EP2625275A1 - Verfahren zur semi-synthetischen herstellung hochreiner "minicircle" dna-vektoren aus plasmiden - Google Patents

Verfahren zur semi-synthetischen herstellung hochreiner "minicircle" dna-vektoren aus plasmiden

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EP2625275A1
EP2625275A1 EP11767977.9A EP11767977A EP2625275A1 EP 2625275 A1 EP2625275 A1 EP 2625275A1 EP 11767977 A EP11767977 A EP 11767977A EP 2625275 A1 EP2625275 A1 EP 2625275A1
Authority
EP
European Patent Office
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dna vector
dna
plasmid
circular
vitro
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP11767977.9A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Bernd Rehberger
Markus Heine
Claas Wodarczyk
Roland Wagner
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rentschler Biotechnologie GmbH
Original Assignee
Rentschler Biotechnologie GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Rentschler Biotechnologie GmbH filed Critical Rentschler Biotechnologie GmbH
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Publication of EP2625275A1 publication Critical patent/EP2625275A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host

Definitions

  • the present invention relates to methods and reagents for the production of DNA vectors, in particular MiniCircle (MC) DNA vectors, in superhelical form. Furthermore, the invention relates to high-purity preparations of circular DNA vectors, in particular MC DNA vectors.
  • MC MiniCircle
  • the requirements for the purification method are also important Insulation of the MC correspondingly high so as not to destroy the desired structure of the MC during the purification.
  • the MC is separated from the DNA byproducts formed after recombination - parental plasmid, miniplasmide and concatemers of the individual products - by a targeted linearization of the unwanted molecules by means of specially selected restriction enzymes and subsequent agarose gel electrophoresis.
  • the MC is not modified by the restriction enzymes, so that the circular status of the MC is not affected.
  • parental plasmids such as MC are also able to transduce eukaryotic cells, this can have negative consequences for the MC experiment (eg permanently transduced cells due to integration of the parental plasmid into the genome of the host cell).
  • the new method dispenses with the use of recombinases for generating the MC from the parent plasmid. At the same time it is not It is necessary to purify the MC obtained by complex and expensive methods, such as, for example, column chromatography, since mixing of the MC with the various by-products is avoided from the outset. This leads to a simplification of the production of MC compared to the previously common methods while increasing the yield and purity of the target molecules, especially as superfluous bacterial sequences in the backbone of the MC are completely avoided.
  • the method presented here is based on a combined in vivo / in vitro technology in which, in a final enzymatic step, circular superhelical MiniCircle DNA is generated with the aid of gyrase.
  • An object of the present invention is thus a process for the preparation of a circular DNA vector in superhelical form, comprising the steps:
  • step (e) twisting the circular DNA vector of step (d) with a gyrase to obtain a circular DNA vector in superhelical form
  • Yet another object of the invention is a process for the preparation of super-helical circular DNA vectors comprising In vitro restriction cleavage, in vitro ligation, and in vitro gyrase digestion.
  • Yet another object of the invention is a process for the preparation of superheical MiniCircle DNA vectors without the use of site (sequence) specific recombinases such as FLP.
  • the production of the DNA vector in particular of the MC-DNA vector, is carried out as follows:
  • the parental plasmid is isolated from the host cell using standard methods.
  • the MC sequences of the PP are excised from the PP by digestion with restriction enzymes.
  • the resulting linear fragments one of which contains the regions of the MC, are e.g. separated by agarose gel electrophoresis.
  • the linearized MC fragments are isolated by common methods, e.g. by elution, and used for further MC preparation.
  • the relaxed MCs are twisted using (recombinant) gyrase in a ' fro' approach to produce the corresponding superheiled (supercoiled) forms of MC needed for their transduction of eukaryotic cells.
  • DNA vectors in particular MiniCircle gene vectors
  • the method described herein for the production of DNA vectors makes it possible to obtain e.g. to produce for the production of recombinant cell lines or gene therapy usable DNA vectors with simple methods in large quantities and purity.
  • a circular DNA vector is produced in superhelical form.
  • the DNA vector consists of double-stranded DNA and usually has a size of 0.5 to about 10 kb, especially about 1-6 kb. However, smaller or larger DNA vectors can also be produced.
  • the DNA vector is a MiniCircle (MC) DNA vector, i. a circular DNA vector corresponding to that for the DNA vector, e.g. the later MiniCircle DNA vector, contains necessary functions. These functions usually include sequences for a transgene, e.g. a recombinant gene or cDNA, together with regulatory sequences for gene expression, e.g.
  • Transcriptional and translational initiation sequences such as promoters, enhancers, ribosomal binding sites, etc., and optionally transcriptional termination sequences such as polyA sequences and other regulatory or functional nucleotide sequences such as e.g. S / MAR sequences for transferring the adherence of the DNA vector to the nuclear matrix as a trigger for integration-independent episomal replication (2, 13, 14).
  • the DNA vector may be a pharmaceutically acceptable DNA Sequence include, for example, a gene or a cDNA from mammals, in particular a human gene or a recombinant variant thereof for therapeutic applications, or a synthetic sequence, for example a synthetic gene.
  • a preferred "transgene” or “transgenic sequence” according to the invention is a eukaryotic sequence, especially a human sequence and / or a synthetic sequence.
  • Such a sequence encodes, for example, growth factors, cytokines, interleukins, interferons, tumor suppressor proteins, etc.
  • the DNA vector can also be transgenic as a sequence of pathogenic organisms which encode an antigen, or a sequence which can be used for a tumor or tumor Autoantigen encoded, included.
  • the preparations of circular super-helical DNA vectors, in particular MC vectors, obtainable by the process according to the invention can be used both as research reagents and as pharmaceutical products.
  • Preferred are medical applications such as DNA vaccination, gene therapy, reprogramming or reprogramming of cells or the use of RNAi.
  • the DNA vectors produced from the process can also be used for the production of therapeutic proteins in recombinant cells, in particular eukaryotic cells, in particular CHO cells.
  • the corresponding host cells are transiently or stably transduced by the DNA vectors, so that the resulting recombinant cells produce the desired therapeutic protein.
  • the production of the therapeutic protein can be carried out under common industrial biotechnological methods.
  • Another field of application of the DNA vectors produced by the method described here, in particular MiniCircle vectors, is the genetic modification of host cells which are more recombinant for expression Proteins are to be used.
  • the host cells are modified by the DNA vectors so that the expression of the transgenic protein in the modified host cells is superior in quantity and / or quality of protein expression from unaltered host cells.
  • DNA vectors in particular MC vectors
  • MC vectors the subsequent modification of already recombinant protein-producing production cells, so that they can be modulated by the genes introduced by the MC in the desired manner with respect to transgene quantity and / or quality.
  • the transduction of the target cells with one or more MCs can take place simultaneously.
  • the generation of the circular superhelical DNA vectors takes place from so-called parental plasmids, which do not differ in their basic functions from ordinary plasmids. They serve to amplify the DNA vector sequences in host cells, e.g. Bacteria such as E. coli. Other examples of suitable host cells are yeasts such as Saccharomyces.
  • These parental plasmids usually carry, in addition to the sequence of the DNA vector, heterologous sequences on a contiguous portion of the whole plasmid, e.g. for propagation in a host cell, such as information for the origin of replication to initiate replication of the plasmid in host cells and, more usually, a gene including regulatory sequences for conferring antibiotic resistance on the plasmid-bearing host cells.
  • a parent plasmid free of recombinase recognition sequences eg free of recognition sequences for sequence-specific recombinases, such as about FLP, Cre, RecA, Phi-C31 and others.
  • the parent plasmid (PP) therefore consists essentially of two parts:
  • the functional entity moiety for replication and amplification of the parental plasmid in host cells e.g. Bacteria.
  • the parent plasmid used as the starting material of the method of the present invention is usually obtained by cultivating a host cell, particularly a prokaryotic host cell such as E. coli, and isolating the plasmid from the host cell.
  • a host cell particularly a prokaryotic host cell such as E. coli
  • a bacterial strain suitable for high-copy amplification of plasmids such as E. coli XL1 Blue (16) is used as the host cell.
  • the recovery of parent plasmids does not differ from methods for the preparation of conventional plasmids or DNA vectors.
  • the purification of the PP from the bacteria can be carried out by standard methods, e.g. with commercially available kits (e.g., QIAgen Midiprep).
  • Step (a) of the method according to the invention comprises the cleavage of a parent plasmid with one or more restriction enzymes.
  • This step is conveniently carried out in vitro, ie on an isolated plasmid preparation.
  • restriction enzymes are used which allow excision of a fragment comprising the sequence of the DNA vector (DNA vector fragment).
  • DNA vector fragment is presented in linear form alongside one or more other linear fragments corresponding to those described in U.S. Pat Parental plasmid existing, additional, heterologous sequences.
  • the region of the DNA vector is not cut, while the remaining sequence, also called mini plasmid (MP), either remains as a whole piece, or is split by the cleavage into smaller pieces. It is important that no DNA fragments are formed that are similar in size to the DNA vector fragment.
  • the restriction cleavage preferably proceeds quantitatively, so that after the enzymatic treatment of the DNA there is no longer any inactivated parental plasmid.
  • step (b) the linear DNA vector fragment of other restriction cleavage products, i. other linear DNA fragments, separated.
  • separation is by size, e.g. by gel electrophoresis. Separation by agarose gel electrophoresis is preferred.
  • the linear DNA vector fragment is isolated in a highly purified form free of other products of restriction cleavage. Because the DNA vector fragment is in linearized form, it can be easily identified by its size by means of a common DNA marker in the gel.
  • the linearized MC can be isolated by standard methods, e.g. by elution and purification by means of commercial kits (e.g., QIAgen gel elute) from the agarose gel.
  • the DNA thus obtained contains only linearized MC-DNA.
  • step (c) the linear DNA vector fragment is brought into contact with a ligase under conditions under which a ligation takes place, whereby a circular DNA vector is produced in a relaxed form.
  • Step (c) is conveniently carried out in vitro, ie on an isolated preparation of the DNA vector fragment.
  • Suitable ligases are available commercially, for example in recombinant form.
  • a blunt-ended ligation may also be performed.
  • step (d) is purified to separate the circular DNA vector from other products of the ligation. This can e.g. by separation over an agarose gel. Here, possibly contaminations with MP fragments or MC concatemers are visible. From the gel, only the band for the circularized DNA vector (MC) is excised and eluted from the DNA. This further increases the purity of the MC-DNA and virtually eliminates contamination with MP or PP fragments.
  • the circular DNA molecule be in superhelical form. This superhelical status is not present after circularization with ligase. Therefore, this must be subsequently produced by gyrase treatment of circular MC.
  • Gyrase which is commercially available in recombinant form, is a type II topoisomerase which, in the presence of ATP, promotes the introduction of negative superhelical structures in DNA causes.
  • Step (e) therefore comprises contacting the circular DNA vector of step (d) with a gyrase under conditions where the vector is twisted, e.g. in the presence of ATP.
  • Step (e) is conveniently carried out in vitro, i. performed on an isolated preparation of the DNA vector. The reaction time can be varied to obtain preparations with different degrees of twist.
  • the reaction can be carried out according to the instructions of the manufacturer for the application of gyrase. After introduction of the superhelical structures into the MC, they may be finally terminated by standard methods, e.g. purified from the reaction batch using commercial kits (e.g., QIAgen MidiPrep).
  • Step (e) involves the purification of the circular, super-helical DNA vectors by standard methods (precipitation, agarose gel electrophoresis followed by elution, Qiagen Qiaquick Nucleotide Removal Kit, etc.) for the removal of by-products from the enzymatic gyrase reaction.
  • kits containing restriction enzymes, a ligase and a gyrase for carrying out the method according to the invention.
  • the kit according to the invention preferably comprises a restriction endonuclease. In another preferred embodiment, no endonuclease is included. More preferably, a restriction endonuclease comprises simultaneous absence of an exonuclease.
  • the kit comprises a guide for carrying out the method according to the invention.
  • Yet another object of the invention is a preparation of a DNA vector, in particular a MiniCircle DNA vector in superhelical form characterized by the absence of by-products, in particular linear or circular miniplasmid and / or parental plasmid.
  • the preparation contains no reference to the above-mentioned after PCR.
  • By-products The PCR reaction is not part of the MC production process but represents a detection method for contaminations by parent and miniplasmide, which makes it possible to detect the greater purity of the present invention in vitro generated MC preparations against recombinations in a conventional manner prepared MC preparations.
  • the sequence-specific primers In order to detect PCR-contaminating parental plasmids, the sequence-specific primers must be chosen such that one of the two oligonucleotides binds in the region of the heterologous backbone of the parental plasmid while the corresponding primer is located in the region of the mini-circle. In this arrangement of the oligonucleotides, only an amplification of the corresponding fragment occurs when parental plasmid occurs in the MC preparation. By means of a second PCR also contaminating miniplasmides can be found. Both must PCR primers are in the region of the heterologous backbone of the original parental plasmid.
  • this may be derived either from miniplasmids or the parent plasmid. If the first PCR was negative for parental plasmid, then the amplicon of the second PCR is due to miniplasmide. If both PCR reactions are positive, no clear statement as to the type of by-products is possible.
  • the in vitro produced MiniCircles have specifically controllable superhelical structural components.
  • the resulting predictability of the composition of the in vitro MC preparation is clearly superior to the random composition of circular DNA molecules obtained from bacteria by site-specific recombination. This superiority has substantial consequences, in particular for the use of therapeutic vectors in clinical applications.
  • FIG. 1 Plasmid map of the MC parental plasmid "pEpi-eGFP M18 antiHLC” and of the recombination products.
  • the parental plasmid contains all the units necessary for a working plasmid, such as Origin of Replication (oh, in this case between HSV TK polyA and the following FRT site, not shown) and antibiotic resistance (Neo / Kana).
  • Origin of Replication ovals
  • antibiotic resistance Neo / Kana
  • Critical to the production of MC vectors by the usual method by means of sequence-specific recombination is the presence of the two FRT sequences, which serve as targets for the FLP Recombinase.
  • the FLP-induced recombination of these two sequences against each other leads to constriction of two independent circular DNA molecules.
  • MiniPlasmid One of these carries the information for the important functions in bacteria and will therefore referred to as MiniPlasmid.
  • MiniPlasmid The second molecule no longer contains any functional bacterial sequences but only carries the information specific to the vector and thus represents the MiniCircle.
  • Figure 2 Comparison of the "in iro" mini-circle with the miniCircle produced by site-specific recombination in E. coli EL250 using a 1% agarose gel.
  • the in vitro MC was obtained by restriction with the enzyme XbaI and subsequent re-ligation with a T4 ligase from the PP. Subsequently, the ligated DNA (1 pg each) for 30 min. (Lane 1), 2 h (lane 2) or 5 h (lane 4) treated with 1 U DNA gyrase.
  • the "EL250" MC was obtained by site-specific recombination in E. coli EL250 after induction with 0.3% L-arabinose (lane 3)
  • the in vitro MC and the "EL250" MCs have the same in a 1% agarose gel Running behavior, ie that super-helical structures were introduced into the ligated MC DNA with the aid of DNA gyrase.
  • i.v. in wfro-MiniCircle
  • EL250 MiniCircle, produced by site-specific recombination in E. coli EL250
  • MC MiniCircle
  • PP parental plasmid
  • MP miniplasmid
  • FIG. 3 Separation of different ccc plasmids on a 0.8% chloroquine agarose gel
  • the plasmids pMAXGFP (LONZA), CMV-GFP parental plasmid and pEpi-delCM18opt (Rentschier Biotechnologie) were used.
  • the plasmids pMAXGFP (LONZA), CMV-GFP parental plasmid and pEpi-delCM18opt were used.
  • Agarose gel contained 2.5 ⁇ g mL- 1 chloroquine and gel-run for 15 h
  • FIG. 4 Separation of different amounts of the ccc plasmid pEpidel CM18opt on a 0.8% chloroquine agarose gel.
  • the DNA was separated for 15 h at 2.5 V cm -1 and the gel contained 2.5 [ig mL -1 chloroquine.
  • the series 1-6 contain different amounts of ccc DNA, the series 7 contains the linearized plasmid.
  • B The band patterns were recorded with the program ImageJ. It becomes clear that the application of a quantity of 100 ng of DNA is sufficient for the evaluation of the band patterns. With prolonged exposure even 50 ng can be evaluated (data not shown).
  • FIG. 5 Comparison of the twist of the "in v fro" miniCircle with the miniCircle produced by site-specific recombination from the plasmid pEpi-delCM18opt
  • Lane 1 The in vitro MiniCircle was prepared by restriction digestion of the parental plasmid with the enzymes XbaI and BstBI and subsequent ligation (T4 ligase) (oc). It can be seen that the ligation is not complete, some of the DNA remains linearized. Furthermore, concatemers arise from two or more DNA pieces. Lane 2: The gyrase and the gyrase buffer were added directly to the ligation batch (1 ⁇ g DNA). It can be seen that no twist has taken place. Lane 3: The ligation was first purified (QIAGEN PCR Purification Kit), then 1 ⁇ ligated DNA was treated with 5 U gyrase for 2 h. Lane 4: The MiniCircle was prepared by site-specific recombination. This was induced in E. coli EL250 by means of a genome-encoded FLP recombinase by L-arabinose.
  • (B) Lanes 3 and 4 from (A) were enlarged and displayed inverted here.
  • the site-specific recombination MC (lane 4) shows the expected banding pattern.
  • the in vitro MC (lane 3) also shows the band pattern, but one band is particularly pronounced.
  • (C) The signals were recorded with the program ImageJ and are marked with arrows. In track 3, the significant band signal mentioned in (B) can be seen (red arrow).
  • linear linearized DNA
  • oc open circle DNA
  • ccc supercoiled DNA
  • U unit
  • EL250 MC produced by site-specific recombination
  • MC MiniCircle
  • FIG. 6 Checking the purity of the generated MiniCircle by PCR and 1% agarose gel
  • a piece was PCRed in the miniplasmid region (see Linearized Vector Map B, PCR 1) and via an FRT site (see linearized vector map B, PCR 2) amplified. In each case 10 ng of template DNA was used. If an amplificate is generated in PCR 1, if the sample contains either miniplasmid or parental plasmid, an amplificate is generated in PCR 2, the sample contains parental plasmid, since in this PCR a primer lies in the MiniCircle region and a primer in the miniplasmid region.
  • C1 In the sample with the miniCircle (EL250 MC) produced by site-specific recombination, an amplificate was produced, in the sample with the // 7-w ' f / -MiniCircle no amplificate was produced.
  • C2 An amplicon was also created on the EL250 MiniCircle.
  • PP Parental plasmid
  • MC minicircle
  • EL250 MC MiniCircle, which was produced by site-specific recombination in E. coli strain EL250.
  • FIG. 7 Sequencing of the "in fro" mini-circle from pEpi-delCM18opt
  • superhelical MC could be successfully produced in vitro, without relying on the use of sequence-specific recombinases or specific bacterial strains to replicate the PP and then induce MC production.
  • a PP pEpi-eGFM18 anti HLC
  • MC MC
  • MP induced, sequence-specific recombination
  • the semi-synthetic MiniCircle DNA vectors described in this application were prepared according to the method described in more detail here:
  • the respective plasmid DNA of the clones was examined by restriction digestion and sequencing for a correct base sequence. Long-term storage of the correct clones was achieved by mixing a 5 ml overnight culture with 87% glycerol in the ratio 1: 1 and storage at -20 ° C (Glycerol stock).
  • the culture at 6000 xg for 15 min. centrifuged.
  • the preparation of the plasmid DNA was carried out with a QIAGEN plasmid kit according to the manufacturer's instructions.
  • the restriction digest was separated by gel electrophoresis (1% agarose gel). After gel-run, the DNA in the gel was stained with methylene blue and the gel slice cut with the linearized MiniCircle DNA with a scalpel. The recovery of the MiniCircle from the gel was done with the QIAGEN Gel Extraction Kit according to the manufacturer's instructions.
  • the linearized MiniCircle DNA was religated by T4 ligase at 16 ° C for 16 h.
  • the purification of the ligated DNA from the ligation mixture was carried out after agarose gel electrophoresis with the QIAGEN Gel Extraction Kit according to the manufacturer's instructions.
  • Transfer of the ligated MiniCircle to the ccc state was achieved by incubation with a DNA gyrase at 37 ° C. The incubation time was based on the desired degree of twist and was between 30 min. and 24 h. The batch was separated by gel electrophoresis (1% agarose). The DNA was stained using methylene blue and then the gel slice was cut out of the gel with the ccc MiniCircle DNA using a scalpel. The recovery of the MiniCircle from the gel was done with the QIAGEN Gel Extraction Kit according to the manufacturer's instructions.
  • the recombination caused by FIpE recombinase takes place between two so-called FRT sites, which in this case flank the MiniCircle sequence located in the parent plasmid.
  • the E. coli EL250 strain (2) contains the gene for the FIpE recombinase integrated in the genome. This gene is under the control of an L-arabinose-inducible promoter, ie the expression of this gene is first switched on by the addition of L-arabinose into the culture medium. The induction takes place in M9 minimal medium, since glucose or sucrose in the LB medium would interfere with the uptake of L-arabinose.
  • the parental plasmid consisting of MiniPlasmid and MiniCircle region, was electrotransformed into E.coli EL250. After selection of individual clones on agar plates (with appropriate selection medium), the respective plasmid DNA of the clones was examined by restriction digestion and sequencing for a correct base sequence. Long-term storage of the correct clones was achieved by mixing a 5 ml overnight culture with 87% glycerol in the ratio 1: 1 and storage at -20 ° C (glycerol stock).
  • the culture at 6000xg for 15 min. centrifuged.
  • the preparation of the plasmid DNA was carried out with a QIAGEN plasmid kit according to the manufacturer's instructions.
  • the starting volume of the bacterial culture was 50 ml in both cases.
  • the yield of MC DNA based on the starting volume of the bacterial culture in the process according to the invention is about 10-15 times higher than in the process by sequence-specific recombination.
  • the reasons for this are in particular the higher starting number of PP copies per bacterium in the bacterial strain used for the method according to the invention and in the low efficiency of the sequence-specific recombination (clearly visible on the strong PP band in the gel) compared to the ligation. 2.
  • the superhelical status of a DNA indicates to what extent the double helix is twisted in itself again. This "twisting state" is considered critical to the efficiency of DNA vectors for their ability to transform eukaryotic cells with significant effect on stability of expression and integration into the host cell genome.
  • the site-specific recombination generated in E. coli and the in vitro MC are compared in terms of their band pattern to demonstrate the suitability of the gyrase in generating ccc-DNA in vitro to obtain the various numbers of twists.
  • Another advantage of the new method is that the quality of twisting of the in vitro MC can be directly adjusted by the amount of gyrase used and the incubation time.
  • a large amount of gyrase (5 U) was used and a long incubation time was chosen to give a uniform To obtain a band pattern that reflects a uniform distribution of different Verdreilungs caren (information from the gyrase manufacturer New England Biolabs: 1 U gyrase twists 0.5 pg DNA in 30 min.).
  • PCR1 - Detection of MiniPlasmid or Parental Plasmid 10 pmol of primer 3 (TTTTCTGCGCGTAATCTGCT) and primer 4 (GTAAAAAGGCCGCGTTGCT) were used per reaction. These were used with 10 ng of MiniCircle preparation or Parental Plasmid control DNA using RedTaq polymerase (Invitrogen) by the following program for the amplification of possible impurities:
  • the positive control used was the parental plasmid pEpi-delCM18opt corresponding to the MiniCircles.
  • the amplicon to be expected upon contamination of the preparation has a size of 602 bp.
  • PCR2 - detection of parental plasmid 10 pmol of primer 1 (GCATGCCATCATGACTTCAG) and primer 2 (CGAAACGATCCTCATCCTGT) were used per reaction. These were used with 10 ng of MiniCircle preparation or Parental Plasmid control DNA using RedTaq polymerase (Invitrogen) by the following program for the amplification of possible impurities:
  • the positive control used was the parental plasmid pEpi-delCM18opt corresponding to the minicircles.
  • the amplicon to be expected upon contamination of the preparation is 876 bp in size.
  • MiniCircle produced by the classical method in E. coli EL250 contains impurities with parental plasmid and possibly also miniplasmid.
  • the in vitro minicircle produced by the new method no longer has DNA contaminants with MP or PP. 4. Control for the correct assembly of the in vitro MC by the ligase
  • a partial sequencing of the in vitro MC was used to investigate whether it also corresponds to the MC generated by site-specific recombination with regard to its sequence. To this end, the region of the FRT site resulting from recombination was sequenced (FIG. 7), the separation of MC and MP initially being carried out by the restriction enzyme XbaI, followed by religation by circularization of the MC fragment to the desired in vitro MC.
  • the partial in vitro MC sequencing data revealed that the FRT region of the in vitro MC corresponds to the FRT region of the vector map. Restriction with Xbal followed by ligation resulted in a new FRT site, as in site-specific recombination. This impressively demonstrates the superiority of the new method. Re-ligation of the linear MC fragments to circular in vitro MC is expected to be safe.
  • the MC produced by the in vitro method are characterized by a significantly greater purity and the manufacturing process by a significantly higher yield based on the starting volume of the bacterial culture.
  • DNA changes in response to topological perturbation of plasmids in E. coli and SV40 in vitro, in nuclei and in CV-1 cells, Nucleic Acids Research, Vol. 15 Num. 13, 5105-5124, 1987
  • Patent Application 20070031378 (12) Mayrhofer Peter et al. 2008, Minicircle-DNA production by site specific recombination and protein-DNA interaction chromatography; The Journal of Gene Medicine, Vol. 10, 1253-1269

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Reagenzien zur Herstellung von DNA-Vektoren, insbesondere MiniCircle (MC) DNA-Vektoren, in superhelikaler Form. Weiterhin betrifft die Erfindung hochreine Präparationen von zirkulären DNA-Vektoren, insbesondere MC DNA- Vektoren.

Description

Verfahren zur semi-synthetischen Herstellung hochreiner "MiniCircle" DNA-Vektoren aus Plasmiden
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Reagenzien zur Herstellung von DNA-Vektoren, insbesondere MiniCircle (MC) DNA-Vektoren, in superhelikaler Form. Weiterhin betrifft die Erfindung hochreine Präparationen von zirkulären DNA-Vektoren, insbesondere MC DNA- Vektoren.
Bisher verwendete Verfahren zur Herstellung der zirkulären MiniCircle DNA- Vektoren sind gekennzeichnet durch hohe Komplexität bei niedrigen Ausbeuten und großem Aufwand zur Erreichung der notwendigen Reinheit und Qualität (1 , 3, 8, 11 , 15).
Diesen Verfahren ist gemein, dass sie Rekombinasen einsetzen, um die MC aus den zuvor in Bakterien vermehrten Parentalplasmiden auszuschneiden. Einerseits garantiert der Einsatz der Rekombinasen den Erhalt des superhelikalen Status des MC, der für den weiteren Einsatz als Vektor zur Transduktion eukaryontischer Zellen notwendig ist. Andererseits ist dieser Vorgang extrem ineffizient, so dass die Ausbeute an MC, bezogen auf die Menge an eingesetzter Bakterienkultur, sehr gering ist. Dies liegt zu einem entscheidenden Teil daran, dass eine permanente Expression der für die Generierung der MC nötigen Rekombinasen in den Produktions- Bakterienstämmen nicht möglich ist, da dies zu einer frühzeitigen Eliminierung der in den Bakterien replizierenden Parentalplasmide führen würde, bevor diese in ausreichender Menge amplifiziert werden konnten, um als Ausgangssubstrat für die Herstellung der MC zur Verfügung zu stehen.
Da der Erhalt der superhelikalen Struktur für den späteren Einsatz der MC essenziell ist, sind auch die Anforderungen an die Aufreinigungsmethode zur Isolierung der MC entsprechend hoch, um die gewünschte Struktur der MC während der Aufreinigung nicht zu zerstören. In der klassischen Variante ((1 ), (3)) erfolgt die Abtrennung der MC von den nach der Rekombination entstandenen DNA-Nebenprodukten - Parentalplasmid, Miniplasmid und Konkatemeren der einzelnen Produkte - durch eine gezielte Linearisierung der ungewünschten Moleküle mittels speziell ausgewählter Restriktionsenzyme und anschließender Agarose-Gelelektrophorese. Der MC wird dabei von den Restriktionsenzymen nicht modifiziert, so dass der zirkuläre Status der MC nicht beeinflusst wird. Dabei besteht jedoch ein signifikantes Risiko, unerwünschte DNA Moleküle wie z.B. das (evtl. linearisierte) Parentalplasmid zusammen mit den MC aus dem Gel zu eluieren und aufzureinigen (3). Da auch die Parentalplasmide wie die MC in der Lage sind, eukaryontische Zellen zu transduzieren, kann dies für das MC-Experiment negative Folgen haben (z.B. dauerhaft transduzierte Zellen auf Grund der Integration des Parentalplasmids ins Genom der Wirtszelle).
Andere Varianten zur Aufreinigung von durch Rekombination in Bakterien generierten MC verwenden ein säulenchromatographisches System, das sich die Bindung spezieller Proteine an die in diesem Fall im MC enthaltene Sequenz des Lactose-Operators (lacOs) zu Nutze macht (11 , 12). In diesem Fall sind die erzielte Reinheit und auch die relative Ausbeute des Systems besser als in der klassischen Variante der Aufreinigung über das Agarosegel. Dafür muss der Nachteil in Kauf genommen werden, dass der MC dann bakterielle DNA Sequenzen (lacOs) enthält, was den funktionellen (5, 6) und regulatorischen Vorteil der MC gegenüber den klassischen Plasmid-Vektoren untergräbt.
Durch das in der vorliegenden Erfindung vorgestellte Verfahren zur Herstellung von MC in vitro können die Nachteile der bisher veröffentlichten Methoden zur MC Herstellung überwunden werden.
Das neue Verfahren verzichtet auf den Einsatz von Rekombinasen zur Generierung der MC aus dem Parentalplasmid. Gleichzeitig ist es nicht nötig, die erhaltenen MC über komplexe und teure Verfahren wie z.B. der Säulenchromatografie aufzureinigen, da eine Vermischung der MC mit den verschiedenen Nebenprodukten von vornherein vermieden wird. Dies führt zu einer Vereinfachung der Herstellung von MC gegenüber den bisher gängigen Verfahren bei gleichzeitiger Erhöhung von Ausbeute und Reinheit der Zielmoleküle, zumal überflüssige bakterielle Sequenzen im Rückgrat des MC komplett vermieden werden.
Das hier vorgestellte Verfahren basiert auf einer kombinierten in vivo/in vitro- Technologie, bei der in einem finalen enzymatischen Schritt mit Hilfe von Gyrase zirkuläre superhelikale MiniCircle-DNA generiert wird.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines zirkulären DNA-Vektors in superhelikaler Form, umfassend die Schritte:
(a) Spalten eines Parentalplasmids mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen, wobei das Parentalplasmid die Sequenz des DNA-Vektors sowie heterologe Sequenzen enthält, um ein lineares DNA-Vektor- Fragment mit der Sequenz des DNA-Vektors zu erhalten,
(b) Abtrennen des linearen DNA-Vektor-Fragments von anderen Produkten der Reaktionsspaltung,
(c) Ligieren des linearen DNA-Vektor-Fragments, um einen zirkulären DNA-Vektor in relaxierter Form zu erhalten,
(d) Abtrennen des zirkulären DNA-Vektors von anderen Produkten der Ligation,
(e) Verdrillen des zirkulären DNA-Vektors aus Schritt (d) mit einer Gyrase, um einen zirkulären DNA-Vektor in superhelikaler Form zu erhalten, und
(f) gegebenenfalls Aufreinigen des zirkulären DNA-Vektors in superhelikaler Form zur Abtrennung von Nebenprodukten.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von superhelikalen zirkulären DNA-Vektoren, umfassend eine Restriktionsspaltung in vitro, eine Ligation in vitro und eine Verdriilung mit Gyrase in vitro.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von superheiikalen MiniCircle DNA-Vektoren ohne den Einsatz orts-(sequenz-) spezifischer Rekombinasen wie etwa FLP.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Herstellung des DNA- Vektors, insbesondere des MC-DNA-Vektors, wie folgt:
• Die benötigten Vektorinformationen werden zusammen mit heterologen Sequenzen auf dem Parentalplasmid (PP) in einer Wirtszelle, z.B. in einem Bakterium, amplifiziert.
• Das Parentalplasmid wird mit Standardmethoden aus der Wirtszelle isoliert.
• Nach der Isolierung werden die MC-Sequenzen des PP mittels Verdau mit Restriktionsenzymen aus dem PP ausgeschnitten. Die dadurch entstandenen linearen Fragmente, von denen eines die Bereiche des MC enthält, werden z.B. durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Die linearisierten MC Fragmente werden mit gängigen Methoden isoliert, z.B. durch Elution, und für die weitere MC Herstellung verwendet.
• Die isolierten linearisierten MC-DNA-Moleküle werden durch die Verwendung (rekombinanter) Ligasen religiert, so dass die MC in der relaxierten, sog.„open circle" Form entstehen.
• Im Anschluss an die Ligation werden die relaxierten MC unter Einsatz (rekombinanter) Gyrase in einem in w'fro-Ansatz verdrillt, so dass die entsprechenden superheiikalen (supercoiled) Formen der MC entstehen, die für deren Einsatz zur Transduktion eukaryontischer Zellen benötigt werden.
• Abschließend wird der zirkuläre, superhelikale Vektor mit Standardmethoden (z.B. Agarose Gelelektrophorese mit anschließender Gel-Elution, Qiagen DNA Aufreinigungskits) von den Beiprodukten der enzymatischen Gyrase-Reaktion gereinigt.
Durch das hier beschriebene Verfahren zur Herstellung von DNA-Vektoren, insbesondere von MiniCircle-Genvektoren wird es ermöglicht, die z.B. für die Herstellung rekombinanter Zelllinien oder die Gentherapie einsetzbaren DNA-Vektoren mit einfachen Methoden in großer Menge und Reinheit herzustellen.
Außerdem werden durch das erfindungsgemäße Verfahren neuartige Präparationen von MC-Vektoren in hoher Reinheit erhalten.
Dies führt zum Einen zu einer deutlichen Reduktion an Kosten und Zeit für die bisher beschriebenen Einsatzgebiete und eröffnet zudem auch Perspektiven für neue Anwendungsfelder.
Gemäß dem o.g. Verfahren wird ein zirkulärer DNA-Vektor in superhelikaler Form hergestellt. Der DNA-Vektor besteht aus doppelsträngiger DNA und hat üblicherweise eine Größe von 0,5 bis etwa 10 kB, insbesondere von ca. 1-6 kB. Es können jedoch auch kleinere oder größere DNA- Vektoren hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der DNA- Vektor ein MiniCircle (MC) DNA-Vektor, d.h. ein zirkulärer DNA-Vektor, der die für den DNA-Vektor, z.B. den späteren MiniCircle DNA-Vektor, nötigen Funktionen enthält. Diese Funktionen beinhalten üblicherweise Sequenzen für ein Transgen, z.B. ein rekombinantes Gen oder eine entsprechende cDNA, zusammen mit regulatorischen Sequenzen zur Genexpression, z.B. Transkriptions- und Translations-Initiationssequenzen wie Promotoren, Enhancer, ribosomale Bindungsstellen, etc. und ggf. Transkriptions- Terminations-Sequenzen wie polyA Sequenzen und weitere regulatorische oder funktionelle Nucleotid-Sequenzen wie z.B. S/MAR Sequenzen zur Übertragung der Adhärenz des DNA-Vektors an die Kernmatrix als Auslöser für integrationsunabhängige episomale Replikation (2, 13, 14).
Als Transgen kann der DNA-Vektor eine pharmazeutisch verwendbare DNA- Sequenz enthalten, z.B. ein Gen bzw. eine cDNA aus Säugern, insbesondere ein humanes Gen oder eine rekombinante Variante davon für therapeutische Anwendungen, oder eine synthetische Sequenz, z.B. ein synthetisches Gen. Somit ist ein erfindungsgemäß bevorzugtes„Transgen" oder eine „transgene Sequenz", wobei diese Begriffe austauschbar verwendet werden können, eine eukaryotische Sequenz, insbesondere eine humane Sequenz und/oder eine synthetische Sequenz. Eine solche Sequenz kodiert z.B. für Wachstumsfaktoren, Cytokine, Interleukine, Interferone, Tumorsuppressor-Proteine etc. Andererseits kann der DNA- Vektor als Transgen auch eine Sequenz aus pathogenen Organismen, die für ein Antigen kodiert, oder eine Sequenz, die für ein Tumor- oder Autoantigen kodiert, enthalten.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlichen Präparationen von zirkulär-superhelikalen DNA-Vektoren, insbesondere MC Vektoren, können sowohl als Forschungsreagenzien als auch als pharmazeutische Produkte verwendet werden. Bevorzugt sind medizinische Anwendungen wie etwa DNA Vakzinierung, Gentherapie, Neu- oder Reprogrammierung von Zellen oder der Einsatz von RNAi.
Darüber hinaus können die aus dem Verfahren hergestellten DNA-Vektoren, insbesondere MC Vektoren, auch zur Herstellung von therapeutischen Proteinen in rekombinanten Zellen, insbesondere eukaryontischen Zellen, insbesondere CHO Zellen, verwendet werden. Dazu werden die entsprechenden Wirtszellen transient oder stabil durch die DNA-Vektoren transduziert, so dass die daraus resultierenden rekombinanten Zellen das gewünschte therapeutische Protein produzieren. Die Produktion des therapeutischen Proteins kann dabei unter gängigen industriellen biotechnologischen Methoden erfolgen.
Ein weiteres Einsatzgebiet der mit dem hier beschriebenen Verfahren hergestellten DNA-Vektoren, insbesondere MiniCircle Vektoren, ist die genetische Modifikation von Wirtszellen, die zur Expression rekombinanter Proteine verwendet werden sollen. Dabei werden die Wirtszellen durch die DNA-Vektoren so modifiziert, dass die Expression des transgenen Proteins in den modifizierten Wirtszellen in Quantität und/oder Qualität der Proteinexpression aus unveränderten Wirtszellen überlegen ist.
Zudem ermöglicht der Einsatz der DNA-Vektoren, insbesondere MC- Vektoren, die nachträgliche Modifikation von bereits rekombinantes Protein produzierenden Produktionszellen, so dass diese durch die durch den MC eingebrachten Gene in gewünschter Weise bzgl. Transgen-Quantität und/oder Qualität moduliert werden können.
Um die entsprechenden Zielzellen mit den durch das beschriebene Verfahren hergestellten MC zu verändern, kann die Transduktion der Zielzellen mit einem oder mehreren MC gleichzeitig erfolgen.
Die Generierung der zirkulären superhelikalen DNA-Vektoren erfolgt aus sogenannten Parentalplasmiden, die sich in ihren Grundfunktionen nicht von gewöhnlichen Plasmiden unterscheiden. Sie dienen zur Amplifikation der DNA-Vektorsequenzen in Wirtszellen, z.B. Bakterien wie etwa E.coli. Andere Beispiele für geeignete Wirtszellen sind Hefen, wie etwa Saccharomyces. Diese Parentalplasmide tragen neben der Sequenz des DNA-Vektors üblicherweise auf einem zusammenhängenden Teil des Gesamtplasmids heterologe Sequenzen, z.B. zur Propagation in einer Wirtszelle, wie etwa Informationen für den Replikationsursprung zur Initiierung der Replikation des Plasmids in Wirtszellen sowie im Normalfall eines Gens inklusive regulatorischer Sequenzen zur Übertragung einer Antibiotikum-Resistenz auf die Plasmid tragenden Wirtszellen.
Da die Herstellung von DNA-Vektoren gemäß vorliegender Erfindung ohne durch orts- bzw. sequenzspezifische Rekombinasen vermittelte DNA- Rekombination auskommt, kann ein Parentalplasmid als Ausgangsmaterial verwendet werden, das frei von Rekombinase-Erkennungssequenzen, z.B. frei von Erkennungssequenzen für sequenzspezifische Rekombinasen, wie etwa FLP, Cre, RecA, Phi-C31 und weiteren ist.
Vorzugsweise besteht das Parentalplasmid (PP) daher im Wesentlichen aus zwei Teilen:
• Dem Teil mit den funktionellen Einheiten zur Replikation und Amplifikation des Parentalplasmids in Wirtszellen, z.B. Bakterien.
• Dem zweiten Teil mit den Informationen, die für den DNA- Vektor benötigt werden.
Getrennt werden die Plasmid- und die DNA-Vektorsequenzen durch Erkennungssequenzen für ein oder mehrere Restriktionsenzyme, die vorzugsweise nicht auf dem DNA-Vektor-Fragment vorkommen.
Das als Ausgangsmaterial des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Parentalplasmid wird üblicherweise durch Kultivierung einer Wirtszelle, insbesondere einer prokaryontischen Wirtszelle, wie etwa E.coli, und Isolierung des Plasmids aus der Wirtszelle, gewonnen. Vorzugsweise wird als Wirtszelle ein Bakterienstamm verwendet, welcher zur High-Copy- Amplifikation von Plasmiden geeignet ist, wie etwa E.coli XL1 Blue (16). Die Gewinnung von Parentalplasmiden unterscheidet sich dabei nicht von Verfahren zur Herstellung üblicher Plasmide oder DNA-Vektoren.
Die Aufreinigung der PP aus den Bakterien kann nach Standardmethoden, z.B. mit kommerziell erhältlichen Kits (z.B. QIAgen Midiprep), erfolgen.
Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Spaltung eines Parentalplasmids mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen. Dieser Schritt wird günstigerweise in vitro, d.h. an einer isolierten Plasmid- Präparation durchgeführt. Zur Spaltung des Parentalplasmids werden Restriktionsenzyme verwendet, die ein Herausschneiden eines Fragments ermöglichen, welches die Sequenz des DNA-Vektors umfasst (DNA-Vektor- Fragment). Dieses DNA-Vektor-Fragment wird in linearer Form neben einem oder mehreren weiteren linearen Fragmenten entsprechend den im Parentalplasmid vorhandenen, zusätzlichen, heterologen Sequenzen erhalten.
Bei der Restriktionsspaltung wird vorzugsweise der Bereich des DNA- Vektors nicht geschnitten, während die verbleibende Sequenz, auch Mini- Plasmid (MP) bezeichnet, entweder als ganzes Stück zurückbleibt, oder aber durch die Spaltung in kleinere Stücke zerlegt wird. Wichtig dabei ist, dass keine DNA-Fragmente entstehen, die in der Größe ähnlich zum DNA-Vektor- Fragment sind. Die Restriktionsspaltung läuft vorzugweise quantitativ ab, so dass nach der enzymatischen Behandlung der DNA kein inaktes Parentalplasmid mehr vorliegt.
Gemäß Schritt (b) wird das lineare DNA-Vektor-Fragment von anderen Produkten der Restriktionsspaltung, d.h. anderen linearen DNA-Fragmenten, abgetrennt. Üblicherweise erfolgt die Abtrennung nach Größe, z.B. durch Gelelektrophorese. Bevorzugt ist eine Abtrennung durch Agarose-Gelelektrophorese. Als Ergebnis der Abtrennung wird das lineare DNA-Vektor- Fragment in hochreiner Form, frei von anderen Produkten der Restriktionsspaltung, isoliert. Da das DNA-Vektor-Fragment in linearisierter Form vorliegt, kann es anhand seiner Größe mittels eines gewöhnlichen DNA-Markers im Gel leicht identifiziert werden.
Der linearisierte MC kann nach Standardmethoden isoliert werden, z.B. durch Elution und Reinigung mittels kommerzieller Kits (z.B. QIAgen Gel elute) aus dem Agarosegel. Die so erhaltene DNA enthält nur linearisierte MC-DNA.
Gemäß Schritt (c) wird das lineare DNA-Vektor-Fragment mit einer Ligase in Kontakt gebracht, unter Bedingungen, unter denen eine Ligation erfolgt, wobei ein zirkulärer DNA-Vektor in relaxierter Form erzeugt wird. Schritt (c) wird günstigerweise in vitro, d.h. an einer isolierten Präparation des DNA- Vektor-Fragments durchgeführt. Geeignete Ligasen sind kommerziell, z.B. in rekombinanter Form, erhältlich. Um die Ligation möglichst effektiv zu gestalten, sollte bei dem zuvor durchgeführten Verdau des PP darauf geachtet werden, dass die dabei entstehenden 5'- und 3'-Enden des linearisierten DNA-Vektor-Fragments möglichst über komplementäre Nuecleotid-Überhänge verfügen. Gegebenenfalls kann auch eine Ligation mit glatten Enden durchgeführt werden.
Um zu verhindern, dass unter Umständen mitgeschleppte linearisierte MP- DNA zirkularisiert wird bzw. sich aus linearisiertem MC und linearem MP wieder ein PP entsteht, ist es bevorzugt, bei der Auswahl der Restriktionsenzyme zur Trennung von MC und MP darauf zu achten, dass das MP mittels eines zusätzlichen Enzyms so geschnitten wird, dass kein vollständiges MP-Fragment entsteht, das mit sich selbst oder mit dem MC zirkularisiert werden kann.
Nach der Ligation wird der Ansatz gemäß Schritt (d) aufgereinigt, um den zirkulären DNA- Vektor von anderen Produkten der Ligation abzutrennen. Dies kann z.B. durch Auftrennung über ein Agarosegel erfolgen. Hier werden evtl. Kontaminationen mit MP-Fragmenten oder MC-Konkatemere sichtbar. Aus dem Gel wird nur die Bande für den zirkularisierten DNA-Vektor (MC) ausgeschnitten und daraus die DNA eluiert. Dadurch wird der Reinheitsgrad der MC-DNA nochmals erhöht und eine Kontamination mit MP- oder PP- Fragmenten praktisch ausgeschlossen.
Für den Einsatz des MC als DNA-Vektor - speziell bei seiner Verwendung als stabil episomal replizierender Vektor - ist es notwendig, dass das ringförmige DNA-Molekül in superhelikaler Form vorliegt. Dieser superhelikale Status ist nach erfolgter Zirkularisierung mit Ligase nicht gegeben. Deshalb muss dieser nachträglich mittels Gyrase-Behandlung der zirkulären MC hergestellt werden. Bei der Gyrase - die in rekombinanter Form kommerziell erhältlich ist - handelt es sich um eine Typ II Topoisomerase, die in Anwesenheit von ATP die Einführung negativer superhelikaler Strukturen in DNA bewirkt.
Schritt (e) umfasst daher das Inkontaktbringen des zirkulären DNA-Vektors aus Schritt (d) mit einer Gyrase unter Bedingungen, bei denen eine Verdrillung des Vektors erfolgt, z.B. in Gegenwart von ATP. Auf diese Weise wird ein zirkulärer DNA-Vektor in superhelikaler Form in hoher Reinheit und Ausbeute erhalten. Schritt (e) wird günstigerweise in vitro, d.h. an einer isolierten Präparation des DNA-Vektors durchgeführt. Die Reaktionsdauer kann variiert werden, um Präparationen mit unterschiedlichem Verdrillungsgrad zu erhalten.
Die Reaktion kann nach den Vorschriften des Herstellers zur Anwendung der Gyrase erfolgen. Nach Einführung der superhelikalen Strukturen in die MC können diese abschließend mittels Standardmethoden, z.B. mittels kommerzieller Kits (z.B. QIAgen MidiPrep) aus dem Reaktionsansatz aufgereinigt werden.
Schritt (e) umfasst die Aufreinigung der zirkulären, superhelikalen DNA- Vektoren mittels Standardmethoden (Fällung, Agarosegeleiektrophorese mit anschließender Elution, Qiagen Qiaquick Nucleotide Removal Kit etc.) zur Abtrennung von Nebenprodukten aus der enzymatischen Gyrase-Reaktion.
Nach der Herstellung der MC mit der hier beschriebenen Methode, gibt es mehrere Möglichkeiten, den Erfolg und die Qualität der MC-Präparation zu testen:
• Agarosegel-Elektrophorese. Hier darf nur eine Bande zu sehen sein, deren Größe mit Hilfe eines DNA-Markers für superhelikale DNA bestimmt werden kann.
• Überprüfung der superhelikalen Struktur, z.B. anhand eines Chloroquin-Gels. Mit einem Gel dieser Art kann zirkuläre DNA je nach Anzahl der eingeführten superhelikalen Strukturen in ihre verschiedenen Formen aufgetrennt werden (10).
• Mittels PCR kann mit sehr hoher Sensitivität überprüft werden, ob ausschließlich zirkuläre MC-Strukturen in den Präparationen vorliegen, oder ob es auch Kontaminationen mit linearem oder zirkulärem MP und/oder PP gibt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzienkit, welcher Restriktionsenzyme, eine Ligase und eine Gyrase zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält. Der erfindungsgemäße Kit umfasst bevorzugt eine Restriktionsendonuklease. in einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform ist keine Endonuklease enthalten. Insbesondere bevorzugt ist eine Restriktionsendonuklease gleichzeitigem Fehlen einer Exonuklease umfasst. In einer bevorzugten Form der Erfindung umfasst der Kit eine Anleitung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Präparation eines DNA- Vektors, insbesondere eines MiniCircle DNA-Vektors in superhelikaler Form gekennzeichnet durch das Fehlen von Nebenprodukten, insbesondere linearem oder zirkulärem Miniplasmid und/oder Parentalplasmid. Vorzugsweise enthält die Präparation nach PCR keinen Hinweis auf die o.g. Nebenprodukte. Die PCR Reaktion ist dabei nicht Teil des MC Herstellungsprozesses sondern stellt eine Nachweismethode für Kontaminationen durch Parental- und Miniplasmide dar, welche es ermöglicht, die größere Reinheit der erfindungsgemäß in vitro erzeugten MC Präparationen gegenüber durch Rekombination auf herkömmliche Art und Weise hergestellter MC Präparationen nachzuweisen.
Um mittels PCR verunreinigende Parentalplasmide nachzuweisen, müssen die sequenzspezifischen Primer so gewählt werden, dass eines der beiden Oligonucleotide im Bereich des heterologen Rückgrats des Parentalplasmids bindet, während der korrespondierende Primer sich in der Region des MiniCircles befindet. Bei dieser Anordnung der Oligonucleotide kommt es nur zu einer Amplifikation des entsprechenden Fragments, wenn in der MC Präparation Parentalplasmid vorkommt. Mit Hilfe einer zweiten PCR können auch kontaminierende Miniplasmide gefunden werden. Dazu müssen beide PCR-Primer im Bereich des heterologen Rückgrats des ursprünglichen Parentalplasmids liegen. Kommt es zur Amplifikation des PCR-spezifischen Fragments, so kann diese entweder von Miniplasmiden oder dem Parentalplasmid stammen. War die erste PCR negativ für Parentalplasmid, so ist das Amplifikat der zweiten PCR auf Miniplasmide zurück zu führen. Sind beide PCR Reaktionen positiv, so ist keine eindeutige Aussage hinsichtlich der Art der Nebenprodukte möglich.
Die in vitro hergestellten MiniCircles verfügen über gezielt steuerbare superhelikale Strukturanteile. Die dadurch erreichte Vorhersagbarkeit der Zusammensetzung der in vitro MC Präparation ist der zufälligen Zusammensetzung von aus Bakterien durch ortsspezifische Rekombinantion gewonnenen zirkulären DNA-Molekülen deutlich überlegen. Diese Überlegenheit hat substanzielle Konsequenzen, insbesondere für den Einsatz therapeutischer Vektoren bei klinischen Anwendungen.
Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch die nachfolgenden Figuren und Beispiele erläutert werden.
Figurenlegende
Figur 1 : Plasmidkarte des MC Parentalplasmides „pEpi-eGFP M18 antiHLC" und der Rekombinationsprodukte.
Das Parentalplasmid enthält alle für ein funktionierendes Plasmid notwendigen Einheiten wie Origin of Replication (oh, in diesem Falle zwischen HSV TK polyA und der folgenden FRT-Site; nicht eingezeichnet) und Antibiotikum-Resistenz (Neo/Kana). Entscheidend zur Herstellung von MC-Vektoren nach der gängigen Methode mittels sequenzspezifischer Rekombination ist das Vorhandensein der beiden FRT-Sequenzen, die als Angriffspunkte für die FLP-Recombinase dienen. Durch die FLP-induzierte Rekombination dieser beiden Sequenzen gegeneinander kommt es hier zur Abschnürung zweier unabhängiger zirkulärer DNA-Moleküle. Eines davon trägt die Informationen für die in Bakterien wichtigen Funktionen und wird deshalb als MiniPlasmid bezeichnet. Das zweite Molekül enthält keine funktionalen bakteriellen Sequenzen mehr, sondern trägt nur noch die für den Vektor spezifischen Informationen und stellt somit den MiniCircle dar.
Figur 2: Vergleich des„in iro"-Minicircle mit dem per ortsspezifischer Rekombination in E. coli EL250 hergestellten MiniCircle mithilfe eines 1%-igen Agarosegels.
Der in vitro-MC wurde durch Restriktion mit dem Enzym Xbal und anschließender Re-Ligation mit einer T4-Ligase aus dem PP erhalten. Anschließend wurde die ligierte DNA (je 1 pg) für 30 min. (Spur 1 ), 2 h (Spur 2) oder 5 h (Spur 4) mit 1 U DNA-Gyrase behandelt. Der„EL250"-MC wurde durch ortsspezifische Rekombination in E. coli EL250 nach Induktion mit 0,3 % L-Arabinose erhalten (Spur 3). Die in vitro-MC und die „EL250"-MC besitzen in einem 1 % Agarosegel dasselbe Laufverhalten, d.h. dass mit Hilfe der DNA-Gyrase in die ligierte MC-DNA superhelikale Strukturen eingeführt wurden.
In der Spur 1 , 2 und 4 ist erkennbar, dass bereits nach 30 min Gyrase- Behandlung der ligierte MC vollständig in die supercoiled (ccc)-Form überführt wurde. Weiterhin sind MC-Concatemere und nicht-ligierte MC- DNA zu erkennen. In der Spur 3 sind zusätzlich zur MC-Bande eine starke PP-Bande und eine MP-Bande zu erkennen.
Legende: i.v. = in wfro-MiniCircle; EL250 = MiniCircle, durch ortsspezifische Rekombination in E. coli EL250 hergestellt; MC= MiniCircle; PP = Parentalplasmid; MP = Miniplasmid
Figur 3: Auftrennung verschiedener ccc-Plasmide auf einem 0,8 % Chloroquin-Agarosegel
Es wurden die Plasmide pMAXGFP (LONZA), CMV-GFP-Parentalplasmid und pEpi-delCM18opt (Rentschier Biotechnologie) verwendet. Das
Agarosegel enthielt 2,5 pg mL"1 Chloroquin. Der Gellauf erfolgte für 15 h bei
2,5 V cm"1. (A) Je Plasmid wurden entweder 1 pg oder 500 ng für den Gellauf verwendet. Bei allen verwendeten Plasmiden ist ein charakteristisches Bandenmuster entstanden. (B) Die Signale wurden mit dem Programm ImageJ quantifiziert.
Figur 4: Auftrennung verschiedener Mengen des ccc-Plasmid pEpi- delCM18opt auf einem 0,8 % Chloroquin-Agarosegel.
Die DNA wurde für 15 h bei 2,5 V cm"1 aufgetrennt. Das Gel enthielt 2,5 [ig mL"1 Chloroquin. (A) Die Reihe 1 - 6 enthält verschiedene Mengen an ccc- DNA, die Reihe 7 enthält das linearisierte Plasmid. (B) Die Bandenmuster wurden mit dem Programm ImageJ aufgenommen. Es wird deutlich, dass der Auftrag einer Menge von 100 ng DNA für die Auswertung der Bandenmuster ausreichend ist. Bei längerer Belichtung können sogar noch 50 ng ausgewertet werden (Daten nicht gezeigt).
Figur 5: Vergleich der Verdrillung des„in v fro"-MiniCircles mit dem per ortsspezifischer Rekombination entstandenen MiniCircle aus dem Plasmid pEpi-delCM18opt
(A) Spur 1 : Der in vitro MiniCircle wurde durch Restriktionsverdau des Parentalplasmids mit den Enzymen Xbal und BstBI und anschließender Ligation (T4-Ligase) hergestellt (oc). Es ist zu erkennen, dass die Ligation nicht vollständig ist, ein gewisser Teil der DNA bleibt linearisiert. Weiterhin entstehen Concatemere aus zwei oder mehreren DNA-Stücken. Spur 2: Die Gyrase und der Gyrasepuffer wurden direkt dem Ligationsansatz (1 pg DNA) hinzugefügt. Es ist erkennbar, dass keine Verdrillung stattgefunden hat. Spur 3: Die Ligation wurde zunächst aufgereinigt (QIAGEN PCR Purification Kit), anschließend wurde 1 [ig ligierte DNA für 2 h mit 5 U Gyrase behandelt. Spur 4: Der MiniCircle wurde per ortsspezifischer Rekombination hergestellt. Diese wurde in E. coli EL250 mit Hilfe einer im Genom kodierten FLP- Rekombinase durch L-Arabinose induziert.
(B) Die Spur 3 und 4 aus (A) wurden hier vergrößert und invertiert dargestellt. Der per ortspezifischer Rekombination entstandene MC (Spur 4) zeigt das erwartete Bandenmuster. Der in vitro MC (Spur 3) zeigt ebenfalls das Bandenmuster, eine Bande ist jedoch besonders ausgeprägt. (C) Die Signale wurden mit dem Programm ImageJ aufgenommen und sind entsprechend mit Pfeilen gekennzeichnet. Bei der Spur 3 ist das in (B) erwähnte deutliche Bandensignal zu erkennen (roter Pfeil).
Legende: linear= linearisierte DNA, oc = open circle DNA, ccc= supercoiled DNA, U= Unit, EL250 = per ortsspezifischer Rekombination hergestellter MC, MC= MiniCircle
Figur 6: Überprüfung der Reinheit der generierten MiniCircle per PCR und 1 % Agarosegel
Um die generierte MiniCircle-DNA aus pEpi-delCM18opt (Vektorkarte A) auf mögliche Verunreinigungen mit Parentalplasmid oder Miniplasmid zu überprüfen, wurde per PCR ein Stück in der Miniplasmid-Region (s. linearisierte Vektorkarte B; PCR 1 ) und über eine FRT-Site (s. linearisierte Vektorkarte B, PCR 2) ampiifiziert. Es wurde jeweils 10 ng Template-DNA verwendet. Entsteht bei der PCR 1 ein Amplifikat, enthält die Probe entweder Miniplasmid oder Parentalplasmid, entsteht bei der PCR 2 ein Amplifikat, enthält die Probe Parentalplasmid, da bei dieser PCR ein Primer in der MiniCircle-Region und ein Primer in der Miniplasmid-Region liegt. (C1) In der Probe mit dem per ortsspezifischer Rekombination hergestellten MiniCircle (EL250 MC) ist ein Amplifikat entstanden, in der Probe mit dem //7-w'f/ -MiniCircle ist kein Amplifikat entstanden. (C2) Es ist ebenfalls bei dem EL250 MiniCircle ein Amplifikat entstanden. Legende: PP = Parentalplasmid; MC = Minicircle, EL250 MC= MiniCircle, der per ortsspezifischer Rekombination im E. co//-Stamm EL250 hergestellt wurde.
Figur 7: Sequenzierung des„in fro"-MiniCircles aus pEpi-delCM18opt
(A) Vektorkarte des pEpi-delCM18opt-MC mit sequenzierter Region (roter Pfeil) (B) Vergleich der Sequenz des in-vitro MC mit der Sequenz laut Vektorkarte mit dem Programm ClustalW (EMBL-EBI).
Legende: orange= SV40Promotor/Enhancer; braun= FRT-site; blau= Xbal- Schnittstelle innerhalb der FRT-site; grün= eGFP-Gen; * = Basen- Übereinstimmung. Beispiel
Herstellung und Charakterisierung von MC unter Verwendung eines in vitro Verfahrens mit Ligase und Gyrase
Durch Verwendung von Ligase und Gyrase konnten in vitro superhelikale MC erfolgreich hergestellt werden, ohne auf den Einsatz von sequenzspezifischen Rekombinasen oder speziellen Bakterienstämmen zur Replikation der PP und anschließender Induktion der MC Herstellung angewiesen zu sein.
Zu Testzwecken wurde hier ein PP (pEpi-eGFM18 anti HLC) verwendet, das über alle nötigen Elemente verfügt, um mit Hilfe induzierter, sequenzspezifischer Rekombination in MC und MP umgewandelt zu werden. Dadurch war ein direkter Vergleich der beiden Verfahren möglich. Prinzipiell können mit der in iro-Methode bei geeignetem Restriktionsverdau alle Plasmide in MC umgewandelt werden. Eine schematische Darstellung dieses Plasmids ist in Fig. 1 gezeigt.
1. Herstellung von MC aus 50 mL Bakterienkultur: Vergleich erfindungsgemäßes (in vitro) und Rekombinase-vermitteltes Verfahren
Die in dieser Anmeldung beschriebenen semi-synthetischen MiniCircle DNA- Vektoren wurden nach dem hier näher beschriebenen Verfahren hergestellt: Das Parentalplasmid - im hier dargestellten Fall pEpi-delCM18opt - bestehend aus MiniPlasmid und MiniCircle-Region, wurde per Elektrotransformation in E.coli XL1 Blue(16) eingebracht. Nach der Selektion von Einzelklonen auf Agarplatten (mit entsprechendem Selektionsmedium) wurde die jeweilige Plasmid-DNA der Klone per Restriktionsverdau und Sequenzierung auf eine korrekte Basenfolge untersucht. Eine langfristige Lagerung der korrekten Klone erfolgte durch Mischen einer 5 ml Übernacht- Kultur mit 87 % Glycerin im Verhältnis 1 :1 und Lagerung bei - 20 °C (Glycerin-Stock).
Zur Generierung des Parentalplasmids für die spätere in-vitro-Gewinnung von MiniCircle-DNA wurde etwas Kultur vom Glycerinstock in einen Erlenmeyerkolben mit LB- Selektionsmedium transferiert und bei 37 °C und 180 rpm auf einem Orbitalschüttler ü.N. kultiviert. Zur Gewinnung der Plasmid-DNA (= Parentalplasmid) wurde die Kultur bei 6000 xg für 15 min. abzentrifugiert. Die Präparation der Plasmid-DNA erfolgte mit einem QIAGEN Plasmid-Kit gemäß Anleitung des Herstellers.
Der Minicircle, der von zwei gleichen Restriktionsschnittstellen flankiert wird, wurde per Über-Nacht-Restriktionsverdau aus der Plasmid-DNA geschnitten. Der Restriktionsverdau wurde per Gelelektrophorese (1% Agarosegel) aufgetrennt. Nach dem Gellauf wurde die DNA im Gel durch Methylenblau angefärbt und das Gelstück mit der linearisierten MiniCircle-DNA mit einem Skalpell ausgeschnitten. Die Rückgewinnung des MiniCircles aus dem Gel erfolgte mit dem QIAGEN Gel Extraction Kit gemäß Anleitung des Herstellers.
Die linearisierte MiniCircle-DNA wurde durch eine T4-Ligase bei 16 °C für 16 h religiert. Die Aufreinigung der ligierten DNA aus dem Ligationsansatz erfolgte nach Agarose Gelelektrophorese mit dem QIAGEN Gel Extraction Kit gemäß Anleitung des Herstellers.
Die Überführung des ligierten MiniCircles in den ccc-Zustand wurde durch Inkubation mit einer DNA-Gyrase bei 37 °C erreicht. Die Inkubationszeit richtete sich dabei nach dem gewünschten Grad der Verdrillung und lag zwischen 30 min. und 24 h. Der Ansatz wurde per Gelelektrophorese (1% Agarose) aufgetrennt. Dabei wurde die DNA mithilfe von Methylenblau angefärbt und danach das Gelstück mit der ccc-MiniCircle-DNA aus dem Gel mit einem Skalpell ausgeschnitten. Die Rückgewinnung des MiniCircles aus dem Gel erfolgte mit dem QIAGEN Gel Extraction Kit gemäß Anleitung des Herstellers. Die Herstellung der rekombinationsinduzierten MiniCircles aus dem gleichen Parentalplasmid (pEpi-delCM18opt) wie die semi-synthetischen MiniCircles wurde nach dem herkömmlichen Verfahren durch den Einsatz von Rekombinasen wurde wie folgt durchgeführt:
Die FIpE-Rekombinase induzierte Rekombination findet zwischen zwei sog. FRT-Stellen statt, die in diesem Fall die im Parentalplasmid befindliche MiniCircle Sequenz flankieren. Der E.coli-Stamm EL250(2) enthält das Gen für die FIpE-Rekombinase im Genom integriert. Dieses Gen steht unter der Kontrolle eines L-Arabinose-induzierbaren Promotors, d.h. dass die Expression dieses Gens erst durch die Zugabe von L-Arabinose in das Kulturmedium angeschaltet wird. Die Induktion findet in M9-Minimalmedium statt, da Glukose oder Saccharose im LB Medium die Aufnahme der L- Arabinose stören würde.
Das Parentalplasmid, bestehend aus MiniPlasmid und MiniCircle-Region, wurde per Elektrotransformation in E.coli EL250 eingebracht. Nach der Selektion von Einzelklonen auf Agarplatten (mit entsprechendem Selektionsmedium) wurde die jeweilige Plasmid-DNA der Klone per Restriktionsverdau und Sequenzierung auf eine korrekte Basenfolge untersucht. Eine langfristige Lagerung der korrekten Klone erfolgte durch Mischen einer 5 ml Übernacht-Kultur mit 87 % Glycerin im Verhältnis 1 :1 und Lagerung bei - 20 °C (Glycerin-Stock).
Vor der L-Arabinose-Induktion wurde etwas Kultur vom Glycerinstock in einen Erlenmeyerkolben mit LB-Selektionsmedium transferiert und bei 30 °C für 24 h kultiviert. Anschließend wurde die Kultur bei 3700xg für 15 min. zentrifugiert. Das Pellet wurde in M9-Minimalmedium (1/2 des vorherigen Volumens) aufgenommen bzw. gewaschen und erneut für 15 min. bei 3700xg zentrifugiert. Danach wurde das Pellet in dem ursprünglichen Kulturvolumen in M9-Minimalmedium mit Zusatz von 0,3 % L-Arabinose aufgenommen und in einem Erlenmeyerkolben für 5 h bei 30 °C und 180 rpm auf einem Orbitalschüttler inkubiert. Dadurch wurde die Expression der Flp-Rekombinase induziert, durch die wiederum die Rekombination des Parentalplasmids zu MiniCircle und MiniPlasmid katalysiert wurde (diese Reaktion läuft in den Bakterien nicht quantitativ ab, so dass dabei stets nicht umgesetztes Parentalplasmid in den Bakterien zurückbleibt).
Zur Gewinnung der nicht chromosomalen DNA (= MiniCircle, Parentalplasmid und Miniplasmid) wurde die Kultur bei 6000xg für 15 min. abzentrifugiert. Die Präparation der Plasmid-DNA erfolgte mit einem QIAGEN Plasmid-Kit gemäß Anleitung des Herstellers.
Durch einen Über-Nacht Restriktionsverdau mit einem geeigneten Restriktionsenzym, das ausschließlich in der MiniPlasmid-Region schneidet, wurden das nicht umgesetzte Parentalplasmid und das als nicht benötigtes Beiprodukt entstandene MiniPlasmid linearisiert. Der MiniCircle wurde durch diese Reaktion nicht verändert und blieb deshalb im ccc-Zustand. Der Restriktionsverdau wurde per Gelelektrophorese (1% Agarosegel+ 0,5 pg/mL Ethidiumbromid) aufgetrennt. Das Gelstück mit der ccc-MiniCircle- DNA wurde auf einem UV-Tisch mit einem Skalpell ausgeschnitten. Die Rückgewinnung des MiniCircles aus dem Gel erfolgte mit dem QIAGEN Gel Extraction Kit gemäß Anleitung des Herstellers.
Das Ausgangsvolumen der Bakterienkultur betrug in beiden Fällen 50 ml_.
Wie in Fig. 2 deutlich sichtbar, ist die Ausbeute an MC DNA bezogen auf das Ausgangsvolumen der Bakterienkultur beim erfindungsgemäßen Verfahren etwa 10-15 Mal höher als bei dem Verfahren durch sequenzspezifische Rekombination. Gründe dafür liegen insbesondere in der höheren Ausgangszahl an PP-Kopien pro Bakterium bei dem für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Bakterienstamm und in der im Vergleich zur Ligation niedrigen Effizienz der sequenzspezifischen Rekombination (deutlich sichtbar an der starken PP Bande im Gel). 2. Nachweis des superhelikalen Status von in fro-hergestelltem MiniCircle
Der superhelikale Status einer DNA gibt an, in welchem Maße die Doppelhelix nochmals in sich selbst verdrillt ist. Dieser„Verdrillungsstatus" gilt als entscheidend für die Effizienz von DNA-Vektoren bzgl. deren Eigenschaft zur Transformation eukaryontischer Zellen mit signifikanter Auswirkung auf Stabilität der Expression und Integration in das Wirtszellgenom.
2.1 Superhelikaler Status von aus Bakterien isolierter Plasmid-DNA
Um den Grad der Verdrillung von ccc-DNA zu untersuchen, eignet sich ein Agarosegel, dem Chloroquin in einer bestimmten Konzentration zugesetzt wurde (10). Chloroquin fügt positive„supercoils" in die negative ccc-DNA ein. Außerdem trennt sich die ccc-DNA-Bande je nach Stärke der Verdrillung auf. Zunächst wurde die Methode etabliert. Dazu wurden die ccc-Plasmide pMAXGFP (LONZA, Nucleofector-Kit), CMV-GFP-Parentalplasmid (Plasmid Factory) und pEpi-delCM18opt (Rentschier Biotechnologie) auf einem 0,8 %
Agarosegel mit 2,5 \ig mL"1 Chloroquin für 15 h bei 2,5 V cm"1 aufgetrennt (Fig. 3).
Sowohl die kommerziellen Plasmid-Proben als auch die selbst-präparierte Plasmid-DNA aus E. coli XL1 Blue (pEpi-delCM18opt) stellen ein Gemisch aus einem Plasmid mit verschiedenen „Verdrillungsgraden" dar. Aus der Grafik wird deutlich, dass keine einheitliche Verdrillungszahl in Prokaryoten vorherrscht bzw. jedes Plasmid ein eigenes Bandenmuster besitzt. Bei einer
Konzentration von 2,5 [ig mL"1 Chloroquin läuft ccc-DNA mit einer hohen Verdrillungszahl schneller als mit einer niedrigen Verdrillungszahl. Bei höheren Chloroquin-Konzentrationen verhält sich die DNA umgekehrt.
2.2 Vergleich des superhelikalen Status von MC aus ortsspezifischer Rekombination und von erfindungsgemäßen (in vitro) MC
Um die Verdrillung der MiniCircle per ortsspezifischer Rekombination mit dem in 'iro-MiniCircle vergleichen zu können, wurde die niedrigste einzusetzende DNA-Menge bestimmt, da die Ausbeute an MiniCircle per ortsspezifischer Rekombination sehr gering ist. Dazu wurden die Verdünnungen von 50 - 500 ng des ccc-Parentalplasmids pEpi-delCM18opt verwendet (Fig. 4).
Für die Auftrennung der ccc-DNA reichen 50 ng DNA aus, um das entstehende Bandenmuster mit ImageJ auswerten zu können. Im Folgenden werden der per ortsspezifischer Rekombination in E.coli erzeugte und der in vitro MC in Bezug auf ihr Bandenmuster verglichen, um die Eignung der Gyrase bei der in wiro-Generierung von ccc-DNA zur Erzielung der verschiedenen Verdrillungszahlen zu zeigen.
Um den Grad der Verdrillung von ccc-DNA zu untersuchen, wurde die Auftrennung der ccc-DNA mithilfe eines Chloroquin-Agarosegels durchgeführt.
Zur Generierung der in vitro-MC wurde untersucht, ob die Ligase zusammen mit der Gyrase in einem Reaktionsansatz eingesetzt werden kann. Wie in Fig. 5 (A, Spur 2) erkennbar, ist dies unter den getesteten Reaktionsbedingungen nicht möglich. Die Gyrasebehandlung hatte in diesem Fall keine Wirkung. Die Aufreinigung der Ligation mit anschließender Gyrasebehandlung zeigte dagegen ein positives Ergebnis, d.h. ccc-DNA (Fig. 5, A, Spur 3). Beim Vergleich der beiden MCs ist erkennbar, dass beide MCs ein vergleichbares Bandenmuster aufweisen, beim in vitro MC jedoch eine Bande besonders ausgeprägt ist. Ein weiterer Vorteil der neuen Methode ist, dass die Qualität der Verdrillung der in vitro MC durch die verwendete Menge an Gyrase und die Inkubationszeit direkt eingestellt werden kann. Im vorliegenden Fall wurde eine große Menge an Gyrase (5 U) eingesetzt und eine lange Inkubationszeit gewählt, um ein gleichmäßiges Bandenmuster zu erhalten, das eine gleichmäßige Verteilung verschiedener Verdriilungsstufen widerspiegelt (Angaben des Gyrase Herstellers New England Biolabs: 1 U Gyrase verdrillt 0,5 pg DNA in 30 min.).
3. Überprüfung der Reinheit der in vitro MC Präparationen mittels PCR
Um die höhere Reinheit unseres neuen Verfahrens gegenüber den verschiedenen anderen Verfahren zu zeigen, wurden verschieden hergestellte MC-Präparationen verglichen. Hierzu wurde jeweils eine PCR auf die Miniplasmid-Region und über eine der beiden im PP enthaltenen FRT-Erkennungsstellen - zum Nachweis evtl. vorhandenen Parentalplasmids - durchgeführt (Fig.6). Dazu wurden MC verwendet, die aus dem PP pEpi- delCM18opt generiert worden waren.
Die PCR Reaktionen zum Nachweis von MiniPlasmid und/oder Parentalplasmid Verunreinigungen in der MiniCircle Präparation wurden im in dieser Anmeldung dargestellten Fall wie im Folgenden beschrieben durchgeführt:
PCR1 - Nachweis von MiniPlasmid oder Parentalplasmid: Pro Reaktion wurden 10 pmol an "Primer 3" (TTTTCTGCGCGTAATCTGCT) und "Primer 4" (GTAAAAAGGCCGCGTTGCT) eingesetzt. Diese wurden mit 10 ng MiniCircle Präparation bzw. Parentalplasmid-Kontroll-DNA unter Verwendung der RedTaq-Polymerase (Invitrogen) mittels folgendem Programm zur Amplifikation evtl. Verunreinigungen eingesetzt:
16
Als Positivkontrolle wurde das zu den MiniCircles korrespondierende Parentalplasmid pEpi-delCM18opt verwendet. Das bei Verunreinigung der Präparation zu erwartende Amplifikat hat eine Größe von 602 bp.
PCR2 - Nachweis von Parentalplasmid: Pro Reaktion wurden 10 pmol an "Primer 1 " (GCATGCCATCATGACTTCAG) und "Primer 2" (CGAAACGATCCTCATCCTGT) eingesetzt. Diese wurden mit 10 ng MiniCircle Präparation bzw. Parentalplasmid-Kontroll-DNA unter Verwendung der RedTaq-Polymerase (Invitrogen) mittels folgendem Programm zur Amplifikation evtl. Verunreinigungen eingesetzt:
Als Positivkontrolle wurde das zu den MiniCirclen korrespondierende Parentalplasmid pEpi-delCM18opt verwendet. Das bei Verunreinigung der Präparation zu erwartende Amplifikat hat eine Größe von 876 bp.
Überraschenderweise enthält nur der mit der klassischen Methode in E. coli EL250 hergestellte MiniCircle Verunreinigungen mit Parentalplasmid und evtl. auch Miniplasmid. Der mit dem neuen Verfahren hergestellte in vitro- Minicircle weist keine DNA-Verunreinigungen mehr mit MP oder PP auf. 4. Kontrolle auf den korrekten Zusammenbau des in vitro MC durch die Ligase
Durch eine partielle Sequenzierung des in vitro MC wurde untersucht, ob dieser auch im Hinblick auf seine Sequenz dem per ortsspezifischer Rekombination generierten MC entspricht. Dazu wurde die Region der nach Rekombination entstandenen FRT-Stelle sequenziert (Fig.7), wobei zunächst die Trennung von MC und MP durch das Restriktionsenzym Xbal erfolgte, sowie anschließend eine Religation durch Zirkularisierung des MC- Fragmentes zum gewünschten in vitro MC.
Die Daten der partiellen in vitro MC-Sequenzierung ergaben, dass die FRT- Region des in vitro MCs der der FRT-Region der Vektorkarte entspricht. Durch die Restriktion mit Xbal mit anschließender Ligation ist, wie bei der ortsspezifischen Rekombination, eine neue FRT-site entstanden. Damit ist eindrucksvoll die Überlegenheit der neuen Methode gezeigt. Die Re-Ligation der linearen MC-Fragmente zu zirkulären in vitro MC funktioniert erwartungsgemäß sicher.
5. Zusammenfassung der vorliegenden Ergebnisse
Die Daten der vorliegenden Anmeldung zeigen, dass es möglich ist, MC DNA-Vektoren in vitro ohne den Einsatz von ortsspezifischen Rekombinasen herzustellen, die in ihren strukturellen Eigenschaften den herkömmlichen durch ortsspezifische Rekombination hergestellten MC entsprechen.
Dabei zeichnen sich die durch die in vitro Methode hergestellten MC durch eine signifikant größere Reinheit und das Herstellungsverfahren durch eine deutlich höhere Ausbeute bezogen auf das Ausgangsvolumen der Bakterienkultur aus.
Durch den Verzicht auf die ortsspezifische Rekombination zur Herstellung des MC können prinzipiell alle Plasmid-DNA-Vektoren als Ausgangsmaterial zur MC Herstellung verwendet werden. Eine Klonierung der gewünschten Vektorsequenzen („Gene of Interest") in spezielle Parentalplasmide mit entsprechenden Rekombinationssequenzen, entfällt bei der in vitro Methode.
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Claims

Ansprüche
Verfahren zur Herstellung eines zirkulären DNA-Vektors in superhelika- ler Form, umfassend die Schritte:
(a) Spalten eines Parentalplasmids mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen, wobei das Parentalplasmid die Sequenz des DNA-Vektors sowie heterologe Sequenzen enthält, um ein lineares DNA-Vektor- Fragment mit der Sequenz des DNA-Vektors zu erhalten,
(b) Abtrennen des linearen DNA-Vektor-Fragments von anderen Produkten der Reaktionsspaltung,
(c) Ligieren des linearen DNA-Vektor-Fragments, um einen zirkulären DNA-Vektor in relaxierter Form zu erhalten,
(d) Abtrennen des zirkulären DNA-Vektors von anderen Produkten der Ligation,
(e) Verdrillen des zirkulären DNA-Vektors aus Schritt (d) mit einer Gy- rase, um einen zirkulären DNA-Vektor in superhelikaler Form zu erhalten, und
(f) gegebenenfalls Aufreinigen des zirkulären DNA-Vektors in superhelikaler Form zur Abtrennung von Nebenprodukten.
Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Parentalplasmid durch Kultivierung einer Wirtszelle, insbesondere einer pro- karyontischen Wirtszelle, und Isolierung des Plasmids aus der Wirtszelle gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Parentalplasmid in zirkulärer Form aus der Wirtszelle gewonnen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Parentalplasmid verwendet wird, das frei von Rekombina- se-Erkennungssequenzen ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 -4, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologen Sequenzen des Parentalplasmids die zur Propa- gation in einer Wirtszelle, insbesondere einer prokaryontischen Wirtszelle, erforderlichen Sequenzen umfassen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass ein DNA-Vektor hergestellt wird, der frei von prokaryontischen Sequenzen ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass der DNA-Vektor ein Transgen in operativer Verknüpfung mit regulatorischen Sequenzen enthält.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass ein DNA-Vektor hergestellt wird, der S/MAR-Sequenzen enthält.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass die Restriktionsspaltung in Schritt (a) in vitro durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 -9, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (b) eine Gelelektrophorese, insbesondere eine Agarose- Gelelektrophorese, umfasst.
1 1 Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, dass die Ligation in Schritt (c) in vitro durchgeführt wird.
12 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 -10, dadurch gekennzeichnet, dass das Verdrillen in Schritt (e) in vitro durchgeführt wird.
13. Reagenzienkit zur Herstellung eines zirkulären DNA-Vektors in super- helikaler Form, insbesondere zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, umfassend
(a) eine Ligase, (b) eine Gyrase, und
(c) ggf. ein oder mehrere Restriktionsenzyme.
14. Präparation eines MiniCircle DNA-Vektors in superhelikaler Form, gekennzeichnet durch das Fehlen von linearem oder zirkulärem Miniplas- mid und/oder Parentalplasmid.
15. Präparation nach Anspruch 14, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12.
16. Verfahren zur Herstellung von superhelikalen zirkulären DNA-Vektoren, umfassend (a) eine Restriktionsspaltung eines Parenteralplasmids in vitro, um ein lineares DNA-Vektorfragment mit der Sequenz des DNA- Vektors zu erhalten, (b) eine Ligation des linearen DNA- Vektorfragments in vitro, um einen zirkulären DNA- Vektor in relaxierter Form zu erhalten, und (c) eine Verdrillung des zirkulären DNA-Vektors in relaxierter Form mit Gyrase in vitro.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12 und 16, wobei der zirkuläre DNA-Vektor ein MiniCircle DNA-Vektor ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12 und 16-17, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ohne den Einsatz von orts- oder/und sequenzspezifischen Rekombinasen wie zum Beispiel FLP durchgeführt wird.
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