列との間の相補性の程度を低下させることにより、その標的領域へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度または速度が低下するであろう。しかしながら、１つ以上の非相補的塩基の包含により、非標的生物を区別するオリゴヌクレオチドの能力が促進され得る。

優先的ハイブリダイゼーションは、発光、質量変化、および伝導度または濁度の変化に基づくものを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の様々な技法のうちのいずれかを使用して測定することができる。いくつかの検出手段が本明細書に記載されており、特にそのうちの１つが以下に提供される実施例で使用される。好ましくは、試験試料中の標的ハイブリダイゼーションシグナルと非標的ハイブリダイゼーションシグナルとの間に少なくとも１０倍の差、より好ましくは少なくとも１００倍の差、最も好ましくは少なくとも５００倍の差がある。好ましくは、試験試料中の非標的ハイブリダイゼーションシグナルは、バックグラウンドシグナルレベル以下である。

「ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件」、「ハイブリダイゼーションアッセイ条件」、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」、または「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが、密接に関連する非標的微生物に由来する核酸よりもＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する標的核酸（好ましくは、ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ）に優先的にハイブリダイズすることを可能にする条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件は、プローブのＧＣ含有量および長さ、プローブ配列と試験試料中に存在し得る非標的配列の配列との間類似性の程度、およびプローブ配列と標的配列との間の類似性の程度を含む因子によって変化し得る。ハイブリダイゼーション条件には、温度およびハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成が含まれる。以下の実施例の節には、本開示のプローブを使用してＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する標的核酸を検出するための好ましいハイブリダイゼーションアッセイ条件が提供されているが、他のストリンジェントな条件も当業者によって容易に確認され得る。

「アッセイ条件」とは、標的核酸へのオリゴヌクレオチドの安定したハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。アッセイ条件は、標的核酸へのオリゴヌクレオチドの優先的ハイブリダイゼーションを必要としない。

「均一な検出可能な標識」とは、標識が標的配列にハイブリダイズされたプローブ上にあるかを決定することによって均一様式で検出することができる標識を指す。すなわち、均一な検出可能な標識は、ハイブリダイズされていない形態の標識または標識プローブからハイブリダイズされたものを物理的に除去することなく検出することができる。増幅された核酸を検出するために標識プローブを使用する場合、均一な検出可能な標識が好ましい。均一な標識の例は、Ａｒｎｏｌｄらの米国特許第５，２８３，１７４号、Ｗｏｏｄｈｅａｄらの米国特許第５，６５６，２０７号、およびＮｅｌｓｏｎらの米国特許第５，６５８，７３７号に詳細に記載されている。均一なアッセイに使用するための好ましい標識には、化学発光化合物が含まれる（例えば、Ｗｏｏｄｈｅａｄらの米国特許第５，６５６，２０７号、Ｎｅｌｓｏｎらの米国特許第５，６５８，７３７号、およびＡｒｎｏｌｄ，Ｊｒ．らの米国特許第５，６３９，６０４号を参照されたい）。好ましい化学発光標識は、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば、標準ＡＥまたはその誘導体（例えば、ナフチル－ＡＥ、オルト－ＡＥ、１－または３－メチル－ＡＥ、２，７－ジメチル－ＡＥ、４，５－ジメチル－ＡＥ、オルト－ジブロモ－ＡＥ、オルト－ジメチル－ＡＥ、メタ－ジメチル－ＡＥ、オルト－メトキシ－ＡＥ、オルト－メトキシ（シンナミル）－ＡＥ、オルト－メチル－ＡＥ、オルト－フルオロ－ＡＥ、１－または３－メチル－オルト－フルオロ－ＡＥ、１－または３－メチル－メタ－ジフルオロ－ＡＥ、および２－メチル－ＡＥ）である。

「均一なアッセイ」とは、特定のプローブハイブリダイゼーションの程度を決定する前に、ハイブリダイズされていないプローブからハイブリダイズされたプローブを物理的に分離することを必要としない検出手順を指す。例示的な均一なアッセイ、例えば、本明細書に記載のものは、適切な標的にハイブリダイズされたときに蛍光シグナルを放出する分子トーチ、分子ビーコン、または他の自己報告プローブ、ハイブリッド二本鎖に存在しない場合に化学的手段によって選択的に破壊され得る化学発光アクリジニウムエステル標識、および当業者によく知られているであろう他の均一に検出可能な標識を用いることができる。

「核酸二本鎖」、「二本鎖」、「核酸ハイブリッド」、または「ハイブリッド」とは、二本鎖水素結合領域を含む安定した核酸構造を意味する。かかるハイブリッドには、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＲＮＡ：ＤＮＡ、およびＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖分子、ならびにそれらの類似体が含まれる。構造は、任意の既知の手段によって検出可能になるように十分に安定している。

「増幅オリゴヌクレオチド」または「増幅オリゴマー」とは、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与する（例えば、プライマーまたはプロモーター－プライマーとして機能する）オリゴヌクレオチドである。特定の増幅オリゴマーは、標的核酸配列またはその相補鎖の領域に相補的な少なくとも約１０個の連続する塩基、任意選択的に、少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、または２２個の連続する塩基を含む。連続する塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または完全に相補的であり得る。当業者であれば、列挙された範囲がその範囲内のすべての整数および有理数（例えば、９２％または９８．３７７％）を含むことを理解するであろう。特定の増幅オリゴマーは、約１７～約５０塩基の長さ、またはより好ましくは約１７～約２２塩基の長さであり、任意選択的に、修飾されたヌクレオチド、または５’末端で結合したＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ中には見られない余分な塩基配列を含み得る。

「プライマー」とは、鋳型核酸にハイブリダイズし、ポリメラーゼ酵素によって伸長される３’末端を有する増幅オリゴマーである。プライマーは、任意選択的に修飾され得る（例えば、標的配列に非相補的な５’領域を含めることによって）。かかる修飾には、プライマーもしくは標的オリゴヌクレオチドを操作もしくは増幅するために使用されるまたはそれを操作もしくは増幅するのに有用なタグ、プロモーター、または他の非標的特異的配列などの機能的付加が含まれ得る。

転写媒介増幅の文脈内で、５’プロモーター配列で修飾されたプライマーは、本明細書で「プロモーター－プライマー」と称される。分子生物学または生化学の技術分野の当業者であれば、プライマーとして機能することができるオリゴマーが、５’プロモーター配列を含むように修飾され、その後、プロモーター－プライマーとして機能することができ、同様に、任意のプロモーター－プライマーが、その５’プロモーター配列の有無にかかわらずプライマーとしての役割を果たすことができることを理解するであろう。３’ブロック末端を組み込むように修飾されたプロモーター－プライマーは、本明細書で「プロモータープロバイダー」と称され、これは、標的核酸にハイブリダイズし、転写を開始する役割を果たす上流プロモーター配列を提供することができるが、オリゴ伸長のためのプライマーを提供しない。

「核酸増幅」または「標的増幅」または単に「増幅」とは、標的核酸配列、もしくはその相補配列、またはそれらの断片の複数のコピー（すなわち、完全標的核酸よりも少なく含む増幅配列）を産生する任意のインビトロ手順を指す。核酸増幅手順の例には、転写関連方法、例えば、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）および他のもの（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、同第５，４３７，９９０号、同第５，１３０，２３８号、同第４，８６８，１０５号、および同第５，１２４，２４６号）、レプリカーゼ媒介増幅（例えば、米国特許第４，７８６，６００号）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、欧州特許第０３２０３０８号）、ヘリカーゼ依存性増幅（例えば、米国特許第７，２８２，３２８号）、ならびに鎖置換増幅（ＳＤＡ）（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号）が挙げられる。増幅は、線形または指数関数的であり得る。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、および熱サイクリングステップを使用して、ＤＮＡまたはｃＤＮＡの２つの相補鎖の複数のコピーを合成する。ＬＣＲ増幅は、少なくとも４つの別個のオリゴヌクレオチドを使用して、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および変性の複数のサイクルを使用することによって標的およびその相補鎖を増幅する。ヘリカーゼ依存性増幅は、ヘリカーゼを使用して、ＤＮＡ二本鎖の２つの鎖を分離して一本鎖鋳型を産生し、続いて、鋳型にハイブリダイズする配列特異的プライマーのハイブリダイゼーションおよびＤＮＡポリメラーゼによる伸長を行い、標的配列を増幅する。ＳＤＡは、標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二本鎖の一方の鎖にニック形成する制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むプライマーを使用し、続いて、一連のプライマー伸長ステップおよび鎖置換ステップで増幅を行う。レプリカーゼ媒介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびＱβ－レプリカーゼなどのレプリカーゼを使用する。特定の実施形態はＰＣＲまたはＴＭＡを使用するが、本明細書に開示されるオリゴマーが他の増幅法でプライマーとして容易に使用され得ることは当業者に明らかであろう。

転写関連増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、プロモーターを含むオリゴヌクレオチドを使用し、任意に他のオリゴヌクレオチドを含んで、最終的に核酸テンプレートから複数のＲＮＡ転写物を産生し得る（例えば、Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号、Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，４３７，９９０号、ＰＣＴ公開第８８／０１３０２号および同第８８／１０３１５号（Ｇｉｎｇｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．）、Ｍａｌｅｋ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，１３０，２３８号、Ｕｒｄｅａ ｅｔ ａｌ．の米国特許第４，８６８，１０５号および同第５，１２４，２４６号、ＰＣＴ公開第９４／０３４７２号（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．）、ならびにＰＣＴ公開第９５／０３４３０号（Ｒｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．）において詳細に記載される）。ＴＭＡを使用する方法は、以前に詳細に説明されている（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号）。

「増幅条件」とは、核酸増幅を可能にする条件を意味する。以下の実施例の節には、転写媒介増幅法で本開示のプライマーを使用してＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する標的核酸配列を増幅するための好ましい増幅条件が提供されているが、所望の特定の増幅法に応じて、他の許容される増幅条件も当業者によって容易に決定され得る。

「逆センス」または「逆鎖」とは、参照またはセンス核酸鎖に完全に相補的な核酸分子を意味する。

「センス」、「同センス」、または「プラスセンス」とは、参照核酸分子と完全に相同の核酸分子を意味する。

「アンプリコン」とは、標的核酸に由来する、核酸増幅反応で産生される核酸分子を意味する。アンプリコンは、標的核酸と同センスまたは逆センスのものであり得る標的核酸配列を含む。「由来する」とは、言及された核酸が、標的生物から直接的に、または核酸増幅の産物として間接的に得られることを意味し、その産物は、例えば、標的生物に存在しないアンチセンスＲＮＡ分子であり得る。

「捕捉プローブ」とは、標的核酸および固定化プローブにハイブリダイズし、それによって試験試料中の標的核酸を固定化および単離するための手段を提供することができる、オリゴヌクレオチドまたは一緒に結合された少なくとも２つのオリゴヌクレオチドのセットを意味する。標的核酸にハイブリダイズする捕捉プローブのその部分は、「標的結合領域」と呼ばれ、固定化プローブにハイブリダイズする捕捉プローブのその部分は、「固定化プローブ結合領域」と呼ばれる。好ましい捕捉プローブは、アッセイ条件下で標的核酸および固定化プローブの両方にハイブリダイズするが、標的結合領域および固定化プローブ結合領域は、異なるハイブリダイゼーション条件下でそれらのそれぞれの標的配列にハイブリダイズするように設計され得る。このようにして、捕捉プローブは、固定化プローブ結合領域の固定化プローブへのハイブリダイゼーションを可能にする条件を調整する前に、より好ましい溶液相動力学下で標的核酸にまずハイブリダイズするように設計され得る。標的結合および固定化プローブ結合領域が同じ捕捉プローブ上に提供される場合、それらは同じオリゴヌクレオチド上で互いに直接隣接してもよく、それらは１つ以上の任意に修飾されたヌクレオチドによって互いに分離されてもよく、またはそれらは非ヌクレオチドリンカーによって互いに結合されてもよい。

「標的ハイブリダイズ配列」または「標的結合領域」とは、アッセイ条件下で、標的核酸、標的配列のＤＮＡもしくはＲＮＡ等価物、または標的配列の補体中に存在する標的配列に安定して結合するオリゴヌクレオチドの部分を意味する。アッセイ条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件または増幅条件であり得る。

「固定化プローブ結合領域」とは、アッセイ条件下で固定化プローブにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの部分を意味する。

特許請求の範囲における「ホモポリマーテール」とは、少なくとも１０個の同一の塩基（例えば、１０個の連続するアデニンまたはチミン）の連続する塩基配列を意味する。

「固定化プローブ」とは、捕捉プローブを固定化支持体に結合するためのオリゴヌクレオチドを意味する。固定化プローブは、結合または相互作用によって直接的または間接的のいずれかで固体支持体に結合され、それらの条件が同じか異なるかにかかわらず、捕捉プローブを標的核酸および固定化プローブにハイブリダイズするために使用される条件下で安定したままである。固定化プローブは、試料中の非結合材料からの結合標的核酸の分離を促進する。

「単離する」または「単離すること」とは、試験試料中に存在する標的核酸の少なくとも一部分が、反応容器内、または反応装置もしくは固体担体（例えば、試験管、キュベット、マイクロタイタープレートウェル、ニトロセルロースフィルター、スライド、またはピペットチップ）上で、容器、装置、または担体からの標的核酸の大幅な喪失なしに標的核酸を精製することができるように、固定または放出可能な方法で濃縮されることを意味する。

「分離する」、「分離」、「分離すること」、または「精製する」、「精製された」、もしくは「精製すること」とは、容器、装置、または担体中またはその上に含まれる試料の１つ以上の成分が、容器、装置、または担体中またはその上に存在する１つ以上の他の試料成分から物理的に除去されることを意味する。分離または精製ステップ中に除去され得る試料成分は、タンパク質、炭水化物、脂質、阻害剤、非標的核酸、および非結合プローブを含む。好ましくは、固定化捕捉プローブに結合した標的核酸は、分離または精製ステップ中に試料に保持される。

「種特異的」とは、言及されるハイブリダイゼーションアッセイプローブが、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ種に属する生物に由来する核酸に存在する標的核酸配列を優先的に（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で）検出することができることを意味する。

「から本質的になる」とは、本発明の基本的な特徴および新規の特徴を実質的に（ｍａｔｅｒｉａｌｌｙ）変化させない追加の成分、組成物、または方法ステップが、本発明の組成物またはキットまたは方法に含まれ得ることを意味する。本発明の基本的な特徴および新規の特徴に実質的な影響を及ぼすいずれの成分、組成物、または方法ステップも、この用語に入らないであろう。例えば、オリゴヌクレオチドへの付加または欠失は、オリゴヌクレオチドがその特許請求される特性を有することを防止しない（すなわち、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、非標的核酸よりも標的核酸に優先的にハイブリダイズする）非物質的な変化であり得る。オリゴヌクレオチドは、標的核酸へのプローブのハイブリダイゼーションに関与せず、かつかかるハイブリダイゼーションに影響を及ぼさない他の核酸分子を含み得る。

ハイブリダイゼーション条件およびプローブ設計
ハイブリダイゼーション反応条件、最も重要なことに、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション溶液中の塩の濃度は、本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブがＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する標的核酸配列を有する核酸に優先的にハイブリダイズすることを可能にするように選択することができる。減少した塩濃度および／または上昇した温度（ストリンジェンシーが増加した条件）で、二本鎖ハイブリッド分子中の対合ヌクレオチド塩基間の水素結合が破壊されると、核酸ハイブリダイゼーションの程度が低下する。このプロセスは、「融解」として知られている。

概して言えば、最も安定したハイブリッドは、最多数の連続する完全に一致した（すなわち、水素結合した）ヌクレオチド塩基対を有するものである。かかるハイブリッドは、通常、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーが増加すると最後に融解すると予想される。しかしながら、１つ以上のミスマッチ、「非カノニカル」、または不完全な塩基対を含む（核酸のヌクレオチド配列にその位置でより弱いまたは存在しない塩基対合をもたらす）二本鎖核酸領域は、比較的高ストリンジェンシー条件下で依然として十分に安定している場合があり、試験試料中に存在し得る他の選択されていない核酸と交差反応することなく核酸ハイブリッドがハイブリダイゼーションアッセイで形成および検出されることを可能にし得る。

したがって、一方では、標的核酸のヌクレオチド配列と、系統発生学的に異なるが密接に関連する生物に属する非標的核酸のヌクレオチド配列との間の類似性の程度、および他方では、特定のプローブのヌクレオチド配列と、標的および非標的核酸のヌクレオチド配列との間の相補性の程度に応じて、１つ以上のミスマッチが、非標的核酸ではなく標的核酸にハイブリダイズするプローブまたはプライマーに含まれるオリゴヌクレオチドの能力を必ずしも打ち負かすわけではないであろう。

本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、プローブ：標的ハイブリッドの融解温度（Ｔ_ｍ）（Ｔ_ｍは、所与の反応混合物中の潜在的に二本鎖の分子の半分が一本鎖の変性状態にある温度として定義される）と、プローブと、検出されることを求められていないが、試験試料中に存在することが予想される系統発生学的に最も密接に関連する生物のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡとの間に形成されるミスマッチハイブリッドのＴ_ｍとの間の差を最大化するように選ばれた、選択された、および／または設計された。非標識増幅プライマーおよび捕捉プローブは、本開示において有用であるためにハイブリダイゼーションアッセイプローブとして非常に高度な特異性を有する必要はないが、それらは、指定された増幅またはハイブリダイゼーションアッセイ条件下で他の核酸よりも１つ以上の標的核酸に優先的にハイブリダイズするように同様に設計される。この比較に使用される配列は、実験室において決定されたか、または公開されたソースから取得された。

ｒＲＮＡ分子内で、二次構造（分子内水素結合によって部分的に引き起こされる）と機能との間に密接な関係がある。この事実は、一次ヌクレオチド配列の進化的変化に制限を課し、二次構造を維持させる。例えば、二重ヘリックスの一方の「鎖」（分子内水素結合により、両方の「鎖」が同じｒＲＮＡ分子の一部である）で塩基が変化する場合、補償置換が、通常、相補性（共分散と称される）、ひいては必要な二次構造を保存するために他方の「鎖」の一次配列に起こる。これにより、保存された一次配列およびまた保存された二次構造要素の両方に基づいて、２つの非常に異なるｒＲＮＡ配列が整列することを可能になる。本明細書に記載のハイブリダイゼーションアッセイプローブの潜在的標的配列は、整列した配列の相同性の変化に注目することによって特定された。

推定上固有の潜在的標的ヌクレオチド配列を単に特定するだけでは、機能的に種特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブが、その配列を含むＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡにハイブリダイズするように作製され得ることは保証されない。様々な他の因子が種特異的プローブの標的部位としての核酸遺伝子座の適合性を決定するであろう。ハイブリダイゼーション反応の程度および特異性、例えば、本明細書に記載のものがいくつかの因子に影響されるため、それらの因子のうちの１つ以上の操作により、その標的に完全に相補的であるか否かにかかわらず、特定のオリゴヌクレオチドの正確な感度および特異性が決定されるであろう。様々なアッセイ条件の重要性および影響は、当業者に既知であり、Ｋｏｈｎｅ，“Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ－Ｖｉｒａｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”（米国特許第４，８５１，３３０号）、Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｔｏ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎａｅ”（米国特許第５，２１６，１４３号）、およびＨｏｇａｎ，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎ－Ｖｉｒａｌ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”（米国特許第５，８４０，４８８号）に開示されている。

ハイブリダイゼーションの所望の温度およびハイブリダイゼーション溶液組成（塩濃度、界面活性剤、および他の溶質など）も二本鎖ハイブリッドの安定性に影響を及ぼし得る。イオン強度およびプローブが標的にハイブリダイズすることを可能にするであろう温度などの条件は、種特異的プローブの構築時に考慮されなければならない。ハイブリッド核酸の熱安定性は、一般に、反応混合物のイオン強度とともに増加する。他方で、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシド、およびアルコールなどの水素結合を破壊する化学試薬は、ハイブリッドの熱安定性を大幅に低下させる可能性がある。

その標的に対するプローブの特異性を最大化するために、本開示のプローブは、高ストリンジェンシー条件下でそれらの標的にハイブリダイズするように設計された。かかる条件下で、高度の相補性を有する単一の核酸鎖（または領域）のみが互いにハイブリダイズするであろう。かかる高度の相補性を有しない単一の核酸鎖は、ハイブリッドを形成しないであろう。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーにより、ハイブリッドを形成するために２つの核酸鎖間に存在すべき相補性の量が決定される。ストリンジェンシーは、プローブと標的核酸との間に形成されるハイブリッドと、プローブと試験試料中に存在する任意の非標的核酸との間の潜在的なハイブリッドとの間の安定性の差を最大化するように選ばれる。

適切な特異性は、非標的生物の配列に対して完全な相補性を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの長さを最小限に抑えることによって、非標的核酸に相補性のＧおよびＣ豊富な領域を避けることによって、かつ非標的配列に対して可能な限り多くの不安定化ミスマッチを含むようにプローブを構築することによって達成され得る。プローブが特定のタイプの生物のみの検出に適しているかは、プローブ：標的ハイブリッドとプローブ：非標的ハイブリッドとの間の熱安定性の差に大きく依存する。プローブを設計する際に、これらのＴ_ｍ値の差は、可能な限り大きくすべきである（好ましくは２℃～５℃以上）。Ｔ_ｍの操作は、ＧＣ含有量対ＡＴ含有量、またはヌクレオチド類似体（例えば、リボフラノシル部分に対する２’－Ｏ－メチル置換を有するリボヌクレオチド）の包含などのプローブの長さおよびプローブの組成を変化させることによって達成することができる。

一般に、オリゴヌクレオチドプローブの最適なハイブリダイゼーション温度は、所与の二本鎖の融解温度よりも約５℃低い。最適温度よりも低い温度でのインキュベーションは、ミスマッチ塩基配列がハイブリダイズすることを可能にする場合があり、それ故に、特異性を低下させる可能性がある。プローブが長いほど、かつ塩基対間の水素結合が多いほど、一般に、Ｔ_ｍが高くなる。Ｇ－Ｃ塩基対が追加の水素結合を呈し、ひいてはＡ－Ｔ塩基対よりも高い熱安定性を呈するため、ＧおよびＣのパーセンテージを増加させることも、Ｔ_ｍを増加させる。かかる考慮すべき事項は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｊ．ＳＡＭＢＲＯＯＫ ＥＴ ＡＬ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＣＨ．１１（２ｄ ｅｄ．１９８９）を参照されたい。

Ｔ_ｍを決定するための好ましい方法は、Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ”（米国特許第５，２８３，１７４号）に開示される周知のハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）を使用してハイブリダイゼーションを測定する。Ｔ_ｍは、以下の様式でＨＰＡを使用して測定することができる。プローブ分子をアクリジニウムエステルで標識し、過剰量の標的を使用してコハク酸リチウム緩衝液（０．１Ｍコハク酸リチウム緩衝液、ｐＨ４．７、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５ｍＭアルドリチオール－２、１．２Ｍ ＬｉＣｌ、３％（体積／体積）エタノール絶対、２％（重量／体積）ラウリル硫酸リチウム）中でプローブ：標的ハイブリッドを形成させる。その後、プローブ：標的ハイブリッドを含む溶液のアリコートをコハク酸リチウム緩衝溶液で希釈し、予想されるＴ_ｍ（典型的には５５℃）よりも低い温度で開始し、２～５℃増分で増加する様々な温度で５分間インキュベートする。その後、この溶液を弱アルカリ性ホウ酸緩衝液（６００ｍＭホウ酸、２４０ｍＭ ＮａＯＨ、１％（体積／体積）ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ８．５）で希釈し、同等の温度またはより低い温度（例えば、５０℃）で１０分間インキュベートする。

これらの条件下で、一本鎖プローブに結合したアクリジニウムエステルが加水分解する一方で、ハイブリダイズされたプローブに結合したアクリジニウムエステルは、加水分解から比較的保護される。したがって、加水分解処理後に残っているアクリジニウムエステルの量は、ハイブリッド分子の数に比例する。残りのアクリジニウムエステルを、過酸化水素およびアルカリを溶液に加えることによって残りのアクリジニウムエステルから産生される化学発光を監視することによって測定することができる。化学発光を、ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）４５０ｉルミノメーター（Ｇｅｎ－Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などのルミノメーターで測定することができる。結果として得られたデータを、温度に対する（通常は最低温度からの）最大シグナルのパーセントとしてプロットすることができる。Ｔ_ｍは、最大シグナルの５０％が残る温度として定義される。上記の方法に加えて、Ｔ_ｍは、当業者に知られる同位体方法によって決定され得る（例えば、米国特許第５，８４０，４８８号を参照されたい）。

所与のハイブリッドのＴ_ｍが使用されるハイブリダイゼーション溶液の性質に応じて変化することに留意されたい。塩濃度、界面活性剤、および他の溶質などの因子が熱変性中にハイブリッド安定性に影響を及ぼし得る（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ＥＴ ＡＬ．（上記）第１１章を参照されたい）。イオン強度およびプローブが標的にハイブリダイズすることを可能にするであろう温度などの条件は、プローブの構築時に考慮されるべきである。概して言えば、ハイブリッド核酸の熱安定性は、反応混合物のイオン強度とともに増加する。他方で、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシド、およびアルコールなどの水素結合を破壊する化学試薬は、ハイブリッドの熱安定性を大幅に低減させる可能性がある。

その標的に対するハイブリダイゼーションアッセイプローブの特異性を確実にするために、高ストリンジェンシー条件下で標的核酸にのみハイブリダイズするプローブを設計することが好ましい。高度に相補的な配列のみが高ストリンジェンシー条件下でハイブリッドを形成するであろう。したがって、アッセイ条件のストリンジェンシーは、安定したハイブリッドを形成するために２つの配列間に必要な相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、プローブ：標的ハイブリッドと潜在的なプローブ：非標的ハイブリッドとの間の安定性の差を最大化するように選ばれるべきである。

特定のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例が本明細書に提供される。言うまでもなく、代替のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が本開示に基づいて当業者によって決定され得る。（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ＥＴ ＡＬ．（上記）第１１章を参照されたい。）

標的核酸配列領域の長さ、ひいてはプローブ配列の長さも重要であり得る。いくつかの事例では、特定の領域由来の配列がいくつか存在する場合があり、位置および長さが異なり、これを使用して、所望のハイブリダイゼーション特性を有するプローブを設計することができる。他の事例では、あるプローブは、単一の塩基のみが異なる別のプローブよりも特異性に関して有意に良好であり得る。完全に相補的ではない核酸がハイブリダイズすることが可能であるが、完全に相補的な塩基の最長ストレッチ、ならびに塩基組成物が、一般に、ハイブリッド安定性を決定するであろう。

ハイブリダイゼーションに阻害性の強力な内部構造を形成することで知られているｒＲＮＡの領域は、あまり好ましくない標的領域である。同様に、広範な自己相補性を有するプローブも一般に避けられている。しかしながら、本明細書で考察される分子トーチおよび分子ビーコンなどのヘアピンプローブのように、プローブにある程度の自己相補性が望ましい場合がある。鎖が分子内または分子間ハイブリッドに完全にまたは部分的に含まれる場合、反応条件の変化なしに新たな分子間プローブ：標的ハイブリッドの形成に関与する可能性は低くなるであろう。リボソームＲＮＡ分子は、水素結合によって非常に安定した分子内ヘリックスおよび二次構造を形成することで知られている。ハイブリダイゼーション条件下で実質的に一本鎖のままである標的核酸の領域に対するプローブを設計することにより、プローブと標的との間のハイブリダイゼーションの速度および程度が増加され得る。

ゲノムリボソーム核酸（ｒＤＮＡ）標的は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の産物と同様に、二本鎖形態で自然発生する。これらの二本鎖標的は、プローブとのハイブリダイゼーションに生来阻害性であり、ハイブリダイゼーション前に変性を必要とする。適切な変性およびハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５）を参照されたい）。

それらの標的核酸に完全に一致したオリゴヌクレオチドの融解温度の推定値を提供するであろういくつかの式が利用可能である。１つのそのような式は、次のとおりである：
Ｔ_ｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ_１０［Ｎａ^＋］）＋０．４１（分率Ｇ＋Ｃ）－（６００／Ｎ）
（式中、Ｎがヌクレオチドの数でのオリゴヌクレオチドの長さである）、１４ヌクレオチド長と６０～７０ヌクレオチド長との間のオリゴヌクレオチドのＴ_ｍの良好な推定値を提供する。かかる計算から、Ｔ_ｍのその後の経験的検証または「微調整」が、当該技術分野で周知のスクリーニング技法を使用して行われ得る。ハイブリダイゼーションおよびオリゴヌクレオチドプローブに関するさらなる情報については、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ＥＴ ＡＬ．（上記）第１１章を参照することができる。この参考文献は、当該技術分野で周知のものの中でもとりわけ、ハイブリッドのＴ_ｍに対するミスマッチの影響の推定値を提供する。したがって、２つ以上の生物のリボソームＲＮＡ（またはｒＤＮＡ）の所与の領域の既知のヌクレオチド配列から、これらの生物を互いに区別するであろうオリゴヌクレオチドが設計され得る。

オリゴヌクレオチドの調製
本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅プライマー、および捕捉プローブは、当該技術分野で既知の方法によって容易に調製することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、固相法を使用して合成される。ホスホジエステル結合によってヌクレオチドを結合するための標準のホスホルアミダイト固相化学は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ Ｍｅｔｈｏｄ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：２８７（１９８７）に開示されている。シアノエチルホスホルアミダイト前駆体を使用した自動固相化学合成がＢａｒｏｎｅによって説明されている。Ｂａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｓ－ｄｉａｌｋｙｌａｍｉｎｅｐｈｏｓｐｈｉｎｅｓ －－ ａ Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ Ｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２（１０）：４０５１（１９８４）を参照されたい。Ｂａｔｔは、「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｕｌｆｕｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」という表題の米国特許第５，４４９，７６９号で、ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドを合成するための手順を開示している。加えて、Ｒｉｌｅｙらは、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」という表題の米国特許第５，８１１，５３８号で、メチルホスホネート結合を含む異なる結合を有するオリゴヌクレオチドの合成を開示している。さらに、オリゴヌクレオチドの有機合成のための方法は、当業者に既知であり、例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ＥＴ ＡＬ．（上記）第１０章に記載されている。

特定のオリゴヌクレオチドの合成および精製後、いくつかの異なる手順を利用して、そのオリゴヌクレオチドを精製し、その品質を制御することができる。好適な手順は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高圧液体クロマトグラフィーを含む。これらの手順はいずれも、当業者に周知である。

本開示のオリゴヌクレオチドはすべて、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅プライマー、または捕捉プローブであるかにかかわらず、それらの性能を増強するために、または増幅産物の特徴付けを容易にするために化学基で修飾され得る。例えば、オリゴヌクレオチドをある特定のポリメラーゼの核酸分解活性またはヌクレアーゼ酵素に対して耐性にする骨格修飾オリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、２’－Ｏ－アルキル、またはペプチド基を有するオリゴヌクレオチドは、増幅または他の反応でのかかる酵素の使用を可能にし得る。修飾の別の例は、プローブまたはプライマーの核酸鎖内のヌクレオチド間に組み込まれ、かつプローブのハイブリダイゼーションまたはプライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長を防止しない非ヌクレオチドリンカーを使用することを含む。Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｏｎ－Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｎｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ”（米国特許第６，０３１，０９１号）を参照されたい。本開示のオリゴヌクレオチドは、所望の修飾および天然ヌクレオチドの混合物も含み得る。

増幅オリゴヌクレオチドの３’末端は、Ｋａｃｉａｎらによって米国特許第５，５５４，５１６号に開示されるＤＮＡ合成の開始を防止または阻害するように修飾またはブロックすることができる。増幅ヌクレオチドの３’末端は、当該技術分野で周知の様々な方法で修飾することができる。例として、適切な修飾は、リボヌクレオチド、３’デオキシヌクレオチド残基（例えば、コルジセピン）、２’，３’－ジデオキシヌクレオチド残基、修飾ヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート、および非ヌクレオチド結合、例えば、Ａｒｎｏｌｄらによって米国特許第６，０３１，０９１号に開示されるものまたはアルカン－ジオール修飾（Ｗｉｌｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｂａｃｋｂｏｎｅ－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ Ｂｕｔａｎｅｄｉｏｌ－１，３ Ｍｏｉｅｔｙ ａｓ ａ ‘Ｖｉｃａｒｉｏｕｓ Ｓｅｇｍｅｎｔ’ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｙｌ Ｍｏｉｅｔｙ －－ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８（８）：２０６５（１９９０）を参照されたい）の付加を含み得るか、またはその修飾は、単に標的核酸配列に非相補的なプライミング配列の領域３’からなり得る。加えて、異なる３’ブロックプライマーまたは３’ブロックもしくは非ブロックプライマーの混合物は、そこで開示されるように、核酸増幅の効率を増加させ得る。

プライマーの５’末端は、いくつかの核酸ポリメラーゼに存在する５’－エキソヌクレアーゼ活性に耐性を示すように修飾することができる。かかる修飾は、Ａｒｎｏｌｄらによって米国特許第６，０３１，０９１号に開示される技法などの技法を使用して、プライマーの末端５’ヌクレオチドに非ヌクレオチド基を付加することによって行うことができる。鎖置換を容易にするために、５’末端は、Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ，“Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”（米国特許第６，０８７，１３３号）に開示されるように、非相補ヌクレオチドを含むようにも修飾され得る。

合成されると、選択されたオリゴヌクレオチドがいくつかの周知の方法のうちのいずれかによって標識され得る（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ（上記）第１０章を参照されたい）。有用な標識には、放射性同位体および非放射性レポート基が含まれる。同位体標識には、^３Ｈ、^３５Ｓ、^３２Ｐ、^１２５Ｉ、^５７Ｃｏ、および^１４Ｃが含まれる。同位体標識は、ニック翻訳、末端標識、第二鎖合成、逆転写の使用などの当該技術分野で既知の技法によって、かつ化学的方法によってオリゴヌクレオチドに導入することができる。放射性標識プローブを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、オートラジオグラフィー、シンチレーションカウンティング、またはガンマカウンティングによって検出することができる。選択される検出法は、標識に使用される特定の放射性同位体に依存するであろう。

非同位体材料も標識に使用することができ、核酸配列の内部にまたは核酸配列の末端に導入され得る。修飾ヌクレオチドは、酵素的または化学的に組み込まれ得る。プローブの化学的修飾は、例えば、Ａｒｎｏｌｄらによって米国特許第６，０３１，０９１号に開示されるように、非ヌクレオチドリンカー基を使用してプローブの合成中または合成後に行われ得る。非同位体標識には、蛍光分子（Ｔｙａｇｉらによって米国特許第５，９２５，５１７号に開示される蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対などの個々の標識または相互作用標識の組み合わせ）、化学発光分子、酵素、補因子、酵素基質、ハプテン、または他のリガンドが含まれる。いくつかの実施形態において、本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、標準アクリジニウムエステル（ＡＥ）などのＡＥを有する非ヌクレオチドリンカーによって標識される。アクリジニウムエステル標識は、Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，“Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｅｓｔｅｒ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ”（米国特許第５，１８５，４３９号）に開示されるように行われ得る。

核酸増幅
好ましくは、本開示の増幅プライマーは、オリゴマーであり、核酸ポリメラーゼによる伸長のための基質として使用されるのに十分に長い。最適なプライマーの長さは、反応の温度、プライマーの構造および塩基組成、ならびにプライマーがどのように使用されるべきかを含むいくつかの因子を考慮すべきである。例えば、最適な特異性のために、オリゴヌクレオチドプライマーは、一般に、標的核酸配列の複雑さに応じて、少なくとも１２塩基の長さであるべきである。かかる特異性が必須でない場合、より短いプライマーが使用され得る。そのような場合、鋳型核酸との安定したハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度で反応を行うことが望ましい場合がある。

所望の特徴を有する増幅プライマーを設計するための有用なガイドラインは、上記の「オリゴヌクレオチドの調製」という表題の節に記載されている。増幅およびプローブのための最適な部位は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ核酸の少なくとも２つ、好ましくは３つの保存領域を含む。これらの領域は、約１５～３５０塩基の長さ、好ましくは約１５～１５０塩基の長さである。

増幅プライマーのセット（プライマーおよび／またはプロモーター－プライマー）で観察される増幅の程度は、それらの特定の標的配列にハイブリダイズするプライマーの能力および酵素により伸長またはコピーされるそれらの能力を含むいくつかの因子に依存する。異なる長さおよび塩基組成の増幅プライマーが使用され得るが、本開示において好ましい増幅プライマーは、１７～２２個の塩基の標的結合領域を有し、予測されるＴ_ｍは、好ましくは４２℃超、好ましくは少なくとも約５０℃を目標とする。

標的配列の融解温度、相補性、および二次構造などのプローブハイブリダイゼーションに影響を及ぼすパラメータも、増幅プライマーハイブリダイゼーションに影響を及ぼし、ひいては増幅プライマーの性能に影響を及ぼす。非特異的伸長（プライマー－二量体または非標的コピー）の程度も増幅効率に影響を及ぼし得る。したがって、増幅プライマーは、一般に、特にそれらの配列の３’末端に低い自己相補性または交差相補性を有するように選択される。Ｎａｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ”（米国特許第５，９５８，７００号）に開示される自己報告「シグナルプライマー」、およびＮａｚａｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｌａｂｅｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒｅｏｎ”（米国特許第５，８６６，３３６号）に開示される「ヘアピンプライマー」などの自己相補性領域を含む増幅プライマーが有用であり得る。偽プライマー伸長を減少させるために、長いホモポリマーランおよび高いＧＣ含有量が避けられている。Ｏｌｉｇｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＯｌｉｇｏ Ｔｅｃｈ（登録商標）分析ソフトウェアを含むその設計のこの態様に役立つコンピュータプログラムが利用可能である。

本開示の増幅プライマーとともに使用される核酸ポリメラーゼとは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれかまたはそれらの両方を核酸ポリマーまたは鎖に鋳型依存的に組み込む化学的、物理的、または生物学的薬剤を指す。核酸ポリメラーゼの例には、ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型依存的な５’から３’の方向の核酸合成をもたらす。二本鎖核酸中のこれらの２つの鎖の典型的な逆平行配向のため、この方向は、鋳型上の３’領域から鋳型上の５’領域である。ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼの例には、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）由来のＤＮＡポリメラーゼＩの大きい断片が含まれる。例えば、Ｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ”（米国特許第６，０６６，４８３号）を参照されたい。ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼの例には、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素またはトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素などの様々なレトロウイルス逆転写酵素が挙げられる。

ほとんどの核酸増幅反応中に、核酸ポリメラーゼは、標的核酸を鋳型として使用してプライマーの３’末端にヌクレオチド残基を付加し、それ故に、標的核酸の領域に部分的または完全に相補的なヌクレオチド配列を有する第２の核酸鎖を合成する。多くの核酸増幅反応では、増幅反応を進行させるために、結果として得られた二本鎖構造を含む２つの鎖が化学的または物理的手段によって分離されなければならない。あるいは、新たに合成された鋳型鎖は、鎖置換または元の標的鎖の一部またはすべてを消化する核酸分解酵素の使用などの他の手段によって、第２のプライマーまたはプロモーター－プライマーとのハイブリダイゼーションに利用可能になり得る。このようにして、このプロセスは、いくつかのサイクルで繰り返され、標的ヌクレオチド配列を有する核酸分子の数の大幅な増加をもたらし得る。

第１の増幅プライマーもしくは第２の増幅プライマーのいずれかまたはそれらの両方がプロモーター－プライマーであり得る。いくつかの用途では、増幅プライマーは、Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｋｉｔ”（米国特許第５，５５４，５１６号）に開示されるように、センス鎖に相補的なプロモーター－プライマーのみからなり得る。プロモーター－プライマーは、通常、標的核酸分子またはプライマー伸長産物に存在するヌクレオチド配列に相補的ではないオリゴヌクレオチドセグメントを含む（例えば、Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ”（米国特許第５，３９９，４９１号）を参照されたい）。これらの非相補配列は、増幅プライマー上の相補配列に対して５’位に位置し得、核酸ポリメラーゼの作用により二本鎖にされたときにＲＮＡ合成の開始のための遺伝子座を提供し得る。そのように提供されたプロモーターは、標的核酸配列の複数のＲＮＡコピーのインビトロ転写を可能にし得る。文脈が別途明確に指示しない限り、本明細書におけるプライマーへのすべての言及がプライマーおよびプロモーター－プライマーを含むことが理解されるであろう。

好ましい増幅法は、Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ”、米国特許第５，４８０，７８４号によって開示される転写媒介増幅法である。この方法によれば、標的の一部分に相補的な３’領域および５’プロモーター領域を有するプロモーター－プライマー、ならびに標的の一部分と同じヌクレオチド配列を有するプライマーは、標的ＲＮＡ分子と接触させる。プライマーおよびプロモーター－プライマーは、標的分子上に存在するセンスおよびその相補体の両方、ならびによってアンプリコンの長さおよび配列を含む、増幅される標的領域の境界を定義する。この好ましい実施形態では、増幅オリゴヌクレオチドおよび固定化標的ＲＮＡは、有効量のモロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド三リン酸の両方、ならびに必要な塩および補因子の存在下、４２℃で接触させる。これらの条件下では、核酸増幅が起こり、主に、標的核酸とは反対のセンスのＲＮＡアンプリコンの産生をもたらす。次に、これらのアンプリコンは、例えば、１つ以上の検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用することによって、溶液中で検出することができる。いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションプローブは、標的核酸と同じセンスのアクリジニウムエステル標識ハイブリダイゼーションプローブであり、米国特許第５，２８３，１７４号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示されるように、ＨＰＡ技術を使用して検出することができる。

固定化プローブおよび捕捉プローブの３’末端は、好ましくは、核酸ポリメラーゼ活性の基材としてのそれらの使用を防止または阻害するために「キャップ」またはブロックされる。キャッピングは、３’デオキシリボヌクレオチド（コルジセピンなど）、３’，２’－ジデオキシヌクレオチド残基、米国特許第６，０３１，０９１号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示されるものなどの、非ヌクレオチドリンカー、アルカン－ジオール修飾、または非３’末端の非相補ヌクレオチド残基を含み得る。

当業者は、上記方法論が、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｑβレプリカーゼ媒介増幅、自家持続配列複製（３ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）を含む、様々な他の増幅スキームに、記載されるように、または明らかな修飾有するかのいずれかで、適していることを認識するであろう。

試料処理
標的配列の増幅または検出の前の試料処理は、試料中に存在する非標的核酸から標的配列を区別するために必要または有用であり得る。試料処理手順は、例えば、不均一アッセイにおける溶液相からの核酸および／またはオリゴヌクレオチドの直接的または間接的固定化を含み得る。いくつかの手順では、そのような固定化は、複数のハイブリダイゼーション事象を必要とし得る。“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｂｙ ａ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｓａｎｄｗｉｃｈ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ”、米国特許第４，４８６，５３９号および同第４，５６３，４１９号においてＲａｎｋｉらは、例えば、標的相補的配列および標的核酸の別個の領域に相補的である標識された核酸プローブを有する固相結合核酸の使用を含む一段階核酸「サンドイッチ」ハイブリダイゼーション法を開示する。Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｋｉｔｓ ｆｏｒ Ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ”、米国特許第４，７５１，１７７号は、固体支持体からの固定化プローブの漏出に起因するＲａｎｋｉの方法に関連する感度問題を報告によれば克服する「メディエーター」ポリヌクレオチドを含む方法を開示する。標的核酸を直接的に固定化する代わりに、Ｓｔａｂｉｎｓｋｙのメディエーターポリヌクレオチドは、溶液中で遊離して形成した標的ポリヌクレオチド：プローブポリヌクレオチド複合体を結合および間接的に固定化するために使用される。

溶液中に遊離しているマトリックスおよび粒子などの、任意の既知の固体支持体は、試料処理に使用され得る。固体支持体は、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、および好ましくは、試料の回収および／または非結合核酸または他の試料成分の除去を促進する磁気的に誘引可能な粒子であり得る。特に好ましい支持体は、単分散である（すなわち、サイズが±５％で均一である）磁性球であり、それによって一貫した結果を提供し、これは自動化された手順での使用に特に有利である。１つのそのような自動化された手順は、Ａｍｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ａ Ｔａｒｇｅｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ”、米国特許第６，３３５，１６６号によって開示される。

固体支持体上に標的核酸を固定化するためのオリゴヌクレオチドは、アッセイ条件（例えば、増幅および／または検出のための条件）下で安定である任意の結合または相互作用によって、固体支持体に直接的または間接的に結合され得る。本明細書では「固定化プローブ」と呼ばれるこのオリゴヌクレオチドは、標的核酸に直接結合し得るか、またはホモポリマートラクト（例えば、ポリｄＴ）もしくは単純な短い反復配列（例えば、ＡＴリピート）などの塩基配列領域を含み得、これは、捕捉プローブ上に存在する相補塩基配列領域にハイブリダイズする。直接結合は、固定化プローブが中間オリゴヌクレオチドの不在下で固体支持体に結合されるときに発生する。例えば、直接結合は、共有結合、キレート化、またはイオン性相互作用を介し得る。間接的結合は、固定化プローブが１つ以上のリンカーによって固体支持体に結合されるときに発生する。「リンカー」は、少なくとも２つの異なる分子を安定な複合体に結合するための手段であり、結合パートナーセットの１つ以上の成分を含有する。

結合パートナーセットのメンバーは、互いに認識および結合することができる。結合パートナーセットは、例えば、受容体およびリガンド、酵素および基質、酵素および補因子、酵素および補酵素、抗体および抗原、糖およびレクチン、ビオチンおよびストレプトアビジン、リガンドおよびキレート剤、ニッケルおよびヒスチジン、実質的に相補的なオリゴヌクレオチド、およびポリマー核酸の相補的なホモポリマー核酸またはホモポリマー部分であり得る。結合パートナーセットの成分は、結合に関与するメンバーの領域である。

その使いやすさおよび迅速さの点で実用的な利点を有する好ましい試料処理システムは、本明細書において「固定化プローブ結合領域」と呼ばれる、捕捉プローブの塩基配列に相補的な塩基配列を含む固定化プローブを含む。捕捉プローブは、アッセイ条件下で標的核酸に含まれる標的配列に特異的にハイブリダイズし得る、本明細書において「標的結合領域」と呼ばれる、塩基配列をさらに含む。標的核酸の領域についての捕捉プローブの標的結合領域の特異性は、分離ステップ後に試料から残る非標的核酸の数を最小化するために望ましいが、それは、捕捉プローブが標的核酸を単離するためだけに使用されている場合、本開示の捕捉プローブの要件ではない。捕捉プローブが、標的配列のその後の増幅のために標的核酸を単離するために使用されていない場合、捕捉プローブは、置換または非置換アクリジニウムエステルなどの、標的結合領域内またはその近くに結合した検出可能な標識をさらに含み得る。標識された捕捉プローブは、捕捉プローブなどの一本鎖核酸を検出することなくハイブリッド核酸を特異的に検出するために、均一または半均一アッセイにおいて使用され得る。

このシステムの利点は、本明細書に記載される他の試料処理手順において必要とされる複数のそのような事象（例えば、捕捉プローブ：標的およびプローブ：標的またはプローブ：アンプリコン）ではなく、単一の標的特異的ハイブリダイゼーション事象（捕捉プローブ：標的）のみが標的検出に必要であることである。また、標的核酸が捕捉され、検出される全体的な速度は、最も遅いハイブリダイズオリゴヌクレオチドによって制限されるため、アッセイ中のオリゴヌクレオチドが少ないと、アッセイがより速く、より簡単に最適化される傾向がある。捕捉プローブの標的結合領域は、代替アッセイシステムでは特異性が低い場合があるが、それは依然として、非標的核酸での捕捉プローブの有意な飽和を回避するのに十分にまれでなければならない。よって、２つの別々の特異的な標的配列がこれらの代替システムにおいて特定されるという要件は、適切な標的の特定に制約を課し得る。対照的に、捕捉プローブが同時に検出プローブとして機能する場合、１つのみのそのような標的配列が必要とされる。

どちらのアプローチを採用する場合でも、アッセイは、試験試料中の標的核酸の存在を検出するための手段を含んでもよい。検出可能な標識の存在を必要としない手段を含む、標的核酸を検出するための様々な手段が、核酸検出の当業者に周知である。それにもかかわらず、検出可能な標識を含むプローブが好ましい。標的核酸の存在を検出するための標識プローブは、標的核酸に含まれる標的配列に実質的に相補的であり、これに特異的にハイブリダイズする塩基配列を含まなければならないであろう。プローブが標的核酸に安定して結合し、得られる標的：プローブハイブリッドが直接的または間接的に固定化されると、非結合プローブは、洗い流すか、または不活性化することができ、残る結合プローブは、検出および／または測定することができる。

好ましい試料処理システムは、検出および核酸増幅の要素を組み合わせる。これらのシステムは、標的核酸を直接的または間接的にまず固定化し（例えば、捕捉プローブを使用して）、捕捉された標的核酸は、細胞破片、非標的核酸、および増幅阻害剤を試料を含む容器から除去することによって精製され、続いて標的核酸に含まれる標的配列の増幅が行われる。次いで、増幅産物が、標識されたプローブで、好ましくは溶液中で検出される。標的核酸は、増幅中に固定化状態のままであり得るか、または捕捉プローブ：標的複合体のＴ_ｍ、および／もしくは捕捉プローブ：固定化プローブ複合体のＴ_ｍを超える温度でまずインキュベートするなどの、適切な条件を使用して増幅する前に固体支持体から溶出もしくは分離され得る。このシステムの好ましい実施形態は、Ｗｅｉｓｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｗｏ－Ｓｔｅｐ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ”、米国特許第６，１１０，６７８号によって開示される。このシステムでは、捕捉プローブは、標的核酸にハイブリダイズし、固定化プローブは、異なるハイブリダイゼーション条件下で捕捉プローブ：標的複合体にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件の第１のセットの下では、捕捉プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションは、捕捉プローブの固定化プローブへのハイブリダイゼーションよりも好ましい。よって、この条件の第１のセットの下では、捕捉プローブは、固体支持体に結合されるのではなく溶液中にあり、それによって遊離捕捉プローブの濃度を最大化し、標的核酸へのハイブリダイゼーションに好ましい溶液相動力学を利用する。捕捉プローブが標的核酸にハイブリダイズするのに十分な時間を有した後、ハイブリダイゼーション条件の第２のセットが課され、捕捉プローブ：標的複合体において固定化プローブにハイブリダイズすることを可能にし、それによって試料溶液中の標的核酸を単離する。次いで、固定化された標的核酸が精製され得、標的核酸に存在する標的配列が増幅および検出され得る。粗製試料（例えば、臨床、環境、工業、食品、水など）を処理して、試料中に存在する物質による酵素阻害および／または核酸分解を防止する場合、１つ以上の洗浄ステップを含む精製手順が一般に望ましい。

リボソーム核酸を単離するための捕捉プローブ
本開示の捕捉プローブは、非標的核酸の存在下で、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの２３Ｓリボソーム核酸に由来する核酸に結合し、これを単離するように設計される。そのようなものとして、捕捉プローブは、標的結合領域および固定化プローブ結合領域の両方を含む。捕捉プローブの標的結合領域は、アッセイ条件下でＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍからの２３Ｓリボソーム核酸に由来する標的配列にハイブリダイズする塩基配列を含む。必須ではないが、標的結合領域は、好ましくは、アッセイ条件下、非標的核酸の存在下で標的配列について特異性を示す。固定化プローブ結合領域は、ポリヌクレオチド、または直接的または間接的のいずれかで、試験試料中に存在する固体支持体に結合される、ポリヌクレオチド配列を含むキメラを含む固定化プローブにハイブリダイズする塩基配列を有する。標的結合領域および固定化プローブ結合領域は、直接、または例えば、ヌクレオチド塩基配列、脱塩基配列、または非ヌクレオチドリンカーによって、互いに結合され得る。

好ましい実施形態では、本開示による捕捉プローブは、本明細書に開示される捕捉プローブのうちの１つに対して少なくとも約８５％相同性（好ましくは少なくとも約９０％相同性、より好ましくは少なくとも約９５％相同性、最も好ましくは１００％相同性）である塩基配列領域を含む標的結合領域を含む。これらの好ましい捕捉プローブの固定化プローブ結合領域は、アッセイ条件下で試験試料に提供される固体支持体に直接的または間接的に結合した固定化プローブにハイブリダイズする塩基配列を含む。固定化プローブ結合領域は、好ましくは、固定化プローブの５’末端に位置するホモポリマー領域（例えば、ポリ（ｄＴ））に相補的である捕捉プローブの３’末端に位置するホモポリマー領域（例えば、ポリ（ｄＡ））を含む。他の塩基配列は、例えば、短い反復配列を含む、固定化プローブ結合領域に組み込まれ得る。

望ましくないクロスハイブリダイゼーション反応を防止するために、本開示の捕捉プローブは、好ましくは、標的結合領域のヌクレオチド塩基配列以外のヌクレオチド塩基配列を除外し、これは、アッセイ条件下での試験試料中に存在し得る任意の生物に由来する核酸に安定して結合することができる。このアプローチと一貫して、形成される捕捉プローブ：標的複合体の固定化を最大化するために、固定化プローブ結合領域のヌクレオチド塩基配列は、好ましくは、試験試料中に存在し得る任意の生物に由来する核酸ではなく、アッセイ条件下で固定化プローブ中に存在するヌクレオチド塩基配列に安定して結合することができるように設計される。

捕捉プローブの標的結合領域および固定化プローブ結合領域は、捕捉プローブ：標的複合体が捕捉プローブ：固定化プローブ複合体のＴ_ｍよりも高いＴ_ｍを有するように選択され得る。このようにして、固定化プローブよりも標的配列への捕捉プローブのハイブリダイゼーションを好む条件の第１のセットが課され、それによって捕捉プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションに最適な溶液相ハイブリダイゼーション動力学を提供し得る。捕捉プローブが標的配列に結合するのに十分な時間が経過すると、固定化プローブへの捕捉プローブのハイブリダイゼーションを可能にする、あまりストリンジェントではない条件の第２のセットが課され得る。これらの用途に有用な条件のセットは、日常的な実験のみを使用して当業者によって確立することができる。

本開示の捕捉プローブはまた、試験試料中の標的配列の直接検出のための標識または相互作用標識対を含み得る。標識、標識の組み合わせ、およびプローブを標識するための手段の非限定的な例は、上記に記載される。

直接検出アッセイにおけるそれらの適用にかかわらず、捕捉プローブの最も一般的な使用は、標的核酸に含まれる標的配列を増幅する前の標的核酸の単離および精製におけるものである。増幅の前に標的核酸を単離および精製することによって、意図されない増幅反応（すなわち、非標的核酸の増幅）の数は、有利に減少することができる。増幅試薬の存在下および増幅条件下で、捕捉プローブ自体が核酸ポリメラーゼ活性の基材として機能することを防止または阻害するために、捕捉プローブの３’末端をキャップまたはブロックすることができる。キャッピング剤の例には、３’デオキシリボヌクレオチド、３’，２’－ジデオキシヌクレオチド残基、非ヌクレオチドリンカー、アルカン－ジオール修飾、および３’末端の非相補ヌクレオチド残基が含まれる。

以下の特定の実施例は、標的核酸配列の増幅の前に標的核酸を単離および精製するための標的捕捉ステップを組み込んだ。これらの実施例の捕捉プローブは、配列番号３４、配列番号３５、および配列番号３６の５’標的結合領域を有し、さらに、配列番号３７、配列番号３８、および配列番号３９によって与えられる、３０ヌクレオチドの長さのポリｄＡテールを有する３’固定化プローブ結合領域を含んでいた。捕捉プローブの標的結合領域は、プライマー、プロモーター－プライマー、およびハイブリダイゼーションアッセイプローブによって結合された領域とは異なる標的核酸の領域に結合するように設計された。この標的捕捉アッセイの固体支持体は、Ｓｅｒａ－Ｍａｇ（商標）ＭＧ－ＣＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ（Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２４１５２１０５－０５０４５０）、１ミクロン、ハイブリダイゼーション条件下で捕捉プローブのポリｄＡテールに結合することができた共有結合オリゴ（ｄＴ）_１４を有する超常磁性粒子であり得る。同様の磁性粒子は、Ｓｕｔｏｒ，“Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ Ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”、米国特許第５，６４８，１２４号によって開示されている。粒子を懸濁液から取り出し、試料チューブの内壁に沿って固定化するために、チューブを、米国特許第６，２５４，８２６号においてＡｃｏｓｔａらによって開示された磁気分離ラックに移した。粒子が固定化されている間、流体をチューブから吸引し、チューブを以下に記載される洗浄緩衝液で洗浄した。洗浄ステップは、標的配列を増幅するための下記の増幅試薬および酵素試薬を添加する前に繰り返すことができる。洗浄ステップ間に、粒子は、洗浄緩衝液に再懸濁することができる。

Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍリボソーム核酸の増幅
本開示の増幅プライマーは、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する２３Ｓリボソーム核酸の領域を対象としている。増幅プライマーは、核酸増幅アッセイを使用してＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの存在を検出するために使用されるハイブリダイゼーションアッセイプローブの標的核酸配列（またはその相補体）のうちの少なくとも１つに隣接、重複、またはこの内に含まれ得る。上記に示されるように、増幅プライマーはまた、それらの５’末端において非相補塩基を含み得、任意選択で、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、標的核酸をテンプレートとして使用してＲＮＡ転写を誘導することができるプロモーター配列（例えば、Ｔ７プロモーター配列）を含み得る。

本開示の増幅プライマーは、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸中に存在する標的核酸配列を増幅することができる。第１鎖増幅プライマーは、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のいずれかの１８～２２個の連続する塩基を含むか、またはそれからなる塩基の標的ハイブリダイズ配列を有するオリゴヌクレオチドを含み、任意選択で５’プロモーター配列（例えば、配列番号９）を含む。例示的な第１鎖プライマーは、配列番号８、配列番号７、または配列番号６の標的ハイブリダイズ配列を有する。第２鎖増幅プライマーは、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５の１７～２０個の連続する塩基を含むか、またはそれからなる塩基の標的ハイブリダイズ配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。例示的な第２の鎖プライマーは、配列番号１８、配列番号１７、または配列番号１６の標的ハイブリダイズ配列を有する。

本開示の増幅プライマーは、（上で論じられる）ブロックされた３’および／または５’末端、あるいはＲＮＡポリメラーゼによって認識される特定のヌクレオチド配列（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列）、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の開始もしくは伸長を増強する配列、または分子内塩基対合を提供し、二次もしくは三次核酸構造の形成を促進し得る配列を含むが、これらに限定されない配列付加などの修飾を有し得る。

増幅プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｑレプリカーゼ媒介増幅、自家持続配列複製（３ＳＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、およびループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）などの核酸増幅手順で使用され、これらの各々は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｍｕｌｌｉｓ，“Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”、米国特許第４，６８３，２０２号、Ｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｋｉｔｓ ｆｏｒ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”、米国特許第６，１９７，５６３号、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ－－ａｎ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０（７）：１６９１－１６９６（１９９２）、Ｆａｈｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｌｆ－ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（３ＳＲ）：Ａｎ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ ＰＣＲ，”ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１：２５－３３（１９９１）、Ｋａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，３９９，４９１号、Ｄａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ”、米国特許第５，５５４，５１７号、Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｕｓｉｎｇ Ｇａｐ Ｆｉｌｌｉｎｇ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”、米国特許第５，４２７，９３０号、Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”、米国特許第５，６８６，２７２号、Ｗａｌｋｅｒ，“Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”、米国特許第５，７１２，１２４号、Ｎｏｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ”、米国特許第６，４１０，２７８号、Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”、米国特許第６，２１４，５８７号、およびＨｅｌｅｎ Ｈ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ（１９９７）を参照されたい。特に示されないが、「核酸増幅」の定義を満たす他の増幅手順もまた、本発明者らによって企図される。

本開示の増幅プライマーは、好ましくは非標識であるが、ハイブリダイゼーションアッセイプローブと組み合わせて、またはこれを除いて、標的核酸の検出を促進するために１つ以上のレポーター基を含み得る。増幅標的配列を直接検出するために、多種多様な方法が利用可能である。例えば、ヌクレオチド基質またはプライマーは、新たに合成されたＤＮＡに組み込まれる検出可能な標識を含むことができる。得られる標識増幅産物は、次いで一般に、使用されていない標識されたヌクレオチドまたはプライマーから分離され、標識は、分離された産物画分で検出される。例えば、Ｗｕ，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ”、米国特許第５，３８７，５１０号を参照されたい。

プライマーが、例えば、ドナー／アクセプター色素対（すなわち、相互作用標識の対）を形成する２つの色素に結合することによって修飾される場合、分離ステップは必要とされない。修飾されたプライマーは、プライマーが標的核酸にハイブリダイズしない限り、一方の色素対メンバーの蛍光が他方の色素対メンバーによって消光されたままであり、それによって２つの色素を物理的に分離するように設計することができる。さらに、プライマーは、２つの色素間に位置付けられた制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むようにさらに修飾することができるので、修飾されたプライマーと標的核酸との間にハイブリッドが形成される場合、制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、二本鎖になり、適切な制限エンドヌクレアーゼによる切断またはニッキングに利用可能になる。ハイブリッドの切断またはニッキングは、次いで２つの色素を分離し、消光の減少による蛍光の変化をもたらし、これは、試験試料中の標的生物の存在の指標として検出することができる。そのような修飾プライマーは、Ｎａｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ”、米国特許第５，９５８，７００号および同第６，０５４，２７９号によって開示されている。

有用な検出可能な標識として機能することができる物質は、当該技術分野で周知であり、放射性同位体、蛍光分子、化学発光分子、クロモフォア、ならびにビオチンおよびハプテンなどのリガンドを含み、これは、直接検出可能ではないが、それらの特定の結合パートナーの標識された形態（例えば、それぞれ、アビジンおよび抗体）との反応によって容易に検出することができる。

別のアプローチは、検出可能に標識されたプローブとのハイブリダイゼーション、および得られるハイブリッドを任意の従来の方法で測定することによって増幅産物を検出することである。例えば、産物は、化学発光性のアクリジニウムエステル標識プローブを標的配列にハイブリダイズし、ハイブリダイズされていないプローブ上に存在するアクリジニウムエステルを選択的に加水分解し、ルミノメーターで残りのアクリジニウムエステルから産生される化学発光を測定することによってアッセイすることができる。例えば、Ａｒｎｏｌｄら、米国特許第５，２８３，１７４号、およびＮｅｌｓｏｎら、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｐｒｏｂｉｎｇ，Ｂｌｏｔｔｉｎｇ，ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｃｈ．１７（Ｌａｒｒｙ Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ ｅｄ．，２ｄ ｅｄ．１９９５）を参照されたい。

Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍリボソーム核酸へのハイブリダイゼーションアッセイプローブ
本明細書に開示されるのは、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸（例えば、核酸増幅産物）を検出するのに有用な新規のハイブリダイゼーションアッセイプローブである。ハイブリダイゼーションは、水素結合した二本鎖を形成する相補核酸の２つの一本鎖の会合である。検出されることが求められる核酸配列（「標的配列」）にハイブリダイズすることができる核酸配列は、標的配列のプローブとして機能することができる。ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ、およびＲＮＡ／ＲＮＡを含む、相補核酸鎖間で起こり得る。塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、イノシン（Ｉ）、およびそれらの類似体を含むヌクレオチドから形成された、デオキシリボ－（ＤＮＡ）またはリボ－（ＲＮＡ）核酸の２つの一本鎖は、ハイブリダイズして、２つの鎖が相補塩基の対の間の水素結合によって一緒に保持される二本鎖構造を形成し得る。一般に、Ａは、ＴまたはＵに水素結合され、Ｇは、Ｃに水素結合される。したがって、ハイブリダイズされた鎖に沿った任意の点で、古典的な塩基対ＡＴまたはＡＵ、ＴＡまたはＵＡ、ＧＣまたはＣＧが見られ得る。よって、核酸の第１の一本鎖が第２に対する十分な連続する相補塩基を含み、それらの２つの鎖がそれらのハイブリダイゼーションを促進するであろう条件下で一緒にされる場合、二本鎖核酸が生じるであろう。適切な条件下で、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが形成され得る。

ハイブリダイゼーションの速度および程度は、多くの因子によって影響される。例えば、２つの鎖のうちの１つが完全にまたは部分的にハイブリッドに含まれる場合、それは新しいハイブリッドの形成に関与することがあまりできなくなることを暗示している。関心のある配列のかなりの部分が一本鎖になるようにプローブを設計することによって、ハイブリダイゼーションの速度および程度は、大幅に増加され得る。また、標的が統合されたゲノム配列である場合、ＰＣＲの産物の場合のように、それは二本鎖形態で自然に発生するであろう。これらの二本鎖標的は、プローブとのハイブリダイゼーションに対して自然に阻害性であり、ハイブリダイゼーションステップの前に変性を必要とする。加えて、十分な自己相補性がある場合、プローブ内に形成される分子内ハイブリッドがあり得る。ハイブリダイゼーションに阻害性である強力な内部構造を形成することが知られる核酸の領域は、典型的には、あまり好ましくない。そのような構造の例には、ヘアピンループが含まれる。ハイブリダイゼーションアッセイプローブにおける望ましくない二次構造は、慎重なプローブ設計を通して回避することができ、Ｏｌｉｇｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＯｌｉｇｏ Ｔｅｃｈ（登録商標）分析ソフトウェアなどの、商業用コンピュータプログラムは、これらのタイプの相互作用について検索するために利用可能である。

均一アッセイなどのいくつかの用途では、少なくともいくらかの程度の自己相補性を示すプローブが、試験試料中のプローブ：標的二本鎖の検出を促進するために望ましい場合がある。本明細書において上記で考察したように、そのようなプローブは、「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」と呼ばれる自己相補性の別個の領域を含むように設計される「分子トーチ」を含む。これらの２つのドメインは、分子トーチにおける結合領域によって接続され、ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする。結合領域は、ポリエチレングリコールなどの非ヌクレオチドリンカーであり得る。分子トーチは、Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｒｃｈｅｓ”、米国特許第６，３６１，９４５号によって開示される。

変性条件に曝露されると、分子トーチの２つの相補的な領域（完全にまたは部分的に相補的であり得る）が融解し、標的結合ドメインを、元のハイブリダイゼーションアッセイ条件が回復したときに標的配列へのハイブリダイゼーションに利用可能にする。分子トーチは、標的結合ドメインが標的閉鎖ドメインよりも標的配列へのハイブリダイゼーションを優先するように設計される。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、分子トーチが標的核酸にハイブリダイズされるときとは異なるシグナルを、分子トーチが自己ハイブリダイズされるときに産生するように位置付けられた相互作用標識（例えば、フルオロフォア／クエンチャー）を含み、それによって、それと会合した存続可能な標識を有するハイブリダイズされていないプローブの存在下で試験試料中のプローブ：標的二本鎖の検出を可能にする。

米国特許第６，３６１，９４５号におけるＢｅｃｋｅｒらの教示に従って、本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸間を区別することができる「標的結合ドメイン」に加えて、「標的閉鎖ドメイン」、「結合領域」、および分子トーチに特徴的な相互作用標識を含むように設計および構築され得る。

自己相補ハイブリダイゼーションアッセイプローブの別の例は、「分子ビーコン」である。分子ビーコンは、標的補体配列、標的核酸配列の不在下で閉鎖立体構造にプローブを保持する親和性対（または核酸アーム）、およびプローブが閉鎖立体構造にある場合に相互作用する標識対を有する核酸分子を含む。標的核酸と標的相補的配列とのハイブリダイゼーションは、親和性対のメンバーを分離し、それによりプローブを開放立体配座にシフトさせる。開放立体構造へのシフトは、例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳ）であり得る、標識対の相互作用の低減により検出可能である。様々な分子ビーコン構成および用途の例は、米国特許第５，９２５，５１７号においてＴｙａｇｉらによって開示されている。Ｔｙａｇｉらの教示に従って、本開示によるプローブは、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸間を区別することができる「標的補体配列」に加えて、「親和性対」、および分子ビーコンに特徴的な二重標識を含むように設計および構築され得る。

ハイブリダイゼーションアッセイの場合では、標的核酸配列の長さ、したがって、プローブ配列の長さは、重要であり得る。いくつかの場合では、特定の領域からのいくつかの配列があり得、位置および長さが異なり、これは所望のハイブリダイゼーション特性を有するプローブをもたらすであろう。他の場合では、１つの配列は、単一の塩基のみが異なる別のものよりも良好なハイブリダイゼーション特性を有し得る。完全に相補的ではない核酸がハイブリダイズすることが可能であるが、完全に相同性の塩基配列の最長のストレッチは、通常、主にハイブリッド安定性を決定するであろう。異なる長さおよび塩基組成のプローブが使用され得るが、好ましいプローブは、最大１００個の塩基の長さ、より好ましくは１３～５０個の塩基の長さ、さらにより好ましくは１３～２２個の塩基の長さであるオリゴヌクレオチドを有する。

ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸中に存在するか、またはこれに由来する２３Ｓ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ標的配列に実質的に相補的な塩基配列を含む（例えば、核酸増幅産物を含む）。したがって、プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、または核酸増幅中に使用される条件下で、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ標的配列に安定して結合することができる。上で論じられるように、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、標的核酸に安定して結合しない追加の塩基配列を有し得る。

自己相補プローブに加えて、本開示のプローブは、捕捉プローブの固定化プローブ結合領域を含むように設計および構築され得、固定化プローブ結合領域は、所定のハイブリダイゼーション条件下で、固体支持体に直接的または間接的に結合した固定化プローブに含まれる実質的に相補的なヌクレオチド塩基配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基配列で構成される。固定化プローブ結合領域は、好ましくは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍを含む、試験試料中に存在し得る任意の生物からの核酸に安定して結合しないように選択される。よって、本開示による捕捉プローブの固定化プローブ結合領域について好ましいヌクレオチド塩基配列は、固定化プローブ上の５’ポリｄＴテールに一致する３’ポリｄＡテールなどのホモポリマーテールである。これらのテールは、所定のハイブリダイゼーション条件下で安定したハイブリダイゼーションを促進するために十分な任意の長さであり得、好ましくは約３０個の塩基の長さである。

固定化プローブは、好ましくは、プローブが試料中に存在する標的核酸にハイブリダイズするために十分な時間を有すると、精製ステップ中に反応容器において単離され得る磁気的に誘引可能な粒子に結合される。Ａｃｏｓｔａらは、米国特許第６，２５４，８２６号（“Ａｓｓａｙ Ｗｏｒｋ Ｓｔａｔｉｏｎ”）において、そのような精製ステップを行うために使用することができる機器を開示する。捕捉プローブは、好ましくは、捕捉プローブ：標的ハイブリッドの融解温度が捕捉プローブ：固定化プローブハイブリッドの融解温度よりも高くなるように設計される。このようにして、異なるセットのハイブリダイゼーションアッセイ条件を使用して、捕捉プローブの固定化されたオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの前に、捕捉プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションを促進し、それによって遊離プローブの濃度を最大化し、好ましい溶液相ハイブリダイゼーション動力学を提供することができる。この「二段階」標的捕捉方法は、上で論じられており、Ｗｅｉｓｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，１１０，６７８号によって開示される。本開示に容易に適合させることができる他の標的捕捉スキームは、当該技術分野で周知であり、限定なしに、以下：Ｄｕｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，“Ｍａｐｐｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｍＲＮＡｓ ｂｙ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，”６５（１）：４６８－４７８（１９８０）、Ｒａｎｋｉ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，４８６，５３９号、Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ、米国特許第４，７５１，１７７号、およびＢｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，１３０，０３８号によって開示されるものを含む。

Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍプローブについて、「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」、「標的配列」、および「標的領域」という用語はすべて、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ中に存在する核酸配列、またはそれに相補的な配列を指し、これは密接に関連する非Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ種の核酸中に存在しない。

本開示のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍプローブは、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基およびヌクレオチド類似体の置換を可能にする、少なくとも１３のヌクレオチドの長さの標的ハイブリダイズ配列を有するオリゴヌクレオチドであって、配列番号１９、配列番号２０、または配列番号２１からなる群から選択される塩基配列またはその相補体内に完全に含まれるオリゴヌクレオチドを含む。プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、非Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ生物に由来する核酸よりもＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する標的核酸に優先的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、プローブは、同じ条件下でＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成することができる塩基の標的ハイブリダイズ配列と重複して、またはそれに加えて、任意の他の標的相補塩基配列領域を含まない。いくつかの実施形態において、プローブは、フルオロフォアおよびクエンチャーで標識され、任意選択で、内部に配置された非ヌクレオチドリンカー（例えば、Ｃ９リンカー）を含む。

プローブは、任意の周知の方法によって、検出可能な標識またはレポーター基で標識され得る。例えば、プローブは、標的配列の検出を促進するために、放射性同位体、抗原、または化学発光部分などの検出可能な部分で標識され得る。有用な標識には、放射性同位体および非放射性レポート基が含まれる。同位体標識としては、^３Ｈ、^３５Ｓ、^３２Ｐ、^１２５Ｉ、^５７Ｃｏ、および^１４Ｃが挙げられる。同位体標識は、ニック翻訳、末端標識、第２鎖合成、逆転写などの当該技術分野で知られる技法によって、および化学的方法によってオリゴヌクレオチドに導入することができる。放射性標識プローブを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、オートラジオグラフィー、シンチレーションカウンティング、またはガンマカウンティングなどの技法によって検出することができる。選択される検出法は、標識に使用される特定の放射性同位体に依存する。

上で考察したように、非同位体材料も標識に使用することができ、ヌクレオチド間の内部またはオリゴヌクレオチドの末端に導入され得る。修飾ヌクレオチドは、酵素的または化学的に組み込まれ得る。オリゴヌクレオチドの化学的修飾は、当該技術分野で知られる技法を使用して、オリゴヌクレオチドの合成中または合成後に実施され得る。例えば、米国特許第６，０３１，０９１号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示される非ヌクレオチドリンカー基の使用による。非同位体標識には、蛍光分子、化学発光分子、蛍光化学発光分子、リン光分子、電気化学発光分子、クロモフォア、酵素、酵素補因子、酵素基質、色素、およびハプテン、または他のリガンドが含まれる。別の有用な標識技法は、ストリンジェントな条件下で標的核酸に安定して結合することができない塩基配列である。本開示のプローブは、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合されるアクリジニウムエステルで標識され得る。アクリジニウムエステル標識技法は、米国特許第５，１８５，４３９号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示される。結合試薬は、米国特許第６，０３１，０９１号においてＡｒｎｏｌｄらによって開示される。

選択されるハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ核酸を含有する疑いのある試験試料と接触させることができる。一般的に、試験試料は、未知の生物も含有する供給源に由来する。プローブをＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する増幅核酸を含み得る試験試料と接触させた後、試験試料は、試験試料中の非標的生物に由来する核酸よりもＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する標的核酸へのプローブの優先的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下でインキュベートすることができる。

核酸組成物
別の関連態様では、本開示は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブと標的核酸との間（「プローブ：標的」）に形成される核酸ハイブリッドを含む組成物を特徴とする。プローブと標的核酸との間に形成されるハイブリッドの１つの使用は、試験試料中の標的生物または生物の群の存在または量の指標を提供することである。

本開示はまた、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で捕捉プローブと標的核酸との間（「捕捉プローブ：標的」）に形成される核酸ハイブリッドを含む組成物を企図する。捕捉プローブと標的核酸との間に形成されるハイブリッドの１つの使用は、標的核酸に含まれる標的配列の増幅または、例えば、不均一アッセイにおける、標的核酸の検出の前に、試験試料中の標的核酸を単離および精製することである。増幅または検出の前に標的核酸を単離および精製することによって、非特異的結合または増幅の機会が有利に減少する。

本開示はさらに、増幅条件下で増幅プライマーと標的核酸との間（「プライマー：標的」）に形成される核酸ハイブリッドを含む組成物を特徴とする。プライマーと標的核酸との間に形成されるハイブリッドの１つの使用は、増幅プライマーの３’末端に核酸ポリメラーゼの開始部位を提供することである。例えば、ハイブリッドは、逆転写酵素、ＴａｑポリメラーゼまたはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ７ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼなどのようなＲＮＡポリメラーゼの開始部位を形成し得る。

本開示の組成物は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する標的核酸と、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含むプローブとの間で形成された核酸ハイブリッドを含む試験試料中のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの存在または量を決定するための組成物を含み、標的結合領域の塩基配列は、本明細書に開示されるプローブのいずれかの塩基配列からなる。これらの組成物のオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸に安定して結合しない少なくとも１つの追加のヌクレオチド塩基配列領域を含み得る。

標的核酸と標的結合領域を有する捕捉プローブとの間に形成された核酸ハイブリッドを含む試験試料中に存在するＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する標的核酸を固定化するための組成物も本開示によって企図され、標的結合領域の塩基配列は、本明細書に開示される任意の標的捕捉オリゴヌクレオチドの塩基配列に対して少なくとも約８５％相同性（好ましくは少なくとも約９０％相同性、より好ましくは少なくとも約９５％相同性、最も好ましくは１００％相同性）である。さらなる実施形態では、これらの組成物は、捕捉プローブの固定化プローブ結合領域と固定化プローブとの間に形成された核酸ハイブリッドをさらに含む。

アッセイ法
本開示は、試験試料中のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸の存在または量を決定するための様々な方法を企図する。当業者は、使用される正確なアッセイ条件、プローブ、および／またはプライマーが、使用される特定のアッセイ形式および試料の供給源に応じて異なることを理解するであろう。

本開示の一態様は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で試験試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、試験試料中に存在する非Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ生物に由来する核酸よりもＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸に優先的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させることによって、試験試料中のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの存在または量を決定する方法に関する。この方法のプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸に安定して結合しない少なくとも１つの追加の塩基配列領域を含み得る。

本開示のさらなる態様は、増幅条件下で試験試料を１つ以上の増幅プライマーと接触させることによって、試験試料中に存在するＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する核酸を増幅するための方法に関し、各増幅プライマーは、標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、標的結合領域の塩基配列は、本明細書に示されるオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列を有するか、またはこれに実質的に対応する。この実施形態の増幅プライマーは、任意に、ＲＮＡポリメラーゼによって認識されるか、またはＲＮＡポリメラーゼによる開始もしくは伸長を増強する５’配列を含む。含まれる場合、Ｔ７プロモーターが好ましい。

好ましい実施形態では、試験試料中のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ由来核酸を増幅するための方法は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下の試験試料を、ストリンジェントな条件下で試験試料中に存在する非Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ生物からの核酸よりも増幅されたＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ標的核酸に優先的にハイブリダイズすることができるハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させるステップをさらに含む。試験試料は、増幅のために十分な期間が経過した後、任意選択でハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させてもよいが、代わりに、増幅プライマーおよびハイブリダイゼーションアッセイプローブは、特にハイブリダイゼーションアッセイプローブが、分子トーチまたは分子ビーコンなどの自己ハイブリダイズプローブである場合、任意の順序で試料に添加され得る。

開示された技術の特定の好ましい実施形態は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに特異的な核酸増幅産物の合成が、増幅反応が起こっているときに監視されるリアルタイムフォーマットを使用して実施することができる。分子トーチまたは分子ビーコンを増幅反応混合物に含めて、配列特異的な検出を可能にすることができる。分子トーチは、標的核酸のリアルタイム検出に特に有用であり得る。

本開示のさらに別の態様は、試験試料中のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する標的核酸を固定化するための方法に関し、これは、試験試料に、捕捉プローブが標的核酸に安定して結合し、それによって捕捉プローブ：標的複合体を形成することを可能にするハイブリダイゼーション条件の第１のセット、および捕捉プローブが試験試料中の固定化プローブに安定して結合し、それによって固定化プローブ：捕捉プローブ：標的複合体を形成することを可能にするハイブリダイゼーション条件の第２のセットの下、標的結合領域および固定化プローブ結合領域を有する捕捉プローブを提供することを含む。ハイブリダイゼーション条件の第１および第２のセットは、同じであっても異なっていてもよく、捕捉プローブ：標的複合体は、ハイブリダイゼーション条件の第２のセット下で安定したままである。捕捉プローブの塩基の標的ハイブリダイズ配列は、配列番号３４、配列番号３５、または配列番号３６の塩基配列を有することができる。標的捕捉オリゴヌクレオチドは、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９によって与えられる、長さが３０塩基のポリ（ｄＡ）テールを有する３’固定化プローブ結合領域をさらに含み得る。

これらの標的結合領域配列を組み込むオリゴヌクレオチドセグメントは、オリゴヌクレオチドバックボーンの糖残基上に２’－Ｏ－メチル置換（時には「２’メトキシ」または「２’ＯＭｅ」）を含むように合成することができる。

精製ステップは、固定化ステップに続いて、固定化標的核酸に含まれる標的配列の増幅または特異的検出に干渉またはこれを防止し得る試験試料の１つ以上の成分を除去し得る。Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ由来の核酸を固定化および任意に精製するためのこの方法は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する標的核酸の存在を増幅および／または検出するための上記の方法のいずれかに先行し得る。精製ステップが含まれる場合、標的核酸は、標的配列を増幅または検出する前に試料条件を変更することによって、固定化プローブから間接的に溶出もしくは分離されるか、または固定化プローブ：捕捉プローブ：標的複合体の捕捉プローブから直接的に溶出もしくは分離され得る。

キット
本開示はまた、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍを検出および／または定量化するために有用なキットを特徴とする。キットは、少なくとも１つのアッセイに十分な量で、当業者によく知られているように、好適な包装材料中に本開示の任意のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、捕捉プローブおよび／または増幅プライマーを含み得る。典型的には、本キットは、試験試料中のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの存在または量を決定するための増幅および／または検出アッセイでパッケージングされたプローブおよび／またはプライマーを使用するための有形形態で記録された（例えば、紙面または電子媒体に含まれる）説明書も含むであろう。様々なキット構成要素は、様々な形式で提供してもよい。例えば、必要な酵素、ヌクレオチド三リン酸、プローブ、および／またはプライマーが、凍結乾燥試薬として提供され得る。凍結乾燥試薬の構成要素は、再構成されると、それらがアッセイですぐに使用できる各々の成分の完全な混合物を適切な比で形成するように、凍結乾燥前に予混合され得る。加えて、本開示のキットは、凍結乾燥試薬を再構成するための再構成試薬を含み得る。Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに由来する標的核酸を増幅するための特定の好ましいキットでは、酵素、ヌクレオチド三リン酸、および酵素に必要な補因子が、再構成されると、本増幅法での使用に適切な試薬を形成する単一の凍結乾燥試薬として提供される。これらのキットでは、凍結乾燥プライマー試薬も提供され得る。他の好ましいキットでは、凍結乾燥プローブ試薬が提供される。典型的な包装材料は、本開示のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、捕捉プローブ、および／または増幅プライマーを固定限界内で保持することができる、ガラス、プラスチック、紙、ホイル、微粒子などのような固体マトリックスを含むであろう。したがって、例えば、パッケージング材料には、ミリグラム未満（例えば、ピコグラムもしくはナノグラム）の量の企図されるプローブもしくはプライマーを含むために使用されるバイアル（例えば、ガラスまたはプラスチック）が含まれ得るか、またはそれらは、本開示の増幅法および／または検出法に関与することができるように、本開示のプローブもしくはプライマーが作動可能に取り付けられている、すなわち、結合しているマイクロタイタープレートウェルであり得る。

説明書は、典型的には、試薬および／または試薬の濃度、ならびに少なくとも１つのアッセイ方法パラメータ（例えば、試料量あたりの使用する試薬の相対量であり得る）を表示するであろう。加えて、維持、期間、温度、および緩衝液条件などの詳細も含まれ得る。

上で示したように、本開示のキットは、個別にまたは上に開示された組み合わせのうちの１つで提供されるかにかかわらず、試験試料中のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの存在または量の増幅および／または決定における使用のための、本明細書に記載されるハイブリダイゼーションアッセイプローブ、捕捉プローブ、および／または増幅プライマーのいずれかを含み得る。

本開示の異なる態様および実施形態を説明するための実施例が以下に提供される。当業者であれば、これらの実施例が、本開示をその内部に記載されている特定の実施形態に限定するようには意図されていないことを理解するであろう。

開示された技術は、リアルタイム転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応フォーマットを使用して例示され、二重標識分子トーチハイブリダイゼーションプローブがＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ核酸増幅産物を検出するために使用された。以下に記載されるハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ならびに捕捉プローブ、プライマー、およびプロモーター－プライマーのすべては、当該技術分野で周知の標準的なホスホルアミダイト化学および標準的な手順を使用して合成された。例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：２８７（１９８７）を参照されたい。合成を、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（商標）８９０９ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して行った。

Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍのリボソーム核酸を増幅および検出するために開発されたシステムは、プローブ、プライマー、捕捉オリゴヌクレオチド、およびそれらの組み合わせを含んだ。特に、単一の細菌細胞は、２３Ｓ ｒＲＮＡの少なくとも約１，０００コピーを含む。したがって、２３Ｓ標的核酸の１，０００以下のコピーの検出可能性を示す結果は、その手順が単一の細菌細胞を検出することができることと一致するであろう。詳細は次の実施例に示す。

実施例１は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの２３ｓリボソーム核酸を増幅および検出したリアルタイムＴＭＡ反応におけるオリゴヌクレオチドのスクリーニングを記載している。有利なことに、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸配列は、密接に関連するＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ細菌の核酸配列も検出することなく検出された。

実施例１
２３ｓリボソーム核酸検出に特異的なオリゴヌクレオチドの組み合わせのスクリーニング
インビトロ転写物は、スクリーニング手順においてリボソームＲＮＡ配列を含む標的核酸として機能した。Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ２３Ｓリボソーム核酸配列の一部をコードするＤＮＡインサートを、Ｔ７プロモーターの下流にあるプラスミドクローニングベクターにライゲーションし、標準的な実験手順を使用して細菌宿主において増殖させた。精製されたプラスミドは制限酵素消化によって線形化され、次いでＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのテンプレートとして使用してＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍインビトロ転写産物（ＩＶＴ）を産生し、これが、分光光度法によって定量化された。Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ＩＶＴは、配列番号１の配列を含んだ。並行手順を使用して、Ｔ７プロモーターの下流にあるＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ ２３Ｓリボソーム核酸配列の一部をコードするＤＮＡインサートを含むプラスミドクローニングベクターを調製した。この場合も、プラスミドは細菌宿主において増殖され、精製され、制限酵素消化によって線形化され、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ ＩＶＴを産生するために使用され、これも分光光度法によって定量化された。Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ ＩＶＴは、配列番号２の配列を含んでいた。

オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの組み合わせを、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸配列を増幅および特異的に検出する能力についてスクリーニングした。表１に、この手順で使用したオリゴヌクレオチドの組み合わせを示す。

等温核酸増幅反応のリアルタイムモニタリングは、温度制御されたＭＸ３００５ｐ機器（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して実行された。当業者に周知であるように、反応はマルチウェルプレートの個々のウェルで実施され、各ウェルは、リボヌクレオチド三リン酸、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、塩、およびＴＭＡ反応を実行するための補因子のｐＨ緩衝混合物を含む６５μｌの増幅試薬を含んだ。表１に示すように、反応はさらにプライマーおよび分子トーチハイブリダイゼーションプローブを含んだ。次に、個々のウェルは、増幅反応のテンプレートまたはターゲットとして機能するＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ＩＶＴまたはＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ ＩＶＴのいずれかの１ｘ１０^６コピーを含む１０μｌのアリコートを受容した。すべての反応は２回分ずつ準備した。マルチウェルプレートを最初に６０℃で５分間インキュベートして、ＩＶＴへのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にし、次に約４３℃に平衡化した。次に、マルチウェルプレートを、４４℃に設定されたＥＰＰＥＮＤＯＲＦ ＴＨＥＲＭＯＭＩＸＥＲ（登録商標）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）に移した。次に、これも当業者に周知であるように、各反応ウェルは、モロニーマウス白血病ウイルス（「ＭＭＬＶ」）逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのｐＨ緩衝混合物を含有する酵素試薬の２５μｌアリコートを受容した。プレートを粘着カバーで密封し、１分間穏やかに振とうした後、４２℃でインキュベートするように設定されたリアルタイム機器に移した。分子トーチからの蛍光シグナル（相対蛍光単位（ＲＦＵ）で測定）が一定の時間間隔で検出された。合成されたアンプリコンの量の指標として機能する閾値ベースのＴＴｉｍｅ値は、実質的に米国特許第８，６１５，３６８号でＬｉｇｈｔらによって開示された方法に従って、モニターされた蛍光シグナルから決定された。

図１Ａ～１Ｆに示されている手順の結果により、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの標的核酸を検出したが、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａの核酸を検出しなかったいくつかの実行可能なオリゴシステムが特定された。

実施例２は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を検出するための別のアプローチを記載している。ここで、標的核酸は、「二相性」反応メカニズムを使用して増幅され、線形および指数関数的増幅ステップが時間的に分離された。この技術の本質的な特徴は、米国特許第１０，１９６，６７４号に記載されており、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に、二相性増幅技術の使用は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸検出の感度を改善した。

実施例２
二相性増幅手順を使用した増幅および検出
二相性増幅手順では、第１相の線形増幅反応および第２相の指数関数的増幅反応を使用した。この手順では、システムＳ５およびＳ７のプライマーとプローブの組み合わせを使用した。第１相の増幅反応は、それぞれがその相補的なＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ標的核酸にハイブリダイズしたＴ７プロモーター－プライマーを含む前増幅ハイブリッド複合体が固体支持磁気ビーズ上に捕捉される標的捕捉ステップで始まった。標的捕捉反応は、４００μｌ容量のｐＨ緩衝ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）界面活性剤溶液、既知のコピーレベルのＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ＩＶＴ、Ｔ７プロモーター－プライマーのうちの１つ（Ｓ５の場合は配列番号１１、およびＳ７の場合は配列番号１２）、ＩＶＴおよび任意のハイブリダイズしたＴ７プロモーター－プライマー（すなわち、前増幅ハイブリッド）の捕捉または固定化を可能にする磁気ビーズ、ならびに磁気ビーズへの前増幅ハイブリッドの固定化または捕捉を促進する標的捕捉オリゴ（Ｓ５およびＳ７の両方について配列番号３７）を含んだ。この実施例の標的捕捉オリゴヌクレオチド（ＴＣＯ）は、ビーズ固定化オリゴヌクレオチド（すなわち、オリゴ（ｄＴ））とＩＶＴとを橋渡しするのに役立つが、ＩＶＴに相補的な捕捉オリゴヌクレオチドを表示するビーズ上に直接配列特異的にＩＶＴを捕捉するための他のオプションもまた使用可能である。標的捕捉ステップにより、反応混合物で形成された前増幅ハイブリッドの形成および捕捉が可能になった。自動磁性粒子プロセッサーを使用することにより、磁性ビーズの単離および洗浄が容易になった。この手順により、ハイブリダイズしていないＴ７プロモーター－プライマーが枯渇したか、実質的に含まない、単離された前増幅ハイブリッドが得られた。単離された前増幅ハイブリッドをｐＨバッファー、リボヌクレオチド三リン酸、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、塩、補因子、ＭＭＬＶ逆転写酵素およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ酵素と、非Ｔ７プライマー（配列番号ＮＯ：１８）、但し、前増幅ハイブリッドに含まれるもの以外のＴ７プロモーター－プライマーは追加されていない。第１相反応中の前増幅ハイブリッドのＴ７プライマーの伸長により、ｃＤＮＡ鎖が作成された。ＭＭＬＶのＲＮａｓｅＨ活性は、ｃＤＮＡ合成のテンプレートとして機能するＲＮＡ鎖を逆転写酵素消化した。反応混合物中に存在する非Ｔ７プライマーは、相補的ｃＤＮＡにハイブリダイズし、伸長されて、Ｔ７プロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡを産生した。次に、反応混合物のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、二本鎖テンプレートから転写産物を合成した。これらの転写産物は、反応混合物に含まれていた非Ｔ７プライマーにハイブリダイズし、その後、逆転写酵素によって伸長された。この場合も、ＲＮＡテンプレート鎖はＭＭＬＶ逆転写酵素のＲＮａｓｅＨ活性によって分解された。これらのステップの結果は、ＩＶＴターゲット鎖と同じ配列配向または極性を有するプロモーターのないｃＤＮＡ鎖の第１相反応混合物における蓄積であった。

指数相増幅反応は、第１相反応混合物に、Ｔ７プロモーター－プライマー（Ｓ５については配列番号１１、およびＳ７については配列番号１２）および分子トーチハイブリダイゼーションプローブ（Ｓ５については配列番号３２、およびＳ７については配列番号３３）を加えることによって開始した。この例示的な手順では、追加されたＴ７プロモーター－プライマーは、標的捕捉ステップ中に使用されたものと同じであった（すなわち、前増幅ハイブリッドの成分）。代わりに、他のＴ７プロモーター－プライマーを使用することもできた。指数相増幅反応中に増幅産物として産生されたＲＮＡ転写産物は、反応が進むにつれて分子トーチハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズし、得られた複合体は反応時間の関数として蛍光発光によって検出された。二相性増幅技術の一般的な側面は、Ｎｅｌｓｏｎらによって米国特許第１０，１９６，６７４号に開示されている。

図２Ａ～２Ｂに示されているこの手順の結果から、システム５とシステム７の両方が二相性増幅および検出フォーマットを使用して良好に機能することが確認された。システム５は、ＩＶＴのわずか１０コピー／ｍｌでも、非常に良好な形状の実行曲線を示した。

実施例３は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ核酸を検出するための例示的なアッセイの感度および特異性を実証するために使用される一組の手順を記載している。この手順では、少量の可変量のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ＩＶＴと、多量の一定量の密接に関連しているが非標的のＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ ＩＶＴを組み合わせた。混合物は、標的捕捉および二相性増幅および検出に供された。このデモンストレーションでは、システムＳ５オリゴヌクレオチドを使用した。

実施例３
ＩＶＴを使用したアッセイの感度および特異性のテスト
システムＳ５のプライマーおよびプローブオリゴヌクレオチドを使用する、実施例２の二相性増幅および検出手順に、アッセイの感度および特異性を実証するために本質的に従った。標的核酸の量および同一性が変数として機能した。個々の標的捕捉反応は、（１）比較のためのベースラインを確立するためにＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ＩＶＴの１０コピー／ｍｌ、３０コピー／ｍｌ、１００コピー／ｍｌ、もしくは３００コピー／ｍｌ、または（２）０コピー／ｍｌのＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ＩＶＴおよび１×１０^６コピー／ｍｌのＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、３０コピー／ｍｌのＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ＩＶＴおよび１×１０^６コピー／ｍｌのＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、もしくは１００コピー／ｍｌのＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ＩＶＴおよび１×１０^６コピー／ｍｌのＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａのいずれかのアリコートでスパイクされた。前の実施例に記載されているように、第１相線形および第２相指数関数的増幅反応を実施した。

図３Ａ～３Ｂに示す手順の結果により、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍアッセイはＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの標的核酸に非常に特異的であり、密接に関連する非標的核酸が大量に存在することによって実質的に損なわれないことが確認された。図３Ａは、１０コピー／ｍｌのレベルでもＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ増幅産物の検出を表す整形式の実行曲線を示す。したがって、アッセイは非常に感度が高かった。図３Ｂは、高レベルのＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ非標的核酸の存在下でＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ増幅産物が３００コピー／ｍｌまたは３０コピー／ｍｌで容易に検出可能であることを示した。さらに、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ標的核酸の増幅産物は検出できなかった。したがって、このアッセイは高感度かつ高特異的であった。

実施例４は、ＩＶＴの代わりに細胞を使用してＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍアッセイの特異性および感度を調査するために使用される手順を示す。既知の数のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ生物全体を使用して得られた陽性結果のカーブフィッティング分析を使用して、アッセイ感度を決定した。

実施例４
Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ細胞を使用したアッセイ感度のテスト
実施例３のリアルタイムＴＭＡアッセイを使用して、標的核酸の供給源としてＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ細胞を使用する感度試験のためにＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの２３Ｓ ｒＲＮＡを捕捉、増幅および検出した。市販のＰａｎｔｈｅｒ（登録商標）自動核酸検査装置（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、試料を処理し、増幅および検出反応を実行した。表２に示されているレベルの暗視野定量化Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ生物の段階希釈は、１０の複製で処理され、陽性の検出は、最小の蛍光シグナル読み取り値と、所定のレベルの増幅に達する最大時間との組み合わせを要することによって決定された。より具体的には、陽性は、少なくとも１．０のバックグラウンドを差し引いたＲＦＵ（相対蛍光単位）、および５３分以下のＴｔｉｍｅ測定値として決定された。手順の結果を表２に提示する。

表２に提示された結果の統計分析は、開示されたアッセイを使用して、５０％の確率で最少０．２７の生物を検出すること、および９５％の確率で最少１．３６の生物を検出することを示した。

実施例５は、他の様々な生物からの核酸も検出せずに、前の実施例のアッセイを使用してＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を検出する方法を実証した手順を説明する。

実施例５
細菌細胞を使用したアッセイ特異性のテスト
本質的に実施例４に記載されているような二相性の増幅および検出手順に従って、増幅可能な核酸の供給源として非標的生物のコレクションを使用するＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍアッセイの特異性を調査した。既知量の非標的生物を含有するパネルのプールされたセットを表３に示す。上記のように、溶解および標的捕捉試薬の組み合わせには、ｐＨバッファー、ラウリル硫酸リチウム界面活性剤、核酸の捕捉を支援する表面固定化オリゴヌクレオチドを表示する磁気ビーズが含まれた。この場合、表面固定化オリゴヌクレオチドはオリゴ（ｄＴ）を含み、標的捕捉試薬は、配列番号３７の標的捕捉オリゴヌクレオチドおよび配列番号７の標的ハイブリダイズ配列を含むＴ７プロモーター－プライマーをさらに含んだ（例えば、配列番号１１）。標的核酸およびハイブリダイズしたプライマーを含む捕捉された複合体を有するビーズを洗浄した後、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、リボヌクレオチド三リン酸、ＭＭＬＶ逆転写酵素、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、塩および補因子、ならびに線形相増幅を開始するための配列番号１８の配列を有する非Ｔ７プライマーを含む増幅試薬と組み合わせた。最初のインキュベーション期間の後、反応混合物を、配列番号３２の配列を有する分子トーチを含む試薬のアリコート、およびＴ７プロモーター－プライマーと組み合わせて、指数相増幅反応を開始した。この場合、追加されたＴ７プロモーターは、便利な選択の問題であったが、標的捕捉試薬（配列番号１１）に含まれるものと同じであった。同じ目的で異なるＴ７プロモーター－プライマーを使用できた可能性もある。

表３に示される結果は、有利なことに、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍアッセイがＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ核酸の検出に非常に特異的であることを示した。表に示されているように、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍに特徴的な核酸配列は、ＩＶＴが３０コピー／ｍｌしかない試験試料を使用して、１００％の陽性レベルで検出された。交差反応する可能性のある非標的微生物が存在し、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ標的が存在しない場合、陽性率は０％であった。低力価のＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ＲＮＡ（３０コピー／ｍｌ）の干渉試験では、１００％の陽性が示された。アッセイのパフォーマンスは、非標的生物の影響を受けなかった。

前述の概要および発明を実施するための形態の両方が例示および説明にすぎず、本教示を限定するものではないことを理解されたい。参照により組み込まれるいずれの資料も本開示の明示的内容と矛盾する限りにおいて、明示的内容が優先されるものとする。

本開示が、特徴の様々な組み合わせおよび部分組み合わせを含むある特定の説明的実施形態を参照してかなり詳細に説明および図示されているが、当業者であれば、本開示の範囲内に包含される他の実施形態ならびにその変形および修正を容易に理解するであろう。さらに、かかる実施形態、組み合わせ、および部分組み合わせの説明は、本開示が特許請求の範囲に明示的に列挙されるもの以外の特徴または特徴の組み合わせを必要とすることを伝えることを意図するものではない。したがって、本開示は、以下の番号付けされた実施形態の趣旨および範囲内に包含されるすべての修正および変形を含むとみなされる。

番号付けされた実施形態
実施例１は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブであって、
ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、配列番号１９の少なくとも１３個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列またはその相補体と、
検出可能な標識と、を含み、
最大４７塩基の長さである、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである。

実施形態２は、フルオロフォア部分と、クエンチャー部分と、２’－Ｏ－メチル置換を有するリボフラノシル部分を含む少なくとも１つのヌクレオチド類似体とをさらに含む、実施形態１に記載のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである。

実施形態３は、非ヌクレオチドリンカーおよび一対の相互作用標識をさらに含み、
分子トーチハイブリダイゼーションプローブである、実施形態１に記載のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである。

実施形態４は、上記一対の相互作用標識が、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む、実施形態３に記載のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである。

実施形態５は、上記非ヌクレオチドリンカーが、Ｃ９リンカーである、実施形態３または４に記載のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである。

実施形態６は、上記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択され、これらの配列の各々が、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、実施形態１～５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである。

実施形態７は、配列番号１９の少なくとも１３個の連続する塩基の前記標的ハイブリダイズ配列が、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、配列番号２１の１３～２２個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列またはその相補体である、実施形態１～５のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである。

実施形態８は、上記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２６および配列番号２７からなる群から選択され、これらの配列の各々が、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、実施形態７に記載のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである。

実施形態９は、２’－Ｏ－メチル置換を有するリボフラノシル部分を含む少なくとも１つのヌクレオチド類似体をさらに含む、実施形態１または３～８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである。

実施形態１０は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ２３Ｓリボソーム核酸配列を増幅するためのプライマーセットであって、
第１のプライマーであって、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の少なくとも１８個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列を含み、
上記第１のプライマーが、最大５０塩基の長さである、第１のプライマーと、
第２のプライマーであって、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５の少なくとも１７個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列を含み、
上記第２のプライマーが、最大５０塩基の長さである、第２のプライマーと、を含み、
上記第１および第２のプライマーのうちの少なくとも１つは、それぞれの上記標的ハイブリダイズ配列の上流に結合したファージプロモーター配列をさらに含む、プライマーセットである。

実施形態１１は、上記第１のプライマーが、第１の標的ハイブリダイズ配列の上流に結合した前記ファージプロモーター配列を含む、実施形態１０に記載のプライマーセットである。

実施形態１２は、上記ファージプロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列を含む、実施形態１１に記載のプライマーセットである。

実施形態１３は、上記第１のプライマーの前記標的ハイブリダイズ配列は、その３’末端が配列番号７で終わる、実施形態１０～１２のいずれか１つに記載のプライマーセットである。

実施形態１４は、上記第１のプライマーの上記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される、実施形態１０～１３のいずれか１つに記載のプライマーセットである。

実施形態１５は、上記第１のプライマーの上記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される、実施形態１０～１２のいずれか１つに記載のプライマーセットである。

実施形態１６は、上記第１のプライマーが、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群から選択されるプロモーター－プライマーである、実施形態１０～１２のいずれか１つに記載のプライマーセットである。

実施形態１７は、上記第２のプライマーの上記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３の１７～２０個の連続する塩基である、実施形態１０～１６のいずれか１つに記載のプライマーセットである。

実施形態１８は、上記第２のプライマーの上記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６である、実施形態１０～１７のいずれか１つに記載のプライマーセットである。

実施形態１９は、上記第２のプライマーの上記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４の１７～２０個の連続する塩基である、実施形態１０～１７のいずれか１つに記載のプライマーセットである。

実施形態２０は、上記第２のプライマーの上記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１７または配列番号１６である、実施形態１９に記載のプライマーセットである。

実施形態２１は、上記第２のプライマーの上記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１５の１７～２０個の連続する塩基である、実施形態１０～１７のいずれか１つに記載のプライマーセットである。

実施形態２２は、上記第２のプライマーの上記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１８または配列番号１７である、実施形態２１に記載のプライマーセットである。

実施形態２３は、上記第１のプライマーが、配列番号１１であり、上記第２のプライマーが、配列番号１８である、実施形態１０～１２のいずれか１つに記載のプライマーセットである。

実施形態２４は、上記第１のプライマーが、配列番号１２であり、上記第２のプライマーが、配列番号１８である、実施形態１０～１２のいずれか１つに記載のプライマーセットである。

実施形態２５は、試料がＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を含むかどうかを決定する方法であって、上記方法が、
（ａ）上記試料をプライマーのセットと接触させるステップと、
（ｂ）インビトロ核酸増幅反応において上記プライマーのセットを使用して、上記試料中に存在し得るＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの任意の核酸を増幅するステップであって、
それにより、上記試料がＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を含む場合には増幅産物が産生される、ステップと、
（ｃ）検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを使用して、ステップ（ｂ）で産生された上記増幅産物のうちのいずれかを検出するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の結果から、上記試料がＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を含むかどうかの指標として、ステップ（ｂ）において上記増幅産物が産生されたかどうかを決定するステップと、を含む、方法である。
実施形態２６は、上記検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブが、
ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、配列番号１９の少なくとも１３個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列またはその相補体と、
検出可能な標識と、を含み、
上記オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブが、最大４７塩基の長さである、実施形態２５に記載の方法である。

実施形態２７は、上記検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブが、非ヌクレオチドリンカーおよび一対の相互作用標識を含む分子トーチハイブリダイゼーションプローブである、実施形態２６に記載の方法である。

実施形態２８は、上記分子トーチハイブリダイゼーションプローブの上記一対の相互作用標識が、フルオロフォアおよびクエンチャーを含む、実施形態２７に記載の方法である。

実施形態２９は、上記分子トーチハイブリダイゼーションプローブの上記非ヌクレオチドリンカーが、上記標的ハイブリダイズ配列の１つの末端に位置付けられたＣ９リンカーである、実施形態２７に記載の方法である。

実施形態３０は、上記検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブが、フルオロフォア部分、クエンチャー部分、および２’－Ｏ－メチル置換を有するリボフラノシル部分を含む少なくとも１つのヌクレオチド類似体の各々をさらに含む、実施形態２６に記載の方法である。

実施形態３１は、ステップ（ａ）の前記プライマーのセットが、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、
上記第１のプライマーは、最大５０塩基の長さであり、配列番号３の少なくとも１８個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列を含み、
上記第２のプライマーは、最大５０塩基の長さであり、配列番号１３の少なくとも１７個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列を含み、
上記第１および第２のプライマーのうちの少なくとも１つは、それぞれの上記標的ハイブリダイズ配列の上流に結合したファージプロモーター配列をさらに含む、実施形態２６に記載の方法である。

実施形態３２は、ステップ（ａ）および（ｂ）が同時に行われ、上記増幅反応がリアルタイム増幅反応である、実施形態２５～３１のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態３３は、ステップ（ｃ）で検出された上記増幅産物が、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの２３Ｓ ｒＲＮＡとは反対のセンスのＲＮＡアンプリコンである、実施形態２５～３２のいずれか１つに記載の方法である。

実施形態３４は、試験試料中に存在し得るＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を検出するための反応混合物であって、
上記試験試料と、
第１のプライマーおよび第２のプライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマーセットであって、
上記第１のプライマーは、配列番号３の少なくとも１８個の連続する塩基に相補的な塩基配列を含み、
上記第２のプライマーは、ポリメラーゼ媒介プライマー伸長反応において配列番号１をテンプレートとして使用する場合、上記第１のプライマーの伸長産物に相補的な塩基配列を含む、オリゴヌクレオチドプライマーセットと、
検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブであって、上記オリゴヌクレオチドプライマーセットおよび配列番号１の塩基配列を含むテンプレートを使用して実施される核酸増幅反応で産生されるアンプリコンに相補的な塩基配列を含む、ハイブリダイゼーションプローブと、を含む、反応混合物である。

実施形態３５は、上記検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブが、フルオロフォア、クエンチャー、および非ヌクレオチドリンカーのそれぞれを含む分子トーチハイブリダイゼーションプローブである、実施形態３４に記載の反応混合物である。

実施形態３６は、上記検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブが、２’－Ｏ－メチル置換を有するリボフラノシル部分を有する少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む、実施形態３４に記載の反応混合物である。

実施形態３７は、上記アンプリコンに相補的な上記塩基配列が、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にし、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択される、実施形態３４～３６のいずれか１つに記載の反応混合物である。

実施形態３８は、上記第１のプライマーが、配列番号８、配列番号７、および配列番号６からなる群から選択される３’末端配列を含む、実施形態３４～３６のいずれか１つに記載の反応混合物である。

実施形態３９は、上記第１のプライマーが、最大５０塩基の長さであり、配列番号３の少なくとも１８個の連続する塩基に相補的な配列の上流にプロモーター配列を含む、実施形態３４～３８のいずれか１つに記載の反応混合物である。

実施形態４０」は、上記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である、実施形態３９に記載の反応混合物である。

実施形態４１は、上記第２のプライマーが、最大５０塩基の長さであり、配列番号１３の少なくとも１７個の連続する塩基を含む、実施形態３４～４０のいずれか１つに記載の反応混合物である。

実施形態４２は、上記第２のプライマーが、配列番号１８、配列番号１７、および配列番号１６からなる群から選択される３’末端を含む、実施形態３４～４１のいずれか１つに記載の反応混合物である。

実施形態４３は、上記アンプリコンが、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの２３Ｓ ｒＲＮＡと反対の極性を有するＲＮＡアンプリコンであり、その結果、上記ＲＮＡアンプリコンが、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的である、実施形態３４～４２のいずれか１つに記載の反応混合物である。

実施形態４４は、上記反応混合物が、上記分子トーチハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズした上記ＲＮＡアンプリコンを含む、実施形態４３に記載の反応混合物である。

実施形態４５は、上記核酸増幅反応が、転写関連増幅反応である、実施形態３４～４４のいずれか１つに記載の反応混合物である。

実施形態４６は、上記転写関連増幅反応が、転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応である、実施形態４５に記載の反応混合物である。

実施形態４７は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を検出するための試薬のキットであって、
オリゴヌクレオチドプライマーのセットであって、
上記セットの第１のプライマーは、配列番号３の少なくとも１８個の連続する塩基に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含み、
上記セットの第２のプライマーは、ポリメラーゼ媒介プライマー伸長反応において配列番号１をテンプレートとして使用する場合、上記第１のプライマーの伸長産物に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、オリゴヌクレオチドプライマーのセットと、
分子トーチハイブリダイゼーションプローブであって、最大５０塩基の長さであり、配列番号１９の少なくとも１３個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列またはその相補体を含み、フルオロフォア部分、クエンチャー部分、非ヌクレオチドリンカー、および２’－Ｏ－メチル置換を有するリボフラノシル部分を含む少なくとも１つのヌクレオチド類似体の各々をさらに含む、分子トーチハイブリダイゼーションプローブと、
上記プライマーのセットを使用してインビトロ核酸増幅反応を実施するための１つ以上の試薬と、を含む、キットである。

実施形態４８は、配列番号１９の少なくとも１３個の連続する塩基の上記標的ハイブリダイズ配列またはその相補体が、配列番号２１の１３～２２個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列またはその相補体である、実施形態４７に記載のキットである。

実施形態４９は、上記分子トーチハイブリダイゼーションプローブの上記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２６および配列番号２７からなる群から選択される、実施形態４７または４８に記載のキットである。

実施形態５０は、上記分子トーチハイブリダイゼーションプローブの上記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択される、実施形態４７～４９のいずれか１つに記載のキットである。

実施形態５１は、上記第１および第２のプライマーの各々が、最大５０塩基の長さである、実施形態４７～５０のいずれか１つに記載のキットである。

実施形態５２は、ファージプロモーター配列が、上記第１のプライマーの上記標的ハイブリダイズ配列の上流に結合している、実施形態４７～５１のいずれか１つに記載のキットである。

実施形態５３は、上記ファージプロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である、実施形態５２に記載のキットである。

実施形態５４は、上記第１のプライマーの上記標的ハイブリダイズ配列は、その３’末端が配列番号７で終わる、実施形態４７～５３のいずれか１つに記載のキットである。

実施形態５５は、上記第１のプライマーの上記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される、実施形態４７～５４のいずれか１つに記載のキットである。

実施形態５６は、上記第１のプライマーの上記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される、実施形態４７～５３のいずれか１つに記載のキットである。

実施形態５７は、実施形態４７から５６のいずれか１つのキットであり、第１のプライマーは、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるプロモーター－プライマーである。

実施形態５８は、上記第２のプライマーの上記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３の１７～２０個の連続する塩基である、実施形態４７～５７のいずれか１つに記載のキットである。

実施形態５９は、上記１つ以上の試薬が、逆転写酵素、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの各々を含む、実施形態４７～５８のいずれか１つに記載のキットである。

本開示の種々の実施形態が詳細に図示および記載されたが、本開示または添付の請求の範囲から逸脱しない範囲で様々な改変がなされ得ることが当業者にとって容易に明らかとなるであろう。

Claims (59)

1. Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を検出するためのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブであって、
   ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、配列番号１９の少なくとも１３個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列またはその相補体と、
   検出可能な標識と、を含み、
   前記オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブが、最大４７塩基の長さである、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ。
2. フルオロフォア部分と、クエンチャー部分と、２’－Ｏ－メチル置換を有するリボフラノシル部分を含む少なくとも１つのヌクレオチド類似体とをさらに含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ。
3. 非ヌクレオチドリンカーおよび一対の相互作用標識をさらに含み、
   分子トーチハイブリダイゼーションプローブである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ。
4. 前記一対の相互作用標識が、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む、請求項３に記載のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ。
5. 前記非ヌクレオチドリンカーが、Ｃ９リンカーである、請求項３または４に記載のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ。
6. 前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択され、これらの配列の各々が、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、請求項１～５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ。
7. 配列番号１９の少なくとも１３個の連続する塩基の前記標的ハイブリダイズ配列が、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、配列番号２１の１３～２２個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列またはその相補体である、請求項１～５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ。
8. 前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２６および配列番号２７からなる群から選択され、これらの配列の各々が、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、請求項７に記載のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ。
9. ２’－Ｏ－メチル置換を有するリボフラノシル部分を含む少なくとも１つのヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項１または３～８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ。
10. Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ２３Ｓリボソーム核酸配列を増幅するためのプライマーセットであって、
    第１のプライマーであって、配列番号３、配列番号４、または配列番号５の少なくとも１８個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列を含み、
    前記第１のプライマーが、最大５０塩基の長さである、第１のプライマーと、
    第２のプライマーであって、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５の少なくとも１７個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列を含み、
    前記第２のプライマーが、最大５０塩基の長さである、第２のプライマーと、を含み、
    前記第１および第２のプライマーのうちの少なくとも１つが、それぞれの前記標的ハイブリダイズ配列の上流に結合したファージプロモーター配列をさらに含む、プライマーセット。
11. 前記第１のプライマーが、第１の標的ハイブリダイズ配列の上流に結合した前記ファージプロモーター配列を含む、請求項１０に記載のプライマーセット。
12. 前記ファージプロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列を含む、請求項１１に記載のプライマーセット。
13. 前記第１のプライマーの前記標的ハイブリダイズ配列は、その３’末端が配列番号７で終わる、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のプライマーセット。
14. 前記第１のプライマーの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される、請求項１０～１３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
15. 前記第１のプライマーの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のプライマーセット。
16. 前記第１のプライマーが、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群から選択されるプロモーター－プライマーである、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のプライマーセット。
17. 前記第２のプライマーの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３の１７～２０個の連続する塩基である、請求項１０～１６のいずれか一項に記載のプライマーセット。
18. 前記第２のプライマーの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１６である、請求項１０～１７のいずれか一項に記載のプライマーセット。
19. 前記第２のプライマーの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１４の１７～２０個の連続する塩基である、請求項１０～１７のいずれか一項に記載のプライマーセット。
20. 前記第２のプライマーの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１７または配列番号１６である、請求項１９に記載のプライマーセット。
21. 前記第２のプライマーの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１５の１７～２０個の連続する塩基である、請求項１０～１７のいずれか一項に記載のプライマーセット。
22. 前記第２のプライマーの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１８または配列番号１７である、請求項２１に記載のプライマーセット。
23. 前記第１のプライマーが、配列番号１１であり、前記第２のプライマーが、配列番号１８である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のプライマーセット。
24. 前記第１のプライマーが、配列番号１２であり、前記第２のプライマーが、配列番号１８である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のプライマーセット。
25. 試料がＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を含むかどうかを決定する方法であって、前記方法が、
    （ａ）前記試料をプライマーのセットと接触させるステップと、
    （ｂ）インビトロ核酸増幅反応において前記プライマーのセットを使用して、前記試料中に存在し得るＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの任意の核酸を増幅するステップであって、
    それにより、前記試料がＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を含む場合には増幅産物が産生される、ステップと、
    （ｃ）検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを使用して、ステップ（ｂ）で産生された前記増幅産物のうちのいずれかを検出するステップと、
    （ｄ）ステップ（ｃ）の結果から、前記試料がＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を含むかどうかの指標として、ステップ（ｂ）において前記増幅産物が産生されたかどうかを決定するステップと、を含む、方法。
26. 前記検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブが、
    ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、配列番号１９の少なくとも１３個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列またはその相補体と、
    検出可能な標識と、を含み、
    前記オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブが、最大４７塩基の長さである、請求項２５に記載の方法。
27. 前記検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブが、非ヌクレオチドリンカーおよび一対の相互作用標識を含む分子トーチハイブリダイゼーションプローブである、請求項２６に記載の方法。
28. 前記分子トーチハイブリダイゼーションプローブの前記一対の相互作用標識が、フルオロフォアおよびクエンチャーを含む、請求項２７に記載の方法。
29. 前記分子トーチハイブリダイゼーションプローブの前記非ヌクレオチドリンカーが、前記標的ハイブリダイズ配列の１つの末端に位置付けられたＣ９リンカーである、請求項２７に記載の方法。
30. 前記検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブが、フルオロフォア部分、クエンチャー部分、および２’－Ｏ－メチル置換を有するリボフラノシル部分を含む少なくとも１つのヌクレオチド類似体の各々をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
31. ステップ（ａ）の前記プライマーのセットが、第１のプライマーおよび第２のプライマーを含み、
    前記第１のプライマーは、最大５０塩基の長さであり、配列番号３の少なくとも１８個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列を含み、
    前記第２のプライマーは、最大５０塩基の長さであり、配列番号１３の少なくとも１７個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列を含み、
    前記第１および第２のプライマーのうちの少なくとも１つは、それぞれの前記標的ハイブリダイズ配列の上流に結合したファージプロモーター配列をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
32. ステップ（ａ）および（ｂ）が同時に行われ、前記増幅反応がリアルタイム増幅反応である、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の方法。
33. ステップ（ｃ）で検出された前記増幅産物が、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの２３Ｓ ｒＲＮＡとは反対のセンスのＲＮＡアンプリコンである、請求項２５～３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 試験試料中に存在し得るＴ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を検出するための反応混合物であって、
    前記試験試料と、
    第１のプライマーおよび第２のプライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマーセットであって、
    前記第１のプライマーは、配列番号３の少なくとも１８個の連続する塩基に相補的な塩基配列を含み、
    前記第２のプライマーは、ポリメラーゼ媒介プライマー伸長反応において配列番号１をテンプレートとして使用する場合、前記第１のプライマーの伸長産物に相補的な塩基配列を含む、オリゴヌクレオチドプライマーセットと、
    検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブであって、前記オリゴヌクレオチドプライマーセットおよび配列番号１の塩基配列を含むテンプレートを使用して実施される核酸増幅反応で産生されるアンプリコンに相補的な塩基配列を含む、ハイブリダイゼーションプローブと、を含む、反応混合物。
35. 前記検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブが、フルオロフォア、クエンチャー、および非ヌクレオチドリンカーの各々を含む分子トーチハイブリダイゼーションプローブである、請求項３４に記載の反応混合物。
36. 前記検出可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブが、２’－Ｏ－メチル置換を有するリボフラノシル部分を有する少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む、請求項３４に記載の反応混合物。
37. 前記アンプリコンに相補的な前記塩基配列が、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にし、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択される、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の反応混合物。
38. 前記第１のプライマーが、配列番号８、配列番号７、および配列番号６からなる群から選択される３’末端配列を含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の反応混合物。
39. 前記第１のプライマーが、最大５０塩基の長さであり、配列番号３の少なくとも１８個の連続する塩基に相補的な配列の上流にプロモーター配列を含む、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の反応混合物。
40. 前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である、請求項３９に記載の反応混合物。
41. 前記第２のプライマーが、最大５０塩基の長さであり、配列番号１３の少なくとも１７個の連続する塩基を含む、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の反応混合物。
42. 前記第２のプライマーが、配列番号１８、配列番号１７、および配列番号１６からなる群から選択される３’末端を含む、請求項３４～４１のいずれか一項に記載の反応混合物。
43. 前記アンプリコンが、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの２３Ｓ ｒＲＮＡと反対の極性を有するＲＮＡアンプリコンであり、その結果、前記ＲＮＡアンプリコンが、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの２３Ｓ ｒＲＮＡに相補的である、請求項３４～４２のいずれか一項に記載の反応混合物。
44. 前記反応混合物が、前記分子トーチハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズした前記ＲＮＡアンプリコンを含む、請求項４３に記載の反応混合物。
45. 前記核酸増幅反応が、転写関連増幅反応である、請求項３４～４４のいずれか一項に記載の反応混合物。
46. 前記転写関連増幅反応が、転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応である、請求項４５に記載の反応混合物。
47. Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍの核酸を検出するための試薬のキットであって、
    オリゴヌクレオチドプライマーのセットであって、
    前記セットの第１のプライマーは、配列番号３の少なくとも１８個の連続する塩基に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含み、
    前記セットの第２のプライマーは、ポリメラーゼ媒介プライマー伸長反応において配列番号１をテンプレートとして使用する場合、前記第１のプライマーの伸長産物に相補的な標的ハイブリダイズ配列を含む、オリゴヌクレオチドプライマーのセットと、
    分子トーチハイブリダイゼーションプローブであって、最大５０塩基の長さであり、配列番号１９の少なくとも１３個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列またはその相補体を含み、フルオロフォア部分、クエンチャー部分、非ヌクレオチドリンカー、および２’－Ｏ－メチル置換を有するリボフラノシル部分を含む少なくとも１つのヌクレオチド類似体の各々をさらに含む、分子トーチハイブリダイゼーションプローブと、
    前記プライマーのセットを使用してインビトロ核酸増幅反応を実施するための１つ以上の試薬と、を含む、キット。
48. 配列番号１９の少なくとも１３個の連続する塩基の前記標的ハイブリダイズ配列またはその相補体が、配列番号２１の１３～２２個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列またはその相補体である、請求項４７に記載のキット。
49. 前記分子トーチハイブリダイゼーションプローブの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２６および配列番号２７からなる群から選択される、請求項４７または４８に記載のキット。
50. 前記分子トーチハイブリダイゼーションプローブの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択される、請求項４７～４９のいずれか一項に記載のキット。
51. 前記第１および第２のプライマーの各々が、最大５０塩基の長さである、請求項４７～５０のいずれか一項に記載のキット。
52. ファージプロモーター配列が、前記第１のプライマーの前記標的ハイブリダイズ配列の上流に結合している、請求項４７～５１のいずれか一項に記載のキット。
53. 前記ファージプロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列である、請求項５２に記載のキット。
54. 前記第１のプライマーの前記標的ハイブリダイズ配列は、その３’末端が配列番号７で終わる、請求項４７～５３のいずれか一項に記載のキット。
55. 前記第１のプライマーの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される、請求項４７～５４のいずれか一項に記載のキット。
56. 前記第１のプライマーの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択される、請求項４７～５３のいずれか一項に記載のキット。
57. 前記第１のプライマーが、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群から選択されるプロモーター－プライマーである、請求項４７～５６のいずれか一項に記載のキット。
58. 前記第２のプライマーの前記標的ハイブリダイズ配列が、配列番号１３の１７～２０個の連続する塩基である、請求項４７～５７のいずれか一項に記載のキット。
59. 前記１つ以上の試薬が、逆転写酵素、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの各々を含む、請求項４７～５８のいずれか一項に記載のキット。

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