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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Nucleasen, insbesondere strangspezifische
Polynucleotidnickasen, und auf Verfahren zur Herstellung solcher
Nickasen. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf gewisse Verwendungen
von und auf Kits, die solche Nickasen umfassen.
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Nickasen
sind Endonucleasen, die nur einen einzelnen Strang einer DNS-Duplex
spalten. Gewisse Nickasen führen
einzelsträngige
Schnitte nur an bestimmten Stellen auf dem DNS-Molekül ein, indem
sie daran binden und eine bestimmte Nucleotiderkennungssequenz erkennen.
Eine Anzahl natürlich
vorkommender Nickasen wurde entdeckt, wovon derzeit die Sequenzerkennungseigenschaften
für vier
davon bestimmt worden sind. Zwei von ihnen erkennen degenerierte
Trinuclotide: R/AG – N.CviQXI
(18) und C/CD – N.CviPII
(19). Die dritten und die vierten isoschizomären Enzyme – N.BstSEI und N.BstNBI, isoliert
aus Bacillus stearothermophilus, erkennen das Pentanucleotid GAGTC(N)4/
und schneiden den Einzelstrang außerhalb der Sequenz (20). Ein
Enzym, das in der Lage wäre,
einzelsträngige
Schnitte in doppelsträngige
DNS einzuführen,
könnte eine
breite Anwendung in einer Anzahl von Verfahren in der Molekularbiologie
finden. Die praktische Anwendung sämtlicher natürlich vorkommender
Nickasen ist jedoch sehr begrenzt oder annähernd unmöglich bei der Mehrheit der
Verfahren, da ihre kurzen Erkennungssequenzen in zu häufiger Spaltung
resultieren.
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Während Untersuchungen
von Replikationsstartmechanismen wurden ebenfalls spezifische Nickasen entdeckt.
Eines der am besten untersuchten Beispiele ist das Gen-II-Protein
(gpII-Protein) des
Bakteriophagen fd, das einen DNS-Strang an dem Phagenreplikationsstartpunkt
schneidet und den Replikationsvorgang startet (21, 22).
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Anders
als in anderen bekannten Fällen,
wird kein intermediärer
kovalenter Proteinkomplex mit dem 5'-Ende des geschnittenen Stranges während der
DNS-Hydrolyse gebildet und so gibt es eine Möglichkeit, dieses Protein in
gewissen Anwendungen zu verwenden. Die Anwendung von gpII-Protein
bei der Zubereitung einzelsträngiger
DNS ist in der internationalen Patentanmeldung WO 95/09915 A1 beschrieben.
Das zu mutierende DNS-Fragment wird in einen speziellen Vektor,
der die Sequenz des Replikationsstartpunktes des fd-Phagen enthält, kloniert.
Die gewonnene supergeknäulte
zirkuläre
Plasmid-DNS wird mit dem Protein gp2 behandelt, das einen Schnitt
in einen DNS-Strang einführt.
Der geschnittene DNS-Strang wird weiter mit ExoIII von E. coli abgebaut
und auf diesem Weg kann die gewonnene einzelsträngige zirkuläre DNS entweder
für das
Annealing mit dem mutagenen synthetischen Primer (23) für die ortspezifische
Mutagenese oder für
differenzielles Display (24) verwendet werden. Die US-Patente Nrn.
5,968,786 und 5,928,908 beschreiben die Anwendungen von gpII-Protein
für die
Produktion markierter einzelsträngiger
DNS-Sonden und für
das Einführen unidirektional
verschachtelter Deletionen.
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Die
hauptsächliche
Unvollkommenheit dieses Proteins liegt darin, dass das Schneiden
von DNS nicht sehr effizient ist, so dass es unmöglich ist, das Schneiden des
gesamten Substrates zu erreichen. Eine typische Ausbeute liegt bei
nur 50–60
Prozent. Dies ist ziemlich ungünstig,
da es einen hohen Hintergrund verursacht und, um den Hintergrund
zu erniedrigen, ist die zusätzliche
Reinigung geschnittener DNS aus der nicht geschnittenen Form notwendig.
Das andere Ungünstige
ist, dass dieses Protein einen Schnitt in nur einen DNS-Strang einführen kann.
Falls der andere DNS-Strang geschnitten werden soll, muss das DNS-Fragment in
einen anderen Vektor, der den fd-Replikationsstartpunkt in der entgegengesetzten
Orientierung enthält,
subkloniert werden. In diesem Fall sind zusätzliche Manipulationen, die
ein paar Tage benötigen,
notwendig.
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Eine
sequenzspezifische Nickase wurde durch Modifizieren der Typ-II-Restriktionsendonuclease EcoRV
(17, Stahl et al., Biochemistry 1998, 37, 5682–5688) produziert. Diese mutierte
Nickase hatte jedoch keine Spezifizität hinsichtlich des DNS-Strangs und deswegen
ist die praktische Anwendung solcher einer Mutante sehr begrenzt.
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Ähnlich schufen
Giraud-Panis und Lilley Mutanten der Endonuclease VII des Bakteriophagen
T4, die in der Lage waren, an einen Vier-Wege-DNS-Knotenpunkt zu
binden und ihn in ein geschnittenes zirkuläres Produkt umzuwandeln (EMBO
Journal, Band 16, Nr. 9, S. 2528–2534). Ebenso schufen Janscak
et al. Mutanten der Typ-IB-Restriktionsendonuclease
EcoAI, die in der Lage waren, doppelsträngige DNS zu schneiden (Nucleic
Acids Research, 1999, Band 27, Nr. 13, S. 2638–2643).
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EcoRI
ist eine typische Restriktionsendonuclease vom Typ II, die beide
Stränge
doppelsträngiger
DNS innerhalb einer bestimmten Erkennungssequenz spaltet. S. E.
Halford und N. P. Johnson zeigten, dass die Zugabe von Ethidiumbromid
(EtBr) während
der Spaltung von supergeknäultem
Plasmid mit EcoRI die Bildungsrate der geschnittenen zirkulären Plasmidform
(das erste Stadium der Reaktion) nicht beeinflusst, jedoch signifikant
die Bildung der linearen DNS-Form (das zweite Stadium) inhibiert
(7). So wandelt die Zugabe von EtBr in den Reaktionspuffer EcoRI
in eine spezifische Nickase um. Dasselbe Phänomen wurde für etliche
andere Restriktionsendonucleasen gezeigt: HindIII, BglI, PstI, HincII
und PvuII (8). Es wurde jedoch gezeigt, dass, obwohl DNS-Moleküle mit einzelsträngigen Brüchen das
Hauptreaktionsprodukt waren, zur selben Zeit ein signifikanter Anteil
des Substrates entweder vollständig
ungespalten war oder dass beide DNS-Stränge hydrolysiert waren (8).
Das andere Problem, das die Anwendung dieses Effektes für praktische
Zwecke signifikant begrenzt, ist, dass, obwohl Typ-II-Restriktionsendonucleasen
eine strikte Spezifizität
für Nucleotidsequenzen
aufrecht erhalten, sie keine Spezifizität für einen bestimmten DNS-Strang
haben, das heißt
+- und –-Stränge werden
mit derselben Effizienz geschnitten.
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Wegen
der Nachteile der oben genannten Verfahren konzentrierten sich Versuche,
strangspezifische Schnitte in doppelsträngige DNS einzuführen, darauf,
einen einzelnen Strang vor der Spaltung durch eine Restriktionsendonuclease
durch Modifikation des DNS-Moleküls selber
zu schützen.
Untersuchungen der Spaltung semimethylierter DNS durch Restriktionsendonucleasen
zeigten, dass gewisse Enzyme, z. B. MspI und HaeIII, nur den nicht-methylierten
DNS-Strang in semimethylierten Sequenzen spalten (9). In diesem
Fall wird das strangspezifische Schneiden von DNS erreicht. Die
Hauptbegrenzung dieses Verfahrens liegt darin, dass die Mehrheit
der Restriktionsendonucleasen keine semimethylierten Substrate überhaupt
spalten oder dass sie beide DNS-Stränge spalten, deshalb ist dieses
Vorgehen nicht weit angewendet (9). Weiterhin muss der vor der Spaltung
zu schützende
Strang selektiv vor der Schneidereaktion methyliert werden.
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Ein
weiterer Weg, strangspezifische Schnitte in DNS zu erhalten, wurde
während
der Untersuchung des Spaltens von mit Phosphorthioat substituierter
DNS durch Restriktionsendonucleasen gefunden (10, 11, 12). Wenn
die Phosphatgruppe der Phosphordiesterbindung durch Thiophosphat
in einem DNS-Strang ersetzt wurde, hydrolysierten gewisse Restriktionsendonucleasen
nur den unmodifizierten Strang. Gewisse Restriktionsenzyme sind
unempfindlich für
eine solche DNS-Modifikation und hydrolysieren ziemlich effektiv
beide DNS-Stränge,
außer
und bis EtBr zu der Reaktionsmischung hinzugefügt wird (13). Nach der Zugabe
von EtBr in die Reaktionsmischung wird eine spezifische und selektive
Spaltung des nicht modifizierten DNS-Stranges erreicht.
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Diese
Verfahren des DNS-Schneidens durch Restriktionsenzyme, die die Modifikation
eines DNS-Stranges involvieren, wurden auf ortspezifische Mutagenese
(14, 15) und später
isothermische DNS-Amplifikation (16) angewendet. Die beschriebenen
Verfahren sind jedoch nicht auf native DNS anwendbar und erfordern
entweder enzymatische Manipulationen in vitro oder, in dem Falle
der isothermischen DNS-Amplifikation, die Verwendung chemisch modifizierter
synthetischer Primer vor der Schneidereaktion.
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Die
vorliegende Erfindung zielt darauf ab, die mit den Enzymen und Verfahren
des Standes der Technik einhergehenden Nachteile zu überwinden.
Insbesondere zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, eine Nickase
bereitzustellen, die in der Lage ist, einen vorausgewählten DNS-Strang
zu spalten.
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Demgemäß stellt
die vorliegende Erfindung eine strangspezifische Polynucleotidnickase
bereit, umfassend eine Endonuclease, die eine erste Untereinheit
und eine zweite Untereinheit umfasst, und die eine asymmetrische
Nucleotiderkennungssequenz erkennt, worin die erste Untereinheit
eine katalytische Domäne umfasst,
die in der Lage ist, einen Strang einer DNS-Duplex zu spalten, und
die zweite Untereinheit eine inaktivierte katalytische Endonucleasedomäne umfasst
und unfähig
ist, den anderen Strang der DNS-Duplex
zu spalten.
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Die
Nickasen der vorliegenden Erfindung sind gegenüber dem Stand der Technik vorteilhaft,
da sie in der Lage sind, einen vorausgewählten DNS-Strang an einer sequenzspezifischen
Stelle zu schneiden. Weiterhin stellt ein Nickasepaar, welches dieselbe
asymmetrische Erkennungssequenz erkennt, jedoch unterschiedliche
DNS-Stränge
schneidet, ein einfaches System bereit, das es ermöglicht,
dass jeder Strang für
das Schneiden an einer bestimmten Stelle ausgewählt wird. Zusätzliche
DNS-Manipulationen sind unnötig,
so dass es keinen Bedarf für
eine Synthese des komplementären
DNS-Stranges unter
Verwendung von dNTP-Analoga gibt (wie es der Fall ist bei Verfahren,
die semimethylierte oder mit Phosphorthioat substituierte DNS nutzen),
oder dafür,
DNS in einen anderen Vektor zu subklonieren, wie es der Fall ist,
wenn gpII-Protein verwendet wird.
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Mit "strangspezifisch" in Beziehung auf
die Nickasen der vorliegenden Erfindung ist gemeint, dass, wenn
die Erkennungssequenz vorhanden ist, die Nickasen in der Lage sind,
einen bestimmten Strang einer DNS-Duplex zu spalten, wobei der Strang
durch die Orientierung der Erkennungssequenz bestimmt werden kann.
Die Nickasen erkennen eine asymmetrische Erkennungssequenz, was
bedeutet, dass in der Erkennungssequenz ein Strang der DNS-Duplex
nicht dieselbe Sequenz wie der komplementäre Strang besitzt, wenn jeder
Strang in 5'-3'-Richtung gelesen
wird. Der bestimmte Strang, der durch die Nickase gespalten werden
wird, kann deswegen bestimmt werden, falls die Sequenz bekannt ist.
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Die
Länge der
Erkennungssequenz ist nicht besonders begrenzt, vorausgesetzt, dass
sie lang genug ist, so dass die Zahl des Vorkommens der Erkennungssequenz
in einem bestimmten DNS-Molekül,
das mit der Nickase behandelt werden soll, nicht zu hoch ist. In
einer Anzahl von Anwendungen der vorliegenden Nickasen kann es wünschenswert
sein, nur einen einzelnen Schnitt in das DNS-Molekül an einer
bekannten Stelle einzuführen.
Falls die Erkennungssequenz zu kurz ist, wird die Wahrscheinlichkeit
des Einführens
zusätzlicher
unerwünschter
Schnitte in die DNS erhöht
werden. Die Länge
der Erkennungssequenz kann jedoch niedriger sein, falls die Nickase
mit kürzeren
DNS-Molekülen verwendet
werden soll. Vorzugsweise umfasst die Erkennungssequenz 4 oder mehr
Nucleotide, bevorzugter 5 oder mehr Nucleotide und am bevorzugtesten 6
oder mehr Nucleotide.
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Die
Nickasen gemäß der vorliegenden
Erfindung umfassen eine Endonuclease, die eine erste Untereinheit
und eine zweite Untereinheit umfasst, wobei die erste Untereinheit
eine katalytische Domäne
umfasst, die in der Lage ist, einen Strang der DNS-Duplex zu spalten.
Die Art der ersten Untereinheit ist nicht besonders begrenzt, vorausgesetzt,
dass sie eine katalytische Domäne
mit der obigen Aktivität
enthält
und dass eine Nickase, umfassend diese Untereinheit, eine asymmetrische
Sequenz erkennt. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel umfasst die
erste Untereinheit eine Untereinheit aus einer Typ-II-Restriktionsendonuclease.
Vorzugsweise umfasst die erste Untereinheit eine Untereinheit aus
einer heteromeren Restriktionsendonuclease. Bevorzugter umfasst
die erste Untereinheit eine Untereinheit aus der Restriktionsendonuclease
R.Bpu10I, einem Enzym, das aus Bacillus pumilus 10 zubereitet worden
ist (siehe Referenz 25).
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Die
katalytische Domäne
der ersten Untereinheit kann einen Strang der DNS-Duplex an jeder
bestimmten Stelle spalten, stromaufwärts oder stromabwärts der
Erkennungssequenz oder innerhalb der Erkennungssequenz. Vorzugsweise
ist die katalytische Domäne
in der Lage, einen Strang der DNS-Duplex innerhalb der Erkennungssequenz
zu spalten. Dies liegt daran, dass, wenn die Spaltungsstelle innerhalb
der Erkennungssequenz liegt, die Sequenz unmittelbar an jeder Stelle
der Spaltstelle bestimmt werden kann, sogar, wenn die verbleibende
Sequenz des DNS-Moleküls
unbekannt ist. Dies kann bei nachfolgenden Anwendungen des geschnittenen
DNS-Moleküls
nützlich
sein.
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Die
Art der zweiten Untereinheit ist nicht besonders begrenzt, vorausgesetzt,
dass sie unfähig
ist, den anderen Strang der DNS-Duplex zu spalten und dass eine
Nickase, umfassend diese Untereinheit, die oben genannten Eigenschaften
der DNS-Erkennung und -Spaltung zeigt. Die zweite Untereinheit umfasst
eine inaktivierte katalytische Endonucleasedomäne. Die katalytische Domäne kann
durch jedes bekannte Verfahren inaktiviert sein, vorzugsweise durch
ortspezifische oder unspezifische Mutagenese der Untereinheit. Vorzugsweise
umfasst die zweite Untereinheit eine modifizierte Untereinheit aus
einer Typ-II-Restriktionsendonuclease. Bevorzugter umfasst die zweite
Untereinheit eine Untereinheit aus einer heteromeren Restriktionsendonuclease,
die modifiziert worden ist, um die katalytische Domäne davon
inaktiv zu machen. Am bevorzugtesten umfasst die zweite Untereinheit
eine inaktivierte Untereinheit von R.Bpu10I.
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Ohne
durch eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass
die zweite Untereinheit wirken kann, um die erste Untereinheit zu
stabilisieren und/oder die katalytische Aktivität der ersten Untereinheit zu
fördern.
Die zweite Untereinheit kann ebenfalls notwendig sein für die Sequenzerkennung
durch die Nickase. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die katalytische
Domäne
der ersten Untereinheit unfähig,
einen Strang der DNS-Duplex in der Abwesenheit der zweiten Untereinheit
zu spalten. Dies liegt daran, dass die Anwesenheit der zweiten Untereinheit
sicherstellen kann, dass die erste Untereinheit die korrekten Sequenzerkennungs-
und -spaltungseigenschaften zeigt.
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Die
erste Untereinheit und die zweite Untereinheit können Untereinheiten unterschiedlicher
Restriktionsendonucleasen umfassen, vorausgesetzt, dass, wenn sie
in einer Endonuclease kombiniert werden, die Endonuclease die geeigneten
Sequenzerkennungseigenschaften zeigt und einen einzelnen Strang
der DNS-Duplex spaltet. Vorzugsweise umfassen die erste Untereinheit
und die zweite Untereinheit eine nicht modifizierte und eine modifizierte
Untereinheit derselben Restriktionsendonuclease, bevorzugter aus
derselben heteromeren Restriktionsendonuclease. Es ist bevorzugt,
Untereinheiten aus derselben Restriktionsendonuclease in den Nickasen
der vorliegenden Erfindung zu kombinieren, da es wahrscheinlich
ist, vorausgesetzt, dass die zweite Untereinheit auf solch einem
Wege modifiziert wird, dass nur ihre katalytische Domäne inaktiviert
wird, dass die zweite Untereinheit die Sequenzerkennungs- und -spaltungseigenschaften
der ersten Untereinheit unterstützen
wird.
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Untereinheiten
heteromerer Restriktionsendonucleasen sind besonders geeignet für die Verwendung als
Untereinheiten für
die Nickasen der vorliegenden Erfindung. Da eine heteromere Restriktionsendonuclease wenigstens
zwei verschiedene Untereinheiten umfasst, kann jede dieser Untereinheiten
für die
Spaltung eines bestimmten DNS-Strangs verantwortlich sein. Zum Beispiel
kann eine heteromere Restriktionsendonuclease eine Untereinheit
umfassen, die einen DNS-Strang spaltet, der als der (+)-Strang bezeichnet
werden kann, und eine Untereinheit, die einen DNS-Strang spaltet,
der als der (–)-Strang
bezeichnet werden kann. Unter der Voraussetzung, dass die Endonuclease
eine asymmetrische Nucleotiderkennungssequenz erkennt, kann das Kombinieren
der Untereinheit, die den eine inaktivierte katalytische Domäne umfassenden
(–)-Strang
spaltet, mit einer unmodifizierten Untereinheit von derselben Endonuclease,
die den (+)-Strang spaltet, eine Nickase bereitstellen, die in der
Lage ist, nur den (+)-Strang zu spalten. Eine Nickase, die in der
Lage ist, den (–)-Strang zu
spalten, kann durch Modifizieren der Untereinheit, die den (+)-Strang
spaltet, und durch Kombinieren dieser modifizierten Untereinheit
mit einer unmodifizierten Untereinheit, die in der Lage ist, den
(–)-Strang
zu spalten, bereitgestellt werden.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Erzeugung einer strangspezifischen Polynucleotidnickase bereit,
wobei das Verfahren das Inaktivieren der katalytischen Aktivität einer Untereinheit
einer Restriktionsendonuclease umfasst, worin die Endonuclease eine
erste Untereinheit umfasst, die eine katalytische Domäne umfasst,
die in der Lage ist, einen Strang einer DNS-Duplex zu spalten, und
eine zweite Untereinheit umfasst, die eine katalytische Domäne umfasst,
die in der Lage ist, den anderen Strang der DNS-Duplex zu spalten,
und worin die Endonuclease eine asymmetrische Nucleotiderkennungssequenz
erkennt. Dieses Verfahren ist besonders geeignet, gewisse Nickasen
gemäß der vorliegenden
Erfindung zu produzieren. Die Erfindung stellt ebenfalls eine durch
solch ein Verfahren zu gewinnende strangspezifische Polynucleotidnickase
bereit.
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Mit "Inaktivieren der
katalytischen Aktivität
einer Untereinheit einer Restriktionsendonuclease" ist gemeint, dass
eine Untereinheit der Endonuclease so modifiziert wird, dass die
Endonuclease nicht länger
in der Lage ist, beide Stränge
der DNS-Duplex zu spalten, sondern in der Lage bleibt, einen einzelnen
Strang zu spalten. Das Verfahren, das verwendet wird, die katalytische
Aktivität
einer Untereinheit zu inaktivieren, ist nicht besonders beschränkt, vorausgesetzt,
dass die andere Untereinheit eine gewisse katalytische Aktivität bewahrt
und dass die Endonuclease immer noch in der Lage ist, die Erkennungssequenz
zu erkennen. Bevorzugt wird die katalytische Aktivität einer
Untereinheit aktiviert, ohne wesentlich die katalytische Aktivität der anderen Untereinheit
oder die Sequenzerkennungseigenschaften der Endonuclease zu beeinflussen.
Vorzugsweise werden die Proteinwechselwirkungen zwischen den Untereinheiten
im Wesentlichen bewahrt.
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In
einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
umfasst der Schritt des Inaktivierens der katalytischen Aktivität einer
Untereinheit die nicht-spezifische Mutagenese der Untereinheit.
Bei diesem Vorgehen werden Mutationen zufällig an verschiedenen Örtlichkeiten
durch die Untereinheit hinweg eingeführt. Mutanten, die Mutationen
an unterschiedlichen Positionen einbauen, werden dann hinsichtlich
der Sequenz- und DNS-Spaltungsaktivität untersucht.
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In
einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel
umfasst der Schritt des Inaktivierens der katalytischen Aktivität einer
Untereinheit der Restriktionsendonuclease das Identifizieren der
katalytischen Domäne der
Untereinheit und das nachfolgende Einführen von Mutationen in die
katalytische Domäne
durch ortspezifische Mutagenese. Bei diesem Ausführungsbeispiel kann die katalytische
Domäne
durch jedes geeignete Verfahren identifiziert werden, vorzugsweise
durch Vergleichen der Proteinsequenz der Untereinheit mit den Proteinsequenzmotiven
aus anderen Restriktionsendonucleasen. Mit "Proteinsequenzmotive" sind besonders die Sequenzen der bekannten
katalytischen Domänen
anderer Restriktionsendonucleasen gemeint, wie z. B. das (E/D)X9-15EXK-Motiv, das für gewisse Endonucleasen charakteristisch
ist.
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Die
Länge der
Erkennungssequenz der Endonuclease in dem obigen Prozess ist nicht
besonders begrenzt, vorausgesetzt, dass sie von einer geeigneten
Länge für die Nickase
ist, welche hergestellt werden soll. Vorzugsweise umfasst die Erkennungssequenz
4 oder mehr Nucleotide, bevorzugter 5 oder mehr Nucleotide und am
bevorzugtesten 6 oder mehr Nucleotide.
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Die
Endonuclease des oben genannten Verfahrens kann beide Stränge der
DNS-Duplex an jeglichen bestimmten Stellen, stromaufwärts oder
stromabwärts
zur Erkennungssequenz oder innerhalb der Erkennungssequenz, spalten.
Vorzugsweise ist die Endonuclease in der Lage, wenigstens einen
Strang der DNS-Duplex innerhalb der Erkennungssequenz zu spalten.
Bevorzugter ist die Endonuclease in der Lage, beide Stränge der
DNS-Duplex innerhalb der Erkennungssequenz zu spalten.
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Die
anderen Eigenschaften der Endonuclease des vorliegenden Verfahrens
sind nicht besonders begrenzt, vorausgesetzt, dass die Endonuclease
die DNS-Spaltungs- und -Sequenzerkennungseigenschaften, die oben
genannt sind, zeigt. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel umfasst die
Endonuclease eine Typ-II-Restriktionsendonuclease. Die Endonuclease
kann zwei oder mehr identische Untereinheiten umfassen oder kann
zwei oder mehr nicht identische Untereinheiten umfassen. Bevorzugt
umfasst die Endonuclease eine heteromere Restriktionsendonuclease.
Bevorzugter umfasst die Endonuclease R.Bpu10I.
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Weiterhin
stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von wie oben definierten
Nickasen bereit, um eine oder mehrere ortspezifische Schnitte in
vorausgewählte
Stränge
einer DNS-Duplex einzuführen.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
werden die Nickasen bei der Herstellung zirkulärer einzelsträngiger DNS
aus zirkulärer
doppelsträngiger
DNS verwendet. Die zirkuläre
doppelsträngige
DNS kann typischerweise ein supergeknäultes Plasmid sein. Die zirkuläre doppelsträngige DNS
sollte wenigstens eine Erkennungsstelle für die Nickase haben. Falls
es mehr als eine Nickaseerkennungsstelle auf der zirkulären doppelsträngigen DNS
gibt, sollten die Stellen sich zueinander in derselben Orientierung
befinden, so dass Schnitte nur in einen Strang eingefügt werden.
Die DNS wird durch Inkubation in der Anwesenheit der Nickase geschnitten,
um eine geschnittene Form der zirkulären doppelsträngigen DNS
zu erzeugen. Wo die DNS ein supergeknäultes Plasmid ist, wird die
geschnittene Form typischerweise eine unterschiedliche Migrationsgeschwindigkeit
in einem Agarosegel haben. Vorzugsweise wird die Vollständigkeit
des Verfahrens dann durch Gelelektrophorese überwacht. Geschnittene DNS
kann entweder aus der Reaktionsmischung oder aus einem Agarosegel
durch eine geeignete Technik aufgereinigt werden. Der geschnittene
Strang kann dann, typischerweise nach dem Wechseln des Reaktionspuffers,
mit jedem geeigneten Enzym abgebaut werden, das eine 3'-5'- oder 5'-3'-Exonucleaseaktivität besitzt,
dem jedoch die Endonucleaseaktivität fehlt, wie z. B. E.-coli-Exonuclease
III oder T7-DNS-Polymerase.
Nach diesem Vorgehen kann zirkuläre
einzelsträngige
DNS aufgereinigt werden und kann für weitere Anwendungen, wie
ortspezifische Mutagenese und DNS-Sequenzen verwendet werden. Der in dem
obigen Fall abgebaute Strang kann als der (+)-Strang bezeichnet werden, und folglich
wird der (–)-Strang
hergestellt. Falls es gewünscht
wird, eine einzelsträngige
zirkuläre
DNS zu produzieren, die den (+)-Strang umfasst, kann ein analoges
Vorgehen durchgeführt
werden unter Verwendung einer Nickase, die dieselbe Erkennungssequenz
wie die obige Nickase erkennt, die jedoch den anderen Strang der
DNS-Duplex spaltet.
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Ein
Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, dass es, um einzelsträngige Formen
von (+)- und (–)-Strängen zu
erhalten, keinen Bedarf dafür
gibt, DNS in zwei verschiedene Vektoren mit dem f1-Phagen-Replikationsstartpunkt
oder den gpII-Protein-Erkennungssequenzen in entgegengesetzten Orientierungen
zu subklonieren. Typischerweise kann ein Nickasepaar, das dieselbe
Erkennungssequenz erkennt, das jedoch in der Lage ist, unterschiedliche Stränge einer
DNS-Duplex zu spalten, durch Bilden verschiedener Kombinationen nativer
und mutierter Untereinheiten einer bestimmten heteromeren Restriktionsendonuclease
hergestellt werden. Das prinzipielle Schema dieses Vorgehens wird
in 7 durch Bezugnahme auf ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel,
das R.Bpu10I einschließt,
vorgestellt.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Kit
zur Erzeugung eines oder mehrerer ortspezifischer Schnitte in vorausgewählten Strängen einer
DNS-Duplex bereit, umfassend eine wie oben definierte erste Nickase
und eine wie oben definierte zweite Nickase, worin die erste Nickase
und die zweite Nickase dieselbe Erkennungssequenz erkennen, worin
die erste Nickase in der Lage ist, einen ersten Strang der DNS-Duplex
zu spalten, und worin die zweite Nickase in der Lage ist, einen
zweiten Strang der DNS-Duplex zu spalten.
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In
einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
dieses Aspektes umfassen die ersten und zweiten Untereinheiten der
ersten und zweiten Nickase Untereinheiten aus einer einzelnen heteromeren
Restriktionsendonuclease, wobei die erste Nickase eine erste Untereinheit
umfasst, die in der Lage ist, den ersten Strang der DNS-Duplex zu
spalten, und eine zweite Untereinheit umfasst, die eine katalytische
Domäne
umfasst, die inaktiviert ist, um unfähig zu sein, den zweiten Strang
der DNS-Duplex zu spalten, und worin die zweite Nickase eine erste
Untereinheit umfasst, die in der Lage ist, den zweiten Strang der
DNS-Duplex zu spalten, und eine zweite Untereinheit umfasst, die
eine katalytische Domäne
umfasst, die inaktiviert ist, um unfähig zu sein, den ersten Strang
der DNS-Duplex zu spalten. Die erste Nickase kann durch selektives
Inaktivieren der katalytischen Domäne einer Untereinheit einer
bestimmten heteromeren Restriktionsendonuclease hergestellt werden
und die zweite Nickase kann durch selektives Inaktivieren einer
davon verschiedenen Untereinheit der bestimmten heteromeren Restriktionsendonuclease
hergestellt werden. Der obige Kit umfasst bevorzugt weiter eine
Exonuclease, wie E.-coli-Exonuclease III, die in der Lage sein kann,
den geschnittenen Strang der DNS-Duplex abzubauen. In einem anderen
Ausführungsbeispiel
umfasst der Kit weiter ein zirkuläres doppelsträngiges DNS-Molekül, wie ein
Plasmid, wobei das Molekül
die Erkennungssequenz, die durch die ersten und zweiten Nickasen
erkannt wird, umfasst.
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Die
Nickasen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls bei der Herstellung
verschachtelter Deletionen in einem DNS-Molekül verwendet werden. Bei diesem
Ausführungsbeispiel
kann eine Nickase gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, um einen einzelsträngigen Schnitt in ein DNS-Molekül, wie ein Plasmid,
einzuführen.
Ein einzelner Strang des DNS-Moleküls wird dann teilweise mit
einer 3'-5'- oder 5'- oder 3'-Exonuclease, wie z. B. E.-coli-Exonuclease
III, abgebaut. Das Ausmaß dieses
Abbaus kann durch Variieren der Temperatur und NaCl-Konzentration
kontrolliert werden. Die einzelsträngigen Strecken können mit
jeder geeigneten Nuclease, wie z. B. S1-Nuclease, entfernt werden. Die stumpf
endenden Fragmente können
dann erneut ligiert werden, um ein zirkularisiertes Plasmid zu bilden,
das für
die Transformation in kompetente Bakterien geeignet ist. Indem das
Ausmaß des
Exonucleaseabbauschrittes variiert wird, wird eine Bibliothek mit unidirektionalen
Deletionen erzeugt, die für
DNS-Sequenzen verwendet
werden kann. Einer der Vorteile der vorliegenden Verwendung gegenüber dem
Stand der Technik ist, dass ein einzelnes Enzym (eine Nickase gemäß der vorliegenden
Erfindung) in der Lage ist, ein geeignetes Substrat für den Exonucleaseabbau
zu erzeugen. Die vorbekannten Verfahren beruhen auf der Verwendung
von zwei verschiedenen Restriktionsendonucleasen, um ein Ende mit
einem 3'-Überhang
(das gegenüber
dem Abbau durch eine 3'-5'-Endonuclease, wie Exonuclease
III, resistent ist) und ein Ende mit einem 5'-Überhang
(das für
den Abbau durch Exonuclease III empfänglich ist) zu erzeugen. Weiterhin
stellt die vorliegende Erfindung ein alternatives Verfahren der
Zubereitung des Substrates für
den Exonucleaseabbau bereit, das z. B. verwendet werden kann, wenn
alle anderen Restriktionsendonucleasen, die Erkennungsstellen in
der Polylinkerregion eines eine zu sequenzierende Insertregion enthaltenden
Plasmids besitzen, ebenfalls Erkennungsstellen in der Insertregion
besitzen.
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Die
Nickasen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls bei der Zubereitung
eines Vektors zur Verwendung in einem ligationsunabhängigen Klonierverfahren
verwendet werden. Dieses Verfahren ermöglicht es, den Ligationsschritt
bei der Konstruktion rekombinanter Moleküle wegzulassen, z. B. bei der
Zubereitung eines Plasmidvektors mit einem DNS-Insert (28). Bei
den im Stand der Technik beschriebenen Vorgehensweisen wird das
zu klonierende DNS-Fragment in das Vektormolekül über komplementäre homopolymere
Nucleotidsequenzen eingebaut, welche mit Hilfe der terminalen Desoxynucleotidyltransferase
(TdT) aus Kälberthymus
eingeführt
werden. Gewöhnlich
werden polymere Schwänze
mit einer Länge
von annähernd
20 bis 30 nt aus Oligo-dG an die 3'-Enden eines linearisierten Vektors
angehängt,
während
komplementäre
Oligo-dC-Schwänze an das
zu klonierende Fragment angehängt
werden. Das Mischen von auf diesem Wege zubereiteten Vektor- und
DNS-Fragmenten resultiert in der Bildung einer chimären DNS
wegen der Hybridisierung komplementärer Sequenzen an den DNS-Enden.
Solch eine DNS transformiert kompetente E.-coli-Zellen wirksam.
Wegen der reparativen Maschinerie der Zelle wird kovalent geschlossene,
doppelsträngige
Plasmid-DNS innerhalb der Zelle gebildet, die erfolgreich replizieren
kann.
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Das
Klonierverfahren des Standes der Technik vermeidet vorteilhafterweise
die Insertion etlicher verschiedener Fragmente oder etlicher Kopien
desselben Fragments in ein einzelnes Vektormolekül, was oftmals bei dem Ligation
einschließenden
Vorgehen geschieht. Ein zusätzlicher
Vorteil liegt darin, dass es keinen Bedarf gibt, die zu klonierende
Sequenz mit einem Restriktionsenzym zu verdauen, um spezifische
komplementäre
DNS-Enden, die für
das Ligationsvorgehen notwendig sind, zu gewinnen. Ferner können vor
der Zugabe homopolymerer Nucleotidsequenzen lange DNS-Moleküle in kleinere
Fragmente durch Beschallung oder mit unspezifischen Nucleasen, z.
B. DNase I aus Rinderpankreas, abgebaut werden. Dieser Weg des Mischens zu
klonierender DNS-Fragmente
ist statistisch vollständig
zufällig,
im Gegensatz zu der nach der Spaltung mit jedem spezifischen Restriktionsenzym
gewonnenen DNS-Fragmentmischung.
-
Dieses
Verfahren hat jedoch ebenfalls etliche Nachteile. Es wurde gezeigt,
dass die Effizienz des ligationsunabhängigen Vorgehens stark von
der Länge
homopolymerer Nucleotidschwänze
abhängt,
es wird nämlich
die höchste
Effizienz der Transformation erreicht, wenn 20 Nucleotide lange
Oligo-dG-Schwänze
an den Vektor angehängt
werden (29). Wenn diese Schwänze
wenigstens 5 Nucleotide kürzer
oder länger
sind, nimmt die Transformationseffizienz mit chimären DNS-Molekülen um ein
Vielfaches von etlichen Malen ab. Deswegen ist der Vektorzubereitungsschritt
für das
ligationsunabhängige
Vorgehen ziemlich kompliziert und bedarf der gründlichen Kalibrierung der Zugabe
der Homooligonucleotidschwänze
mit TdT.
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Eine
andere bekannte Modifikation des ligationsunabhängigen Klonierverfahrens wird
verwendet für das
Klonieren von PCR-Fragmenten, um ein mit zusätzlichen Nucleotiden an den
3'-Enden eines PCR-Fragmentes
in Beziehung stehendes Problem zu vermeiden. Enzyme, die 3'- oder 5'-exonucleolytische
Aktivität
besitzen, können
für die
Schaffung einzelsträngiger
DNS-Sequenzen an den Enden von Vektor- und PCR-Fragment verwendet
werden, wie z. B. E.-coli-Exodesoxyribonuclease III, T4- oder T7-DNS-Polymerasen,
Klenow-Polymerase, Lambda-Phage-Exodesoxyribonuclease VII etc. Ein
weiteres Enzym, das für
den oben beschriebenen Zweck verwendet werden kann, ist Uracil-DNS-Glycosylase aus E.
coli (UDG), das spezifisch Uridinbasen aus dem DNS-Strang eliminiert,
wodurch die Phosphordiesterbindungen in dem DNS-Rückgrat geschwächt werden
(30). Es ist möglich,
dU in die 5'-Endsequenzen
von PCR-Fragmenten während
der chemischen Synthese von PCR-Primern einzuführen. Die Verwendung nicht
modifizierter dNTPs für
das PCR-Verfahren resultiert in der Synthese von PCR-Fragmenten
mit uridinylierten Sequenzen an ihren 5'-Enden und, die empfindlich sind für UDG. UDG-
und Hitzebehandlung solcher PCR-Produkte ergibt die PCR-Fragmente mit
spezifischen einzelsträngigen
Sequenzen an den 5'-Enden.
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Das
am meisten problematische Vorgehen in diesem Fall ist die Zubereitung
des Vektors mit entsprechenden einzelsträngigen Sequenzen an den Enden.
Da Vektor-DNS gewöhnlich
in vivo amplifiziert wird, gibt es keine Möglichkeit, dU anstelle von
dT in gewissen Positionen einzuführen.
Dies kann auf zwei Wegen getan werden: entweder wird der Vektor
durch PCR amplifiziert, wobei die Primer uridinylierte Sequenzen
an ihren 5'-Enden haben, oder
es werden nach der Vektorlinearisierung spezielle Adapter, bei denen
dU dT in einem Strang ersetzen, mit dem Vektormolekül ligiert.
Danach wird der Vektor mit UDG auf demselben Wege wie das PCR-Fragment
behandelt. Deswegen ist die Vektorzubereitung sowohl ein teures
als auch ein zeitaufwändiges Vorgehen.
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Die
Fähigkeit
der Nickasen der vorliegenden Erfindung, spezifisch einen vorausgewählten DNS-Strang
zu schneiden, kann für
die effiziente Zubereitung von Vektoren für ein ligationsunabhängiges Klonierverfahren
angewandt werden, wie in 8 durch Bezugnahme auf ein bevorzugtes
Ausführungsbeispiel, das
R.Bpu10I involviert, erläutert.
Vorzugsweise enthält
der Kloniervektor eine einzigartige Restriktionsstelle, die durch
umgedrehte Erkennungssequenzen für
die Nickase flankiert werden. Es ist möglich, solche eine Sequenz
als eine Kassette zu schaffen, die in jeden gewünschten Vektor ligiert werden
kann, und der resultierende Vektor kann in vivo danach amplifiziert
werden. Gemäß diesem
Ausführungsbeispiel
wird der Vektor nach Isolation und Aufreinigung mit einem Restriktionsenzym
linearisiert, das innerhalb der Kassette schneidet, und mit der
passenden Nickase behandelt. Dadurch werden Schnitte in ausgewählte DNS-Stränge eingefügt und danach
wird ein DNS-Strang mit Hilfe einer Exonuclease abgebaut, um 3'- oder 5'-Übergänge bekannter
Sequenzen an den Enden des linearisierten Vektors zu erzeugen. Das
Insert wird vorzugsweise durch PCR-Amplifikation unter Verwendung
von uridinylierten Primern mit 5'-Enden,
die mit der Vektorsequenz in den Übergangsregionen komplementär sind,
und mit 3'-Enden,
die mit der zu amplifizierenden Sequenz komplementär sind,
zubereitet. Das Insert kann dann mit einem Enzym wie Uracil-DNS-Glycosylase
aus E. coli behandelt werden, um die 5'-Enden abzubauen und mit der Vektorsequenz
komplementäre
3'-Überhänge zu erzeugen. Das
zubereitete Insert und der Vektor können dann vermischt werden
und verwendet werden, um kompetente Zellen zu transformieren.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Kit
zur Verwendung in einem Klonierverfahren bereit, umfassend eine
wie oben definierte Nickase und einen Vektor, der eine Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuclease
umfasst, die an jeder Seite durch die Erkennungssequenz der Nickase
flankiert wird, worin die Erkennungssequenzen der Nickase im Verhältnis zueinander
umgedreht sind, so dass die Nickase in der Lage ist, unterschiedliche
Stränge
des Vektors an jeder Seite der Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuclease
zu spalten.
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Die
Nickasen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls bei der Zubereitung
eines kovalent geschlossenen linearen DNS-Moleküls verwendet werden. Solche
Moleküle
können
als minimalistische Transfektionsvektoren in pharmazeutischen Anwendungen
verwendet werden. Zum Beispiel sind die so genannten MIDGE (Minimalistic
Vectors für
Gene Expression in Clinical Applications, 31) kovalent geschlossene DNS-Transfektionsvektoren,
die in der Gentherapie oder genetischen Impfung verwendet werden.
Die Konstruktion und Aufreinigung minimalistischer DNS-Vektoren
werden beschrieben und gelehrt in den europäischen Patentanmeldungen
EP 941 318 A1 ,
EP 967 274 A2 .
Minimalistische Transfektionsvektoren für MIDGE kombinieren die Vorteile
viraler Vektoren (Zellspezifität
und hohe Expressionsspiegel) mit jenen von Plasmidvektoren (keine
Immunogenität
oder Gefahr von Virusrekombination und vergleichsweise niedrige
Kosten). Solche Vektoren enthalten nur die Expressionskassette (Promotor,
kodierende Sequenz und Terminator/Poly-A-Stelle). Sie sind um 50–80% kleiner
als Plasmide und haben eine lineare, kovalent geschlossene Topologie
(31).
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Gemäß den Verfahren
des Standes der Technik werden MIDGE-Vektoren in einem Drei-Schritt-Vorgehen
gemacht, bei welchem die gewünschte
Sequenz aus einem geeigneten Plasmid mit wenigstens einer Restriktionsendonuclease
ausgeschnitten wird, wodurch kurze, überhängende Enden einzelsträngiger DNS
erzeugt werden. Beide antiparallelen Stränge des DNS-Polymers, welche
die für
ihre Expression notwendigen kodierenden Sequenzen, Promotor- und
Terminatorsequenzen enthalten, werden dann mit einem Haarnadelschleifen
bildenden, zu sich selber komplementären Desoxyoligonucleotid ligiert,
um ein doppelsträngig
lineares Molekül,
das an beiden Enden geschlossen ist, zu erzeugen. Die gewonnene
Ligationsmischung wird danach mit der zweiten Restriktionsendonuclease
inkubiert, welche eine Sequenz erkennt und schneidet, die in dem
erzeugten, kovalent geschlossenen DNS-Molekül fehlt, die jedoch wenigstens
einmal in dem Rest des replizierbaren Konstruktes vorhanden ist.
Der Restriktionsverdauungsansatz wird anschließend oder gleichzeitig mit
einer Exonuclease (Exo) behandelt, welche praktisch für freie
3'- und 5'-Enden spezifisch
ist, und das Vektorrückgrat
wird abgebaut. Die verbleibende, kovalent geschlossene MIDGE-DNS
wird dann der HPLC-Reinigung unterzogen.
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Für die Schaffung
kovalent geschlossener linearer DNS-Moleküle gemäß den oben beschriebenen Techniken
besteht ein Bedarf, Haarnadelschleifen bildende, selbstkomplementäre Desoxyoligonucleotide
mit Enden, die zu dem gewünschten
DNS-Fragment komplementär sind,
zu synthetisieren. Die Nickasen der vorliegenden Erfindung können verwendet
werden, um kovalent geschlossene lineare DNS-Moleküle zu schaffen, ohne
den Bedarf für
eine zusätzliche
Oligonucleotidsynthese. Vorzugsweise wird die in die kovalent geschlossene
lineare DNS einzuschließende
DNS-Sequenz als Erstes in einen Plasmidvektor kloniert, der ein
Erkennungssequenzpaar für
eine Nickase an jeder Stelle der Insertsequenz enthält, wo die
Erkennungssequenzen jedes Paars im Verhältnis zueinander umgedreht
sind. In diesem Ausführungsbeispiel
umfasst die Sequenz zwischen jedem Erkennungssequenzpaar eine selbst-komplementäre Sequenz,
die in der Lage ist, eine Haarnadelschleife zu bilden, wie z. B.
ein unterbrochenes Palindrom. Nach der Behandlung mit einer Nickase
gemäß der vorliegenden
Erfindung wird die Insertregion mit überhängenden Enden aus dem Plasmidvektor
ausgeschnitten und die selbstkomplementären überhängenden Enden bilden geschlossene
Haarnadelschleifen an jedem Ende des DNS-Moleküls. Die resultierende Struktur
wird bevorzugt ligiert, um eine kovalent geschlossene lineare DNS
zu bilden. Der kovalent geschlossene Vektor, der ebenfalls hergestellt
wird, kann zuerst mit einer Restriktionsendonuclease gespalten werden,
die keine Erkennungssequenzen in der Insertfragment-DNS hat, und
kann dann mit einem Enzym, das Exonucleaseaktivität besitzt,
z. B. T7-DNS-Polymerase, abgebaut werden. Dieses Vorgehen wird in
Beispiel 9 mit Bezugnahme auf ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel,
das eine Nickase, die Untereinheiten von R.Bpu10I umfasst, erläutert.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Kit
zur Herstellung kovalent geschlossener linearer DNS bereit, umfassende
eine wie oben definierte Nickase, und einen Vektor, der eine Erkennungssequenz
für eine
Restriktionsendonuclease umfasst, die auf jeder Seite durch ein
Erkennungssequenzpaar der Nickase flankiert wird, worin die Erkennungssequenzen
jedes Paars im Verhältnis
zueinander umgedreht sind, so dass die Nickase in der Lage ist,
jeden Strang des Vektors auf jeder Seite der Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuclease
zu spalten, und worin ein Strang der Sequenz zwischen jedem Paar an
Erkennungssequenzen eine selbst-komplementäre Sequenz umfasst, die in
der Lage ist, eine Haarnadelschleife zu bilden.
-
Die
Erfindung wird nun im Wege des Beispiels nur mit Bezugnahme auf
die folgenden Experimente und spezifischen Ausführungsbeispiele und die begleitenden
Zeichnungen beschrieben werden, in welchen:
-
1 die
Aminosäuresequenz
der α- und β-Untereinheiten
der Restriktionsendonuclease Bpu10I zeigt.
-
2 Punktmutationen
in den α-
und β-Untereinheiten
der Restriktionsendonuclease Bpu10I und ihren Einfluss auf die funktionelle
Aktivität
von Untereinheiten zeigt.
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3 eine
schematische Darstellung eines Plasmids zeigt, das Bpu10I-α-Protein überexprimiert.
-
4 eine
schematische Darstellung eines Plasmids zeigt, das Bpu10I-β-Protein überexprimiert.
-
5 eine
schematische Darstellung eines Plasmids zeigt, das Bpu10I-α-E180Q-Protein überexprimiert.
-
6 eine
schematische Darstellung eines Plasmids zeigt, das Bpu10I-β-E177A-Protein überexprimiert.
-
7 die
Umwandlung doppelsträngiger
zirkulärer
Plasmid-DNS zu einer einzelsträngigen
Form unter Verwendung ortspezifischer Nickasen zeigt.
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8 ein
Schema der Vektorzubereitung für
ein ligaseunabhängiges
Klonierverfahren unter Verwendung ortspezifischer Nickasen zeigt.
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9 ein
Zubereitungsschema kovalent geschlossener DNS-Moleküle unter
Verwendung ortspezifischer DNS-Nickasen zeigt.
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10 die
Strangspezifität
von Bpu10I-Nickasen zeigt.
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11 die
Schneideaktivität
von N.Bpu10Iα (α + βE177A) zeigt.
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Experiment 1
-
Das
Bpu10I-Restriktions-Modifikations-System aus Bacillus pumilus, das
die asymmetrische Sequenz 5'-CCTNAGC-3' erkennt, umfasst
vier Gene: zwei Gene, die m5C-Methylasen
kodieren, und zwei Gene, die α- und β-Polypeptide
der Bpu10I-Endonuclease-Untereinheiten
kodieren (25, EMBL, Zugangs-Nr. Y14683, 1).
-
Für die Manifestierung
der enzymatischen Aktivität
in vivo und in vitro von R.Bpu10I sind Produkte beider Gene, bpu10IRα und bpu10IRβ, notwendig.
In der Anwesenheit von nur einem Polypeptid in der Reaktionsmischung
geschieht weder Schneiden von DNS noch Spaltung beider Stränge, wohingegen
nach der Zugabe des zweiten Polypeptids eine normale Bpu10I-ENase-Aktivität beobachtet
wird. Es wird vermutet, dass Untereinheiten nur enzymatisch aktiv
sind, wenn sie sich in einem heteromeren Komplex befinden, und dass möglicherweise
jede Untereinheit unterschiedliche Stränge asymmetrischer DNS-Sequenz schneidet.
-
Um
diese Vermutung zu bestätigen,
wurden Punktmutationen, die die katalytische Aktivität inaktivieren,
jedoch die Protein-Protein-Wechselwirkung bewahren, in α- und β-Untereinheiten der
Bpu10I-ENase eingeführt.
Für diesen
Zweck wurden Aminosäuresequenzen
beider Untereinheiten analysiert, um zu versuchen, katalytische
Zentren zu identifizieren, die analog zu jenen sind, die in anderen
RE gefunden worden sind, z. B. das Motiv (E/D)X9-15EXK,
das charakteristisch für
gewisse RE ist, und das SD171X8E180XK182-Motiv in
der N-terminalen Domäne
von Bpu10Iα und
das TE168X8E177XK179-Motiv in
dem N-Terminus der β-Untereinheit,
die ziemlich gut mit der Konsensussequenz übereinstimmten, die identifiziert
worden war. Auf der Basis dieser Beobachtungen kann die Annahme
gemacht werden, dass (E/D)X8EXK-Motive die
katalytischen/Magnesium bindenden Zentren der hierin beschriebenen
Proteine sein könnten.
Diese Region wurde als das Ziel für Punktmutagenese gewählt und
es wurde eine Reihe von Mutationen durch Standard-PCR-Techniken
eingeführt,
sowohl in α-
als auch in β-Untereinheiten
(1, worin die Positionen, in welche Aminosäuresubstitutionen
eingeführt
worden sind, unterstrichen sind).
-
Die
gewonnenen mutierten Bpu10I-α-
und -β-Proteine
und ihre Kombinationen mit den relevanten Wildtyp-Untereinheiten
wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit
analysiert, doppelsträngige
DNS zu spalten und zu schneiden. Alle Reaktionen wurden bei 37°C in Bpu10I-Puffer
durchgeführt:
10 mM Bis-Tris-Propan-HCl (pH 6,5), 10 mM MgCl2,
100 mM KCl, 0,1 mg/ml BSA. Durch PCR eingeführte Punktmutationen und ihre
Wirkung auf die funktionelle Aktivität von α- und β-Untereinheiten sind in 2 vorgestellt,
in welcher in der mit * bezeichneten Spalte der erste Buchstabe
und die Zahl die mutierte Aminosäure
und ihre Position anzeigen, und der letzte Buchstabe die nach der
Mutagenese gewonnene Aminosäure
anzeigt; +++ zeigt eine Aktivität
an, die gleich ist mit jener des nativen Enzyms; ++ zeigt eine Aktivität an, die
niedriger ist als die des nativen Enzyms; und + zeigt an, dass nur
Spuren an Aktivität
registriert worden sind.
-
Die
E180Q-Mutante der α-Untereinheit
und die E177A-Mutante der β-Untereinheit
wurden für
weitere Experimente ausgewählt.
Proteine wurden bis nahezu zur Homogenität aufgereinigt (siehe Beispiel
1) und es wurde durch etliche unterschiedliche Verfahren gezeigt
(siehe Beispiele 2, 3), dass, wenn die E180Q-Mutante der α-Untereinheit
(αE180Q)
und die native β-Untereinheit
in der Reaktionsmischung kombiniert werden, der einzige Strang mit
der Sequenz 5'-CC^TNAGC-3' wirksam geschnitten
wird. Umgekehrt resultiert die Anwesenheit der nativen α-Untereinheit
und der E177Q-Mutante der β-Untereinheit
(βE177A)
in der Reaktionsmischung in dem spezifischen Schneiden des gegenüber liegenden
DNS-Stranges mit der Erkennungssequenz 5'-GC^TNAGG-3' (3). Das
Experiment wurde wie folgt durchgeführt: ϕX174-Plasmid-DNS,
ein Satz spezifischer Primer (#1: 5'-TGGTTATATTGACCATGC-3', Position 1303;
#2: 5'-TTAAAATAGTTGTTATAGATA-3', Position 1411),
dNTPs und α[33dATP] wurden in der Verlängerungsreaktion
mit T7-DNS-Polymerase durch die einzige Bpu10I-Erkennungsstelle (Position 1361) verwendet.
Nach der Inaktivierung der Polymerase durch Erhitzen auf 65°C für 15 Minuten
wurden markierte Verlängerungsprodukte
parallel mit der Bpu10I-Restriktionsendonuclease, N.Bpu10Iα (α + βE177A) und
N.Bpu10Iβ (αE180Q + β) verdaut.
Verdauungsreaktionen wurden durch 10% denaturierende PAGE analysiert.
Wegen der unterschiedlichen Entfernung von der Bpu10I-Erkennungsstelle
zu den Primer-Annealing-Stellen (60 bp und 46 bp) oben und unten
an den DNS-Strängen,
konnte der gespaltene Strang spezifisch auf dem Gel identifiziert
werden. In 3 zeigt Spur 1 markierte ϕX174-DNS, verdaut
mit Bpu10I-Restriktionsendonuclease, Spur 2 zeigt markierte ϕX174-DNS,
verdaut mit N.Bpu10Iα (α + βE177A) und
Spur zeigt markierte ϕX174-DNS, verdaut mit N.Bpu10Iβ (αE180Q + β). Primer
und Fragmente, die mit jeder Nickase gespalten worden sind, sind
unten gezeigt:
-
Bpu10I-Stelle
fett gedruckt (Position 1361)
-
Damit
gewonnene Daten bestätigen
die Hypothese, dass eine Restriktionsendonuclease, die eine nicht
palindromische DNS-Sequenz erkennt, durch ortspezifische (oder unspezifische)
Mutagenese zu einer spezifischen Nickase umgewandelt werden kann,
die nur einen DNS-Strang
spaltet. Diese Daten bestätigen ebenfalls
die Annahme, dass in dem nativen R.Bpu10I-Enzym die α-Untereinheit
für das
Spalten des DNS-Strangs mit der Sequenz 5'-GC^TNAGG-3' verantwortlich ist,
während
es die β-Untereinheit
für die
Sequenz 5'-CC^TNAGC-3' ist.
-
Beispiel 1
-
Produktion und Aufreinigung
nativer und mutierter Untereinheiten von Bpu10I-Nickasen
-
Rekombinante
Plasmide für
die Überexpression
von Bpu10Iα-,
Bpu10Iβ-,
Bpu10IαE180Q- und Bpu10IβE177A-Proteinen
sind in den 3 bis 6 vorgestellt.
Die Gene für
die oben genannten Proteine, mit der Ausnahme von Bpu10IαE180Q, wurden überexprimiert,
indem sie in den Expressionsvektor pAL4A (A. Lubys, unveröffentlicht,
MBI-Fermentas) inseriert worden sind, der die Kombination des starken
induzierbaren Promotors pL mit der thermosensitiven Mutante des
Repressorproteins cI aus dem Phagen Lambda nutzt. Das Gen für Bpu10IαE180Q wurde überexprimiert,
indem es in den pUC19-Plasmidvektor unter der Kontrolle des lac-Promotors
inseriert worden ist.
-
Eine
Hinterlegung von jedem der oben genannten Plasmide wurde unter dem
Budapester Vertrag bei der Microbial Strain Collection of Latvia
(Mikroorganismenstammsammlung von Lettland) (blvd Kronvalda 4, Riga,
Lettland, LV-1586) gemacht. Jede Hinterlegung wurde unter Verwendung
von E. coli ER2267, die wie folgt transformiert waren, gemacht:
| Zugangsnummer | Plasmid |
| P634 | pUC19-Bpu10I
R alfa E180Q |
| P635 | pAL-Bpu10I
R beta E177A |
| P636 | pAL-Bpu10I
R alfa |
| P637 | pAL-Bpu10I
R beta |
-
Das
Induktionsschema für
die Bpu10Iα-,
Bpu10Iβ-
und Bpu10IβE177A-Proteine
war wie folgt: E.-coli-ER2267-Zellen, die mit den relevanten überexprimierenden
Plasmiden (3, 4 und 6)
transformiert worden sind, wurden über Nacht in flüssigem LB-Medium,
das mit Ampicillin (50 mg/l) ergänzt
worden war, bei 30°C
kultiviert. Die Über-Nacht-Kultur
wurde zu frischem LB-Medium, das mit Ampicillin (50 mg/l) ergänzt worden
war, hinzugefügt
und wurde bei 37°C
bis zur späten
logarithmischen Phase (OD600 1,2–1,4) weitergeführt. Die
Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet.
-
E.-coli-RR1-Zellen
mit dem überexprimierenden
Bpu10IαE180Q-Plasmid
(5) wurden über
Nacht in flüssigem
LB-Medium, das mit Ampicillin (50 mg/l) ergänzt worden war, bei 37°C kultiviert.
Die Über-Nacht-Kultur
wurde zu frischem LB-Medium, das mit Ampicillin (50 mg/l) ergänzt worden
war, hinzugefügt und
wurde bei 37°C
bis zur späten
logarithmischen Phase (OD600 1,2–1,4) weitergeführt. Dem
RR1-Strang fehlt das Lac-Repressorprotein,
deswegen ist die Induktion der Expression nicht notwendig. Die Zellen
wurden dann durch Zentrifugation geerntet. Die Proteine wurden wie
folgt aufgereinigt:
- 1. Aufreinigung von Bpu10Iα: Sämtliche
der folgenden Vorgänge
wurden entweder auf Eis oder bei 4°C durchgeführt. Zellbiomasse wurde in
Puffer A (10 mM Tris-HCl,
pH 7,0, 1 mM EDTA, 7 mM 2-Mercaptoethanol), ergänzt mit 150 mM KCl, in einem
Verhältnis
von 4 ml Puffer/1 g Zellbiomasse resuspendiert und durch Beschallung
(22 kHz, 100 W) für
5 bis 8 Minuten/100 ml Suspension aufgebrochen. Nucleinsäuren wurden
durch Zugabe von Polyethylenimin in einer Endkonzentration von 0,7%
zu der beschallten Suspension und durch Zentrifugation bei 10.000
rpm (Rotor JA10 von Beckman) für
10 Minuten eliminiert. Der Überstand
wurde gesammelt und trockenes Ammoniumsulfat wurde unter langsamem
Mischen bis zu einer Sättigung
von 80% hinzugefügt.
Proteine wurden durch Zentrifugation bei 10.000 rpm (Rotor JA10
von Beckman) für
10 Minuten gefällt
und das gesammelte Pellet wurde in Puffer A, ergänzt mit 150 mM KCl, in einem
Verhältnis
von 1–2
ml/1 g Pellet gelöst.
Die Proteinsuspension wurde dann gegen ein 30–50-mal höheres Volumen von Puffer A,
ergänzt
mit 150 mM KCl, der Dialyse unterzogen. Der resultierende Proteinextrakt
wurde dann auf eine Phosphorcellulose-P11-Säule (Whatman), äquilibriert
mit Puffer A, der mit 150 mM KCl ergänzt worden war, in einem Verhältnis von
2–4 ml
Sorbent/1 g Zellbiomasse geladen. Die Säule wurde mit zwei Säulenvolumina
Puffer A, ergänzt
mit 150 mM KCl, gewaschen und ein linearer Gradient aus zehn Säulenvolumina
von 0,15 M bis 1 M KCl, gelöst
in Puffer A, wurde mit der Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml/cm2 pro Stunde angelegt. Das Enzym eluierte
bei 0,6–0,7
M KCl und wurde vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden dann
gegen ein 20–30-mal
höheres
Volumen von Puffer A, der mit 150 mM KCl ergänzt worden war, über Nacht
dialysiert und wurden auf eine Bordo-Sepharose-Säule (Fermentas), die mit Puffer
A, der mit 150 mM KCl ergänzt
worden war, äquilibriert
worden war, in einem Verhältnis
von 0,5–0,9
ml Sorbent/1 g Zellbiomasse geladen. Die Säule wurde mit zwei Säulenvolumina
Puffer A, ergänzt mit
150 mM KCl, gewaschen und ein linearer Gradient von zehn Säulenvolumina
aus 0,15 M bis 1 M KCl, gelöst
in Puffer A, wurde mit der Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml/cm2 pro Stunde angelegt. Das Enzym eluierte
bei 0,35–0,52
M KCl und wurde vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden dann
gegen ein 20–50-mal
höheres
Volumen Puffer A, ergänzt
mit 150 mM KCl, über
Nacht dialysiert und wurden auf eine Heparin-Sepharose-Säule (Amersham Pharmacia Biotech),
die mit Puffer A, der mit 150 mM KCl ergänzt worden war, äquilibriert
worden war, in einem Verhältnis
von 0,3–0,8
ml Sorbent/1 g Zellbiomasse geladen. Die Säule wurde mit zwei Säulenvolumina
Puffer A, ergänzt
mit 150 mM KCl, gewaschen und ein linearer Gradient aus zehn Säulenvolumina
von 0,15 M bis 1 M KCl, gelöst
in Puffer A, wurde mit der Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml/cm2 pro Stunde angelegt. Das Enzym eluierte
bei 0,43–0,6
M KCl und wurde vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden dann
gegen ein 10–20-mal
höheres
Volumen Lagerungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM KCl, 0,1
mM EDTA, 1 mM DTT, 50% v/v Glycerol) dialysiert. Das oben beschriebene
Aufreinigungsschema ergab eine annähernd homogene Proteinzubereitung
mit einem Molekulargewicht von ungefähr 35 kDa, bestätigt durch
eine mit Coomasie-Blau R-250 gefärbte
SDS-PAGE-Gelelektrophorese. Die Proteinkonzentration wurde gemäß Bradford
(27) gemessen und die Proteinzubereitung wurde auf eine Endkonzentration
von 100 μM
mit dem Lagerpuffer, der mit 0,2 mg/ml BSA ergänzt worden war, verdünnt.
- 2. Aufreinigung von Bpu10IαE180Q:
Sämtliche
der folgenden Maßnahmen
wurden entweder auf Eis oder bei 4°C durchgeführt. Zellbiomasse wurde in
Puffer A (10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA, 7 mM 2-Mercaptoethanol),
ergänzt
mit 250 mM KCl, in einem Verhältnis
von 4 ml Puffer/1 g Zellbiomasse resuspendiert und durch Beschallung
(22 kHz, 100 W) für
5 bis 8 Minuten/100 ml Suspension aufgebrochen. Nucleinsäuren wurden
durch die Zugabe von Polyethylenimin in einer Endkonzentration von
0,7% zu der beschallten Suspension und durch Zentrifugation bei
10.000 rpm (Beckman-JA10-Rotor) für 10 Minuten eliminiert. Der Überstand
wurde gesammelt und trockenes Ammoniumsulfat wurde unter langsamem
Mischen bis zu einer Sättigung
von 80% hinzugefügt.
Proteine wurden durch Zentrifugation bei 10.000 rpm (Rotor JA10
von Beckman) für
10 Minuten gefällt
und das gesammelte Pellet wurde in Puffer A, ergänzt mit 150 mM KCl, in dem
Verhältnis
1–2 ml/1
g Pellet gelöst.
Die Proteinsuspension wurde dann gegen ein 30–50-mal höheres Volumen Puffer A, ergänzt mit
150 mM KCl, dialysiert. Der resultierende Proteinextrakt wurde dann
auf eine Phosphorzellulose-P11-Säule
(Whatman), die mit Puffer A, der mit 150 mM KCl ergänzt worden
war, äquilibriert
worden war, in dem Verhältnis
von 2–4
ml Sorbent/1 g Zellbiomasse geladen. Die Säule wurde mit zwei Säulenvolumina
Puffer A, ergänzt
mit 150 mM KCl, gewaschen und ein linearer Gradient aus zehn Säulenvolumina
von 0,15 M bis 1 M KCl, gelöst
in Puffer A, wurde mit der Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml/cm2 pro Stunde angelegt. Das Enzym eluierte
bei 0,8–0,9
M KCl und wurde vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden dann
gegen ein 20–30-mal
höheres
Volumen von Puffer A, ergänzt
mit 150 mM KCl, über
Nacht dialysiert und auf eine mit Puffer A, der mit 150 mM KCl ergänzt worden
war, äquilibrierte Bordo-Sepharose-Säule (Fermentas)
in dem Verhältnis
von 0,5–0,9
ml Sorbent/1 g Zellbiomasse geladen. Die Säule wurde mit zwei Säulenvolumina
Puffer A, ergänzt
mit 150 mM KCl, gewaschen und ein linearer Gradient aus zehn Säulenvolumina
aus 0,15 M bis 1 M KCl, gelöst
in Puffer A, wurde mit der Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml/cm2 pro Stunde angelegt. Das Enzym eluierte
bei 0,51–0,62
M KCl und wurde vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden dann
gegen ein 20–50-mal
höheres
Volumen Puffer A, ergänzt mit
150 mM KCl, über
Nacht dialysiert und auf eine Heparin-Sepharose-Säule (Amersham Pharmacia Biotech), äquilibriert
mit Puffer A, der mit 150 mM KCl ergänzt worden war, in dem Verhältnis von
0,3–0,8
ml Sorbent/1 g Zellbiomasse geladen. Die Säule wurde mit zwei Säulenvolumina
Puffer A, ergänzt
mit 150 mM KCl, gewaschen und ein linearer Gradient aus zehn Säulenvolumina
von 0,15 M bis 1 M KCl, gelöst
in Puffer A, wurde mit der Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml/cm2 pro Stunde angelegt. Das Enzym eluierte
bei 0,15–0,59
M KCl und wurde vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden dann
gegen ein 20–50-mal
höheres
Volumen Puffer A, ergänzt
mit 150 mM KCl, über
Nacht dialysiert und auf eine AH-Sepharosesäule (Amersham Pharmacia Biotech), äquilibriert
mit Puffer A, der mit 150 mM KCl ergänzt worden war, in dem Verhältnis von
0,3–0,8
ml Sorbent/1 g Zellbiomasse geladen. Die Säule wurde mit zwei Säulenvolumina Puffer
A, ergänzt
mit 150 mM KCl, gewaschen und ein linearer Gradient aus zehn Säulenvolumina
von 0,15 M bis 1 M KCl, gelöst
in Puffer A, wurde mit der Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml/cm2 pro Stunde angelegt. Die durchfließende Fraktion
wurde dann gegen ein 10–20-mal
höheres
Volumen Lagerpuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM KCl, 0,1 mM
EDTA, 1 mM DTT, 50% v/v Glycerol) dialysiert. Das oben beschriebene
Aufreinigungsschema ergab eine anscheinend homogene Proteinzubereitung
mit dem Molekulargewicht von ungefähr 35 kDa, bestätigt durch
eine mit Coomasie-Blau
R-250 gefärbte
SDS-PAGE-Gelelektrophorese. Die Proteinkonzentration wurde nach
Bradford (27) gemessen und die Proteinzubereitung wurde auf eine
Endkonzentration von 100 μM
mit dem mit 0,2 mg/ml BSA ergänzten
Lagerpuffer verdünnt.
- 3. Aufreinigung von Bpu10Iβ und
Bpu10IβE177A:
Dasselbe Aufreinigungsschema wurde für die Reinigung von nativen
und mutierten β-Proteinen
angewandt. Sämtliche
der folgenden Vorgänge
wurden entweder auf Eis oder bei 4°C durchgeführt. Zellbiomasse wurde in
Puffer A (10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA, 7 mM 2-Mercaptoethanol),
ergänzt
mit 250 mM KCl, in dem Verhältnis
von 4 ml Puffer/1 g Zellbiomasse resuspendiert und durch Beschallung
(22 kHz, 100 W) für
5 bis 8 Minuten/100 ml Suspension aufgebrochen. Nucleinsäuren wurden
durch die Zugabe von Polyethylenimin mit einer Endkonzentration
von 0,7% zu der beschallten Suspension und durch Zentrifugation
bei 10.000 rpm (Rotor JA10 von Beckman) für 10 Minuten eliminiert. Der Überstand
wurde gesammelt und trockenes Ammoniumsulfat wurde unter langsamem
Mischen bis zu 80%iger Sättigung
hinzugefügt.
Proteine wurden durch Zentrifugation bei 10.000 rpm (Rotor JA10
von Beckman) für
10 Minuten gefällt
und das gesammelte Pellet wurde in Puffer A, ergänzt mit 150 mM KCl, in dem
Verhältnis
von 1–2
ml/1 g Pellet gelöst.
Proteinsuspension wurde dann gegen ein 30–50-mal höheres Volumen Puffer A, ergänzt mit
150 mM KCl, dialysiert. Der resultierende Proteinextrakt wurde dann
auf eine Phosphorzellulose-P11-Säule
(Whatman), die mit Puffer A, der mit 150 mM KCl ergänzt worden
war, äquilibriert
worden war, in dem Verhältnis
von 2–4
ml Sorbent/1 g Zellbiomasse geladen. Die Säule wurde mit zwei Säulenvolumina
Puffer A, ergänzt
mit 150 mM KCl, gewaschen und ein linearer Gradient aus zehn Säulenvolumina
von 0,15 M bis 0,6 M KCl, gelöst
in Puffer A, wurde mit der Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml/cm2 pro Stunde angelegt. Das Enzym eluierte
bei 0,3–0,4
M KCl und wurde vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden dann
gegen ein 20–30-mal
höheres
Volumen von Puffer A, ergänzt
mit 200 mM KCl, über
Nacht dialysiert und auf eine Bordo-Sepharose-Säule (Fermentas), äquilibriert mit
Puffer A, der mit 200 mM KCl ergänzt
worden war, in dem Verhältnis
von 0,5–2,0
ml Sorbent/1 g Zellbiomasse geladen. Die Säule wurde mit zwei Säulenvolumina
Puffer A, ergänzt
mit 200 mM KCl, gewaschen und ein linearer Gradient aus zehn Säulenvolumina
aus 0,2–1
M KCl, gelöst
in Puffer A, wurde mit der Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml/cm2 pro Stunde angelegt. Das Enzym eluierte
bei 0,5–0,7
M KCl und wurde vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden dann
gegen ein 20–40-mal
höheres
Volumen Puffer A, ergänzt
mit 150 mM KCl, über
Nacht dialysiert und auf eine AH-Sepharose-Säule (Amersham Pharmacia Biotech),
die mit Puffer A äquilibriert
worden war, der mit 150 mM KCl ergänzt worden war, in dem Verhältnis von
0,2–2,0
ml Sorbent/1 g Zellbiomasse geladen. Die Säule wurde mit zwei Säulenvolumina
Puffer A, ergänzt
mit 150 mM KCl, gewaschen und ein linearer Gradient aus zehn Säulenvolumina
von 0,15 M bis 0,8 M KCl, gelöst
in Puffer A, wurde mit der Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml/cm2 pro Stunde angelegt. Die Enzymaktivität eluierte
bei 0,3–0,4
M KCl und wurde vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden dann
gegen ein 10–20-mal
höheres
Volumen Puffer A, ergänzt
mit 150 mM KCl, über
Nacht dialysiert und auf eine Heparin-Sepharose-Säule, die
mit Puffer A äquilibriert
worden war, der mit 200 mM KCl ergänzt worden war, in dem Verhältnis von
0,5–2,0
ml Sorbent/1 g Proteinextrakt geladen. Die Säule wurde mit zwei Säulenvolumina
Puffer A, ergänzt
mit 200 mM KCl, gewaschen und ein linearer Gradient aus zehn Säulenvolumina
von 0,15 M bis 0,8 M KCl, gelöst
in Puffer A, wurde mit der Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml/cm2 pro Stunde angelegt. Die Enzymaktivität eluierte
bei 0,3–0,4
M KCl und wurde vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden dann
gegen ein 10–20-mal
höheres
Volumen Lagerpuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM KCl, 0,1 mM
EDTA, 1 mM DTT, 50% v/v Glycerol) dialysiert. Das oben beschriebene
Aufreinigungsschema ergab anscheinend homogene Proteinzubereitungen,
wobei die Molekulargewichte von ungefähr 34 kDa durch mit Coomasie-Blau
R-250 gefärbte
SDS-PAGE-Gelelektrophorese bestätigt
worden ist. Die Proteinkonzentrationen wurden nach Bradford (27)
gemessen und die Proteinzubereitungen wurden auf eine Endkonzentrationen
von 100 μM
mit dem Lagerpuffer, ergänzt
mit 0,2 mg/ml BSA, verdünnt.
-
Bpu10Iα-Nickase
mit der Spezifität
5'-GC^TNAGG-3' wurde durch Mischen
von Bpu10Iα- und Bpu10IβE177A-Proteinen
in dem molaren Verhältnis
von 1:3 gewonnen, während
Bpu10Iβ-Nickase
mit der Sequenzspezifität
5'-CC^TNAGC-3' durch Mischen von
Bpu10Iβ-
und Bpu10IαE180Q-Proteinen
in dem molaren Verhältnis
1:4 gewonnen wurde. Die Schneideaktivität wurde dann entweder durch Überwachen
des Übergangs
von superverknäultem
Plasmid mit einer Bpu10I-Erkennungsstelle in die geschnittene Form
mittels Agarosegelelektrophorese beurteilt oder durch Schneiden
von DNS des Phagen Lambda, gefolgt von der Behandlung mit S1-Nuclease
aus Aspergillus oryzae (Fermentas). Elektropherogramme geschnittener
Lambda-DNS ergaben keine Fragmentation bei nicht denaturierenden
Bedingungen, während
die nachfolgende Behandlung mit S1-Nuclease, wobei das Enzym spezifisch
einzelsträngige,
dem Schnitt gegenüber
liegende DNS spaltet, ein Verdauungsmuster ergab, das typisch für Bpu10I-Restriktionsendonuclease
ist (
11). In
11 zeigt jede
Spur das Folgende:
| Spuren
1 und 10: | DNS-Molekulargewichtsstandard
(GeneRuler DNA Ladder Mix, Fermentas) |
| Spur
2: | Phage-λ-DNS |
| Spur
3: | Phage-λ-DNS + Bpu10Iα-Untereinheit |
| Spur
4: | Phage-λ-DNS + Bpu10Iα-Untereinheit
+ S1-Nuclease |
| Spur
5: | Phage-λ-DNS + Bpu10IβE177A-Untereinheit |
| Spur
6: | Phage-λ-DNS + Bpu10IβE177A-Untereinheit
+ S1-Nuclease |
| Spur
7: | Phage-λ-DNS + N.Bpu10Iα (α + βE177A) |
| Spur
8: | Phage-λ-DNS + N.Bpu10Iα (α + βE177A) +
S1-Nuclease |
| Spur
9: | Phage-λ-DNS + Bpu10I |
-
Anwendung
spezifischer DNS-Nickasen
-
Die
Anwendungsmöglichkeiten
der gewonnenen spezifischen DNS-Nickasen werden durch die folgenden,
nicht begrenzenden Beispiele erläutert.
-
Beispiel 2
-
Produktion einzelsträngiger zirkulärer DNS-Moleküle aus supergeknäulten doppelsträngigen Plasmiden
in vitro und ihre Anwendung bei molekularbiologischen Techniken:
DNS-Sequenzieren, ortspezifische Mutagenese, differenzielles Display
etc.
-
pUC19-Bpu-Plasmid,
das eine Bpu10I-Erkennungsstelle besitzt, wurde durch Ligieren eines
399 bp großen
SspI-DraI-ϕX174-DNS-Fragmentes (1007–1406 nt, GenBank/EMBL -Zugangs-Nrn.
V01128, J02482, M103483) mit einer Bpu10I-Stelle 5'-CCTAAGC-3' (1361 nt) in mit
SmaI-HincII verdautes pUC19 konstruiert. Einzelsträngige Schnitte
in der Plasmid-DNS wurden eingeführt,
indem sie mit entweder N.Bpu10Iα (α + βE177A), das
5'-GC^TNAGG-3' spaltet, oder mit
N.Bpu10Iβ (αE180Q + β), das 5'-CC^TNAGC-3' spaltet, inkubiert
wurde. Schneidereaktionen wurden wie folgt durchgeführt: In
50 ml Gesamtreaktionsvolumen wurden 5 μg Vektor-DNS mit Schneideenzymen
(entweder α oder β), die, wie
in Beispiel 1 beschrieben, in Bpu10I-Puffer (10 mM Bis-Tris Propan
HCl (pH 6.5), 10 mM MgCl2, 100 mM KCl, 0,1
mg/ml BSA) zubereitet worden sind, bei 37°C für 3 Stunden inkubiert. Die
Schneideenzymkonzentration in der Reaktionsmischung betrug 2 pmol/μl. Die Vollständigkeit
der Schneidereaktion wurde durch Agarosegelelektrophorese bestätigt und
die Reaktion wurde durch Phenol/Chloroform-Deproteinierung, gefolgt von DNS-Fällung mit
Ethanol, beendet. Die geschnittene DNS wurde mit 100 U E.-coli-Exonuclease
III in ExoIII-Puffer (Fermentas) inkubiert, bis sämtliche
DNS gemäß Agarosegelelektrophorese
in die einzelsträngige
Form umgewandelt worden war. Die gewonnene ssDNS nach Phenol/Chloroform-Deproteinierung,
gefolgt von DNS-Fällung
mit Ethanol, wurde in Sequenzierreaktionen mit Standard-M13/pUC-Sequenzierprimer
genommen. Sequenzierreaktionen wurden mit dem Auto-Reader-DNA-Sequenzierkit (Fermentas)
durchgeführt
und auf einem 8% denaturierenden Standard-PAGE-Sequenziergel in einer automatisierten
Gelsequenziereinheit (ALF ExpressTM Amersham
Pharmacia Biotech) laufen gelassen. DNS-Sequenzen von guter Qualität wurden
nur in jenen Fällen
gewonnen, bei denen ein passender Primer, der mit dem erwarteten,
nicht abgebauten Strang (+ oder –, in Abhängigkeit von den angewandten
Schneideenzymen) für
die Reaktion verwendet worden war. Primer, die zu dem gegenüber liegenden,
abgebauten Strang komplementär
waren, ergaben keine Reaktionsprodukte.
-
Beispiel 3
-
Schaffung verschachtelter
Deletionen unter Verwendung ortspezifischer Nickasen
-
pUC19-Bpu-Plasmid,
das eine Bpu10I-Erkennungsstelle besitzt, wurde entweder mit N.Bpu10Iα (α + βE177A), das
5'-GC^TNAGG-3' spaltet, oder mit
N.Bpu10Iβ (αE180Q + β), das 5'-CC^TNAGC-3' spaltet, inkubiert.
Schneidereaktionen wurden auf demselben Wege, wie in Beispiel 2
beschrieben, durchgeführt.
Die Vollständigkeit
der Schneidereaktion wurde durch Agarosegelelektrophorese bestätigt und
die Reaktion wurde durch Phenol/Chloroform-Deproteinierung, gefolgt
von DNS-Fällung
mit Ethanol beendet. Geschnittene DNS wurde dann als ein Substrat
für die
Schaffung verschachtelter Deletionen unter Verwendung von ExoIII/S1-Deletionkit
(Fermentas) verwendet. Sämtliche
Vorgänge
wurden durchgeführt,
wie vom Hersteller empfohlen. Reaktionsprodukte nach der Ligation
wurden in E. coli durch Standard-Calcium-Techniken (27) transformiert. Plasmide,
die aus rekombinanten Klonen isoliert worden sind, die den unterschiedlichen
Zeitpunkten des ExoIII-Abbaus entsprechen, wurden der Restriktionsanalyse
unterzogen, welche ergab, dass in Abhängigkeit von dem verwendeten
Schneideenzym der DNS-Abbau entweder nur stromaufwärts oder
nur stromabwärts
der Bpu10I-Erkennungssequenz geschah.
-
Beispiel 4
-
Vektorzubereitung
für ein
ligationsunabhängiges
Klonierverfahren
-
Ein
pUC57-PKA2-Vektorplasmid, das eine PstI-Erkennungsstelle, flankiert
von zwei umgekehrten Bpu10I-Erkennungsstellen besitzt, wurde durch
Ligieren der folgenden Kassette in mit PaeI-KpnI verdautes pUC57
(Fermentas) konstruiert:
-
-
20 μg des Plasmids
pUC57-PKA2 wurden mit N.Bpu10Iα (α + βE177A), das
5'-GC^TNAGG-3' spaltet und wie
in Beispiel 1 beschrieben zubereitet worden war, in Bpu10I-Puffer
in einem Gesamtreaktionsvolumen von 400 μl bei 37°C für 3 Stunden behandelt. Die
Schneideenzymkonzentrationen der Reaktionsmischung betrug 2 pmol/μl. Nachdem
die Schneidereaktion abgeschlossen war, wie bestätigt durch Agarosegelelektrophorese,
wurden 10 Einheiten PstI-Restriktionsendonuclease zu der Reaktionsmischung
hinzugefügt
und die Inkubation wurde bei 37°C
für weitere
2 Stunden verlängert.
Die Reaktion wurde durch Phenol/Chloroform-Deproteinierung, gefolgt
von DNS-Fällung
mit Ethanol beendet. Verdaute Vektor-DNS wurde dann mit 500 U E.-coli-Exonuclease III in
ExoIII-Puffer (Fermentas) bei 25°C
für 1 Minute
inkubiert. Exonucleaseabbau sollte in der Bildung des Vektormoleküls, das
18 nt und 21 nt einzelsträngige
vorstehende 3'-Enden
besitzt, resultieren.
-
Nachfolgend
wurden uridinylierte Primer, die 5'-Enden besitzen, die komplementär sind mit
Vektor-DNS-Sequenz und deren 3'-Enden
zu der Phage-Lambda-Sequenz (EMBL/GenBank, Zugangs-Nrn. J02459,
2761–3678)
komplementär
sind, synthetisiert:
-
-
Nach
der PCR-Reaktion an Phage-Lambda-DNS wurde das erwartete, 943 bp
lange DNS-Fragment amplifiziert.
Das Fragment wurde entweder direkt in Reaktion mit UDG genommen
oder gel-gereinigt. Das gewonnene PCR-Fragment (annähernd 0,2 μg) wurde
mit vorbereiteter Vektor-DNS (annähernd 0,1 μg) in 1 × PCR-Reaktionspuffer (10 mM
Tris-HCl, pH 8,8, 50 mM KCl, 0,8% Nonidet P40), enthaltend keine
Magnesiumionen, vermischt, die Mischung wurde mit E.-coli-Uracil-DNS-Glycosylase
bei 37°C
für 30
Minuten behandelt und nachfolgend für die Transformation kompetenter
E.-coli-JM109-Zellen
verwendet. Die erhaltene Effizienz der Transformation war 7,3 × 104 CFU/1 μg
DNS für
das ungereinigte PCR-Fragment oder 8,2 × 104 CFU/1 μg DNS für gel-gereinigtes
PCR-Fragment.
-
Kolonie-PCR-Analyse
wurde bei 39 zufällig
ausgewählten
Transformanten unter Verwendung von direkten und Umkehr-Standard-pUC/M13-Sequenzierprimern
durchgeführt,
was ergab, dass sämtliche
Transformanten das klonierte DNS-Insert mit der erwarteten Länge von
943 bp besaßen.
-
Beispiel 5
-
Zubereitung kovalent geschlossener,
doppelsträngiger
linearer DNS-Moleküle
-
Es
wurde ein spezielles Vektor/Insert-Plasmid pUC19-800K8 konstruiert,
bei dem das gewünschte
Insert-DNS-Fragment von zwei umgekehrten Bpu10I-Erkennungssequenzen
auf jeder Seite flankiert war (8). Die
Spacersequenz zwischen zwei Bpu10I-Erkennungsstellen umfasst ein unterbrochenes
Palindrom, welches nach der Schneidereaktion eine selbstkomplementäre Haarnadelstruktur
zwischen den oberen und unteren DNS-Strängen bilden sollte. Die Ligation
der resultierenden Struktur sollte ein kovalent geschlossenes lineares
Insert-DNS-Molekül
und ein kovalent geschlossenes Vektorrückgrat ergeben. Das Vektorrückgrat wird
nach der nachfolgenden Spaltung mit Restriktionsendonuclease, welche
keine Erkennungssequenzen in der Insertfragment-DNS hat, empfänglich für Abbau
mit Enzymen, die exonucleolytische Aktivität besitzen, z. B. T7-DNS-Polymerase.
-
20 μg des Plasmids
pUC19-800K8 wurden mit N.Bpu10Iα (α + βE177A), wodurch
5'-GC^TNAGG-3' abgespalten wurde,
das wie in Beispiel 1 beschrieben zubereitet war, in Bpu10I-Puffer
in einem Gesamtreaktionsvolumen von 400 μl bei 37°C für drei Stunden behandelt. Die
Schneideenzymkonzentration in der Reaktionsmischung betrug 2 pmol/μl. Nachdem
die Schneidereaktion abgeschlossen war, wie bestätigt durch Agarosegelelektrophorese,
wurde pUC19-800K8 bei 95°C
für 5 Minuten
inkubiert und es wurde ihm ermöglicht, langsam
auf Raumtemperatur abzukühlen,
um das Schneideenzym zu inaktivieren und um den selbstkomplementären Haarnadelstrukturen
zu ermöglichen,
an den DNS-Enden Doppelstränge
zu bilden. Schnitte wurden kovalent durch Hinzufügen von ATP in einer Konzentration
von 0,5 mM, T4-DNS-Ligase (Fermentas) und durch Ligieren bei Raumtemperatur
für eine
Stunde geschlossen. Die Reaktion wurde abgeschlossen durch Phenol/Chloroform-Deproteinierung,
gefolgt von DNS-Fällung
mit Ethanol. Die Reaktionsprodukte wurden danach mit NsbI-Restriktionsendonuclease
inkubiert, welche keine Erkennungssequenzen in der gewünschten Insertfragment-DNS,
aber eine Erkennungsstelle in dem Vektorrückgrat hatte. Nach dem Abschluss
der Verdauungsreaktion, wie bestätigt
durch Agarosegelelektrophorese, wurde T7-DNS-Polymerase zu der Reaktionsmischung
hinzugefügt
und die Inkubation wurde für
weitere 30 Minuten bei 37°C
verlängert.
NsbI-Verdauung erzeugt zwei stumpf endende Vektorrückgratfragmente,
die für
den Abbau durch T7-DNS-Polymerase empfänglich sind wegen deren 3'-5'-Exonucleaseaktivität, während die
kovalent geschlossene Insert-DNS gegenüber einem solchen Abbau resistent
ist. Es wurde durch Agarosegelelektrophorese gezeigt, dass das einzige
verbleibende DNS-Fragment nach der Reaktion dasjenige ist, welches
der kovalent geschlossenen linearen Insert-DNS entspricht (9).
-
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