EP1047706A2 - Verfahren zur synthese von nucleinsäuremolekülen - Google Patents

Verfahren zur synthese von nucleinsäuremolekülen

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EP1047706A2
EP1047706A2 EP99919096A EP99919096A EP1047706A2 EP 1047706 A2 EP1047706 A2 EP 1047706A2 EP 99919096 A EP99919096 A EP 99919096A EP 99919096 A EP99919096 A EP 99919096A EP 1047706 A2 EP1047706 A2 EP 1047706A2
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EP
European Patent Office
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nucleic acid
acid molecule
synthesis
dna
sequence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99919096A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Annette Bernauer
Hubert Stefan Bernauer
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Original Assignee
Individual
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Publication date
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Publication of EP1047706A2 publication Critical patent/EP1047706A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides

Definitions

  • the invention relates to a method for the synthesis of nucleic acid molecules.
  • the invention relates to a method of this type that is carried out recursively.
  • the nucleic acid components are preferably of synthetic or semisynthetic origin.
  • the principle of the method according to the invention is based on the fact that a further nucleic acid molecule is attached to or with a nucleic acid molecule provided and / or is linked, the end of the nucleic acid molecule provided is masked, if no further nucleic acid molecule has been attached and / or linked to this or with this, the further nucleic acid molecule is cleaved at a predetermined location, an end again preferably being formed to or with which another nucleic acid molecule can be attached and or linked, and the aforementioned process steps may be repeated until the desired product is synthesized.
  • the invention b also relates to a kit for carrying out the method according to the invention
  • nucleic acid molecules with a precisely defined sequence in the simplest possible manner with little time - and to provide cost
  • the currently most widespread methods for providing such nucleic acid molecules include cloning DNA, for example from cDNA libraries, optionally coupled with subsequent sequencing of the isolated cDNA.
  • DNA with the desired sequence can be produced synthetically, for example using the conventional phoshoamidite method become
  • DNA molecules of interest must be isolated, for example, by cDNA or positioning cloning and cloned into suitable vectors.
  • the resulting vectors and thus the DNA molecules of interest must be multiplied "In vivo"
  • the vectors have to be introduced into suitable host cells, for example bacteria or yeasts.
  • suitable host cells for example bacteria or yeasts.
  • the DNA has to be isolated again from the host organisms they are again available for manipulation purposes.
  • they must again be introduced into suitable host organisms.
  • process steps and / or complicated manipulations are often necessary in order to obtain a certain to generate DNA WANTED It is also, unfortunately, to imagine and well known to the skilled person that still multiply this effort unless a larger number of various DNAs are prepared to
  • the object of the present invention was therefore to provide a method which enables the synthesis of nucleic acid molecules of the desired sequence and length in a simple and time-saving manner. This object is achieved by the embodiments characterized in the claims
  • the invention thus relates to a method for the synthesis of nucleic acid molecules, the following
  • nucleic acid molecule which has at least one end which permits attachment and / or linkage of or with a further nucleic acid molecule
  • 2 Attachment and / or linkage of at least one further nucleic acid molecule to or with the nucleic acid molecule
  • the one end of the at least one another nucleic acid molecule is attached to and / or linked to the at least one end of the nucleic acid molecule and / or linked
  • the other end of the at least one further nucleic acid molecule is masked in the event of a link
  • 3 optionally masking the at least one end of the nucleic acid molecule to the or with which no other nucleic acid molecule has been attached and / or linked
  • step (2) Repeat steps (2) to (4) at least once, possibly several times, with suitable nucleic acid molecules being used in step (2)
  • the further nucleic acid molecule is a single-stranded nucleic acid molecule
  • the method according to the invention comprises the following step after step (2)
  • the method according to the invention comprises the following step after step (4) or (5)
  • the method according to the invention is suitable for the synthesis of single-stranded (dsDNA) or partially double-stranded DNA
  • FIG. 1 The principle of the method according to the invention is shown in FIG. 1. Further embodiments are shown in FIGS. 2 to 7
  • a single-stranded nucleic acid molecule a partially double-stranded nucleic acid molecule with an overhanging 5 'or 3' end or a double-stranded nucleic acid molecule with a smooth end is provided.
  • the next step is by means of a ligase activity, for example a T4-RNA ligase, a single-stranded nucleic acid molecule covalently bound
  • the single-stranded nucleic acid molecule can be bound with its 5 '- phosphate or 3' - hydroxy end to the provided nucleic acid molecule.
  • the method according to the invention comprises nucleic acid synthesis in 3 '-5 '- or in the 5' -3 'direction (starting from the orientation of the precursor molecules)
  • masked means that masked means that this end in this ligation approach cannot be linked to another single-stranded nucleic acid molecule of the same type, and this results in single-stranded molecules which consist of several copies of the same nucleic acid molecule and also can be linked to the nucleic acid molecule provided.
  • a masking is a chemical, enzymatic or other modification of the end which prevents the above-mentioned linkage.
  • Masking in the sense of this invention is described in more detail below.
  • the ends of the nucleic acid molecules provided are masked, which have not been linked to a single-stranded nucleic acid molecule
  • the single-stranded nucleic acid molecule which has been ligated to the provided nucleic acid molecule is attached to a predetermined one Cleaved site, removing the mask and creating an end that allows a link to a next single-stranded nucleic acid molecule.
  • the method according to the invention advantageously ensures that only those nucleic acid molecules to those in the previous one are extended in further ligation sections Step a single-stranded nucleic acid molecule was ligated
  • the ligation, masking and cleavage step can now be repeated any number of times in this order with new molecules to be added, in each case using suitable single-stranded nucleic acid molecules
  • the complementary counter strand with a polymerase activity is synthesized, the single strand was synthesized in the 3 '- 5' direction and became a double-stranded nucleic acid molecule with a smooth end or a partial one provided double-stranded nucleic acid molecule, the complementary nucleic acid strand can be synthesized directly from the free 3 'end of the nucleic acid molecule provided.
  • the corresponding complementary nucleic acid strand is synthesized by means of a polymerase activity directly after (each) cleavage of the ligated single-stranded nucleic acid molecule before the ligation of the next single-stranded nucleic acid molecule.
  • the procedure is essentially as described above for the synthesis of the complete complementary nuclein
  • each single-stranded nucleic acid molecule is selected such that it advantageously forms a hairpin structure at the 3 'end.
  • the masking is carried out before the polymerase reaction which occurs before the ends of the nucleic acid molecules provided are masked removed at the 3 'end of the ligated nucleic acid molecule
  • the further nucleic acid molecules which are attached to and / or linked to the provided nucleic acid molecule are double-stranded.
  • the nucleic acid molecule provided is single-stranded or partially double-stranded with an overhanging 3 'or 5' end another nucleic acid molecule a corresponding, in its sequence complementary, 3'- or 5'-overhanging end, an attachment takes place by hybridization of the single-stranded overhanging ends.
  • the other end of the further nucleic acid molecule is preferably smooth. The masking described above ensures that this is attached to it There is no addition via hybridization of cohesive ends of further nucleic acid molecules of the same type
  • the further nucleic acid molecule is single-stranded and there is an attachment to the nucleic acid molecule provided via hybridization of complementary terminal nucleotides.
  • the nucleic acid molecule provided is single-stranded or partially double-stranded with an overhanging 3 'or 5' End
  • the single-stranded further nucleic acid molecule can additionally covalently with the nucleic acid molecule provided by means of a Ligase activity linked If the hybridization takes place via 3 '- terminal nucleotides, the complementary strand can be synthesized in the next step by means of a polymerase activity.
  • the 3 ' end of the further single-stranded nucleic acid molecule is chosen such that it forms a hairpin structure, so that a 3 'end is provided for the subsequent polymerization reaction for the synthesis of the complementary nucleic acid strand.
  • the synthesized nucleic acid duplex is cleaved at a predetermined location, the recognition sequence necessary for the cleavage and the smooth end or the hairpin structure is removed and a preferably cohesive end is formed which allows attachment via hybridization and, if appropriate, covalent linkage of the nucleic acid molecule to a further single-stranded nucleic acid molecule
  • the present invention also encompasses processes whose addition, masking and / or cleavage combinations represent the corresponding steps of the abovementioned embodiments.
  • a single-stranded nucleic acid molecule can be covalently linked to a nucleic acid molecule provided, and then the complementary nucleic acid strand can be synthesized , the double strand is cleaved as described above, and another single-stranded nucleic acid molecule is attached via hybridization in the next synthesis cycle
  • the synthesis of the complementary nucleic acid strand does not have to take place after every addition, masking and / or cleavage step or at the end of the synthesis of the complete nucleic acid single strand.
  • the time of filling up the complementary strand can be chosen arbitrarily , in the sense that it is selected, for example, after any permuting addition, masking and / or cleavage step
  • Masked single-stranded 3-ends can be, for example, by the incorporation of an amino block, a dideoxynucleotide, a 3′-phosphate or an artificially incorporated 5-end
  • masked single-stranded 5 ' ends are distinguished, for example, by a missing phosphate group or by the incorporation of a 5-modified nucleotide (eg biotin-dNTP, digoxygenin-dNTP).
  • a partially double-stranded nucleus Cleic acid molecule with overhanging single-stranded ends can thus be masked by removing an overhanging 3 ' end by means of exonuclease activity, or by synthesizing the complementary strand to an overhanging 5-end by means of polymerase activity, so that in both cases a double-stranded nucleic acid molecule with smooth ends arises
  • the term “providing a nucleic acid molecule” encompasses any form of providing, for example the cloning of a gene with subsequent restriction cleavage and isolation of a fragment with, for example, an overhanging or smooth end which serves as starting material for the process according to the invention.
  • the nucleic acid molecule is by attaching two at least partially complementary synthetic oligonucleotides to each other, whereby an overhang can result from the attachment to one another.
  • single-stranded oligonucleotides are provided
  • the "attachment" of the nucleic acid single-strand molecules is preferably carried out by hybridization.
  • the necessary hybridization conditions can, if necessary, be modified by the person skilled in the art for each step of the addition of a new single strand based on his specialist knowledge
  • the nucleic acid single-stranded molecules used in the process according to the invention have a maximum length of approximately 150 nucleotides. A length of between 15 and 130 nucleotides is preferred.
  • the yield of intact oligonucleotides in the chemical synthesis of single-stranded precursor molecules with increasing length decreases because of incorrect incorporation of nucleotides.Therefore, a compromise must be made between the length of the oligonucleotides and their yield.
  • the quality of the single-stranded molecules used for the synthesis also has an influence on the yield of the desired nucleic acid with the gonucleotide purification with the help of HPLC, the individual nucleic acid single-stranded molecules for further syntheses are intact.
  • the length of the oligonucleotides used in further syntheses will vary according to the amount required for a synthesis orient tt and the yield in chemical synthesis
  • predetermined position means that this sequence is defined either by its primitive sequence or by its relative positioning to the actual cleavage point
  • a predetermined site for cleavage of a single nucleic acid strand can be created, for example, by incorporation of one or more artificial or modified nucleotides, base analogs or a chemical group, internal or terminal, which can be cleaved by means of a physical, chemical or enzymatic process so that a 3'-OH and / or a 5 - phosphate end is formed (eg Maxam-Gilbert reaction etc).
  • Nucleotides which are suitable for the process according to the invention are, for example, 5-hydroxy-2-deoxycytide, 5-hydroxy- 2- deoxyu ⁇ dm or 5-hydroxy-2-deoxyu ⁇ dm While the first two nucleotides are substrates for E co // - endonuclease III and formamidopy ⁇ midine DNA glycosylase, the latter nucleotide can be cleaved using uracil DNA glycosylase and apy ⁇ midase or alkali treatment
  • phosphoborane nucleotides or thioate nucleotides in the DNA sequence can bring a terminal digestion of exonuclease II or T7 (gene 6) nuclease to a standstill, the sequence being predetermined up to the modified nucleotide for cleavage
  • a further possibility for cleaving the nucleic acid single strand at a predetermined point is to introduce a "mismatch" in an artificial hairpin structure.
  • This structure can be cleaved efficiently and precisely by means of a "mismatch repa" enzyme
  • which (molecular) agent is ultimately used as residual activity for cleaving one or more predetermined positions in a nucleic acid double strand in the process according to the invention is not essential to the invention.
  • the recognition sequence is usually removed by cleavage from the growing nucleic acid double-stranded molecule.
  • class II S residual endonucleases have properties which meet the requirements for such an agent Depending on the embodiment of the method according to the invention, representatives of this class, which generate a free, cohesive 3 ' end or a protruding, cohasive 5' end, are suitable
  • the restricting agent can be of diverse nature, including all nucleic acids specifically cleaving synthetic agents such as synthetic peptides, PNA (peptide nucleic acid), triple kale DNA binding oligonucleotides, which are necessary for the specific processing of the
  • Nucleic acid term (s) are suitable for the purposes of this invention, as are naturally occurring DNA-cleaving enzymes.
  • the person skilled in the art is able to use suitable (exo) nuclease or residual functional activities for his particular purposes,
  • these can be, for example, residual II endionucleases, (c) asymmetric recognition sequences (residual endonucleases of Class II S), as well as symmetrical recognition sequences can be used, (d) as already mentioned above, the cleavage sites may be caused by the restriction activity generated, do not lie within the specific recognition sequence, but must be located 5 or 3 ' distally thereof, (e) the distance of the interface from the recognition sequence must be precisely and clearly defined,
  • Agent preferably cohesive ends This also eliminates the need for masking the single strands discussed above, which, for example, are attached to the smooth ends
  • a suitable selection of restricting agents can be found in the accompanying literature
  • step (5) or the frequency of its implementation ultimately depends on the length of the desired end product and also on the length of the strand of the starting material available
  • a generally synthetic, single-stranded DNA molecule (+) is made available, the 5 'templates of which are brought to hybridization with the 3' end of the previously synthesized single-stranded DNA molecule (-)
  • a double stranded strand is formed 3'-Term ⁇ nus which terminally masks the double strand
  • the complementary template strand can be completely or partially (FIG. 8A) degraded to facilitate the subsequent hybridization reaction by means of, for example, 5'-3 'exonuclease activity (FIG. 8B).
  • nucleic acids for example genes
  • nucleotide sequences are available at any time, anywhere and quickly (within days) if the nucleotide sequences are known from databases, for example. Knowing these sequences and the teaching according to the invention, the person skilled in the art can synthesize any desired nucleotide molecule
  • Nucleic acid molecules in the size of genes no longer have to be physically stored in refrigerators with high energy consumption. Your sequences can be managed in EDP systems and, if necessary, easily synthesized in a biological system. This eliminates the need for transport. DNA sequences can also be sent by email become
  • nucleotide sequences such as DNA sequences and gene sequences are mutated in vitro to achieve certain properties, such as stability to heat, pH changes or solubility in certain solvents, as well as the optimization or change in the biological behavior of their gene products.
  • fro mutagenesis is a complex undertaking. Due to the synthetic possibility, it is possible to insert any number of mutations even at widely spaced sequence positions, since the sequence is freely definable and predeterminable. Any number of variants can be generated The free synthesizability of the DNA sequences will shift many of the currently common methods of time-consuming DNA manipulations from the laboratory to the synthesis machine, which results in a large saving in costs and, consequently, in a large amount of time.
  • the experiment to be carried out by the person skilled in the art then consists of the design of a nucleic acid sequence on a computer editor and checking whether the properties desired by the sequence manipulations are set on the biological model or in vitro.
  • the method according to the invention is thus also a contribution to the further development of techniques of reverse genetics
  • nucleic acid molecules, fragments thereof and / or nucleotides after step (2), (2a), (3), (4), (4a), (5) and / or are not incorporated into the nucleic acid molecule provided. or (5a) separated
  • the separation of the non-incorporated single-stranded nucleic acid molecules is preferred, but not absolutely necessary, and can be accomplished by a person skilled in the art by standard methods, for example by column chromatography methods.
  • concentration of free nucleotide phosphates could be limiting, in particular for the overall yield of desired nucleic acid, and the nucleotides consumed in the synthesis and interfere with the ligation reaction, which is necessary, for example, in the case of the generation of blunt ends or the attachment of single nucleic acid strands to blunt ends and the subsequent generation of the complementary strand when carrying out the method according to the invention, as described above.
  • each individual synthesis step can be carried out under optimal conditions. It is therefore advisable to separate the one that is not required n Single strands in each case before the next synthesis step, for example in a matrix-coupled reaction, after the expiration of which used nucleotides and excess single-strand nucleic acids are eluted. Of course, the separation can also take place after or during the implementation of step (5)
  • step (5) An example of the ligation after step (5) is provided by the case that bacteria, for example BE coli, are transformed with the non-ligated synthesis product and the ligation is carried out by endogenous ligases. It is known that with increasing size the complementary overlap of cohesive ends results in a Transformation of, for example, £ coli with suitable DNA using the endogenous ligase activity for circulatory purposes is possible.
  • Gaps and protruding single-stranded DNAs are entirely tolerated, since repair mechanisms restore the integrity of the circular double strand Filled and repaired if at least one phosphodiester backbone is intact. Ligation is preferably carried out when the overhangs are only a few nucleotides long.
  • the predetermined position of the nucleic acid molecule is generated by incorporation of an artificial or modified nucleotide, a base analog, a chemical group or a “mismatch” in an artificial hairpin structure, which means a physical, chemical or enzymatic process can be split
  • the artificial or modified nucleotide is 5-hydroxy-2-deoxy-cyt ⁇ d ⁇ n, 5-hydroxy-2-deoxyur ⁇ d ⁇ n, or 5-hydroxy-2 ' -deoxyu ⁇ d ⁇ n
  • the present invention relates in a further preferred embodiment to a method in which the linkage of two terminal nucleotides via a 3 ' hydroxy and a 5 ' phosphate end with the aid of a ligase activity, and the attachment via the hybridization of complementary sequences take place
  • the nucleic acid is DNA. In another preferred embodiment of the method according to the invention, the nucleic acid is RNA.
  • the method according to the invention also includes the generation of DNA / RNA hybrids
  • the masking in step (3) is carried out additively and subtractively by adding or removing a chemical group or a chemical molecule.
  • a 5 "end is masked by removing the phosphate Group (s) or the incorporation of a 5-modified nucleotide (eg Biotm-dNTP, digoxygenin-dNTP etc.)
  • a 5-modified nucleotide eg Biotm-dNTP, digoxygenin-dNTP etc.
  • the masking is effected at least by the incorporation of a 5 'nucleotide -mod ⁇ f ⁇ z ⁇ erten
  • a masked 3 ' end is distinguished by the presence of an amino block, a dideoxynucleotide, a 3 ' phosphate, or an artificial 5 ' end
  • the further nucleic acid molecule forms a hairpin loop on the nucleic acid molecule provided after attachment and / or linkage at the distal end, which serves as a primer for the polymerase activity
  • the invention relates to a method, wherein the cleavage at a predetermined point in step (4) is carried out by a sequence-specific cleaving helical DNA
  • a triple-helical DNA is formed, for example, when a single-stranded DNA, at the end of which a heavy metal (SM) is coupled, attaches to a double-stranded DNA and, if the sequence conditions are suitable, a triple-helical structure with a double-stranded DNA forms The nucleic acid duplex is cleaved by the heavy metal at a defined position
  • any specific physical, chemical and enzymatic nucleic acid cleavage can be used according to the invention, which is necessary for the attachment of a single-stranded nucleic acid molecule for subsequent ligation with the double-stranded nucleic acid molecule.
  • Further examples of this are methodological approaches based on designed peptides or PNA ( peptide nucleic acid)
  • Another preferred embodiment of the invention relates to a method in which the cleavage at a predetermined point in step (4) is carried out by a type II S residual endonuclease.
  • Type or class II S enzymes have an asymmetric, that is to say non-parametric, recognition sequence.
  • the cleavage sites are either 5 ' - or 3 ' -d ⁇ stal to the recognition sequence Either 5 - (eg BspMI) or 3 - (eg RleAl) projecting ends or smooth ends (eg BsmFI) are generated
  • the type II S residual endonuclease is the RleAl enzyme from Rh zobium leguminosarum (Vesely Z, Muller A, Schmitz G, Kaluza K, Jarsch M, Kessler C (1990) RleAl a novel class-IIS restnction endonuclease from Rhrzobium leguminosarum recognizing 5 ' -CCCACA (N12 / 9) - 3 ' , Gene 95 129-131)
  • the nucleic acid double-stranded molecules and / or the nucleic acid single-stranded molecules are of synthetic or semisynthetic origin, the use of synthetic single-stranded molecules being particularly preferred for the synthesis
  • Semisynthetic molecules can be produced by incorporating nucleic acid fragments from "in vivo" (bacteria, yeast) amplified DNA (dsDNA, ssDNA) or RNA in one or more intermediate steps of the synthesis according to the invention at defined sites by ligation reactions. This strategy can be costly in individual cases help reduce
  • the nucleic acid molecule as a starter molecule can also be an “in vivo” DNA molecule to which any DNA sequences are attached by recursive DNA synthesis
  • the synthesis is at least partially automated.
  • a nucleic acid (gene) synthesizer for nucleic acid double strands from single nucleic acid strands
  • a battery of automated chemical oonucleotide syntheses (a technology already practiced to a large extent) can be used Providing raw material for the synthesis of biologically active, double-stranded DNA molecules (eg entire genes) These are produced from the chemically synthesized oligonucleotides in a likewise automated process
  • the double-stranded nucleic acids to be extended are bound to the synthesis matrix in a synthesis chamber.
  • this synthesis chamber the same steps described above are repeated in a cyclical reaction sequence.
  • the reaction by-products of the previous reaction are washed out of the synthesis chamber before the start of a new reaction.
  • the starter molecule is extended by one nucleic acid molecule remains bound to the synthesis matrix
  • a nucleic acid with a different sequence sequence is incorporated, so that ultimately a possibly double-stranded nucleic acid with the desired nucleotide sequence is formed
  • the invention relates to a method in which the synthesis is carried out in a matrix-bound manner
  • All carrier materials to which a nucleic acid can be bound and whose properties are compatible with the desired recursive nucleic acid synthesis are suitable as a synthesis matrix, for example streptavidin-coated surfaces, the nucleic acid double-strand molecule used as the starter molecule being incorporated via a built-in biochemical synthesis of the nucleotide
  • Further preferred synthesis matrices include nylon surfaces to which polydT-containing sequences are coupled by UV radiation, and tosyl-, active ester- or epoxy-activated surfaces (eg GOPS), the binding preferably taking place via an “amino link”, such as glass (CPG, glass wool etc), silicate, latex, polystyrene, epoxy or silicon
  • the synthesized nucleic acid molecule is isolated after the synthesis
  • a plasmid is linked to the synthesis product and the resulting nucleic acid molecule, optionally after its recirculation, is introduced and reproduced in bacteria.
  • defined sequences are incorporated into the primer in the nucleic acid molecule provided and in the nucleic acid molecule used in the last synthesis step Can bind specifically With the aid of these polymers, the completely synthesized nucleic acid molecule can be amplified in a PCR reaction, whereby the synthesis product is isolated from the affinity matrix.
  • Sequence motifs for example, type III recognition sites
  • single-stranded nucleic acid molecules are isolated by denaturing the double-stranded nucleic acid molecule
  • This embodiment of the method according to the invention is suitable for producing single-stranded nucleic acid molecules of any composition.
  • the invention relates to a kit comprising
  • the manufacturer of the kit according to the invention knows how to produce and formulate the individual components of the kit, for example the buffers contain bound starter molecule and / or a set of suitable single-stranded molecules Description of the figures
  • FIG. 1 In vitro" -ssDNA synthesis in the 3 '-5' direction (1) A starter molecule (s) coupled to a matrix is linked by means of a ligase activity around an n + lth single-stranded molecule through a 3'- 5 ' phosphodiester bond The n + lth ssDNA has a uracil deoxynucleotide at the terminal.
  • the glycosidic linkage of the base uracil is cleaved by the DNA uracil glycosylase, which results in an apyrimidine position - this in turn is cleaved by an apyrimidine endonuclease activity (exonuclease cell) so that a 5 'phosphate and a 3 'OH end is formed.
  • the n + 2nd ssDNA molecule is linked to the released 5' phosphate end in the n + 2nd ligation reaction - a subsequent phosphate reaction (not shown, see FIG.
  • Figure 2 In vitro - dsDNA synthesis in the 3 '-5' direction. All steps are carried out as in Figure 1, but then in the last step, starting from the 3 'end of the starter molecule, a polymerization reaction is started, which the new Synthesized single strand to double strand - Alternatively, in the first and in the last step, a primer of a pair of primers can be installed and thus a double strand molecule can be generated by amplification by means of the PCR reaction -
  • Figure 3 "In vitro" - dsDNA synthesis in the 3 '-5' direction. All steps are carried out as in Figure 1 .. Within each synthesis cycle, a polymerization step is initiated after the phosphatase treatment, which converts the ligated ssDNA into a dsDNA. The processing can also be carried out using a restriction endunuclease of the type HS, provided that a recognition sequence is built into each of the ssDNA fragments.
  • a polymerization step is initiated after the phosphatase treatment, which converts the ligated ssDNA into a dsDNA.
  • the processing can also be carried out using a restriction endunuclease of the type HS, provided that a recognition sequence is built into each of the ssDNA fragments.
  • Steps take place as in Figure 1 - one by one
  • Ligation step carried out phosphate reaction inactivates all DNA molecules for the next ligation step and for all subsequent ligation steps, provided that no ssDNA molecule in the n-lth
  • a 5 'phosphate can again be made available for the next reaction sequence by processing -
  • n + 2nd ssDNA molecule is linked to the released 5 'phosphate end in the n + 2nd ligation reaction.
  • a subsequent terminal transferase reaction with a dideoxytrinucleotide (not shown, see FIG. 7) inactivates all DNA chains for the n + 3rd ligation step for all subsequent ligation steps, unless there is an n + 2nd ssDNA mole was installed in the n + 2nd step.
  • the 3-OH for the next reaction sequence (n + 3) can be made available again through processing by the DNA uraclyglycosylase and the apyrimidine endonuclease activity. All steps are repeated k times until the last ssDNA molecule in the mth step was installed.
  • a 3 'end can be provided for a DNA polymerization reaction or dsDNA polymerization can be carried out as described in FIG.
  • FIG. 7 "In vitro" SSDNA synthesis in the 5 '-3' direction (1) /
  • FIG. 8A shows a complete degradation of the template molecule with T7 (Gen6), while FIG. 8B shows a partial degradation with exonuclease III.
  • the recursive DNA synthesis "in vitro" can be used for manipulation of DNA sequences "in vitro".
  • gene mutations such as deletion mutagenesis, also several deletions in one gene at the same time, gene fusions with generation of new properties, insertion mutagenesis, substitution mutagenesis and also sequence inversions
  • one to any number of point mutations can be introduced into a sequence. All DNA sequences can be generated directly in parallel syntheses without intermediate cloning steps
  • the functional changes in biological activity “in vivo” resulting from the sequence manipulations can have an effect on the protein level, provided that the coding sequences can be translated into functional proteins.
  • the method can thus be used to implement considerations in enzyme or protein design
  • RNA sequences of regulatory cis elements in order to change the binding activity of transactivators and suppressors, to investigate their behavior or even to create completely new combinations of cis elements.
  • activity of RNA was also able to -Molecules are manipulated (e.g. ribozymes), provided the manipulated DNA is transcribed
  • the following example of the application of the recursive DNA “in vitro” synthesis method is the manipulation of DNA sequences for the analysis of the binding activity of a transactive regulatory protein on a bacterial promoter region.
  • the “in vitro” mutagenesis of the binding sites has an impact on the DNA -binding protein examined
  • the DNA wild-type sequence and the mutants of the cis-active element are shown in FIG. 7, the sequence manipulations are explained in the text.
  • the aim of the experiments was to test the functionality of the binding of the regulator in a different sequence context “in vitro” and possibly also to be able to be examined “in vivo”
  • the WT-6-HDNO promoter fragment from the 5 control region of the 6-HDNO gene has some very interesting sequence features (see FIG. 7). It is characterized by extended inverted sequence repetitions (IR) and other striking sequence motifs. Characteristic sequence arrangements within the 6-HDNO -Gen-promoter region are shown in FIG. 7. This shows two inverted repeats, IR1 and IR2, which have extensive homologies with one another (FIG. 7). The right one Palmdromic half-side of IR2 repeats itself in the 5 range. Such palindromes are structural features that can be found in many bacterial cis-active regulator regions
  • IR1 and IR2 are separated by a 50 bp interpalindromic sequence.
  • the palindromic half-sides of IR1 are over 17 bp homologous, those of IR2 over 9 bp.
  • the palindrome of IR1 is twelve base pairs larger, but shows two insertions in this area of two and one base pair (AT, A)
  • Ten of twelve base pairs of IR1 in the 5 half and 9 of 12 base pairs in the 3 half of the sequence are homologous to IR2 (FIG. 7A, sequences of IR1 and IR2).
  • IR1 represents an almost perfect S 70 -like promoter sequence, with a remarkable modification.
  • the -10 region differs from the consensus sequence TAT AAT by inserting a C, which results in the sequence TAT-CAAT.
  • sequence of IR2 one finds ei ne -30 region, but no similarity to the known -10 region of an S 70 -like promoter sequence.
  • the spacing between the -10 and -30 region corresponds to the S 70 ideal of 17 at 16 bp.
  • the -35 region of an S 70 -like promoter lacks a consensus-like -10 region.
  • IR1 and IR2 there are three channels - (CATG) recognition pal ⁇ ndrome at homologous position
  • CAG channel - recognition pal ⁇ ndrome
  • the question of chance or necessity of such a structure arises outside the palindromic sequences of IR1 and IR2 there are also striking sequence motifs GC and AT-rich sequences are arranged alternately
  • An interesting Seq The feature of this domain is the presence of GC-rich sequence segments which are interrupted by an AT-rich sequence segment in the 6-HDNO-5 sequence.
  • the GC sequence blocks are located above the 5 region of the S 70 -like promoter.
  • the AT-rich positions turn into the protein with their small DNA groove, the GC-rich sequence blocks show GC-rich promoters on the outside, which are linked to the known S 70 -like promoters no longer have sequence similarity can be found in Streptomyces species
  • the plasmid pUC19 (Yanish-Perron et al, 1985) was double-digested with BamHI and Kpnl and purified via an agarose gel.
  • Kpnl has the recognition sequence 5 ' -GGTAC ' C- 3 '
  • An oligonucleotide of complementary sequence in the presence of a T4 ligase, T4 DNA polymerase and 0.2 mM dNTP was attached to the 3' protruding Kpnl end under standard conditions (Sambrook et al, (1989)), ligated and to Double strand filled in.
  • the oligonucleotide has the recognition sequence of the restriction endonuclease RleAl plus a few additional bases (see FIG. 7A (1)).
  • the now double-stranded DNA molecule (filled-in supernatant synthetic oligonucleotide) was made up of an enrichment fraction of the restriction enduminosolone leonuclum leone nuclobium leonuclease leonuclease (each Fig. 7 (2) and (3))
  • the reaction conditions were taken from Veseley et al, (1990).
  • This enzyme produces 3 - protruding ends outside se in an asymmetric binding site This specificity is unique so far and allows the repeated attachment of an O gonucleotides and the Primmg for a DNA polymerisation.
  • the short DNA fragment with the RleAl recognition sequence was cleaned away from the plasmid over an agarose gel.
  • FIG. 7B The changes which were introduced by “recursive DNA synthesis in vitro” in the sequence of the promoter-containing IR1 palindrome and in the interpalindromic sequence are shown in FIG. 7B.
  • FIG. 7B-4 shows retention only by the binding of N ⁇ cR1 to IR2 since the size of the complex to IR2 is the same size like the complex at IR1, this is an indication of the binding of the same protein to both palindromes Contrary to the pronounced effect created by the changes in both the length and the symmetry of the palindrome IR1 on the N ⁇ cR1 bond, changes in the number of helical turns in the interpalindromic sequence did not result in any difference in the N ⁇ cR1 bond to both palindromes Die Lange der The interpalindromic sequence was changed by deletions as well as insertions of 5 bp each (FIGS.
  • IR1 contains the -10 region of the promoter of the 6-HDNO gene, which differs from the consensus sequence of the promoter of the S 70 _ RNA polymerases by the insertion of an additional base position in the TATAAT sequence containing cytosine (FIG. 7B -1)
  • the question arose whether this unusual S 70 -10 region has a share in the specificity of the N ⁇ cR1 binding in IR1.
  • Fig. 7B-2 with N ⁇ cR1, the deletion of the cytosine residue at the corresponding position (Fig 7B-2) no change in the protein binding pattern compared to the pattern obtained with the unchanged DNA fragment, but in the binding of the S 70- like RNA polymerase from £ coli
  • PLASMID ⁇ - B - N 7885 bp Huang, Little, Seed (1985) in Vectors: A survey of molecular cloning and their applications "Rodriguez, R., ed, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, United States. STARTER MOLECULE:
  • biotinylated starter molecule was bound to streptavidingecoatete DynalBeads. Then 0-2 rnM Biotin-deoxyUracil was set (0.5 h incubation at RT each) to block all biotin binding sites.
  • the ssDNA was filled in to the dsDNA using the T4 DNA polymerase. If need be, the dsDNA was released from its attachment to the DynalBeads. The same amount of fresh DynalBeads were added. Only the molecules with biotin were bound to the column. Molecules without biotin from the last ligation reaction were washed away.
  • the restriction endonuclease Pacl was subsequently cleaved.
  • the Dynabeads were pelletized with a magnet.
  • the molecules were precipitated from the supernatant using ethanol and the molecule was circularized using the T4 DNA ligase. " ⁇ " The circularized synthetic plasmid molecules were then in E. coli DHlO / P3 transformed according to standard protocol and selected against Tet / Amp on LB plates.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von Nucleinsäuremolekülen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein derartiges Verfahren, das rekursiv durchgeführt wird. Die Nucleinsäurekomponenten sind vorzugsweise synthetischen oder semisynthetischen Ursprungs. Das Prinzip des erfindungsgemässen Verfahrens beruht darauf, dass an bzw. mit einem bereitgestellten Nucleinsäuremolekül ein weiteres Nucleinsäuremolekül angelagert und/oder verknüpft wird, das Ende des bereitgestellten Nucleinsäuremoleküls maskiert wird, falls an dieses bzw. mit diesem kein weiteres Nucleinsäuremolekül angelagert und/oder verknüpft wurde, das weitere Nucleinsäuremolekül an einer vorbestimmten Stelle gespalten wird, wobei vorzugsweise wiederum ein Ende entsteht, an das bzw. mit dem ein weiteres Nucleinsäuremolekül angelagert und/oder verknüpft werden kann, und die vorgenannten Verfahrensschritte gegebenenfalls so oft wiederholt werden, bis das gewünschte Produkt synthetisiert ist. Die Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens.

Description

Verfahren zur Synthese von Nucleinsauremolekülen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von Nucleinsauremolekülen Insbesondere betrifft die Erfindung ein derartiges Verfahren, das rekursiv durchgeführt wird Die Nucleinsäurekomponenten sind vorzugsweise synthetischen oder semisynthetischen Ursprungs Das Prinzip des erfindungsgemaßen Verfahrens beruht darauf, daß an bzw mit einem bereitgestellten Nucleinsäuremolekül ein weiteres Nucleinsäuremolekül angelagert und/ oder verknüpft wird, das Ende des bereitgestellten Nucleinsaure- molekuls maskiert wird, falls an dieses bzw mit diesem kein weiteres Nucleinsäuremolekül angelagert und oder verknüpft wurde, das weitere Nucleinsäuremolekül an einer vorbestimmten Stelle gespalten wird, wobei vorzugsweise wiederum ein Ende entsteht, an das bzw mit dem ein weiteres Nucleinsäuremolekül angelagert und oder verknüpft werden kann, und die vorgenannten Verfahrensschritte gegebenenfalls so oft wiederholt werden, bis das gewünschte Produkt synthetisiert ist Die Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Durchfuhrung des erfindungsgemaßen Verfahrens
Rekombinante Techniken zur Manipulation von Nucleinsauren haben in den letzten zwanzig Jahren vielen wissenschaftlichen Disziplinen, aber auch der pharmazeutischen Industrie sowie der medizinischen Forschung einen enormen Auftrieb verliehen In vielen Anwendungsbereichen ist es wünschenswert, ein Nucleinsäuremolekül mit genau definierter Sequenz auf möglichst einfache Weise mit lediglich geringem Zeit- und Kostenaufwand bereitzustellen Die gegenwartig am weitesten verbreiteten Verfahren zur Bereitstellung derartiger Nucleinsauremolekule beinhalten die Clonierung von DNA beispielsweise aus cDNA-Genbanken, gegebenenfalls gekoppelt mit anschließender Sequenzierung der isolierten cDNA Andererseits kann DNA mit gewünschter Sequenz synthetisch, beispielsweise über das konventionelle Phoshoamidit- Verfahren, hergestellt werden
Übliche Verfahren zur Bereitstellung gewünschter doppelstrangiger Nucleinsauremolekule werden nachfolgend am Beispiel der Bereitstellung von DNA-Molekulen erläutert Interessierende DNA-Molekule müssen beispielsweise durch eine cDNA- oder Positionierungsclonierung isoliert und in geeignete Vektoren cloniert werden Die Vermehrung der resultierenden Vektoren und damit der interessierenden DNA-Molekule erfolgt „in vivo" Dazu müssen die Vektoren in geeignete Wirtszellen, beispielsweise Bakterien oder Hefen, eingebracht werden Zur weiteren Manipulation der DNA, beispielsweise für die Bereitstellung abgewandelter Konstrukte, die neue phanotypische Eigenschaften vermitteln, muß die DNA wieder aus den Wirtsorganismen isoliert werden Erst dann steht sie wieder für Manipulationszwecke zur Verfugung Zur weiteren Vermehrung muß sie wiederum in geeignete Wirtsorganismen eingebracht werden Somit sind oft viele Verfahrensschritte und/oder umständliche Manipulationen notwendig, um eine gewünschte DNA zu erzeugen Es ist auch leider vorstellbar und dem Fachmann wohlbekannt, daß sich dieser Aufwand noch vervielfacht sofern eine größere Anzahl an verschiedenartigen DNAs hergestellt werden soll
Ein weiteres, im Stand der Technik bekanntes Verfahren für die „in vιtro"-Synthese von doppelstrangiger DNA ist die PCR-Technik Voraussetzung für eine derartige Herstellung ist die Verfügbarkeit geeigneter
Matrizen-DNA Die Subklonierung geeigneter DNA-Fragmente und die unter Umstanden langwierige Einstellung der richtigen Reaktionsbedingungen für die PCR können die experimentellen Arbeiten beträchtlich verzogern
Die vorstehend beschriebenen, im Stand der Technik bekannten Verfahren sind immer noch relativ zeit- und damit auch kostenaufwendig Zudem sind sie, wie im Falle der cDNA-Clonierung, nicht immer ohne weiteres erfolgreich Die synthetische Generierung von längeren Nucleinsaurefragmenten bereitet in der Praxis oft wesentliche Schwierigkeiten Auch die Generierung von DNA durch PCR, obwohl sie die DNA- Rekombinationstechnik weit vorangetrieben hat, kann im Einzelfall nicht von Erfolg gekrönt sein oder auf Schwierigkeiten stoßen, wie vorstehend beschrieben wurde
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher, ein Verfahren bereitzustellen, das die Synthese von Nucleinsauremolekulen gewünschter Sequenz und Lange auf einfache und zeitsparende Weise ermöglicht Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausfuhrungsformen gelost
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Synthese von Nucleinsauremolekulen, das die folgenden
Schritte teilweise oder vollständig umfaßt
1 Bereitstellung eines Nucleinsauremolekuls, das mindestens ein Ende aufweist, das eine Anlagerung und/ oder Verknüpfung von bzw mit einem weiteren Nucleinsäuremolekül erlaubt, 2 Anlagerung und/ oder Verknüpfung mindestens eines weiteren Nucleinsauremolekuls an das bzw mit dem Nucleinsäuremolekül, wobei das eine Ende des mindestens einen weiteren Nucleinsauremolekuls an das bzw mit dem mindestens eιne(n) Ende des Nucleinsauremolekuls angelagert und/ oder verknüpft wird, und das andere Ende des mindestens einen weiteren Nucleinsauremolekuls im Falle einer Verknüpfung maskiert ist, 3 Gegebenenfalls Maskierung des mindestens einen Endes des Nucleinsauremolekuls, an das bzw mit dem kein weiters Nucleinsäuremolekül angelagert und/oder verknüpft wurde,
4 Spaltung des mindestens einen weiteren angelagerten und/oder verknüpften Nucleinsauremolekuls an einer vorbestimmten Stelle, wobei die Maskierung entfernt wird, und ein Ende erzeugt wird, das eine Anlagerung und/oder Verknüpfung von bzw mit einem weiteren Nucleinsäuremolekül erlaubt, und
5 Mindestens ein-, gegebenenfalls mehrmalige Wiederholung der Schritte (2) bis (4), wobei in Schritt (2) jeweils geeignete Nucleinsauremolekule eingesetzt werden
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens ist das weitere Nucleinsäuremolekül ein Nucleinsaure-Einzelstrangmolekul
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform umfaßt das erfindungsgemaße Verfahren nach Schritt (2) folgenden Schritt
(2a) Auffüllung des zweiten zum Einzelstrang in seiner Sequenz komplementären Nucleinsaurestrangs durch eine Polymeraseaktivitat, wobei gegebenenfalls zuvor die Maskierung entfernt wird In einer weiteren besonders bevorzugten Ausfuhrungsform umfaßt das erfindungsgemaße Verfahren nach Schritt (4) oder (5) folgenden Schritt
(4/5a) Auffüllung des zweiten, zum Einzelstrang in seiner Sequenz komplementären Nuclemsaurestrangs durch eine Polymeraseaktivitat
Wie vorstehend erwähnt, eignet sich das erfindungsgemaße Verfahren zur Synthese von einzelstrangiger (dsDNA) oder partiell doppelstrangiger DNA
Das Prinzip des erfindungsgemaßen Verfahrens ist in Fig 1 dargestellt Weitere Ausfuhrungsformen sind in den Fig 2 bis 7 dargestellt
In einer Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens wird ein einzelstrangiges Nucleinsäuremolekül, ein partiell doppelstrangiges Nucleinsäuremolekül mit einem überhangenden 5'- oder 3' - Ende oder ein doppelstrangiges Nucleinsäuremolekül mit einem glatten Ende bereitgestellt An dieses Ende des bereitgestellten Nucleinsauremolekuls wird im nächsten Schritt mit Hilfe einer Ligaseaktivitat, beispielsweise einer T4-RNA-Lιgase, ein einzelstrangiges Nucleinsäuremolekül kovalent gebunden Das einzelstrangige Nucleinsäuremolekül kann dabei mit seinem 5' - Phosphat- oder 3' - Hydroxy - Ende an das bereitgestellte Nucleinsäuremolekül gebunden werden Dementsprechend umfaßt das erfindungsgemaße Verfahren eine Nucleinsauresynthese in 3' -5' - oder in 5' -3' -Richtung (von der Orientierung der Vorlaufermolekule ausgehend) In diesen Ausfuhrungsformen ist es wesentlich, daß das Ende des einzelstrangigen Nucleinsauremolekuls, das nicht mit dem bereitgestellten Nucleinsäuremolekül verknüpft wird, maskiert ist Maskiert bedeutet in diesem Sinne der vorliegenden Erfindung, daß dieses Ende in diesem Ligationsansatz nicht mit einem anderen einzelstrangigen Nucleinsäuremolekül der gleichen Art verknüpft werden kann, und dadurch einzelstrangige Moleküle entstehen, die aus mehreren Kopien des gleichen Nucleinsauremolekuls bestehen und ebenfalls mit dem bereitgestellten Nucleinsäuremolekül verknüpft werden können Im Sinne der Erfindung ist eine Maskierung eine chemische, enzymatische oder sonstige Modifikation desjenigen Endes, das die o g Verknüpfung verhindert Maskierungen im Sinne dieser Erfindung werden nachfolgend noch genauer beschrieben Nach der Ligation werden die Enden der bereitgestellten Nucleinsauremolekule maskiert, die mit keinem einzelstrangigen Nucleinsäuremolekül verknüpft worden sind Im nächsten Schritt wird das einzelstrangige Nucleinsäuremolekül, das an das bereitgestellte Nucleinsäuremolekül ligiert wurde, an einer vorbestimmten Stelle gespalten, wobei die Maskierung entfernt und ein Ende erzeugt wird, das eine Verknüpfung mit einem nächsten einzelstrangigen Nucleinsäuremolekül erlaubt Durch die beiden letzten Schritte gewährleistet das erfindungsgemaße Verfahren in vorteilhafter Weise, daß in weiteren Ligationsschntten nur diejenigen Nucleinsauremolekule weiter verlängert werden, an die im vorangegangenen Schritt ein einzelstrangiges Nucleinsäuremolekül ligiert wurde Der Ligations-, Maskierungs- und Spaltungsschritt kann in dieser Reihenfolge mit jeweils neu anzulagernden Molekülen nun beliebig oft wiederholt werden, wobei jeweils geeignete einzelstrangige Nucleinsauremolekule eingesetzt werden In einer anderen bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens wird nach der Synthese des kompletten gewünschten Einzelstrangs der in seiner Sequenz komplementäre Gegenstrang mit einer Polymeraseaktivitat synthetisiert Wurde der Einzelstrang in 3' - 5' - Richtung synthetisiert und wurde ein doppelstrangiges Nucleinsäuremolekül mit einem glatten Ende oder ein partiell doppelstrangiges Nucleinsäuremolekül bereitgestellt, kann der komplementäre Nucleinsaure- strang direkt von dem freien 3' - Ende des bereitgestellten Nucleinsauremolekuls synthetisiert werden Wurde jedoch ein einzelstrangiges Nucleinsäuremolekül bereitgestellt und erfolgt die Synthese des Einzelstrangs in 3' - 5' - Richtung, muß über Hybridisierung eines geeigneten einzelstrangigen Nucleinsaureoligomers an das bereitgestellte Nucleinsäuremolekül vor der Polymerasereaktion ein 3' - Ende zur Verfugung gestellt werden Erfolgte die Synthese des Nucleinsaureeinzelstrangs in 5' -3' - Richtung, wird das letzte einzelstrangige Nucleinsäuremolekül, das an den synthetisierten Nucleinsaure- einzelstrang ligiert wird, vorteilhafterweise so gewählt, daß das 3' -Ende eine Haarnadelstruktur ausbildet, so daß nach Spaltung der Haarnadelstruktur ein 3' - Ende für die Synthese des komplementären Nuclemsaurestranges durch eine Polymeraseaktivitat zur Verfugung gestellt wird
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens wird direkt nach (jeder) Spaltung des ligierten einzelstrangigen Nucleinsauremolekuls vor der Ligation des nächsten einzelstrangigen Nucleinsauremolekuls der entsprechende komplementäre Nucleinsaurestrang mittels einer Polymeraseaktivitat synthetisiert Im wesentlichen wird ansonsten dabei verfahren, wie vorstehend für die Synthese des kompletten komplementären Nucleinsaurestrangs beschrieben Im Falle einer 5' - 3' - Syntheserichtung wird dabei jedes Nucleinsaure - Einzelstrangmolekul so gewählt, daß es am 3' - Ende vorteilhafterweise eine Haarnadelstruktur ausbildet Zusatzlich wird vor der Polymerasereaktion, die vor der Maskierung der Enden der bereitgestellten Nucleinsauremolekule erfolgt, die Maskierung am 3' - Ende des ligierten Nucleinsauremolekuls entfernt
In einer weiteren Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens sind die weiteren Nucleinsauremolekule, die an das bereitgestellte Nucleinsäuremolekül angelagert und/oder damit verknüpft werden, doppelstrangig In dieser Ausfuhrungsform ist das bereitgestellte Nucleinsäuremolekül einzelstrangig oder partiell doppelstrangig mit einem überhangenden 3'- oder 5'-Ende Besitzt das weitere Nucleinsäuremolekül ein entsprechendes, in seiner Sequenz komplementäres, überhangendes 3'- oder 5'-Ende, findet eine Anlagerung durch Hybridisierung der einzelstrangigen überhangenden Enden statt Vorzugsweise ist das andere Ende des weiteren Nucleinsauremolekuls glatt Durch die vorstehend beschriebene Maskierung ist gewährleistet, daß an dieses Ende keine Anlagerung über Hybridisierung kohasiver Enden von weiteren Nucleinsauremolekulen der gleichen Art stattfindet
In einer wiederum anderen Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens ist das weitere Nucleinsäuremolekül einzelstrangig und es findet eine Anlagerung an das bereitgestellte Nucleinsäuremolekül über Hybridisierung von komplementären endstandigen Nucleotiden statt In dieser Ausfuhrungsform ist das bereitgestellte Nucleinsäuremolekül einzelstrangig oder partiell doppelstrangig mit einem überhangenden 3'- oder 5'-Ende Gegebenenfalls kann das einzelstrangige weitere Nucleinsäuremolekül zusätzlich kovalent mit dem bereitgestellten Nucleinsauremolekul mittels einer Ligaseaktivitat verknüpft werden Findet die Hybridisierung über 3' - endstandige Nucleotide statt, kann im nächsten Schritt mittels einer Polymeraseaktivitat der komplementäre Strang synthetisiert werden Findet die Hybridisierung über 5 - endstandige Nucleotide statt, wird das 3'-Ende des weiteren einzelstrangigen Nucleinsauremolekuls so gewählt, daß es eine Haamadelstruktur ausbildet, so daß ein 3' - Ende für die anschließende Polymerisationsreaktion zur Synthese des komplementären Nucleinsaurestrangs bereitgestellt wird Im nächsten Schritt wird der synthetisierte Nucleinsauredoppelstrang an einer vorbestimmten Stelle gespalten, wobei die für die Spaltung notwendige Erkennungssequenz und das glatte Ende bzw die Haamadelstruktur entfernt wird und ein vorzugsweise kohasives Ende entsteht, das eine Anlagerung über Hybridisierung und gegebenenfalls eine kovalente Verknüpfung des Nucleinsauremolekuls mit einem weiteren einzelstrangigen Nucleinsauremolekuls erlaubt
Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem Verfahren, deren Anlagerungs-, Maskierungs- und/oder Spaltungsschntte Kombinationen der entsprechenden Schritte der vorgenannten Ausfuhrungsformen darstellen So kann beispielsweise in einem ersten Synthesezyklus ein einzelstrangiges Nucleinsaure- molekul kovalent mit einem bereitgestellten Nucleinsäuremolekül verknüpft werden, anschließend der komplementäre Nuclemsaurestrang synthetisiert werden, der Doppelstrang wie vorstehend beschrieben gespalten werden, und im nächsten Synthesezyklus ein weiteres einzelstrangiges Nucleinsäuremolekül über Hybridisierung angelagert werden
Werden einzelstrangige Nucleinsauremolekule mittels einer Ligaseaktivitat mit einem bereitgestellten Nucleinsäuremolekül verknüpft, muß die Synthese des komplementären Nucleinsaurestrangs nicht nach jedem Anlagerungs-, Maskierung- und/oder Spaltungsschritt oder am Ende der Synthese des kompletten Nucleinsaureeinzelstrangs erfolgen Der Zeitpunkt des Auffullens des komplementären Stranges kann beliebig gewählt werden, in dem Sinne, daß er beispielsweise nach einem beliebigen permutierendem Anlagerungs-, Maskierungs- und/ oder Spaltungsschritt gewählt wird
Der Begriff „Maskierung" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, daß eine kovalente Verknüpfung zweier Nucleinsauremolekule nicht möglich ist Maskierte einzelstrangige 3 -Enden können beispielsweise durch den Einbau eines Aminoblocks, eines Didesoxynucleotids, eines 3'-Phosphats oder durch ein künstlich eingebautes 5 - Ende erzeugt werden Maskierte einzelstrangige 5'-Enden zeichnen sich im Sinne der vorliegenden Erfindung beispielsweise durch eine fehlende Phosphatgruppe oder durch den Einbau von einem 5 -modifizierten Nucleotid (z B Biotin-dNTP, Digoxygenin-dNTP) aus Findet eine Verlängerung eines bereitgestellten Nucleinsauremolekuls über Hybridisierung komplementärer, endstandiger Nucleotide statt, so wird ein doppelstrangiges Nucleinsäuremolekül mit einem glatten Ende, an das kein weiteres Nucleinsäuremolekül mit seinen endstandigen Nucleotiden hybridisieren kann, im Sinne der vorliegenden Erfindung auch als maskiert bezeichnet Ein partiell doppelstrangiges Nucleinsäuremolekül mit überhangenden einzelstrangigen Enden kann somit maskiert werden, indem ein überhangendes 3'-Ende mittels einer Exonucleaseaktivitat entfernt wird, oder der komplementäre Strang zu einem überhangenden 5 -Ende mittels einer Polymeraseaktivitat synthetisiert wird, so daß in beiden Fallen ein doppelstrangiges Nucleinsäuremolekül mit glatten Enden entsteht Der Begriff „Bereitstellen eines Nucleinsauremolekuls" umfaßt jegliche Form des Bereitstellens, z B die Clonierung eine Gens mit anschließender Restriktionsspaltung und Isolierung eines Fragmentes mit z B einem überhangenden oder glatten Ende, das als Ausgangsmatenal für das erfindungsgemaße Verfahren dient In einer anderen Ausfuhrunsform wird das Nucleinsäuremolekül durch Aneinanderlagerung von zwei mindestens teilweise komplementären synthetischen Oligonucleotiden bereitgestellt, wobei durch die Aneinanderlagerung ein Überhang entstehen kann In einer weiteren Ausfuhrungsform werden einzelstrangige Oligonucleotide bereitgestellt
Der Begriff „an mindestens einem Ende", wie erfindungsgemaß verwendet, bedeutet, daß die Synthese uni- oder bidirektional verlaufen kann
Die „Anlagerung" der Nucleinsaure-Einzelstrangmolekule erfolgt vorzugsweise durch Hybridisierung Die erforderlichen Hybπdisierungsbedingungen können, falls erforderlich, vom Fachmann ohne weiteres für jeden Schritt der Anlagerung eines neuen Einzelstranges aus seinen Fachkenntnissen heraus modifiziert werden
Die im erfindungsgemaßen Verfahren eingesetzten Nucleinsaure-Einzelstrangmolekule haben eine Lange von maximal ca 150 Nucleotiden Bevorzugt ist eine Lange zwischen 15 und 130 Nucleotiden Generell ist bei der Wahl der Lange der Einzelstrangmolekule zu beachten, daß die Ausbeute intakter Oligonucleotide bei der chemischen Synthese von Einzelstrang-Vorlaufermolekulen mit zunehmender Lange sinkt und zwar wegen fehlerhaften Einbaues von Nucleotiden Es ist also ein Kompromiß einzugehen zwischen Lange der Oligonucleotide und deren Ausbeute Einen Einfluß auf die Ausbeute an gewünschter Nucleinsaure mit dem erfindungsgemaßen Verfahren hat auch die Qualltat der für die Synthese eingesetzten Einzelstrangmolekule Durch die O gonucleotidreinigung mit Hilfe der HPLC sind die einzelnen Nuclemsaure-Einzelstrangmolekule für weiterfuhrende Synthesen intakt Schlußendlich wird sich die Lange der in weiterfuhrenden Synthesen verwendeten Oligonucleotide nach dem Mengenbedarf für einen Syntheseschπtt und der Ausbeute bei der chemischen Synthese orientieren
Der Begriff „vorbestimmte Stelle", wie erfindungsgemaß verwendet, bedeutet, daß diese Sequenz entweder durch ihre Pnmarsequenz oder durch ihre relative Positionierung zur eigentlichen Spaltungsstelle definiert ist
Eine vorbestimmte Stelle zur Spaltung eines Nuclemsaureeinzelstrangs kann beispielsweise durch Inkorporation eines oder mehrerer artifizieller oder modifizierter Nucleotide, Basenanaloga oder einer chemischen Gruppe, intern oder terminal, erzeugt werden, die/das mittels eines physikalischen, chemischen oder enzymatischen Verfahrens gespalten werden kann, so daß ein 3'-OH- und/oder ein 5 - Phosphat-Ende entsteht (z B Maxam-Gilbert-Reaktion etc ) Nucleotide, die sich für das er indungsgemaße Verfahren eignen, sind beispielsweise 5-Hydroxy-2-desoxycytιdιn, 5-Hydroxy-2- desoxyuπdm oder 5-Hydroxy-2 -desoxyuπdm Wahrend die ersten beiden Nucleotide Substrate für E co//-Endonuclease III und Formamidopyπmidine DNA Glycosylase darstellen, kann an letzterem Nucleotid mittels Uracil DNA-Glycosylase und Apyπmidase bzw Alkali-Behandlung gespalten werden Beispielsweise können Phosphoborannukleotide oder Thioatnukleotide in der DNA-Sequenz einen terminalen Verdau von Exonuklease II oder T7 (Gen 6) Nuklease zum Stillstand bringen, wobei die Sequenz bis zum modifizierten Nukleotid zur Spaltung vorbestimmt ist
Eine weitere Möglichkeit zur Spaltung des Nucleinsaureemzelstranges an einer vorbestimmten Stelle besteht in der Einfuhrung eines „mismatches" in einer artifiziellen Haamadelstruktur Mittels eines „mismatch repaιr"-Enzyms laßt sich diese Struktur effizient und präzise spalten
Welches (molekulare) Agens als Restπktionsaktivitat zur Spaltung einer oder mehrerer vorbestimmter Stellen in einem Nucleinsauredoppelstrang im erfindungsgemaßen Verfahren letztlich Verwendung findet, ist nicht erfindungswesentlich Wesentlich hingegen ist für Ausfuhrungsformen, die die Spaltung von doppelstrangiger Nucleinsaure umfassen, daß, wie bereits vorstehend exemplarisch erwähnt, die Erkennungssequenz auf der Nucleinsaure und die tatsächlich gespaltene Sequenz voneinander örtlich getrennt sind Erfindungsgemaß wird nämlich in der Regel die Erkennungssequenz durch die Spaltung aus dem wachsenden Nucleinsaure-Doppelstrangmolekul entfernt Die Restπktionsendonucleasen der Klasse II S besitzen Eigenschaften, die den Anforderungen an ein solches Agens entsprechen Dabei sind je nach Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens Vertreter dieser Klasse, die ein freies, kohasives 3'-Ende oder ein überstehendes, kohasives 5 -Ende erzeugen, geeignet
Die Eigenschaften der Restnktionsaktivitaten, die im erfindungsgemaßen Verfahren einsetzbar sind, können wie folgt zusammengefaßt werden
(a) das restringierende Agens kann vielfaltiger Natur sein dazu gehören alle Nucleinsauren spezifisch spaltenden synthetischen Agenzien wie synthetische Peptide, PNA (peptide nucleic acid), tripelhe kale DNA bindende Oligonucleotide, die für die spezifische Prozessierung des/der
Nucleιnsaure-Termιnus/ι im Sinne dieser Erfindung geeignet sind, wie auch natürlich vorkommende DNA-spaltende Enzyme Der Fachmann ist in der Lage, für seine jeweiligen Zwecke geeignete (Exo-) Nuklease- bzw auch Restnktionsaktivitaten einzusetzen,
(b) diese können beispielsweise Restπktionsendonucleasen des Typs II S sein, (c) asymmetrische Erkennungssequenzen (Restπktionsendonucleasen der Klasse II S), wie auch symmetrische Erkennungssequenzen sind dabei einsetzbar, (d) wie bereits vorstehend erwähnt, dürfen die Spaltstellen, die durch die Restriktionsaktivitat erzeugt werden, nicht innerhalb der spezifischen Erkennungssequenz liegen, sondern müssen 5 oder 3'dιstal davon lokalisiert sein, (e) die Entfernung der Schnittstelle von der Erkennungssequenz muß genau und eindeutig definiert sein,
(f) um die Spezifitat der Anlagerung des Nucleinsaure-Einzelstranges in einer Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens zu gewährleisten und eine effiziente Ligationsreaktion zu gewährleisten, sofern diese gewünscht ist, erzeugt die Nukleaseaktivitat bzw das restringierende
Agens vorzugsweise kohasive Enden Damit entfallt auch die vorstehend diskutierte Notwendigkeit der Maskierung der Einzelstrange, die z B an die glatten Enden angelagert werden Eine geeignete Auswahl an restringierenden Agenzien kann der Fachmann der beigefugten Literatur ste entnehmen
Die Durchfuhrung des Schrittes (5) bzw die Häufigkeit seiner Durchfuhrung hangt letztendlich von der Lange des gewünschten Endproduktes, als auch von der Stranglange des zur Verfugung stehenden Ausgangsmateπals ab
In einer anderen besonders bevorzugten Ausfuhrungsform wird ein i d R synthetisches, einzelstrangiges DNA-Molekul (+) zur Verfugung gestellt, dessen 5'-Temιnus zur Hybridisierung mit dem 3'-Ende des vorhergehend templateabhangig synthetisierten Einzelstrang-DNA-Molekuls (-) gebracht wird Somit wird eine i d R synthetische Templatesequenz (-) zur Verfugung gestellt, die, ausgehend von dem 3'-Ende (+) des vorhergehend synthetisierten Stranges, für die Synthese eines neuen DNA-Stranges (+) zur Verfugung steht Es entsteht dabei ein doppelstrangiger 3'-Termιnus, der den Doppelstrang terminal maskiert Der komplementäre Templatestrang kann zur Erleichterung der nachfolgenden Hybπdisierungs- reaktion mittels einer z B 5'-3' Exonukleaseaktivitat ganz (Figur 8A) oder teilweise (Figur 8B) abgebaut werden Eine interne Maskierung des Einzelstrangmolekuls (z B mit Boranphosphaten) dient dann dazu, den Stoppunkt der Exonuklease genau festzulegen (K W Porter et al , Nucl Actds Res 25(8), 1611-1617 (1997))
Die Vorteile, die die vorliegende Erfindung gegenüber dem Stand der Technik leistet, umfassen unter anderem
1 Verfügbarkeit
Sequenzen von Nucleinsauren, beispielsweise von Genen sind, sofern die Nucleotidfolgen beispielsweise aus Datenbanken bekannt sind, jederzeit, überall und schnell (innerhalb von Tagen) verfugbar In Kenntnis dieser Sequenzen sowie der erfindungsgemaßen Lehre kann der Fachmann jedes gewünschte Nucleotidmolekul synthetisieren
2 Lagerung und Transport
Nucleinsauremolekule in der Große von Genen müssen nicht mehr physikalisch in Kuhlschranken unter hohem Energieverbrauch gelagert werden Ihre Sequenzen können in EDV-Anlagen verwaltet, und bei Bedarf in einem biologischen System einfach synthetisiert werden Somit entfallt auch der Transport DNA-Sequenzen können per e-Mail verschickt werden
3 Manipulierbarkeit Beliebige Nucleotidfolgen wie z B DNA-Sequenzen und Gensequenzen werden für das Erreichen bestimmter Eigenschaften, wie Stabilität gegenüber Hitze, pH-Änderungen oder Loslichkeit in bestimmten Losungsmitteln wie auch der Optimierung oder Veränderung des biologischen Verhaltens ihrer Genprodukte in vitro mutiert Die in v/fro-Mutagenese ist trotz vieler verschiedener Verfahren ein aufwendiges Unterfangen Durch die Synthesemoglichkeit ist das Einfugen beliebig vieler Mutationen auch an weit auseinander egenden Sequenzpositionen möglich, da die Sequenz frei definierbar und vorherbestimmbar ist Es können also beliebig viele Varianten erzeugt werden Die freie Synthetisierbarkeit der DNA-Sequenzen wird viele der heute üblichen Methoden zeitaufwendiger DNA-Manipulationen aus dem Labor an die Synthesemaschine verlagern, wodurch eine große Kosten-, und damit verbunden eine große Zeitersparnis resultiert Das vom Fachmann durchzuführende Experiment besteht dann aus dem Design einer Nucleinsauresequenz an einem Computereditor und der Überprüfung, ob sich die durch die Sequenzmanipulationen gewünschten Eigenschaften am biologischen Modell oder in vitro einstellen Das erfindungsgemaße Verfahren ist somit auch ein Beitrag zur Weiterentwicklung von Techniken der reversen Genetik
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens werden nicht in das bereitgestellte Nucleinsäuremolekül inkorporierte weitere Nucleinsauremolekule, Fragmente davon und/oder Nucleotide nach Schritt (2), (2a), (3), (4), (4a), (5) und/oder (5a) abgetrennt
Die Abtrennung der nicht inkorporierten Nucleinsaure-Einzelstrangmolekule ist zwar bevorzugt, aber nicht unbedingt notwendig und kann vom Fachmann nach Standardverfahren, z B durch saulenchromatographische Verfahren bewerkstelligt werden Die Konzentration an freien Nucleotidphosphaten konnte insbesondere für die Gesamtausbeute an gewünschter Nucleinsaure limitierend werden, verbrauchte Nucleotide die Synthese und Ligationsreaktion stören, die z B im Falle der Generierung von glatten Enden bzw der Anlagerung von Nucleinsaure-Einzelstrangen an glatte Enden und nachfolgender Erzeugung des komplementären Stranges bei der Durchfuhrung des erfindungsgemaßen Verfahrens notwendig ist, wie vorstehend beschrieben wurde Eine hohe Konzentration verschiedener Einzelstrang-DNAs erhöht das Risiko unerwünschter Nebenprodukte Praktisch ist es deshalb von Vorteil, wenn jeder einzelne Syntheseschritt unter optimalen Bedingungen ablaufen kann Somit empfiehlt sich eine Abtrennung der nicht benotigten Einzelstrange jeweils vor dem nächsten Syntheseschritt, beispielsweise in einer matrixgekoppelten Reaktion, nach deren Ablauf verbrauchte Nucleotide und überschüssige Einzelstrang-Nucleinsauren eluiert werden Die Abtrennung kann somit selbstverständlich auch nach oder wahrend der Durchfuhrung des Schrittes (5) erfolgen
Die vorstehend beschriebene optionale Ligation in der Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens, die die Anlagerung über Hybridisierung komplementärer endstandiger Nucleotide umfaßt, kann beispielsweise vor, gleichzeitig mit oder nach Schritt (4) erfolgen In einer anderen Ausfuhrungsform kann sie nach oder wahrend des Schrittes (5) erfolgen Ein Beispiel für die Ligation nach Schritt (5) liefert der Fall, daß Bakterien, z B E coli, mit dem nicht ligierten Syntheseprodukt transformiert werden und die Ligation durch endogene Ligasen vorgenommen wird So ist bekannt, daß mit zunehmender Große der komplementären Überlappung kohasiver Enden eine Transformation beispielsweise von £ coli mit geeigneter DNA unter Ausnutzung der endogenen Ligaseaktivitat zur Zirkulansierung möglich ist Dabei werden Lucken und überstehenden Einzelstrang-DNAs durchaus toleriert, da Reparaturmechanismen die Integrität des zirkulären Doppelstranges wieder herstellen Einzelstrangbereiche werden aufgefüllt und repariert, wenn zumindest ein Phosphodiesterruckgrat intakt ist Vorzugsweise wird eine Ligation dann vorgenommen, wenn die Überhange nur wenige Nucleotide lang sind Im Falle längerer Überhange ist denkbar, daß zwischen den endstandigen Nucleotiden des Einzel- und des Doppelstranges Lucken auftreten, die vor einer Ligationsreaktion beispielsweise durch eine Polymeraseaktivitat geschlossen werden Da die bislang bekannten Restriktionsenzyme zumeist nur relativ kurze kohasive Enden erzeugen, ist auch ein C und G bzw A und T „tailing" mit terminaler Transferase denkbar, das lange Uberlappungsbereiche erzeugt, die ohne „in vitro" Ligation direkt transformiert werden können Schließlich kann das Syntheseprodukt auch nach Schritt der Isolierung des fertigen Syntheseproduktes einer Ligation zugeführt werden
Wie bereits vorstehend erwähnt, wird in einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens die vorbestimmte Stelle des Nucleinsauremolekules durch Inkorporation eines artifiziellen oder modifizierten Nucleotids, eines Basenanalogons, einer chemischen Gruppe oder eines „mismatch" in einer artifiziellen Haamadelstruktur erzeugt wird, das/die/der mittels eines physikalischen, chemischen oder enzymatischen Verfahrens gespalten werden kann
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform ist das artifizielle oder modifizierte Nucleotid 5- Hydroxy-2-desoxy-cytιdιn, 5-Hydroxy-2-desoxyurιdιn, oder 5-Hydroxy-2'-desoxyuπdιn
Wie bereits ebenfalls vorstehend erwähnt, betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform ein Verfahren, bei dem die Verknüpfung von zwei endstandigen Nucleotiden über ein 3'-Hydroxy- und ein 5'-Phosphat-Ende mit Hilfe einer Ligaseaktivitat, und die Anlagerung über die Hybridisierung komplementärer Sequenzen erfolgen
In einer anderen bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens ist die Nucleinsaure DNA In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens ist die Nucleinsaure RNA Von dem erfindungsgemaßen Verfahren umfaßt ist auch die Generierung von DNA/RNA-Hybnden
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens erfolgt die Maskierung in Schritt (3) additiv und substraktiv durch Hinzufugung bzw Entfernung einer chemischen Gruppe oder eines chemischen Moleküls In einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens erfolgt die Maskierung eines 5"-Endes durch das Entfernen der Phosphat-Gruppe(n) oder den Einbau eines 5 -modifizierten Nucleotids (z B Biotm-dNTP, Digoxygenin-dNTP etc ) Wie vorstehend erwähnt, wird durch eine Maskierung des 5'-Endes eines anzulagernden Nucleinsaure- Einzelstrangmolekules in der entsprechenden Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens eine unerwünschte Ligasenebenreaktion zwischen den 5'- und 3'-Enden der Nucleinsaure- Einzelstrangmolekule untereinander unterbunden und damit der möglichen Bildung von Konkatemeren vorgebeugt, wodurch eine optimale Ausbeute des Verfahrens der erfindungsgemaßen Lehre gewährleistet wird
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens erfolgt die Maskierung durch den Einbau mindestens eines 5'-modιfιzιerten Nucleotids In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens zeichnet sich, wie bereits erwähnt, ein maskiertes 3'-Ende durch das Vorhandensein eines Aminoblocks, eines Didesoxynucleotids, eines 3'-Phosphats, oder eines künstlichen 5'-Endes aus
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform bildet das weitere Nucleinsäuremolekül an dem bereitgestellten Nucleinsäuremolekül nach Anlagerung und/ oder Verknüpfung entfernten Ende eine Haarnadelschieife aus, die als Primer für die Polymeraseaktivitat dient
Die Erfindung betrifft in einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform ein Verfahren, wobei die Spaltung an einer vorbestimmten Stelle in Schritt (4) durch eine sequenzspezifisch spaltende tπpelhelikale DNA erfolgt
Eine tripelhelikale DNA wird z B dann gebildet, wenn sich eine Einzelstrang-DNA, an deren Ende ein Schwermetall (SM) gekoppelt ist, an einen DNA-Doppelstrang anlagert und sich, sofern die Sequenzbedingungen geeignet sind, eine tripelhelikale Struktur mit einem DNA-Doppelstrang ausbildet Der Nucleinsaure-Doppelstrang wird von dem Schwermetall an einer definierten Position gespalten
Darüber hinaus kann wie bereits erwähnt, erfindungsgemaß jede spezifische physikalische, chemische und enzymatische Nucleinsaurespaltung eingesetzt werden, welche für die Anlagerung eines Nucleinsaure-Einzelstrangmolekules zur nachfolgenden Ligation mit dem Nucleinsaure- Doppelstrangmolekul forderlich ist Weitere Beispiele hierfür sind methodische Ansätze basierend auf designten Peptiden oder PNA (peptide nucleic acid) Eine Übersicht über die vorgenannten Moleküle und Beispiele für deren Einsatzmoglichkeiten kann der Fachmann der nachstehenden Literaturhste entnehmen
Eine andere bevorzugte Ausfuhrungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren, bei dem die Spaltung an einer vorbestimmten Stelle in Schritt (4) durch eine Typ II S Restπktionsendonuclease erfolgt Typ oder Klasse II S Enzyme besitzen eine asymmetrische, also nichtpa ndromische Erkennungssequenz Die Spaltstellen liegen entweder 5'- oder 3'-dιstal zur Erkennungssequenz Es werden entweder 5 - ( z B BspMI) oder 3 - (z B RleAl) überstehenden Enden oder glatte Enden (z B BsmFI) erzeugt
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens ist die Typ II S Restπktionsendonuclease das RleAl-Enzym aus Rh zobium leguminosarum (Vesely Z , Muller A, Schmitz G, Kaluza K, Jarsch M, Kessler C (1990) RleAl a novel class-IIS restnction endonuclease from Rhrzobium leguminosarum recognizing 5'-CCCACA(N12/9) - 3', Gene 95 129-131)
In einer anderen bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens ist/sind das Nucleinsaure-Doppelstrangmolekule und/oder die Nucleinsaure-Einzelstrangmolekule synthetischen oder semisynthetischen Ursprungs, wobei für die Synthese der Einsatz synthetischer Einzelstrangmolekule besonders bevorzugt ist Semisynthetische Moleküle sind dadurch herstellbar, daß Nucleinsaurefragmente aus „in vivo" (Bakterien, Hefe) amplifizierter DNA (dsDNA, ssDNA) oder RNA in einem oder mehreren intermediären Schritten der erfindungsgemaßen Synthese an definierten Stellen durch Ligationsreaktionen eingebaut werden Diese Strategie kann im Einzelfall Kosten beträchtlich reduzieren helfen Beispielsweise kann das als Startermolekul Nucleinsäuremolekül ebenfalls ein „in vivo" erzeugtes DNA-Molekul sein, an das durch rekursive DNA-Synthese beliebige DNA-Sequenzen angehängt werden
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens ist die Synthese zumindest teilweise automatisiert So kann beispielsweise in einem Nucleinsaure (Gen-) syntheseautomaten für Nucleinsaure-Doppelstrange aus Nucleinsaure-Einzelstrangen eine Batterie von automatisierten chemischen O gonucleotidsynthesen (eine bereits in großem Ausmaße praktizierte Technologie) den Rohstoff für die Synthese von biologisch aktiven, doppelstrangigen DNA-Molekulen (z B ganzen Genen) liefern Diese werden aus den chemisch synthetisierten Oligonucleotiden in einem ebenfalls automatisierten Verfahren hergestellt
Dabei sind in einer Synthesekammer die zu verlängernden Doppelstrangnucleinsauren an der Synthesematrix gebunden In dieser Synthesekammer laufen in einer zyklischen Reaktionsfolge immer wieder die gleichen oben beschriebenen Schritte ab Die Reaktionsnebenprodukte der vorhergehenden Reaktion werden vor Beginn einer neuen Reaktion aus der Synthesekammer ausgewaschen Das um ein Nucleinsäuremolekül verlängerte Startermolekul bleibt an die Synthesematrix gebunden Bei jedem Syntheseschritt wird eine Nucleinsaure mit einer anderen Sequenzfolge eingebaut, so daß schlußendlich eine gegebenenfalls doppelstrangige Nucleinsaure mit der gewünschten Nucleotidsequenz entsteht
Die Erfindung betrifft in einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform ein Verfahren, bei dem die Synthese matrixgebunden durchgeführt wird
Alle Tragermatenalien, an die sich eine Nucleinsaure binden lassen und deren Eigenschaften mit der angestrebten rekursiven Nucleinsaure-Synthese kompatibel sind, kommen als Synthesematrix in Frage, z B streptavidinbemantelte Oberflächen, wobei das als Startermolekul eingesetzte Nucleinsaure- Doppelstrangmolekul über ein eingebautes biotmyhertes Nucleotid an die Synthesematrix gekoppelt wird Weitere bevorzugte Synthesematrices schließen Nylonoberflachen, an die polydT-haltige Sequenzen durch UV-Bestrahlung gekoppelt werden, sowie tosyl-, aktivester- oder epoxidaktivierte Oberflachen (z B GOPS) ein, wobei die Bindung vorzugsweise über einen „Aminolink" erfolgt, wie Glas (CPG, Glaswolle etc ), Silikat, Latex, Polystyrol, Epoxid oder Silizium
In einer anderen bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens wird das synthetisierte Nucleinsäuremolekül nach der Synthese isoliert
Dies geschieht einerseits durch Einbau eines affinitatsvermittelnden Agens im letzten Syntheseschritt, wie z B Biotin, Digoxiginm, eines Histidin-Tags oder eines Maltoserestes Die so markierten Syntheseendprodukte können somit einfach und kostengünstig mittels entsprechender Säulen isoliert werden
Alternativ wird im letzten Syntheseschritt des erfindungsgemaßen Verfahrens ein Plasmid mit dem Syntheseprodukt verknüpft und das dadurch entstehende Nucleinsäuremolekül, gegebenenfalls nach dessen Rezirkulansierung in Bakterien eingeführt und vervielfältigt Alternativ werden in das bereitgestellte Nucleinsäuremolekül sowie in das im letzten Syntheseschritt verwendete Nucleinsäuremolekül definierte Sequenzen inkorporiert, an die Primer spezifisch binden können Mit Hilfe dieser Pπmer kann das fertig synthetisierte Nucleinsäuremolekül in einer PCR-Reaktion amp fiziert werden, wodurch das Syntheseprodukt von der Afflnitatsmatπx isoliert wird Finden sich in den termmalen Sequenzen Sequenzmotive (z B TypIlS Erkennungsstellen), mittels derer kohasive Enden erzeugt werden können, so ist es leicht möglich, aus einzelnen DNA-Molekulen solche von noch höherer Ordnung zu synthetisieren
In einer anderen bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens werden Nucleinsaure-Einzelstrangmolekule durch Denaturierung des Nucleinsaure-Doppelstrangmolekuis isoliert
Diese Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens ist dazu geeignet, Nuclemsaure- Einzelstrangmolekule beliebiger Zusammensetzung herzustellen In diesem Zusammenhang besonders zu erwähnen ist die Möglichkeit, derartige RNA-Molekule bereitzustellen
Schließlich betrifft die Erfindung einen Kit, umfassend
(a) eine Ligase, und/oder
(b) eine Polymerase, (c) ggfs ein Typ II S-Restπktionsenzym,
(d) ggfs eine Uracil-DNA-Gycosylase und eine Apyπmidase und/oder eine Endonuclease III und eine Formamidopyπmidin DNA Glycosylase und/ oder ein "mismatch repair" Enzym,
(e) gegebenenfalls eine Phosphatase, eine terminale Transferase und/ oder eine Exonuklease,
(f) gegebenenfalls einen Waschpuffer zur Eluation von Reaktionsnebenprodukten und nicht in das Produkt der erfindungsgemaßen Synthese eingebautem Material,
(g) gegebenenfalls eine Synthesematrix mit einem gegebenenfalls bereits daran gebundenen Nucleinsäuremolekül als Startermolekul,
(h) gegebenenfalls geeignete Reaktionspuffer für die in (a) bis (e) aufgeführten Enzyme
Aufgrund der Lehre der vorliegenden Erfindung sowie aufgrund des allgemeinen Fachwissens in diesem technischen Gebiet ist dem Hersteller des erfindungsgemaßen Kits bekannt, wie er die einzelnen Komponenten des Kits, z B die Puffer, herstellt und formuliert Gegebenenfalls kann der erfindungsgemaße Kit auch ein nicht an eine Matrix gebundenes Startermolekul und/ oder einen Satz geeigneter Einzelstrangmolekule enthalten Beschreibung der Figuren
Figur 1. „In vitro"-ssDNA-Synthese in 3 ' -5 ' -Richtung (1) Ein an eine Matrix gekoppeltes Startermolekül (n) wird mittels einer Ligaseaktivitat um ein n+ltes Einzelstrangmolekül durch eine 3'- 5' Phosphodiesterbindung verknüpft. Die n+lte ssDNA besitzt terminal ein Uracildesoxynukleotid . Die glycosidische Bindung der Base Uracil wird durch die DNA-Uracilglycosylase gespalten , wodurch eine apyrimidinische Position entsteht- Diese wiederum wird durch eine apyrimidinische Endonukleaseaktivität (Exonukleaselll) so gespalten, daß ein 5 ' -Phosphat und ein 3 ' -OH ende entsteht. (3) an das freiwerdende 5 ' -Phosphatende wird in der n+2ten Ligationsreaktion das n+2te ssDNA-Molekül verknüpft - Eine anschließende Phosphatesereaktion (nicht gezeigt, s. Figur4. ) inaktiviert alle DNA-Ketten für den n+3ten Ligationsschritt für alle folgenden Ligationsschritte , sofern kein n+2tes ssDNA-Molekül im n+2ten Schritt eingebaut wurde. Durch die DNA-Uracilglycosylase und die apyrimidinische Endonukleaseaktivität kann durch Prozessierung wieder ein 5'- Phospahat für die nächste Reaktionsfolge (n+3) zur Verfügung gestellt werden- Alle Schritte wiederholen sich k-mal bis das letzte ssDNA-Molekül im m-ten Schritt eingebaut wurde.
Figur 2. „In vitro" - dsDNA-Synthese in 3 ' -5 ' -Richtung . Alle Schritte erfolgen wie in Figur 1. , dann aber wird im letzten Schritt ausgehend vom 3 ' -Ende des Startermoleküls eine Polymerisationsreaktion gestartet, die den neu synthetisierten Einzelstrang zum Doppelstrang auffüllt- Alternativ kann im ersten und im letzten Schritt jeweils ein Primer eines Primerpaares eingebaut werden und somit ein Doppelstrangmolekül durch Amplifikation mittels der PCR-Reaktion erzeugt werden -
Figur 3. „In vitro" - dsDNA-Synthese in 3 ' -5 ' -Richtung . Alle Schritte erfolgen wie in Figur 1.. Innerhalb eines jeden Synthesεzyklus wird nach der Phosphatasebehandlung ein Polymerisationschritt eingeleitet, der die anligierte ssDNA in eine dsDNA umwandelt. Die Prozessierung kann auch mittels einer Restriktionsendunuklease des Typs HS erfolgen, sofern eine Erkennungssequenz in jedem der ssDNA-Fragmente eingebaut vorliegt.
Figure 4. „In vitro" - dsDNA-Synthese in 3 ' -5 ' -Richtung . Alle
Schritte erfolgen wie in Figur 1 - Eine nach einem
Ligationsschritt durchgeführte Phosphatesereaktion inaktiviert alle DNA-Moleküle für den nächsten Ligationsschritt und für alle folgenden Ligationsschritte, sofern kein ssDNA-Molekül im n-lten
Synthesezyklus eingebaut wurde. Durch die DNA-Uracilglycosylase und die apyrimidinische Endonukleaseaktivität in jedem
Synthesezyklus kann durch Prozessierung wieder ein 5 '-Phosphat für die nächste Reaktionsfolge zur Verfügung gestellt werden -
Alle Schritte wiederholen sich k-mal bis das letzte ssDNA- Molekül im m-ten Schritt eingebaut wurde - ^ Figur 5. „In vitro" -ssDNA-Synthese in 5 ' -3 ' -Richtung (1) Ein an eine Matrix gekoppeltes Startermolekül (n) wird mittels einer Ligaseaktivitat um ein n+ltes Einzelstrangmolekül durch eine 3 ' - 5' Phosphodiesterbin ung verknüpft. Die n+lte ssDNA besitzt terminal ein Uracildesoxynukleotid , ist 5 ' -phosphoryliert und 3 ' -blockiert ( - ) - Die glycosidische Bindung der Base Uracil wird durch die DNA-Uracilglycosylase gespalten, wodurch eine apyrimidinische Position entsteht. Diese wiederum wird durch eine apyrimidinische Endonukleaseaktivität (Exonukleaselll ) so gespalten, daß ein 5 ' -Phosphat und ein 3 ' -OH ende entsteht- (3) an das freiwerdende 5 ' -Phosphatende wird in der n+2ten Ligationsreaktion das n+2te ssDNA-Molekül verknüpft. Eine anschließende terminale Transferasereaktion mit einem Didesoxytrinukleotid (nicht gezeigt, s. Figur 7.) inaktiviert alle DNA-Ketten für den n+3ten Ligationsschritt für alle folgenden Ligationsschritte, sofern kein n+2tes ssDNA-Molekül im n+2ten Schritt eingebaut wurde. Durch die DNA-Uracilglycosylase und die apyrimidinische Endonukleaseaktivität kann durch Prozessierung wieder ein 3 ' -OH für die nächste Reaktionsfolge (n+3) zur Verfügung gestellt werden- Alle Schritte wiederholen sich k-mal bis das letzte ssDNA-Molekül im m-ten Schritt eingebaut wurde.
Figur 6. „In vitro" -ssDNA-Synthese in 5 ' -3 ' -Richtung (1) Ein an eine Matrix gekoppeltes Startermolekül (n) wird mittels einer Ligaseaktivitat um ein n+ltes Einzelstrangmolekül durch eine 3*- 5' Phosphodiesterbindung verknüpft. Alle weiteren Schritte erfolgen wie in Figur S. dargestellt .
Im letzten Schritt kann, initiiert durch beispielsweise eine 3'- terminale Haarnadelstruktur ein 3 ' -Ende für eine DNA- Polymerisationsreaktion zur Verfügung gestellt werden oder eine dsDNA Polymerisation erfolgt wie in Figur 2 beschrieben -
Figur 7. „In vitro" -ssDNA-Synthese in 5 ' -3 ' -Richtung (1)/
Darstellung der Reaktion zur Inaktivierung nicht ligierter
Enden. Eine terminale Transferasereaktion mit einem
Didesoxytrinukleotid inaktiviert alle DNA-Ketten für den nächsten Ligationsschritt für alle jeweils folgenden
Ligationsschritte, sofern kein ssDNA-Molekül im n-lten
Syntheseschritt eingebaut wurde. Durch die DNA-Uracilglycosylase und die apyrimidinische Endonukleaseaktivität kann durch
Prozessierung wieder ein 3 ' -OH für die nächste Reaktionsfolge zur Verfügung gestellt werden- Alle Schritte wiederholen sich k- mal bis das letzte ssDNA-Molekül im m-ten Schritt eingebaut wurde .
Figur 8. Polymerase-basierte DNA-Synthese. Ein Startermolekül (n) wird zur Verfügung gestellt. Synthetische Oligonukleotide werden sequentiell in einer zyklischen Reaktionsfolge zur Verfügung gestellt, wobei deren 5'-Ende zur Hybridisierung mit dem jeweils vorhergehenden 3'-Ende des komplementären DNA-Stranges gebracht wird. Vom 3'-Ende ausgehend erfolgt die Synthese zum Doppelstrang. Fig. 8A zeigt eine vollständige Degradation des Template-Moleküls mit T7 (Gen6), während in Fig. 8B eine partielle Degradation mit Exonuklease III dargestellt ist. Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung
Beispiel 1
Die rekursive DNA-Synthese „in vitro" kann für Manipulation von DNA - Sequenzen „in vitro" eingesetzt werden Zum einen können Genmutationen, wie Deletionsmutagenesen, auch mehrere Deletionen in einem Gen gleichzeitig, Genfusionen unter Erzeugung neuer Eigenschaften, Insertionsmutagenesen, Substitutionmutagenesen und auch Sequenzinversionen durchgeführt werden Des weiteren lassen sich eine bis beliebig viele Punktmutationen in eine Sequenz einfuhren Alle DNA-Sequenzen können ohne Zwischenclonierungsschπtte in parallelen Synthesen direkt erzeugt werden
Die durch die Sequenzmanipulationen resultierenden funktionalen Veränderungen der biologischen Aktivität „in vivo" können sich zum einen auf der Proteinebene auswirken, sofern die codierenden Sequenzen in funktionale Proteine translatiert werden können Die Methode kann somit zur Umsetzung von Überlegungen bei Enzym- bzw Proteindesign eingesetzt werden
Zum anderen aber ist es möglich, die DNA-Sequenzen regulatorischer cis-Elemente zu manipulieren, um die Bindungsaktivitat von Transaktivatoren und Suppresoren zu verandern, deren Verhalten zu untersuchen oder gar ganz neue Kombinationen von cis-Elementen zu schaffen Weiterhin konnte auch die Aktivität von RNA-Molekulen manipuliert werden (z B Ribozyme), sofern die manipulierte DNA transkribiert wird
Das folgende Beispiel für die Anwendung der rekursiven DNA -„in vitro" - Synthesemethode ist die Manipulation von DNA-Sequenzen zur Analyse der Bindungsaktivitat eines transaktiven Regulatorproteins an einer bakteriellen Promotorregion Durch die „in vitro" - Mutagenese der Bindungsstellen werden die Auswirkungen auf das DNA-bindende Protein untersucht Die DNA- Wildtypsequenz und die Mutanten des cis-aktiven Elementes sind in der Figur 7 dargestellt, die Sequenzmanipulationen sind im Text erläutert Ziel der Versuche war es, die Funktionalität der Bindung des Regulators in einem anderen Sequenzkontext „in vitro" und eventuell auch „in vivo" untersuchen zu können
Auf einem SaulllA-DNA-Fragment im Bereich eines bakteriellen Promotors finden sich pa ndromische Sequenzabschnitte, deren Struktur starke Ähnlichkeit mit Sequenzen besitzen, die auch in anderen Systemen an der transkriptionellen Regulation beteiligt sind Die transkπptionelle Aktivität des im 5 - Sequenzbereich des 6-HDNO-Gens befindlichen S70 -ähnlichen Promotors, auf dem cis-aktive Elemente liegen, wurde von Mauch et al , (1990) „in vivo" im heterologen E coli System detailliert untersucht Die Clonierung dieses DNA-Fragments, das in den meisten DNA-Bindungsstudien dieser Arbeit Verwendung fand, wird im folgenden als WT-6-HDNO-Prorτnotorfragment bezeichnet (Fig 7A (1-3)
Die Inkubation von Rohextrakten aus Arthrobacter nicotinovorans Zellen (10-40 mg Gesamtprotein) mit einem radioaktiv markierten 6-HDNO-Bιndunsfragment des 6-HDNO-Gens bei Anwesenheit eines Kompetitors (i d R polydldC), aus dem Promotorbereich, zeigt nach der Trennung der Bestandteile dieses Inkubationsansatzes im elektrischen Feld eines nativen PAA-Gels eine deutliche Retention des DNA-Fragments gegenüber einem Kontrollansatz ohne Zugabe von Rohextraktprotein
Der zur Identifikation der NιcR1-Bιndeaktιvιtat herangezogene experimentelle Ansatz wird als Gelretentionsanalyse bezeichnet Mit Hilfe dieser Methode kann das kinetische und funktionale Verhalten von DNA-Bindungsproteinen in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern „in vitro" qualitativ und quantitativ untersucht werden Außerdem kann man unter bestimmten Voraussetzungen auch Aussagen zur Struktur des DNA/ Protein-Komplexes machen
Unter Verwendung von Rohextrakten kann man in der Regel im Gelretentionsexpenment eine dominante, retardierte Bande erkennen Eine zweite Bande ist manchmal ebenfalls erkennbar Diese DNA- Bindungsaktivitat konnte durch große Mengen von unmarkierter, unspezifischer Kompetitor-DNA nicht supprimiert werden, wohl aber durch unmarkiertes Bindefragment in sehr geringen Mengen Es wurde deshalb angenommen, daß diese DNA-Bindeaktivitat spezifisch ist und mit der transkπptionellen Regulation des Nikotinregulons in Zusammenhang steht Sie wurde mit dem Kürzel NιcR1 (nicotme regulator 1) bezeichnet (Mauch et al , Bernauer et al , 1992)
Das Verhalten der nιcR1-Bιndeaktιvιtat im Gelretentionsexpenment wurde in dieser Arbeit analysiert um Aussagen über den Ort, die Spezifitat, Kinetik und Stochiometrie der Bindungsreaktion treffen zu können und die Reaktion der DNA-Bindungsfunktion auf Manipulationen an dem WT-6-HDNO-Promotorfragment und auf potentielle Effektorsubstanzen zu untersuchen
Diese Versuche sollten darüber Aufschluß geben, welche molekularen Mechanismen für die Regulation des 6-HDNO-Gens verantwortlich sein konnten Außerdem wurden die Anzuchtbedingungen und der Induktionsstatus der Arthrobacter nicotinovorans Zellen variiert, aus denen schließlich Rohextrakt zur Analyse im Gelretentionsexpenment hergestellt wurde Diese Experimente sollten Aufschluß darüber geben, ob sich das Bindungsverhalten von NιcR1 verändert oder die Anwesenheit zusätzlicher Faktoren in Abhängigkeit von einem der Versuchsparameter nachzuweisen ist Der zu den Protem/DNA- Bindungsversuchen verwendete Reaktionsstandardpuffer lehnt sich an den von Garner und Revzin (1981) verwendeten Reaktionspuffer an Die NιcR1 -Bindungsaktivitat ist durch Ammoniumsulfat- fraktionierung anreicherbar Die Anreicherung der NιcR1 -Bindungsaktivitat war die Voraussetzung für Versuche zur Analyse des Bindungsverhaltens von NιcR1 bei gleichzeitiger Bindung von beiden palmdromischen Sequenzen, die auf dem WT-6-HDNO-Promotorfragment zu finden sind
Das WT-6-HDNO-Promotorfragment aus dem 5 -Kontrollbereich des 6-HDNO-Gens besitzt einige sehr interessante Sequenzmerkmale (s Fig 7) Es ist von ausgedehnten invertierten Sequenzwiederholungen (IR) und anderen auffälligen Sequenzmotiven geprägt Charakteristische Sequenzarrangements innerhalb der 6-HDNO-Gen-promoterregιon sind in Fig 7 gezeigt Dies zeigt zwei invertierte Wiederholungen, IR1 und IR2, welche extensive Homologien untereinander haben (Fig 7) Die rechte palmdromische Halbseite von IR2 wiederholt sich im 5 -Bereich noch einmal Solche Palindrome sind strukturelle Merkmale, die man in vielen bakteriellen cis-aktiven Regulatorregionen findet
IR1 und IR2 sind durch eine 50 bp lange interpalindromische Sequenz voneinander getrennt Die palindromischen Halbseiten von IR1 sind über 17 bp zueinander homolog, die von IR2 über 9 bp Das Palindrom von IR1 erreicht eine um zwölf Basenpaare größere Ausdehnung, zeigt aber in diesem Bereich zwei Insertionen von je zwei und einem Basenpaar (AT, A) Zehn von zwölf Basenpaaren von IR1 in der 5 -Hälfte und 9 von 12 Basenpaaren in der 3 -Hälfte der Sequenz sind zu IR2 homolog (Fig 7A, Sequenzen von IR1 und IR2) Diese sequenzspezifischen Merkmale konnten strukturelle und funktionale Bedeutung bei der Bindung des „in trans' -bindungsaktiven Proteins NιcR1 und einer S70 -ähnlichen RNA-Polymerase besitzen IR1 repräsentiert eine nahezu perfekte S70 -ähnliche Promotorsequenz, mit einer bemerkenswerten Modifikation Die -10-Regιon unterscheidet sich von der Konsensussequenz TAT AAT durch die Insertion eines C, wodurch die Sequenz TAT-CAAT entsteht In der Sequenz von IR2 findet man eine -30-Regιon, aber keine Ähnlichkeit zu der bekannten -10-Regιon einer S70 -ahnlichen Promotorsequenz Der Abstand der -10 und -30-Regιon entspricht mit 16 bp dem S70 -Ideal von 17 Integriert in die Sequenz von IR2 ist die -35-Regιon eines S70-ahnlιchen Promotors eine konsensusahnliche -10-Regιon fehlt Einige andere Sequenzmerkmale konnten auch die Aktivität weiterer am 5 -Sequenzbereich des 6-HDNO-Gens transaktiver regulatorischer Elemente widerspiegeln Innerhalb der Palindrome IR1 und IR2 befinden sich drei Nlal-(CATG)-Erkennungspalιndrome an homologer Position Interessant ist, daß sich hinter der linken palindromischen Halbseite von IR2, an nicht homologer Position, ebenfalls eine solche Schnittstelle befindet Es stellt sich die Frage von Zufall oder Notwendigkeit einer solchen Struktur Außerhalb der palindromischen Sequenzen von IR1 und IR2 befinden sich ebenfalls auffallende Sequenzmotive GC- und AT-reiche Sequenzen sind alternierend angeordnet Ein interessantes Sequenzmerkmal dieser Domäne ist die Gegenwart GC reicher Sequenzabschnitte, welche von einem AT-reichen Sequenzabschnitt in der 6-HDNO-5 -Sequenz unterbrochen werden Die GC-Sequenzblocke sind oberhalb der 5 -Region des S70 -ähnlichen Promotors lokalisiert Eine detaillierte Basennachbarschaftsanalyse nach dem in Ebbole und Zalkm (1989) beschriebenen Algorithmus zeigt, daß diese Sequenz in hohem Maße nicht statistisch ist Um dies zu zeigen, wurde eigens ein Computerprogramm in „Pascal" geschrieben Wahrend die Sequenzen innerhalb der palindromischen Bereiche aus ziemlich regelmäßig alternierenden kurzen GC- und AT- Bereichen mit sehr ausgewogenem GC-Gehalt bestehen, finden sich 5 zu den Palindromen größere Sequenzabschnitte mit sehr unausgewogenem GC-Gehalt (Fig 7A) Zunächst steigt der GC-Gehalt von 5' außerhalb des Palindroms IR2 kommend an, es wird zunächst ein GC-Maximum dann ein GC- Minimum durchlaufen (Fig 7A) Die Situation wiederholt sich vor dem Palindrom IR1 Alternierende GC- und AT-reiche Sequenzabschnitte werden mit strukturellen Eigenschaften der Proteinbindung in Zusammenhang gebracht Die AT-reichen Positionen drehen sich mit ihrer kleinen DNA-Furche in das Protein, die GC-reichen Sequenzblocke zeigen nach außen GC-reiche Promotoren, welche mit den bekannten S70 -ähnlichen Promotoren keine Sequenzahnlichkeit mehr besitzen finden sich in Streptomyces Spezies Als Startermolekul (s Fig 7AA(0)) für die rekursive DNA-Synthese wurde das Plasmid pUC19 (Yanish- Perron et al , 1985) mit BamHI und Kpnl doppelverdaut und über ein Agarosegel gereinigt Kpnl hat die Erkennungssequenz 5'-GGTAC'C-3' An das 3'-uberstehende Kpnl-Ende wurde ein Oligonukleotid komplementärer Sequenz in Anwesenheit einer T4-Lιgase, T4-DNA-Polymerase und 0,2 mM dNTP unter Standardbedingungen (Sambrook et al , (1989)) angelagert, ligiert und zum Doppelstrang aufgefüllt Das Oligonucleotid besitzt am 5'-Ende die Erkennungssequenz der Restriktionsendonuclease RleAl plus einige zusätzliche Basen (s Fig 7A(1)) Das nun doppelstrangige DNA-Molekul (aufgefülltes überstehendes synthetisches Oligonucleotid) wurde mit einer Anreicherungsfraktion der Restriktionsendonuclease RleAl aus Rhizobium leguminosarum restringiert (jeweils Fig 7 (2) und (3 )) Die Reaktionsbedingungen wurden aus Veseley et al , (1990) entnommen Dieses Enzym erzeugt 3 - überstehende Enden außerhalb seiner asymmetrischen Bmdungsstelle Diese Spezifitat ist bislang einzigartig und laßt die wiederholte Anlagerung eines O gonucleotides und das Primmg für eine DNA- Polymeπsation zu Das kurze DNA-Fragment mit der RleAl-Erkennungssequenz wurde vom Plasmid über ein Agarosegel weggereinigt An das bei der Restriktionsreaktion entstehende 3 '-überstehende Ende wurde erneut ein zu dessen Ende komplementäres Oligonucleotid (Fig 7A(2)) angelagert und aufgefüllt, wie oben erwähnt (s auch Fig 1 und 2) Die gleiche Reaktion wurde mit dem Oligonucleotid (Fig 7A(3)) und den Varianten Fig 7B-1 bis B-7 durchgeführt Durch die Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden konnten parallel sieben Sequenzvarianten und die Wildtypsequenz erzeugt werden Nach der Reaktionsfolge Fig 7A (3) wurden die neu entstandenen DNAs mit BamHI nachgespalten (s Sequenz, Fig 7A(3")), der Vektor (pUC19 + Bindefragment) zirkulaπsiert und gemäß Standardmethoden in E coli transformiert Findet sich die RleAl-Erkennungssequenz terminal am Ende auch der synthetischen Oligonucleotide, kann man die DNA-Synthesereaktion wie in diesem Beispiel jeweils um einen Schritt verlangern
Um die Bindungseigenschaften von NιcR1 zu charakterisieren, wurden Sequenzanderungen in die den S70 "ähnlichen Promotor tragende IR1-Bιndungsstelle eingeführt und die Lange der interpalindromische Sequenz (IS, Fig 7B-5, -6, -7) wurde variiert Durch letzere Versuche sollten die stenschen Anforderungen an die pahndromische Bindungssequenz IR1 untersucht werden Sequenzmodifikationen, welche in das WT-6-HDNO-Promotorfragment eingeführt wurden, sind in der Figur 7 gezeigt
Die Änderungen, die durch „rekursive DNA Synthese in vitro" in der Sequenz des Promotor enthaltenden IR1-Palιndroms und in der interpalindromischen Sequenz eingeführt wurden, sind in Fig 7B dargestellt Die Reduktion von IR1 auf ein Oktamer (Fig 7B-3) wie auch die Deletion der zentralen G-Position (Fig 7B-4) zerstören die Bindungsfahigkeit von NιcR1 an IR1
Setzt man die Spaltungsprodukte im Gelretentionsexpenment ein, so wird nur IR2 retardiert, nicht aber das mutierte IR1 enthaltende Fragment Das in Fig 7B-4 gezeigt Konstrukt zeigt Retention nur noch durch die Bindung von NιcR1 an IR2 Da die Große des Komplexes an IR2 die gleiche Große hat wie der Komplex an IR1 , ist dies ein Hinweis auf die Bindung desselben Proteins an beide Palindrome Entgegen dem ausgeprägten Effekt, der durch die Änderungen sowohl der Lange wie auch der Symmetrie des Palindroms IR1 auf die NιcR1 -Bindung erzeugt wird, führten Änderungen der Anzahl an Helixwindungen in der interpalindromischen Sequenz zu keinem Unterschied der NιcR1-Bιndung an beide Palindrome Die Lange der interpalindromischen Sequenz wurde durch Deletionen wie auch Insertionen von je 5bp (Fig 7B-6 und -7) verändert Diese Änderungen entsprechen je einer halben He xwindung Als Konsequenz ergibt sich daraus, daß sich in diesen DNA-Mutanten die IR2- Bindungsstelle relativ zu der IR1-Bιndungsstelle um 180° verdreht befindet Zusätzlich wurde die 50 bp lange interpa ndromische Sequenz um 20 bp reduziert (Fig 7B-5) Das Muster des Gelretentionsexpeπments, welches diese Änderungen tragt (Fig 7B-5, -6, -7), war identisch mit dem Kontrollmuster, das mit dem unveränderten 242 bp langen 6-HDNO-Promotorfragment (Fig 7B-1) zu sehen war
Die rechte Hälfte von IR1 enthalt die -10 Region des Promotors des 6-HDNO-Gens die sich von der Konsensussequenz des Promotors der S70 _RNA-Polymerasen durch die Insertion einer Cytosin enthaltenden, zusätzlichen Basenposition in der TATAAT-Sequenz unterscheidet (Fig 7B-1) Es stellte sich die Frage, ob diese ungewöhnliche S70 -10-Regιon an der Spezifitat der NιcR1-Bιndung an IR1 Anteil hat Im Gelretentionsexpenment (Fig 7B-2) mit NιcR1 zeigte die Deletion des Cytosinrestes an der entsprechenden Position (Fig 7B-2) keine Änderung des Proteinbindungsmusters, verglichen mit dem Muster, das mit dem unveränderten DNA-Fragment erhalten wurde, wohl aber bei der Bindung der S 70 -ähnlichen RNA-Polymerase von £ coli
Die Aussage, daß die beiden Mutationen Fig 7B-3 und -4 die NιcR1-Bιndefahιgkeιt an das Palindrom IR1 stark verringern, wenn nicht sogar ganz verhindern, wird durch weitere, hier nicht beschriebene Versuche untermauert
Beispiel 2
Beispiel für die Synthese des :
PLASMIDS π-B-N7 885 bp : Huang, Little, Seed (1985) in Vectors : A survey of molecular cloning and their applications" Rodriguez, R., ed., Butterworth Publishers , Stoneham, MA,USA STARTERMOLEKÜL :
AAUGCGGCCGCTCACGAG CGCGCGGTTAATTAACTCGAGAABTCCGCGGTGCAATTAATT- X
Kes tr iktionsen zyme : E agl , Bs t2 BI , Acc3S I , No tl , P acl , Xhol , ΞcoKI , S ac l
B =Biotin X =AminoBloc k
π -AJJ7 - SEQUENCE : Sou rce : GeneBank POSITION 3 : Urac il
01 AAUTTτCGGACTTTTGAAAGτGATGGTGGTσGGGGAAGGATTCGAACCTτCGAAσTCGATσAC3 '
02 AAUGσCAσATTTAGAGTCTGCTCCCTTTGGCCσCTCGGGΛACCCCACCACGGσTΛAτGCTTTT3 '
03 AAUACTGGCCTGCTCCCTTATCGGGAAGCGGGGCGCATCATATCAAATGACGCGCCGCTGTAA3'
04 AAUAGTGTTACGTTGA3AAAGAATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAGATCTCTAGAAGCTΕ-3 '
05 AAUCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCT-- 3 '
06 AAUCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAA- 3 '
07 AAUGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGΛTACCTGTCCGCCTTTC- 3 '
OS AAUTCCCTTCGGGAÄGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGT- 3 '
09 AAUAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCG-3 '
Ol 0 AAUCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGG- 3 '
011 AAUCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCT-3 '
012 AAUTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGC-3 ' 013 AAUTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCG-3 '
Ol 4 AAUCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTC- 3 '
Ol 5 AAUAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAAATTC- 3 ' LETZTER SYNTHESE7. YKL US :
B =B iotin-AAUCTCGAGAATTCCGCGGTGC^ATTAATTAAAAAAAAAAAAA
Underscore : SupF BlueSequence : Polylxnker
BlackSequence : ColEI
Kurzprotokoll
Ein μg biotinyliertes Startermolekül wurde an streptavidingecoatete DynalBeads gebunden. Dann wurde 0-2 rnM Biotin-desoxyUracil eingestellt (je 0.5 h Inkubation bei RT ) , um alle Biotin Bindungsstellen zu blockieren.
In 16 Synthesezyklen (Ligation, T4-RNA-Ligase; Uracil-DNA- Glycosyllase , Exonukleaselll ; Phosphatase) wurden die 17 DNA- Moleküle zu einer einzelstrangigen, die ganze Plasmidsequenz umfassende DNA verknüpft.
Vom 3 ' -Ende des Startermolekül her wurde mittels der T4-DNA- Polymerase die ssDNA zur dsDNA aufgefüllt. Mit Not wurde die dsDNA von Ihrer Bindung an die DynalBeads befreit. Die gleiche Menge frischer DynalBeads wurden zugegeben. Nur die Moleküle mit Biotin wurden an die Säule gebunden. Moleküle ohne Biotin aus der letzten Ligationsreaktion wurden weggewaschen .
Mit der Restriktionsendonuklease Pacl wurde nachgespalten. Die Dynabeads wurden mit einem Magneten pelletiert.
Aus dem Überstand wurden die Moleküle mit Ethanol gefällt und das Molekül mit der T4-DNA-Ligase zirkularisiert . "~" Die zirkularisierten synthetischen Plasmidmoleküle wurden dann in E . coli DHlO / P3 transformiert nach Standardprctokoll und gegen Tet/ Amp aud LB-Platten selektioniert .
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Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
Verfahren zur Synthese von Nucleinsauremolekulen, das die folgenden Schritte umfaßt
(1) Bereitstellung eines Nucleinsauremolekuls, das mindestens ein Ende aufweist, das eine Anlagerung und/oder Verknüpfung von bzw mit einem weiteren Nucleinsäuremolekül erlaubt,
(2) Anlagerung und/oder Verknüpfung mindestens eines weiteren Nucleinsauremolekuls an das bzw mit dem Nucleinsäuremolekül, wobei das eine Ende des mindestens einen weiteren Nucleinsauremolekuls an das bzw mit dem mindestens eιne(n) Ende des Nucleinsauremolekuls angelagert und/oder verknüpft wird und das andere Ende des mindestens einen weiteren Nucleinsauremolekuls im Falle einer Verknüpfung maskiert ist,
(3) Maskierung des mindestens einen Endes des Nucleinsauremolekuls, an das bzw mit dem kein weiteres Nucleinsäuremolekül angelagert und/oder verknüpft wurde,
(4) Spaltung des mindestens einen weiteren angelagerten und/oder verknüpften Nucleinsauremolekuls an einer vorbestimmten Stelle, wobei die Maskierung entfernt wird, und ein Ende erzeugt wird, das eine Anlagerung und/oder Verknüpfung von bzw mit einem weiteren
Nucleinsäuremolekül erlaubt, und
(5) mindestens ein-, gegebenenfalls mehrmalige Wiederholung der Schritte (2) bis (4), wobei in Schritt (2) jeweils geeignete Nucleinsauremolekule eingesetzt werden
Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das weitere Nucleinsäuremolekül ein Einzelstrangmolekul ist
Verfahren nach Anspruch 2, das nach Schritt (2) folgenden Schritt umfaßt
(2a) Auffüllung des zweiten, zum Einzelstrang in seiner Sequenz komplementären Nucleinsaurestrangs durch eine Polymeraseaktivitat, wobei gegebenenfalls zuvor die Maskierung entfernt wird
Verfahren nach Anspruch 2, das nach Schritt (4) oder (5) folgenden Schritt umfaßt
(4/5a) Auffüllung des zweiten, zum Einzelstrang in seiner Sequenz komplementären Nucleinsaurestrangs durch eine Polymeraseaktivitat
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei nicht in das bereitgestellte Nucleinsäuremolekül inkorporierte weitere Nucleinsauremolekule, Fragmente davon und/oder Nucleotide nach Schritt (2), (2a), (3), (4), (4a), (5) und/oder (5a) abgetrennt werden
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die vorbestimmte Stelle des Nucleinsauremolekuls durch Inkorporation eines artifiziellen oder modifizierten Nucleotids, eines
Basenanalogons, einer artifiziellen Haamadelstruktur erzeugt wird, das/die/der mittels eines physikalischen, chemischen oder enzymatischen Verfahrens gespalten werden kann
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das artifizielle oder modifizierte Nucleotid 5-Hydroxy-2- desoxycytidin, 5-Hydroxy-2-desoxyuπdιn, oder 5-Hydroxy-2 -desoxyuπdin ist Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Verknüpfung von zwei endstandigen Nucleotiden über ein 3'-Hydroxy- und ein 5'-Phosphat-Ende mit Hilfe einer Ligaseaktivitat, und die Anlagerung über die Hybridisierung komplementärer Sequenzen erfolgen
9 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Nucleinsauren DNA oder RNA ist
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Maskierung in Schritt (3) additiv oder substraktiv durch Hinzufugung bzw Entfernung einer chemischen Gruppe oder eines chemischen Moleküls erfolgt
11 Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Maskierung durch eine Phosphatase-, eine terminale Transferase-, eine Polymerase- oder eine Exonuciease-Reaktion oder chemisch erfolgt
12 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , wobei die Maskierung eines 5' -Endes durch das Entfernen der Phosphat-Gruppe(n) oder den Einbau eines 5 -modifizierten Nucleotids erfolgt
13 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei sich ein maskiertes 3'-Ende durch das Vorhandensein eines Aminoblocks, eines Didesoxynucleotids, eines 3'-Phosphats oder eines künstlichen 5'-Endes auszeichnet
14 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das weitere Nucleinsauremolekuls nach Anlagerung und/oder Verknüpfung an dem vom bereitgestellten Nucleinsäuremolekül entfernten Ende eine Haarnadelschleife ausbildet, die als Primer für die Polymeraseaktivitat dient
15 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Spaltung an einer vorbestimmten Stelle in Schritt (4) durch eine sequenzspezifisch spaltende tripelhelikale DNA oder durch eine Typ II S Restπktionsendonuklease erfolgt
16 Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Typ II S Restπktionsendonuklease das Rle AI-Enzym aus Rhizobtum leguminosarum ist
17 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das bereitgestellte Nucleinsäuremolekül und/ oder die weiteren Nucleinsauremolekule synthetischen oder semisynthetischen Ursprungs sind
18 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Synthese zumindest teilweise automatisiert
19 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei die Synthese matrixgebunden durchgeführt
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Matrix aus Nylon, Glas wie CPG-Glas und Glaswolle, Silikat, Latex, Polystyrol, Epoxid oder Silizium ist.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei das synthetisierte Nucleinsäuremolekül nach der Synthese isoliert wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 , wobei das synthetisierte Nucleinsäuremolekül nach der Synthese bei terminalem Einbau von Primersequenzen mittels einer geeigneten Methode amplifiziert wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei einzelne synthetisierte Nucleinsauremolekule nach der Synthese zu noch größeren DNA-Moleküleinheiten verbunden werden, gegebenenfalls über Restriktionsenzym Typ IIS - Termini vermittelt.
24. Kit, umfassend:
(a) eine Ligase, und/oder
(b) eine Polymerase,
(c) ggf. ein Typ II S-Restriktionsenzym,
(d) ggf. eine Uracil-DNA-Glycosylase und eine Apyrimidase und/oder eine Endonuclease III und eine Formamidopyrimidin DNA Gycosylase und/oder ein „mismatch repair" Enzym,
(e) gegebenenfalls eine Phosphatase, eine terminale Transferase und/oder eine Exonuklease,
(f) gegebenenfalls einen Waschpuffer zur Eluation von Reaktionsnebenprodukten und nicht in das Produkt der erfindungsgemäßen Synthese eingebautem Material,
(g) gegebenenfalls eine Synthesematrix mit einem gegebenenfalls bereits daran gebundenen Nucleinsäuremolekül als Startermolekül,
(h) gegebenenfalls geeignete Reaktionspuffer für die in (a) bis (e) aufgeführten Enzyme.
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