DE102007043131A1 - De novo Formierung künstlicher Chromosomen aus prä-fabrizierten Multigenkonstrukten in primären Zellen zur Erzeugung von Organen für die Transplantationsmedizin/Xenotransplantation - Google Patents

De novo Formierung künstlicher Chromosomen aus prä-fabrizierten Multigenkonstrukten in primären Zellen zur Erzeugung von Organen für die Transplantationsmedizin/Xenotransplantation Download PDF

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    • C12N2800/208—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of mammalian origin, e.g. minichromosome

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Einführung multipler Transgene in eine primäre Zelle und auf Verfahren zur Herstellung multi-transgener primärer Zellen, Gewebe und/oder Tiere unter Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts, das in der Lage ist, de novo künstliche Chromosomen zu bilden. Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Verwendung der multi-transgenen primären Zellen, Gewebe und/oder Tiere, bevorzugt im Zusammenhang mit der Xenotransplantation. Die Nukleinsäurekonstrukte, die in der Lage sind, de novo künstliche Chromosomen zu bilden, werden genutzt als effiziente Mittel für den Transfer multipler humaner Transgene und daher zu Generierung von Tieren als Organspender in der Xenotransplantation.

Description

  • Um eine Organabstoßung hinauszuzögern oder zu vermeiden, müssen Schweine mit multiplen Transgenen erzeugt werden. Schwierigkeiten vorhandener Transgenvektoren schließen eine Größenbegrenzung (oft < 10 kb) und ineffiziente Zucht von Schweinen mit multiplen Loci ein. Künstliche humane Chromosomen (HAC von „Human Artificial Chromosomes") haben gezeigt, dass stabile Segregation von Niedrig-Kopie-Elementen de novo durch den Transfer großer DNA-Konstrukte in humane HT1080-Tumorzellen erzeugt werden kann, unter der Voraussetzung, dass eine Zentromer-profiziente Satelliten-DNA (> 100 kb) enthalten war. Jedoch ist bisher eine de novo Satelliten-Sequenz in keinem anderen Säugetier, einschließlich der Maus, kloniert worden. Der Antragsteller hat folgendes entwickelt 1) eine 50 kb PCR für die Subklonierung der Genloci, 2) biochemische Verbindung langer DNA-Konstrukte und Transfer, 3) einen telomerisierten PAC-Vektor (26 kb). Der Vektor enthält einen CMV/EGFP-Marker und eine weiß/blaue Klonierstelle für die Produktion einer genomischen DNA-Bibliothek in E. coli. Eine mit Satelliten angereicherte Bibliothek (100–200 kb) wird erzeugt werden und Klone werden mittels Sequenzierung und Strukturanalyse analysiert werden. Die Zentromerformierung wird nach dem Transfer in embryonale Schweinefibroblasten oder Mesenchymzellen und mikrovaskuläre Endothelzellen analysiert werden, gefolgt von einem Kerntransfer in Zusammenarbeit mit Prof. Eckhard Wolf in der Forschergruppe. FISH und Langzeit-Genexpression werden zur Identifizierung von Schweinefeten mit passenden SusACs (Sus scrofa artificial chromosomes) angewandt werden. Die de novo Strategie ermöglicht die nachträgliche Addition weiterer Gene in die getesteten Konstrukte, um Organe der nächsten Generation zu erzeugen. Die stabile Expressionsplattform wird von dne Einrichtungen für Schweine, der Erfahrung mit aktuell exprimierten Genen und dem Organüberleben sowie den Sicherheitsanalysen der anderen Konsortiumsmitglieder profitieren.
  • 1. Stand der Technik, vorläufige Arbeit
  • Einführung
  • Künstliche Säugetierchromosomen (MACs von Mammalian Artificial Chromosomes) stellen ein ideales, nicht integrierendes Gen-Zufuhrsystem mit einer ausreichenden Klonierungskapazität für die Aufnahme multipler Genloci dar. Die de novo Konstruktion der MACs basiert auf der Transfektion großer Konstrukte „nackter" DNA, die zur Formierung stabil segregierender Niedrig-Kopie-Episome führt. Eine der wichtigsten Komponenten ist ein funktionelles Zentromer, und kürzlich durchgeführte Studien mit Kandidaten-Sequenzen, die in Menschen Zentromere formieren, ergaben ein überraschend klares Bild. Der Prozess der de novo Zentromerformierung auf künstlichen humanen Chromosomen (HAC) in kultivierten HT1080 Tumorzellen funktionierte nur effizient mit Mitgliedern der primären, evolutionär modernen Klasse humaner Alpha-Satelliten-DNA, die aus langen homogenen, Tandem-Repeat-Arrays zusammengesetzt ist und Bindungsstellen für das Zentromer-bindende Protein B (CENP-B) enthält. Unter Einschluss einer kürzlich durchgeführten Studie zur Zentromer-DNA des Chromosoms 5 (Kraner et al. in Vorb.) formierten alle suprachromosomalen Familien, die diese Kriterien erfüllen, effizient Zentromere. Alles in allem stellte sich heraus, dass es keiner magischen Sequenz bedarf, noch einer seltenen strukturellen Eigenschaft, um ein de novo profizientes Zentromer in Menschen zu erhalten. Bei Mäusen war die Isolierung des besten Kandidaten, eines homogenen Abschnitts der minoren Mäuse-Satelliten-DNA, unterstützt durch die Ergebnisse der 1) Robertson-Translokationen, die immer einen Anteil der minoren Satelliten zurück behielten, 2) Minichromosomen und 3) CENP-Eindungs-Analysen (Garagna et al. 1995, Zeng et al. 2004, Masumoto et al. 1989), unter Verwendung von YAC-Bibliotheken (McGuigan et al. 1998) nicht erfolgreich. Verglichen mit der Klonierung humaner Alpha-Satelliten-Sequenzen war dies nicht überraschend, da die größte, gut funktionierende, in einem YAC klonierte Alpha-Satelliten-Sequenz nur 70 kb war und die Effizienz < ca. 50 kb auf Null fiel (Neil et al. 1990, Ikeno et al. 1998, Kouprina et al. 2003). Im Gegensatz dazu können PACs viel größere Abschnitte (100–200 kb) mit einer hoch homogenen Tandem-Repeat-Struktur tragen (Schindelhauer und Schwarz 2002). Darüber hinaus könnte einer gewöhnlichen genomischen Bibliothek in Abhängigkeit von der Wahl des für die Bibliotheksproduktion verwendeten Restriktionsenzyms eine gewünschte Zentromerregion fehlen, weil die Tandem-Repeat-Arrrays typischerweise nur einen kleinen, spezifischen Satz von Restriktionsstellen innerhalb ihrer Repeats höherer Ordnung enthalten. Diese Neigung ist besonders problematisch bei Regionen mit hoher Homogenität (> 97%), die die besten Zentromerkandidaten darstellen.
  • HAC Expressionsplattform
  • Die hohe Klonierungskapazität der HACs ermöglicht die Einführung einer großen Auswahl an Genloci ohne die Größenbegrenzungen, die mit den derzeit verwendeten integrierenden Vektoren assoziiert werden (Choo 2001, Grimes et al. 2001, Mejia et al. 2001, Basu und Willard 2005, Glover et al. 2005). Eine Reihe anderer Ansätze befinden sich in der Entwicklung, wie zum Beispiel die Integration von Genen in zufällige oder gezielte Positionen vorhandener Chromosomen oder kleiner Marker-Chromosomen und deren Telomer-gerichtete Trunkierung (Barnett et al. 1993, Heller et al. 1996, Mills et al. 1999, Auriche et al. 2002, Yang et al. 2000, Katoh et al. 2004), jedoch könnte eine Kontrolle der Sequenzzusammensetzung bei der Einführung von multiplen Transgenen eingeschränkt sein. Ein grundlegend anderer Weg, künstliche Chromosomen zu erzeugen, ist ihre de novo Formierung nach Transfektion isolierter chromosomaler Elemente (Harrington et al. 1997, Ikeno et al. 1998). Es ist klar, dass der de novo Ansatz auf die Entwicklung von prä-fabrizierten HAC-Vektoren ausgerichtet ist, die alle Sequenzelemente enthalten, die für die Replikation, Segregation und Expression benötigt werden. Sobald ein funktionelles Konstrukt etabliert wurde, kann dieses Konstrukt dazu verwendet werden, zusätzliche Sequenzelemente und gewünschte Genloci damit zu verbinden, was besonders für die multiplen Gene nützlich ist, die für die Xenotransplantation erforderlich sind. Deshalb schloss die HAC-Entwicklung auch die Verbesserung der molekularen Werkzeuge für die präzise Konstruktion der langen DNA-Anordnungen aus geeigneten genomischen Ressourcen, wie zum Beispiel den BACs und PACs, ein. Es wurden zwei im Prinzip unterschiedliche Strategien für den Aufbau der gewünschten Sequenzen entwickelt. Mehrere Gruppen setzen auf eine schnelle Verbindung der funktionellen Sequenzelemente und Genloci unter Verwendung einer Modifikation der PACs/BACs innerhalb lebender E. coli-Zellen auf der Basis zufälliger und gezielter Rekombination (Meija et al. 2000, Kotzamanis et al. 2005, Basu et al. 2005). Innerhalb des vergangenen Jahrzehnts entwickelte die Gruppe des Antragstellers eine Technologie zum Aufbau langer DNA-Konstrukte unter Anwendung konventioneller Klonierung in PACs. Die lange DNA-Technologie schließt die Isolierung intakter DNA (> 100 kb) und nachfolgende Manipulation, wie zum Beispiel biochemische Verbindung (Schindelhauer und Cooke 1997), oder sehr lange PCR (derzeit bis zu 64,7 kb humaner genomischer DNA). zur Einführung von Restriktionsstellen mittels Primern, und den funktionellen Transfer ein (Laner et al. 2005). Eine Voraussetzung der MAC-Konstruktion ist die funktionelle Bewertung aller Sequenzelemente, die eingeschlossen werden sollen. Die Expression auf HACs wurde über die Komplementierung einer genetischen Defizienz in der verwendeten Wirtszelllinie nachgewiesen (Grimes et al. 2001, Meija et al. 2001, Ikeno et al. 2002). Für die Xenotransplantation wurde eine Anzahl von Kerngenen, die in ein SusAC eingebaut werden sollten, definiert und funktionell bewertet, einschließlich der Komplement-, Endothel-, Entzündungs-, Immun- und Koagulationsregulatoren (zusammengefasst in Tabelle 1). Die wachsende Anzahl der in den Organen zu exprimierenden Genen erfordert die Entwicklung einer stabil segregierenden Expressionsplattform mit der Kapazität, alle gewünschten Gene einzuschließen. Der hier vorgeschlagene de novo MAC-Ansatz bietet die Möglichkeit, ein „entwickelbares" Konstruktsystem zu erzeugen, das parallel zu in vivo Analysen für weitere biochemische Modifikationen und nachfolgenden Transfer in den gewünschten Schweinestamm zur Verfügung steht, der wahrscheinlich auf dem Alpha-1,3-Galactosyltransferase Knockout beruht (Projekt P II, Niemann). Tabelle 1 Im Konsortium verwendete Transgene und weitere Kandidaten für die Inklusion in ein SusAC
    Aktuelle Transgene Funktion Partner/ref
    hDAF CD55 Komplementinhibition P III
    CD59 Komplementinhibition P II
    hTM Humanes Thrombomodulin Koagulation normalisieren P II
    TRAIL TNFalpha-zugehöriger Apoptoseinduzierender Ligand Immunregulation P III
    HLA-E Immunregulation P III
    Zusätzlich
    HMCP CD46 Komplementinhibition
    hTFPI Humaner Gewebeweg-Inhibitor Koagulation normalisieren
    Hirudin Blutegelprotein Koagulation normalisieren
    NTPDase CD39* Koagulation normalisieren
    hHO-1 Humane Hämoxygenase-1 Koagulation normalisieren P II
    Humane Glykosyltransferasen sialyl-/fucosyl- Xeno-Antigen-Reduktion
    Neu
    CTLA4-I Non-Gal Epitopblocker Xeno-Antigen-Reduktion
    Kostimulation-blockierende Immunregulation P V
    Transene Immunregulation P III
    • *CD39 ist die hauptsächliche vaskuläre Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase (NTPDase). Es wandelt ATP und ADP in AMP um, das weiter zum antithrombotischen und entzündungshemmenden Mediator Adenosin abgebaut wird.
  • Der grundlegendste Aspekt der Entwicklung einer stabil segregierenden genetischen Einheit ist die Isolation einer Schweine-Zentromersequenz, die zu einer de novo Zentromerformierung nach Transfektion in kultivierte Zellen fähig ist. Seit den ersten Erfolgen der de novo HAC-Formierung unter Verwendung isolierter Zentromerarrays der Chromosomen 17 und 21 (Harrington et al. 1997, Ikeno et al. 1998) wurde eine Reihe von Kandidatensequenzen analysiert (siehe unten). Das umfassende Wissen über humane Zentromere kann nun auf die Entwicklung von SusACs für die Xenotransplantation übertragen werden.
  • Die folgenden ca. 6 Seiten geben eine Übersicht über die Alpha-Satelliten-DNA-Familien und ihre Rolle in der Zentromerfunktion und de novo Formierung auf künstlichen Chromosomen. Rezensenten, die einige der Details lieber auslassen möchten, überspringen bitte diesen Abschnitt und lesen weiter auf Seite 11 „Was wir von humanen Zentromeren gelernt haben".
  • De novo Formierung von Zentromeren
  • Die Funktion eines reinen Satelliten-Tandem-Arrays, der die Grundsequenz an allen normalen Säugetierzentromeren darstellt, wurde nicht zwangsläufig erwartet, weil niedere Eukaryoten spezifische und einzigartige Sequenzstücke in ihren Zentromeren enthalten. Während Säugetiere ein „regionales" Zentromer besitzen, das große Kinetochoren bildet, die multiple Mikrotubuli anbinden, bindet das „Punkt"-Zentromer von Saccharomyces cerevisiae nur einen Mikrotubulus und besitzt spezifische Proteinbindungsstellen innerhalb des 125 bp großen cen-Elements (Fitzgerald-Hages et al. 2982). In Schizosaccharomyces pombe werden einzigartige Zentromersequenzen von Tandemwiederholungen flankiert, und Teile beider Komponenten waren für die Zentromerfunktion wesentlich (Baum et al. 1994). Die Existenz solch einer „de novo Zentromerformierung", die allein auf einer bestimmten Satelliten-DNA basiert, wurde durch verschiedene Ergebnisse unterstützt. Zunächst haben viele HAC-Studien durch FISH-Analysen gezeigt, dass die erzeugten episomalen Elemente in einer geringen Anzahl von Kopien für viele Zellteilungen (100) in Abwesenheit einer Selektion aufrecht erhalten werden (Harrington et al. 1997, Ikeno et al. 1998, Henning et al. 1999, Ebersole et al. 2000, Meija et al. 2002, Laner et al. 2005, Kraner et al. in Vorb.). Die Berichte demonstrierten ebenfalls ein funktionelles Zentromer auf den HACs unter Verwendung von Kolokalisation der HAC-Zentromersequenzen mit spezifischen Zentromerproteinen, zum Beispiel CENP-A, eine Zentromer-spezifische Histon H3-Variante, die als eine der frühesten Komponenten betrachtet wird, die auf die replizierte Zentromer-DNA geladen wird und somit ein Schlüsselfaktor bei der Bestimmung der weiteren Assemblierung eines Kinetochors ist. CENP-C (Earnshaw et al. 1989, Saitoh et al. 1992), CENP-H (Sugata et al. 2000), CENP-I (Nishihashi et al. 2002) oder CENP-E, das bei der Anbindung der Mikrotubuli mitwirkt, sind weitere Proteine zur Markierung aktiver Zentromere. Andere Proteine, wie zum Beispiel CENP-B (Cooke et al. 1990, Earnshaw und Rothfield 1985), das einzige bekannte Zentromerprotein mit einer spezifischen Bindungssequenz, und CENP-G (Gimelli et al. 2000) können auch an inaktiven Zentromeren beobachtet werden. Eine echte de novo Formierung der HAC-Zentromere auf den Input-Sequenzen wurde des weiteren durch die Verwendung der FISH-Sonden anderer alphoider Sequenzen oder Chromosomenfärbungen unterstützt, um die Aufnahme zusätzlicher Zentromersequenzen auf den HACs auszuschließen. Die ersten echten de novo HACs wurden aus einem einzigen subklonierten HOR mit einer Größe von 2,6 kb aufgebaut. Somit enthielt der transferierte synthetische Array keine anderen Sequenzen, jedoch lag auch gesamtgenomische DNA in der Lipofektion vor. Die zweite erfolgreiche Zentromersequenz war eine homogene Alpha-Satelliten-DNA aus dem humanen Chromosom 21, die in einem telomerisierten YAC (Ikeno 1998) kloniert wurde. Dieser Chromosom 21-Array enthielt keine alu- oder LINS-Elemente und bestand aus Dimeren, die durchschnittlich eine Bindungsstelle für CENP-B (CENP-B Box) in jedem zweiten Monomer enthielten. Um das Fehlen anderer Sequenzen innerhalb der homogenen Alpha-Satelliten-DNA weiter zu unterstützen, wurden in PACs klonierte Arrays analysiert. Die Homogenität der HOR-Struktur wurde durch partielle Restriktionskartierung ganzer Inserts von 110 bis 160 kb aus Chromosom X nachgewiesen, die homogene Leitern der 2 kb Repeats höherer Ordnung mit nur wenigen Ausnahmen innerhalb stärker divergierender PACs (Schindelhauer und Schwarz 2002) aufwiesen. Ein Sequenzierungsversuch einer seltenen Lücke, die zwischen zwei Repeats höherer Ordnung mit einem unregelmäßigen Abstand in einer der analysierten PACs, B11, identifiziert wurde, ergab eine einfache Verschiebung, die wahrscheinlich durch Duplikation eines gewöhnlichen Pentamer-Segments der Alpha-Satelliten-DNA innerhalb dieses ansonsten normalen Dodekamer-Repeats höherer Ordnung des humanen X-Chromosoms verursacht wurde. Es wurden in diesem unregelmäßigen Segment keine anderen Sequenzen als Alpha-Satelliten-Sequenzen detektiert, und es stellte sich heraus, dass das ungewöhnliche Vorhandensein der seltenen Schnittstelle MluI an dieser Position das Ergebnis eines einzelnen Nukleotidaustauschs war. Die Studie demonstrierte außerdem eine hohe Klonierungsstabilität der internen Anordnung der HORs unter Verwendung einer informativen Nukleotidvariante, die eine DraI-Stelle in einige der HORs der PAC A7 einführte, was in einem typischen partiellen Restriktionsmuster resultierte. Das Muster war nach 800 bakteriellen Zellteilungen unverändert und demonstrierte das Fehlen intramolekularer Rekombination innerhalb eines PAC, eine wichtige Voraussetzung für die Analyse von genuinen Arrays. Solche homogenen partiellen Restriktionsmuster ganzer Alpha-Satelliten-PACs wurden auch für ein Chromosom 17 Array-Segment mit 200 kb durchgeführt, das ausschließlich aus 2,6 kb Repeats höherer Ordnung zusammengesetzt war. HACs, die aus diesem homogenen Array erzeugt wurden, das in den telomerisierten PAC-Vektor pTAT-Bs kloniert wurde, und einer Baktofektion oder Lipofektion unterzogen wurden (Laner et al. 2005), segregierten stabil in Abwesenheit von Selektion, banden CENP-A, und enthielten keine anderen Sequenzen als die Input-Alpha-Satelliten-Sequenzen. Die Funktion eines anderen Chromosom 17-Klons war auch aus einer Studie bekannt, die Chromosom 17 und V-Arrays vergleicht und nur mit dem 17-Array eine effiziente HAC-Formierung aufwies (Meija et al. 2002). Eine Studie mit Alpha-Satelliten-Sequenzen, die vom Rand des humanen X-Arrays isoliert wurden, der weniger homogen (< 95%) war und LINS-Insertionen enthielt, offenbarte einen Abfall der HAC-Effizienz unter ca. 10% (Schueler et al. 2001). Gemeinsam unterstützten diese Studien die Auffassung, dass Insertionen anderer Sequenzen innerhalb der funktionierenden Array-Segmente ungewöhnlich seien, und argumentieren somit gegen andere Elemente, die für eine de novo Zentromerfunktion erforderlich sind. In dieser Hinsicht argumentieren eine Reihe von Beobachtungen ebenso gegen die Aufnahme von funktionellen Zentromersequenzen aus Wirtschromosomen über homologe Rekombination. Im Allgemeinen ist die Sequenzhomogenisierung zwischen verwandten Sequenzen aus verschiedenen Chromosomen-Arrays innerhalb einer Familie sehr ineffizient (zum Beispiel X, 17, 11). In ähnlicher Weise sind Translokationen zwischen Chromosomen mit nahezu identischen Alpha-Satelliten-Arrays, wie auf den Chromosomen 5 und 19, nicht aufgefallen. Des weiteren sind HACs im Verlauf von FISH-Analysen für gewöhnlich freie Elemente, aber sie assoziieren auch häufig mit Telomeren und Zentromeren endogener Chromosomen. Derartige Assoziationen schienen in HT1080-Zellen nicht sequenzabhängig zu sein, da sie regelmäßig mit nicht verwandten Zentromeren beobachtet wurden (unveröffentlichte Beobachtungen). Diese Auffassung wird auch durch eine große Studie zu natürlichen Marker-Chromosomen unterstützt, die hauptsächlich Alpha-Satelliten-Arrays der Chromsomen 16 und 18 aus zwei vermutlich genetisch gesunden Individuen enthielten. Auch wenn beide Fälle häufige zentromerische Assoziationen in Lymphozyten (n > 1000) mit nahezu allen Chromosomen aufwiesen, zeigten die verwandten Chromosomen weder eine Chromosomen-Trunkierung noch existierte eine besondere Neigung zu Assoziationen mit den verwandten Chromsomen hin (Felbor et al. 2002). Alles in allem deuten die Studien darauf hin, dass die de novo Formierung eines HAC auf der transfizierten Alpha-Satelliten-DNA stattfindet. Die folgenden Abschnitte werden eine Übersicht über die von Menschen erhaltenen Daten geben, um die vergleichsweise wenigen verfügbaren Daten aus Schweinezentromeren auswerten zu können.
  • Humane Alpha-Satelliten Repeats wurden in fünf suprachromosomale Familien klassifiziert
  • Alle Säugetier-Zentromere enthalten große Arrays von Satelliten-DNA. Die Sequenz der Satelliten, die Größe der Repeats höherer Ordnung, der GC-Gehalt und die Array-Größe können von Chromosom zu Chromosom und zwischen nahe verwandten Spezies stark variieren. Eine Reihe nicht-Mendelscher molekularer Mechanismen, wie ungleiches Crossing-over, Sequenzkonversion oder -transposition, jede in ihrer eigenen Geschwindigkeit, tragen zu dem gesamten Homogenisierungsprozess bei und resultieren in einer konzertierten Evolution der Satellitenfamilien und ihrer Mitglieder innerhalb der Chromosomen, zwischen Chromosomen und innerhalb der Population (Dover 1982, Warburton und Willard 1992, Elder und Turner 1995, Henikoff 2001, Schindelhauer und Schwarz 2002). Nicht-interagierende Populationen werden ihren eigenen Satz an Satellitensequenzen entwickeln. Dies wird anhand der Analyse von Menschenaffen- und humanen Alpha-Satelliten-Sequenzen auf dem X-Chromosom veranschaulicht. Während die Variation in normaler genomischer DNA bei nur 0,2–0,3% innerhalb einer Spezies liegt und bei 1,0–1,5% zwischen den Spezies (The Chimpanzee Sequencing and Analysis Consortium 2005), divergieren die verwandten X-Alpha-Satelliten-Arrays um 5–10% (Durfy und Willard 1990, Schindelhauer und Schwarz 2002).
  • Alle normalen Zentromere von Primaten enthalten Mb-lange Abschnitte mit Alpha-Satelliten-Sequenzen. Es wird angenommen, dass sich die Alpha-Satelliten-Arrays der Menschenaffen aus einem alten Typ eines 171 bp Repeats entwickelt haben, ähnlich demjenigen, der immer noch im Genom der Afrikanischen grünen Meerkatze Cercopithecus aethiops vorliegt (Goldberg et al. 1996). Arrays dieses primordialen Typ A-Monomers, dem die CENP-B Boxen fehlen, sind verwandt mit der humanen suprachromosomalen Familie 4, die den einzigen Alpha-Satelliten-Typ umfasst, der auf dem humanen Y-Chromosom gefunden wurde (Alexandrov et al. 1993). Vor 15–25 Millionen Jahren entstand ein verwandtes B-Typ Monomer, das eine CENP-B Box enthielt (Haaf et al. 1995, Romanova et al. 1996). Nach wie vor findet man im Menschen einige alt aussehende homogene Arrays mit unregelmäßig verteilten Typ A- und Typ B-Monomeren und diese wurden in die suprachromosomale Familie 5 eingeordnet. Vor vielleicht 7 Millionen Jahren führte die Amplifikation verschiedener multimerischer Anordnungen von 170/171 bp Monomeren zur Entwicklung der modernen suprachromosomalen Familien 1–3, wobei die Familien 1 und 2 aus Dimeren der Typ A- und Typ B-Monomere bestehen (Wu und Manuelidis 1980, Thompson et al. 1989), während die Familie 3 durch eine Amplifikation eines Pentamers entstand (Tabelle 1, Waye und Willard 1987, Alexandrov et al. 1988, Lee et al. 1997, Alexandrov et al. 2001). Ein typisches Merkmal der Evolution der Zentromere der Menschenaffen (und auch anderer Spezies) ist, dass die Homogenisierung überwiegend intrachromosomal verläuft und so zu Teilmengen moderner Array-Familien führte, die nur für eine oder eine kleine Gruppe von Chromosomen spezifisch sind (Willard und Waye 1987, Waye und Willard 1989). Die jüngsten, aktuellen Evolutionsschritte in den Menschenaffen- und Menschenabstammungslinien waren die Amplifikation dieser Mono-, Di- und Pentamere zu den derzeitigen Chromosomen-spezifischen Repeatstrukturen höherer Ordnung, die 2–34 Monomere enthalten und typische Homologien von > 97% innerhalb eines Array aufweisen. Normale humane Chromosomen, das Y-Chromosom ausgenommen, enthalten mindestens einen modernen Array-Typ der suprachromosomalen Familien 1–3, sowie alte Typen der Familien 4 und 5. Einzelne Chromosomen können nur ein (X, 17) oder mehr als ein Array (Beispiele Chr. 1, 7, 5, 19) aufweisen. Eine Übersicht über die Organisation und Verteilung der suprachromosomalen Familien ist in Tabelle 2 dargestellt, modifiziert aus veröffentlichten Quellen (Alexandrov 1993, Romanova et al. 1996, Finelli et al. 1996, Lee et al. 1997, Alexandrov et al. 2001, Schwarz und Schindelhauer, in. Vorb.) Tabelle 2: Organisation, chromosomale Vereilung und de novo Effizienz der fünf suprachromosomalen Alpha-Satelliten-DNA-Familien in Menschen.
    Suprachromosomale Familie Struktur Chromsomen2 DNA-Arays, die in Versuchen verwendet wurden, um künstliche humane Chromosomen de novo zu bilden
    1 J1-J2 (modernes Dimer 1, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 16, 19 D5Z2 (Laner et al. 2004, Laner et al. 2005, Kraner et al. in Vorb.)
    2 D1-D2 (modernes Dimer) 2, 4, 8, 9, 13, 14, 15, 18 (2 Arrays), 20, 21, 22 D21Z1 (Ikeno et al. 1998, Ebersole et al. 2000, Ohzeki et al. 2002) D14Z9/D22Z? (Henning et al. 1999)
    3 W1-W2-W3-W4-W5 (modernes Pentamer) 1, 11, 17, X D17Z1 (Grimes et al. 2002, Meija et al. 2002, Basu et al. 2005, Laner et al. 2005) DXZ1 (Harrington et al. 1997, Schueler et al. 2001)
    4 M1 (altes Monomer) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X, Y ⎕21-II? (Masumoto et al. 1998) D22Z2 (Kouprina et al. 2003) DYZ3 (Grimes et al. 2002, Meija et al. 2002, Kouprina et al. 2003)
    5 R1, R2 (alte Dimere) 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22? Chr. 22 (Kouprina et al. 2003) D5Z1 (Kraner et al. in Vorb.)
    • 1Typ B-Monomere, die CENP-B Boxen enthalten, sind fett gedruckt.
    • 2Arrays, die effizient HACs de novo formiert haben, sind fett gedruckt; diejenigen, die ineffizient waren oder vollständig versagten, sind unterstrichen.
  • Alle evolutionär neuen Familien mit CENP-B Boxen waren in der Lage, Zentromere de novo zu bilden
  • Nicht alle Alpha-Satelliten-Sequenzen bildeten effizient Zentromere. Zum Beispiel bildete ein divergiertes Array des Chromosoms 21, dem die CENP-B Boxen fehlen, keine HACs und integrierte immer. Darüber hinaus integrierte das CENP-Benthaltende Segment des Chromosoms 21, das effizient Zentromere säte, in ein Wirtschromosom nach Einführung einer kritischen Mutation in die CENP-B-Box (Ohzeki et al. 2002). Die Y-Alpha-Satelliten-DNA, die einer alten Familie angehört, der die CENP-B-Boxen fehlen, bildete Zentromere nur sehr schlecht (Grimes et al. 2002, Meija et al. 2002, Kouprina et al. 2003), was nahelegt, dass ein homogenes Array mit CENP-B-Boxen für die Zentromerfunktion erforderlich ist. In diesem Zusammenhang wurde bei einer Reihe nicht-alphoider Sequenzen, einschließlich eines klonierten Neozentromers (Saffery et al. 2001) und eines synthetisches Arrays von pBR322 Sequenzen mit oder ohne CENP-B-Boxen (Ohzeki et al. 2002), keine de novo Aktivität beobachtet. Ein Mitglied der suprachromosomalen Familie 4 (SF4), abgeleitet von Chromosom 21, das einen divergierten Array ohne CENP-B-Boxen umfasst, zeigte keine de novo Zentromer-Formierung (Ikeno et al. 1998). Auch ein natürlicher homogener Array auf Chromosom 5, der zur Familie SF5 gehört, die nur mutierte CENP-B Boxen enthält, unterstützte nicht die Zentromer-de novo-Formierung (Kraner et al. in Vorb.). Jedoch wurde bei allen modernen suprachromosomalen Familien, SF1-3, die die Hauptklasse der Alpha-Satelliten-DNA umfassen, die auf allen humanen Autosomen und dem X-Chromosom zu finden sind, eine effiziente de novo Zentromerformierung auf künstlichen humanen Chromosomen beobachtet. SF3 schließt die profizienten 17 (Harrington et al. 1997, Meija et al. 2002, eigene Arbeit) und X-Arrays (Schueler et al. 2001) mit ein. Interessanterweise funktionierte ein synthetischer 17-Array mit einer mutierten CENP-B-Box nicht (Basu et al. 2005). Die Profizienz von SF 2 wurde mit einem Chromosom 21-Array demonstriert (Ikeno et al. 1998) und auch bei einem Chromosom 14/22 -Mitglied beobachtet (Henning et al. 1999). Ein synthetisches 21-Array mit mutierten CENP-Boxen funktionierte nicht (Ohzeki et al. 2002, Ikeno et al. 2002). Die SF 1 Funktion wurde kürzlich unter Verwendung eines Chromosom 5 Arrays gezeigt (Laner et al. 2004, Laner et al. 2005, Kraner et al. in Vorb.). Interessanterweise zeigte die letztgenannte Studie auch, dass die Stelle des Kinetochors auf normalen Chromosomen 5 und 19 mit der SF1-Familie lokalisiert und nicht mit einem SF5-Array, das ebenfalls auf diesen Chromosomen vorliegt. Die de novo Formierung und die Aufrechterhaltung der Zentromere schließt daher die gleiche Hauptklasse von Sequenzen ein.
  • Hypothesen über die Notwendigkeit einer Zentromersequenz variierten stark
  • CENP-B-Boxen sind 17 bp Eindungs-Sequenzen (Masumoto et al. 1989, Muro et al. 1992), die innerhalb der Alpha-Satelliten-Sequenzen aller höherer Primaten gefunden werden (Haaf et al. 1995). Das Protein CENP-B ist von der Hefe bis zum Menschen stark konserviert (Irelan et al. 2001) und Bindungsstellen mit 9 von 17 Nucleotiden wurden in der minoren Satelliten-DNA von Mus musculus und in Mus caroli gefunden (Kipling et al. 1995). Jedoch wurden in anderen Spezies keine CENP-B-Boxen entdeckt, einschließlich niederer Affen ebenso wie auf dem Y-Chromosom (Tyler-Smith und Brown 1987, Masumoto et al 1989), und es ist nach wie vor nicht bekannt, ob ein funktionelles Homolog in diesen Fällen dem Zentromer dienen könnte. Es war jedoch nicht klar, ob CENP-B bei der Zentromerfunktion überhaupt eine wichtige Rolle spielen würde, da bisher kein CENP-B an Neozentromeren beobachtet worden ist, die gelegentlich Chromosomfragmente retten können, denen Alpha-Satelliten-Sequenzen fehlen, und 20 andere Zentromerproteine enthalten, die von den > 100 bekannten Proteinen analysiert wurden, von denen die meisten von der Hefe bis zum Menschen sehr gut konserviert sind (Voullaire et al. 1993, Choo 1997, Barry et al. 1999, Warburton et al. 2000, Amor und Choo 2002, Amor et al. 2004, für einen Überblick der Zentromerproteine siehe Liu et al. 2006). Stabile Di-Isochromosomen banden darüber hinaus immer noch CENP-B sowohl an ihrem inaktiven als auch aktiven Alpha-Satelliten-Array (Sullivan und Schwartz 1995, Sullivan und Willard 1998), und CENP-B Knock-out-Mäuse überlebten und entwickelten sich (Kapoor et al. 1998, Perez-Castro et al. 1998, Hudson et al. 1998, Fowler et al. 2000). Daher kann CENP-B allein nicht essentiell für die Neuformierung und Aufrechterhaltung von Zentromeren sein. Auf der anderen Seite ergab ein Versuch, die Chromosomenarmsequenz zu verwenden, die einem Neozentromer auf einem HAC-Konstrukt zugrunde liegt, keine de novo Zentromer-Formierung (Saffery et al. 2001). Interessanterweise fand man bei einem Satz von Markerchromosomen, abgeleitet von 13q, das Neozentromer in jedem einzelnen Fall an einer anderen Position, was gegen eine spezifische Sequenz mit einer hohen Wahrscheinlichkeit für die Assemblierung eines Neozentromers spricht (Alonso et al. 2003, Cardone et al. 2006). Dieser Mangel einer klaren Sequenzeinschränkung für die Kinetochor-Formierung, zusammen mit Beobachtungen von bestrahlten Chromosomenfragmenten in Drosophila, schlug eine epigenetische Definition eines Zentromers vor, das weitgehend von der zugrunde liegenden Sequenz unabhängig ist (Kargen und Allshire 1997, Sullivan et al. 2001).
  • Was wir von humanen Zentromeren gelernt haben
  • Innerhalb des letzten Jahrzehnts der HAC-Forschung wurden eindeutig beide Extreme widerlegt, die „rein epigenetische" Hypothese und die „Einzelsequenz"-Hypothese der Zentromerfunktion. Ungeachtet der bleibenden Fragen zur Zentromerfunktion und der Rolle einer Primärsequenz, schlagen die Daten vor, dass eine de novo Zentromerformierung eine normale Fähigkeit der verschiedenen Hauptfamilien der Satelliten-DNA ist, die auf normalen Chromosomen vorzufinden sind. Alle normalen humanen Chromosomen, ausgenommen das Y-Chromosom, enthalten mindestens ein langes Alpha-Satelliten-Array, das zu einer der modernen Familien SF1-3 gehört und ebenfalls CENP-B Boxen enthält (Masumoto 2004, Kraner et al. in Vorb.). Mitglieder aller dieser „modernen" Familien zeigten auch eine de novo Ausprägung (Schwarz und Schindelhauer, in Vorb.). Die an menschlichen Zentromeren gelernten Lektionen schlagen vor, dass die Zentromerisolierung bei Schweinen durchführbar sein sollte, sofern ein großes Array einer modernen Klasse normaler Zentromer-Satelliten-DNA kloniert werden kann.
  • Schweine-Satelliten-DNA kann in mindestens zwei suprachromosomale Familien klassifiziert werden
  • Bei der Suche nach „apha satellite" generiert die EMBL/Genbank-Datenbank 852 Treffer, einschließlich 220 aus unseren kürzlich durchgeführten Studien. Gibt man "sus satellite or repeat and centromere" ein, werden nur 21 Treffer generiert, auch wenn einige von ihnen interessante Kandidaten zu sein scheinen. Der Schweine-Karyotyp ist bimodal, zwei Drittel der Chromosomen (1–12, X) sind metazentrisch, vergleichbar mit den meisten humanen Chromosomen. Die übrigen (13–18) sind akrozentrisch und ähneln den akrozentrischen oder telozentrischen Mäuse-Chromosomen, die große Blöcke Heterochromatin an ihren Zentromeren enthalten (Adega et al. 2005), von denen bekannt ist, dass sie eine geringfügige Rolle in der Zentromerfunktion spielen, da heterochromatische Marker nicht unbedingt auf HACs detektierbar sind (Grimes et al. 2004). Bei Mäusen werden 6 Mb-lange majore Satelliten-Blöcke von nur einigen hundert kb minorer Satelliten flankiert, von denen Teile wahrscheinlich die funktionellen Zentromere darstellen (Zeng et al. 2004).
  • Es sind zwei Hauptklassen der zentromerischen Schweine-Satelliten-Sequenzen bekannt (Tabelle 3). Die MC-Klasse ist auf allen metazentrischen Chromosomen 1–12 und dem X-Chromosom zu finden und weist Chromosomen spezifische Teilmengen auf, die mit der humanen Alpha-Satelliten-DNA vergleichbar sind. MC-Tandem-Repeats haben eine ca. 340 bp Monomerstruktur (Jantsch et al. 1999, Miller et al. 1993), und in einem Fall, auf Chromosom 9, konnte man beobachten, dass sie sich über ein repetitives Array von mindestens 2 Mb erstrecken, das vielleicht aus 3,3 kb langen Dekameren zusammengesetzt war, wie man sie in einem Cosmid vorfand (Janzen et al. 1999). Teilmengen verwandter Sequenzen sind auch auf anderen metazentrischen Chromosomen vorhanden (Rogel-Gaillard et al. 1997), was vorschlägt, dass auf 340 bp Monomeren basierende Familien, ähnlich den humanen suprachromosomalen Familien, die auf 170/171 bp Monomeren basieren, auf den metazentrischen Chromosomen charakterisiert werden könnten.
  • Die AC-Klasse ist auf allen akrozentrischen Chromosomen 13–18 zu finden. Mehrere divergierte Mitglieder sind sequenziert worden. Die repetitive Einheit ist 14 bp lang und Multimere von divergierendem Inhalt. Bei einem 51 bp langen Repeat (MC2) wurde nachgewiesen, dass es an Chr. 11 hybridisiert (Riquet et al. 1996). Tabelle 3. Mindestens zwei suprachromosomale Familien der Satelliten-DNA existieren an den Schweinezentromeren
    Suprachromosomale Familie Struktur Chromosomen Ref.
    Mc1 340 bp Monomere, Arrays 1–12, X Jantsch et al. 1990 Miller et al. 1993 Rogel-Gaillard et al. 1997
    Ac2 14 bp divergierend 13–18 Jantsch et al. 1990
    Y Kein Satellit beschrieben
    Andere Familien
    Mc2 S0048: 51 bp divergierend 11 Riquet et al. 1996
    Chromosomenspezifisch
    pAV1,5 340 bp 1 Jantsch et al. 1990
    6,1 (pSac3.3-2) 340 bp 10-merisch, Tandem-Array 9 Janzen et al. 1999
  • Die Schweinedaten, die von den metazentrischen Chromosomen erhalten wurden, schlagen eine ungefähr ähnliche Organisation der zentromerischen Satelliten im Vergleich zur Situation beim Menschen vor. Möglicherweise deuten die divergierende Natur und die kurzen repetitiven Einheiten der zweiten Klasse, AC2, darauf hin, dass echte Zentromersatelliten für akrozentrische Chromsomen nicht identifiziert wurden. Strukturelle und funktionelle Analysen höherer Ordnung von subklonierten Array-Segmenten müssen durchgeführt werden, um ihre Zusammensetzung und Zentromerprofizienz in Schweinezellen abzuklären.
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  • 2. Beschreibung der Erfindung
  • Stand der Forschung
  • Durch die Transfektion langer DNA Konstrukte, die eine geeignete Zentromersequenz tragen, konnten sich in menschlichen Zellen de novo Chromosomen formieren (Harrington 1997, Ikeno 1998, Henning 1999, Ebersole 2000, Grimes 2001, Mejia 2002).
  • Bislang konnten de novo Chromosomen nicht in primären Zellen und in keiner Tierart, sondern ausschliesslich in menschlichen kultivierten Tumorzellen erhalten werden (Moralli 2006). Dafür wurden menschliche Satellitensequenzen mit einer Länge von 100 kb und mehr verwendet. Eine Transfektion tierischer Satellitensequenzen führte in der Maus bislang nicht zu bekannt gewordenen, stabil vererbten de novo Chromosomen, vermutlich weil die verwendeten menschlichen Satelliten, die in Tumorzellen funktionierten, oder die bislang stabil klonierten Mäuse-Satelliten Abschnitte keine funktionellen Zentromere in der Maus darstellten. Aufgrund der erheblichen Sequenzunterschiede der Zentromersatelliten zwischen verschiedenen Arten wurde vermutet, dass speziesspezifische Satelliten verwendet werden müssen.
  • Die de novo formierten Chromosomen sind eigenständige genetische Einheiten, die als low copy element mit 1–2 Kopien replizieren und exakt auf die Tochterzellen aufgeteilt werden. Sie werden typischerweise ohne Selektion für mindestens 100 Zellteilungen stabil vererbt.
  • Bislang ist es unserem und anderen Laboratorien mehrfach gelungen, verschiedene Gene (von wenigen kb bis zu > 100 kb, mit dem bislang längsten nachgewiesenen Genort mit 300 kb in unserem Labor, unveröffentlicht) auf de novo künstlichen Chromosomen unterzubringen und zu exprimieren, vorausgesetzt ein funktionelles Zentromer wurde verwendet. Das Zentromerchromatin oder die Anwesenheit von Telomeren führte dabei nicht zum Abschalten der menschlichen Gene. Ein nichtfunktionierender Zentromersatellit integrierte dagegen in zufällige Positionen der zelleigenen Chromosomen des Wirts (Ikeno 1998, Poster Kraner 17 Feb. 2007) und bildete keine freien genetischen Einheiten, etwa wie es von konventionellen Gentransfektionen bekannt ist.
  • Erfindung
  • Durch ein neu entwickeltes Konstruktionssystem, das die Insertion von Genen und die Verbindung weiterer Gene in Form von telomerisierten PACs (P1 artificial chromosome für die Vermehrung langer genomischer DNA in E. coli) ermöglicht, können sehr lange Konstrukte erzeugt werden. Diese können in so hoher Qualität (Grad 1 DNA) und Menge bereitgestellt und gelagert werden, dass Schritt für Schritt weitere Genabschnitte hinzugefügt oder ausgetauscht werden können. Damit wird es möglich, künstliche Chromosomen mit multiplen Genen für die Xenotransplantation zu entwickeln, sobald ein funktionelles Schweinezentromer isoliert wurde. Durch die menschlichen und an den Menschen adaptierten Gene und Faktoren, die auf einer Multigeneinheit untergebracht werden müssen, sollen die Zelloberflächen und Organe gegen eine Abstossung geschützt werden. Dafür kommen z. B. Komplementfaktoren (CD46 und weitere), Gerinnungsmodulatoren (Thrombomodulin und weitere, CD39), Co-stimulierende Faktoren (PD-L1! und andere Tolerationsfaktoren, Immunmodulatoren CTLA, Cytokine IL10, IL23, Chemokine, HLA-E, HLA Klasse I, II, III Antigene, modifizierte Antigene, si-RNAs, oberflächenmodulierende Enzyme, und im weiteren Sinne Inhibitoren endogener Viren (PERV) und modifizierte immunogene Proteine in Frage, sowie gesundheitssteigernde Proteinvarianten gegen eine vorbestehende Zell/Organerkrankung. Die erreichbaren Längen der Konstrukte könnten mitunter die Kloniergrenze überschreiten. Dafür werden lange Konstrukte in geeigneten Vektorsystemen so untergebracht und hochwertig erzeugt, dass sie für eine Transfektion in primäre Zellen biochemisch zu noch längeren Konstrukten verbunden werden können (Schindelhauer and Cooke 1997). Die stabile Lagerung der charakterisierten Moleküle (Gene, telomerisierte Zentromere) erlaubt ein Wiederverwenden in fortlaufend weiterentwickelten Konstrukten für de novo Chromosomen. Dabei integrieren die multiplen Gene nicht in dem weiterzuentwickelnden Schweinestamm in mehrere zufällige Stellen der Chromosomen, sondern es entsteht eine einzige genetische Einheit, die fortlaufend im Labor weiterentwickelt werden kann (auf der Ebene funktioneller DNA). Da alle Gene auf einer einzigen Einheit zu liegen kommen, kann das Problem der genetischen Segregation multipler Gene bei der Vermehrung der Tiere wirkungsvoll vermieden werden.
  • Als Beispiel und Durchbruch für die vorliegende Erfindung wurde ein menschliches künstliches Chromosom mit einem Zentromer von Chromosom 5 im Schwein eingesetzt, Um festzustellen, ob das telomerisierte Konstrukt, von dem bekannt war, das es in menschlichen Tumorzellen effizient ein Zentromer formierte und zu autonomen künstlichen Chromosomen führte (Laner et al 2004, 2005), die bereits erfolgreich 3 Genabschnitte gleichzeitig stabil in menschliche Tumorzellen eingebracht hatten (genomisches HPRT-Gen, EGFP-Markergen, BS-Resistenzgen), auch in primären Schweinezellen zu einer stabil vererbten Einheit führt und eine selektionslose Weitergabe eines einzigen Elements während der Entwicklung eines gesamten Tierorganismus ermöglicht, wurden primäre Zellen eines frisch geschlachtetet Ebers (Alter 5 Monate) aus dem Knochenmark der Röhrenknochen isoliert, von Blut und Knochenresten gereinigt, und in Zellkulturschalen vermehrt. Nach Lipofektion des Konstrukts TTE1 das ca. 341 Repeateinheiten des 340 bp alpha Satelliten von Chromosom 5 (116 kb) enthält (Laner et al. 2004, Laner et al. 2005) und zu Grad 1 DNA präpariert wurde (eine Methode zur Herstellung sehr langer Moleküle ohne DNA Brüche, vgl Diplomarbeit Marko Noerenberg, Poster 17 Feb. 2007), wurde für ca. 4 Wochen mit Blasticidin S selektioniert. Von den 12 erhaltenen klonalen Zellinien aus dieser Transfection zeigten 8 eine grüne Fluoreszenz unter dem Mikroskop, weil sie ein Konstruktmolekül stabil aufgenommen hatten und vermehrten, das ein EGFP-Markergen enthielt. Zusätzlich durchgeführte Lipofektionen in mikrovaskuläre Endothelzellen führten ebenfalls zu einer hohen Rate an grün fluoreszierenden Klonen, was für die funktionelle Aufnahme eines einzigen Moleküls spricht. In dieser zuvor sehr gut charakterisierten DNA-Präparation enthielten ca. 70% der HAC-Moleküle (Human Artificial Chromosome) das intertelomerisch plazierte EGFP-Markergen, was eine Abschätzung der übertragenen Molekülzahl pro erfolgreichem, klonal wachsenden Transfektionsvorgang ermöglicht. Mit diesem Zentromerkonstrukt (unpubliziert) und anderen telomerisierten Genfragmenten (Marko Noerenberg, Diplomarbeit, Poster 17 Feb. 2007) war zuvor aufgefallen, dass in der Regel nur 1 oder 2 Konstruktmoleküle zu einem Zellklon führen können und Ereignisse mit multiplen Molekülen in der Regel zwar zu expressionsfähigen, aber nicht mehr teilungsfähigen Zellen führen, und das sogar in Tumorzellen. Das legte nahe, dass in primären Zellen am geeignetsten ein einziges übertragenes Molekül in der Zelle zu einem funktionellen Klon führen sollte, damit sie sich nach dem Transfer weiterteilen können. Von den grünen Zellklonen der Knochenmarkszellen wurden 8 deutlich fluoreszierende und gut wachsende Klone expandiert (eine Zellteilung in 2 Tagen). Von zwei gut wachsenden Klonen wurde einer für einen Kerntransfer verwendet, und 3 Muttertieren eingepflanzt. Aus einer erhaltenen Trächtigkeit aus ca 50 Blastocysten wurden zwei gesunde Ferkel geboren. Beide saugten und entwickelten sich normal. Sie zeigten deutliche und gleichmässige Grünfluoreszenz aller aussenliegenden Körperpartien und Schleimhäute (Tag 1 und 7). Von beiden Klongeschwistern wurden Hautbiopsien entnommen und primäre Fibroblastenkulturen angelegt, expandiert und die Grünfluoreszenz und Chromosomenzahl untersucht.
  • Gelegentlich erhaltene Epithelinseln und die vielen primären Fibroblasten zeigten deutliche Fluoreszenz unter dem Mikroskop. Die Intensität entsprach im wesentlichen der des ursprünglichen Zellklons. Die Grünfluoreszenz blieb während der weiteren Expansion bestehen, was einer praktisch 100%igen Stabilität entspricht. Eine Re-Selektion unter Blasticidin S eines Teils der Zellkulturen zeigte ein Überleben der Fibroblastenkulturen beider Schweine mit einer annähernd 100%igen Rate, nur einzelne der ca 10 5 re-selektionierten Zellen lösten sich ab, während praktisch alle nach einer anfänglichen Erholungsphase nach wenigen Tagen das volle Wachstum wiederaufnahmen und weiterhin dauerhaft grün fluoreszierten.
  • Bei der Auszählung der DAPI gefärbten Metaphasechromosomen der Fibroblastenkultur wurde ein normaler Chromosomensatz gezählt. Es konnten immer wieder zusätzliche kleine DAPI-Elemente beobachtet werden, die nahe bei den normalen Chromosomen oder frei lagen.
  • Um zu überprüfen, ob Anteile des Telomervektors und des menschlichen Zentromers in den Fibroblasten beider Schweine und in der DNA der ursprünglichen Zellinie tatsächlich vorhanden waren, wurde eine genomische PCR des Vektors und spezifisch für die Chromosom 5 Satellitensequenzen durchgeführt (Primer 5IFopt/5IR, Details im bevorzugten Ausführungsbeispiel und Beispielen). Beide Sequenzen waren in den genomischen DNAs vorhanden, aber nicht nachweisbar in der DNA aus den untransfizierten Zellen. Eine Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH Analyse) erlaubte das direkte Sichtbarmachen der spezifischen Sequenzen des Chromosoms 5 und eines Vektorabschnitts in den primären Fibroblasten und damit eine exakte Beschreibung ihrer chromosomalen Lage. Interphasezellkerne und Metaphasen zeigten beide Signale zusammen auf einem einzigen separaten, DAPI gefärbten Chromatinelement. Die Vektor und repetitive alpha Satelliten DNA Sonden zusammen waren in keiner einzigen Metaphase in ein endogenes Schweinechromosom integriert.
  • Damit wurde eindeutig und erstmalig gezeigt, dass mit den funktionellen Zentromersatelliten, die in den tetratelomerischen pTAT-Vektoren kloniert wurden, frei segregierende genetische Einheiten in einer primären Zelle (erstmals für Mensch und Tier), erstamls im Schwein, und damit erstmals in einem Tier und Grosstiermodell erzeugt werden konnten. Diese werden als low copy Einheit (hier ein einziges) stabil in der Mitose weitergegeben und erlauben eine stabile Genfunktion (EGFP-Beispiel). Damit kann ein Verfahren angewendet werden, das auf diesen und nachfolgenden künstlichen Chromosomen beruht. Durch Prä-Fabrikation langer DNA Fäden mit multiplen Genen auf einem einzigen Inputmolekül können nun massgeschneiderte Einheiten in primären Zellen erzeugt werden, die funktionell ohne Selektion weitergegeben werden.
  • Da die Konstruktion auf DNA Ebene erfolgt, ist die Hauptentwicklung der Xenotransplantation von einem bestimmten Schweinestamm unabhängig.
  • 3. Bevorzugtes Ausführungsbeispiel:
  • Formierung künstlicher Chromosomen in primären Schweinezellen und stabile Weitergabe an geklonte Nachkommen
  • Die de novo Erzeugung künstlicher menschlicher Chromosomen (HAC von „Human Artificial Chromosomes") nach dem Transfer isolierter DNA-Konstrukte wurde bisher nur in kultivierten menschlichen Tumorzellen nachgewiesen1,2. Hier berichten wir von der Formierung eines überzähligen („surplus") Chromosoms basierend auf dem Transfer eines HAC-Konstrukts in primäre Schweinezellen und von der nachfolgenden stabilen Weitergabe in geklonten Schweinen, d. h. des ersten künstlichen de novo Chromosoms sowohl in einer primären Zelle (Säugetier- und humane Zelle) als auch im Tier. Das telomerisierte PAC-Konstrukt TTE1 (142 kb), das 116 kb der dimeren Alpha-Satelliten-DNA-Familie („E1") des humanen Chromosoms 5 trägt, war dafür bekannt, effizient künstliche Chromosomen in HT1080-Zellen (Kraner et al. in Vorb.)3,4 zu formieren.
  • Da lebensfähige HT1080-Zellklone normalerweise DNA aus 1 oder 2, jedoch selten aus > 2 Konstruktmolekülen3–5 enthielten, erwartete man beim Transfer in primäre Zellen eine Verbesserung durch Konstrukt-Präparationen, die einen großen Anteil intakter DNA enthalten. Der telomerisierte PAC-Vektor pTT (26 kb) enthält (eines von zwei) Blasticidin S (BS) und die CMV-EGFP Expressionskassette auf einem 6 kb sub/inter-telomerischen Fragment, welches keinen prokaryotischen Selektionsmarker3,4 enthält und deshalb während des Bakterienwachstums teilweise verloren gehen kann, wodurch die HAC-Formierung nicht beeinträchtigt, jedoch der Anteil grüner Klone reduziert wird. Die hier verwendete DNA-Präparation von TTE1 enthielt den EGFP-Marker in etwa 2/3 der physikalisch intakten Moleküle (Grad 1 DNA), wie aus Transfektionen mit Konstruktgemischen mit und ohne EGFP geschätzt worden ist (Daten nicht gezeigt).
  • Um frische Primärzellen zu erhalten, die Klonexpansion erlauben, wurden Knochenmarkszellen aus den großen Knochen und Rippen eines 5 Monate alten Ebers (80 kg) aus dem Schlachthaus entnommen. Die Zellen wurden mittels eines Ficoll-Gradienten6 aus Blut gereinigt und in T75-Gewebekulturflaschen 9 Tage lang in DMEM, enthaltend 10% FCS, Amphotericin B, Penicillin und Streptomycin, expandiert. Für die Lipofektion wurden ungefähr 100 ng des Konstrukts für 16 Stunden ohne Serum in zwei T75-Flaschen inkubiert, gefolgt von 4 Tagen ohne und 18 Tagen mit 4 μg/ml BS. Am Tag 22 nach dem Transfer wurden 8 grüne und 4 nicht-fluoreszierende Kolonien gepickt, in Sechs-Well-Platten und T25-Flaschen bis zum Tag 46 expandiert und dann aufgeteilt in T25 mit und ohne Selektion. Die grünen Klone seg4 und seg8 zeigten gutes Wachstum bei einer Verdopplungszeit von 2 Tagen und leuchtend grüne Fluoreszenz an Tag 85, was die Stabilität mit und ohne Selektion demonstrierte. Nach diesem Zeitraum war die genomische DNA beider Klone positiv in einer Vektor-PCR (Daten nicht gezeigt). Um die Stabilität des de novo HAC in vivo zu testen, wurden die seg4-Zellen für einen Kerntransfer durch Fusion mit enukleierten Oozyten7 verwendet. Die Fusionsrate lag bei 88%, die Zellteilungs- und Blastozytenraten entsprachen 58% bzw. 12% (n = 57). Die Blastozyten wiesen eine Zellzahl von 68 ± 11 (SEM) auf. Insgesamt wurden 235 von seg4-Zellen geklonte Embryonen in drei Empfänger transferiert, wobei es zu einer Schwangerschaft mit zwei Nachkommen aus 56 Embryonen (ergänzt durch 53 parthenogenetische Oozyten) kam. Das bedeutet, dass die Klonierungseffizienz aus den seg4-Zellen innerhalb des Entwicklungsbereichs von 1–5% bei transgenen Fibroblasten lag8. Zwei gesunde, voll entwickelte Ferkel mit einem Körpergewicht von 717 g (Nr. 9562) und 1163 g (Nr. 9563) wurden nach Ende der Schwangerschaft am Tag 116 geboren (ergänzende Informationen). Beide Ferkel wiesen grüne Fluoreszenz in allen sichtbaren Körperteilen (1a) und in nahezu allen kultivierten Hautzellen auf (1b, ergänzende Informationen), darunter einige Zellen mit einer außergewöhnlich hohen Expression, vermutlich verursacht durch eine gelegentliche Überreplikation des Markers. Mit DAPI gefärbte Metaphasen zeigten einen normalen männlichen Karyotyp mit 38 Chromosomen und einem überzähligen kleinen Chromatinelement (ergänzende Informationen). Fibroblasten beider Schweine wurden für 36 Tage ohne Selektion oder 7 Tage ohne und 29 Tage mit BS Re-Selektion kultiviert, was nicht in einem erhöhten Zelltod oder reduziertem Wachstum resultierte, was mittels Beobachtungen unter dem Mikroskop beurteilt wurde. Diese und spätere Passagen nach der Expansion aus eingefrorenen Beständen wurden der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) unterzogen. Die HAC-Detektion basierte zum einen auf dem Vorhandensein beider Signale, der humanen Zentromer-5-Sonde „E1" (pink) und entweder der EGFP-(rot) oder BS-Vektorsonde „rsf"4 (rot), und auf der anderen Seite auf dem Ausbleiben der Integration beider Sonden in Schweinechromosomen, was für beide Schweine in allen Sondenkombinationen mit und ohne Selektion (1c) gezeigt wurde. Darüber hinaus schloss die schweineartige, zentromerische, vom MC1-Satellit9- abgeleitete Sonde „smf/r" (ergänzende Informationen), die stark mit mehreren metazentrischen Chromosomen und schwach mit einigen der akrozentrischen Chromosomen (grün) hybridisierte, das Vorhandensein der meisten (2/3) Schweine-Zentromerregionen auf den HACs aus. Ein Versuch, eine akrozentrische Sonde auf der Basis veröffentlichter Wiederholungssequenzen zu isolieren, ergab weder ein spezifisches Satelliten-PCR-Muster noch eine brauchbare Sonde und konnte deshalb auf den HACs nicht ausgeschlossen werden. Versuche, eine potenzielle Mensch-Schwein-Satelliten-Nachbarschaft mit Primerkombinationen von smf/r mit 5IF/R und 5IFopt/R zu amplifizieren, waren in beiden Schweinen nach 35 Zyklen und 4 min Elongation negativ (Daten nicht gezeigt). Beide humanen cen 5 PCRs 5IF/5IR und 5IFopt/5IFR waren positiv nach 26 Zyklen, während X-alphoide Primer nach 34 Zyklen zu keinem Produkt führten (ergänzende Information), wodurch eine humane genomische Kontamination in beiden Schweineproben ausgeschlossen und die Authentizität der 8 subklonierten 5IFopt/R-Fragmente von Schwein 9563 untermauert wurde, das 8 unterschiedliche Sequenzen vom Typ „E1" umfaßt, wie bei der kleinen Auswahl von 8 aus ca. n = 341 Dimeren (0,34 kb), die in der Input-DNA vorhanden sind (ergänzende Informationen), zu erwarten war. Von einer Speziesübergreifenden de novo-Zentromerfunktion wurde weder in Mäusen noch in irgendeinem anderen höheren Eukaryoten berichtet und könnte Mensch-Schweinspezifisch sein. Weitere Analysen der Zentromeridentität und der Ausschluss einer Aufnahme eines Schweine-Zentromers mit einem umfassenderen Satz an Schweine-Zentromersonden sind erforderlich und befinden sich zurzeit in Entwicklung, ebenso wie die Etablierung einer Keimbahn-Transmission. Die nachgewiesene Formierung eines stabilen überzähligen Chromosoms aus einem vorgefertigten DNA-Molekül ebnet den Weg für verschiedene genetische Modifikationen in Schweinen, wie zum Beispiel der Transfer von maßgeschneiderten Multi-Transgen-Einheiten zur Generierung von Organspendern für die Xenotransplantation, wobei die Segregation unabhängiger multipler Transgene während der Züchtung vermieden wird.
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    • 9. Rogel-Gaillard, C., Bourgeaux, N., Save, J. C., Renard, C., Coullin, P., Pinton, P., Perle, M., Vaiman, M., Chardon, P. Construction of a swine YAC library allowing an efficient recovery of unique and centromeric repeated sequences. Mamm. Genome 8, 186–192 (1997).
  • 4. Figurenlegenden
  • 1. Repetitive DNA-Familien.
  • Repeats repräsentieren > 50% der Säugetiergenome und liegen verstreut und in Tandem-Arrays angeordnet vor (A). Megabasen-lange Tandem-Repeat-Arrays von in starkem Maße homogenen Satelliten-Familien fand man bei allen normalen Säugetier-Zentromeren. Humane Zentromere können homogene Arrays verschiedener Alpha-Satelliten-Familien oder großer divergierender Regionen enthalten (B). Kürzlich durchgeführte Studien identifizierten, dass homogene Abschnitte von ca. 100–200 kb, die einem evolutionär modernen Array-Typ angehören, Zentromer-profizient sind.
  • 2. In primären Schweinezellen gebildete künstliche Chromsomen sind in vivo stabil.
    • a) Beide Ferkel, die vom HAC-transfizierten Knochenmarkszellklon seg4 abstammen, wiesen unter Blaulicht (9 V, 20 cm Lichtkegel) leuchtende grüne Fluoreszenz in allen sichtbaren Körperteilen auf. Gezeigt werden Klauen am Tag 1,
    • b) Köpfe und Hinterläufe am Tag 7.
    • c) Zellen, die aus Hautproben am Tag 7 ohne Selektion kultiviert wurden, zeigten grüne Fluoreszenz in nahezu allen Zellen in den Fibroblasten- und Epithelinseln (oben: Schwein 9562, mittlere und untere Reihe: Schwein 9563).
    • d) Dreifarbige FISH-Analysen von Hautfibroblastenkulturen beider Schweine, die 36 Tage ohne oder 7 Tage ohne und 29 Tage mit BS-Selektion kultiviert wurden, werden zusammengefasst. Das einzelne, überzählige, in allen Analysen beobachtete DAPI-Element wies sowohl ein Signal für die Vektorsonde rsf oder EGFP (rot) als auch für die humane Zentromer 5-Alpha-Satelliten-Input-DNA E1 (pink) auf. Keine der Analysen zeigte eine Integration beider Signale in ein Schweinechromosom. Die Nachweisfrequenz der HACs für beide Sondensignale wird in der Tabelle für jedes Experiment aufgeführt. Sonde smf/r (FITC, grün), nachweisbar in einem Anteil (2/3) der Schweine-Zentromerregionen, lieferte kein spezifisches Signal auf dem HAC. Gezeigt wird ein Metaphasen-Schnitt mit einem typischen HAC (Pfeilspitze, überlagerte Kanäle) und Einzelkanal-Ausschnitte mit dem HAC auf der rechten Seite (von oben nach unten: DAPI blau, EGFP rot, E1 pink, smf/r grün, aus der Analyse 9563 BS).
  • Die Bilder wurden mit einem Zeiss Axiovert 200, das mit einer HBO103W-Lampe und einer s/w CCD-Kamera ausgestattet ist, aufgenommen und mit der Software Axiovision bearbeitet. Tabelle 4
    FISH Sonden E1 (DEAC) EGFP (Cy3,5) smf/r (FITC) Sonden E1 (DEAC) rsf (Cy3,5) smf/r (FITC) n Metaphasen analysiert HAC-Signale in % Metaphasen
    63BS + 31 61
    63 + 21 62
    62BS + 23 44
    62 + 19 37
    63BS + 26 73
    63 + 15 60
    62BS + 12 50
    62 + 3 33
  • 3.
  • Der grün fluoreszierende und gut wachsende primäre Zellklon seg4, der durch Transfektion des HAC-Konstrukts TTE1 erlangt wurde, wurde einem Kerntransfer unterzogen und resultierte in zwei gesunden grünen Ferkeln 9562 und 9563. Lichtfotografie am Tag 7 und unter Blaulicht (9 V, 20 cm Lichtkegel) am Tag 1.
  • 4.
  • EGFP-Expression in Hautgewebeschnitten beider Ferkel, erhalten am Tag 7 nach der Geburt, und verschiedene Zelltypen, die für 7 Tage in DMEM, FCS, Amphotericin B, Penicillin und Streptomycin kultiviert wurden. Man beachte, dass grüne Fluoreszenz in nahezu allen Zellen unter dem Mikroskop beobachtet wurde. Schwach exprimierende Zellen in der Nähe der hell leuchtenden Abschnitte erscheinen in einigen der gezeigten Abschnitte dunkel, was nicht notwendigerweise ein Fehlen der EGFP-Expression indiziert.
    linke Spalten: Schwein 62
    recht Spalten: Schwein 63
  • 5.
  • EGFP-Expression in kultivierten Fibroblasten aus Hautproben nach 36 Tagen Wachstum ohne Selektion oder 7 Tage ohne und 29 Tage mit BS. Die Helligkeit der EGFP-Expression war in den selektierten Zellen etwas erhöht, jedoch war die überwiegende Mehrheit der Zellen, die ohne Selektion wuchsen, schwach grün, wie mit bloßem Auge unter einem mit einer HBO50-Lampe ausgestatteten Zeiss 10-Mikroskop beobachtet werden konnte.
    • A) 9562 Ohrkultur 5 Wochen, 4 Wochen mit BS-Re-Selektion (alle überlebten)
    • B) 9562 Ohrkultur 5 Wochen auf DMEM (ähnliche Wachstumsrate im Vergleich zu BS)
    • C) 9563 Ohrkultur 5 Wochen, 4 Wochen mit BS-Re-Selektion (alle überlebten)
    • D) 9562 Ohrkultur 5 Wochen auf DMEM (ähnliche Wachstumsrate im Vergleich zu BS)
  • 6.
    • a) Metaphasen, abgeleitet von Hautfibroblasten, die 7 Tage lang ohne und 39 Tage mit BS aufgezogen wurden, wiesen die normale Anzahl von 38 Chromosomen auf, wie in 7 von 8 vollständig aussehenden Metaphasen von Schwein 9563 gezählt wurde, von denen 5 ein freies kleines DAPI-Element (Pfeilspitze) aufwiesen.
    • b) Karyogramm von Schwein 9563. Die Chromosomen-spezifischen Satellitensonden (rote und grüne Signale), die sich zurzeit in Entwicklung befinden, werden in einer anderen Arbeit veröffentlicht (Karyogramm aus der Bachelorarbeit von Benedikt Baumer, Molekulare Biotechnologie, Wissenschaftszentrum Weihenstephan, TUM, Juli 2007).
  • 7.
  • PCR-Analysen unter Verwendung genomischer DNA der primären Zellklone seg3 (zeigte geringes Wachstum und wurde ausgeschlossen), seg4 und seg8, sowie kultivierter Hautzellen der Ferkel 9562 und 9563. Es wurden Wiederholungs-DNA-Präparate (Zahlen) verwendet, die aus Zellen in verschiedenen Kulturstadien gewonnen wurden.
    • a) EGFP-PCR wurde angewendet, um die genomischen DNA-Proben und die stabile Anwesenheit der Vektorsequenzen zu überprüfen, wie sie aufgrund der starken grünen Fluoreszenz unter dem Mikroskop zu erwarten waren.
    • b) Humane zentromerische Input-DNA von Chromosom 5 war in allen Schweineproben vorhanden und zeigte das typische Satellitenmuster, was Anwesenheit und stabile Vererbung der humanen E1-Arraysequenzen in den primären Schweinezellklonen und in beiden erlangten Schweinen indiziert, sowie Abwesenheit des Produkts in den nicht transfizierten primären Schweinezellen.
    • c) Um humane genomische Kontamination in den genomischen DNA-Proben der primären Zellkultur (seg4-1) und in beiden Schweineohrproben (9562-1 und 9563-1) auszuschließen, wurden humane Alpha-Satelliten-Repeats, von denen es für gewöhnlich > 1000 Kopien pro humanem Genom gibt, in einer 34 Zyklen PCR unter Verwendung der Primer X-3A/4A amplifiziert. Es wurden keine Produkte aus den Schweine-DNA-Proben erhalten, die so adjustiert wurden (EthBr-Färbung), dass sie gleiche Mengen von ungefähr 100 ng genomischer DNA pro Reaktion enthielten.
  • 5. Beispiele
  • Ergänzende Informationen PCR Primer
    Figure 00350001
  • Abgeleitet aus der veröffentlichten Konsensus-Sequenz der Mc1 Repeat-Familie von Rogel-Gaillard et al. 1997. Aus genomischer DNA von Deutscher Landsau und Pietrain-Schweinen erhielt man folgende Produkte: 0,201 kb/0,201 kb plus 0,34 kb Satelliten-Multimere. Die Primer wurden verwendet, um die zentromerische Schweine-Satellitensonde smf/r zu generieren.
  • Figure 00350002
  • Figure 00360001
  • Abgeleitet von veröffentlichten Ac2 Repeat-Sequenzen, EMBL/Genbank Zugangsnr. X16513. Akamatsu et al. 1989. Es wurde kein spezifisches Satellitenprodukt aus der genomischen Schweine-DNA erhalten (diese Arbeit).
  • 5IFopt5'-GTT AGG AAA CAC TCT GTT TGT AA-3' (SEQ ID NO. 5) wurde abgeleitet von sequenzierten Proben von Dimeren des Konstrukts TTE1 und enthält drei verschiedene Nukleotidpositionen im Vergleich zum Primer 5IF (der zur Isolierung eines PAC-Klons verwendet wurde, der das E1 Array-Insert enthält, das in pTTE1 subkloniert wurde). In Kombination mit dem Primer 5IR ergaben beide die Produkte 0,275 kb/0,275 + 0,34 kb, die typisch für den D5Z2 Alpha-Satelliten-Array sind, der auf dem humanen Chromosom 5 vorhanden ist. Primer 51F/R veröffentlicht in Laner et al. 2005.
  • EGF/R Primer amplifizieren einen 281 bp EGFP-kodierenden Teil und wurden in Laner et al. 2005 veröffentlicht.
  • X-3A/4A Primer amplifizieren ein X-Chromosomen-spezifisches 0,5 kb Alpha-Satellitenprodukt aus humaner genomischer DNA. Locus DXZ1 trägt normalerweise > 1000 sehr ähnliche Kopien pro Chromosom. Primer wurden in Warburton and Willard 1992 veröffentlicht.
  • In dieser Arbeit verwendete und generierte Sequenzen
  • Zentromersequenzen des E1-Typs wurden subkloniert aus:
    • – TTE1, Eco RI-Subklone: AM409269, AM409268
    • – 5IF/R PCR Produkte wurden erhalten aus genomischer DNA der menschlichen Chromosom 5 Hamster-Hybridlinie Hy190 (freundliche Gabe von Mariano Rocci, Bar): AM409267, AM409266, AM409265 und Gesamthumaner genomischer DNA: AM409264, AM409263.
  • Von Schwein 9563 stammende Proben menschlicher Alpha-Satelliten-DNA des Typs „E1"
  • PCR-Fragmente 5IFopt/5IR von Schwein 9563 wurden subkloniert in pGem.
  • Korrigierte Sequenzen (Einzelstrang gelesen) zur Veröffentlichung in der EMBL/Genbank.
  • Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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    • - Moralli 2006 [0017]
    • - Ikeno 1998, Poster Kraner 17 Feb. 2007 [0019]
    • - Schindelhauer and Cooke 1997 [0020]
    • - Laner et al 2004, 2005 [0021]
    • - Laner et al. 2004 [0021]
    • - Laner et al. 2005 [0021]
    • - Diplomarbeit Marko Noerenberg, Poster 17 Feb. 2007 [0021]
    • - Marko Noerenberg, Diplomarbeit, Poster 17 Feb. 2007 [0021]
    • - Kraner et al. in Vorb. [0027]
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    • - Laner et al. 2005 [0038]
    • - Laner et al. 2005 [0039]

Claims (15)

  1. Verfahren zur Einführung multipler Transgene in eine primäre Zelle, umfassend (a) zur Verfügung stellen eines Nukleinsäurekonstrukts, das in der Lage ist, de novo ein künstliches Chromosom zu bilden, das als eine Einheit umfasst: (i) Telomer-Repeats, bevorzugt zwei entgegengesetzt gerichtete Telomersequenzen von Tandemrepeats von 135 repetitiven TTAGGG Einheiten, (ii) Zentromer-Region, bevorzugt des humanen Chromosoms 5, weiter bevorzugt 116 kb der dimeren Alpha-Satelliten-DNA-Familie E1 des humanen Chromosoms 5; noch weiter bevorzugt 341 Repeateinheiten des 340 bp Alpha-Satelliten des humanen Chromosoms 5, (iii) Unit Copy Replikon des Phagen P1, (iii) mindestens ein Markergen, (iv) mindestens 2 Transgene, bevorzugt mindestens 3 Transgene, (v) Restriktionsstellen, (b) Einführen des Nukleinsäurekonstrukts in eine primäre Zelle, (c) Erhalten einer multi-transgenen primären Zelle, (d) optional, Erhalten des de novo gebildeten künstlichen Chromosoms.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die primäre Zelle ausgewählt ist aus primären Zellen eines Tiers, bevorzugt eines Säugetiers, weiter bevorzugt eines Schweins.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die primäre Zelle ausgewählt ist aus Knochenmarkszellen und Fibroblasten.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Transgene ausgewählt sind aus menschlichen Genen oder aus an den Menschen adaptierten Genen und Faktoren, wie – Komplementfaktoren, – Gerinnungsmodulatoren, – Co-stimulierende Faktoren, – Immunmodulatoren, – Cytokine, – Chemokine, – HLA-E-, HLA-Klasse I, II und III-Antigene – oberflächenmodifizierende Enzyme, – Inhibitoren endogener Viren, – modifizierte endogene Proteine, – gesundheitssteigernde Proteinvarianten gegen eine vorbestehende Zell- oder Organerkrankung.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Nukleinsäurekonstrukt, das in der Lage ist, de novo ein künstliches Chromosom zu bilden, ein Vektor oder ein Plasmid ist, bevorzugt ein Vektorkonstrukt, das in der Lage ist, de novo ein humanes künstliches Chromosom zu bilden (HAC-Vektorkonstrukt), weiter bevorzugt ein HAC-Vektorkonstrukt pTTE1 oder ein HAC-Vektorkonstrukt abgeleitet von pTAT, pTT, pTTE1.
  6. Multi-transgene primäre Zelle erhalten mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
  7. Multi-transgene primäre Zelle nach Anspruch 6 umfassend ein de novo gebildetes künstliches Chromosom.
  8. De novo gebildetes künstliches Chromosom erhalten mit einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 oder aus einer multi-transgenen primären Zelle nach Anspruch 6 oder 7.
  9. Verwendung einer multi-transgenen primären Zelle nach Anspruch 6 oder 7 oder eines de novo gebildeten künstlichen Chromosoms nach Anspruch 8 für – die Herstellung multi-transgener Tiere, bevorzugt Säugetiere, weiter bevorzugt Schweine, – die Herstellung multi-transgener Gewebe, – die Transplantation von Zellen, Geweben und Organen, insbesondere in der Transplantationsmedizin und Xenotransplantation, – die Transplantationsmedizin.
  10. Verfahren zur Herstellung multi-transgener Tiere, bevorzugt Säugetiere umfassend (a) zur Verfügung stellen eines Nukleinsäurekonstrukts, das in der Lage ist, de novo ein künstliches Chromosom zu bilden, wie in den Ansprüchen 1, 4 und/oder 6 definiert, (b) Einführen des Nukleinsäurekonstrukts in eine primäre Zelle eines Tiers, bevorzugt eines Säugetiers, weiter bevorzugt eines Schweins, (c) Erhalten einer multi-transgenen primären Zelle, (d) Herstellen von Nachkommen des Tieres unter Verwendung der multi-transgenen primären Zelle.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die primäre Zelle ausgewählt ist aus Knochenmarkszellen und Fibroblasten.
  12. Multi-transgenes Tier erhalten mit einem Verfahren nach Anspruch 10 oder 11.
  13. Multi-transgenes Tier nach Anspruch 12, welches ein Säugetier, bevorzugt ein Schwein ist.
  14. Multi-transgenes Tier nach Anspruch 12 oder 13 umfassend ein de novo gebildetes künstliches Chromosom in jeder Zelle.
  15. Verwendung eines multi-transgenen Tiers nach einem der Ansprüche 12 bis 14 als Donor für die Xenotransplantation von Zellen, Geweben und Organen.
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