DE69637156T2

DE69637156T2 - Dna-molekül, herstellung und verwendung in der gentherapie

Info

Publication number: DE69637156T2
Application number: DE69637156T
Authority: DE
Inventors: Beatrice Cameron; Joel Crouzet; Anne-Marie Darquet; Daniel Scherman; Pierre Wils
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1995-02-23
Filing date: 1996-02-21
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2016-02-22
Also published as: IL117214A0; KR19980702406A; NO973838L; AU4882296A; EP0815214A1; FI973467A0; HUP9801216A2; AU709111B2; NO973838D0; FR2731014A1; FI973467A; ATE366806T1; MX9706109A; HUP9801216A3; ZA961484B; DE69637156D1; EP0815214B1; FR2731014B1; CZ266897A3; WO1996026270A1

Description

Die Gentherapie besteht darin, einen Defekt oder eine Anomalie durch Einbringen einer genetischen Information in die betroffene Zelle oder das betroffene Organ zu korrigieren. Diese Information kann entweder in vitro in eine Zelle, die dem Organ entnommen wurde und dann wieder in den Organismus injiziert wird, oder in vivo direkt in das Zielgewebe eingebracht werden. Da es sich um ein Molekül mit hohem Molekulargewicht und mit negativer Ladung handelt, ist es für die DNA schwierig, die Phospholipidmembranen der Zellen spontan zu passieren. Deshalb werden verschiedene Vektoren verwendet, um den Gentransfer zu ermöglichen: einerseits die viralen Vektoren, andererseits die natürlichen oder synthetischen chemischen und/oder biochemischen Vektoren. Die viralen Vektoren (Retroviren, Adenoviren, adenoassoziierte Viren ...) sind, insbesondere für das Passieren der Membranen, sehr wirksam, bergen jedoch gewisse Risiken, wie Pathogenität, Rekombination, Replikation, Immunogenität .... Die chemischen und/oder biochemischen Vektoren ermöglichen es, diese Risiken zu vermeiden (siehe Behr, 1993, Cotten und Wagner, 1993, Reviews). Dies sind zum Beispiel Kationen (Calciumphosphat, DEAE-Dextran ...), die wirken, indem sie mit der DNA Niederschläge bilden, die von den Zellen „phagozytiert" werden können. Es kann sich auch um Liposomen handeln, in denen die DNA enthalten ist und die mit der Plasmamembran fusionieren. Die synthetischen Gentransfervektoren sind im Allgemeinen Lipide oder kationische Polymere, welche die DNA komplexieren und mit dieser ein Partikel bilden, das auf der Oberfläche positive Ladungen trägt. Diese Partikel sind in der Lage, mit den negativen Ladungen der Zellmembran in Wechselwirkung zu treten und diese dann zu durchdringen. Als Beispiele für solche Vektoren können Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS, Transfectam^TM) oder N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA, Lipofectin^TM) genannt werden. Es wurden auch chimäre Proteine entwickelt: sie aus einem polykationischen Abschnitt, der die DNA kondensiert, die an einen Ligan den gebunden ist, der an einen Membranrezeptor bindet und den Komplex durch Endozytose in die Zellen schleust. So ist es theoretisch möglich, auf ein Gewebe oder bestimmte Zellpopulationen „abzuzielen", um die in-vivo-Bioverfügbarkeit des transferierten Gens zu verbessern.
Jedoch setzt die Verwendung von chemischen und/oder biochemischen Vektoren oder von nackter DNA die Möglichkeit voraus, große Mengen DNA von pharmakologischer Reinheit herzustellen. In diesen Techniken der Gentherapie besteht nämlich das Medikament aus der DNA selbst und es ist wesentlich, in angemessenen Mengen DNAs herstellen zu können, die Eigenschaften aufweisen, die für einen therapeutischen Gebrauch beim Menschen geeignet sind.
Die derzeit in der Gentherapie verwendeten Plasmide tragen (i) einen Replikationsstartpunkt, (ii) ein Markergen, wie ein Resistenzgen gegen ein Antibiotikum (Kanamycin, Ampicillin ...), und (iii) ein oder mehrere Transgene mit Sequenzen, die für ihre Expression notwendig sind (Enhancer, Promotor(en), Polyadenylierungssequenzen ...). Diese Plasmide, die derzeit in der Gentherapie (auf der Ebene von klinischen Tests, wie der Behandlung von Melanomen, Nabel et al., 1992, oder auf Ebene von experimentellen Studien) eingesetzt werden, weisen jedoch gewisse Nachteile auf, die insbesondere mit ihrer Ausbreitung im Organismus verbunden sind. So kann aufgrund dieser Ausbreitung ein im Organismus vorliegendes kompetentes Bakterium mit einer geringen Häufigkeit dieses Plasmid aufnehmen. Dies ist umso wahrscheinlicher, als es sich um eine gentherapeutische in-vivo-Behandlung handelt, bei welcher die DNA im Organismus des Patienten verbreitet werden und mit Bakterien, die diesen Patienten infizieren, oder auch mit Bakterien der kommensalen Flora in Kontakt kommen kann. Ist das das Plasmid aufnehmende Bakterium ein Enterobakterium wie E. coli, so kann sich dieses Plasmid replizieren. Ein solches Ereignis führt dann zur Ausbreitung des therapeutischen Gens. Insofern, als die therapeutischen Gene, die bei Gentherapiebehandlungen verwendet werden, zum Beispiel für ein Lymphokin, einen Wachstumsfaktor, ein Antionkogen oder ein Protein, dessen Funktion beim Wirt fehlerhaft ist, kodieren können und es somit ermöglichen, einen genetischen Defekt zu beheben, könnte die Verbreitung bestimmter dieser Gene unvorhersehbare und besorgniserregende Wirkungen haben (zum Beispiel falls ein pathogenes Bakterium das Gen eines humanen Wachstumsfaktors erhalten würde). Darüber hinaus besitzen die Plasmide, die in der nicht-viralen Gentherapie verwendet werden, auch einen Resistenzmarker gegen ein Antibiotikum (Ampicillin, Kanamycin ...). Das Bakterium, das ein solches Plasmid erhält, hat somit einen unbestreitbaren Selektionsvorteil, da jede antibiotherapeutische Behandlung, die ein Antibiotikum aus der gleichen Familie als jenes verwendet, welches das Resistenzgen des Plasmids selektiert, zur Selektion des besagten Plasmids führen wird. Diesbezüglich gehört Ampicillin zur Familie der β-Lactame, welche die Familie der weltweit meistverwendeten Antibiotika ist. Es ist deshalb erforderlich zu versuchen, die Verbreitung der therapeutischen Gene und der Resistenzgene weitestgehend einzuschränken. Außerdem besteht die Gefahr, dass die von dem Plasmid getragenen Gene, die dem Vektorteil des Plasmids entsprechen (für die Replikation erforderliche Funktion(en), Resistenzgen) in den transfizierten Zellen ebenfalls exprimiert werden. Es gibt tatsächlich einen nicht auszuschließenden Transkriptionshintergrund, bedingt durch die Expressionssignale des Wirts auf das Plasmid. Diese Expression exogener Proteine kann aufgrund von deren potentieller Immunogenität und somit des Angriffs der transfizierten Zellen durch das Immunsystem in einigen Gentherapiebehandlungen durchaus schädlich sein.
Es ist deshalb besonders wichtig, über Medikamenten-DNA-Moleküle verfügen zu können, die eine für den therapeutischen Gebrauch geeignete genetische Reinheit aufweisen. Es ist außerdem besonders wichtig, über Verfahren zu verfügen, die es ermöglichen, diese DNA-Moleküle in Mengen herzustellen, die für einen pharmakologischen Gebrauch geeignet sind. Die vorliegende Erfindung bietet eine Lösung für diese Probleme.
Die vorliegende Erfindung beschreibt DNA-Moleküle, die in der Gentherapie verwendbar sind, mit einer erheblich verbesserten genetischen Reinheit und guten Eigenschaften hinsichtlich der Bioverfügbarkeit. Die Erfindung beschreibt außerdem ein besonders wirksames Verfahren zur Herstellung dieser Moleküle und zu deren Reinigung.
Die vorliegende Erfindung liegt insbesondere in der Entwicklung von in der Gentherapie verwendbaren DNA-Molekülen, die fast keinerlei nicht-therapeutische Region aufweisen. Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle, die aufgrund ihrer zirkulären Struktur, ihrer begrenzten Größe und ihrer supergeknäuelten Form auch als Minikreise bezeichnet werden, weisen zahlreiche Vorteile auf.
Sie ermöglichen zunächst die Beseitigung der mit der Verbreitung des Plasmids verbundenen Risiken, wie (1) der Replikation und Verbreitung, die zu einer unkontrollierten Überexpression des therapeutischen Gens führen können, (2) der Verbreitung und Expression von Resistenzgenen, (3) der Expression von potentiell immunogenen Genen und/oder Entzündungsgenen, die im nicht-therapeutischen Abschnitt des Plasmids vorliegen, usw. Die in den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen enthaltene genetische Information beschränkt sich im Wesentlichen auf das (die) therapeutischen Gen(e) und auf die Regulationssignale für dessen (deren) Expression (weder Replikationsstartpunkt, noch Antibiotikaresistenzgen, usw.). Die Wahrscheinlichkeit, dass diese Moleküle (und somit die genetische Information, die sie enthalten) an einen Mikroorganismus weiter gegeben und stabil erhalten werden ist, fast null.
Darüber hinaus haben die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle aufgrund ihrer begrenzten Größe potentiell eine bessere in-vivo-Bioverfügbarkeit. Insbesondere zeigen sie verbesserte Eigenschaften hinsichtlich der Zellpenetration und -verteilung. So ist es bekannt, dass der Gewebediffusionskoeffizient umgekehrt proportional zum Molekulargewicht ist (Jain, 1987). Ebenso haben auf zellulärer Ebene Moleküle mit hohem Molekulargewicht eine weniger gute Permeabilität durch die Plasmamembran. Zudem ist das hohe Molekulargewicht auch ein Nachteil für die Wanderung des Plasmids zum Zellkern, die für dessen Expression unerlässlich ist, da die Kernporen für die Diffusion zum Kern eine begrenzte Größe voraussetzen (Landford et al., 1986). Das Entfernen der nicht-therapeutischen Abschnitte des Plasmids (insbesondere Replikationsstartpunkt und Resistenzgen) gemäß der Erfindung ermöglicht es ebenfalls, die Größe der DNA-Moleküle zu reduzieren. Diese Reduzierung kann auf einen Faktor 2 geschätzt werden, indem zum Beispiel 3 kb für den Replikationsstartpunkt und den Resistenzmarker (Vek torteil) und 3 kb für das Transgen mit den für dessen Expression notwendigen Sequenzen berechnet werden. Diese Reduzierung (i) von Molekulargewicht und (ii) von negativer Ladung verleiht den Molekülen der Erfindung verbesserte Eigenschaften hinsichtlich Diffusion und Bioverfügbarkeit auf Gewebe-, Zell- und Kernebene.
Ein erster Gegenstand der Erfindung ist somit ein doppelsträngiges DNA-Molekül mit den folgenden Merkmalen:

– es liegt in zirkulärer und supergeknäuelter Form vor,
– es umfasst eine Expressionskassette, welche aus einem Gen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse unter der Kontrolle eines Transkriptionspromotors und eines Transkriptionsterminators, welche in Säugetierzellen aktiv sind, besteht,
– es weist keinen Replikationsstartpunkt auf,
– es weist kein Markergen auf und
– es umfasst eine Region, welche aus der ortsspezifischen Rekombination zwischen zwei Sequenzen resultiert, wobei die Region außerhalb der Expressionskassette gelegen ist.

Wie vorstehend angegeben, weisen die Moleküle der Erfindung im Wesentlichen keine nicht-therapeutischen Regionen und insbesondere keinen Replikationsstartpunkt und/oder kein Markergen auf.
Die vorliegende Erfindung ergibt sich auch aus der Entwicklung eines speziellen Verfahrens, spezieller Konstruktionen und spezieller Zellwirte, die für die Herstellung dieser therapeutischen DNA-Moleküle besonders wirksam sind. Insbesondere beruht das erfindungsgemäße Verfahren auf der Herstellung der vorstehend definierten therapeutischen DNA-Moleküle durch Exzision aus einem Plasmid oder einem Chromosom mittels ortsspezifischer Rekombination. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders vorteilhaft, da es keinen vorhergehenden Schritt der Plasmidreinigung erfordert, sehr spezifisch, besonders effizient ist, die hergestellten DNA-Mengen nicht verringert und direkt zu therapeutischen Molekülen von sehr hoher genetischer Reinheit und hoher Bioverfügbarkeit führt. Dieses Verfahren führt zur Bildung von zirkulären DNA-Molekülen (Minikreisen), die im Wesentlichen das interessierende Gen sowie die Regulationssequenzen enthalten, die dessen Expression in den Zellen, dem Gewebe, dem Organ oder dem Apparat oder sogar dem gesamten Organismus, in welchen bzw. welchem die Expression gewünscht wird, ermöglichen. Darüber hinaus können diese Moleküle dann durch klassische Techniken gereinigt werden.
Die ortsspezifische Rekombination kann mittels verschiedener Systeme, welche die ortsspezifische Rekombination zwischen Sequenzen bewirken, durchgeführt werden. Bevorzugter wird die ortsspezifische Rekombination im Verfahren der Erfindung mittels zweier spezifischer Sequenzen erhalten, die in der Lage sind, in Gegenwart eines speziellen Proteins, das allgemein Rekombinase genannt wird, zu rekombinieren. Aus diesem Grund umfassen die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle im Allgemeinen außerdem eine Sequenz, die aus dieser ortsspezifischen Rekombination hervorgeht. Die im Rahmen der Erfindung verwendeten, die Rekombination ermöglichenden Sequenzen umfassen im Allgemeinen 5 bis 100 Basenpaare und bevorzugter weniger als 50 Basenpaare.
Die ortsspezifische Rekombination kann in vivo (das heißt in der Wirtszelle) oder in vitro (das heißt an einer Plasmidpräparation) durchgeführt werden.
Diesbezüglich liefert die vorliegende Erfindung ebenfalls spezielle genetische Konstruktionen, die für die Herstellung der vorstehend definierten therapeutischen DNA-Moleküle geeignet sind. Diese erfindungsgemäßen genetischen Konstruktionen oder rekombinanten DNAs umfassen insbesondere das oder die Gene von Interesse, umrahmt von den beiden Sequenzen, welche die ortsspezifische Rekombination erlauben und in direkter Orientierung angeordnet sind. Die Anordnung in direkter Orientierung weist darauf hin, dass die beiden Sequenzen in der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA die gleiche 5'-3'-Polarität haben. Die erfindungsgemäßen genetischen Konstruktionen können doppelsträngige DNA-Fragmente (Kassetten) sein, die sich im Wesentlichen aus den vorstehend genannten Elementen zusammensetzen. Diese Kassetten sind für die Konstruktion von Zellwirten verwendbar, die diese Elemente in ihr Genom integriert enthalten (1). Die erfindungsgemäßen genetischen Konstruktionen können auch Plasmide sein, das heißt jedes lineare oder zirkuläre DNA-Molekül, welches in der Lage ist, sich in einer gegebenen Wirtszelle zu replizieren, und welches das oder die Gene von Interesse umrahmt von den beiden Sequenzen enthält, welche die ortsspezifische Rekombination erlauben und in direkter Orientierung angeordnet sind. Es kann sich genauer gesagt um einen Vektor (wie einen Klonierungs-und/oder Expressionsvektor), einen Phagen, einen Virus usw. handeln. Diese erfindungsgemäßen Plasmide können verwendet werden, um jeden beliebigen Zellwirt zu transformieren, der hinsichtlich der Herstellung der Minikreise mittels Replikation des Plasmids und anschließender Exzision des Minikreises kompetent ist (2).
In dieser Hinsicht liegt ein weiterer Gegenstand der Erfindung in einer rekombinanten DNA, umfassend einen nicht-therapeutischen Abschnitt und einen therapeutischen Abschnitt oder eine Expressionskassette, welche(r) aus einem Gen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse unter der Kontrolle eines Transkriptionspromotors und eines Transkriptionsterminators, welche in Säugetierzellen aktiv sind, besteht und von zwei Sequenzen eingerahmt ist, welche eine ortsspezifische Rekombination erlauben und in direkter Orientierung angeordnet sind, wobei die Rekombination durch Herausschneiden der nicht-therapeutischen Abschnitte erlaubt, das Molekül gemäß der Erfindung zu erzeugen.
Die rekombinante DNA gemäß der Erfindung ist bevorzugt ein Plasmid, welches wenigstens umfasst:

a) einen Replikationsstartpunkt und gegebenenfalls ein Markergen in dem nicht-therapeutischen Abschnitt,
b) zwei Sequenzen, welche eine ortsspezifische Rekombination erlauben und in direkter Orientierung angeordnet sind, und
c) angeordnet zwischen den Sequenzen b) eine Expressionskassette, welche aus einem Gen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse unter der Kontrolle eines Transkriptionspromotors und eines Transkriptionsterminators, welche in Säugetierzellen aktiv sind, besteht.

Das in den erfindungsgemäßen genetischen Konstruktionen vorliegende spezifische Rekombinationssystem kann unterschiedlicher Herkunft sein. Insbesondere können die verwendeten spezifischen Sequenzen und Rekombinasen verschiedenen Strukturklassen und insbesondere der Familie der Integrase des Bakteriophagen λ oder der Familie der Resolvase des Transposons Tn3 angehören.
Unter den Rekombinasen, die der Familie der Integrase des Bakteriophagen λ angehören, können insbesondere die Integrase des Phagen lambda (Landy et al., Science 197 (1977) 1147), P22 und Φ80 (Leong et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468), HP1 von Haemophilus influenzae (Hauser et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 6859), die Integrase Cre des Phagen P1, die Integrase des Plasmids pSAM2 ( EP 350 341 ) oder auch die FLP-Rekombinase des Plasmids 2μ genannt werden. Werden die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle durch Rekombination mittels eines ortsspezifischen Systems der Familie der Integrase des Bakteriophagen lambda hergestellt, so umfassen die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle im Allgemeinen außerdem eine Sequenz, die aus der Rekombination zwischen zwei Anheftungssequenzen att des entsprechenden Bakteriophagen oder Plasmids hervorgeht.
Unter den Rekombinasen, die der Familie des Transposons Tn3 angehören, können insbesondere die Resolvase des Transposons Tn3 oder der Transposons Tn21 und Tn522 (Stark et al., 1992), die Invertase Gin des Bakteriophagen Mu oder auch die Resolvase von Plasmiden, wie die des Fragments par von RP4 (Abert et al., Mol. Microbiol. 12 (1994) 131), genannt werden. Werden die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle durch Rekombination mittels eines ortsspezifischen Systems der Familie des Transposons Tn3 hergestellt, so umfassen die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle im Allgemeinen außerdem eine Sequenz, die aus der Rekombination zwischen zwei Erkennungssequenzen der Resolvase des betreffenden Transposons hervorgeht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind in den genetischen Konstruktionen der vorliegenden Erfindung die Sequenzen, welche die ortsspezifische Rekombination erlauben, von einem Bakteriophagen abgeleitet. Bevorzugter handelt es sich um die Anheftungssequenzen (attP- und attB-Sequenzen) eines Bakteriophagen oder um abgeleitete Sequenzen. Diese Sequenzen sind in der Lage, in Gegenwart einer als Integrase bezeichneten Rekombinase spezifisch miteinander zu rekombinieren. Der Begriff „abgeleitete Sequenz" umfasst die Sequenzen, welche durch Modifikation(en) der Anheftungssequenzen der Bakteriophagen erhalten werden und die Fähigkeit bewahren, in Gegenwart der geeigneten Rekombinase spezifisch zu rekombinieren. So kann es sich um verkürzte oder, im Gegenteil, durch Anfügen weiterer Sequenzen (Restriktionsschnittstellen usw.) verlängerte Fragmente dieser Sequenzen handeln. Es kann sich auch um Varianten handeln, die durch Mutation(en), insbesondere Punktmutation(en) erhalten wurden. Als attP- und attB-Sequenzen eines Bakteriophagen oder eines Plasmids werden erfindungsgemäß die Sequenzen des spezifischen Rekombinationssystems des Bakteriophagen oder Plasmids bezeichnet, das heißt, die in dem Phagen oder Plasmid vorhandene attP-Sequenz und die entsprechende chromosomale attB-Sequenz.
Als bevorzugte Beispiele können insbesondere die Anheftungssequenzen der Phagen lamda, P22, Φ80, P1, HP1 von Haemophilus influenzae oder auch des Plasmids pSAM2 oder 2μ genannt werden. Diese Sequenzen sind vorteilhafterweise ausgewählt aus der Gesamtheit oder einem Teil der Sequenzen SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 11, SEQ ID Nr. 12, SEQ ID Nr. 13 und SEQ ID Nr. 14. Diese Sequenzen umfassen insbesondere die homologe Zentralregion der Anheftungssequenzen dieser Phagen.
Diesbezüglich umfasst ein Plasmid gemäß der Erfindung:

(a) einen bakteriellen Replikationsstartpunkt und gegebenenfalls ein Markergen in dem nicht-therapeutischen Abschnitt;
(b) die Sequenzen attP und attB eines unter den Phagen lambda, P22, Φ80, HP1, P1 ausgewählten Bakteriophagen oder des Plasmids pSAM2 oder 2μ, welche in direkter Orientierung angeordnet sind; und
c) angeordnet zwischen den Sequenzen b) einen therapeutischen Abschnitt oder eine Expressionskassette, welche(r) aus einem Gen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse unter der Kontrolle eines Transkriptionspromotors und eines Transkriptionsterminators, welche in Säugetierzellen aktiv sind, besteht.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um die Anheftungssequenzen (attP und attB) des Phagen lamda. Plasmide, die diese Sequenzen tragen, sind insbesondere die Plasmide pXL2648, pXL2649 oder pXL2650. Werden diese Plasmide in vivo oder in vitro mit der Integrase des Phagen lamda in Kontakt gebracht, so rekombinieren die Sequenzen miteinander, um in vivo oder in vitro durch Exzision einen Minikreis gemäß der Erfindung zu bilden, der im Wesentlichen die Elemente (c), das heißt den therapeutischen Abschnitt, umfasst (2).
Weiter sind gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Sequenzen, welche die ortsspezifische Rekombination erlauben, von der Region loxP des Phagen P1 abgeleitet. Diese Region setzt sich im Wesentlichen aus zwei invertierten Sequenzwiederholungen zusammen, die in der Lage sind, in Gegenwart eines Cre genannten Proteins spezifisch miteinander zu rekombinieren (Sternberg et al., J. Mol. Biol. 150 (1971) 467). Die Erfindung betrifft somit ein Plasmid umfassend:

a) einen bakteriellen Replikationsstartpunkt und gegebenenfalls ein Markergen in dem nicht-therapeutischen Abschnitt,
b) die invertierten Sequenzenwiederholungen des Bakteriophagen P1 (Region loxP), welche in direkter Orientierung angeordnet sind; und
c) angeordnet zwischen den Sequenzen (b) einen therapeutischen Abschnitt oder eine Expressionskassette, welche(r) aus einem Gen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse unter der Kontrolle eines Transkriptionspromotors und eines Transkriptionsterminators, welche in Säugetierzellen aktiv sind, besteht.

Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform sind in den genetischen Konstruktionen der vorliegenden Erfindung die Sequenzen, welche die ortsspezifische Rekombination ermöglichen, von einem Transposon abgeleitet. Bevorzugter handelt es sich um die Erkennungssequenzen der Resolvase eines Transposons oder um abgeleitete Sequenzen. Als bevorzugte Beispiele können insbesondere die Erkennungssequenzen der Transposons Tn3, Tn21 und Tn522 genannt werden. Als bevorzugtes Beispiel kann die Sequenz SEQ ID Nr. 15 oder ein Derivat von dieser genannt werden (siehe auch Sherrat, S. 163-184, Mobile DNA, Verl. D. Berg und M. Howe, American Society for Microbiology, Washington D. C. 1989).
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen die Plasmide:

a) einen Replikationsstartpunkt und gegebenenfalls ein Markergen in dem nicht-therapeutischen Abschnitt,
b) zwei Sequenzen, welche eine ortsspezifische Rekombination erlauben und in direkter Orientierung angeordnet sind, und
c) angeordnet zwischen den Sequenzen b) einen therapeutischen Abschnitt oder eine Expressionskassette, welche(r) aus einem oder mehreren Genen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse und einer Sequenz, welche in der Lage ist, durch Hybridisierung mit einem spezifischen Oligonukleotid eine Dreifachhelix zu bilden, besteht.

Gemäß einer weiteren besonders vorteilhaften Ausführungsform umfassen die Plasmide der Erfindung außerdem eine Multimer-Resolutionssequenz. Es handelt sich bevorzugt um die Sequenz mrs (Multimer-Resolution-System) des Plasmids RK2.
Bevorzugter betrifft die Erfindung ein Plasmid umfassend:

a) einen Replikationsstartpunkt und gegebenenfalls ein Markergen in dem nicht-therapeutischen Abschnitt,
b) zwei Sequenzen, welche eine ortsspezifische Rekombination erlauben und in direkter Orientierung angeordnet sind, und
c) platziert zwischen den Sequenzen b) einen therapeutischen Abschnitt oder eine Expressionskassette, welche(r) aus einem oder mehreren Genen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse und einer aus dem Genort par von RK2 stammenden Sequenz mrs, welche erlaubt, Muitimere aufzulösen, besteht.

Diese Ausführungsform ist besonders vorteilhaft. Werden die Plasmide pXL2649 oder pXL2650 in vivo mit der Integrase des Bakteriophagen in Kontakt gebracht, so rekombinieren die Sequenzen, um den Minikreis und das Miniplasmid, aber auch multimere oder topologische Minikreis- oder Miniplasmidformen zu bilden. Es ist besonders vorteilhaft, die Konzentration dieser Formen reduzieren zu können, um die Minikreis-Produktion zu erhöhen und dessen Reinigung zu erleichtern.
Multimere Plasmidformen sind dem Fachmann bekannt. Zum Beispiel ermöglichen das Fragment cer von ColE1 (Summers u. a. 1984 Cell 36 S. 1097) oder die mrs-Lokalisation des Genortes par von RK2 (L. Ebert 1994 Mol. Microbiol. 2, S. 131) die Auflösung von Plasmidmultimeren und tragen zu einer erhöhten Stabilität des Plasmids bei. Während die Auflösung an der cer-Lokalisation vier von dem E. coli-Genom kodierte Proteine erfordert (Colloms u. a. 1990 J. Bacteriol. 172, S. 6973), erfordert die Auflösung an der mrs-Lokalisation nur das Protein ParA, dessen Gen parA auf dem Genort par von RK2 kartographiert ist. Deshalb scheint es vorteilhaft, die Gesamtheit oder einen Teil des Genortes par, der parA und die Sequenz mrs enthält, zu verwenden. Zum Beispiel kann die Sequenz mrs zwischen die attB- und attP-Sequenzen des Phagen lamda angeordnet und das Gen parA in trans oder in cis von seinem eigenen Promotor oder einem induzierbaren Promotor exprimiert werden. Diesbezüglich umfasst ein spezielles Plasmid der Erfindung:

a) einen Replikationsstartpunkt und gegebenenfalls ein Markergen in dem nicht-therapeutischen Abschnitt,
b) zwei Sequenzen, welche eine ortsspezifische Rekombination erlauben und in direkter Orientierung angeordnet sind, und
c) platziert zwischen den Sequenzen b) einen therapeutischen Abschnitt oder eine Expressionskassette, welche(r) aus einem oder mehreren Genen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse, einer aus dem Genort par von RK2 stammenden Sequenz mrs, welche erlaubt, Multimere aufzulösen, und einer Sequenz, welche in der Lage ist, durch Hybridisierung mit einem spezifischen Oligonukleotid eine Dreifachhelix zu bilden, besteht.

Ein derartiges Plasmid ist unter anderem das Plasmid pXL2960, das in den Beispielen beschrieben wird. Es kann nur in monomerer Form angewandt werden und die Herstellung von Minikreisen ermöglichen.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Variante umfassen die erfindungsgemäßen Plasmide:

a) einen Replikationsstartpunkt und gegebenenfalls ein Markergen in dem nicht-therapeutischen Abschnitt,
b) zwei Sequenzen, welche eine ortsspezifische, Integrase-abhängige Rekombination erlauben und in direkter Orientierung angeordnet sind, und zwei Sequenzen, welche eine ortsspezifische, Resolvase-abhängige Rekombination erlauben und angrenzend an die beiden ersten und gleichfalls in direkter Orientierung angeordnet sind, und
c) angeordnet zwischen den Sequenzen b) einen therapeutischen Abschnitt oder eine Expressionskassette, welche(r) aus einem oder mehreren Genen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse und gegebenenfalls einer Sequenz, welche in der Lage ist, durch Hybridisierung mit einem spezifischen Oligonukleotid eine Dreifachhelix zu bilden, besteht.

Die beiden Sequenzsätze der ortsspezifischen Rekombination stammen aus unterschiedlichen Familien. Es handelt sich vorteilhafterweise um einen ersten Satz Integrase-abhängiger Sequenzen und um einen zweiten Satz parA-abhängiger Sequenzen. Die Verwendung von zwei Sequenzsätzen ermöglicht, die Ausbeuten der Produktion von Minikreisen zu erhöhen, wenn die erste ortsspezifische Rekombination unvollständig ist. Werden die Plasmide pXL2650 oder pXL2960 in vivo mit der Integrase des Bakteriophagen in Kontakt gebracht, so rekombinieren die Sequenzen, um das Miniplasmid und den Minikreis zu bilden, aber diese Reaktion ist nicht vollständig (es können 5 bis 10% des Ausgangsplasmids verbleiben). Das Einbringen einer mrs-Sequenz von RK2 in der Nähe von jeder der att-Sequenzen des Phagen lamda ermöglicht es, die Produktion von Minikreisen zu erhöhen. So können nach Induktion der Integrase des Phagen lamda und Int-abhängiger Rekombination die nicht rekombinierten Moleküle vom Protein ParA von RK2 übernommen werden und an den mrs-Lokalisationen rekombinieren. Umgekehrt können nach Induktion des Proteins ParA und ParA-abhängiger Rekombination die nicht rekombinierten Moleküle von der Integrase des Phagen lamda übernommen werden und an den att-Lokalisationen rekombinieren. Derartige Konstruktionen erlauben somit, Minikreise und vernachlässigbare Mengen nicht rekombinierter Moleküle zu produzieren. Die att-Sequenzen sowie die mrs-Sequenzen sind in direkter Orientierung angeordnet und die Gene int und parA können gleichzeitig oder nacheinander vom gleichen induzierbaren Promotor oder von zwei induzierbaren Promotoren induziert werden. Bevorzugt handelt es sich um die Anheftungssequenzen attB und attP des Phagen lamda in direkter Orientierung und um zwei mrs-Sequenzen von RK2 in direkter Orientierung.
Wie vorstehend erwähnt, beruht ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung auf einem Verfahren zur Herstellung der vorstehend definierten therapeutischen DNA-Moleküle durch Exzision aus einem Plasmid oder einem Chromosom mittels ortsspezifischer Rekombination.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung besteht somit aus einem Verfahren zur Herstellung eines DNA-Moleküls (Minikreises) wie vorstehend definiert, gemäß dem eine Kultur von Wirtszellen, welche eine rekombinante DNA, wie vorstehend definiert, enthalten, mit der Rekombinase, welche erlaubt, die ortsspezifische Rekombination zu induzieren, in Kontakt gebracht wird. Bevorzugter erfolgt das Inkontaktbringen entweder durch Transfektion oder Infektion mit einem Plasmid oder einem Phagen, welches bzw. welcher das Gen der Rekombinase enthält, oder durch Induktion der Expression eines für die Rekombinase kodierenden Gens, das in der Wirtszelle vorhanden ist. Wie nachstehend erwähnt, kann dieses Gen in der Wirtszelle in einer in das Genom integrierten Form, auf einem replikativen Plasmid oder auf dem erfindungsgemäßen Plasmid im nicht-therapeutischen Abschnitt vorhanden sein.
Um die Produktion der erfindungsgemäßen Minikreise durch ortsspezifische Rekombination in vivo zu ermöglichen, muss die verwendete Rekombinase zum gegebenen Zeitpunkt in die Zellen oder das Kulturmedium gebracht oder in diesen induziert werden. Hierfür können verschiedene Verfahren verwendet werden. Gemäß einem ersten Verfahren wird eine Wirtszelle verwendet, welche das Gen der Rekombinase in einer Form enthält, die seine regulierte Expression ermöglicht. Es kann insbesondere unter Kontrolle eines Promotors oder eines Systems induzierbarer Promotoren oder auch in einem wärmeempfindlichen System eingebracht werden. Das Gen kann insbesondere in einem wärmeempfindlichen Phagen vorliegen, der während der Wachstumsphase latent ist und bei einer geeigneten Temperatur induziert wird (Beispiel lysogener Phage lamda Xis cl857). Die Expressionskassette des Gens der Rekombinase kann von einem Plasmid, einem Phagen oder sogar von dem erfindungsgemäßen Plasmid im nicht-therapeutischen Bereich getragen werden. Sie kann in das Genom der Wirtszelle integriert oder in replikativer Form beibehalten werden. Gemäß einem weiteren Verfahren wird die Expressionskassette des Gens von einem Plasmid oder einem Phagen getragen, welches bzw. welcher verwendet wird, um die Zellkultur nach der Wachstumsphase zu transfizieren oder zu infizieren. In diesem Fall ist es nicht notwendig, dass das Gen in einer Form vorliegt, die seine regulierte Expression ermöglicht. Insbesondere kann jeder beliebige konstitutive Promotor verwendet werden. Das Inkontaktbringen mit der Rekombinase kann auch in vitro bei einem Plasmidpräparat durch direkte Inkubation mit dem Protein durchgeführt werden.
Bevorzugt wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Wirtszelle verwendet, die in der Lage ist, das Rekombinase-Gen reguliert zu exprimieren. Diese Ausführungsform, in der die Rekombinase nach Induktion direkt von der Wirtszelle bereitgestellt wird, ist besonders vorteilhaft. Es genügt einfach, zum gewünschten Zeitpunkt die Zellen in Kultur unter die Bedingungen der Expression des Rekombinase-Gens (permissive Temperatur für ein wärmeempfindliches Gen, Zugabe eines Induktors für einen regulierbaren Promotor, usw.) zu bringen, um die ortsspezifische Rekombination in vivo und somit die Exzision des erfindungsgemäßen Minikreises zu induzieren. Darüber hinaus erfolgt diese Exzision mit besonders hohen Ausbeuten, da alle Zellen in Kultur die Rekombinase exprimieren, was nicht unbedingt der Fall ist, wenn eine Transfektion oder eine Infektion durchgeführt werden muss, um das Rekombinase-Gen zu transferieren.
Gemäß einer ersten Ausführungsform umfasst das Verfahren der Erfindung die Exzision der therapeutischen DNA-Moleküle aus einem Plasmid mittels ortsspezifischer Rekombination. Diese Ausführungsform setzt die vorstehend beschriebenen Plasmide ein, die zunächst die Replikation in einem gewählten Wirt und dann die Exzision der nicht-therapeutischen Abschnitte des Plasmids (insbesondere des Replikationsstartpunktes und des Resistenzgens) durch ortsspezifische Rekombination unter Bildung der erfindungsgemäßen zirkulären DNA-Moleküle erlauben. Zur Durchführung des Verfahrens können verschiedene Plasmidtypen und insbesondere ein Vektor, ein Phage oder ein Virus verwendet werden. Es handelt sich bevorzugt um einen replikativen Vektor.
Vorteilhafterweise umfasst das erfindungsgemäße Verfahren einen vorangehenden Schritt der Transformation von Wirtszellen mit einem Plasmid, wie vorstehend definiert, und der anschließenden Kultur der transformierten Zellen, was den Erhalt von geeigneten Plasmidmengen erlaubt. Die Exzision durch ortsspezifische Rekombinationen wird dann durch Inkontaktbringen mit der Rekombinase unter den vorstehend definierten Bedingungen durchgeführt (2). Wie vorstehend erwähnt kann die ortsspezifische Rekombination in dieser Ausführungsform in vivo (das heißt in der Wirtszelle) oder in vitro (das heißt an einem Plasmidpräparat) durchgeführt werden.
Gemäß einer bevorzugten Form werden somit die DNA-Moleküle der Erfindung aus einem replikativen Vektor durch Exzision des nicht-therapeutischen Abschnittes, der insbesondere den Replikationsstartpunkt und das Markergen trägt, mittels ortsspezifischer Rekombination erhalten.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren der Erfindung die Exzision der DNA-Moleküle aus dem Genom des Zellwirtes mittels ortsspezifischer Rekombination. Diese Ausführungsform beruht insbesondere auf der Konstruktion von Zellwirten, die in ihr Genom integriert eine oder mehrere Kopien einer Kassette enthalten, welche das interessierende Gen umrahmt von den Sequenzen, die die Rekombination erlauben, enthält (1). Verschiedene Techniken können zur Insertion der Kassette der Erfindung in das Genom der Wirtszelle verwendet werden. Insbesondere kann die Insertion an mehreren verschiedenen Orten des Genoms durch Verwendung von integrativen Vektoren erhalten werden. In dieser Hinsicht können verschiedene Transpositionssysteme, wie insbesondere das System miniMu, oder defektive Transposons, wie zum Beispiel Derivate von Tn10, verwendet werden (Kleckner et al., Methods Enzymol. 204 (1991) 139; Groisman E., Methods Enzymol. 204 (1991) 180). Die Insertion kann auch mittels homologer Rekombination erfolgen, die es ermöglicht, in das Genom des Bakteriums eine Kassette zu integrieren, die zwei Rekombinationssequenzen in direkter Orientierung enthält, welche ein oder mehrere interessierende Gene umrahmen. Dieser Vorgang kann zudem so oft wie gewünscht reproduziert werden, so dass so viele Kopien wie möglich pro Zelle erhalten werden. Eine andere Technik besteht darin, ein in-vivo-Amplifikationssystem zu verwenden, das die Rekombination wie in Labarre et al. (Labarre J., O. Reges, Guyonvarch und G. Leblon. 1993. Gene replacement, integration, and amplification at the gdhA locus of Corynebacterium glutamicum. J. Bacteriol. 175:1001-1007) beschrieben einsetzt, so dass man von einer Kopie der Kassette auf eine sehr viel größere Anzahl kommt.
Eine bevorzugte Technik besteht in der Verwendung von miniMu. Hierfür werden miniMu-Derivate konstruiert, umfassend einen Resistenzmarker, die für ihre Transposition nötigen Funktionen in cis und eine Kassette, die zwei Rekombinationssequenzen in direkter Orientierung enthält, welche das oder die interessierenden Gene umrahmen. Diese miniMu werden vorteilhafterweise an mehreren Orten des Genoms angeordnet, indem ein Resistenzmarker (zum Beispiel Kanamycin) verwendet wird, der es erlaubt, mehrere Kopien pro Genom zu selektionieren (Groisman E., oben). Wie vorstehend beschrieben, kann die besagte Wirtszelle auch induzierbar eine ortsspezifische Rekombinase exprimieren, die zur Exzisi an des von den Rekombinationssequenzen in direkter Orientierung umrahmten Fragments führt. Nach der Exzision können die Minikreise durch herkömmliche Techniken gereinigt werden.
Diese Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist besonders interessant, da sie zur Bildung eines einzigen Plasmidmolekültyps führt: dem Minikreis der Erfindung. Die Zellen enthalten kein weiteres episomales Plasmid, wie dies bei der Produktion ausgehend von einem Plasmid der Fall ist (1 und 2).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht außerdem aus einer modifizierten Wirtszelle, welche in ihr Genom inseriert eine oder mehrere Kopien einer rekombinanten DNA, wie vorstehend definiert, umfasst.
Die Erfindung betrifft außerdem jedwede rekombinante Zelle, die ein Plasmid, wie vorstehend definiert, enthält. Diese Zellen werden mittels jedweder dem Fachmann bekannten Technik erhalten, die das Einbringen einer DNA in eine gegebene Zelle erlaubt. Es kann sich insbesondere um eine Transformation, eine Elektroporation, eine Konjugation, eine Protoplastenfusion oder jedwede andere dem Fachmann bekannte Technik handeln. Was die Transformation betrifft, wurden im Stand der Technik verschiedene Protokolle beschrieben. Insbesondere kann die Zelltransformation durchgeführt werden, indem die ganzen Zellen in Gegenwart von Lithiumacetat und Polyethylenglykol gemäß der von Ito et al. (J. Bacteriol. 153 (1983) 163-168) beschriebenen Technik oder in Gegenwart von Ethylenglykol und Dimethylsulfoxid gemäß der Technik von Durrens et al. (Curr. Genet. 18 (1990) 7) behandelt werden. Ein alternatives Protokoll wurde auch in der Patentanmeldung EP 361 991 beschrieben. Was die Elektroporation betrifft, kann diese nach Becker und Guarentte (in: Methods in Enzymology Bd. 194 (1991) 182) durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in jedem Typ von Zellwirt durchgeführt werden. Insbesondere kann es sich um Bakterien oder eukaryotische Zellen (Hefen, tierische Zellen, pflanzliche Zellen) usw. handeln. Unter den Bakterien können bevorzugter E. coli, B. subtilis, Streptomyces, Pseudomonas (P. putida, P. aeruginosa), Rhizobium meliloti, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, Streptomyces pristinaespiralis, Enterococcus faecium oder Clostridium usw. genannt werden. Unter den Bakterien wird bevorzugt E. coli verwendet. Unter den Hefen können Kluyveromyces, Saccharomyces, Pichia, Hansenula usw. genannt werden. Unter den tierischen Zellen von Säugetieren können die CHO-, COS-, NIH3T3-Zellen usw. genannt werden.
Je nach dem verwendeten Wirt, wird das erfindungsgemäße Plasmid vom Fachmann angepasst, um seine Replikation zu erlauben. Insbesondere der Replikationsstartpunkt und das Markergen werden in Abhängigkeit von der selektionierten Wirtszelle gewählt.
Das Markergen kann ein Resistenzgen, insbesondere gegen ein Antibiotikum (Ampicillin, Kanamycin, Geneticin, Hygromycin, usw.), oder jedes Gen sein, das der Zelle eine Funktion verleiht, die diese nicht mehr besitzt (zum Beispiel ein Gen, das auf dem Chromosom deletiert oder inaktiviert wurde), wobei das Gen auf dem Plasmid diese Funktion wiederherstellt.
In einer besonderen Ausführungsform umfasst das Verfahren der Erfindung einen zusätzlichen Schritt der Reinigung des Minikreises.
Diesbezüglich kann der Minikreis mittels der herkömmlichen Techniken der Reinigung von Plasmid-DNA gereinigt werden, da er wie Plasmid-DNA supergeknäuelt vorliegt. Diese Techniken umfassen unter anderem die Reinigung im Cäsiumchlorid-Dichtegradienten in Gegenwart von Ethidiumbromid oder die Verwendung von Anionenaustauschersäulen (Maniatis et al., 1989). Darüber hinaus ist es, wenn man der Ansicht ist, dass die Plasmid-DNA, die den nicht-therapeutischen Abschnitten (insbesondere Replikationsstartpunkt und Selekionsmarker) entspricht, in zu großer Menge vorliegt, auch möglich, nach oder vor der Reinigung ein oder mehrere Restriktionsenzyme zu verwenden, die das Plasmid und nicht den Minikreis verdauen, was es ermöglicht, sie mittels Techniken, welche supergeknäuelte DNA von linearer DNA trennen, wie einem Cäsiumchlo rid-Dichtegradienten in Gegenwart von Ethidiumbromid (Maniatis et al., 1989), zu trennen.
Darüber hinaus beschreibt die vorliegende Erfindung auch ein verbessertes Verfahren zur Reinigung der Minikreise. Dieses Verfahren ermöglicht es, in einem einzigen Schritt Minikreise von sehr hoher Reinheit mit hohen Ausbeuten zu erhalten. Dieses verbesserte Verfahren beruht auf der Wechselwirkung zwischen einer doppelsträngigen Sequenz, die auf dem Minikreis vorhanden ist, und einem spezifischen Liganden. Der Ligand kann unterschiedlicher Natur und insbesondere proteinischer, chemischer oder nukleischer Natur sein. Es handelt sich bevorzugt um einen Liganden vom Typ Nukleinsäure und insbesondere um ein gegebenenfalls chemisch modifiziertes Oligonukleotid, das fähig ist, durch Hybridisierung mit der auf dem DNA-Molekül der Erfindung vorhandenen spezifischen Sequenz eine Dreifachhelix zu bilden. Es wurde in der Tat gezeigt, dass bestimmte Oligonukleotide fähig sind, spezifisch mit doppelsträngigen DNA-Sequenzen Dreifachhelices zu bilden (Helene et al., Biochem. Biophys. Acta 1049 (1990) 99; siehe auch FR 94 15162 , in die Beschreibung durch Bezugnahme aufgenommen).
In einer besonders vorteilhaften Variante enthalten somit die DNA-Moleküle der Erfindung außerdem eine Sequenz, die fähig ist, spezifisch mit einem Liganden in Wechselwirkung zu treten (3). Bevorzugt handelt es sich um eine Sequenz, die fähig ist, durch Hybridisierung mit einem spezifischen Oligonukleotid eine Dreifachhelix zu bilden. Diese Sequenz kann an jeder Stelle des DNA-Moleküls der Erfindung positioniert sein, solange sie die Funktionalität des interessierenden Gens nicht beeinträchtigt. Diese Sequenz ist ebenfalls in den genetischen Konstruktionen der Erfindung (Plasmiden, Kassetten) in dem Abschnitt vorhanden, der das interessierende Gen umfasst (siehe insbesondere das Plasmid pXL2650). Die auf dem DNA-Molekül der Erfindung vorhandene spezifische Sequenz umfasst bevorzugt zwischen 5 und 30 Basenpaaren.
Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Oligonukleotide können die folgenden Basen enthalten:

– Thymidin (T), das in der Lage ist, mit den AT-Basenpaaren der doppelsträngigen DNA Triplets zu bilden (Rajagopal et al., Biochem. 28 (1989) 7859);
– Adenin (A), das in der Lage ist, mit den AT-Basenpaaren der doppelsträngigen DNA Triplets zu bilden;
– Guanin (G), das in der Lage ist, mit den GC-Basenpaaren der doppelsträngigen DNA Triplets zu bilden;
– Protoniertes Cytosin (C+), das in der Lage ist, mit den GC-Basenpaaren der doppelsträngigen DNA Triplets zu bilden (Rajagopal et al., oben).

Das verwendete Oligonukleotid umfasst bevorzugt eine Homopyrimidin-Sequenz, die Cytosine enthält, und die auf dem DNA-Molekül vorliegende spezifische Sequenz ist eine Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz. Das Vorliegen von Cytosinen ermöglicht, dass bei saurem pH eine stabile Dreifachhelix, in der die Cytosine protoniert sind, und bei alkalischem pH eine destabilisierte Dreifachhelix vorliegt, in der die Cytosine neutralisiert sind.
Um die Bildung einer Dreifachhelix durch Hybridisierung zu ermöglichen, ist es wichtig, dass das Oligonukleotid und die auf dem DNA-Molekül der Erfindung vorhandene spezifische Sequenz komplementär sind. In dieser Hinsicht werden, um die besten Ausbeuten und die beste Selektivität zu erhalten, in dem Verfahren der Erfindung ein Oligonukleotid und eine spezifische Sequenz verwendet, die völlig komplementär sind. Es kann sich insbesondere um ein Oligonukleotid poly-CTT und eine spezifische Sequenz poly-GAA handeln. Zum Beispiel kann das Oligonukleotid mit der Sequenz GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT (SEQ ID Nr. 5) genannt werden, in dem die Basen GAGG keine Dreifachhelix bilden, aber es ermöglichen, das Oligonukleotid vom Kopplungsarm räumlich zu trennen.
Es versteht sich allerdings von selbst, dass bestimmte Fehlpaarungen toleriert werden können, solange sie nicht zu einem zu großen Affinitätsverlust führen. Das verwendete Oligonukleotid kann natürlich sein (aus natürlichen, nicht modifizierten Basen bestehen) oder chemisch modifiziert sein. Insbesondere kann das Oligonukleotid vorteilhafterweise bestimmte chemische Modifikationen aufweisen, die es ermöglichen, seine Resistenz oder seinen Schutz gegenüber den Nukleasen oder seine Affinität zu der spezifischen Sequenz zu erhöhen.
So kann das Oligonukleotid durch Modifikation des Rückgrats (z.B. Methylphosphonate, Thiophosphate, Phosphotriester, Phosphoramidate usw.) gegenüber Nukleasen resistenter gemacht werden. Ein anderer Typ der Modifikation hat insbesondere zum Ziel, die Wechselwirkung und/oder Affinität zwischen dem Oligonukleotid und der spezifischen Sequenz zu verbessern. Insbesondere besteht eine überaus vorteilhafte Modifikation gemäß der Erfindung darin, die Cytosine des Oligonukleotids zu methylieren. Das auf diese Weise methylierte Oligonukleotid weist die bemerkenswerte Eigenschaft auf, bei neutralem pH mit der spezifischen Sequenz eine stabile Dreifachhelix zu bilden. Es ermöglicht es somit, bei höheren pH-Werten zu arbeiten als bei den Oligonukleotiden des Stands der Technik, das heißt bei pH-Werten, bei denen die Risiken der Degradation der Plasmid-DNA geringer sind.
Die Länge des im Verfahren der Erfindung verwendeten Oligonukleotids beträgt mindestens 3 und bevorzugt zwischen 5 und 30 Basen. Vorteilhafterweise wird ein Oligonukleotid mit einer Länge von über 10 Basen verwendet. Die Länge kann von Fall zu Fall vom Fachmann in Abhängigkeit von der gewünschten Selektivität und Stabilität der Wechselwirkung angepasst werden.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können mittels jeder bekannten Technik synthetisiert werden. Insbesondere können sie mit Hilfe von Nukleinsäure-Synthesegeräten hergestellt werden. Natürlich kann jedes andere dem Fachmann bekannte Verfahren verwendet werden.
Für die Ausführung des Verfahrens der Erfindung kann der spezifische Ligand (Protein, Nukleinsäure usw.) auf einem Träger aufgepfropft sein oder nicht. Verschiedene Trägertypen können hierfür verwendet werden, wie unter anderem nicht konditionierte oder in Säulen vorkonditionierte funktionalisierte Chromatographieträger, funktionalisierte Kunststoffoberflächen oder magnetische oder nicht magnetische funktionalisierte Latexkugeln. Es handelt sich bevorzugt um Chromatographieträger. Chromatographieträger, die verwendet werden können, sind beispielsweise Agarose, Acrylamid oder Dextran sowie deren Derivate (wie Sephadex, Sepharose, Superose, ...), Polymere wie Polystyroldivinylbenzol oder gepfropfte oder nicht gepfropfte Kieselsäure. Die Chromatographiesäulen können im Diffusionsmodus oder im Perfusionsmodus arbeiten.
Um dessen kovalente Bindung an den Träger zu erlauben, wird der Ligand im Allgemeinen funktionalisiert. Handelt es sich um ein Oligonukleotid, so kann dieses zum Beispiel durch eine Thiol-, Amin- oder Carboxylendgruppe in 5'- oder 3'-Stellung modifiziert werden. Insbesondere erlaubt das Hinzufügen einer Thiol-, Amin- oder Carboxylgruppe zum Beispiel, das Oligonukleotid an einen Träger zu binden, welcher Disulfid-, Maleimid-, Amin-, Carboxyl-, Ester-, Epoxid-, Bromcyan- oder Aldehydfunktionen trägt. Diese Bindungen bilden sich durch die Ausbildung von Disulfid-, Thioether-, Ester-, Amid- oder Aminbindungen zwischen dem Oligonukleotid und dem Träger. Jedes andere dem Fachmann bekannte Verfahren kann verwendet werden, wie zum Beispiel bifunktionelle Verknüpfungsreagenzien.
Darüber hinaus kann es zur Verbesserung der Aktivität des gebundenen Oligonukleotids vorteilhaft sein, die Bindung mittels eines Arms" vorzunehmen. Die Verwendung eines Arms ermöglicht es, das Oligonukleotid in einem gewählten Abstand vom Träger zu fixieren, was es ermöglicht, die Bedingungen von dessen Wechselwirkung mit dem DNA-Molekül der Erfindung zu verbessern. Der Arm besteht vorteilhafterweise aus Nukleotidbasen, welche die Hybridisierung nicht beeinträchtigen. So kann der Arm Purinbasen umfassen. Beispielsweise kann der Arm die Sequenz GAGG umfassen.
Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle können innerhalb jeder Impfanwendung oder gen- und zelltherapeutischen Anwendung zum Transfer eines Gens an einen Organismus, ein Gewebe oder eine gegebene Zelle verwendet werden. Insbesondere können sie für eine direkte in-vivo-Verabreichung oder für die Modifikation von Zellen in vitro oder ex vivo im Hinblick auf deren Implantation in einen Patienten verwendet werden. In dieser Hinsicht können die erfindungsgemäßen Moleküle als solche (in Form von nackter DNA) oder in Verbindung mit verschiedenen synthetischen oder natürlichen chemischen und/oder biochemischen Vektoren verwendet werden. Es kann sich insbesondere um Kationen (Calciumphosphat, DEAE-Dextran, ...) handeln, die wirken, indem sie mit der DNA Niederschläge bilden, die von den Zellen „phagozytiert" werden können. Es kann sich auch um Liposomen handeln, in die das DNA-Molekül inkorporiert ist und die mit der Plasmamembran fusionieren. Die synthetischen Gentransfervektoren sind im Allgemeinen kationische Lipide oder Polymere, welche die DNA komplexieren und mit dieser ein Partikel bilden, das an der Oberfläche positive Ladungen trägt. Diese Partikel sind in der Lage, mit den negativen Ladungen der Zellmembran zu Wechselwirken und diese dann zu durchdringen. Als Beispiele für derartige Vektoren können DOGS (Transfectam^TM) oder DOTMA (Lipofectin^TM) genannt werden. Es wurden auch chimäre Proteine entwickelt: sie bestehen aus einem polykationischen Abschnitt, der die DNA kondensiert und an einen Liganden gebundenenen ist, welcher an einen Membranrezeptor bindet und den Komplex mittels Endozytose in die Zellen schleust. Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle können auch für den Transfer von Genen in Zellen mittels physikalischer Transfektionstechniken wie Beschuss, Elektroporation, usw. verwendet werden. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Moleküle gegebenenfalls vor ihrer therapeutischen Verwendung zum Beispiel durch enzymatische Spaltung linearisiert werden.
Diesbezüglich betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung jedwede pharmazeutische Zusammensetzung, die ein DNA-Molekül mindestens wie vorstehend definiert umfasst. Dieses Molekül kann nackt oder in Verbindung mit einem chemischen und/oder biochemischen Transfektionsvektor vorliegen. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können im Hinblick auf Verabreichungen auf topischem, oralem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraokularem, transdermalem usw. Weg formuliert sein. Bevorzugt wird das DNA-Molekül in einer injizierbaren Form oder als Applikation verwendet. Es kann, insbesondere zur direkten Injektion an der zu behandelnden Stelle, mit jedem für eine injizierbare Formulierung pharmazeutisch annehmbaren Träger gemischt werden. Es kann sich insbesondere um isotone sterile Lösungen oder um trockene, insbesondere lyophilisierte, Zusammensetzungen handeln, welche je nach Fall durch Zugabe von sterilisiertem Wasser oder physiologischem Serum die Bildung von injizierbaren Lösungen ermöglichen. Es kann sich insbesondere um Tris- oder PBS-Puffer handeln, die in Glucose oder Natriumchlorid verdünnt sind. Eine direkte Injektion der Nukleinsäure in die erkrankte Region des Patienten ist interessant, da sie erlaubt, die therapeutische Wirkung auf die erkrankten Gewebe zu konzentrieren. Die verwendeten Nukleinsäuredosen können entsprechend unterschiedlichen Parametern und insbesondere entsprechend dem Gen, dem Vektor, der verwendeten Verabreichungsform, der betreffenden Krankheit oder auch der gewünschten Behandlungsdauer angepasst werden.
Die DNA-Moleküle der Erfindung können ein oder mehrere Gene von Interesse, das heißt eine oder mehrere Nukleinsäuren (cDNA, gDNA, synthetische oder halbsynthetische DNA usw.) umfassen, deren Transkription und gegebenenfalls Translation in der Zielzelle Produkte von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse erzeugen.
Unter den Genen von therapeutischem Interesse können insbesondere die Gene, die kodieren für: Enzyme, Blutderivate, Hormone, Lymphokine: Interleukine, Interferone, TNF, usw. ( FR 9203120 ), Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter oder deren Vorläufer oder Syntheseenzyme, trophische Faktoren: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 usw; die Apolipoproteine: ApoAI, ApoAIV, ApoE usw. ( FR 93 05125 ), Dystrophin oder ein Minidystrophin ( FR 9111947 ), Tumorsuppressorgene (p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, usw. ( FR 93 04745 ), Gene, die für Faktoren kodieren, die an der Koagulation beteiligt sind: Faktor VII, VIII, IX, usw., Suizidgene: Thymidinkinase, Cytosindeaminase usw.; oder auch noch die Gesamtheit oder ein Teil eines natürlichen oder künstlichen Immunglobulins (Fab, ScFv, usw.), eine Liganden-RNA ( WO91/19813 ) usw. genannt werden. Das therapeutische Gen kann auch ein Gen oder eine Antisense-Sequenz sein, dessen bzw. deren Expression in der Zielzelle es ermöglicht, die Expression von Genen oder die Transkription von zellulären mRNAs zu kontrollieren. Derartige Sequenzen können zum Beispiel gemäß der in dem Patent EP 140 308 beschriebenen Technik in der Zielzelle in RNAs umgeschrieben werden, die zu zellulären mRNAs komplementär sind und somit deren Translation in Protein blockieren.
Das Gen von Interesse kann auch ein Impfgen, das heißt ein für ein Antigenpeptid kodierendes Gen, das fähig ist, beim Menschen oder beim Tier eine Immunantwort hervorzurufen, zur Herstellung von Impfstoffen sein. Es kann sich insbesondere um Antigenpeptide handeln, die spezifisch für das Epstein-Barr-Virus, das HIV-Virus, das Hepatitis B-Virus ( EP 185 573 ), das Pseudotollwut-Virus oder auch tumorspezifisch ( EP 259 212 ) sind.
Im Allgemeinen enthält das Gen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse in den Plasmiden und Molekülen der Erfindung auch eine Transkriptionspromotorregion, die in der Zielzelle oder dem Zielorganismus (d.h. den Säugetieren) funktionell ist, sowie eine 3'-gelegene Region, die ein Transkriptionsstopsignal und eine Polyadenylierungsstelle (Expressionskassette) festlegt. Was die Promotorregion betrifft, so kann es sich um eine Promotorregion handeln, die von Natur aus für die Expression des betreffenden Gens verantwortlich ist, wenn diese in der betreffenden Zelle oder dem betreffenden Organismus funktionsfähig ist. Es kann sich auch um Regionen unterschiedlichen Ursprungs (die verantwortlich für die Expression anderer Proteine oder sogar synthetisch sind) handeln. Es kann sich insbesondere um Promotorsequenzen eukaryotischer oder viraler Gene handeln. Zum Beispiel kann es sich um Promotorsequenzen aus dem Genom der Zielzelle handeln. Unter den eukaryotischen Promotoren kann jeder Promotor oder jede abgeleitete Sequenz verwendet werden, welche die Transkription eines Gens spezifisch oder unspezifisch, induzierbar oder nicht induzierbar, stark oder schwach stimuliert oder unterdrückt. Es kann sich insbesondere um ubiquitäre Promotoren (den Promotor der Gene HPRT, PGK, α-Aktin, Tubulin usw.), Promotoren der Intermediärfilamente (den Promotor der Gene GFAP, Desmin, Vimentin, Neurofilamente, Kerastin usw.), Promotoren von therapeutischen Genen (zum Beispiel den Promotor der Gene MDR, CFTR, Faktor VIII, ApoAI, usw.), gewebespezifische Promotoren (den Promotor des Gens Pyruvatkinase, Villin, Intestinales Fettsäurebindungsprotein, α-Aktin des glatten Muskels usw.) oder auch um Promotoren, die auf einen Stimulus antworten (Steroidhormonrezeptor, Retinsäurerezeptor usw.), handeln. Ebenso kann es sich um Promotorsequenzen aus dem Genom eines Virus, wie zum Bei spiel die Promotoren der adenoviralen Gene E1A und MLP, den frühen CMV-Promotor oder auch den LTR-Promotor von RSV usw., handeln. Darüber hinaus können diese Promotorregionen durch Anfügen von Aktivierungssequenzen, Regulationssequenzen oder Sequenzen, die eine gewebespezifische oder mehrheitliche Expression erlauben, modifiziert werden.
Außerdem kann das Gen von Interesse auch eine Signalsequenz umfassen, die das synthetisierte Produkt in die Sekretionswege der Zielzelle leitet. Diese Signalsequenz kann die natürliche Signalsequenz des synthetisierten Produktes sein, aber es kann sich auch um jede andere funktionelle Signalsequenz oder um eine künstliche Signalsequenz handeln.
Entsprechend dem Gen von Interesse können die DNA-Moleküle der Erfindung für die Behandlung oder die Vorhütung zahlreicher Krankheiten, einschließlich genetischer Erkrankungen (Dystrophie, zystische Fibrose usw.), neurodegenerativer Erkrankungen (Alzheimer, Parkinson, ALS usw.), Krebserkrankungen, Krankheiten, die mit Störungen der Koagulation oder Dyslipoproteinämien einhergehen, Krankheiten, die mit Virusinfektionen einhergehen (Hepatitis, AIDS usw.), oder im landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Bereich usw. verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele, die als Erläuterung, jedoch nicht als Einschränkung zu betrachten sind, ausführlicher beschrieben.
Figurenlegende
1: Produktion eines Minikreises ausgehend von einer in das Genom integrierten Kassette.
2: Produktion eines Minikreises ausgehend von einem Plasmid.
3: Produktion eines Minikreises, der eine spezifische Sequenz eines Liganden enthält.
4: Konstruktion von pXL2649. Ori: Replikationsstartpunkt; Kan^r: Markergen, das eine Kanamycinresistenz verleiht; Amp^r: Markergen, das eine Ampicillinresistenz verleiht; galK: Gen der E. coli-Galactosidase; Plac: Promotor des Lactose-Operons.
5: Luciferaseaktivität nach Transfektion von NIH3T3-Mausfibroblasten mit dem Plasmid pXL2650, dem ausgehend von dem Plasmid pXL2650 erzeugten Minikreis und dem PGL2-Control (Promega Biotech). Die Transfektion wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 0,5 mg DNA pro Loch, 50000 Zellen pro Loch. Das verwendete Lipofektionsmittel ist RPR 115335. Das Ergebnis ist in RLU pro Mikrogramm Protein als Funktion des Ladungsverhältnisses Lipofektionsmittel/DNA dargestellt.
6: Konstruktion des Plasmids pXL2793. Dieses Plasmid erzeugt nach Rekombination einen Minikreis, der eine synthetische Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz und die Luciferase-Kassette des pXL2727 umfasst.
7: Die Vertiefung 1 entspricht dem Verdau der nach Reinigung mittels Dreichfachhelixsäule eluierten Fraktion mit SalI. Die Vertiefung 2 entspricht dem Verdau der nach Reinigung mittels Dreichfachhelixsäule eluierten Fraktion mit XmnI. Die Vertiefung 3 entspricht der nicht verdauten nach Reinigung mittels Dreichfachhelixsäule eluierten Fraktion. Die Vertiefung 4 entspricht dem unverdauten nicht induzierten Plasmid pXL2793. Die Vertiefungen 5 und 6 entsprechen dem Größenmarker für lineare DNA bzw. für supergeknäuelte DNA.
8: Schematische Beschreibung der Konstruktion des Plasmids pXL2776.
9: Schematische Beschreibung der Konstruktionen der Plasmide pXL2777 und pXL2960.
10: Wirkung der Integrase des Bakteriophagen 1 bei E. coli auf die Plasmide pXL2777 und pXL2960. M: 1 kb-Molekulargewichtsmarker für lineare DNA oder für supergeknäuelte DNA. N.I.: nicht induziert. I: induziert. N.D. unverdaut.
11: Rekombinationskinetik der Integrase des Bakteriophagen 1 bei E. coli auf die Plasmide pXL2777 und pXL2960. 2': 2 Minuten. O/N: 14 Stunden. M: 1 kb-Molekulargewichtsmarker für lineare DNA oder für supergeknäuelte DNA. N.I.: nicht induziert. I: induziert. N.D. unverdaut.
Allgemeine Techniken der Klonierung und Molekularbiologie
Die klassischen Techniken der Molekularbiologie wie die Zentrifugation von Plasmid-DNA im Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gradienten, die Verdaus mit Restriktionsenzymen, die Gelelektrophorese, die Elektroelution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen, die Transformation in E. coli, die Nukleinsäurefällung usw. sind in der Literatur beschrieben (Maniatis et al., 1989, Ausubel et al., 1987). Die Nukleotidsequenzen wurden mit der Kettenterminationsmethode unter Befolgung des bereits dargestellten Protokolls (Ausubel et al., 1987) bestimmt.
Die Restriktionsenzyme wurden von New England Biolabs (Biolabs), Berthesda Research Laborstories (BRL) oder Amersham Ltd (Amersham) bereitgestellt.
Für die Ligierungen werden die DNA-Fragmente in 0,7%-igen Agarosegelen oder 8%-igen Acrylamidgelen nach ihrer Größe aufgetrennt, mittels Elektrophorese und anschließender Elektroelution gereinigt, mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt und dann in einem 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7.4, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 2 mM ATP in Gegenwart von DNA-Ligase des Phagen T4 (Biolabs) inkubiert. Die Oligonukleotide werden unter Verwendung der Chemie der Phosphoramidite, die in b durch eine Cyanoethylgruppe geschützt sind (Sinha et al., 1984, Giles 1985), mit dem automatischen DNA-Synthesegerät Biosearch 8600 unter Verwendung der Empfehlungen des Herstellers synthetisiert.
Die ligierten DNAs werden verwendet, um den kompetent gemachten Stamm zu transformieren: E. coli MC1060 [(lacIOPZYA)X74, galU, galK, strA^r, hsdR] (Casadaban et al., 1983); HB101 [hsdS20, supE44, recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20, xyl-5, mtl-1, λ-, F-] (Maniatis et al., 1989) und DH5α [endA1 hsdR17 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 λ- 080 dlacZΔM15] für die Plasmide.
Die Kulturmedien LB und 2XTY werden für den bakteriologischen Teil verwendet (Maniatis et al., 1989).
Die Plasmid-DNAs werden nach der Technik der alkalischen Lyse gereinigt (Maniatis et al., 1989).
Definition der verwendeten Begriffe und Abkürzungen.
Rekombinante DNA: Gesamtheit der Techniken, die es ermöglichen, entweder innerhalb des gleichen Mikroorganismus DNA-Sequenzen zu verbinden, die natürlicherweise nicht verbunden sind, oder ein DNA-Fragment spezifisch zu mutagenisieren.

ATP: Adenosin-5'-triphosphat
BSA: Rinderserumalbumin
PBS: 10 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl, pH 7,4
dNTP: 2'-Desoxyribonukleosid-5'-triphosphate
DTT: Dithiothreitol
kb: Kilobasen
bp: Basenpaare

Beispiel 1: Konstruktion eines Plasmids, das die Sequenzen attP und attB des Bakteriophagen in direkten wiederholten Orientierungen trägt.
Das Plasmid pNH16a hat insofern als Ausgangsmaterial gedient, als es bereits ein Fragment des Bakteriophagen λ enthält, welches die Sequenz attP trägt (Hasan und Szybalski, 1987). Dieses Plasmid wurde mit EcoRI verdaut. Oligonukleotide, welche die Sequenz attB enthalten (Landy, 1989), wurden synthetisiert. Sie haben die folgende Sequenz:

Oligonukleotid 5476 (SEQ ID Nr. 1) 5'-AATTGTGAAGCCTGCTTTTTTATACTAACTTGAGCGG-3'
Oligonukleotid 5477 (SEQ ID Nr. 2) 5'-AATTCCGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCAGGCTTCAC-3'

Sie wurden hybridisiert, um die Sequenz attB zu rekonstruieren, und dann in die EcoRI-Schnittstelle des 4.2 kb großen EcoRI-Fragments von pNH16a (Hasan und Szybalski, 1987) ligiert. Nach Transformation von DH5α wurde ein rekombinanter Klon aufbewahrt. Das auf diese Weise konstruierte Plasmid wurde pXL2648 genannt (siehe 4). Dieses Plasmid enthält die attP- und attB-Sequenzen des Bakteriophagen in direkter Orientierung. Unter der Wirkung der Integrase des Bakteriophagen (Protein Int) muss eine Exzision der Sequenzen zwischen den beiden att-Stellen stattfinden. Dies führt zur Trennung dessen, was zwischen den beiden att-Sequenzen inseriert ist, vom Replikationsstartpunkt und vom Resistenzmarker des Plasmids, die außen gelegen sind.
Beispiel 2: Erhalt eines Minikreises in vivo in E. coli.
Eine Kanamycinresistenz-Kassette wurde an die EcoRI-Schnittstelle des Plasmids pXL2648 kloniert (4). Diese Kassette stammt aus dem Plasmid pUC4KIXX (Pharmacia Biotech.). Hierfür wurden 10 g des Plasmids pUC4KIXX mit EcoRI verdaut und dann durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt; das 1,6 kb große Fragment, das den Kanamycinresistenz-Marker enthält, wurde mittels Elektroelution gereinigt; es wurde dann mit dem mit EcoRI linearisierten Plasmid pXL2648 ligiert. Die rekombinanten Klone wurden nach Transformation in E. coli DH5α und Selektion auf Kanamycinresistenz selektioniert. Das erwartete Restriktionsprofil wurde an einem Klon beobachtet; dieser Plasmidklon wurde pXL2649 genannt (4). Dieses Plasmid wurde mittels Transformation in zwei E. coli-Stämme eingebracht.
D1210 [hsdS20, supE44, recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20, xyl-5, mtl-1, λ-, F-, lacIg] (Sadler et al., 1980)
D1210HP, der dem durch den Phagen xis^– (Xis^– Kil^–) cl857 lysogenisierten DH1210 entspricht (Podjaska et al., 1985).
Die Transformanten wurden bei 30°C auf 2XTY-Medium mit Kanamycin (50 mg/l) selektioniert. Nach erneuter Isolierung auf selektivem Medium wurden die Stämme in 5 ml Medium L, das mit Kanamycin (50 mg/l) supplementiert war, inokuliert. Nach 16-ständiger Inkubation bei 30°C unter Schütteln (5 cm Rotationsamplitude) wurden die Kulturen in 100 ml des gleichen Mediums 1/100 verdünnt. Diese Kulturen wurden unter den gleichen Bedingungen bis zum Erreichen einer OD₆₁₀ von 0,3 inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Hälfte der Kultur entnommen und 10 min bei 42°C inkubiert, um den lytischen Zyklus des Phagen und damit die Expression der Integrase zu induzieren. Nach dieser Inkubation wurden die Kulturen erneut auf 30°C gebracht und 1 Stunde unter diesen Bedingungen inkubiert. Danach wurden die Kulturen beendet und Plasmid-DNA-Minipräparationen wurden durchgeführt. Unabhängig von den Bedingungen ist das Profil der Agarosegelelektrophorese der unverdauten Plasmid-DNA des Plasmids pXL2649 im Stamm D1210 unverändert, ebenso wie in dem thermisch nicht induzierten Stamm D1210HP. Hingegen beobachtet man in D1210HP, der 10 min bei 42°C inkubiert und dann 1 Stunde bei 30°C kultiviert wurde, dass nicht mehr ein Plasmid, sondern zwei zirkuläre DNA-Moleküle vorliegen: eines mit niedrigem Molekulargewicht, das am schnellsten wandert und eine EcoRI-Schnittstelle enthält, und eines mit höherem Molekulargewicht, das wie erwartet eine einzelne BglI-Schnittstelle enthält. Es hat also tatsächlich eine Exzision der zwischen den beiden att-Sequenzen liegenden Sequenzen und die Bildung eines Minikreises ohne jeglichen Replikationsstartpunkt stattgefunden. Diese zirkuläre supergeknäuelte DNA, die keinen Replikationsstartpunkt trägt, wird als Minikreis bezeichnet. Diese Bezeichnung spiegelt den zirkulären Charakter des Moleküls besser wider. Das Ausgangsplasmid pXL2649 ist vorhanden, aber es stellt ungefähr 10% des Plasmids dar, dessen von att umgebene Sequenzen herausgeschnitten wurden.
Der Minikreis kann anschließend mit den klassischen Techniken zur Reinigung von Plasmid-DNA gereinigt werden, da er wie Plasmid-DNA supergeknäuelt ist. Diese Techniken umfassen unter anderem die Reinigung im Cäsiumchlorid-Dichtegradienten in Gegenwart von Ethidiumbromid oder die Verwendung von Anionenaustauschersäulen (Maniatis et al., 1989). Darüber hinaus ist es, wenn man der Ansicht ist, dass die Plasmid-DNA, die dem Replikationsstartpunkt und dem Selekionsmarker entspricht, in zu großer Menge vorliegt, immer noch möglich, nach der Reinigung ein oder mehrere Restriktionsenzyme zu verwenden, die das Plasmid und nicht den Minikreis verdauen, was es ermöglicht, sie mittels Techniken, welche supergeknäuelte DNA von linearer DNA trennen, wie eines Cäsiumchlorid-Dichtegradienten in Gegenwart von Ethidiumbromid (Maniatis et al., 1989), zu trennen.
Beispiel 3: Erhalt eines Minikreises, der eine Luciferase-Expressionskassette enthält.
Um die in-vivo-Verwendung dieser Minikreise zu testen, wurde ein Reportergen mit den für seine Expression notwendigen Sequenzen in das Plasmid pXL2649 kloniert (siehe Beispiel 2). Es handelt sich insbesondere um eine 3150 bp lange BglII-BamHI-Kassette aus pGL2-Control (Promega Biotech.). Diese Kassette enthält den frühen SV40-Promotor, den Enhancer des frühen SV40-Promotors, das Luciferase-Gen von Photinus pyralis und eine von SV40 abgeleitete Polyadenylierungsstelle. Das 3150 bp lange BglII-BamHI-Fragment wurde an die BamHI-Schnittstelle des mit BamHI verdauten pXL2649 kloniert, so dass die Kanamycinresistenz-Kassette durch die Luciferase-Expressionskassette von pGL2-Control ersetzt wird. Das derart konstruierte Plasmid wurde pXL2650 genannt. In diesem Plasmid fassen die Stellen attP und attB die Luciferase-Expressionskassette ein. Die ortsspezifische Rekombination erlaubt es, nur die für die Expression der Luciferase notwendigen Sequenzen sowie das Luciferase-Gen herauszuschneiden. Dies kann genau wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt werden. Ein Minikreis wie das Plasmid pXL2650 kann dann in in-vivo- oder in-vitro-Transfektionsversuchen verwendet werden.
Eine 1 Liter-Kultur des Stamms D1210HP pXL2650 wurde bei 30°C in mit Ampicillin (50 mg/ml) supplementiertem 2XTY-Medium durchgeführt. Bei einer OD₆₁₀ von 0,3 wurde die Kultur 20 min auf 42°C gebracht und dann erneut 20 min auf 30°C gebracht. Die episomale DNA wurde mittels der Technik des klaren Lysats (Maniatis et al., 1989), gefolgt von einem mit Ethidiumbromid supplementierten Cäsiumchlorid-Dichtegradienten (Maniatis et al., 1989), einer Extraktion des Ethidiumbromids mit Isopropanol und einer Dialyse, präpariert. Es zeigte sich, dass diese DNA den Minikreis enthält. 100 g dieser Präparation wurden mit PstI verdaut, und das Hydrolysat wurde einem mit Ethidiumbromid supplementierten Cäsiumchlorid-Dichtegradienten (Maniatis et al., 1989) augesetzt. Ein identisches Ergebnis wird erzielt, wenn die Präparation gleichzeitig mit AlwNI und XmnI verdaut wird. Die supergeknäuelte Form wurde zurückgewonnen und nach Eliminierung des Ethidiumbromids (Maniatis et al.) stellte sich heraus, dass sie nur dem Minikreis ohne Replikationsstartpunkt und jedwedem Markergen entspricht. Diese Minikreis-Präparation kann für in-vitro- und in-vivo-Transfektionsversuche verwendet werden.
Beispiel 4: In-vitro-Transfektion von Säugetierzellen und insbesondere von humanen Zellen mit einem Minikreis.
Die Minikreis-DNA, die das Luciferase-Gen von Photinus pyralis wie in Beispiel 3 beschrieben enthält, das heißt dem Minikreis entspricht, der aus dem Plasmid pXL2650 gebildet wird, wird in 150 mM NaCl verdünnt und mit einem Transfektionsmittel vermischt. Es können verschiedene kommerzielle Transfekti onsmittel wie Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS, Transfectam^TM, Promega, Lipofectin^TM (Gibco-BRL) usw., in unterschiedlichen Verhältnissen von positiven/negativen Ladungen verwendet werden. Beispielsweise wurde das Transfektionsmittel in Ladungsverhältnissen größer oder gleich 3 verwendet. Die Mischung wird gevortext, 10 min bei Raumtemperatur belassen, in Kulturmedium frei von fetalem Kälberserum verdünnt und dann den Zellen in einer Menge von 2 μg DNA pro Kulturloch zugesetzt. Die verwendeten Zellen sind einem Adenokarzinom des menschlichen Kolons entstammende Caco-2-Zellen, die gemäß einem beschriebenen Protokoll (Wils et al., 1994) kultiviert und am Tag vor dem Versuch in 48-Loch-Kulturplatten mit je 50000 Zellen/Loch ausgesät wurden. Nach zwei Stunden bei 37°C werden 10% V/V fetales Kälberserum zugegeben, und die Zellen werden 24 Stunden bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert. Die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen, und die Luciferaseaktivität wird gemäß dem beschriebenen Protokoll (wie dem Promega-Kit) gemessen. Es können andere Zelllinien (Fibroblasten, Lymphozyten, ...) aus unterschiedlichen Spezies oder Zellen, die einem Individuum entnommen wurden (Fibroblasten, Keratinozyten, Lymphozyten, ...) und ihm nach der Transfektion wieder injiziert werden, verwendet werden.
Beispiel 5: In-vitro-Transfektion von NIH 3T3-Zellen.
Die Minikreis-DNA, die das Luciferase-Gen von Photinus pyralis wie in Beispiel 3 beschrieben enthält, das heißt dem Minikreis entspricht, der aus dem Plasmid pXL2650 gebildet wird, wurde in vitro in Säugetierzellen transfiziert; pXL2650 und PGL2-Control (Promega-Biotech.), welche die gleiche Expressionskassette umfassen, wurden als Kontrolle verwendet. Die verwendeten Zellen sind NIH 3T3-Mausfibroblasten, die am Tag vor dem Versuch in 24-Loch-Kulturplatten mit je 50000 Zellen/Loch ausgesät wurden. Das Plasmid wird in 150 mM NaCl verdünnt und mit dem Lipofektionsmittel RPR115335 vermischt. Es können jedoch verschiedene andere kommerzielle Agenzien, wie Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS, Transfectam^TM, Promega) (Demeneix et al., Int. J. Dev. Biol. 35 (1991) 481), Lipofectin^TM (Gibco-BRL) (Fegner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 7413) usw., verwendet werden. Es wird ein Verhältnis von positiven Ladungen des Lipofektionsmittels/negativen Ladungen der DNA größer oder gleich 3 verwendet. Die Mischung wird gevortext, 10 min bei Raumtemperatur belassen, in von fetalem Kälberserum freiem Medium verdünnt und dann den Zellen in einer Menge von 0,5 mg DNA pro Kulturloch zugesetzt. Nach zwei Stunden bei 37°C werden 10% V/V fetales Kälberserum zugegeben, und die Zellen werden 48 Stunden bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert. Die Zellen werden zweimal mit PBS gewaschen und die Luciferaseaktivität wird gemäß dem beschriebenen Protokoll (Promega-Kit, Promega Corp. Madison, WI) an einem Lumat LB9501-Luminometer (EG und G Berthold, Evry) gemessen. Die Transfektionsergebnisse, die den genannten Bedingungen entsprechen, sind in 5 dargestellt. Sie zeigen eindeutig, dass der Minikreis die gleichen Transfektionseigenschaften aufweist wie Plasmide, die einen Replikationsstartpunkt besitzen. So könnten diese Minikreise in gentherapeutischen Anwendungen ohne Unterschied zu Standardplasmiden angewandt werden.
Beispiel 6: Affinitätsreinigung eines Minikreises unter Verwendung einer Dreifachhelix-Wechselwirkung.
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Reinigung eines erfindungsgemäßen Minikreises aus einer Mischung, welche die Plasmidform, aus der er herausgeschnitten ist, umfasst, durch Wechselwirkungen vom Typ einer Dreifachhelix, die mit einer vom zu reinigenden Minikreis getragenen synthetischen DNA-Sequenz aufgebaut werden. Dieses Beispiel zeigt, wie die Reinigungstechnik mittels Bildung einer Dreifachhelix verwendet werden kann, um einen Minikreis von einer Plasmidform, aus welcher er herausgeschnitten ist, zu trennen.
6-1. Erhalt eines Minikreises, der eine synthetische Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz umfasst.
6-1.1. Insertion einer Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz in das Plasmid pXL2650
Das Plasmid pXL2650 besitzt eine einzelne BamHI-Schnittstelle unmittelbar nach der Kassette, die das Luciferase-Gen von Photinus pyralis enthält. Diese einzelne Schnittstelle wurde verwendet, um die beiden nachstehenden Oligonukleotide zu klonieren:

4957 (SEQ ID Nr. 3) 5'-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAC-3'
4958 (SEQ ID Nr. 4) 5'-GATCGTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG-3'

Diese Oligonukleotide liefern, nachdem sie hybridisiert und in das Plasmid pXL2650 kloniert wurden, eine Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz (GAA)₁₇ wie vorstehend beschrieben.
Zur Durchführung dieser Klonierung wurden die Oligonukleotide zunächst auf folgende Weise hybridisiert. Je 1 g von jedem dieser beiden Oligonukleotide wurden in 40 ml eines 50 mM Tris-HCl-Puffers pH 7.4, 10 mM MgCl₂ zusammengegeben. Diese Mischung wurde auf 95°C erhitzt und wurde anschließend so auf Raumtemperatur gebracht, dass die Temperatur langsam sank. 10 ng der Mischung der hybridisierten Oligonukleotide wurden mit 200 ng des mit BamHI linearisierten Plasmids pXL2650 ligiert, 30 ml Endvolumen. Nach Ligierung wurde ein Aliquot in DH5 transformiert. Die Transformationsmischungen wurden auf mit Ampicillin (50 mg/l) supplementiertem Medium L ausgestrichen. Vierundzwanzig Klone wurden mit PflMI und BamHI verdaut. Ein Klon wurde gefunden, der die Größe des 950 bp großen PflMI-BamHI-Fragments, verlängert um 50 bp, aufwies. Dieser Klon wurde zurückbehalten und mit pXL2651 bezeichnet.
Das Plasmid pXL2651 wurde gemäß dem Wizard Megaprep-Kit (Promega Corp., Madison, WI) unter Befolgung der Empfehlungen des Herstellers gereinigt.
6-1.2. Insertion einer Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz in das Plasmid pXL2649
a) Insertion neuer Restriktionsschnittstellen beiderseits der Kanamycin-Kassette von pXL2649.
Das Plasmid pXL2649, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde mit EcoRI verdaut, um die aus dem Plasmid pUC4KIXX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) stammende Kanamycin-Kassette zu entnehmen. Hierfür wurden 5 mg des Plasmids pXL2649 mit EcoRI verdaut. Das 4,2 kb große Fragment wurde mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und mittels Elektroelution gereinigt.
Andererseits wurde das Plasmid pXL1571 verwendet. Dieses wurde aus dem Plasmid pFR10 (Gene 25 (1983), 71-88) konstruiert, in welches das 1,6 kb große aus pUC4KIXX stammende Fragment, das dem Kanamycin-Gen entspricht, an der SstI-Schnittstelle inseriert wurde. Diese Klonierung hat es ermöglicht, beiderseits des Kanamycin-Gens 12 neue Restriktionsschnittstellen zu inserieren.
Fünf Mikrogramm pXL1571 wurden mit EcoRI dialysiert. Das dem Kanamycin-Gen entsprechende 1,6 kb große Fragment wurde mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und mittels Elektroelution gereinigt. Es wurde anschließend mit dem 4,2 kb großen EcoRI-Fragment von pXL2649 ligiert. Die rekombinanten Klone wurden nach Transformation in E. coli DH5α und Selektion auf Kanamycin- und Ampicillinresistenz selektioniert. Das erwartete Restriktionsprofil wurde an einem Klon beobachtet; dieser Plasmidklon wurde pXL2791 genannt.
b) Extraktion der Kanamycin-Kassette des Plasmids pXL2791.
Das Plasmid pXL2791 wurde mit SstI verdaut, um die Kanamycin-Kassette zu entnehmen. Das 4,2 kb große Fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und mit dem Gelextraktionskit Jetsorb (Genomed) gereinigt. Anschließend wurde es ligiert. Die rekombinanten Klone wurden nach Transformation in E. coli DH5α auf Ampicillinresistenz selektioniert. Das erwartete Restriktionsprofil wurde an einem Klon beobachtet. Dieser Plasmidklon wurde pXL2792 genannt. Dieser Klon umfasst unter anderem SalI- und XmaI-Restriktionsschnittstellen zwischen den attP- und attB-Stellen.
c) Klonierung einer Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz sowie einer Kassette, welche die Expression der Luciferase erlaubt, zwischen die beiden attP- und attB-Stellen des Plasmids pXL2792
Es wurde das Plasmid pXL2727 verwendet. Dieses mit XmaI und SalI verdaute Plasmid erlaubt es, ein Fragment zu entnehmen, welches umfasst: den pCMV-Promotor, das Luciferase-Gen von Photinus pyralis, eine von SV40 abgeleitete Polyadenylierungsstelle und eine Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz. Letztere wurde nach Hybridisierung und Klonierung der beiden nachstehenden Oligonukleotide erhalten:

6006: (SEQ ID Nr. 16) 5'-GATCTGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAACTGCAGATCT-3'
6008: (SEQ ID Nr. 17) 5'-GATCAGATCTGCAGTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCA-3'

Die auf pXL2727 vorliegende Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz wurde mit dem Sequenase Version 2.0-Verfahren (United States Biochemical Corporation) sequenziert. Das erzielte Ergebnis zeigt, dass die tatsächlich auf dem Plasmid pXL2727 vorliegende Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz 10 (GAA-CTT)-Wiederholungen und nicht 17, wie es die Sequenz der Oligonukleotide 6006 und 6008 vermuten lies, umfasst. Die tatsächlich auf dem Plasmid pXL2727 vorliegende Sequenz, die nach Sequenzierung auf dem Strang gelesen wird, der dem Oligonukleotid 6008 entspricht, ist die folgende:
5'-GATCAGATCTGCAGTCTCTTCTTCCTTCTTCTTCTCTTCTTCTCTT CTTCA-3' (SEQ ID Nr. 18)
Ein Mikrogramm pXL2727 wurde mit XmaI und SalI verdaut. Das 3,7 kb große Fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und mit dem Gelextraktionskit Jetsorb (Genomed) gereinigt. Andererseits wurden 1,7 mg pXL2792 mit XmaI und SalI verdaut. Das 4,2 kb große Fragment wurde auf einem Agarosegel aufgetrennt, mit dem Gelextraktionskit Jetsorb (Genomed) gereinigt und mit dem 3,7 kb großen XmaI-SalI-Fragment von pXL2727 ligiert. Die rekombinanten Klone wurden nach Transformation in E. coli DH5α und Selektion auf Ampicillinresistenz selektioniert. Das erwartete Restriktionsprofil wurde an einem Klon beobachtet; dieser Klon wurde pXL2793 genannt. Das Plasmid pXL2793 wurde unter Verwendung eines Cäsiumchlorid-Dichtegradienten gemäß einem früher beschriebenen Verfahren (Maniatis et al., 1989) gereinigt.
6-2. Vorbereitung der Säule, die den Aufbau von Wechselwirkungen vom Dreifachhelix-Typ mit einer auf dem Minikreis vorhandenen Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz ermöglicht.
Die Säule wurde auf folgende Weise präpariert: Die verwendete Säule ist eine mit NHS (N-Hydroxysuccinimid, Pharmacia) aktivierte 1 ml-HiTrap-Säule, die an eine peristaltische Pumpe (Durchsatz < 1 ml/min) angeschlossen ist. Das verwendete spezifische Oligonukleotid weist eine NH₂-Gruppe am 5'-Ende auf.
Die Sequenz des Plasmids pXL2651 ist die folgende:
5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID Nr. 5)
Die Sequenz des Plasmids pXL2793 ist die folgende (oligo 116418):
5'-CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID Nr. 19)
Die verwendeten Puffer sind die folgenden:

Kupplungspuffer: 0,2 M NaHCO₃, 0,5 M NaCl, pH 8,3
Waschpuffer:
Puffer A: 0,5 M Ethanolamin, 0,5 M NaCl, pH 8,3
Puffer B: 0,1 M Acetat, 0,5 M NaCl pH 4
Fixierungs- und Elutionspuffer:
Puffer F: 2 M NaCl, 0,2 M Acetat pH 4,5
Puffer E: 1 M Tris, HCl pH 9, 0,5 mM EDTA.

Die Säule wird auf folgende Weise präpariert:
Die Säule wird mit 6 ml 1 mM HCl gewaschen, dann wird das in dem Kupplungspuffer verdünnte Oligonukleotid (50 nMol in 1 ml) auf die Säule aufgetragen und 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Die Säule wird mit 3 ml Kupplungspuffer, dann mit 6 ml Puffer A, gefolgt von 6 ml Puffer B gewaschen. Diese beiden letzten Puffer werden nacheinander dreimal auf die Säule aufgetragen. Das Oligonukleotid wird auf diese Weise durch eine CONH-Bindung kovalent an die Säule gebunden. Die Säule wird bei 4°C in PBS mit 0,1% NaN₃ gelagert.
6-3. Reinigung eines Minikreises, der eine synthetische Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz umfasst, durch eine Wechselwirkung des Dreifachhelix-Typs.
6-3.1 Reinigung des Plasmids pXL2651
Das Plasmid pXL2651 wurde in den Stamm D1210HP eingebracht. Dieser rekombinante Stamm [D1210HP (pXL2651)] wurde wie in Beispiel 3 beschrieben kultiviert, so dass der Minikreis, der das Luciferase-Gen von Photinus pyralis enthält, gebildet wird. 20 ml Kultur wurden entnommen und zentrifugiert. Das Zellpellet wird in 1,5 ml 50 mM Glucose, 25 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA aufgenommen. Die Lyse erfolgt durch 2 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS, und die Neutralisation erfolgt durch 1,5 ml 3 M Kaliumacetat, pH 5. Die DNA wird dann mit 3 ml 2-Propanol gefällt, das Pellet wird in 0,5 ml 0,2 M Natriumacetat pH 5, 0,1 M NaCl aufgenommen und auf eine Oligonukleotidsäule aufgetragen, die in der Lage ist, wie vorstehend beschrieben Wechselwirkungen vom Dreifachhelix-Typ mit in dem Minikreis enthaltenen Poly-GAA-Sequenzen auszubilden. Nachdem die Säule zuvor mit 6 ml Puffer F gewaschen wurde, wird die den zu reinigenden Minikreis enthaltende Lösung, nachdem sie auf die Säule aufgetragen, wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Säule wird mit 10 ml Puffer F gewaschen und die anschließende Elution erfolgt mit Puffer E.
Auf diese Weise erhält man gereinigte DNA, die dem Minikreis entspricht. Der erhaltene, durch Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung analysierte Minikreis liegt in Form einer einzelnen Bande zirkulärer supergeknäuelter DNA vor. In der Präparation verbleiben weniger als 5% des Ausgangsplasmids pXL2651.
6-3.2 Reinigung des Plasmids pXL2793
Das 7,9 kb große Plasmid pXL2793 wurde in den Stamm D1210HP eingebracht. Dieser rekombinante Stamm wurde wie in Beispiel 3 beschrieben kultiviert, so dass der 4 kb große Minikreis, der das Luciferase-Gen von Photinus pyralis enthält, und ein 3,9 kb großes Plasmid gebildet werden. Zweihundert ml Kultur wurden entnommen und zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit dem Wizard Megaprep-Kit (Promega Corp., Madison, WI) unter Befolgung der Empfehlungen des Herstellers behandelt. Die DNA wurde in einem Endvolumen von 2 ml 1 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 aufgenommen. Zweihundertfünfzig Mikroliter dieser Plasmidprobe wurden mit Puffer F in einem Endvolumen von 2,5 ml verdünnt. Die Säule wurde zuvor mit 6 ml Puffer F gewaschen. Die Gesamtheit der verdünnten Probe wurde auf eine Oligonukleotidsäule geladen, die in der Lage ist, mit in dem Minikreis enthaltenen Poly-GAA-Sequenzen Wechselwirkungen vom Dreifachhelix-Typ auszubilden, und die wie vorstehend beschrieben päpariert wurde. Nach Waschen mit 10 ml Puffer F erfolgt die Elution mit Puffer E. Die eluierte Probe wird in 1 ml-Fraktionen gesammelt.
Durch dieses Verfahren erhält man gereinigte DNA, die dem aus pXL2793 gebildeten Minikreis entspricht. Die von der Säule eluierte DNA-Probe wurde mit tels Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromidfärbung und mittels enzymatischer Restriktion analysiert. Hierfür wurden die eluierten Fraktionen, für welche durch quantitative Bestimmung bei OD₂₆₀ nm gezeigt wurde, dass sie DNA enthielten, 24 Stunden gegen 1 mM Tris, 1 mM EDTA dialysiert, dann mit Isopropanol gefällt und in 200 ml H₂O aufgenommen. Fünfzehn Mikroliter der derart erhaltenen Probe wurden mit SalI, einer Restriktionsschnittstelle, die auf dem Minikreis und nicht auf dem 3,9 kb großen, durch die Rekombination gebildeten Plasmid vorhanden ist, oder mit XmnI, einer Restriktionsschnittstelle, die auf dem 3,9 kb großen, durch die Rekombination gebildeten Plasmid und nicht auf dem Minikreis vorhanden ist, verdaut. Das erhaltene Ergebnis ist in 7 dargestellt und zeigt, dass der Minikreis von dem rekombinanten Plasmid gereinigt wurde.
Beispiel 7: In-vivo-Transfektion von Säugetierzellen mit einem Minikreis.
Dieses Beispiel beschreibt den Transfer eines für das Luciferase-Gen kodierenden Minikreises in das Gehirn neugeborener Mäuse. Der Minikreis (30 μg) wird in sterilem 150 mM NaCl auf eine Konzentration von 1 mg/μl verdünnt. Anschließend wird ein synthetisches Transfektionsmittel wie Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS) in einem Verhältnis von positiven/negativen Ladungen kleiner oder gleich 2 zugegeben. Die Mischung wird gevortext und 2 μg DNA werden mit Hilfe eines Mikromanipulators und einer Minispritze in die Gehirnrinde von anästhesierten neugeborenen Mäusen injiziert. Die Gehirne werden 48 Stunden später entnommen, homogenisiert, zentrifugiert, und der Überstand wird für die Bestimmung der Luciferase gemäß den beschriebenen Protokollen (wie dem Promega-Kit) verwendet.
Beispiel 8: Verwendung des Genortes par von RK2, um das Vorliegen von Minikreis- oder Miniplasmid-Topoisomeren zu reduzieren.
Dieses Beispiel belegt das Vorliegen abgeleiteter topologischer Formen i) des Plasmids, welches die Sequenzen attP und attB in direkter Orientierung enthält, ii) des Minikreises oder iii) des Miniplasmids nach Wirkung der Integrase des Bakteriophagen 1 bei E. coli. Dieses Beispiel zeigt auch, dass diese topologischen oder oligomeren Formen durch Verwendung des Genortes par von RK2 (Gerlitz u. a., 1990, J. Bacteriol. 172, S. 6194) aufgelöst werden können. Dieser Genort enthält insbesondere das Gen parA, welches für eine Resolvase kodiert, die an der Stelle mrs (Muttimer-Resolution-System) wirkt (Eberl u. a., 1994, Mol. Microbiol. 12, S. 131).
8-1. Konstruktion der Plasmide pXL2777 und pXL2960
Die Plasmide pXL2777 und pXL2960 sind vom Vektor pXL2776 abgeleitet und haben das minimale Replikon von ColE1, das für die Kanamycinresistenz kodierende Gen des Transposons Tn5 und die Sequenzen attP und attB des Bakteriophagen 1 in direkter Orientierung gemeinsam. Diese Plasmide unterscheiden sich hinsichtlich der zwischen den Sequenzen attP und attB inserierten Gene, insbesondere enthält pXL2777 die Kassette Oregon (die für das Spectinomycinresistenzgen kodiert), während pXL2960 den Genort par von RK2 trägt.
8-1.1. Minimaler Vektor pXL2658
Der Vektor pXL2658 (2,513 kb) besitzt das minimale Replikon von ColE1 aus pBluescript (ori) und das Gen des Transposons Tn5, das für die Resistenz gegen Kanamycin (Km) als Selektionsmarker kodiert. Nach Glätten des BsaI-Endes durch Behandlung mit Klenow wurde das 1,15 kb große BsaI-PvuII-Fragment von pBKS+ (von Stratagene) mit dem 1,2 kb großen Fragment SmaI von pUC4KIXX (von Pharmacia) kloniert, um das Plasmid pXL2647 zu bilden. Die Oligonukleotide 5542 5'(AGC TTC TCG AGC TGC AGG ATA TCG AAT TCG GAT CCT CTA GAG CGG CCG CGA GCT CC)3' (SEQ ID Nr. 20) und 5543 5'(AGC TGG AGC TCG CGG CCG CTC TAG AGG ATC CGA ATT CGA TAT CCT GCA GCT CGA GA)3' (SEQ ID Nr. 21) wurden miteinander hybridisiert und dann in die HindIII-Schnittstelle von pXL2647 kloniert, so dass pXL2658 konstruiert wird. Auf diesem Plasmid befindet sich das Multisite SstI, NotI, XbaI, BamHI, EcoRI, EcoRV, PstI, XhoI und HindIII zwischen dem Replikationsstartpunkt und dem Gen für die Kanamycinresistenz.
8-1.2. Vektor pXL2776, welcher die Sequenzen attP und attB des Phagen 1 enthält
Der Vektor pXL2776 (2,93 kb) besitzt das minimale Replikon von ColE1 aus pBluescript, das für die Kanamycinresistenz kodierende Gen und die Sequenzen attP und attB des Bakteriophagen 1 in direkter Orientierung, siehe 8. Die 29 bp lange Sequenz attB (Mizuuchi u. a., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, S. 3320) wurde zwischen die Restriktionsschnittstellen SacI und HindIII von pXL2658 eingebracht, nachdem das Sense-Oligonukleotid 6194 5'(ACT AGT GGC CAT GCA TCC GCT CAA GTT AGT ATA AAA AAG CAG GCT TCA G)3' (SEQ ID Nr. 22) mit dem Antisense-Oligonukleotid 6195 5'(AGC TCT GAA GCC TGC TTT TTT ATA CTA ACT TGA GCG GAT GCA TGG CCA CTA GTA GCT)3' (SEQ ID Nr. 23) derart hybridisiert wurde, dass die Restriktionsschnittstellen SacI und HindIII nach der Klonierung nicht mehr rekonstruiert werden. Dieses Plasmid, dessen Sequenz in attB überprüft wurde, wird dann mit SpeI und NsiI verdaut, um darin die von den Restriktionsschnittstellen NsiI und XbaI umrahmte Sequenz attP einzuführen und so das Plasmid pXL2776 zu bilden. Die attP-Sequenz wurde mittels PCR-Amplifikation unter Verwendung des Plasmids pXL2649 (in Beispiel 2 beschrieben) als Matrize, des Sens-Oligonukleotids 6190 5'(GCG TCT AGA ACA GTA TCG TGA TGA CAG AG)3' (SEQ ID Nr. 24) und des Antisense-Oligonukleotids 6191 5'(GCC AAG CTT AGC TTT GCA CTG GAT TGC GA)3' (SEQ ID Nr. 25) und unter Durchführung von 30 Zyklen, während derer die Hybridisierungstemperatur 50°C beträgt, erhalten. Das von den Restriktionsschnittstellen XbaI und HindIII verdaute PCR-Produkt wurde in den Phagen M13mpEH zwischen die XbaI- und HindIII-Restriktionsschnittstellen kloniert. Die amplifizierte Sequenz ist mit der in Lambda II (hrsg. von R. W. Hendrix, J. W. Roberts, F. W. Stahl, R. A. Weisberg; Cold Spring Harbor Laborstory 1983) beschriebenen attP-Sequenz zwischen den Positionen 27480 und 27863 identisch.
8-1.3. Plasmid pXL2777
Das Plasmid pXL2777 (6,9 kb) besitzt das minimale Replikon von ColE1 aus pBluescript, das für die Kanamycinresistenz kodierende Gen, die Sequenzen attP und attB des Bakteriophagen 1 in direkter Orientierung, die durch das Gen sacB, welches für die Levansucrase von B. subtilis kodiert (P. Gay u. a., 1983, J. Bacteriol. 153, S. 1424), getrennt sind, und das Sp-Omegon, das für das Spectinomycin Sp- und das Streptomycin Sm-Resistenzgen kodiert (P. Prentki u. a., 1984, Gene 29, S. 303). Die Kassette sacB-Sp, die EcoRV- und NsiI-Klonierungsenden aufweist, stammt aus dem Plasmid pXL2757 ( FR95/01632 ) und wurde zwischen die EcoRV- und NsiI-Restriktionsschnittstellen von pXL2776 kloniert, um pXL2777 zu bilden.
8-1.4. Plasmid pXL2960
Das Plasmid pXL2960 (7,3 kb) besitzt das minimale Replikon von ColE1 aus pBluescript, das für die Kanamycinresistenz kodierende Gen, die Sequenzen attP und attB des Bakteriophagen 1 in direkter Orientierung, die durch i) das Gen sacB, welches für die Levansucrase von B. subtilis kodiert (P. Gay u. a., 1983, J. Bacteriol. 153, S. 1424), und ii) den Genort par von RK2 (Gerlitz u. a., 1990, J. Bacteriol. 172, S. 6194) getrennt sind. Die Kassette par, die BamHI-Enden aufweist, stammt aus dem Plasmid pXL2433 ( PCT/FR95/01178 ) und wurde zwischen die BamHI-Restriktionsschnittstellen von pXL2777 eingebracht, um pXL2960 zu bilden.
8-2. Auflösen von Minikreis- oder Miniplasmid-Topoisomeren
Die Plasmide pXL2777 und pXL2960 wurden mittels Transformation in den E. coli-Stamm DH1210HP eingebracht. Die Transformanten wurden selektioniert und analysiert, wie in Beispiel 2 beschrieben, mit den nachfolgenden Veränderungen: die Expression der Integrase wurde 15 min bei 42°C induziert, wenn die optische Dichte der Zellen bei 610 nm 1,8 beträgt, und die Zellen werden anschließend bei 30°C 30 min, siehe 9, oder während einer Dauer, die von 2 Minuten bis 14 Stunden (O/N) variiert, siehe 10, inkubiert. Die Plasmid-DNA aus den nicht induzierten und induzierten Kulturen wurde vor und nach dem Verdau mit einem einzelnen Restriktionsenzym im Abschnitt Minikreis (EcoRI) oder Miniplasmid (BglII), siehe Figur Y, oder nach Einwirkung der DNA- Topoisomerase A oder der Gyrase von E. coli auf einem Agarosegel analysiert. Die dimeren supergeknäuelten Formen von Minikreis oder Miniplasmid werden klar i) durch ihr Molekulargewicht, ii) ihre Linealisierung durch das Restriktionsenzym, iii) die Änderung ihrer Topologie durch die Wirkung der Topoisomerase A (gelockertes Dimer) oder der Gyrase (supersupergeknäueltes Dimer), iv) die spezifische Hybridisierung mit einem dem Minikreis oder dem Miniplasmid eigenen internen Fragment belegt. Andere topologische Formen mit höherem Molekulargewicht als das Ausgangsplasmid stammen aus dem Ausgangsplasmid oder dem Minikreis oder Miniplasmid, da sie nach Verdau mit dem einzelnen Restriktionsenzym im Abschnitt Minikreis (EcoRI) oder Miniplasmid (BglII) verschwinden. Diese Formen sind mit dem pXL2960 sehr viel weniger häufig als mit dem pXL2777 als Ausgangsplasmid, siehe 10. Insbesondere liegt, wenn die Zellen wenigstens 30 min bei 30°C inkubiert werden, die dimere Minikreisform mit dem Plasmid pXL2777 in nicht vernachlässigbarer Weise vor, während sie mit dem Plasmid pXL2960 nicht sichtbar ist, siehe 9 und 10. Es ist zu bemerken, dass zu Beginn der Kinetik mit pXL2960 (2 bis 10 min) Minikreisdimere beobachtet werden, die dann aufgelöst werden (nach 30 min), siehe 10. Folglich führt der Genort par zu einer signifikanten Verringerung der oligomeren/topologischen Formen, die aus der Einwirkung der Integrase des Bakteriophagen 1 bei E. coli auf die Plasmide hervorgehen, welche die Sequenzen attP und attB in direkter Orientierung enthalten.
IDENTIFIZIERUNG DER NUKLEOTIDSEQUENZEN

SEQ ID Nr. 1: Oligonukleotid 5476: 5'-AATTGTGAAGCCTGCTTTTTTATACTAACTTGAGCGG-3'
SEQ ID Nr. 2: Oligonukleotid 5477: 5'-AATTCCGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCAGGCTTCAC-3'
SEQ ID Nr. 3: Oligonukleotid 4957: 5'-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAC-3'
SEQ ID Nr. 4: Oligonukleotid 4958: 5'-GATCGTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG-3'
SEQ ID Nr. 5: Oligonukleotid poly-CTT: 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'
SEQ ID Nr. 6: Oligonukleotid (Sequenz attB des Phagen lambda): 5'-CTGCTTTTTTATACTAACTTG-3'
SEQ ID Nr. 7: Oligonukleotid (Sequenz attP des Phagen lambda): 5'-CAGCTTTTTTATACTAAGTTG-3'
SEQ ID Nr. 8: Oligonukleotid (Sequenz att des Phagen P22): 5'-CAGCGCATTCGTAATGCGAAG-3'
SEQ ID Nr. 9: Oligonukleotid (Sequenz attP des Phagen P22): 5'-CTTATAATTCGTAATGCGAAG-3'
SEQ ID Nr. 10: Oligonukleotid (Sequenz attB des Phagen F80): 5'-AACACTTTCTTAAATGGTT-3'
SEQ ID Nr. 11: Oligonukleotid (Sequenz attP des Phagen F80): 5'-AACACTTTCTTAAATTGTC-3'
SEQ ID Nr. 12: Oligonukleotid (Sequenz attB des Phagen HP1): 5'-AAGGGATTTAAAATCCCTC-3'
SEQ ID Nr. 13: Oligonukleotid (Sequenz attP des Phagen HP1): 5'-ATGGTATTTAAAATCCCTC-3'
SEQ ID Nr. 14: Oligonukleotid (Sequenz att des Plasmids pSAM2): 5'-TTCTCTGTCGGGGTGGCGGGATTTGAACCCACGACCTCTTCGTCCCGAA-3'
SEQ ID Nr. 15: (Erkennungssequenz der Resolvase des Transposons Tn3): 5'-CGTCGAAATATTATAAATTATCAGACA-3'
SEQ ID Nr. 16: Oligonukleotid 6006: 5'-GATCTGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAACTGCAGATCT-3'
SEQ ID Nr. 17: Oligonukleotid 6008: 5'-GATCAGATCTGCAGTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCA-3'
SEQ ID Nr. 18 (auf dem Plasmid pXL2727 vorhandene Sequenz, die dem Oligonukleotid 6008 entspricht): 5'-GATCAGATCTGCAGTCTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTCTTCTTCA-3'
SEQ ID Nr. 19: (Oligonukleotid 116418): 5'-CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'
SEQ ID Nr. 20: (Oligonukleotid 5542): 5'-AGCTTCTCGAGCTGCAGGATATCGAATTCGGATCCTCTAGAGCGGCCGCGAGCTCC-3'
SEQ ID Nr. 21: (Oligonukleotid 5543): 5'-AGCTGGAGCTCGCGGCCGCTCTAGAGGATCCGAATTCGATATCCTGCAGCTCGAGA-3'
SEQ ID Nr. 22: sense-Oligonukleotid 6194: 5'-ACTAGTGGCCATGCATCCGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCAGGCTTCAG-3'
SEQ ID Nr. 23: antisense-Oligonukleotid 6195: 5'-AGCTCTGAAGCCTGCTTTTTTATACTAACTTGAGCGGATGCATGGCCACTAGTA GCT-3'
SEQ ID Nr. 24: sense-Oligonukleotid 6190: 5'-GCGTCTAGAACAGTATCGTGATGACAGAG-3'
SEQ ID Nr. 25: antisense-Oligonukleotid 6191: 5'-GCCAAGCTTAGCTTTGCACTGGATTGCGA-3'

Literaturverzeichnis

Ausubel et al. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Wiley and Sons, New York.
Behr J.P. 1993. Acc. Chem. Res. 26:274-278.
Casadaban et al. 1983. Methods Enzymol. 100, 293-308.
Cotten et al. E. 1993. Curr. Biol. 4:705-710.
Giles, J. W. 1985. Am. Biotechnol., Nov./Dez.
Hasan et al. 1987. Gene 56:145-151.
Jain, R. K. 1987. Cancer Res. 47:3039-3051.
Landford et al. 1986. Cell 46:575-582.
Landy, A. 1989. Ann. Rev. Biochem. 58:913-949.
Maniatis, T., E. F. Fritsch und J. Sambrook. 1989. Molecular Cloning: a laboratory manual, Zweite Auflage. Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York.
Nabel et al. 1992. Human Gene Therapy 3:399-410.
Podhajska et al. 1985. Gene 40:163-168.
Sadler et al. 1980. Gene 8:279-300.
Sinha et al. 1984. Acids Res. 12, 4539-4557.
Stark et al. 1992. Trends Genet. 8:432-439.
Viera et al. 1982. Gene 19, 259-268.
Wils et al. Biochem. Pharmacol. 48:1528-1530.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Doppelsträngiges DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, dass: – es in zirkulärer und supergeknäuelter Form vorliegt, – es eine Expressionskassette umfasst, welche aus einem Gen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse unter der Kontrolle eines Transkriptionspromotors und eines Transkriptionsterminators, welche in Säugetierzellen aktiv sind, besteht, – es keinen Replikationsstartpunkt aufweist, – es kein Markergen aufweist und – es eine Region umfasst, welche aus der ortsspezifischen Rekombination zwischen zwei Sequenzen resultiert, wobei die Region außerhalb der Expressionskassette gelegen ist.
Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem eine Sequenz enthält, welche in der Lage ist, durch Hybridisierung mit einem spezifischen Oligonukleotid eine Dreifachhelix zu bilden.
Molekül nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, welche in der Lage ist, eine Dreifachhelix zu bilden, 5 bis 30 Basenpaare umfasst.
Molekül nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, welche in der Lage ist, eine Dreifachhelix zu bilden, eine Homopurin-Homopyrimidin-Sequenz ist.
Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Sequenz umfasst, welche aus der ortsspezifischen Rekombination zwischen zwei Anheftungssequenzen att oder zwischen zwei Erkennungssequenzen der Resolvase eines Transposons oder von parA von RK2 resultiert.
Molekül nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem eine aus dem Genort par von RK2 stammende Sequenz mrs umfasst, welche erlaubt, Multimere aufzulösen.
Molekül nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen von Interesse eine Nukleinsäure ist, welche ein therapeutisches, Impf-, landwirtschaftliches oder veterinärmedizinisches Produkt kodiert.
Molekül nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Herausschneiden ausgehend von einem Plasmid oder einem Chromosom durch ortsspezifische Rekombination erhalten wird.
Rekombinante DNA, umfassend einen nicht-therapeutischen Abschnitt und einen therapeutischen Abschnitt oder eine Expressionskassette, welche(r) aus einem Gen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse unter der Kontrolle eines Transkriptionspromotors und eines Transkriptionsterminators, welche in Säugetierzellen aktiv sind, besteht und von zwei Sequenzen eingerahmt ist, welche eine ortsspezifische Rekombination erlauben und in direkter Orientierung angeordnet sind, wobei die Rekombination durch Herausschneiden der nicht-therapeutischen Abschnitte erlaubt, das Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zu erzeugen.
Rekombinante DNA nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein replikatives Plasmid handelt, welches umfasst: a) einen Replikationsstartpunkt und gegebenenfalls ein Markergen in dem nicht-therapeutischen Abschnitt, b) zwei Sequenzen, welche eine ortsspezifische Rekombination erlauben und in direkter Orientierung angeordnet sind, und c) platziert zwischen den Sequenzen b) einen therapeutischen Abschnitt oder eine Expressionskassette, welche(r) aus einem Gen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse unter der Kontrolle eines Transkriptionspromotors und eines Transkriptionsterminators, welche in Säugetierzellen aktiv sind, besteht.
Rekombinante DNA nach den Ansprüchen 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzen, welche die ortsspezifische Rekombination erlauben, Sequenzen sind, welche in der Lage sind, in Gegenwart einer Rekombinase spezifisch zu rekombinieren.
Rekombinante DNA nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Rekombinase ausgewählt wird unter den Rekombinasen der Familie der Integrase des Phagen lambda und der Familie der Resolvase des Transposons Tn3.
Rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzen, welche die ortsspezifische Rekombination erlauben, von einem Bakteriophagen abgeleitet sind.
Rekombinante DNA nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzen, welche die ortsspezifische Rekombination erlauben, aus den Anheftungssequenzen att eines Bakteriophagen bestehen.
Rekombinante DNA nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzen, welche die ortsspezifische Rekombination erlauben, aus den Anheftungssequenzen des Bakteriophagen lambda, P22, Φ80, P1, HP1 oder ferner des Plasmids pSAM2 oder 2μ bestehen.
Rekombinante DNA nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzen, welche die ortsspezifische Rekombination erlauben, die Gesamtheit oder einen Teil der Sequenzen SEQ ID Nr. 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 oder 14 umfassen.
Plasmid, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: (a) einen bakteriellen Replikationsstartpunkt und gegebenenfalls ein Markergen in dem nicht-therapeutischen Abschnitt; (b) die Sequenzen attP und attB eines unter den Phagen lambda, P22, Φ80, P1, HP1 ausgewählten Bakteriophagen oder des Plasmids pSAM2 oder 2μ, welche in direkter Orientierung angeordnet sind; und (c) platziert zwischen den Sequenzen einen therapeutischen Abschnitt oder eine Expressionskassette, welche(r) aus einem Gen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse unter der Kontrolle eines Transkriptionspromotors und eines Transkriptionsterminators, welche in Säugetierzellen aktiv sind, besteht.
Plasmid nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzen, welche die ortsspezifische Rekombination erlauben, aus den Anheftungssequenzen des Bakteriophagen lambda bestehen.
Rekombinante DNA nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzen, welche die ortsspezifische Rekombination erlauben, von dem Bakteriophagen P1 abgeleitet sind.
Plasmid, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: a) einen bakteriellen Replikationsstartpunkt und gegebenenfalls ein Markergen in dem nicht-therapeutischen Abschnitt, b) die invertierten Sequenzenwiederholungen des Bakteriophagen P1 (Region loxP), welche in direkter Orientierung angeordnet sind; und c) platziert zwischen den Sequenzen (b) einen therapeutischen Abschnitt oder eine Expressionskassette, welche(r) aus einem Gen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse unter der Kontrolle eines Transkriptionspromotors und eines Transkriptionsterminators, welche in Säugetierzellen aktiv sind, besteht.
Rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzen, welche die ortsspezifische Rekombination erlauben, von einem Transposon abgeleitet sind.
Rekombinante DNA nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzen, welche die ortsspezifische Rekombination erlauben, aus Erkennungssequenzen der Resolvase des Transposons Tn3, Tn21 oder Tn522 bestehen.
Rekombinante DNA nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzen, welche die ortsspezifische Rekombination erlauben, die Gesamtheit oder einen Teil der Sequenz SEQ ID Nr. 15 umfassen.
Rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzen, welche die ortsspezifische Rekombination erlauben, von der Region par des Plasmids RP4 abgeleitet sind.
Rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 9 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass sie außerdem eine Sequenz umfasst, welche in der Lage ist, durch Hybridisierung mit einem spezifischen Oligonukleotid eine Dreifachhelix zu bilden.
Plasmid, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: a) einen Replikationsstartpunkt und gegebenenfalls ein Markergen in dem nicht-therapeutischen Abschnitt, b) zwei Sequenzen, welche eine ortsspezifische Rekombination erlauben und in direkter Orientierung angeordnet sind, und c) platziert zwischen den Sequenzen b) einen therapeutischen Abschnitt oder eine Expressionskassette, welche(r) aus einem oder mehreren Genen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse und einer Sequenz, welche in der Lage ist, durch Hybridisierung mit einem spezifischen Oligonukleotid eine Dreifachhelix zu bilden, besteht.
Plasmid, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: a) einen Replikationsstartpunkt und gegebenenfalls ein Markergen in dem nicht-therapeutischen Abschnitt, b) zwei Sequenzen, welche eine ortsspezifische Rekombination erlauben und in direkter Orientierung angeordnet sind, und c) platziert zwischen den Sequenzen b) einen therapeutischen Abschnitt oder eine Expressionskassette, welche(r) aus einem oder mehreren Genen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse und einer aus dem Genort par von RK2 stammenden Sequenz mrs, welche erlaubt, Multimere aufzulösen, besteht.
Plasmid, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: a) einen Replikationsstartpunkt und gegebenenfalls ein Markergen in dem nicht-therapeutischen Abschnitt, b) zwei Sequenzen, welche eine ortsspezifische Rekombination erlauben und in direkter Orientierung angeordnet sind, und c) platziert zwischen den Sequenzen b) einen therapeutischen Abschnitt oder eine Expressionskassette, welche(r) aus einem oder mehreren Genen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse, einer aus dem Genort par von RK2 stammenden Sequenz mrs, welche erlaubt, Multimere aufzulösen, und einer Sequenz, welche in der Lage ist, durch Hybridisierung mit einem spezifischen Oligonukleotid eine Dreifachhelix zu bilden, besteht.
Plasmid, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: a) einen Replikationsstartpunkt und gegebenenfalls ein Markergen in dem nicht-therapeutischen Abschnitt, b) zwei Sequenzen, welche eine ortsspezifische, Integrase-abhängige Rekombination erlauben und in direkter Orientierung angeordnet sind, und zwei Sequenzen, welche eine ortsspezifische, Resolvase-abhängige Rekombination erlauben und angrenzend an die beiden ersten und gleichfalls in direkter Orientierung angeordnet sind, und c) platziert zwischen den Sequenzen b) einen therapeutischen Abschnitt oder eine Expressionskassette, welche(r) aus einem oder mehreren Genen von therapeutischem, Impf-, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse und gegebenenfalls einer Sequenz, welche in der Lage ist, durch Hybridisierung mit einem spezifischen Oligonukleotid eine Dreifachhelix zu bilden, besteht.
Plasmid nach den Ansprüchen 26, 28 und 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, welche in der Lage ist, eine Dreifachhelix zu bilden, wie in den Ansprüchen 3 und 4 definiert ist.
Rekombinante Zelle, welche ein Plasmid oder eine rekombinante DNA nach Anspruch 13, 26, 28 oder 29 enthält.
Rekombinante Zelle, welche inseriert in ihr Genom eine oder mehrere Kopien einer rekombinanten DNA nach Anspruch 9 umfasst.
Rekombinante Zelle nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Bakterium handelt.
Rekombinante Zelle nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine eukaryotische Zelle handelt.
Rekombinante Zelle nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um das Bakterium E. coli D1 21 0HP handelt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein DNA-Molekül zumindest gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kultur von Wirtszellen, welche eine rekombinante DNA, wie in Anspruch 9 definiert, enthalten, mit der Rekombinase, welche erlaubt, in vivo die ortsspezifische Rekombination zu induzieren, in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur von Wirtszellen eine Kultur von Zellen nach Anspruch 31 ist.
Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur von Wirtszellen eine Kultur von Zellen nach Anspruch 32 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkontaktbringen mit der Rekombinase ausgeführt wird durch Transfektion oder Infektion der Kultur von Zellen mit einem Plasmid oder einem Phagen, welches bzw. welcher das Gen der Rekombinase enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass das Inkontaktbringen mit der Rekombinase ausgeführt wird durch Induktion der Expression eines in der Wirtszelle vorhandenen Gens, welches die Rekombinase kodiert.
Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle integriert in ihr Genom das Gen der Rekombinase enthält, welches eine wärmeregulierte Expression aufweist, und das Inkontaktbringen mit der Rekombinase durch Kultivierung bei der Induktionstemperatur erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzte Wirtszelle einen in ihr Genom integrierten lysogenen Phagen enthält, welcher das Gen der Rekombinase enthält.
Verfahren zur Herstellung eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Präparation von rekombinanter DNA nach Anspruch 11 mit der Rekombinase, welche erlaubt, die ortsspezifische Rekombination in vitro zu induzieren, in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 37 oder 44, dadurch gekennzeichnet, dass es einen ergänzenden Schritt einer Reinigung des Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigung einen Schritt des Inkontaktbringens einer Lösung, welche das Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält, mit einem spezifischen Liganden umfasst, welcher gegebenenfalls auf einem Träger aufgepfropft ist.
Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung, welche das Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält, mit einem Oligonukleotid in Kontakt gebracht wird, welches gegebenenfalls auf einem Träger aufgepfropft ist und in der Lage ist, durch Hybridisierung eine Dreifachhelix mit einer in dem Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 vorhandenen spezifischen Sequenz zu bilden.