DE3908897C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft das in den Ansprüchen 1 bis 9 angegebene Verfahren zur Herstellung eins Plasmid-Konstrukts für oligonukleotid-induzierte Mutagenesen sowie nach den Ansprüchen 10 bis 12 ein Verfahren zur Herstellung eines Plasmids mit mutagenisiertem DNA-Bereich.

Es sind verschiedene Verfahren unterschiedlichen Umfangs und Schwierigkeitsgrades entwickelt worden, mit denen sich eine gezielte Mutagenese einer beliebigen Stelle innerhalb eines vorgegebenen DNA-Segmentes mit hoher Ausbeute erreichen läßt (1-13). Jedoch erfordern diese Verfahren ein zweifaches Subklonieren des DNA-Segments, und zwar zuerst in einem speziellen Mutagenese-Vektor (überlicherweise einem M13-Vektor oder einem Plasmid, das einen Replikationsursprung eines filamentösen Phagen beherbergt) und zweitens in einem Vektor, der für die Expression oder Untersuchung der mutierten DNA geeignet ist. Außerdem sind einige DNA-Fragmente viel schwieriger in einzelsträngigen (ss) Vektoren als in doppelsträngigen (ds) Vektoren zu klonieren (14). Es ist daher verständlich, daß eine stellenspezifische Mutagenese direkt mit dem Plasmid, das das interessierende Segment enthält, eine wesentliche Vereinfachung darstellen würde. So ist auch eine Anzahl derartiger Verfahren bereits beschrieben worden. Jedoch liefern sie entweder niedrige Ausbeuten von etwa 10% oder weniger (14 bis 20) oder sind nicht ohne Einschränkungen anwendbar, insofern als sie eine singuläre (d. h. nur einmal vorkommende) Restriktionsstelle in Nachbarschaft zum Zielbereich der Mutagenese erfordern (21 bis 23). Unlängst ist auch die Polymerase-Kettenreaktion für die gezielte Mutagenese benutzt worden (24). Ihre hohe Ausbeute von praktisch 100% für die gewünschte Mutation wird jedoch durch die Bildung zusätzlicher unerwünschter Mutationen herabgesetzt, die auf eine Anhäufung von Replikationsirrtümern bei der In-Vitro-Kettenreaktion zurückgehen. So hat nach 30 Amplifikationszyklen jedes einzelne mutagenisierte DNA-Molekül etwa eine unerwünschte Mutation pro 400 Basenpaare (bp) erfahren (24 und 25). Dadurch wird die effektive Mutantenausbeute für Segmente dieser Länge oder längere Segmente drastisch abgesetzt.

Schließlich wird in Gene, 69 (1988) 317-324 ein Verfahren für eine olionucleotid-gerichtete Mutagenese vorgeschlagen, das zwingend von einem Plasmid-DNA-Strang ausgeht, so daß der komplementäre Strang nicht zugegen sein darf. Ein Plasmid-Klonierungsvektor ist jedoch überhaupt nicht oder höchstens nach aufwendigem Trennverfahren als reinrassiger Einzelstamm erhältlich. Nach dem bekannten Verfahren kann also das zu mutagenisierende DNA-Segment nicht in einem beliebigen Plasmid enthalten sein, sondern muß in einem speziellen Vektor kloniert worden sein, der als reinrassiger Einzelstrang isolierbar ist.

Ausgehend von dem durch Kramer et al. (6) beschriebenen M13-Verfahren wurde nun eine Methode entwickelt, die eine hocheffiziente Mutagenese von DNA-Segmenten in praktisch jedem Plasmid gestattet.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Plasmid-Konstrukts für oligonucleotid-induzierte Mutagenesen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

• (a) einen Bakterienstamm (dut⁻ ung⁻) mit einem Plasmid transformiert, das Plasmid mit Hilfe des Stammes einem dU-Einbau unterwirft und danach wieder isoliert,
• (b) das dU-haltige Plasmid an einer Schnittstelle oder vielen Schnittstellen schneidet, die alle außerhalb des zu mutagenisierenden Bereichs liegen,
• (c) aus dem in die Stufe (a) einzusetzenden Plasmid den ganz oder teilweise zu mutagenisierenden Bereich herausschneidet, den herausgeschnittenen Bereich entfernt und das geschnittene Plasmid isoliert,
• (d) das gemäß Stufe (b) geschnittene dU-haltige Plasmid und das gemäß Stufe (c) erhaltene geschnittene Restplasmid mischt, durch De- und Rehybridisierung der DNA-Doppelstränge zwei komplementäre Ringmoleküle bildet, die den Zielbereich der Mutagenese in einzelsträngiger Form enthalten,
• (e) und gegebenenfalls eines der beiden komplementären Ringmoleküle für die Mutagenese unwirksam macht.

Zweckmäßigerweise schneidet man das in der Stufe (b) zu schneidende dU-haltige Plasmid an einer im Plasmid nur einmal vorkommenden Schnittstelle. Es ist vorteilhaft, wenn diese nur einmal vorkommende Schnittstelle jeweils mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20 und insbesondere mindestens 50 bp von den Schnittstellen des Bereichs entfernt ist, der gemäß Stufe (c) herausgeschnitten wird.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Plasmids mit mutagenisiertem DNA-Bereich, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

• (a1) im Anschluß an die vorstehend angeführten Stufen (a) bis (e) oder
• (a2) ausgehend von einem Plasmid-Konstrukt, das nach dem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 9 erhalten wurde,
  an den ss-Bereich des Plasmid-Konstrukts ein mutagenes Oligonucleotid bindet,
• (b) das erhaltene Substrat enzymatisch zu einem vollständig doppelsträngigen zyklischen Heteroduplex-Plasmid ergänzt,
• (c) einen Bakterienstamm mit dem Heteroduplex-Plasmid transformiert und ein Kulturmedium mit dem Transformationsprodukt inokuliert und
• (d) das angefallene Plasmidgemisch auf das in gewünschter Weise mutagenisierte Plasmid screent.

Man kann dieses Verfahren zur Herstellung eines Plasmids mit mutagenisiertem DNA-Bereich auch so durchführen, daß man anstelle von Stufe (d)

• - mit Plasmid-Material aus dem angefallenen Plasmidgemisch einen beliebigen Bakterienstamm transformiert, erneut ein Kulturmedium mit dem Transformationsprodukt inokuliert und
• - das angefallene Plasmidgemisch auf das in gewünschter Weise mutagenisierte Plasmid screent.

Man kann die beiden vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren auch als ein einziges Verfahren mit zwei Abschnitten ansehen, bei dem man den ersten Abschnitt für ein gegebenes Plasmid mit einem gegebenen Zielbereich nur einmal durchführen wird, wobei der zweite Abschnitt die eigentliche Mutagenese betrifft. Ein schematischer Überblick über den ersten Abschnitt ist in Fig. 1 gegeben. Das gezeigte Plasmid gliedert sich durch die Restriktionsstellen A und B in zwei Segmente. Das schwarze Segment soll die Zielstelle bzw. die Zielstellen für eine Mutagenese enthalten. Es wird daher als Zielsegment bezeichnet. Das weiße Segment wird als Nicht-Zielsegment bezeichnet. In den Ringmolekülen mit Lücke ist das Zielsegment mit dem ss-Bereich bzw. der Lücke identisch. Nachstehend wird die Erfindung anhand von Fig. 1 näher erläutert.

Herstellung eines Plasmid-Konstrukts für eine oligonucleotidgerichtete Mutagenese

• 1. Ein Stamm (dut⁻ ung⁻) wird mit dem gewünschten Plasmid transformiert und das Plasmid wird danach isoliert.
• 2. Diese dU-haltige DNA wird an einer vorzugsweise nur einmal vorkommenden Restriktionsstelle (C) geschnitten, die im Nicht-Zielsegment liegt und vorzugsweise mindestens etwa 10, 20 oder 50 bp vom Zielsegment entfernt sein soll.
• 3. Das normale Plasmid wird an den Restriktionsstellen A und B (die identisch sein können) geschnitten und das resultierende Nicht-Zielsegment wird isoliert.
• 4. Die DNA-Moleküle aus den Stufen 2 und 3 werden gemischt, dehybridisiert und rehybridisiert. Dabei werden zwei komplementäre Ringmoleküle mit Lücke gebildet.
• 5. Zum Eliminieren des unerwünschten Ringmoleküls mit Lücke wird ein Oligonucleotid, das eine Restriktionsstelle aufweist, die im Nicht-Zielsegment nicht vorliegt, an die Lücke hybridisiert, die Restriktionsstelle geschnitten, und das verbliebene Ringmolekül mit Lücke isoliert. Dieses Ringmolekül ist das Substrat für alle Mutagenesen, deren Zielstellen in dieser speziellen Lücke liegen.

Herstellung eines Plasmids mit mutagenisiertem DNA-Bereich

• 1. Das für die Mutagenese ausgewählte Oligonucleotid wird an die Lücke des Ringmoleküls hybridisiert.
• 2. Dieses Substrat wird enzymatisch elongiert und ligiert, so daß man ein vollständig doppelsträngiges Heteroduplex-DNA-Ringmolekül erhält.
• 3. Ein Bakterienstamm (ung⁺) wird mit den Produkten aus Stufe 2 transformiert, wonach eine flüssige Kultur inokuliert wird. Bei Basensubstitutionen sollte man einen Stamm wählen, der das Heteroduplex-DNA-Ringmolekül nicht zu einem Homoduplex-DNA-Ringmolekül reparieren kann (mismatch repair).
• 4. Das Plasmidgemisch wird von der flüssigen Kultur isoliert und zum Transformieren eines vorgegebenen Stammes verwendet. Die Zellen werden ausplattiert.
• 5. Übernacht-Kulturen werden mit einigen Kolonien inokuliert. Ihre Plasmide werden in kleinem Maßstab gewonnen.
• 6. Die DNA-Moleküle werden im Hinblick auf die gewünschte Mutation gescreent, beispielsweise durch eine Einzelbasensequenzierung oder durch eine Restriktionsanalyse.

Die grundlegende Voraussetzung für eine oligonucleotid-induzierte Mutagenese ist ein Ziel-DNA-Bereich in ss-Form. Wie man Fig. 1 (Stufen 2 bis 4) entnehmen kann, kann man diese Voraussetzung mit einem beliebigen ds-Plasmid dadurch schaffen, daß man ein Ringmolekül mit Lücke bildet, das durch Hybridisieren unterschiedlich gespaltener Formen des Plasmids erhalten wird (14). Die Bildung eines doppelsträngigen Ringmoleküls mit Lücke bietet zusätzliche Vorteile im Vergleich zur Verwendung von vollständig einzelsträngigen Ringmolekülen (1, 4 und 6):

• 1. Sie erlaubt die Selektion des mutagenisierten Stranges.
• 2. Sie verkürzt und vereinfacht damit die In-Vitro-DNA-Synthese.
• 3. Sie schützt das übrige DNA-Molekül gegen eine Mißhybridisierung durch das mutagenisierende Oligonucleotid, die zu unerwünschten Mutationen führen kann.
• 4. Die Möglichkeit, daß der Zielbereich für das Oligonucleotid durch die Bildung stabiler Sekundärstrukturen mit anderen einzelsträngigen Bereichen des Moleküls maskiert wird, ist beträchtlich gemindert.

Die erfindungsgemäße Strategie zur Bildung eines Ringmoleküls mit Lücke liefert also zwei komplementäre Ringmoleküle mit Lücke in gleicher Menge (Fig. 1: Stufen 2 bis 4). Vorzugsweise soll nur eines dieser Ringmoleküle nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bildung eines Plasmids mit mutagenisiertem DNA-Bereich führen. Daher wird das andere vorzugsweise unwirksam gemacht. Dazu kann dieses Molekül linearisiert und abgetrennt werden. Die Linearisierung kann man durch eine Spaltung mit Restriktionsendonuklease erreichen, nachdem man ein geeignetes "Restriktionsoligonucleotid" hybridisiert hat (Fig. 1: Stufen 5a und 5b).

Nach der Hybridisierung des mutagenen Oligonucleotids und nach den in vitro durchgeführten Auffüll- und Ligationsreaktionen wird ein Bakterienstamm mit den resultierenden Heteroduplex-Molekülen transformiert, von denen nur ein Strang die Mutation trägt. Bei Basensubstitutionen kann die Mutantenausbeute durch "mismatch repair" in vivo vermindert sein; vgl. 38. Daher wird ein Stamm bevorzugt, der kein "mismatch repair" durchführt.

Für eine weitere Erhöhung der Mutantenausbeute ist es erwünscht, alle Generationsfolgen des nichtmutierten Stranges des Heteroduplex-Moleküls zu unterdrücken, indem man gegen diesen Strang selektiert (5, 6, 8, 12 und 39). Eine Selektionsmethode, die von Merkmalen unabhängig ist, die auf das Plasmid zurückgehen, ist beispielsweise für M13 beschrieben worden (7). Der Strang, gegen den selektiert wird, wird aus einem Stamm (dut⁻ ung⁻) isoliert und enthält demgemäß einige dU-Reste. Derartige DNA wird in Stämmen (ung⁺) bevorzugt abgebaut. So kann ein Ringmolekül mit Lücke gebildet werden, indem man ein dU-haltiges Templat mit einem normalen komplementären Strang kombiniert (Fig. 1: Stufen 1 bis 4).

Für das erfindungsgemäße Verfahren gibt es keine Beschränkungen hinsichtlich des Typs (Substitution, Deletion oder Insertion) und der Position der angestrebten Mutation. Um jedoch selektiv das unerwünschte Ringmolekül mit Lücke zu linearisieren, kann man vorsehen, daß eine Restriktionsstelle in der Lücke vorliegt, die dem ds-Segment fehlt. Bei den meisten rekombinanten Vektoren flankieren verbleibende Restriktionsstellen des Vektor-Polylinkers das eingefügte DNA-Fragment, so daß sie in die Lücke mit einbezogen werden können. Wenn das nicht der Fall ist, kann die Lücke durch die Wahl einer entfernteren Schnittstelle A bzw. B (Fig. 1) praktisch immer derart vergrößert werden, daß sie die gewünschte Stelle enthält.

Es gibt auch andere Methoden, ein spezielles Ringmolekül mit Lücke zu linearisieren, die nicht vom Vorhandensein einer Restriktionsstelle in der Lücke abhängen. Die ss-Region eines Ringmoleküls mit Lücke ist ein ideales Substrat für eine durch Oligonucleotide gelenkte Spaltung, die entweder ein Haarnadelsegment mit einer Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym der Klasse IIS (40 und 41) oder einen Baustein, wie EDTA, tragen, der eine chemische Spaltung von Nukleinsäuren erlaubt (42).

Nach Wahl kann man die Selektion des Ringmoleküls mit Lücke und/oder die Strang-Selektion auf Kosten der Ausbeute weglassen.

Wenn sich die folgenden Generationen der Heteroduplex-Moleküle, die zur Transformation verwendet werden, von beiden Strängen in gleichen Mengen herleiten und wenn die Selektion gegen den dU-haltigen Strang einen Wirkungsgrad von 100% besitzt, führt eine unterlassene Strang-Selektion dazu, daß die Ausbeute um den Faktor 2 fällt. Da die Strang-Selektion einen Wirkungsgrad unter 100% (etwa 70%) erreicht (43), sollte der erwartete Ausbeuteabfall eher einem Faktor von 1,5 entsprechen.

Wenn die Mischung beider komplementären Ringmoleküle mit Lücke (aus Stufe 4 in Fig. 1) zur Mutagenese verwendet wird, fällt die Ausbeute um einen Faktor von 2.

Lebendmaterial
CJ236 (E. coli)
26
BMH71-18mutS (E. coli)	29
DH1 (E. coli)	30
Expressionsvektor pBEH mit ApR-Markergen	31
pBEH13ILM4 und pBEH13IFM3	rekombinante pBEH-Vektoren mit pUC13-Polylinkern und mutierten cDNA-Genen aus hIL2 bzw. hIFβ

Materialien

Puffer: TE = 10 mM Tris · HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA (pH 8,0). RB1 (Restriktionspuffer 1)=10 mM Tris · HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl₂ und 0,1 mg/ml BSA. RB2 (Restriktionspuffer 2)=50 mM Tris · HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl₂, 0,1 mg/ml BSA und 50 mM NaCl. KB (Kinasepuffer)=60 mM Tris · HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl₂ und 0,1 mg/ml BSA. MB (Mutagenesepuffer)=25,5 mM Tris · HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 4,44 mM DTT, 1,66 mM ATP und 0,888 mM jedes dNTP (26). TENA=40 mM Tris-Base, 1 mM EDTA und 20 mM NaOAc (mit HOAc auf pH 8,3 eingestellt).

Oligonucleotide: Die verwendeten Oligonucleotide wurden aus Phosphoramidit-Monomeren auf einem "Geneassembler" gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt.

Enzyme: T4- und T7-DNA-Polymerasen, T4-DNA-Ligase, T4-Polynucleotidkinase und Restriktionsenzyme waren Handelsprodukte.

Medien: LB-Medium und TB-Medium wurden nach Literaturangaben hergestellt (27 und 28).

AGE: Submarine Gele (14 cm Länge×11 cm×0,4 cm) wurden in TENA-Puffer mit einem Gehalt an 0,5 µg/ml Ethidiumbromid bei 70 bis 100 V eingesetzt. Für präparative Gele wurde niedrigschmelzende Agarose verwendet.

Arbeitsweisen

DNA-Isolation von Agarosegelen: Das Protokoll von Weislander (32) wurde folgendermaßen modifiziert. Banden wurden durch Illumination bei 360 nm sichtbar gemacht und herausgeschnitten. Die Gelstücke wurden bei 65°C geschmolzen. Ein Volumen Phenol, das mit 0,1 M Tris · HCl (pH 7,5) äquilibriert worden war, wurde auf 65°C vorgewärmt und zugegeben. Die Mischung wurde 45 s lang in einen Vortexmischer gegeben und in einer Eppendorf-Zentrifuge 2 min zentrifugiert. Die wäßrige Phase wurde in ein frisches Röhrchen überführt. Die organische Phase wurde wie oben angegeben mit einem Volumen Wasser extrahiert, das auf 65°C vorgewärmt worden war. Die resultierende wäßrige Phase wurde mit der zuerst angefallenen wäßrigen Phase vereinigt und danach zweimal mit einem Volumen Tris äquilibriertes Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (50 : 48 : 2) und einmal mit Chloroform : Isoamylalkohol (2 : 1) extrahiert. Durch Extraktion mit 1-Butanol wurde die Lösung etwa vierfach konzentriert. Es wurde 1/10 Volumen 3 M NaOAc (pH 4,8 mit HOAc) zugegeben; die Nukleinsäure wurde mit drei Volumina Ethanol gefällt, mit 70-proz. Ethanol gewaschen und getrocknet und in 0,1×TE gelöst.

Bildung eines dU-haltigen Plasmids: Man nahm Zellen vom Stamm CJ 236 und transformierte sie entweder mit pBEH13ILM4 oder pBEH13IFM3 nach einer leicht modifizierten Hanahan-Arbeitsweise (30 und 33). Einige Transformanden wurden durch Restriktionsanalyse untersucht, um das Vorliegen intakter Plasmide zu verifizieren. Für Präparationen in großem Maßstab ließ man die transformierten Zellen in TB-Medium wachsen, das 50 µg Ap/ml enthielt. Das Plasmid wurde nach einem Standard-CsCl-Gradientenprotokoll isoliert (beispielsweise 34). Alternativ kann man an eine "Minipräparationsmethode" mit zwei bis drei Phenolextraktionen denken (beispielsweise 34).

Linearisierung von dU-haltigen Plasmiden: Es wurden 8,7 pmol (20 µg) DNA mit 20 Einheiten AccI 10 h lang bei 37°C in RB1 (ergänzt mit 10 mM DTT) inkubiert. Vollständiger DNA-Verdau wurde durch AGE (1,5%) verifiziert. Die DNA wurde durch dreifache Phenolextraktion und Ethanolfällung gereinigt und in 0,1×TE gelöst.

Herstellung normaler Nicht-Zielsegmente: Normale Plasmide wurden wie für dU-haltige Plasmide angegeben isoliert. 8 pmol (17,8 µg) wurden simultat mit 37,5 Einheiten EcoRI und 40 Einheiten HindIII 5 h lang bei 37°C in RB2 (ergänzt mit 10 mMDTT) verdaut. Die vollständige DNA-Spaltung wurde wie vorstehend angegeben verifiziert. Die Mischung wurde mit Phenol extrahiert. Die wäßrige Phase wurde nach Zugabe eines Glycerin/BPB-Gemischs auf 150 mm² eines horizontalen 0,8-proz. niedrigschmelzenden Agarosegels gegeben. Nach der Elektrophorese wurde das Nicht-Zielfragment (das große Fragment) isoliert (vgl. vorstehend). Es wurde schließlich in 280 µl 0,1×TE aufgenommen. Das entsprach einer DNA-Konzentration von etwa 70ng/µl.

Bildung von Ringmolekülen mit Lücke: 1,35 pmol eines linearen dU-haltigen Plasmids und 0,5 pmol eines normalen Segmentes (Nicht-Templat) wurden auf 175 µl mit Wasser verdünnt. (Es wurden ein DNA-Verhältnis von 2,7 : 1 gewählt. Man könnte jedoch genausogut an irgendein anderes Verhältnis denken, beispielsweise ein Verhältnis von 1 : 1, um die Isolierung von Ringmolekülen mit Lücke durch Gelelektrophorese zu erleichtern; vgl. unten.) Die Mischung wurde bei 70°C 5 min lang gehalten. Danach wurde 25 µl 1,5 M KCl und 0,1 M Tris · HCl (pH 7,5), vorerwärmt auf 70°C, zugegeben; die Inkubation wurde bei 70°C weitere 3 min lang fortgesetzt. Danach ließ man das Röhrchen bei Raumtemperatur mindestens 3 min lang vor der weiteren Benutzung stehen. Die Bildung der Ringmoleküle mit Lücke wurde mit 1,5-proz. AGE bestätigt.

Linearisierung unerwünschter Ringmoleküle mit Lücke: Zu 200 µl der Mischung von Ringmolekülen mit Lücke gab man folgendes: 6,25 µl 10×RB1, 11 µl "Restriktionsoligonucleotid" (4,5 pmol/µl) und 398 µl Wasser. Nach 5 min bei 65°C und 3 min bei Raumtemperatur gab man 4,5 µl 1 M DTT, 3,5 µl 10 mM ATP und 2 µl T4-DNA-Ligase (1 Einheit/µl) zu. Nach 1 h bei Raumtemperatur und 20 min bei 70°C wurde die Lösung kurz in Eis abgeschreckt. (Es ist anzumerken, daß eine solche Ligation nur möglich ist, wenn das Oligonucleotid direkt am Lückenende hybridisiert. Der Ligationsschritt kann im Prinzip jedoch entfallen, da allein eine Hybridisierung von Oligonucleotiden ähnlicher Länge (etwa 20 nt) in der Regel bereits ausreicht, um eine vollständige Restriktionsspaltung zu erreichen (21).) Es wurden 3 µl SmaI (10 Einheiten/µl) zugegeben; die Mischung wurde bei 30°C 50 min lang inkubiert. Danach wurden 15 µl EDTA (500 mM; pH 8,0) zugegeben; die Lösung wurde auf etwa 250 µl durch Extraktion mit 1-Butanol konzentriert. Nach Phenol-Extraktion wurde die DNA mit Ethanol gefällt und in 25 µl TE aufgenommen. (Die Linearisierung des Ringmoleküls mit Lücke kann man durch AGE überprüfen. Die Mobilität des linearisierten Produkts ist - in Abhängigkeit von der Größe der Lücke - etwas größer als die des linearen Plasmids.)

Isolation von Ringmolekülen mit Lücke: Das DNA-Gemisch, das aus der Linearisierung der unerwünschten Ringmoleküle mit Lücke resultierte, wurde nach Zugabe eines Glycerin/BPB-Gemischs auf 25 mm² eines horizontalen 1,5-proz. niedrigschmelzendem Agarosegels gegeben. Nach Elektrophorese bei 70 bis 85 V wurden die Ringmoleküle mit Lücke wie vorstehend angegeben mit der Abweichung isoliert, daß man vor der Elution 4 µg tRNA (BRL) zu dem Gelstück als Träger zugab. Die tRNA verblieb in der Mischung. Sie störte die Mutagenese nicht. Die isolierten Ringmoleküle mit Lücke wurden schließlich in 45 µl 0,1×TE aufgenommen (entsprechend einer DNA-Konzentration von etwa 2 ng/µl entsprechend 1 fmol/µl).

Phosphorylierung mutagener Primer: 20 pmol des mutagenen Primers wurden in 15 µl KB, 10 mM DTT und 33 µM ATP mit 1,25 Einheiten T4-Polynucleotidkinase 20 min lang bei 37°C inkubiert. Nach 10 min bei 70°C wurde die Mischung auf Eis abgeschreckt. Sie wurde ohne weitere Reinigung zur Mutagenese verwendet.

In-Vitro-Mutagenese: Es wurden 3,0 µl phosphorylierter Primer mit 2,5 µl der isolierten Ringmoleküle mit Lücke, 1,0 µl Wasser, 0,5 µl 1,5 M KCl und 0,1 M Tris · HCl (pH 7,5) gemischt. Nach 5 min bei 65°C und 3 min bei Raumtemperatur wurden 9,0 µl MB, 2,0 µl Wasser, 1,75 µl T4-DNA-Ligase (1 Einheit/µl) und 0,25 µl T4-DNA-Polymerase (4,4 Einheiten/µl) zugegeben; die Mischung wurde 10 min lang bei 26°C und danach 110 min lang bei 37°C inkubiert. Danach wurden 2 µl 150 mM EDTA (pH 8,0) zugegeben.

Transformation von BMH71-18mutS: Es wurde 1 µl der Mischung der In-Vitro-Mutagenese verwendet, um direkt 80 µl kompetente Zellen BMH71-18mutS gemäß den gemachten Angaben zu transformieren (30 und 33). Nach einstündiger Inkubation in SOC-Medium wurden 200 µl (50%) der Zellsuspension verwendet, um 2 ml LB-Medium mit einem Gehalt an Ap (50 µg/ml) zu inokulieren. Diese Kultur ließ man über Nacht wachsen.

Transformation von DH1 und Mutantenscreening: Aus 1 ml der Übernachtkultur der transformierten BMH71-18mutS-Zellen isolierte man Plasmid-DNA in kleinem Maßstab (beispielsweise 34); man nahm in 38 µl 0,1×TE auf (ohne RNase). Man benutzte 1 µl einer 1 : 100-Verdünnung dieses Präparates, um 20 µl kompetente Zellen DH1 zu transformieren (30 und 33). 3 µl der Transformation plattierte man auf LB-Platten mit einem Gehalt an Ap (50 µg/ml) und erhielt 100 bis 300 Kolonien. Von einigen dieser Kolonien ließ man Übernachtkulturen wachsen; Plasmide wurden in kleinem Maßstab hergestellt und durch Restriktionsverdau oder eine geeignete Einzelbasensequenzierung auf die Mutation hin gescreent.

dsDNA-Sequenzierung: Es wurden Plasmidpräparate in kleinem Maßstab zur Dideoxy-DNA-Sequenzierung benutzt (35). Man löste DNA aus 2,8 ml einer Übernachtkultur in 100 µl 0,1×TE. Eine RNase-Behandlung oder RNA-Abtrennung unterblieb. 80 µl dieses Präparats wurden gemäß Hattori & Sakaki denaturiert (36). Die DNA wurde in 32 µl Wasser gelöst. 8 µl dieser Lösung (etwa 0,25 pmol Plasmid) nahm man für eine vollständige Sequenzierungsreaktion (also mit allen vier Basen). Man benutzte unmodifizierte T7-DNA-Polymerase. Das Protokoll von Tabor & Richardson (37) wurde mit den folgenden Modifikationen benutzt. Das Hybridisieren des Primers wurde 5 min lang bei 65°C durchgeführt, wonach man 3 min lang bei Raumtemperatur kühlte. Die molaren Primer-Templat-Verhältnisse variierten im Bereich von etwa 20 bis 32. Bei der Markierungsreaktion waren die Konzentrationen von dCTP, dGTP und dTTP jeweils 0,15 µM. Das Signal/Untergrund-Verhältnis der Autoradiographien ließ sich im allgemeinen nicht von dem einer mit einem CsCl-Gradienten gereinigten DNA unterscheiden.

Nachstehend wird die Erfindung mit Figuren und Beispielen näher erläutert.

Fig. 1: Schematische Erläuterung der Bildung eines einzigen Ringmoleküls mit Lücke, das eine Strangselektion gestattet. Normale DNA-Stränge sind von dU-haltigen DNA-Strängen durch dickere Linien unterschieden. A, B, C und D bezeichnen Restriktionsstellen. Bei den ds-Molekülen bezeichnen die schwarzen Bereiche Zielsegmente und die weißen Bereiche Nicht-Zielsegmente für die Mutagenese. Bei den Ringmolekülen mit Lücke ist das Zielsegment mit dem ss-Bereich identisch. Die linearen Produkte, die beim Rehybridisierungsschritt anfallen, sind der Klarheit halber weggelassen.

Fig. 2: für Mutagenesen verwendete Plasmide. Die schwarzen Segmente bezeichnen das IL2- bzw. IFβ-Gen. Benutzte Restriktionsstellen sind angegeben.

Fig. 3: Überprüfung der Bildung von Ringmolekülen mit Lücke durch AGE. Bahn 1: Mischung des AccI-linearisierten Plasmids (lin) und des EcoRI/HindIII-Nicht-Zielfragments (fr); Bahn 2: Wie Bahn 1, jedoch nach dem Denaturierungs/Renaturierungs-Schritt (gc=Ringmolekül mit Lücke); Bahn 3: Vergleichssubstanzen: lineares Plasmid (lin) und offen zirkuläres Plasmid (oc).

Fig. 4: Beispiele für Mutationsscreening. IFβ-Mutagenese Nr. 11, Analyse durch Fnu4HI-Verdau; Bahn RF: nicht-mutagenisiertes Plasmid; Bahnen 1 bis 8: mutagenisierte Plasmide. Die Pfeile bezeichnen das bei Mutagenese gespaltene Fragment. (Die resultierenden kleineren Fragmente wurden auf diesem Gel nicht aufgelöst.)
IFβ-Mutagenese Nr. 12, Analyse durch XmnI-Verdau; Bahn RX: nicht-mutagenisiertes Plasmid; Bahnen 9 bis 16: mutagenisierte Plasmide. Die Pfeile bezeichnen die beiden nur durch mutagenisierte Plasmide gebildeten Fragmente.
IL2-Mutagenese Nr. 30, Analyse durch HhaI-Verdau; Bahn RH: nicht-mutagenisiertes Plasmid; Bahnen 17 bis 23: mutagenisierte Plasmide. Die Pfeile bezeichnen die beiden nur durch mutagenisierte Plasmide gebildeten Fragmente.

Beispiel 1

Ausgegangen wurde von eukariotischen Expressionsvektoren (31), in die die cDNA-Gene von hIL2 bzw. hIFβ eingesetzt worden waren. Die resultierenden Plasmide pBEH13IL und pBEH13IF (Fig. 2) oder Mutanten dieser Plasmide wurden zur Mutagenese verwendet.

Ein dU-haltiges Plasmid wurde aus dem Stamm CJ 236 (26) isoliert und mit AccI linearisiert. Das normale Plasmid wurde mit EcoRI und HindIII gespalten; das Nicht-Zielfragment (großes Fragment) wurde durch AGE isoliert. Beide DNA-Moleküle wurden gemischt, denaturiert und renaturiert. Die Bildung von Ringmolekülen mit Lücke wurde durch AGE bestätigt (Fig. 3).

Das "Restriktionsoligonucleotid" GAGGATCCCCGGGCGAGCTCG ist komplementär zum "EcoRI-Ende" der Lücke des unerwünschten Ringmoleküls mit Lücke (eine Sequenz, die sowohl pBEH13IL als auch pBEH13IF enthalten). Es enthält u. a. eine SmaI-Sequenz (unterstrichen). Es wurde an das erwähnte Ringmolekül hybridisiert und mit dem Ende der Lücke ligiert, um das Hybrid zu stabilisieren. Nach Hitzeinaktivierung der DNA-Ligase wurde die Mischung mit SmaI inkubiert und danach durch AGE aufgetrennt. Das verbliebene Ringmolekül mit Lücke wurde isoliert.

In Abhängigkeit von verfügbaren Restriktionsstellen und der vorgegebenen Sequenz im ss-Bereich nahe dem Duplex-3′-Terminus des unerwünschten Ringmoleküls mit Lücke ist es in einigen Fällen möglich, das "Restriktionsoligonucleotid" durch begrenzte enzymatische Verlängerung in Gegenwart von weniger als allen vier dNTP-Molekülen zu ersetzen. Man muß jedoch beachten, daß sich mit vielen Restriktionsenzymen nur eine mäßige Spaltung erreichen läßt, wenn der ds-Bereich sehr nahe an der Erkennungssequenz endet.

Das isolierte Ringmolekül mit Lücke war das Substrat für die Hybridisierung der mutagenen Oligonucleotide. Diese Oligonucleotide enthielten Insertionen von 24 bis 45 Nukleotiden (nt). Die Länge ihrer hybridisierenden Segmente betrugen 17 bis 20 nt (5′) bzw. 11 bis 18 nt (3′). Das Auffüllen der Lücke und die Ligation wurden durch T4-DNA-Polymerase bzw. T4-DNA-Ligase katalysiert. Die resultierenden Reaktionsmischungen wurden zur Transformation des Stammes BMH71-18mutS herangezogen (29).

Man isolierte die Plasmide einer Übernachtkultur der Transformanden und benutzte sie zur Transformation des Stammes DH1 (30). Diesmal wurden die Zellen ausplattiert. Man präparierte die Plasmide einiger der resultierenden Kolonien und screente sie auf die gewünschten Mutationen. Dazu führte man eine Restriktionsanalyse durch, da jede Insertion eine neue Restriktionsstelle einführte. Ein Beispiel für ein derartiges Screening ist Fig. 4 zu entnehmen. Insgesamt wurden 10 Mutagenesen für beide Gene durchgeführt. Die Ausbeuten sind Tabelle 1 zu entnehmen. Insgesamt wurden 63 Klonen analysiert, von denen 38 positiv waren, was einer Mutagenesegesamtausbeute von 60% entsprach. Wenn also vier Kolonien gescreent werden, ist die Wahrscheinlichkeit, einen mutierten Klon zu finden, größer 95%.

Tabelle 1. Mutageneseausbeute

Beispiel 2

Beispiel 1 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß die Mischung der beiden komplementären Ringmoleküle mit Lücke (aus Stufe in Fig. 1) zur Mutagenese verwendet wurde. Unter diesen Bedingungen fiel die Ausbeute um den Faktor 1,9 (32% positive Plasmide).

Beispiele 3 und 4 (Wahl der DNA-Polymerase)

Beispiel 1 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß für die Verlängerungsstufe Klenow-Enzym bei Raumtemperatur eingesetzt wurde (Beispiel 3).

Danach wurde Beispiel 1 mit T4-DNA-Polymerase bei 37°C wiederholt (Beispiel 4). Die Mutantenausbeute erhöhte sich um 10 bis 40%.

Diese Ergebnisse werden durch andere Beobachtungen gestützt (26 und 44). Der Grund für die Zunahme kann die verminderte Fähigkeit des T4-Enzyms im Vergleich zur Klenow-Polymerase sein, ds-Strukturen zu verändern (45). Andererseits wird die T4-Polymerase leichter durch Sekundärstrukturen in ihrem Templat inhibiert. Wenn diese Eigenschaft die Verwendung des T4-Enzyms auf bestimmte Template einschränkt, so kann der Fachmann auf eine andere DNA-Polymerase ausweichen.

Das IFβ-Gen enthält eine vollständige Umkehrwiederholung von 10 bp (Fig. 5), die nahe dem "priming end" des Ringmoleküls mit Lücke aus pBEH10IF angeordnet ist. Dennoch konnte die T4-Polymerase die Lücke vollständig auffüllen, wie sich durch AGE ergab. Dieses Ergebnis legt nahe, daß das T4-Enzym für die Mutagenese der meisten Template geeignet sein sollte.

Abkürzungen
AGE
Agarose-Gelelektrophorese
Ap	Ampicillin
bp	Basenpaare
BPB	Bromphenolblau
BSA	Rinderserumalbumin
ds	doppelsträngig
DTT	Dithioerythritol
hIFβ	Humaninterferon-β
hIL2	Humaninterleukin-2
nt	Nukleotide
ss	einzelsträngig

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Claims (12)

1. Verfahren zur Herstellung eines Plasmid-Konstrukts für oligonucleotid-induzierte Mutagenesen, dadurch gekennzeichnet, daß man

• (a) einen Bakterienstamm (dut⁻ ung⁻) mit einem Plasmid transformiert, das Plasmid mit Hilfe des Stammes einem dU-Einbau unterwirft und danach wieder isoliert,
• (b) das dU-haltige Plasmid an einer Schnittstelle oder vielen Schnittstellen schneidet, die alle außerhalb des zu mutagenisierenden Bereichs liegen,
• (c) aus dem in die Stufe (a) einzusetzenden Plasmid den ganz oder teilweise zu mutagenisierenden Bereich herausschneidet, den herausgeschnittenen Bereich entfernt und das geschnittene Plasmid isoliert,
• (d) das gemäß Stufe (b) geschnittene dU-haltige Plasmid und das gemäß Stufe (c) erhaltene geschnittene Restplasmid mischt, durch De- und Rehybridisierung der DNA-Doppelstränge zwei komplementäre Ringmoleküle bildet, die den Zielbereich der Mutagenese in einzelsträngiger Form enthalten,
• (e) und gegebenenfalls eines der beiden komplementären Ringmoleküle für die Mutagenese unwirksam macht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das in der Stufe (e) unwirksam zu machende Ringmolekül abtrennt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das in der Stufe (e) unwirksam zu machende Ringmolekül selektiv spaltet und das entstehende Fragment oder die entstehenden Fragmente vom gewünschten zirkulären Molekül nach bekannten Methoden wie z. B. Gelelektrophorese, Gradientenzentrifugation oder chromatographischen Verfahren abtrennt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur selektiven Spaltung ein Oligonucleotid, das eine Restriktionssequenz enthält, an das zu spaltende Ringmolekül hybridisiert und die Spaltung mit Hilfe eines Restriktionsenzyms durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur selektiven Spaltung ein Oligonucleotid, das ein "Haarnadelsegment" mit einer Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym der Klasse IIS trägt, an das zu spaltende Ringmolekül hybridisiert und die Spaltung mit Hilfe des betreffenden Restriktionsenzyms durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur selektiven Spaltung ein Oligonucleotid, das einen Baustein wie EDTA trägt, der eine chemische Spaltung von Nukleinsäuren erlaubt, an das zu spaltende Ringmolekül hybridisiert und damit die Spaltung durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur selektiven Spaltung den die Lücke enthaltenden Strang des zu spaltenden Ringmoleküls enzymatisch limitiert verlängert, bis eine spaltbare doppelsträngige Restriktionssequenz entstanden ist, und die Spaltung mit Hilfe eines Restriktionsenzyms durchführt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das in der Stufe (b) zu schneidende Plasmid an einer im Plasmid nur einmal vorkommenden Schnittstelle schneidet.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man an einer nur einmal vorkommenden Schnittstelle schneidet, die jeweils mindestens 10, vorzugsweise mindestens 20 und insbesondere mindestens 50 bp von den Schnittstellen des Bereichs entfernt ist, der gemäß Stufe (c) herausgeschnitten ist.

10. Verfahren zur Herstellung eines Plasmids mit mutagenisiertem DNA-Bereich, dadurch gekennzeichnet, daß man

• (a1) im Anschluß an die Stufen (a) bis (e) gemäß Anspruch 1 oder
• (a2) ausgehend von einem Plasmid-Konstrukt, das nach dem Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 9 erhalten wurde, an den ss-Bereich des Plasmid-Konstrukts ein mutagenes Oligonucleotid bindet,
• (b) das erhaltene Substrat enzymatisch zu einem vollständig doppelsträngigen zyklischen Heteroduplex-Plasmid ergänzt,
• (c) einen Bakterienstamm mit dem Heteroduplex-Plasmid transformiert und ein Kulturmedium mit dem Transformationsprodukt inokuliert und
• (d) das angefallene Plasmidgemisch auf das in gewünschter Weise mutagenisierte Plasmid screent.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man anstelle von Stufe (d) gemäß Anspruch 10

• - mit Plasmid-Material aus dem angefallenen Plasmidgemisch einen beliebigen Bakterienstamm transformiert, erneut ein Kulturmedium mit dem Transformationsprodukt inokuliert und
• - das angefallene Plasmidgemisch auf das in gewünschter Weise mutagenisierte Plasmid screent.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Stufe (c) einen Bakterienstamm (ung⁺) für die Transformation verwendet.