WO1998053056A2 - Herstellungsverfahren für lange dna-konstrukte - Google Patents

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WO1998053056A2
WO1998053056A2 PCT/DE1998/001421 DE9801421W WO9853056A2 WO 1998053056 A2 WO1998053056 A2 WO 1998053056A2 DE 9801421 W DE9801421 W DE 9801421W WO 9853056 A2 WO9853056 A2 WO 9853056A2
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Dirk Schindelhauer
Howard J. Cooke
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Dirk Schindelhauer
Cooke Howard J
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing long DNA constructs, in particular artificial chromosomes, and vectors that can be used for this purpose, and to a method for providing large DNAs, especially BACs or PACs.
  • MACs are linear DNAs with a size of several 100 kb. They are characterized by various components. For each MAC, these are a centromer, two terminal telomeres and a chromosome arm between them, which has at least one "origin of replication". The above genes can be applied to the latter component.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method with which long DNA constructs, in particular MACs, can be produced. According to the invention, this is achieved by the subject matter in the claims.
  • the present invention thus relates to a method and vectors with which long DNA constructs, in particular MACs, can be produced.
  • Another object of the present invention is a method by which large DNAs, e.g. BACs "bacterial artificial chromosomes” or PACs "phage P1 artificial chromosomes", in particular components of MACs, can be provided in large quantities and stability.
  • the present invention is based on the applicant's knowledge that large DNAs such as BACs or PACs can be recombined with one another in molten agarose. He has found that it can be used to make MACs if the large DNAs separate the individual components of MACs, such as a centromer, e.g. an alpha satellite DNA, two telomeres, e.g. the
  • Sequence (TTAGGG) n 135 , and have a chromosome arm containing at least one "origin of replication".
  • bacteria containing large DNAs such as BACs or PACs can be mixed with agarose, resulting in agarose blocks after the agarose has cooled.
  • the chromosomal DNA of the bacteria can be cleaved in these, while the large DNAs remain uncleaved.
  • a restriction enzyme is inserted into the blocks, which cleaves only the bacterial chromosome. This can then be removed from the blocks by gel electrophoresis, leaving only the large DNAs in the blocks.
  • the applicant has recognized that the large DNAs as well as the DNA constructs in the agarose gel blocks are stable and can be stored for a long time.
  • the applicant's knowledge is used for a method for producing DNA constructs, comprising the combination of two
  • DNA construct indicates DNA of any kind and length, which can be circular or linear.
  • the DNA is linear and has a length of several 100 kb.
  • the DNA is an artificial mammalian chromosome (MAC). It is particularly preferred if the MAC comprises one or more genes whose expression is desired. Examples of such
  • Genes are those that are defective in connection with diseases, e.g. Cystic fibrosis, stand.
  • the expression "combination by means of recombination” indicates that two DNAs can recombine with one another. This can be done by overlapping sequences. It can be advantageous if the sequences comprise recombination-specific sequences, such as lox or FRT sequences, the recombination then taking place in the presence of a recombinase, such as Cre or Flp recombinase.
  • the recombination of the two DNAs preferably leads to a MAC. In this case, the DNAs have all the elements necessary for one
  • MAC are important. You can also have one or more genes whose expression is desired. Please refer to the above explanations. E.g. combining a MAC from two DNAs, it can be beneficial if one of the DNAs is in a linear form and the other in a circular form. The latter can contain one or more genes whose expression is desired.
  • the linear DNA can contain a centromer and terminal telomeres, these being oriented in opposite directions.
  • the two DNAs can also be in linear form, each DNA having a telomer which is present in a different orientation in one DNA at the left end and in the other DNA at the right end. Furthermore, the two DNAs can be circular
  • the present invention further relates to vectors which contain one or more, in particular two, telomers.
  • Such vectors are suitable for carrying out the method according to the invention.
  • Particularly preferred are vectors which also have two resistance genes, one, for example kanamycin, between the telomer ends and the other, for example ampicillin, between the telomer beginnings.
  • Vectors are also preferred which furthermore have recognition sequences for rare and / or one or multiple-cutting restriction enzymes between the beginning and / or end of the telomeres.
  • Particularly preferred vectors are the ditelomeric vector PTAT and the monotelomeric vectors PT1, PT1 L, PT1 LA and PT1 LAS. Please refer to the examples.
  • the vectors according to the invention can be present as such or in a kit. This can also contain a recombinase, such as Cre or FLP recombinase, and customary auxiliaries, such as buffers, solvents, etc.
  • Another object of the present invention is a method for
  • Such a process comprises the following process steps:
  • melted agarose indicates a so-called “low melting agarose”, which melts at a low temperature.
  • gel electrophoresis indicates that the agarose blocks are subjected to conventional gel electrophoresis, in particular pulse field gel electrophoresis. Please refer to the examples.
  • large DNA includes large extra chromosomal DNA, e.g. BACs or PACs.
  • the present invention thus represents a breakthrough in the targeted therapy of defective genes.
  • Fig. 1 Provision of concentrated, intact PAC-DNA in agarose gel blocks. Pulse field gel electrophoresis in 1% agarose and subsequent ethidium bromide staining to check the cleavage of the E. coli chromosomes with the rarely cutting restriction nuclease AscI.
  • the uncleaved, circular, intact PAC-DNA which does not migrate during pulse field gel electrophoresis (1 6h, 200V, 5-20s switching time, 12 ° C, 0.5xTAE buffer), remains in the blocks (5 blocks of the alpha Chromosome X satellite PACs with a length of 125 Kb), which are removed from the gel pocket (arrow) before staining and stored in TE. In this way, the high concentration of the PAC DNA in the blocks remains unchanged during the separation of the E. coli DNA. 1/3 of
  • Block volume corresponds to the proportion of bacteria which, depending on the number of copies (with or without induction of the lytic replicon of the PACs by IPTG) carry about 2.5 to 10 PAC molecules per cell.
  • the E. coli chromosome is approximately 24 times larger than a 200 kilobase PAC clone. If the PACs are used as "unit copy" plasmids (same copy number as the E. coli chromosome) without induction of the lytic replicon with IPTG, up to about 1/24 of the amount to be seen can be seen (the fragmented E. coli Chromosome) can be expected as intact PAC-DNA in the block. These are very large amounts of intact DNA that allow further in vitro manipulation of these long molecules.
  • Fig. 2 Pulse field gel electrophoresis stained with ethidium bromide.
  • BssHIl linearized alpha-satellite PACs from chromosome X (lanes 1 -3, 1 25 kb) and chromosome 1 7 (lanes 4-6, 140 kb) were combined with an Mlul fragment containing the human HPRT gene locus (lanes 1 -6, 95 kb).
  • the long recombination products with the predictable lengths of 21 6 and 231 kb cannot be seen in the controls without Cre recombinase (lanes 1 and 4) and are clearly visible in the presence of the Cre recombinase (lanes 2 and 5, in the presence of 1 % LMP Agarose).
  • Fig. 4 Test for the suitability of the mutated lox site from PCYPAC2N for the
  • the lox site (black triangle) comes from a precursor vector (pAD I OSacBII) from which the PAC vector was developed. It has no function in PACs and differs from the originally published loxP sequence (sequence positions 201 6-2049 of Genbank Acc. Nr.
  • the lytic replicon of the P1 phage can be induced with IPTG.
  • the restriction sites Nar1 nucleotide item 1 1 991 in U091 28
  • Spei nucleotide item 1 605 in U091 28
  • BstXI item 291 7 in U091 28
  • Bfrl item 3309 in U091 28
  • the "multicopy" plasmid vector pSXNeo1 35lsce was previously equipped with a synthetic Iscel site from complementary oligonucleotides (oligos G438 and G439). It contains 135 repetitive units of the TTAGGG sequence in tandem order (deLange T., et al. 1 990 Mol. Cell. Bio /. 10: 51 8-527), whose function to form de novo telomeres in
  • the ampicillin resistance gene from the vector SP73 (between nucleotide position 939-2202 of Genbank Acc. No. X65333) was amplified with the primers ASal and ABs. The choice of these primer positions ensured that the gene contains transcription termination signals in its 3 'end, but that the pBR-based origin of replication with many copies per cell (ori) is excluded.
  • the Telomeric sequence can be cleaved together with the Notl and Iscel sites at the end of the telomeric sequence using Clal and Xbal, and cloned into suitable cleavage sites with the given orientation.
  • Fig. 6 Map of the monotelomeric vector PT1.
  • a 10.3 kb fragment is produced which only contains the "unit copy" P1 phage replicon, the kanamycin resistance gene and contains the lox site of the PAC vector. It has suitable ends for cloning the Xbal / Clal cleaved 0.9 kb telomeric sequence. All restriction recognition sequences are lost on both ends by ligation, so that the cloning of the same telomer sequence from the identical gel elution sequence
  • This vector is suitable for cloning long genomic fragments into the unique restriction site Nhel (between Tel 1 35 and lox, not shown, at nucleotide position 1 71 6 in Genbank Acc. U091 28) and for the combination with a second one To use telomer sequence bearing component.
  • Fig. 7 Map of the monotelomeric vector PT1 L.
  • Plasmids PT1 with Bfrl (nucleotide position 3309 in Genbank Acc. U091 28) and BstXI (nucleotide position 291 7 in Genbank Acc.
  • Fig. 8 Checking the newly integrated restriction sites of two
  • Fig. 9 Map of the monotelomeric vectors PT1LA and PT1LAS. With the primers ABs and ASal, a 1260 bp fragment containing the ampicillin resistance gene (corresponds to positions 939 - 2202
  • Genbank Acc. X65333 Genbank Acc. X65333
  • amplified from the vector pSXneo135lscel and cleaved with the restriction nucleases BssHII and Sall, the sites of which were created with modified primer sequences.
  • the digested, eluted PCR fragment was ligated to the BssHII and Sall digested, eluted plasmid PT1L and cloned.
  • the planned product PT1LA and another product PT1 LAS were created, which integrated an additional sequence of 1.8 kb (spacer). An additional Nhel site was introduced as a result of the additional sequence (spacer).
  • PT1LA is suitable for inserting long genomic fragments into the unique restriction site
  • Nhel (between Tel 135 and lox, nucleotide position 1716 in Genbank Acc. U09128) to be cloned and used in combination with to use a second component carrying a telomeric sequence.
  • Fig. 10 Checking the vectors PT1 LA and PT1 LAS by restriction analysis. Agarose gel electrophoresis (0.8%) and ethidium bromide
  • Lanes 1 -5 PT1 LA; Lanes 6-10: PT1 LAS; Lanes 1, 6: uncleaved plasmid DNA; Lanes 2.7: BamHI; Lanes 3.8: Notl; Lanes 4,9: Notl and Xbal; Lanes 5, 10: Xbal; Lane 1 1: 1 kb ladeder, Gibco BRL.
  • the small BamHI fragment and the small Notl / Xbal fragment as well as the total length is around 1.8 in PT1 LAS
  • Fig. 1 1 Activation of the Narl cleavage in the presence of large amounts of pBR328.
  • the Narl site introduced with the synthetic linker cannot be split with Narl as long as no supporting Narl site is offered in ice or trans.
  • Fig. 1 2 Review of the T4 DNA ligation of the second telomer fragment on PT1 LAS. 50% of the ligation batch was separated for 24 h at 30 V in 0.8% agarose and stained with ethidium bromide. Lane 4: the reaction mixture without ligase. Lane 5: with ligase. The 1 3.9 kb Narl / Xbal fragment has taken up monomers (arrow) and oligomers of the 0.9 kb Clal / Xbal telomer fragment. Lane 1: 1 kb ladder, Gibco BRL, the top band corresponds to a length of 1 2 kb.
  • Fig. 1 3 Map of the ditelomeric vector PTAT.
  • the vector PT1 LAS with the first telomer sequence originates from the identical preparation of the material already used for the cloning of the first telomer sequence and thus contained Xbal and Clal ends for the directed integration, the vector PT1 LAS with the second telomer sequence.
  • Fig. 1 4 Restriction map of the ditelomeric vector prototype PTAT. The restriction interfaces shown are used to check the cloning. The two Notl positions (8Bp rare cutter), as well as the
  • the arrowheads of the telomer sequences (Tel 1 35) show the
  • the interfaces of the restriction nucleases Accl, Bfrl, Nhel are not found in one of the starting clones used (PCYPAC2N- ⁇ pUC, pSXNeo1 35lscel) in the arrangement as they occur in the spacer.
  • the origin of the spacer DNA is not known, it could come from the E. coli strain used.
  • the vector PT1 LA which contains only the ampicillin resistance gene and no spacer, the cloning of the second telomeric sequence was not successful.
  • the restriction-mapped spacer sequence could have a stabilizing effect on a ditelomeric plasmid. PCRs were carried out to further check the structure.
  • primer pairs gave the expected products: Kr and Kf; Kr and G439; G438 and LPF; LPF and LPR; LPR and ABs; ASal and ABs; the long PCR ASal and G438 gave no product (1 min 95 ° C, 1 min 62 ° C, 4 min 72 ° C, 25 cycles, Taq polymerase with
  • Fig. 1 5 Checking the integrity of the ditelomeric vector PTAT using restriction analysis: agarose gel electrophoresis 0.8% and ethidium bromide staining. Lanes 1, 1 9: 1 kb ladder (Gibco BRL);
  • Lane 2 uncleaved plasmid DNA
  • Lanes 3-18 digested plasmid DNA with the enzymes: 3: Bfrl; 4: Bfrl and Nhel; 5: Nhel 6: Xbal; 7: Xbal and Sall; 8: Sall; 9: Sall and BssHII; 1 0: BssHII 1 1: Accl; 1 2: BamHI; 1 3: BamHI and Sall; 1 4: Notl and Sall; 1 5 Notl and Acel; 1 6: Notl and Nhel; 1 7: Notl and BssHII; 1 8: Notl.
  • Fig. 1 6 The nucleotide sequences of the synthetic primers used for
  • Fig. 1 8 The cloning of a chromosomal component, which from a
  • Chromosome poor with a gene (G), in the ditelomeric vector PTAT or its descendants, enables the free selection of the centromer component (Z) and its insertion in a single in vitro step.
  • the recombination product consists of assembled, identical material that does not have to be analyzed again.
  • Fig. 1 9 The cloning of a centromer component (Z) in the ditelomeric vector equipped with one or more markers (M) leads to the MAC-based construct TZT. It allows the combination of any circular component (G). Different therapeutic genes can thus be inserted into the basic MAC construct using IGSSR in a single in vitro step. Knowing the structure of the two substrates gives the exact structure of the MAC construct produced without the need for further analysis.
  • Example 1 Combination of PACs using lox-Cre recombinase in melted agarose.
  • the DNA in the block is treated with a restriction nuclease that cuts not in the PAC but in the E. coli chromosome (in this case Ascl).
  • the restriction cleavage is carried out in the manufacturer's buffer, to which 0.75 mM spermidine / 3HCI and 0.3 mM spermine / 4HCI is added.
  • the blocks are then treated with Proteinase K.
  • the blocks are loaded onto a 1% agarose gel for pulse field gel electrophoresis, which is not sealed with melted agarose.
  • the blocks containing circular PAC DNA are freed from the gel pockets and in TE Stored at 4 ° C.
  • the gel is stained with ethidium bromide.
  • the E. coli fragments show a pattern which is located at a clear distance from the gel pockets (FIG. 1).
  • the blocks contain large plasmids with a concentration which corresponds to up to 1/3 of the concentration of the respective plasmid DNA in E. coli
  • the PACs to be linked are restriction-mapped and digested with selected restriction nucleases to generate fragments that overlap in the lox site and point in opposite directions.
  • BssHII was used for the alpha satellite PACs and Mlul for the HPRT gene PAC (Fig. 3).
  • Complete cleavage is checked with 1/10 of a small block (approximately 15 ⁇ ) cut from the middle of the small block by means of pulse field gel electrophoresis and ethidium bromide staining.
  • the 9/1 0 of both blocks with the DNA to be connected are 4 x 30 min in CreSS buffer (50 mM Tris / HCl pH 7.4, 10 mM MgCl2, 30 mM NaCl, 0.75 mM
  • the blocks solidify by cooling to room temperature.
  • the blocks are treated with Proteinase-K and can be stored in Proteinase-K buffer (contains SDS and EDTA, for long-term storage for several months) or in TE. 1/4 of a resulting block is analyzed by pulse field gel electrophoresis and ethidium bromide staining (Fig. 2).
  • sequence specific recombination e.g. can be carried out via the FLP recombinase with the recognition sequence FRT.
  • Example 2 Production of vectors according to the invention.
  • a "unit copy" plasmid was produced from the PAC vector PCYPAC2N (FIG. 5). Furthermore, the multitude of
  • telomeric sequence was not known (Fig. 4).
  • the PAC vector DNA was cleaved with the restriction nucleases Narl and Spei (Boehringer enzymes and buffers). The DNA was then purified by ethanol precipitation, in alkaline buffer
  • Ligation batches were analyzed by agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining. The other 50% were dialyzed for 2 hours against distilled water (drop dialysis membrane, Gibco BRL) and used to transform 40 ⁇ l of electrocompetent cells (ElectroMAX DH 10B Cells, Gibco BRL). The transformation was carried out in a 5 10 ⁇ l cuvette at 1.8 KV by electroporation. Kanamycin-resistant clones (30 ⁇ g / ml) were tested for the presence of the telomer fragment by means of PCR from bacterial colonies. The primers LPF and G438 were used for this (62 ° C., 30 cycles, Taq polymerase; see FIGS. 14 and 16).
  • telomeric sequence if the full length is simultaneously detected in a restriction map. To get out of the bacteria that carry "unit copy" plasmids and therefore have up to 50 times fewer plasmid molecules than
  • PT22 give a double-stranded linker for this purpose (sequences in Fig. 1 6).
  • the overhanging ends of the linker are ligated in the given orientation into the singular Bfrl and BstXI sites.
  • 10 ng of the Bfrl / BstXI (Boehringer) cleaved, non-dephosphorylated PT1-DNA were eluted and used with 1 ⁇ g of unphosphorylated linker DNA. (Transformation as described above).
  • Two of the four clones analyzed by restriction mapping contained all new restriction sites. The only exception was initially the integrated Narl site (Fig. 8).
  • the sequence used on the oligonucleotides corresponds to a Narl site that is only cleaved when other effects are more narl split sites in ice or trans. If ten-fold excess of pBR328 is mixed in for the cleavage reaction, the integrated Narl site can be cleaved satisfactorily (FIG. 11).
  • the ampicillin resistance gene (Amp) was moved from the vector SP73 (FIG. 5) into the newly created restriction sites BssHII and Sall of the vector PT1 L cloned. Particular care had to be taken to ensure that the "multy-copy" origin of replication (ori) of the pBR plasmids, which is close to the 3 'end of the ampicillin resistance gene, is not also integrated into the "unit-copy” plasmid in order to avoid the Keep the number of copies as small as possible.
  • the amp fragment should reach right up to the ori in order to
  • the Amp gene was amplified on a 1260 bp fragment, the PCR product was cleaved at the ends with the nucleases Sall and BssHII, eluted, purified and cloned into the dephosphorylated, de-phosphorylated, eluted vector PT1 L which was cleaved from Sall and BssHII. It two colonies were obtained which were double resistant to ampicillin and kanamycin. Both colonies were positive for PCR with primers G438 and LPF to control the presence of the first telomeric sequence, positive for PCR with primers ASal and ABs (corresponds to resistance to ampicillin) and positive for PCR with primers ABs and LPR (confirmation of the planned orientation).
  • PT1 LA, 1 2, 1 Kb had the predicted structure, in the restriction analysis and the other clone (PT1 LAS, 1 3.9 Kb) had an additional 1.8 kb sequence at the 3 'end of the amp Gene integrated (Fig. 9 and 10).
  • the primer binding site for ABs has been preserved directly in 3 'of the amp gene, but the BssHII site itself has been displaced by 1.8 Kb by the integrated sequence.
  • Clone PT1 LAS was obtained from the ligation reaction.
  • the restriction sites Narl and Xbal were introduced into the linker DNA of PT1 L (and thus PT1 LAS).
  • the restriction site Nar1 could be cleaved by admixing a ten-fold excess of pBR328 plasmid (FIG. 11).
  • the Narl and Xbal-cleaved 1 3.9 Kb fragment of the plasmid PT1 LS was dephosphorylated with alkaline phosphatase, phenolized once, eluted from 1% LMP agarose gel after electrophoresis and purified using a Geneclean kit. The procedure was the same as for the cloning of PT1.
  • the ligation was checked (Fig. 1 2).
  • plasmid which can be stably propagated in order to clone long fragments as chromosomal components and to connect them in molten agarose with a second stably cloned chromosomal component.
  • the 6.1 Kb Notl or Iscel fragment of PTAT which has telomer sequences at both ends, can be modified for various purposes.
  • the integrated restriction sites Xbal, Sall and BssHII can be used as unique or other sites.
  • an MCS multiple cloning site
  • MCS multiple cloning site
  • existing multiple restriction sites could be modified by introducing mutations.
  • coli or mammalian cells can be used or DNA fragments for the purpose of detecting MACs in living cells (eg via specific DNA recognition sequences of binding proteins which are coupled to gelly fish protein (GFP)).
  • GFP gelly fish protein
  • Another possibility of modification would be the cloning of a DNA fragment from PTAT or descendants, which contains both telomer sequences (eg the 6, 1 Kb Notl fragment), into another existing vector (e.g. BAC vectors, other PAC vectors, or other vectors ) or in existing genomic clones.
  • PTAT versions could then be used for cloning or recloning a long genomic section (e.g. genomic copy of a gene or centromere candidate sequence).
  • the resulting chromosome arm which contains telomeres at both ends, can be mixed with any number in molten agarose circular centromer candidate sequences that are appropriate
  • Recombination site included for PTAT this would be, for example, every PAC clone of a genomic bank that was produced with the vector PCYPAC2N).
  • the structure of the MAC constructs would already be known from the analysis of the individual components (FIG. 1 8).
  • the recombination in molten agarose requires the recombination products to be obtained in the form of agarose blocks, which means that Another advantage for the recovery of the recombination product arises. If both components are used as circular DNA in the recombination reaction, large circular products are created. These can be completely freed from the hardly unavoidable, small proportion of partially degraded DNA by subsequent pulse field gel electrophoresis. In turn, only intact DNA remains in the block.
  • telomeres After cleavage directly at the ends of the telomeres, only two easily separable fragments run into the gel. The "small" ditelomeric fragment that did not recombine and the recombined "long" ditelomeric MAC construct. The portion of the circular component that did not recombine remains in the block.
  • the MAC containing the most efficient centromer can be determined by transfecting different constructs. A "best" centromer identified in this way would be cloned into improved PTAT versions to obtain a MAC base vector TZT (Telomer-Centromer-Telomer).
  • G438 5'-GGCCGCGCTAGGGATAACAGGGTAATATA-3 '
  • G439 5'-GGCCTATATTACCCTGTTATCCCTAGCGC-3 '
  • Annealing G438 with G439 creates a double-stranded DNA fragment that contains an Iscel consensus sequence and can be cloned into a NotI site.
  • PCR primer to amplify 1 10 bp of the PAC vector containing the lox site (nucleotide positions 1 973-2082 Genbank Acc. U091 28).
  • PCR primer to amplify 1 263 bp of the vector pSP73 (nucleotide positions 939-2202 Genbank Acc. X65333) with the ampicillin resistance gene.
  • sequences of the primers are modified in individual bases to produce a BssHII
  • ABs Cleavage site
  • ASal Sall cleavage site
  • PCR primer to amplify 282 bp of the kanamycin resistance gene of the PAC vector nucleotide positions 10683-10965 from Genbank Acc. U091 28.
  • PT21 5'-TTAAGGCGCCAAATCTAGAGGATCCGCGCGCAAGAGGTCGACCTAA-3 '
  • PT22 5'-GTCGACCTCTTGCGCGCGGATCCTCTAGATTTGGCGCC-3 ' PT21 and PT22 anneal to a double-stranded DNA fragment, which was used as a linker to the restriction sites Narl, Xbal, BamHI, BssHII and Sall between the restriction sites Bfrl (nucleotide position 3309 in precursor Acc. U091 28) and BstXI (nucleotide position 291 7 in the precursor Acc U091 28) of the vector PT1.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines DNA-Konstruktes, umfassend die Kombination zweier oder mehrerer DNAs mittels Rekombination in geschmolzener Agarose. Ferner betrifft die Erfindung hierfür verwendbare Vektoren sowie ein Verfahren zur Bereitstellung großer DNAs, insbesondere BACs oder PACs.

Description

Herstellungsverfahren für lange DNA-Konstrukte
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von langen DNA- Konstrukten, insbesondere künstlichen Chromosomen, und hierfür verwendbare Vektoren sowie ein Verfahren zur Bereitstellung großer DNAs, insbesondere BACs oder PACs.
In der modernen Forschung wird angedacht, therapeutische Proteine in tierischer Zellen bzw. transgenen Tieren herzustellen. Ferner wird angedacht, genetische Defekte von tierischen, insbesondere menschlichen Zellen zu reparieren. Insbesondere gibt es Überlegungen, defekte Gene durch entsprechende gesunde zu kompensieren. Hierzu wird z.B. vorgeschlagen, die gesunden Gene in exprimierbarer Form in das Genom der Zellen zu integrieren. Auch wird in Betracht gezogen, die gesunden Gene auf künstlichen Säugetier. Mensch)- Chromosomen "mammalian (human) artificial chromosomes" (nachstehend mit MACs (HACs) bezeichnet) aufzubringen und diese in die Zellen einzuführen.
MACs sind lineare DNAs mit einer Größe von mehreren 1 00 kb. Sie zeichnen sich durch verschiedene Komponenten aus. Diese sind pro MAC ein Zentromer, zwei endständige Telomere und ein dazwischen liegender, zumindest einen " origin of replication " aufweisenden Chromosomenarm . Auf letzterer Komponente können vorstehende Gene aufgebracht werden.
Die Herstellung von MACs ist allerdings mit großen Problemen verbunden. Bisherige Versuche eine solche Herstellung zu erreichen waren nicht be¬ friedigend. Insbesondere stellt die Größe der einzelnen Komponenten ein Klonierungsproblem dar.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde ein Verfahren bereitzustellen, mit dem lange DNA-Konstrukte, insbesondere MACs, hergestellt werden können. Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit ein Verfahren und Vektoren, mit denen lange DNA-Konstrukte, insbesondere MACs, hergestellt werden können. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, mit dem große DNAs, z.B. BACs "bacterial artificial chromosomes" oder PACs "phage P1 artificial chromosomes" , insbesondere Komponenten von MACs, in großer Menge und Stabilität bereitgestellt werden können.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders, daß große DNAs, wie BACs oder PACs, in geschmolzener Agarose miteinander rekombiniert werden können. Er hat gefunden, daß hiermit MACs hergestellt werden können, wenn die großen DNAs die einzelnen Komponenten von MACs, wie ein Zentromer, z.B. eine alpha-Satelliten-DNA, zwei Telomere, z.B. der
Sequenz (TTAGGG)n = 135, und einen, zumindest einen "origin of replication" enthaltenden Chromosomenarm, aufweisen. Ferner hat er erkannt, daß Bakterien, die große DNAs, wie BACs oder PACs, enthalten, mit Agarose gemischt werden können, wodurch nach Erkalten der Agarose Agarose- Blöckchen erhalten werden. In diesen kann die chromosomale DNA der Bakterien gespalten werden, während die großen DNAs ungespalten verbleiben. Hierzu wird ein Restriktionsenzym in die Blöckchen eingebracht, das ausschließlich das bakterielle Chromosom spaltet. Dieses kann dann durch Gelelektrophorese aus den Blöckchen entfernt werden, wodurch nur noch die großen DNAs in den Blöckchen verbleiben. Der Anmelder hat erkannt, daß die großen DNAs wie auch die DNA-Konstrukte in den Agarosegel-Blöckchen stabil sind und über lange Zeit aufbewahrt werden können.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders für ein Verfahren zur Herstellung von DNA-Konstrukten genutzt, umfassend die Kombination zweier
DNAs mittels Rekombination in geschmolzener Agarose. Der Ausdruck "DNA-Konstrukt" weist auf eine DNA jeglicher Art und Länge hin, die zirkulär oder linear sein kann. Beispielsweise ist die DNA linear und weist eine Länge von mehreren 100 kb auf. Vorzugsweise ist die DNA ein künstliches Säugetier-Chromosom (MAC). Besonders bevorzugt ist es, wenn das MAC ein oder mehrere Gene umfaßt, deren Expression gewünscht wird. Beispiele solcher
Gene sind jene, die in defekter Form in Verbindung mit Krankheiten, z.B. Mukoviszidose, stehen.
Der Ausdruck "Kombination mittels Rekombination" weist darauf hin, daß zwei DNAs miteinander rekombinieren können. Dies kann durch überlappende Sequenzen erfolgen. Günstig kann es sein, wenn die Sequenzen rekombinationsspezifische Sequenzen, wie lox- oder FRT-Sequenzen umfassen, wobei die Rekombination dann in Gegenwart einer Rekombinase, wie Cre- oder Flp- Rekombinase, erfolgt. Vorzugsweise führt die Rekombination der zwei DNAs zu einem MAC. Die DNAs weisen in diesem Fall sämtliche Elemente auf, die für ein
MAC wichtig sind. Ferner können Sie ein oder mehrere Gene aufweisen, deren Expression gewünscht wird. Hierzu wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen. Wird z.B. ein MAC aus zwei DNAs kombiniert, kann es günstig sein, wenn eine der DNAs in linearer und die andere in zirkulärer Form vorliegt. Letztere kann ein oder mehrere Gene enthalten, deren Expression gewünscht wird. Die lineare DNA kann ein Zentromer und endständige Telomere enthalten, wobei diese entgegengesetzt orientiert sind. Auch können die beiden DNAs in linearer Form vorliegen, wobei jede DNA ein Telomer aufweist, das bei der einen DNA am linken Ende und bei der anderen DNA am rechten Ende in jeweils ande- rer Orientierung vorliegt. Des weiteren können die beiden DNAs in zirkulärer
Form vorliegen, wobei zur Ausbildung eines MAC das zirkuläre Rekombinations¬ produkt mittels einer Rekombinationsspaltung linearisiert werden muß.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Vektoren, die ein oder mehrere, insbesondere zwei, Telomere enthalten. Solche Vektoren eignen sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Bevorzugte Vektoren sind solche, die zwei entgegengesetzt orientierte Telomere, z.B. der Sequenz (TTAGGG)n = 135, und eine zwischen den Telomer-Anfängen gelegene rekombinationsspezifische Sequenz, z.B. lox-Sequenz, aufweisen. Besonders bevorzugt sind Vektoren, die ferner zwei Resistenzgene aufweisen, wobei eines, z.B. Kanamycin, zwischen den Telomer-Enden und das andere, z.B. Ampicillin, zwischen den Telomer-Anfängen liegt. Auch sind Vektoren bevorzugt, die ferner zwischen den Telomer-Anfängen und/oder -Enden Erkennungssequenzen für seltene und/oder ein bzw. mehrfach schneidende Restriktionsenzyme aufweisen. Besonders bevorzugte Vektoren sind der ditelomerische Vektor PTAT und die monotelomerischen Vektoren PT1 , PT1 L, PT1 LA und PT1 LAS. Hierzu wird auf die Beispiele verwiesen. Die erfindungsgemäßen Vektoren können als solche oder in einem Kit vorliegen. Dieser kann ferner eine Rekombinase, wie Cre- oder FLP-Rekombinase, und übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, Lösungsmittel, etc. , enthalten.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Bereitstellung von großer DNA, insbesondere von BACs oder PACs. Ein solches Verfahren umfaßt folgende Verfahrensschritte:
(a) Mischen einer Bakterienkultur mit geschmolzener Agarose, wodurch nach Erkalten letzterer Agarose-Blöckchen erhalten werden.
(b) Einführen einer oder mehrerer Restriktionsenzyme in die Agarose- Blöckchen, wobei die Restriktionsenzyme nur das bakterielle Chromosom, nicht aber die große DNA spalten, und
(c) Durchführen einer Gelelektrophorese, wodurch das gespaltene bakterielle Chromosom aus den Agarose-Blöckchen entfernt wird, während die große DNA zurückgehalten wird.
Der Ausdruck "geschmolzene Agarose" weist auf eine sog. "low melting agarose" hin, die bei niedriger Temperatur schmilzt. Der Ausdruck "Gelelektrophorese" weist darauf hin, daß die Agarose-Blöckchen einer üblichen Gelelektrophorese, insbesondere einer Pulsfeld-Gelelektrophorese, unterzogen werden. Hierzu wird auf die Beispiele verwiesen.
Der Ausdruck "große DNA" umfaßt große extra chromosomale DNA, z.B. BACs oder PACs.
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, lange DNA-Konstrukte, insbesondere künstliche Chromosomen, herzustellen. Diese können gewünschte Gene enthalten. Ferner können sie lange Zeit in stabiler Weise gelagert werden.
Des weiteren können sie beliebig variiert und neuen Erfordernissen schnell angepaßt werden. Es wird auf die Beispiele explizit verwiesen. Die vorliegende Erfindung stellt somit einen Durchbruch in der gezielten Therapie von defekten Genen dar.
Beschreibung der Zeichnungen:
Fig. 1 : Bereitstellung von konzentrierter, intakter PAC-DNA in Agarosegel- Blöckchen. Pulsfeld-Gelelektrophorese in 1 % Agarose und anschließender Ethidiumbromid-Färbung zur Überprüfung der Spaltung der E. coli-Chromosomen mit der selten schneidenden Restriktions- nuklease AscI. Die ungespaltene, zirkuläre, intakte PAC-DNA, die während der Pulsfeldgelektrophorese ( 1 6h, 200V, 5-20s Umschalt- zeit, 12°C, 0,5xTAE-Puffer) nicht wandert, verbleibt in den Blöckchen (5 Blöckchen des alpha-Satelliten-PACs von Chromosom X mit einer Länge von 125 Kb), die vor der Färbung aus der Geltasche (Pfeil) entnommen und in TE gelagert werden. Auf diese Weise bleibt während der Abtrennung der E. coli-DNA die hohe Konzentration der PAC-DNA in den Blöckchen unverändert. 1 /3 des
Blöckchenvolumens entspricht dem Anteil an Bakterien, die je nach Kopiezahl (mit oder ohne Induktion des lytischen Replikons der PACs durch IPTG) etwa 2,5 bis 1 0 PAC-Moleküle pro Zelle tragen. Das E. coli-Chromosom ist etwa 24fach größer als ein PAC-Klon von 200 Kilobasen. Werden die PACs als "unit copy" Plasmide (gleiche Kopiezahl wie das E. coli Chromosom) ohne Induktion des lytischen Replikons mit IPTG verwendet, so kann bis zu etwa 1 /24 der zu sehenden Menge (zu sehen ist das fragmentierte E. coli- Chromosom) als intakte PAC-DNA in dem Blöckchen erwartet werden. Das sind sehr große Mengen intakter DNA, die eine weitere in vitro Manipulation dieser langen Moleküle ermöglichen.
Fig. 2: Pulsfeld-Gelelektrophorese mit Ethidiumbromid gefärbt. Die mit
BssHIl linearisierten alpha-Satelliten-PACs vom Chromosom X (Bahnen 1 -3, 1 25 kb) und Chromosom 1 7 (Bahnen 4-6, 140 kb) wurden mit einem Mlul-Fragment kombiniert, das den menschlichen HPRT-Genlokus enthält (Bahnen 1 -6, 95 kb) . Die langen Rekombinationsprodukte mit den voraussagbaren Längen von 21 6 und 231 kb sind nicht in den Kontrollen ohne Cre-Rekombinase zu sehen (Bahnen 1 und 4) und sind klar sichtbar in Gegenwart der Cre- Rekombinase (Bahnen 2 und 5, in Gegenwart von 1 % LMP Aga- rose) . Reaktionen, in denen das Reaktionsgemisch stärker mit der wässrigen Lösung (CreSS Puffer) verdünnt wurde, enthielten eine LMP-Agarose-Konzentration von etwa 0,6% sowie eine entsprechend verringerte DNA-Konzentration (Bahnen 3 und 6) . Die geringere Effizienz in den verdünnten Rekombinationsreaktionen weist darauf hin, daß eine passende Agarose-Konzentration und hohe DNA-Konzentrationen entscheidend sind. Bahn 7, 24 kb-Leiter aus einer halben 1 mm starken Scheibe des MidRange PFG Marker II (New England Biolabs) .
Fig. 3: Sequenzspezifische Rekombination in einer Agarose-Gelmatrix:
Schema der Rekombinations-Substrate (oben) und Produkte (unten) . Die lox-Stelle (Dreieck), die in der PAC-Vektor-DNA vorhanden ist (breites Rechteck), rekombiniert in einer Agarosegel- Matrix in Gegenwart von Cre-Rekombinase. Alpha-Satelliten-DNA- PACs von den menschlichen Chromosomen X (125 kb) und 1 7 ( 140 kb), die mit BssHIl (Bs) linearisiert wurden, werden mit einem 95 kb Mlul (Ml)-Fragment, das von einem 1 75 kb PAC stammt, der den intakten menschlichen HPRT-Genlokus enthält, verbunden. Der Pfeil deutet die Richtung des primären Transkripts (schmales Rechteck) von 42 kb an. Mlu Fragmente, die keine lox-Stelle enthalten, sind nicht als Produkte gezeigt. Das kleine Rekombi- nationsprodukt, das aus 4 kb überlappender PAC-Vektor-Sequenz entstand, hat das Pulsfeld-Gel (in Fig. 2) verlassen.
Fig. 4: Test zur Eignung der mutierten lox-Stelle aus PCYPAC2N für den
Einsatz in eine effiziente in vitro Rekombination. Agarosegel- elektrophorese und anschließender Southernblot. Hybridisiert wurde mit einem 1 10 Bp PCR-Fragment als Probe, das mit den Primern LPF und LPR aus PAC-DNA amplifiziert wurde. Die PAC-DNA wurde mit den Restritionsnukleasen EcoRI (Bahn 1 ) und Hindlll (Bahn 2) gespalten, phenolisiert und äquimolar vermischt. Die Fragmentgemische wurden nach Standardmethoden (NENZYMES,
DuPont) in Abwesenheit (Bahn 3) und in Anwesenheit (Bahn 4) von Cre-Rekombinase (0,9 mg/ml) inkubiert. Es sind deutlich erkennbar Rekombinationsprodukte mit der voraussagbaren Länge von 1 kb und 4,9 kb entstanden. Aus dem geschätzten Verhältnis der Sub- stratbanden zu den Produktbanden, geht hervor, daß die in vitro
Effizienz dieser mutierten lox-Sequenz des PAC-Vektors (Sequenz Positionen 201 6-2049 der Genbank Acc. Nr. U091 28) mit der in vitro Effizienz der original loxP-Sequenz vergleichbar ist.
Fig. 5: Karte der verwendeten Ausgangsplasmide für die Klonierung der monotelomerischen Vektoren PT1 , PT1 L, PT1 LA, PT1 LAS und des ditelomerischen Vektors PTAT. PCYPAC2N-ΔpUC wurde während der Isolierung von alpha-Satelli- ten-Klonen aus der PAC Bank (Pieter J. deJong, loannou, P.A. 1 994 Nat. Genet. 6: 84-89) mit der alpha-Satelliten-DNA-Probe X5 (Waye, J.S., et al. 1 985 Nucleic Acids Res. 13: 2731 -2743) als Vektor ohne Insert isoliert. Die Klonierstelle BamHI und mehrere umgebende Restritionsstellen (Notl, EcoRI, Hindlll) wurden überprüft und Rekombinationen wurden ausgeschloßen. Ferner sind die Klone weiterhin sensitiv gegenüber saccharosehaltigem Medium, was auf ein intaktes sacB-Gen und seines jenseits der Klonierstelle (BamHI, Nukleotid Position 1 in Genbank Acc. U091 28) gelegenen
Promotors schließen läßt. Die lox-Stelle (schwarzes Dreieck) stammt aus einem Vorläufervektor (pAD I OSacBII), aus dem der PAC-Vektor entwickelt wurde. Sie hat keine Funktion in PACs und unterscheidet sich von der ursprünglich veröffentlichten loxP- Sequenz (Sequenz Positionen 201 6-2049 der Genbank Acc. Nr.
U091 28) . Das lytische Replikon des P1 Phagen ist mit IPTG induzierbar. Dargestellt sind die Restriktions Stellen Narl (Nukleotid Pos. 1 1 991 in U091 28), Spei (Pos. 1 605 in U091 28), BstXI (Pos. 291 7 in U091 28) und Bfrl (Pos. 3309 in U091 28), die für weitere Klonierungen verwendet wurden. Der "multicopy" Plasmidvektor pSXNeo1 35lsce wurde zuvor mit einer synthetischen Iscel-Stelle aus komplementären Oligonukleotiden ausgestattet (Oligos G438 und G439). Er enthält 135 repetitive Einheiten der TTAGGG Sequenz in Tandem-Reihenfolge (deLange T., et al. 1 990 Mol. Cell. Bio/. 10: 51 8-527), deren Funktion, de novo Telomere zu bilden, in
TACF-Experimenten bestätigt wurde. Mit den Primern ASal und ABs wurde das Ampicillin-Resistenzgen aus dem Vektor SP73 (zwischen Nukleotidposition 939-2202 der Genbank Acc. Nr. X65333) amplifiziert. Durch Wahl dieser Primerpositionen wurde sichergestellt, daß das Gen Transkriptions-Terminationssignale in seinem 3' Ende enthält, aber der auf pBR basierende Replikations- ursprung mit vielen Kopien pro Zelle (ori) ausgeschloßen wird. Die Telomersequenz kann zusammen mit den am Telomersequenz-Ende liegenden Notl- und Iscel-Stellen unter Verwendung von Clal und Xbal herausgespalten werden, und mit gegebener Orientierung in geeignete Spaltstellen kloniert werden.
Fig. 6: Karte des monotelomerischen Vektors PT1 . Durch Herausspalten des lytischen Replikons und der Klonierstelle des PAC-Vektors PCYPAC2N-ΔpUC unter Anwendung der Restriktionsnukleasen Narl und Spei entsteht ein 10,3 kb Fragment, das nur noch das "unit- copy"-P1 -Phagen-Replikon, das Kanamycin-Resistenzgen und die lox Stelle des PAC-Vektors enthält. Es hat geeignete Enden für die Klonierung der Xbal/Clal herausgespaltenen 0, 9 kb Telomersequenz. Durch Ligierung gehen an beiden Enden sämtliche Restrik- tionserkennungssequenzen verloren, so daß die erneute Klonierung der gleichen Telomersequenz aus der identischen Gelelutions-
Präparation an einer anderen Stelle möglich wird. Dieser Vektor ist geeignet, um lange genomische Fragmente in die singuläre Restriktionsstelle Nhel (zwischen Tel 1 35 und lox, nicht dargestellt, an der Nukleotid Position 1 71 6 in Genbank Acc. U091 28) zu klonieren und für die Kombination mit einer zweiten, eine Telomersequenz tragenden Komponente zu verwenden.
Fig. 7: Karte des monotelomerischen Vektors PT1 L. Durch Spalten des
Plasmids PT1 mit Bfrl (Nukleotid Position 3309 in Genbank Acc. U091 28) und BstXI (Nukleotid Position 291 7 in Genbank Acc.
U091 28) wurde die gerichtete Klonierung des dazu synthetisierten Linkers möglich. Die komplementären Oligonukleotide PT21 und PT22 dienen zur Herstellung des Linkers mit geeigneten Restriktionsstellen für die Klonierung des Amp-Gens und der zweiten, identischen Telomersequenz in entgegengesetzter Richtung. Durch die Klonierung des Linkers blieb wie vorgesehen die Bfrl-Stelle erhalten, während die BstXI-Stelle verschwand. Dieser Vektor ist geeignet, um lange genomische Fragmente in die singuläre Restriktionsstelle Nhel (zwischen Tel 135 und lox, nicht dargestellt, an der Nukleotid Position 1716 in Genbank Acc. U09128) zu klonieren und für die Kombination mit einer zweiten, eine Telomersequenz tragenden Komponente zu verwenden.
Fig.8: Überprüfung der neu integrierten Restriktionsstellen von zwei
Klonen aus der PT1 L-Klonierung. Klon Nr.8: Bahnen 1-9, Klon Nr. 12: Bahnen 12-20. Bahnen 1,12: ungespaltene Plasmid DNA. Bahnen 2,13: Notl; Bahnen 3,14: Notl und Xbal; Bahnen 4,15:
Xbal; Bahnen 5,16: Sall; Bahnen 6,17: BamHI; Bahnen 7,18: Bfrl; Bahnen 8,19: Narl; Bahnen 9,20: BssHII. Bahnen 10,11: 1kb- ladder Längenstandard von Gibco BRL, die oberste Bande entspricht 12 kb. Die Spaltung der Narl-Stelle wurde erst durch Hinzufügen von pBR328 DNA als Aktivator für die Nuklease möglich (vgl. Fig. 11).
Fig.9: Karte der monotelomerischen Vektoren PT1LA und PT1LAS. Mit den Primern ABs und ASal wurde ein 1260 Bp Fragment, das das Ampicillin-Resistenzgen enthält (entspricht Positionen 939 - 2202
Genbank Acc. X65333), aus dem Vektor pSXneo135lscel amplifi- ziert und mit den Restriktionsnukleasen BssHII und Sall, deren Stellen mit modifizierten Primersequenzen geschaffen wurden, gespalten. Das gespaltene, geleluierte PCR-Fragment wurde mit dem BssHII und Sall gespaltenen, geleluierten Plasmid PT1L ligiert und kloniert. Es entstand das geplante Produkt PT1LA und ein weiteres Produkt PT1 LAS, das eine zusätzliche Sequenz von 1 ,8 kb (spacer) integriert hat. Durch die zusätzliche Sequenz (spacer) wurde eine weitere Nhel-Stelle eingebracht. PT1LA ist geeignet, um lange genomische Fragmente in die singuläre Restriktionsstelle
Nhel (zwischen Tel 135 und lox, Nukleotid Position 1716 in Genbank Acc. U09128) zu klonieren und für die Kombination mit einer zweiten, eine Telomersequenz tragenden Komponente zu verwenden.
Fig. 1 0: Überprüfung der Vektoren PT1 LA und PT1 LAS durch Restriktions- analyse. Agarosegelelektrophorese (0,8%) und Ethidiumbromid-
Färbung. Bahnen 1 -5: PT1 LA; Bahnen 6-10: PT1 LAS; Bahnen 1 ,6: ungespaltene Plasmid DNA; Bahnen 2,7: BamHI; Bahnen 3,8: Notl; Bahnen 4,9: Notl und Xbal; Bahnen 5, 10: Xbal; Bahn 1 1 : 1 kb ladeder, Gibco BRL. Das kleine BamHI-Fragment und das kleine Notl/Xbal-Fragment sowie die Gesamtlänge ist in PT1 LAS um 1 ,8
Kb länger als in PT1 LA. Die Differenz zwischen den kleinen BamHI- Fragmenten und den kleinen Notl/Xbal-Fragmenten beider Vektoren entspricht der vollen Länge des 0,9 Kb Telomerfragments.
Fig. 1 1 : Aktivierung der Narl-Spaltung in Gegenwart großer Mengen an pBR328. Die mit dem synthetischen Linker eingebrachte Narl-Stelle läßt sich nicht mit Narl spalten, solange keine unterstützende Narl- Stelle in eis oder trans angeboten wird. Bahnen 1 -3: PT1 LAS; 1 : mit Narl alleine gespalten (ungespalten); 2: mit Narl gespalten nachdem zehnfacher Überschuß an pBR328 Plasmid hinzugemischt wurde; 3: mit Narl + pBR328 und Sall gespalten; Bahnen 4-6: PT1 LA; 4: mit Narl alleine gespalten (ungespalten); 5: mit Narl gespalten nachdem zehnfacher Überschuß an pBR328 Plasmid hinzugemischt wurde; 6: mit Narl + pBR328 und Sall gespalten; Bahn 7: Längenstandard 1 Kb ladder (Gibco BRL) . Somit wurde die
Lokalisation und die Verfügbarkeit der eingebrachten Narl-Stelle überprüft.
Fig. 1 2: Überprüfung der T4-DNA-Ligierung des zweiten Telomerfragments an PT1 LAS. 50% des Ligierungsansatzes wurde für 24 h bei 30 V in 0,8% Agarose aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt. Bahn 4: Das Reaktionsgemisch ohne Ligase. Bahn 5: mit Ligase. Das 1 3,9 kb Narl/Xbal-Fragment hat Monomere (Pfeil) und Oligomere des 0,9 kb Clal/Xbal-Telomerfragments aufgenommen. Bahn 1 : 1 kb ladder, Gibco BRL, die oberste Bande entspricht einer Länge von 1 2 kb.
Fig. 1 3: Karte des ditelomerischen Vektors PTAT. Zur Einführung der zweiten Telomersequenz, die aus der identischen Aufbereitung des bereits für die Klonierung der ersten Telomersequenz verwendeten Materials stammt, und somit Xbal- und Clal-Enden für die ge- richtete Integration enthielt, wurde der Vektor PT1 LAS mit den
Restriktionsnukleasen Narl und Xbal an den neu integrierten Erkennungsstellen gespalten. Die Spaltung der Narl-Stelle des eingeführten Linkers mußte durch Zugabe einer zehnfachen Menge von pBR328-DNA aktiviert werden. Durch Ligierung gehen die Narl- und Clal-Stellen verloren, während die Xbal-Stelle erhalten bleibt.
Die auf dem 0,9 Kb Fragment unmittelbar an den Telomersequenz- Enden liegenden Restriktionsspaltstellen Notl (8 Bp, selten vorkommende Erkennungssequenz) und Iscel ( 1 7 Bp Konsensussequenz, die praktisch nicht vorkommt, schneidet wahrscheinlich kein einziges mal im menschlichen Genom) liegen in beiden Fällen in geplanter Orientierung.
Fig. 1 4: Restriktionskarte des ditelomerischen Vektor Prototyps PTAT. Die dargestellten Restriktionsschnittstellen dienen zur Überprüfung der Klonierungen. Die beiden Notl-Stellen (8Bp rare cutter), sowie die
Iscel-Stelle (die 1 7 Bp Erkennungssequenz ist extrem selten anzutreffen, das menschliche Genom enthält wahrscheinlich keine einzige Iscel-Stelle) wurden zusammen mit den Telomersequenzen (TTAGGG) n = 1 35 auf einem 0,9 Kilobasen langen Fragment inte- griert. Die Pfeilspitzen der Telomersequenzen (Tel 1 35) zeigen die
Richtung von 5' nach 3' des G-reichen Stranges. Das Vorhandensein der BamHI-Stellen an den Anfängen der Telomersequenzen und der Xbal-Stelle am Anfang der unteren Telomersequenz, die ebenfalls von dem verwendeten 0,9 kb Telomer-Fragment stammen, sowie die erhaltenen Längen von 0,9 kb dienen als Beweis, daß die Telomersequenzen vollständig, ohne Deletion integriert wurden. Die Abstandshalter-Sequenz von 1 ,8 kb (spacer) ist in einem Klon während der Klonierung des Ampicillin-Resistenzgens spontan aufgetreten. Die Schnittstellen der Restriktionsnukleasen Accl, Bfrl, Nhel sind in der Anordnung, wie sie im Spacer auftreten, nicht in einem der verwendeten Ausgangsklone (PCYPAC2N-ΔpUC, pSXNeo1 35lscel) anzutreffen. Die Herkunft der Spacer-DNA ist nicht bekannt, sie könnte aus dem verwendeten E. coli-Stamm herrühren. Mit dem Vektor PT1 LA, der nur das Ampicillin-Resistenzgen und keinen Spacer enthält, ist die Klonierung der zweiten Telomersequenz nicht geglückt. Die restriktionskartierte Spacer-Sequenz könnte stabilisierend auf ein ditelomerisches Plasmid wirken. Zur weiteren Überprüfung der Struktur wurden PCRs durchgeführt. Folgende Primerpaare ergaben die erwarteten Produkte: Kr und Kf; Kr und G439; G438 und LPF; LPF und LPR; LPR und ABs; ASal und ABs; die lange PCR ASal und G438 ergab kein Produkt ( 1 min 95 °C, 1 min 62°C, 4 min 72°C, 25 Zyklen, Taq Polymerase mit
Hersteller-Puffer von Amersham).
Fig. 1 5: Überprüfung der Integrität des ditelomerischen Vektors PTAT mittels Restriktionsanalyse: Agarosegelelektrophorese 0,8% und Ethidiumbromid-Färbung. Bahnen 1 , 1 9: 1 kb ladder (Gibco BRL);
Bahn 2: ungespaltene Plasmid DNA; Bahnen 3-18: gespaltene Plasmid-DNA mit den Enzymen: 3: Bfrl; 4: Bfrl und Nhel; 5: Nhel 6:Xbal; 7: Xbal und Sall; 8: Sall; 9: Sall und BssHII; 1 0: BssHII 1 1 : Accl; 1 2: BamHI; 1 3: BamHI und Sall; 1 4: Notl und Sall; 1 5 Notl und Acel; 1 6: Notl und Nhel; 1 7: Notl und BssHII; 1 8: Notl.
Bei vielen Spaltungen sind unscharf begrenzte Banden mit Lauflängen um 8-9 kb zu sehen. Diese Banden, sowie die vorausgesag- ten Fragmente mit telomerischen Sequenzen, hybridisieren mit dem 0,9 Kb Telomerfragment als Probe. Die Spacer-DNA zeigt unspezifische Signale mit der Telomerfragment-Probe (Ergebnis nicht dargestellt). Alle Spaltungen entsprechen der geplanten Struktur des Vektors PTAT. In Bahn 20 wurde die Herausspaltbarkeit des ditelomerischen Fragments von 6, 1 Kilobasen (Pfeil) mit der unmittelbar an den Enden der Telomersequenzen liegenden Nuklease Iscel, die mit ihrer 1 7 Bp Erkennungssequenz äußerst selten vorkommt, nachgewiesen.
Fig. 1 6: Die Nukleotid-Sequenzen der synthetischen Primer, die zur
Klonierung und Überprüfung der Klonierung von PTAT und seinen Vorläufern dienten.
Fig. 1 7: Durch Spaltung des Vektors PTAT mit der extrem selten schneidenden Restriktionsnuklease iscel oder der selten schneidenden Re- striktionsnuklease Notl wird ein 6, 1 Kilobasen langes ditelomerisches Fragment mit jeweils nach außen weisenden, terminalen Telomersequenzen (TTAGGG)n = 1 35 erhalten. Aus TACF-Experi- menten ist bekannt, daß auch de novo Telomere gebildet werden, wenn sich außerhalb des Telomersequenz-Endes weitere DNA-Abschnitte befinden. Demnach kommen auch andere Schnittstellen, die zum Beispiel in PTAT nur einmal zwischen den Telomersequenz- Enden schneiden, als Nukleasen zur Freigabe der Telomersequenzen in Betracht. Es bestehen verschiedene Möglichkeiten, zusätzliche DNA Abschnitte zwischen die Telomere zu klonieren. Eine kleine Auswahl an geeigneten Schnittstellen, die nur einmal im Vektor PTAT schneiden, ist dargestellt (Sall, BssHII, Xbal) . Darüber hinaus sind weitere Restriktionsstellen vorhanden, die für partiellen oder vollständigen Austausch des intertelomerischen Abschnitts verwendet werden können. Fig. 1 8: Die Klonierung einer chromosomalen Komponente, die aus einem
Chromosomenarm mit einem Gen (G) besteht, in den ditelomerischen Vektor PTAT oder seine Abkömmlinge, ermöglicht die freie Wahl der Zentromer-Komponente (Z) und ihre Insertion in einem einzigen in vitro Schritt. Das Rekombinationsprodukt besteht aus zusammengefügtem, identischen Material, das nicht erneut analysiert werden muß.
Fig. 1 9: Die Klonierung einer Zentromer-Komponente (Z) in den mit einem oder mehreren Markern (M) ausgestatteten, ditelomerischen Vektor führt zum MAC-Basis-Konstrukt TZT. Es ermöglicht die Kombination einer beliebigen, zirkulären Komponente (G) . Somit können verschiedene therapeutische Gene mittels IGSSR in einem einzigen in vitro Schritt in das Basis-MAC-Konstrukt inseriert werden. Aus der Kenntnis der Struktur der beiden Substrate ergibt sich die exakte Struktur des produzierten MAC-Konstrukts, ohne weitere Analysen zu benötigen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert:
Beispiel 1 : Kombination von PACs mittels lox-Cre-Rekombinase in geschmolzener Agarose.
Es wird eine Rekombination durchgeführt, in der ein 1 20 kb langer alpha-Satelliten-DNA-PAC-Klon von Chromosom X und ein 140 kb langer alpha-Satelliten-DNA-PAC-Klon von Chromosom 1 7 zusam¬ men mit einem 95 kb langen HPRT(Hypoxanthin-Phosphoribosyl- transferase)-Genfragment verwendet werden.
(A) Bereitstellung von PAC-DNA mittels Agarose-Blöckchen. Die PAC Klone werden in einem End-Kulturvolumen von 100 ml LB Medium propagiert (Kanamycin Selektion, IPTG Induktion). Es werden Bakterien-Blöckchen in Agarose hergestellt (Smith, C.L. et al. 1 988 In Davies, K.E. Genome Analysis, IRL Press, Oxford, 41 -49) . Um besonders hohe DNA-Konzentrationen zu erzielen, wird 1 Volumen Bakterien-Niederschlag mit 2 Volumen einer 2%igen LMP-Agarose (low melting point agarose, Gibco BRL) vermengt. Alle Puffer und Lösungen werden aus destilliertem Wasser angefertigt, das 0, 1 mM EGTA enthält. Um das E. coli-Chromosom zu fragmentieren, während das PAC intakt bleibt, wird die im Blöckchen befindliche DNA mit einer Restriktionsnuklease behandelt, die nicht im PAC aber im E. coli-Chromosom schneidet (in diesem Fall Ascl). Die Restriktionsspaltung wird im Hersteller-Puffer durchgeführt, dem 0,75 mM Sper- midin/3HCI und 0,3 mM Spermin/4HCI zugefügt wird. Anschließend erfolgt Proteinase-K-Behandlung der Blöckchen. Die Blöckchen werden auf ein 1 %iges Agarosegel für Pulsfeld-Gelelektrophorese geladen, das nicht mit geschmolzener Agarose versiegelt wird. Nach einer 1 6-stündigen Laufzeit bei 200 V mit einer ansteigenden Schaltzeit von 5-20 s in 0,5 x TAE Puffer bei 1 2°C werden die Blöckchen, die zirkuläre PAC DNA enthalten, wieder aus den Geltaschen befreit und in TE bei 4°C gelagert. Zur Beurteilung der voll- ständigen Spaltung der E. coli-Chromosomen wird das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt. Die E. coli-Fragmente zeigen ein Muster zeigen, das sich in deutlichem Abstand von den Geltaschen befindet (Fig. 1 ). Die Blöckchen enthalten große Plasmide mit einer Konzentration, die bis zu 1 /3 der Kon- zentration der jeweiligen Plasmid-DNA in E. coli entspricht
(etwa 1 -5 PAC-Moleküle/1 Bakterien-Volumen). (B) Kombination der PAC-Klone mittels lox-Cre-Rekombinase in geschmolzener Agarose.
Die zu verbindenden PACs werden restriktionskartiert und mit ausgewählten Restriktionsnukleasen gespalten, um Fragmente zu erzeugen, die in der lox Stelle überlappen und in entgegengesetzte Richtungen weisen. Von vielen möglichen Nukleasen wurde BssHII für die alpha-Satelliten-PACs und Mlul für den HPRT-Gen-PAC verwendet (Fig. 3) . Vollständige Spaltung wird mit 1 /1 0 eines Blöckchens (etwa 1 5 μ\), das aus der Mitte des Blöckchens herausgeschnitten wurde, mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese und Ethidiumbromid- Färbung kontrolliert. Die 9/1 0 beider Blöckchen mit der zu verbindenden DNA werden 4 x 30 min in CreSS Puffer (50 mM Tris/HCI pH 7,4, 1 0 mM MgCI2, 30 mM NaCI, 0,75 mM
Spermidin/3HCI, 0,3 mM Spermin/4HCI) inkubiert und anschließend mit 130 μ\ CreSS Puffer in einem 1 ,5 ml Reaktionsgefäß vereint. Dadurch entsteht ein Volumen von ca. 400 μ\ und eine LMP-Agarose-Konzentration von ca. 1 %. Das Gemisch wird für 10 min bei 67 °C unter vorsichtigem
Rühren mit einer Pipettenspitze inkubiert. Anschließend wird für 5 min bei 42°C inkubiert. Danach wird BSA (Bovines Serum Albumin, 4 μl einer 10mg/ml Lösung) und DTT (0,4 μl einer 1 M Lösung) unter vorsichtigem Rühren dazugegeben. Für die nächsten 30 min wird weiterhin bei 42°C inkubiert und mehrmals vorsichtig gerührt. Um eine Kontrolle des Materials ohne Rekombination zu erhalten, werden 80 μl mit einer Pipettenspitze mit weiter Bohrung (ca 3mm) vorsichtig in eine Blöckchenform übertragen. Während der nächsten 30 min wird die Inkubations-Temperatur unter wiederholter Zugabe von 1 μ\ Cre-Rekombinase (0,9 mg/ml) und jeweils anschließendem vorsichtigen, aber ausdauernden Rühren, bis insgesamt 6 μl Cre hinzugefügt wurden, schrittweise auf 37 °C gesenkt. Das Reaktionsgemisch wird für zwei min erneut auf 39°C erwärmt und unter Verwendung von vorgewärmten Pipettenspitzen (45°C) mit weiter Bohrung (3mm) vorsichtig in vorgewärmte Blöckchenformen (40°C) gebracht, die sich in einer isolierten Kammer befinden. Dabei muß darauf geachtet werden, daß das Reaktionsgemisch nicht unter 30°C abkühlt, was zum Erstarren der Agarose führen würde. Das weiterhin geschmolzene Reaktions- gemisch wird anschließend für 30 min bei 37 °C und für 30 min bei 32°C inkubiert. Durch Abkühlen auf Raumtenperatur erstarren die Blöckchen. Die Blöckchen werden mit Proteinase-K behandelt und können im Proteinase-K Puffer (enthält SDS und EDTA, für langfristige Lagerung für mehrere Monate) oder in TE gelagert werden. 1 /4 eines resultierenden Blöckchens wird mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung analysiert (Fig. 2).
Es wird darauf hingewiesen, daß auch eine andere sequenzspezifische Rekombination, z.B. über die FLP-Rekombinase mit der Erkennungssequenz FRT, durchgeführt werden kann.
Beispiel 2: Herstellung erfindungsgemäßer Vektoren.
(A) Herstellung des monotelomerischen Vektors PT1 .
Aus dem PAC-Vektor PCYPAC2N (Fig. 5) wurde ein "unit- copy"-Plasmid hergestellt. Ferner wurde die Vielzahl der
Restriktionsnukleasen-Spaltstellen reduziert. Hierzu wurde das lytische Replikon des PAC-Vektors zusammen mit der Klonierstelle entfernt. Auf diese Weise bleibt das P1 -Phagen- Replikon, das Kanamycin-Resistenzgen und die lox-Stelle auf einem Fragment erhalten. Die lox Stelle stammt aus Vorläuferklonen des Vektors PCYPAC2N und ist als Klonier- Überbleibsel ohne Funktion für PACs noch vorhanden. In einer in vivo Reaktion wurden zwei lox-Stellen für die Herstellung des PAC-Vektors zusammengefügt. Um die Eignung der in PACs vorhandenen lox-Stelle als funktioneller Rekombinationsort für eine effiziente Rekombination in geschmolzener Agarose zu prüfen, wurden in vitro Rekombinationstests durchgeführt. Dies wurde insbesondere wichtig, da die Sequenz der lox Stelle im PAC Vektor sich von der ursprünglich veröffentlichten lox-Sequenz unterscheidet (Sequenz Positionen 201 6-2049 der Genbank Acc. Nr. U091 28) und eine effiziente in vitro Rekombination dieser
Sequenz nicht bekannt war (Fig. 4). Für die Klonierung der ersten Telomersequenz wurde die PAC-Vektor-DNA mit den Restriktionsnukleasen Narl und Spei gespalten (Boehringer Enzyme und Puffer) . Anschließend wurde die DNA durch Ethanolpräzipitation gereinigt, in Puffer für alkalische
Phosphatase aufgenommen und für 30 min dephosphoryliert (Boehringer). Nach einmaliger Phenolisierung wurde das 1 0,3 Kb Fragment nach 1 2h Gellauf bei 30V in 0,5xTAE aus einem 1 % Agarosegel (LMP-Agarose, Gibco BRL) unter Vermeidung von UV-Bestrahlung eluiert, mit Geneclean-Kit gereinigt und in TE aufgenommen. Etwa 10 ng DNA wurden mit dem geleluierten Clal/Xbal Telomer-Fragment von 0,9 Kb, das in mehrfachem Überschuß verwendet wurde, über Nacht bei 4-20°C mit T4-DNA-Ligase in entsprechendem Puffer in einem Volumen von 30 μl ligiert. 50% des
Ligierungsansatzes wurden mittels Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung analysiert. Die anderen 50 % wurden für 2h gegen destilliertes Wasser dialysiert (Tropfen- Dialysier-Membran, Gibco BRL) und zur Transformation von 40 μl elektrokompetenten Zellen (ElectroMAX DH 10B Cells, Gibco BRL) verwendet. Die Transformation erfolgte in einer 5 10Oμl Küvette bei 1 ,8 KV durch Elektroporation. Kanamycin- resistente Klone (30μg/ml) wurden mittels PCR aus Bakterienkolonien auf Anwesenheit des Telomerfragments getestet. Dafür wurden die Primer LPF und G438 verwendet (62°C, 30 Zyklen, Taq-Polymerase; vgl. Fig. 14 und 1 6) .
10 Das erwartete 1 ,3 Kb Produkt war nicht zu sehen. Statt dessen hatte jeder der 7 resistenten Klone ein Gemisch aus PCR-Produkten mit Längen von 600 bis 800 Bp. Durch anschließende Restriktionskartierung aus isolierter Plasmid- DNA konnte gezeigt werden, daß alle Klone die volle Länge
1 5 des ursprünglichen Telomerfragments von 0,9 kb besitzen.
Die Reduktion der Länge während einer PCR-Amplifikation, die die Telomersequenz überspannt, wurde bereits in dem Ausgangsklon pSXneo 1 35 (Fig. 5) beobachtet. Sie ist auf die besondere, repetitive Beschaffenheit der Telomersequenz
20 zurückzuführen. Sind die (TTAGGG) Einheiten untereinander streng homolog, wird das PCR-Produkt kaum länger als 400 Bp (plus umliegende Sequenzen), unabhängig davon, wie lang die eigentliche Telomersequenz ist. Dieses besondere PCR-Verhalten der streng homologen Telomersequenzen
25 kann diagnostisch genützt werden, um die Güte der
Telomersequenz zu überprüfen, wenn in einer Restriktionskartierung gleichzeitig die volle Länge nachgewiesen wird. Um aus den Bakterien, die "unit copy" Plasmide tragen und somit bis zu 50 mal weniger Plasmid-Moleküle besitzen als
30 etwa herkömmliche pUC-Vektoren, ausreichende Mengen
DNA für ihre Restriktionsanalyse und eine anschließende Klonierung zu gewinnen, wurden 600 ml LB-Kulturen für die alkalische Lyse-Isolierung verarbeitet. Eine Karte des Vektors PT1 ist in Fig. 6 dargestellt.
(B) Herstellung des monotelomerischen Vektors PT1 L durch
Integration eines synthetischen Linkers in PT1 .
Für die spätere Integration eines zweiten Resistenzgens (Amp) und der zweiten Telomersequenz sowie der Verfüg- barkeit von einmal schneidenden Restriktionsstellen zur
Klonierung von genomischen Fragmenten (Gen/Zentromer) oder eines selektionierbaren Markergens zwischen die Telomersequenzen, wurde ein Linker zwischen lox-Stelle und P1 -Replikon integriert (Fig. 7) . Um die gleiche Telomer- fragment-Präparation verwenden zu können, die zur Klonierung von PT1 führte, wurde eine Narl-Stelle und eine Xbal- Stelle eingebracht. Für die Integration des Amp-Gens und gleichzeitig für das Vorhandensein von selten schneidenden Restriktionsstellen wurde eine BssHII- und eine Sall-Stelle eingebracht. Zwei synthetische Oligonukleotide PT21 und
PT22 ergeben einen doppelsträngigen Linker für diesen Zweck (Sequenzen in Fig. 1 6). Die überhängenden Enden des Linkers werden in gegebener Orientierung in die sin- gulären Bfrl- und BstXI-Stellen ligiert. Hierfür wurden 10 ng der Bfrl/BstXI (Boehringer) gespaltenen, nicht dephosphory- lierten PT1 -DNA geleluiert und mit 1μg unphosphorylierter Linker-DNA verwendet. (Transformation wie oben beschrieben) . Zwei der vier durch Restriktionskartierung analysierten Klone enthielten alle neuen Restriktionsstellen. Die einzige Ausnahme war zunächst die integrierte Narl-Stelle (Fig. 8) .
Die auf den Oligonukleotiden verwendete Sequenz entspricht einer Narl-Stelle, die nur gespalten wird, wenn andere effek- tiver gespaltene Narl-Stellen in eis oder trans zur Verfügung gestellt werden. Wird zehnfacher Überschuß an pBR328 zur Spaltreaktion hinzugemischt, ist die integrierte Narl-Stelle zufriedenstellend spaltbar (Fig. 1 1 ) .
(C) Herstellung der monotelomerischen Vektoren PT1 LA und PT1 LAS.
Um zwei unabhängige Resistenzgene zwischen den Telomer- sequenz-Enden und -Anfängen eines ditelomerischen Vektors zu haben, wurde das Ampicillin-Resistenzgen (Amp) aus dem Vektor SP73 (Fig. 5) in die neu geschaffenen Restritions- stellen BssHII und Sall des Vektors PT1 L kloniert. Dabei mußte insbesondere darauf geachtet werden, daß der nahe am 3' Ende des Ampicillin-Resistenzgens gelegene, "multy- copy"-Replikationsursprung (ori) der pBR-Plasmide nicht auch in das "unit-copy"-Plasmid integriert wird, um die Kopienzahl so klein wie möglich zu halten. Gleichzeitig sollte das Amp-Fragment bis direkt an den ori heranreichen, um
Transkriptionsterminations-Signale des Amp-Transkripts zu gewährleisten. An der Grenze zwischen Amp und ori liegen keine geeigneten Restriktionsstellen, die für ein Herausspalten und die anschließende Klonierung verwendet werden konnten. Möglich war die Synthese der Oiigonukleotide ASal und ABs, die durch Änderung einzelner Nukleotide mit den Restriktionsstellen Sall (in 5' von Amp) und BssHII (in 3' von Amp) ausgestattet wurden. Das Amp-Gen wurde auf einem 1 260 Bp Fragment amplifiziert, das PCR-Produkt wurde mit den Nukleasen Sall und BssHII an den Enden nachgespalten, geleluiert, gereinigt und in den Sall und BssHII gespaltenen, dephosphorylierten, geleluierten Vektor PT1 L kloniert. Es wurden zwei Kolonien erhalten, die doppelt resistent für Ampicillin und Kanamycin waren. Beide Kolonien waren positiv für die PCR mit den Primern G438 und LPF, um das Vorhandensein der ersten Telomersequenz zu kontrollieren, positiv für die PCR mit den Primern ASal und ABs (entspricht der Resistenz gegenüber Ampicillin) sowie positiv für die PCR mit den Primern ABs und LPR (Bestätigung der geplanten Orientierung) . Von diesen hatte ein Klon (PT1 LA, 1 2, 1 Kb) die vorausgesagte Struktur, in der Restriktionsanalyse und der andere Klon (PT1 LAS, 1 3,9 Kb) hatte eine zusätzliche 1 ,8 kb Sequenz am 3' Ende des Amp-Gens integriert (Fig. 9 und 10) . Dabei ist die Primerbindungsstelle für ABs unmittelbar in 3' des Amp-Gens erhalten geblieben, jedoch die BssHII-Stelle selbst ist durch die integrierte Sequenz um 1 ,8 Kb versetzt worden. Aus der Ligierungsreaktion wurde der Klon PT1 LAS erhalten.
(D) Herstellung des ditelomerischen Vektors PTAT aus PT1 LAS.
Für die Klonierung des zweiten Telomerfragments wurden die Restriktionsstellen Narl und Xbal in die Linker-DNA von PT1 L (und damit PT1 LAS) eingebracht. Die Spaltung der Restriktionsstelle Narl wurde durch Zumischen eines zehnfachen Überschußes an pBR328-Plasmid möglich (Fig. 1 1 ) . Das Narl und Xbal gespaltene 1 3,9 Kb Fragment des Plasmides PT1 LS wurde mit alkalischer Phosphatase dephospho- ryliert, einmal phenolisiert, aus 1 %igem LMP-Agarosegel nach Elektrophorese eluiert und mittels Geneclean-Kit gereinigt. Es wurde wie bei der Klonierung von PT1 ver- fahren. Die Ligierung wurde überprüft (Fig. 1 2) . Zwölf doppelt resistente Klone (Ampicillin und Kanamycin) wurden nach Isolierung von Plasmid-DNA aus 600 ml Kulturen mit- tels alkalischer Lyse einer Restriktionsanalyse unterzogen. Einer der erhaltenen Klone wurde analysiert und zeigte das erwartete 10,5 Kb BamHI-Fragment, das beide Telomersequenzen und das P1 -Replikon enthält. Um die gesamte Struktur des ditelomerischen Vektors PTAT zu überprüfen, wurde eine umfangreiche Restriktionsanalyse durchgeführt (Fig. 1 5). Die vorausgesagte Struktur konnte vollständig bestätigt werden und die Funktion der extrem selten schneidenden Iscel-Stellen an beiden Telomersequenz-Enden wurde nachgewiesen. Das bedeutet, daß ein Plasmid zur Verfügung steht, das stabil propagiert werden kann, um lange Fragmente als chromosomale Komponenten zu klonieren und in geschmolzener Agarose mit einer zweiten stabil klonierten chromosomalen Komponente zu verbinden.
(E) Vektor PTAT als Basis für die verschiedensten Anwendungen.
Das 6, 1 Kb lange Notl- oder Iscel-Fragment von PTAT, das an beiden Enden Telomersequenzen besitzt, kann für verschiedene Zwecke modifiziert werden. Dafür können die integrierten Restriktionsstellen Xbal, Sall und BssHII als einmal vorkommende oder andere Stellen verwendet werden. Zusätzlich kann in eine der bestehenden Schnittstellen eine MCS (multiple cloning site) eingeführt werden, die zweckmäßigerweise Erkennungssequenzen von eher selten schneidenden Restriktionsnukleasen enthalten sollte. Weiterhin könnten bestehende mehrfach vorkommende Restriktionsstellen durch Einbringen von Mutationen verändert werden. In die Schnittstellen können weitere prokaryon- tische oder eukaryontische selektionierbare Marker-Gene sowie Gene die zur Farb/Fluoreszenz-Identifizierung von E. coli oder Säugerzellen verwendet werden können oder DNA- Fragmente für Zwecke des Nachweises für MACs in lebenden Zellen (z.B. über spezifische DNA Erkennungssequenzen von Bindungsproteinen die an gelly fish protein gekoppelt sind (GFP)) . Eine andere Möglichkeit der Modifizierung wäre die Klonierung eines DNA-Fragments von PTAT oder Abkömmlingen, das beide Telomersequenzen enthält (z.B. das 6, 1 Kb Notl-Fragment), in einen anderen bestehenden Vektor (etwa BAC Vektoren, andere PAC Vektoren, oder andere Vektoren) oder in bestehende genomische Klone. Diese
Möglichkeit ist insbesondere dadurch erleichtert, da auf Anwesenheit des Fragments nach einer Umklonierung selek- tioniert werden kann (Ampicillin-Resistenz) . Verbesserte PTAT-Versionen könnten dann für die Klonierung oder Umklonierung eines langen genomischen Abschnitts (z.B. genomische Kopie eines Gens oder Zentromer-Kandidaten- sequenz) verwendet werden.
Wird in PTAT oder seine Abkömmlinge zunächst eine geno- mische Kopie des menschlichen HPRT-Gens von Beispiel 1 auf einem langen Fragment kloniert (oder andere selektionierbare Säugergene), so kann in geschmolzener Agarose der entstehende Chromosomenarm, der an beiden Enden Telomere enthält, mit beliebigen zirkulären Zentromer- Kandidatensequenzen verbunden werden, die eine geeignete
Rekombinations-Stelle enthalten (bei PTAT wäre das z.B. jeder PAC-Klon einer genomischen Bank, die mit dem Vektor PCYPAC2N hergestellt worden ist) . Aus der Analyse der einzelnen Komponenten wäre bereits die Struktur der MAC Konstrukte bekannt (Fig. 1 8). Die Rekombination in geschmolzener Agarose bedingt den Erhalt der Rekombinationsprodukte in Form von Agarose-Blöckchen, wodurch ein weiterer Vorteil für die Gewinnung des Rekombinationsproduktes entsteht. Werden beide Komponenten als zirkuläre DNA in die Rekombinationsreaktion eingesetzt, so entstehen große zirkuläre Produkte. Diese können durch anschließende Pulsfeld-Gelelektrophorese von dem kaum zu vermeidenden, kleinen Anteil teilweise degradierter DNA vollständig befreit werden. Im Blöckchen bleibt wiederum nur intakte DNA zurück. Nach Spaltung unmittelbar an den Telomersequenz- Enden laufen nur zwei gut auftrennbare Fragmente in das Gel. Das "kleine" ditelomerische Fragment, das nicht rekombiniert hat, und das rekombinierte "lange" ditelomerische MAC-Konstrukt. Der Anteil der zirkulären Komponente, der nicht rekombinierte, verbleibt im Blöckchen. Durch Trans- fektion verschiedener Konstrukte kann der MAC ermittelt werden, der das effizienteste Zentromer enthält. Ein auf diese Weise identifiziertes "bestes" Zentromer würde in verbesserte PTAT-Versionen kloniert werden, um einen MAC-Basisvektor TZT (Telomer-Zentromer-Telomer) zu erhalten. Dieser kann im geschmolzener Agarose mit jeder beliebigen zirkulären DNA Komponente kombiniert werden, die eine geeignete Rekombinationsstelle enthält (je nach Design von TZT wäre das eine lox Stelle oder Abkömmlinge in Verbindung mit der Rekombinase Cre, eine FRT Stelle in Verbindung mit der Rekombinase Flp, oder beide gleichzeitig, oder andere sequenzspezifische Rekombinationsstellen für eine effiziente in vitro Anwendung) (Fig. 1 9) . Tabelle 1 :
Synthetische Oligonukleotide:
G438: 5'-GGCCGCGCTAGGGATAACAGGGTAATATA-3'
G439: 5'-GGCCTATATTACCCTGTTATCCCTAGCGC-3'
Durch Annealen von G438 mit G439 entsteht ein doppelsträngiges DNA-Fragment, das eine Iscel-Konsensus-Sequenz enthält und in eine Notl-Stelle kloniert werden kann.
LPF: 5'-GAAACGGCCTTAACGACGTAGTCG-3' LPR: 5'-ATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTG-3'
PCR-Primer um 1 10 Bp des PAC-Vektors zu amplifizieren, die die lox-Stelle enthalten (Nukleotid Positionen 1 973-2082 Genbank Acc. U091 28) .
ASal: 5'-GCGAGTCGACAGGGCCTCGTGATACG-3' ABs: 5'-GATTGCGCGCAGAAAAAAAGGATCTC-3'
PCR-Primer um 1 263 Bp des Vektors pSP73 (Nukleotid Positionen 939-2202 Genbank Acc. X65333) mit dem Ampicillin-Resistenzgen zu amplifizieren. Die Sequenzen der Primer sind in einzelnen Basen modifiziert, um eine BssHII-
Spaltstelle (ABs) und eine Sall-Spaltstelle (ASal) an den Enden des PCR-Produkts einzuführen.
Kf: 5'-GGAAAACAGCATTCCAGGTATTAG-3' Kr: 5'-CCATGAGTGACGACTGAATCCG-3'
PCR-Primer um 282 Bp des Kanamycin-Resistenzgens des PAC-Vektors zu amplifizieren (Nukleotid Positionen 10683-10965 der Genbank Acc. U091 28) .
PT21 : 5'-TTAAGGCGCCAAATCTAGAGGATCCGCGCGCAAGAGGTCGACCTAA-3'
PT22: 5'-GTCGACCTCTTGCGCGCGGATCCTCTAGATTTGGCGCC-3' PT21 und PT22 annealen zu einem doppelsträngigen DNA-Fragment, das als Linker verwendet wurde, um die Restriktionsstellen Narl, Xbal, BamHI, BssHII und Sall zwischen die Restriktionsstellen Bfrl (Nukleotid Position 3309 im Vorläufer Acc. U091 28) und BstXI (Nukleotid Position 291 7 im Vorläufer Acc U091 28) des Vektors PT1 einzuschleusen.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1 . Verfahren zur Herstellung eines DNA-Konstruktes, umfassend die Kombination zweier DNAs mittels Rekombination in geschmolzener Agarose.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das DNA-Konstrukt eine Länge von mehreren 100 kb aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das DNA-Konstrukt ein künstliches Säugetier-Chromosom (MAC) ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 -4, wobei die Rekombination über rekombinationsspezifische Sequenzen i.V.m. einer Rekombinase erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Rekombination über lox-Sequenzen i.V.m. einer Cre-Rekombinase erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Rekombination über FRT-Sequen- zen i.V.m. einer FLP-Rekombinase erfolgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 7, wobei eine der DNAs zirkulär und die andere linear ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 7, wobei beide DNAs linear sind.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 -7, wobei beide DNAs zirkulär sind.
1 1 . Vektor mit ein oder mehreren Telomeren.
1 2. Vektor nach Anspruch 1 1 , wobei zwei Telomere vorliegen.
1 3. Vektor nach Anspruch 1 1 , wobei die zwei Telomere entgegengesetzt orientiert sind und zwischen den Telomer-Anfängen eine rekombinationsspezifische Sequenz vorliegt.
14. Vektor nach Anspruch 1 3, wobei die rekombinationsspezifische Sequenz eine lox-Sequenz ist.
1 5. Vektor nach einem der Ansprüche 1 2-14, umfassend ferner zwei Resistenzgene, wobei eines davon zwischen den Telomer-Enden und das andere zwischen den Telomer-Anfängen liegt.
1 6. Vektor nach einem der Ansprüche 1 2-1 5, umfassend ferner zwischen den Telomer-Anfängen und/oder -Enden Erkennungssequenzen für seltene und/oder ein- bzw. mehrfach schneidende Restriktionsenzyme.
17. Verfahren zur Bereitstellung von großer DNA, umfassend die folgenden
Verfahrensschritte:
(a) Mischen einer Bakterienkultur mit geschmolzener Agarose, wodurch nach Erkalten letzterer Agarose-Blöckchen erhalten werden.
(b) Einführen einer oder mehrerer Restriktionsenzyme in die Agarose-
Blöckchen, wobei die Restriktionsenzyme nur das bakterielle Chromosom, nicht aber die große DNA spalten, und
(c) Durchführen einer Gelelektrophorese, wodurch das gespaltene bakterielle Chromosom aus den Agarose-Blöckchen entfernt wird, während die große DNA zurückgehalten wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1 7, wobei die große DNA ein BAC oder ein PAC ist.
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