DE69634043T2

DE69634043T2 - Zirkuläres dna molekül mit einem abhängigen replikationsursprung, seine herstellungsverfahren und seine verwendung in der gentherapie

Info

Publication number: DE69634043T2
Application number: DE69634043T
Authority: DE
Inventors: Joel Crouzet; Fabienne Soubrier
Original assignee: Centelion SAS
Current assignee: CENTELION, VITRY SUR SEINE, FR
Priority date: 1995-09-15
Filing date: 1996-09-13
Publication date: 2005-08-18
Anticipated expiration: 2016-09-14
Also published as: NO981044L; SK285317B6; ATE492642T1; IL173399A; DK0850310T3; PT850310E; WO1997010343A1; ES2357098T3; BR9610511B1; US20090149406A1; DK1724354T3; TWI231826B; SK34798A3; MX9802005A; EP0850310A1; DK1508620T3; FR2738842B1; BR9610511A; JP2000501281A; JP2006136328A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues DNA-Molekül mit konditionaler Replikation, das in der Gentherapie oder für die Herstellung von rekombinanten Proteinen einsetzbar ist.
Die Gentherapie besteht in der Korrektion eines Defizits oder einer Anomalie durch Einführen einer genetischen Information in die Zelle oder das betroffene Organ. Diese Information kann entweder in vitro in eine aus dem Organ entnommene Zelle eingeführt werden und anschließend wieder in den Organismus injiziert werden, oder in vivo direkt in das betreffende Gewebe. Wenn es sich um ein Molekül mit einem hohen Molekulargewicht und negativer Ladung handelt, hat die DNA Schwierigkeiten bei der spontanen Durchquerung der phospholipiden Zellmembranen. Daher werden unterschiedliche Vektoren eingesetzt, um den Gentransfer zu erlauben: einerseits Virenvektoren, andererseits chemische Vektoren und/oder biochemische, natürliche oder synthetische Vektoren.
Virenvektoren (Retrovirus, Adenovirus, verbundene Adenoviren, usw.) sind sehr wirkungsvoll, insbesondere beim Durchgang der Membranen, weisen jedoch eine Reihe von Risiken auf, wie z. B. Pathogenität, Rekombination, Replikation, Immunigenität, usw.
Chemische und/oder biochemische Vektoren erlauben die Vermeidung dieser Risiken (zwecks Revue, siehe Behr, 1993, Cotten und Wagner, 1993). Z. B. sind es die Kationen (Kalziumphosphat, DEAE-Dextran, usw.), die bei ihrer Wirkung Ausfällungen mit der DNA bilden, die durch die Zellen „phagozytiert" werden können. Es kann sich ebenfalls um Liposome handeln, in denen die DNA integriert ist und die mit der plasmischen Membran fusionieren. Synthetische Gentransfer-Vektoren sind ebenfalls Lipide oder kationische Polymere, die die DNA komplexieren und mit ihr ein an der Oberfläche positive Ladungen tragendes Partikel bilden. Zur Verdeutlichung dieser Art von Vektoren können insbesondere Dioctadecylamidogylcylspermin (DOGS, Transfectam^TM) oder N-[2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-Trimethylammonium-Chlorid (DOTMA, Lipofectin^TM) genannt werden.
Der Einsatz von chemischen und/oder biochemischen Vektoren oder der reinen DNA impliziert jedoch die Möglichkeit, große Mengen DNA in pharmakologischer Reinheit herzustellen. Bei den Techniken der Gentherapie besteht das Medikament nämlich aus der DNA selbst und es ist unabdingbar, DNA in angemessenen Mengen herstellen zu können, die für einen therapeutischen Einsatz beim Menschen geeignete Eigenschaften aufweist.
Bei der nicht viralen Vektorologie werden Plasmide bakteriellen Ursprungs eingesetzt. Die in der Gentherapie im Allgemeinen eingesetzten Plasmide tragen (i) einen Replikationsstartpunkt, (ii) ein Makergen, wie z. B. ein Resistenzgen gegen Antibiotika (Kanamycin, Ampicilin, usw.) und (iii) ein oder mehrere Transgene mit für ihre Expression (Enhancer, Promoter, Polyadenylations-Sequenzen) notwendigen Sequenzen.
Die derzeitig verfügbare Technologie ist jedoch nicht vollständig zufrieden stellend.
Einerseits verbleibt ein Disseminationsrisiko im Organismus. Somit kann eine im Organismus vorhandene Bakterie dieses Plasmid in niedriger Frequenz aufnehmen. Die Möglichkeit, dass dies geschieht, ist umso größer, als es sich um eine Gentherapiebehandlung in vivo handelt, bei der die DNA im Organismus des Patienten verstreut werden kann und mit Bakterien in Kontakt kommen kann, die diesen Patienten infizieren, oder auch mit Baktieren der symbiotischen Flora. Wenn die Empfängerbakterien des Plasmids eine Enterobakterie wie z. B. E. coli ist, kann sich dieses Plasmid replizieren. Ein derartiges Ereignis führt dann zur Dissemination des therapeutischen Gens. In dem Maße, wie die bei der Gentherapiebehandlung eingesetzten therapeutischen Gene z. B. ein Lymphokin kodieren können, könnte ein Wachstumsfaktor, ein Antionkogen oder ein Protein, dessen Funktion beim Wirt fehlt und daher die Korrektur eines Gendefekts erlaubt, die Dissemination einiger bestimmter dieser Gene unvorhersehbare und schwerwiegende Folgen haben (z. B. wenn eine pathogene Bakterie das Gen eines menschlichen Wachstumsfaktors erwerben würde).
Andererseits besitzen die im Allgemeinen in der nicht viralen Gentherapiebehandlung eingesetzten Plasmide auch einen Resistenzmarker für ein Antibiotikum (Ampicilin, Kanamycin, usw.). Die ein derartiges Plasmid erwerbende Bakterie hat daher einen nicht zu verleugnenden selektiven Vorteil, da jede ein Antibiotikum derselben Familie wie das das Resistenzgen des Plasmid auswählende Gen einsetzende Antibiotikatherapiebehandlung zur Auswahl des fraglichen Plasmids führen wird. In dieser Hinsicht gehört Ampicilin zu den β-Laktamen, die die weltweit am häufigsten eingesetzten Antibiotika sind. Der Einsatz von Selektionsmarkern bei Bakterien, die keine Resistenzgene gegen Antibiotika sind, wäre daher besonders vorteilhaft. Er würde die Auswahl von Bakterien verhindern, die ein einen derartigen Marker tragendes Plasmid haben aufnehmen können.
Es ist daher besonders wichtig, sich zu bemühren, so weit wie möglich die Dissemination von therpeutischen Genen und Resistenzgenen zu begrenzen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es insbesondere, neue, in der Gentherapie oder für die Herstellung von rekombinanten Proteinen in vitro einsetzbare DNA-Moleküle vorzuschlagen, die sich nur in Zellen replizieren, die bestimmte Funktionen dieser nicht viralen Träger komplementieren können.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine besonders wirkungsvolle Methode zur Herstellung dieser DNA-Moleküle.
Die beanspruchten DNA-Moleküle weisen den Vorteil auf, die mit einer Dissemination des Plasmids verbundenen Risiken zu eliminieren, wie z. B. (1) die Replikation und die Dissemination, die eine nicht kontrollierte übermäßige Expression des therapeutischen Gens nach sich ziehen können und (2) die Dissemination und die Expression von Resistenzgenen. Die in den erfindungsgemäßen DNA-Molekülen enthaltene genetische Information umfasst in der Tat ein/mehrere therapeutische(s) Gen(e) und die Regulationssignale seines/ihrer Expression, wobei ein funktionaler konditionaler Replikationsstartpunkt das zellulare Wirtsspektrum dieses Plasmids sehr stark einschränkt, wobei ein bevorzugt von einem Gen unterschiedlicher Selektionsmarker verringerter Größe, die bevorzugt unterschiedlich zu einem die Resistenz gegenüber einem Antibiokum verleiht, und ggf. ein die Resolution von Plasmidmultimeren erlaubendes DNA-Fragment. Die Wahrscheinlichkeit, dass diese Moleküle (und damit die genetische Information, die sie enthalten) auf einen Mikroorganismus übertragen und dauerhaft aufrecht erhalten werden, ist sehr begrenzt.
Schließlich weisen diese aufgrund ihrer zirkularen Struktur, ihrer verringerten Größe und ihrer supereingerollten Form auch als Miniplasmide bezeichneten erfindungsgemäßen Träger die folgenden zusätzlichen Vorteile auf: Aufgrund ihrer im Verhältnis zu den aus herkömmlicherweise eingesetzten ColE1 abgeleiteten Plasmiden verringerten Größe haben die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle potenziell eine bessere Biodisposition in vivo. Insbesondere weisen sie verbesserte zellulare Penetrations- und Verteilungskapazitäten auf. So wird anerkannt, dass der Diffusionskoeffizient in den Geweben zum Molekulargewicht umgekehrt proportional ist (Jain, 1987). Auch haben Moleküle mit einem hohen Molekulargewicht eine schlechtere Permeabilität durch die plasmische Zellmembran. Darüber hinaus ist das hohe Molekulargewicht beim zu seiner Expression unerlässlichen Durchgang des Plasmids durch den Kern ebenfalls einen Nachteil, da die nuklearen Poren bei der Diffusion zum Kern eine Größenbeschränkung erzwingen (Landford et al., 1986). Die Größenreduktion der nicht therapeutischen Teile des erfindungsgemäßen DNA-Moleküls (insbesondere Replikationsstartpunkt und Selektionsgen) erlaubt ebenfalls die Verringerung der Größe der DNA-Molekühle. Der die Replikation und die Selektion dieses Plasmids bei der Bakterie erlaubende Teil (1,1 kb) wird um einen Faktor 3 verringert, indem z. B. 3 kb für den Replikationsstartpunkt und den Resistenzmarker Vektorteil gezählt werden. Diese Verringerung (i) des Molekulargewichts und (ii) der negativen Ladung verleiht den erfindungsgemäßen Molekülen verbesserte Diffusions- und gewebemäßige, zellulare und nukleare Biodispositionskapazitäten.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein DNA-Molekül von zirkulärer Form, welches in der Gentherapie nützlich ist, umfassend wenigstens eine Nukelinsäuresequenz von Interesse und gleichfalls die Regulationssignale für deren Expression, deren Transkription und ggf. Translation in der eukaryotischen Zielzelle die Produkte mit einem therapeutischen, in Zusammenhang mit Impfungen bestehenden, landwirtschaftlichen oder veteinärmedizinischen Nutzen erzeugen, umfassend

a. die Region, welche dessen Replikator erlaubt, einen konditionalen (abhängigen) Replikationsstartpunkt umfasst, welcher aus einem Plasmid oder einem Bakteriophagen stammt, dessen Funktionalität in einer prokatyotischen Wirtszelle von wenigstens einem Replikationsintiationsprotein, welches für das Plasmid oder den Bakteriophagen spezifisch ist und in Bezug auf die prokaryotische Wirtszelle fremd ist, erfordert,
b. das DNA-Molekül das Replikationsinitiationsprotein nicht umfasst,
c. das DNA-Molekül einen Selektionsmarker von verringerter Größe, welcher von einem Gen, welches Resistenz gegen ein Antibiotikum verleiht, verschieden ist, umfasst und
d. das DNA-Molekül sich lediglich in Zellen, die das Initiationsprotein komplementieren können, repliziert.

Dieses DNAMolekül kann in einsträngiger oder doppelsträngiger Form auftreten und besitzt vorteilhaft eine supereingerollte Form.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung können die eingesetzten Wirtszellen verschiedenen Ursprungs sein. Es kann sich um eukaryotische oder prokaryotische Zellen handeln. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um prokaryotische Zellen.
Herkömmlicherweise erfordert die Replikation von Plasmidbakterien das Vorhandensein von wenigstens einem vom zellularen Wirt vom Polymerase-RNA-Typ kodierten Protein, NNase, Polymerase-DNA, usw. Aus den bereits zuvor dargelegten Gründen kann man bei diesem Replikationstyp eventuelle Disseminationsrisiken im behandelten Organismus nicht vollständig ausschließen. Die Funktionalität des Replikationsstartpunktes des erfindungsgemäßen DNA-Moleküls erfordert vorteilhaft das Vorhandensein eines spezifischen und der Wirtszelle fremden Proteins. Dieses Merkmal hat den Vorteil, das Wirtsspektrum des beanspruchten Plasmids auf spezifische, dieses Initiationsprotein ausdrückende Stämme zu reduzieren. Das im Rahmen der vorliegenden Erfindung dargelegte DNA-Molekül besitzt daher vorteilhaft einen so genannten konditionalen Replikationsstartpunkt.
Der erfindungsgemäß eingesetzte konditionale Replikationsstartpunkt kann aus Plasmiden oder Bakteriophagen stammen, die die folgenden Merkmale teilen: Sie enthalten in ihrem Replikationsstartpunkt wiederholte Sequenzen oder Iterone und sie kodieren wenigstens ein Replikationsprotein der Replikation, (Rep), das für sie spezifisch ist. Beispielhaft können konditionale Replikationssysteme der folgenden Plasmide oder Bakteriophagen genannt werden:
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung entstammt der in den beanspruchten DNA-Mokülen eingesetzte Replikationsstartpunkt aus einem als R6K bezeichneten natürlichen Plasmid von E. coli.
Die Replikationsfunktionen von R6K werden in einem DNA-Fragment von 5,5 kpb (1) mit 3 Replikationsstartpunkten α, β γ zusammengefasst (wobei γ und β 90% der Replikation gewährleisten) und einem die Replikationsinitiationsproteine π und das Protein Bis kodierenden Operon. Die für die Aufrechterhaltung dieses Plasmids in seiner charakterischen Anzahl von Kopien (15 Kopien pro Genom) notwendige minimale genetische Information ist in zwei Elementen enthaltenden. Die 400 pdb des Ori γ und des Gens Pir, deren Produkt das Initiationsprotein π ist.
Das Ori γ kann in zwei funktionale Teile dividiert werden: den Herzeil und das Aktivationselement (1). Der für die Replikation wesentliche Herzteil enthält die Iteronen (7 direkte Wiederholungen von 22 pdb), in denen sich das in der SEQ ID Nr. 1 repräsentierte Protein π bindet, und die flankierende Segmente, die Zielproteine des Wirts sind (IHF, DnaA).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Replikationsstartpunkt des beanspruchten Vektors ganz oder teilweise durch diesen Replikationsstartpunkt γ des Plasmids R6k und noch bevorzugter ganz oder teilweise durch die SEQ ID Nr. 1 oder einen ihrer Derivate gebildet.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff Derivat jede von der betrachteten Sequenz aufgrund einer Degeneration des genetischen Codes unterschiedliche, durch eine oder mehrere Modifikationen der genetischen und/oder chemischen Natur erhaltene Sequenz sowie jede mit diesen Sequenzen hybridisierende Sequenz oder Frequenzen davon und deren Produkt die hinsichtlich des Initiationsproteins der Replikation π angezeigte Aktivität besitzt. Unter Modifikation genetischer und/oder chemischer Art sind jede Mutation, Substitution, Deletion, Addition und/oder Modifikation eines oder mehrerer Rückstände zu verstehen. Der Begriff Derivat umfasst ebenfalls die zur betrachteten Sequenz homologen, aus anderen zellularen Stämmen und insbesondere aus Zellen menschlichen Ursprungs oder anderen Organismen stammende und eine Aktivität desselben Typs besitzende Sequenzen. Derartige homologe Sequenzen können durch Hybridisierungsexperimente erhalten werden. Die Hybridisierungen können ausgehend von Nukelinsäurebanken unter Verwendung von der nativen Sequenz oder einem Fragment davon als Sonde unter konventionellen Stringenzbedingungen (Maniatis et al., siehe allgemeine Techniken der Molekularbiologie) oder bevorzugt unter erhöhten Stringenzbedingungen realisiert werden.
Der oben beschriebene Replikationsstartpunkt, der den Vorteil aufweist, eine sehr eingeschränkte Größe zu haben, ist nur bei Vorhandensein eines spezifischen Initiationsproteins, des Proteins Pi, des Produkts des Gens Pir (SEQ ID Nr. 2) funktional. Da dieses Protein in trans wirken kann, kann das Ori Gamma des Gens Pir physisch abgetrennt werden, das in das Genom der als spezifischer Wirt dieser Plasmiden ausgewählten Zelle eingeführt werden kann. Mutationen in π können seine inhibierenden Funktionen beeinträchtigen (Inuzuka und Wada, 1985) und eine Erhöhung der Anzahl von Kopien der Derivate von R6K bis zum 10-fachen der ursprünglichen Anzahl der Kopien nach sich ziehen. Diese Substitutionen sind alle im Bereich von 40 Aminosäuren inbegriffen, der damit für die Kontrolle der Anzahl der Plasmidkopien durch π verantwortlich zu sein scheint (2).
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung resultiert das in der Wirtszelle ausgedrückte Protein π aus der Expression des in der SEQ ID Nr. 2 repräsentierten Gens oder eines seiner Derivate, wie z. B. zuvor definiert und ganz besonders des Gens Pir 116, das im Verhältnis zum Gen Pir eine Mutation enthält. Diese Mutation entspricht der Substitution eines Prolins durch ein Leucin. In diesem Zusammenhang liegt die Anzahl von Kopien der Derivate von R6K in der Größenordnung von 250 Kopien pro Genom.
Neben einem konditionalen Replikationsstartpunkt wie zuvor definiert enthalten die beanspruchten DNA-Moleküle einen ein (oder mehrere) die Gewährleistung der Selektion des DNA-Moleküls beim ausgewählten Wirt erlaubende(s) Gen(e) umfassenden Bereich.
Es kann sich um einen klassischen Marker vom eine Resistenz gegenüber einem Antibiotikum, wie z. B. Kanamycin, Ampicilin, Chloramphenicol, Streptomicyin, Lividomycin oder andere verleihenden Gentyp handeln.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist dieser Bereich jedoch um ein eine Resistenz gegenüber einem Antibiotikum verleihendes Gen unterschiedlich. Es kann sich somit um ein Gen handeln, dessen Produkt unter den definierten Kulturbedingungen zur Lebensfähigkeit des beabsichtigten Wirts unerlässlich ist. Es kann z. B. Folgendes sein:

– Ein einen tRNA-Suppressor kodierendes Gen natürlichen oder synthetischen Ursprungs. Es handelt sich besonders bevorzugt um ein tRNA-Amber-Codon (TAG).
– Ein Gen, dessen Produkt unter bestimmten Kulturbedingungen zum Metabolismus der Zelle notwendig ist: in der Biosynthese eines Metabolits (Aminosäure, Vitamin, usw.) intervenierendes Gen, die Assimilation einer im Kulturmilieu (besondere Stickstoff- oder Kohlenstoffquelle) vorhandenen Substanz erlaubendes Katabolismusgen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält dieser Bereich eine Expressionskassette eines eine Suppressor-tRNA spezifischer Codone kodierenden Gens. Dieses kann insbesondere aus denen ausgewählt werden, die die Phenylalmin-, Cystein-, Prolin-, Alanin- und Histidinbasen kodieren. Es handelt sich bevorzugt um eine Suppressor-tRNA der Amber-Codone (TAG).
In diesem besonderen Fall umfasst das zur Auswahl der DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung bei den zellulären Wirten verwendete System zwei Elemente: 1) auf dem DNA-Molekül eine Suppressor-Transfer-RNA des Amber-Codons (TAG) kodierendes Gen, das den Selektionsmarker bildet und als Gen (sup) bezeichnet wird und 2) ein spezifischer Wirt, dessen eines bei bestimmten Kulturbedingungen wesentliches Gen einen Amber-Codon TAG umfasst. Diese Zelle kann unter den Kulturbedingungen wachsen, für die das Produkt des den Codon TAG enthaltenen Gens wesentlich ist, nur wenn das die Expression von sup erlaubende Plasmid in der Zelle vorhanden ist. Die Kulturbedingungen bilden daher den Selektionsdruck des DNA-Moleküls. Die verwendeten Gene sup können natürlichen Ursprungs sein (Glass et al., 1982) oder aus synthetischen Konstruktionen stammen (Normanly et al., 1986; Kleina et al., 1990).
Ein derartiges System bietet insofern eine hohe Flexibilität, als es gemäß dem eine Amber-Mutation umfassenden Gen möglich ist, unterschiedliche selektive Milieus zu bestimmen. Bei der Bakterie Lactococcus lactis zum Beispiel ist der Amber-Codon in einem Biosynthesegen der Purine lokalisiert. Dies erlaubt die Selektion des Trägerplasmids des die Suppressor-rRNA kodierenden Gens, wenn die Bakterien sich in der Milch vermehren. Ein derartiger Marker hat den Vorteil, eine sehr verringerte Größe aufzuweisen und keine „fremdenden", aus Phagen oder Transposonen stammende Sequenzen aufzuweisen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung umfasst das DNA-Molekül darüber hinaus ein DNA-Fragment, ein ortsspezifisches Rekombinaseziel, das die Resolution der multimeren Plasmide erlaubt.
Somit erlaubt ein derartiges, in ein zirkuläres DNA-Molekül eingeführtes Fragment, dessen Replikationsstartpunkt z. B. Ori Gamma ist, die Auflösung der Multimeren eines derartigen Plasmas. Derartige Multimere werden insbesondere beobachtet, wenn das DNA-Molekül in einem ein mutiertes Allel von Pir tragenden Stamm hergestellt wird, das die Erhöhung der Anzahl von Kopien der Derivate von R6K, wie Pir-116, erlaubt.
Diese Rekombination kann dank diverser Systeme realisiert werden, die die ortsspezifische Rekombination zwischen den Sequenzen antreiben. Noch mehr bevorzugt wird die ortsspezifische Rekombination der Erfindung mittels spezifischer intramolekularer Rekombinationssequenzen erhalten, die zur Rekombination untereinander in Gegenwart von spezifischen, im Allgemeinen als Rekombinase bezeichneten Proteinen fähig sind. In diesem präzisen Fall handelt es sich um die Rekombinase XerC und YerD. Aus diesem Grund umfassen die DNA-Moleküle erfindungsgemäß im Allgemeinen darüber hinaus eine diese ortsspezifische Rekombination erlaubende Sequenz. Das in genetischen Konstruktionen erfindungsgemäß vorhandene Rekombinationssystem (Rekombinasen und spezifischer Erkennungsort) kann unterschiedlicher Herkunft sein. Insbesondere können die verwendeten spezifischen Sequenzen und Rekombinasen unterschiedlichen strukturellen Klassen angehören und insbesondere der Resolvasefamilie des Transposons Tn3 oder der Integrasefamilie des Bakeriophagen Lambda. Unter den zur Familie des Transposons Tn3 gehörenden Rekombinasen kann man insbesondere die Resolvase des Transposons Tn3 oder der Transposone Tn21 und Tn522 nennen (Stark et al., 1992); die Invertase Gin des Bakteriophagen mu oder auch die Resolvasen von Plasmiden, wie z. B. die des Fragments Par von RP4 (Abert et al., Mol. Microbiol. 12 (1994) 131). Unter den zur Familie der Integrase des Bakteriophagen X gehörenden Rekombinasen kann man insbesondere die Integrase der Phagen Lambda nennen (Landy et al., Science 197 (1977), P22 und φ80 (Leong et al., J. Biol. Chem., 260 (1985) 4468), HP1 von Haemophilus influenzae (Huser et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 6859), die Integrase Cre des Phagen P1, die Integrase des Plasmids pSAM2 ( EP 350 341 ) oder auch die FLP-Rekombinase des Plasmids 2 μ und die Rekombinasen XerC und YerD von E-coli.
Die DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung enthalten bevorzugt das Fragment cer des natürlichen Plasmids von E. coli Co1E1. Das verwendete Fragment cer ist ein Fragment Hpall von 382 pdb von ColE1, von dem nachgewiesen wurde, dass es in Cis die Resolution von Plasmidmultimeren erlaubte (Sommers et al., 1984; Leugn et al., 1985). Es ist ebenfalls möglich, ein Fragment Hpall-Tagl verringerter Größe (280 pdb) oder ein kleineres, im Fragment Hpall-Tagl inbegriffenes Fragment (rund 220 pdb) zu verwenden, die dieselben Eigenschaften besitzen (Sommers und Sherrat, 1988). Diese Resolution erfolgt über eine spezifische intramolekulare Rekombination, bei der vier durch das Genom von E. coli kodierte Proteine: ArgR, PepA, XerC und XerD zum Einsatz kommen (Stirling et al., 1988, 1989; Colloms et al., 1990; Blakely et al., 1993).
Diesbezüglich ist es ganz besonders vorteilhaft, das Fragment Cer von ColE1 oder eines seiner Derivate, wie zuvor definiert, zu verwenden.
Gemäß einer Ausführungsvariante können die DNA-Moleküle darüber hinaus eine zur spezifischen Interaktion mit einem Liganden fähige Sequenz umfassen. Es handelt sich bevorzugt um eine zur Bildung einer dreifachen Schraube mit einem spezifischen Oligonukleotid durch Hybridisierung fähigen Sequenz. Diese Sequenz erlaubt somit die Reinigung der Moleküle der Erfindung durch selektive Hybridisierung mit einem komplementären, auf einem Träger immobilisierten Oligonukleotid (siehe Patentantrag WO96/18744). Die Sequenz kann an jedem Situs des DNA-Moleküls der Erfindung positioniert sein, solange sie nicht die Funktionalität des Gens von Interesse und des Replikationsstartpunktes beeinträchtigt.
Als repräsentatives DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung kann man insbesondere das Plasmid pXL2774 und seine Derivate beanspruchen. Im Sinne der Erfindung wird unter Derivat jeden vom pXL2774 abweichenden und ein oder mehrere Gen(e) von Interesse außer dem Luciferasegen umfassende Aufbau verstanden. Genannt werden können ebenfalls die eine Expressionskassette eines therapeutischen Gens und eine zur spezifischen Interaktion mit einem Liganden fähigen Sequenz umfassende Plasmiden pXL3029 und 3030.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf die Ausarbeitung eines Verfahrens aus spezifischen zellulären Konstruktionswirten, die bei der Herstellung dieser therapeutischen DNA-Moleküle besonders wirksam sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Herstellungsverfahren von zirkularen DNA-Molekülen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Wirtszelle, welche wenigstens ein DNA-Molekül wie zuvor beschrieben, ein spezifisches und in Hinblick auf die Wirtszelle fremdes, in situ oder nicht in situ exprimierte Protein enthält, welches die Funktionalität des genannten DNA-Moleküls Replikationsstartpunktes unter den die Selektion der durch die genannten DNA-Moleküle umgewandelten Wirtszellen erlaubenden Bedingungen bedingt.
Besonders bevorzugt wird das die Funktionalität des Replikationsstartpunktes des DAN-Moleküls bedingende Protein in situ ausgehend von einem entsprechenden Gen ausgedrückt. Das das Initialisierungsgen der Replikation kodierende Gen kann durch ein angehängtes, mit den Derivaten des verwendeten konditionalen Replikationsstartpunktes kompatiblem Replikon getragen werden oder in das Genom der Wirtszelle durch Rekombinase dank eines Transposons, eines Bakteriophagen oder jedes anderen Vektors eingeführt werden. In dem besonderen Fall, in dem das das Protein ausdrückende Gen auf einem angehängten Replikon platziert ist, enthält dieses ebenfalls einen Promoter-Bereich der funktionalen Transkription, sowie einen sich in 3' befindenden Bereich, der ein Transkriptions-Endsignal spezifiziert. Bezüglich des Promoter-Bereichs kann es sich um einen natürlicherweise für die Expression des betrachteten Gens verantwortlichen Promoter-Bereich handeln, wenn dieser auch zum Funktionieren in der Zelle geeignet ist. Es kann sich ebenfalls um (für die Expression anderer Proteine verantwortliche oder sogar synthetische) Bereiche unterschiedlicher Herkunft handeln. Es kann sich insbesondere um Promoter-Sequenzen von prokaryotischen Genen oder Bakteriophagen handeln. Z. B. kann es sich um aus dem Genom der Zelle entstammende Promoter-Sequenzen handeln.
Als das Initialisationsprotein der Replikation kodierende Gene können entweder die Gene des Wildtyps oder mutierte Allele verwendet werden, die den Erhalt einer erhöhten Anzahl von Kopien der spezifischen Plasmide (oder Derivate) des die Funktionalität des im DNA-Molekül eingesetzten Replikationsstartpunktes bedingenden Initialisationsproteins erlauben.
Derartige Mutanten wurden insbesondere für die Plasmide R6K beschrieben (Inuzuka und Wada, 1985; Greener et al., 1990), Rts 1 (Terawaki und Itohl, 1985; Terawaki et al., 1990; Zeng et al., 1990) F (Seelke et al., 1982; Helsberg et al., 1985; Kawasaki et al., 1991) RK2 (Dulrand et al., 1990; Haugan et al., 1992, 1995) pSe101 (Xia et al., 1991; Goebel et al., 1991; Fang et al., 1993).
In dem besonderen Fall, in dem das eingesetzte DNA-Molekül einen vom Plasmid R6K abweichenden Replikationsstartpunkt besitzt, ist das Initialisationsprotein das Protein π desselben Plasmids oder weicht davon ab. Es ist besonders vorteilhaft, eine mutierte Form dieses zur erheblichen Erhöhung der Anzahl der ursprünglichen Kopien fähigen Proteins auszudrücken. Zu diesem Zweck ist das auf dem Niveau der Wirtszelle integrierte Gen bevorzugt ganz oder teilweise durch die in der SEQ ID Nr. 2 dargestellte Sequenz oder eines ihrer Derivate oder noch mehr bevorzugt durch das Gen Pir116 dargestellt. Die dmit verbundene Mutation entspricht der Substitution eines Prolins durch ein Leucin. Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird dieses Gen Pir116 direkt in das Genom der Wirtszelle integriert.
Eines der unter den ausgewählten Kulturbedingungen unerlässlichen Gene der spezifischen zellularen Wirtszelle enthält vorteilhaft einen spezifischen, durch den auf dem Niveau des DNA-Moleküls ausgewählten Suppressor-tRNA erkennbaren Codon. Gemäß einer bevorzugten Ausbildungsform der Erfindung handelt es sich um einen Amber-Codon TAG. In diesem besonderen Fall kann die Zelle unter den Kulturbedingungen wachsen, unter denen das Produkt des den Codon TAG enthaltenden Gens wesentlich ist, nur wenn das die Expression des sup erlaubende Plasmid in der Wirtszelle vorhanden ist. Die Kulturbedingungen bilden daher den Selektionsdruck des DNA-Moleküls.
Das den Amber-Code umfassende Gen ist bevorzugt ein in der Biosynthese einer Aminosäure wirkendes Gen, Arginin. Dieses Gen argE kodiert eine N-Acetylomithinase (Meinnel et al., 1992) und umfasst in diesem Fall ein einer punktuellen Mutation Gin-53 => CAG entsprechendes Codon TAG; der Selektionsdruck des das Gen sup tragenden Plasmids wird dann durch Kultur im Minimumilieu M9 gewährleistet (Maniatis et al., 1989). Das könnte jedoch z. B. auch ein Biosynthesegen eines Vitamins, einer Nukleinbase oder auch eines den Einsatz einer besonderen Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle erlaubenden Gens oder jedes anderen Gens sein, dessen Funktionalität für die zellulare Lebensfähigkeit unter den ausgewählten Kulturbedingungen unerlässlich ist.
Die Wirtszelle wird bevorzugt aus den Quellen E. coli ausgewählt und noch mehr bevorzugt aus dem Stamm E. coli XAC-1.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist die im beanspruchten Verfahren eingesetzte Wirtszelle eine Zelle des Stamms E. coli XAC-1, die in ihrem Genom das Gen Pir 116 umfasst und durch das Plasmid pXL2774 oder eines seiner Derivate umgewandelt wird.
Gemäß einer vorteilhaften Variante der Erfindung ist die im beanspruchten Verfahren eingesetzte Wirtszelle eine prokaryotische Zelle, in der das Gen endA1 oder ein homologes Gen inaktiviert ist. Das Gen endA kodiert die Endonuklease I von E. coli. Dieses periplasmische Enzym besitzt eine nicht spezifische Schnittaktivität der doppelsträngigen DNA (Lehrnan, I. R. G. G. Roussos und E. A. Pratt (1962) J. Biol. Chem. 237: 819–828; Wright M. (1971) J. Bacteriol. 107: 87–94). Eine an unterschiedlichen Stämmen von Escherichia coli (Wildtyp oder endA) durchgeführte Studie hat aufgezeigt, dass die Beschädigung der in den Extrakten dieser Bakterienstämme inkubierten Plasmid-DNA in den Stämmen endA+ existierte, aber nicht in den Mutanten endA (Wnendt S. (1994) BioTechniques 17: 270–272). Die Qualität der von den Stämmen endA+ oder den Mutanten endA isolierten Plasmid-DNA wurde von der Firma Promega unter Einsatz ihres Reinigungssystems studiert (Shoenfeld, T., J. Mendez, D. Storts, E. Portman, B. ✝ Patterson, J. Frederiksen und C. Smith, 1995. Effects of bacterial strains carrying the endA1 genotype on DNA quality isolated with Wizard plasmid purification systems. Promega notes 53). Ihre Schlussfolgerung lautet folgendermaßen: Die Qualität der ausgehend von Mutanten endA hergestellten DNA ist insgesamt besser als die der in den getesteten Stämmen endA+ hergestellten DNA.
Die Herstellungsqualität von Plasmid-DNA wird daher von jeder Kontamination durch diese Endonuklease beeinträchtigt (mehr oder weniger langfristige Beschädigung der DNA).
Die Deletion oder die Mutation des Gens endA kann problemlos in dem Maße in Betracht gezogen werden, wie die diese Endonuklease-Aktivität nicht mehr aufweisenden Mutanten sich global als Bakterien vom Wildtyp verhalten (Dürrwald, H. und H. Hoffman-Berling (1968) J. Mol. Biol. 34: 331–346).
Das Gen endA1 kann durch Mutation, vollständige oder teilweise Deletion, Disruption, usw. aktiviert werden. Die Inaktivierung des Gens endA des zur Herstellung von Plasmiden pCOR ausgewählten Stamms von E. coli kann insbesondere durch Transfer dank des Bakteriophages P1, der von Cherepanov und Wackernagel beschriebenen Deletion ΔendA::TC^R realisiert werden (Cherepanov, P. P. und W. Wackernagel. 1995, Gene disruption in Escherichia col: TC^R and KM^R cassettes with the option of Fip-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158: 9–1–4) oder durch Austausch des im Genom der Bakterie von Interesse vorhandenen Allels vom Wildtyp durch ein mutiertes oder deletiertes Allel endA, und zwar durch homologe Rekombination. Die Verwendung dieses Stammtyps im Rahmen der vorliegenden Erfindung erlaubt vorteilhaft die Verbesserung der Qualität der produzierten DNA.
Die Erfindung betrifft ebenfalls jede rekombinante, ein DNA-Molekül wie zuvor beschrieben enthaltende Zelle. Es kann sich um eine Zelle verschiedener Ursprünge, vom eurkaryotischen, prokaryotischen Typ, usw. handeln.
Diese Zellen werden durch jede dem Fachmann bekannte Technik erhalten, die das Einführen des genannten Plasmids in eine bestimmte Zelle erlauben. Es kann sich insbesondere um eine Transformation, eine Elektroporation, Konjugation, Fusion von Protoplasten oder jede andere, dem Fachmann bekannte Technik handeln.
Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle können in jeder Impfanwendung oder Gen- und Zelltherapie für den Transfer eines Gens auf einen Organismus, ein Gewebesoder eine bestimmte Zelle oder für die Herstellung von rekombinanten Proteinen in vitro verwendet werden.
Insbesondere können sie für eine direkte Verabreichung in vivo oder für die Modifikation von Zellen in vitro oder ex vivo zwecks ihrer Einpflanzung in einen Patienten verwendet werden.
In dieser Hinsicht betrifft ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung jede pharmazeutische Zusammensetzung mit wenigstens einem DNA-Molekül wie zuvor definiert. Dieses Molekül kann dort einem chemischen und/oder biochemischen Transfektionsvektor zugeordnet sein oder auch nicht. Es kann sich insbesondere um Kationen (Kalziumphosphat, DEAE-Dextran, usw.), Liposome, usw. handeln. Die damit verbundenen synthetischen Vektoren können Lipide oder kationische Polymere sein. Als Beispiele derartiger Vektoren kann man DOGS (Transfectam TM) oder DOTM (Lipofectin TM) nenne.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur topischen, oralen, parentalen, intranasalen, intravenösen, intramuskulären, subkutanen, intraokularen, transdermischen, usw. Verabreichung formuliert sein. Das beanspruchte Plasma wird bevorzugt in einer injizierbaren Form oder als Applikation verwendet. Es kann mit jedem pharmazeutisch akzeptablen Vektor für eine injizierbare Form vermischt werden, insbesondere für eine direkte Injektion im zu behandelnden Situs. Es kann sich insbesondere um sterile, isotinische Lösungen oder um trockene, insbesondere lyophilisierte Zusammensetzungen handeln, die durch Hinzufügen je nach Fall von sterilisiertem Wasser oder physiologischem Serum die Bildung von injizierbaren Lösungen erlauben. Es kann sich insbesondere um in Glukose oder Natriumchlorid gelöste Puffer Tris oder PBS handeln. Eine direkte Injektion in den betroffenen Bereich des Patienten ist interessant, denn sie erlaubt die Konzentration der therapeutischen Wirkung in das betroffene Gewebe. Die verwendeten Dosen können in Abhängigkeit von unterschiedlichen Parametern angepasst werden, insbesondere in Abhängigkeit des Gens, des Vektors, der verwendeten Verabreichungsmethode, der betroffenen Pathologie oder auch der Dauer der gewünschten Behandlung.
Die DNA-Moleküle der Erfindung können ein oder mehrere Gen(e) von Interesse umfassen, d. h. eine oder mehrere Nukleinsäure(n) (DNA, DNA, synthetische oder halbsysnthetische DNA, usw.), deren Transkription und eventuelle Translation in der Zielzelle Produkte mit einem therapeutischen, im Zusammenhang mit Impfungen bestehenden, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse generieren.
Zu den Genen mit therapeutischem Interesse kann man insbesondere die Enzyme, aus Blut abgeleitete Sequenzen, Hormone, Lymphokine kodierenden Gene nennen: Interleukine, Interferone, TNF, usw. (FR 9203120), Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter oder ihre Vorstufen oder Synthese-Enzyme, trophische Faktoren: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, usw., Alipolipoproteine: ApoAl, ApoAIV, ApoE, usw. (FR 93 05125), Dystrophin oder Minidystrophin (FR 9111947), Tumorsuppressogene: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, usw (FR 9304745), Gene, die bei der Blutgerinnung implizierte Faktoren kodieren: die Faktoren VII, VIII, IX, usw, Suizidgene: Thymidinkinase, Cytosindesaminase, usw. oder auch ganz oder teilweise ein natürliches oder künstliches Immunglobulin (Fab, ScFV, usw.) ein RNA-Ligand (WO 91/19813) usw. Das therapeutische Gen kann ebenfalls ein Gen oder eine Antisinnsequenz sein, deren Expression in der Zielzelle die Kontrolle der Expression der Gene oder die Transkription von zellularer m-RNA erlaubt. Derartige Sequenzen können z. B. in der Zielzelle in mit zellularer mRNA komplementärer RNA transkribiert werden und somit gemäß der im Patent EP 140 308 beschriebenen Technik ihre Translation in Proteine blockieren.
Das Gen von Interesse kann auch ein Impfgen sein, d. h. ein ein Peptid-Antigen kodierendes Gen, das fähig ist, zwecks Realisierung von Impfstoffen beim Menschen oder beim Tier eine Immunantwort zu generieren. Es kann sich insbesondere um spezifische Antigen-Peptide des Epstein Barr-Virus, des HIV-Virus, des Hepatitis B-Virus ( EP 185 573 ), des Virus der Pseudotollwust oder auch spezifischer Tumoren ( EP 259 212 ) handeln.
In den DNA-Molekülen der Erfindung enthält das Gen von therapeutischem, im Zusammenhang mit Impfungen, landwirtschaftlichem oder veterinärmedizinischem Interesse im Allgemeinen einen Promoter-Bereich der funktionalen Transkription in der Zelle oder dem Zielorganismus, sowie einen Bereich in 3', und der ein Transkriptionsendsignal und einen Polyadenylations-Situs spezifiziert. Hinsichtlich des Promoter-Bereichs kann es sich um einen natürlicherweise für die Expression des betrachteten Gens verantwortlichen Promoter-Bereich handeln, wenn dieser zur Funktion in der betroffenen Zelle oder dem betroffenen Organismus geeignet ist. Es kann sich ebenfalls um Bereiche unterschiedlicher Herkunft handeln (die für die Expression anderer Proteine verantwortlich oder sogar synthetisch sind). Es kann sich insbesondere um Promoter-Sequenzen von eukaryotischen oder viralen Genen handeln. Z. B. kann es sich um aus dem Genom der Zielzelle entstammende Promoter-Sequenzen handeln. Von den eukaryotischen Promotern kann man jeden Promoter oder jede abgeleitete Sequenz verwenden, der/die die Transkription eines Gens spezifisch oder unspezifisch, induktiv oder nicht induktiv, stark oder schwach stimuliert oder verhindert. Es kann sich insbesondere um ubiquitäre Promoter handeln (Promoter der Gene HPRT, PGK, α-Aktin, Tubulin, usw.), um Promoter der Zwischenfilamente (Promoter der Gene GFAP, Desmin, Vimentin, Neurofilamente, Keratin, usw.), Promoter von therapeutischen Genen (z. B. der Promoter der Gene MDR, CFTR, Faktor VIII, ApoAl, usw.), spezifische Gewebe-Promoter (Promotor des Gens Pyruvatkinase, Villin, intestinales Bindeprotein der Fettsäuren, α-Aktin des glatten Muskels, usw.) oder auch auf einen Stimulus reagierende Promoter (Rezeptor steroider Hormone, Rezeptor der Retinolsäure, usw.). Ebenso kann es sich um aus dem Genom eines Virus stammende Promoter-Sequenzen handeln, wie z. B. die Promoter der Gene E1A und MLP Adenovirus, der frühreife Promoter des CMV oder auch der Promoter des LTR des RSV, usw. Darüber hinaus können diese Promoter-Regionen durch Hinzufügen von Aktiviations-, Regulations- oder eine gewebespezifische oder mehrheitliche Expression erlaubende Sequenzen modifiziert werden.
Darüber hinaus kann das Gen von Interesse ebenfalls eine das synthetisierte Produkt in den Sekretwegen der Zielzelle leitende Signalsequenz umfassen. Diese Signalsequenz kann die natürliche Signalsequenz des synthetisierten Produkts sein, aber es kann sich auch um jede andere funktionale Signalsequenz oder eine künstliche Signalsequenz handeln.
Gemäß dem Gen von Interesse können die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle zur Behandlung oder zur Prävention zahlreicher Pathologien verwendet werden, unter Einschluss von genetischen Krankheiten (Dystrophie, zystische Fibrose, usw.), neurodegenerative Krankheiten (Alzheimer, Parkinson, ALS, usw.), Krebs, Pathologien im Zusammenhang mit Störungen der Blutgerinnung oder Dyslipoproteinämien, Pathologien im Zusammenhang mit Virusinfektionen (Hepatitis, AIDS, usw.) oder in den agronomischen und veterinärmedizinischen Bereichen, usw.
Im Übrigen betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls die Verwendung von DNA-Molekülen mit konditionaler Replikation für die Herstellung von rekombinanten Proteinen. Die Bakterien können zur Herstellung von Proteinen diversen, eukaryotischen oder prokaryotischen Ursprungs verwendet werden. Unter den Bakterien bildet E. coli aufgrund seiner leichten Handhabung, der hohen Anzahl von verfügbaren Expressionsystemen und erheblicher Mengen an Proteinen, die man erhalten kann, den zur Expression von heterologen Genen bevorzugten Organismen. Es versteht sich von selbst, dass das System der Erfindung in anderen Organismen einsetzbar ist, wobei der Tropismus wie zuvor angegeben durch die Art des Replikationsstartpunktes bestimmt wird. Für diese Verwendung umfasst die Nukleinsequenz von Interesse einen unter der Kontrolle von dem gewählten Wirt entsprechenden Expressionssignalen, insbesondere einem prokaryotischen Wirt, kodierenden Bereich. Es kann sich z. B. um die Promoter Plac, Ptrp, PT7, Ptrc, Ptac, PL, PR, die Sequenz Shine-Dalgamo, usw. handeln (Diese Struktur bildet die Expressionskassette). Die Nukleinsäuresequenz von Interesse kann jede ein ein Interesse im Bereich der Pharmazie, der Lebensmittelindustrie, der Chemie oder der Agrochemie aufweisendes Protein kodierende Sequenz sein. Es kann sich um ein Struturgen einer komplementären DNA-Sequenz, einer synthetischen oder halbsynthetischen Sequenz, usw. handeln.
Die Expressionskassette kann auf dem erfindungsgemäßen Vektor mit konditionaler Replikation eingeführt werden und somit einen die Expression von Proteinen von Interesse bei E. Coli erlaubenden Vektor mit konditionaler Replikation bilden. Dieser Vektor weist mehrere Vorteile auf: Keine Verwendung von Antibiotika zur Auswahl bei der Bakterie (niedrigere Kosten, keine Studie hinsichtlich des Vorhandenseins von Antibiotika im Endprodukt oder abgeleiteten, eventuell toxischen Produkten notwendig) Disseminationswahrscheinlichkeit des Plasmids in der Natur praktisch gleich null (konditionaler Replikationsstartpunkt), mögliche Fermentierung im total definierten Milieu. Die aufgezeigten Beispiele zeigen die vorteilhaften Eigenschaften dieser konditionalen Vektoren für die Herstellung von rekombinanten Proteinen.
Die vorliegende Erfindung wird weiter im Detail mithilfe der nachfolgenden Beispiele beschrieben, die als Verdeutlichung und nicht als Einschränkung zu verstehen sind.
Legende der Figuren
1: Funktionale Organisation des in der Replikation implizierten Bereichs von R6K.
2: Organisation der funktionalen Bereiche des Proteins π des Plasmids R6K.
3: Darstellung des Einführungsprotokolls des Gens Pir in das Genom von E. coli XAC1.
4: Aufbauschema der Vektoren pXL2666, 2730 und 2754
5: Aufbau des pXL2774.
6: Wachstums- und Herstellungskinetik im 21 Fermentator
7: Wachstums- und Herstellungskinetik im 800 1 Fermentator
8: Aufbau des pXL3056.
9: Verdeutlichung des durch E. coli XAC-1Pir-11 hergestellten Proteins aFGF (pXL305b+PT7po123) nach Induktion. Die gesamten denaturierten Zellextrakte werden auf Polyacrylamidgel 12,5% SDS M: molekularer Massemarker abgesetzt (Biorad. Low range). Jedes Band wird durch einen Pfeil und eine Ziffer identifiziert, die seine Masse in kDaltons angibt. 1:XAC-1Pir-11 (pXL3056+pUC4K) nicht induziert; 2: XAC-1Pir-116 (pXL3056+pUC4K) induziert bei 42°C; 3:XAC-1Pir-116 (pXL3056+PT7po123) Klon 1, nicht induziert; 4: XAC-1Pir-116 (pXL3056-PT7po123) Klon 1, induziert bei 42°C; 5: XAC-1PIr-116 (pXL3056+PT7po123) Klon 2, nicht induziert; 6: XAC-1Pir-116 (pXL3056+PT7po123) Klon 2, induziert bei 42°C; tl: 1 μg von gereinigtem aFGF; t4: 4 μg von gereinigtem aFGF.
10: Aufbauschema der Vektoren pXL3029 und pXL3030.
I. – MATERIAL UND METHODEN
A) Material
1) Kulturmilieu
Die vollständigen Milieus LG, 2XTY und SOC, das Minimummilieu M9 (Maniatis et al., 1989) wurden verwendet. Die Agar-Agar-Milieus wurden durch Hinzufügen von 15 g Agar Difco erhalten. Darüber hinaus wurden diese Milieus, wenn notwendig, mit Antibiotika, Ampicilin oder Kanamycin, in jeweiligen Konzentrationen von 100 mg/l und 50 mg/l vervollständigt. Die chromogenen Substrate X-Gal und X-Gluc wurden in der Konzentration von 40 mg/l verwendet.
2) E. coli-, Plasmid- und Bakteriophagen-Stämme
Die verwendeten E. coli-, Plasmid- und Bakteriophagen-Stämme wurden jeweils in den nachstehenden Beispielen identifiziert.
B) Methoden
1) Handhabung der DNA
Die Isolation von bakterieller (Plasmid-, genomischer) und phagischer (Replikationsform von M13) DNA, die Verdauung durch die Restriktions-Endonuklease, die Fragmentligaturen der DNA, die Elektrophorese im Agaraose-Gel (als TBE-Puffer) und andere Standardtechniken wurden gemäß den Empfehlungen der Hersteller zur Verwendung von Enzymen oder unter Beachtung der in „Molecular Cloning: a Laboratory Manual" (Maniatis et al., 1989) beschriebenen Protokolle realisiert.
Die bei der Elektrophorese eingesetzten DNA-Größenmarker waren folgende: Maßstab 1 kpb (BRL) für die linearen Fragmente und den überaufgerollten DNA-Marker (Strategène) bei den nicht verdauten Plasmiden.
Die Sequenzierung wurde gemäß der an die Dideoxynukleotide Fluroreszente verwendende automatisierte Methode angepasste Technik von Sangar (Sangar et al., 1977) und die Tag Polymerase-DNA (PRISM Ready Reaction DyeDideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems) realisiert.
Die verwendeten Oligodesoxynukleotide (bezeichnet als „Seq + Nr.", siehe nachstehend) wurden auf dem Synthetisator „Applied Biosystems 394 DNA/RNA" durch die Methode der Phosphoramiditen unter Hinzuziehung von β-Cyanoehtyl-Schutz-Gruppierungen (Sinha et al., 1984) synthetisiert. Nach der Synthese wurden die Schutz-Gruppierungen durch Behandlung mit Ammoniak eliminiert.
Zwei Ausfällungen mit Butanol erlauben die Reinigung und die Konzentration von Oligonukleotiden (Sawadogo et al., 1991).
Sequenz der zur Verstärkung von PCR verwendeten Oligonukleotiden

SEQ ID NR. 3 5'-GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3'
SEQ ID NR. 4 5'-GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC3'
SEQ ID NR. 5 5'-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3'
SEQ ID NR. 6 5'-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3'

Die Reaktionen von PCR (Saiki ete al., 1985) wurden unter den folgenden Bedingungen in einem Gesamtvolumen von 100 μl realisiert. Die Reaktionsmischung umfasst 150 ng genomische DNA des zu untersuchenden Stamms, 1 μg jedes der beiden Oligonukleotid-Ansätze (24-mer), 10 μl Puffer 10XPCR, dessen Zusammensetzung die folgende ist „500 mM KCl, 0,1% Gelatine, 20 mM MgCl₂, 100 mM Tris-HCL pH 7,5" und 2,5 Einheiten Taq Polymerase-DNA (Amplitaq Perkin-Elmer). Die PCR-Bedingungen auf dem Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler-Gerät sind die folgenden: 2 Min. bei 91°C, 30 aufeinander folgende Denaturierungszyklen (1 Min. bie 91°C), Hybridisierungszyklen (2 Min. bei 42°C) und Elongationszyklen (3 Min. bei 72°C) und schließlich 5 Min. bei 72°C. Die so erhaltenen, durch ein Restriktionsenzym verdaute oder nicht verdaute Produkte werden durch Elektrophorese auf Agarose-Gel analysiert.
Die Analyse der unterschiedlichen Plasmidarten durch die DNA-Topo-Isomerase wurde gemäß dem folgenden Protokoll realisiert: Die im Labor gereinigten Enzyme werden 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsmischungen (Gesamtvolumen: 40 μl) haben die folgende Zusammensetzung: 150 ng Plasmid, 300 ng DNA-Topo-Isomerase I oder 150 ng DNA-Gyrase von E. Coli oder 160 ng von DNA-Topo-Isomerase IV von S. aureus und 20 μl spezifischer Puffer jedes Enzyms. Die Zusammensetzung dieser Puffer wird nachstehend angegeben:
Bei DNA-Topo-Isomerase 1: 50 mM Tris-HCL pH 7,7, 40 mM KCL,
1 mM DTT, 100 μg/ml SAB, 3 mM Mg Cl₂, 1 mM EDTA;
Bei DNA-Topo-Isomerase IV: 0 mM Tris-HCL pH 7,7, 6 mM McCl₂,
10 mM DTT, 100 μg/ml SAB, 1,5 mM ATP,
350 mM Kaliumglutamate
Bei DNA-Gyrase: 50 mM Tris-HCL ph 7,7, 5 mM McCl₂, 1,5 mM ATP, 5 mM DTT, 100 μg/ml SAB, 20 mM KCl.
2) Umwandlung von E. coli
Sie wurde routinemäßig gemäß der von Chung und Miller (1988) beschriebenen Methode TSB (Transformation and Storage Buffer) realisiert. Durch einen Stamm wie TG1 (Gibson et al. 1984) bewegt sich die Wirksamkeit der erhaltenen Umwandlung in der Größenordnung von 10⁵–10⁶ Transformanden per μg pUC4K (Vieira und Messing; 1982). Wenn eine höhere Umwandlungswirksamkeit notwendig war, wurden die Bakterien durch Elektroporation gemäß dem durch den Hersteller des Elektroporators (Biorad) empfohlenen Protokoll umgewandelt. Diese Methode erlaubt die Erreichung von wirksamkeiten von 10⁸ bis 10¹⁰ Transformanden per μg pUC4K.
3) Durch ein kationisches Lipofektin vermittelte zellulare Transfektion
Die verwendeten Zellen sind Mäuse-Fibroblasten NIH 3T3, die am Vortag in Schälchen mit 24 Vertiefungen in einer Dichte von 50.000 Zellen pro Vertiefung eingeimpft wurden. Das verwendete Kulturmilieu ist das 4,5 g/l Glukose enthaltende, mit 10% fötalem Kalbsserum und 1% Glutaminserum 200 mM und Antibiotika (Streptomycin 5.10³, Penicilin 5.10³ μg/ml) (Gibco) vervollständigte Milieu DMEM. Die Plasmid-DNA (1 μg in 25 μg NaCl 9‰) wird Volumen für Volumen einer Lipofektanz-Suspension zugemischt. Es werden vier Verhältnisse „Lipofektant-Charge/DNA-Charge" getestet: 0, 3, 6 und 9. Diese Verhältnisse werden unter Berücksichtigung der Tatsache berechnet, dass 1 μg Plasmid-DNA 3,1 nMol negativer Charge trägt und dass der Lipofektant 3 positive Chargen pro Molekül trägt. Nach einem die Bildung des Komplexes DNA/Lipid erlaubenden Kontakt von 10 Minuten werden 50 μg der Mischung DNA-Lipofektant auf die Zellen im Kulturmilieu ohne Serum (500 μl) eingeführt. Die Zellen wurden zuvor 2 Mal mit demselben Milieu gespült. Die Inhibition der Transfektion durch das Serum wird somit vermieden. Nach der Inkubation (2 Stunden bei 37°C im Inkubator mit CO₂) wird das Milieu zu 10% fötalem Kalbsserum hinzugefügt. Anschließend werden die Zellen wieder für 24 Stunden in den Inkubator zurückgegeben.
4) Messung der Luciferase-Aktivität von eukaryotischen Zellen
Sie wird 24 Stunden nach der Transfektion durchgeführt. Die Luciferase katalysiert die Oxydation des Luciferins in Gegenwart von ATP, Mg⁺² und O₂ mit gleichzeitiger Herstellung eines Photons. Die durch einen Luminometer gemessene gesamte Lichtemission ist proportional zur Luciferase-Aktivität des Musters. Die verwendeten Reagenzien werden von Promega (Luciferase assay system) geliefert und gemäß dem empfohlenen Protokoll verwendet. Nach der Lyse der Zellen wird die unlösliche Fraktion jedes Extrakts durch Zentrifugieren eliminiert. Die Dosierung wird auf 5 μg im Lysepuffer der Zellen gelösten oder ungelösten Überstand durchgeführt.
3) Messung der proteinartigen Konzentration der Zellextrakte
Sie erfolgt gemäß der Methode BCA (Pierce) unter Hinzuziehung von Bicinchoninsäure (Wiechelman et al., 1988). Die Referenzreihe von SAB wird im Lysepuffer (siehe III-B-4) realisiert. Die zu dosierenden Muster und die der Reihe werden 1 Stande lang bei 37°C Volumen für Volumen mit dem Iodoacetamid 0,1 M/Puffer Tris 0,1 M ph 8,2 vorbehandelt. Diese Behandlung erlaubt bei der Dosierung die Vermeidung der Interferenz des im Lysepuffer vorhandenen Reduktionsmittels (DTT). Die Lektüre der Dosierung erfolgt bei 562 nm.
BEISPIEL 1
Aufbau von Wirtsstämmen XAC-1Pir et Pir-116 durch homologe Rekombination
Der eingesetzte Stamm ist der Stamm E. coli XAC-1 (Normanly et al., 1980. Vorteilhaft umfasst dass Gen argE dieses Stamms eine Glutamin-53-Mutation (CAG) im Amber-Codon (TAG) (Meinnel et al., 1992)). Das Gen argE gehört zur abweichenden Operation argECBH und kodiert ein Biosynthese-Enzym des Arginins, das N-Acetylomehtiniase. XAC-1 kann daher das Arginin nicht synthetisieren, und infolgedessen im Minimummilieu wachsen. Diese Auxotrophie wird aufgehoben, wenn der Stamm ein die Expression einer Suppressor-tRna erlaubendes Plasmid beherbergt. Dann ist es also möglich, durch Kultur im Minimummilieu die Bakterien auszuwählen, die ein derartiges Plasmid tragen. Um dort die Replikation von von R6K abgeleiteten Plasmiden zu erlabuen, war es notwendig, durch homologe Rekombinase das Gen Pir in das Genom von XAC-1 einzuführen. Das Gen Pir (Wildform oder mutierte Form) wird im Locus uidA durch Austausch zwischen dem Gen uidA der Wildform und einer durch das Gen Pir (oder Pir-116) unterbrochene Kopie eingefügt. Das Gen uidA kodiert eine β-Glukuronidase, ein Hydrolyse-Enzym der β-Glukuroniden. Dieses Gen kann ohne Probleme inaktiviert werden, da es in den klassischen synthetischen Milieus, in denen die β-Glukuroniden nicht verwendet werden, für das Wachstum nicht wesentlich ist. Darüber hinaus kann die β-Glukuronidase-Aktivität dank eines chromogenen Substrats, dem X-Gluc, dessen Hydrolyse ein blaues Pigment freisetzt, verfolgt werden.
1) Aubau eines die Kassette „Km^R -uidA::Pir (oder Pir-116) tragenden Suizidvektors
Wir haben eine einen einzigen Bakterienwirt implizierende Strategie angewendet, indem wir die Modifikationen des Genoms der Stammes von Interesse minimiert haben. Der Phage M13mp10 (Messing et Vieira: 1982) wurde als Suizidvektor verwendet (Blum et al., 1989). Eine für die Replikation wesentliche Amber-Mutation im Gen II verringert das Wirtsspektrum dieses M13 auf die Stämme, wie z. B. TG1 (supE). Die eine Amber-Suppressor-tRNA produzieren; es kann sich daher in den Stämmen E. coli sup+, wie XAC-1 nicht replizieren.
Die das Resistenzgen gegenüber Kanamycin von Tn5 und _uidA::Pir oder Pir-116 enthaltende Kassetten BamHl von 3,8 kpb wurden jeweils ausgehend von M13sm34 und 33 (Metacalf et al., 1994) gereinigt. Sie wurden in durch BamHl linearisiertem M13mp10 geklont. Die rekombinanten Klone wurden nach Elektroporation im TG1 der Ligatur-Mischungen durch Verstreichen auf dem Agar-Agar-Milieu LB + m ausgewählt. Die Konformität der erhaltenen Klone wurde durch Analyse des Restriktionsprofils und durch Sequenzierung des der Mutation Pir-116 entsprechenden Bereichs erhalten.
2) Einführung durch homologe Rekombinase der Gene Pir oder Pir-116 im Genom von E. coli XAC-1
Die angesetzte Strategie und die unterschiedlichen implizierten Ereignisse werden in 3 dargestellt.
a) Erstes Rekombinations-Ereignis
Der Stamm XAC-1 wurde durch Eleketroporation mit 10, 100 oder 2000 ng jedes RF (mp^10– _uid4::Pir oder Pir-116) umgewandelt. Ein Drittel jeder Expressionsmischung wurde auf Kanamycin enthaltenen, nachts bei 37°C inkubierten Schachteln verteilt. Die Phagen mp^10– -uidA::Pir oder Pir-116 können sich in dem Stamm XAC-1 (sup+) nicht replizieren. Der Marker KM^R kann sich daher nur durch Integration im Genom der Bakterie über eine homologe Rekombinase mit der Kopie des Wildtyps des Gens uidA halten. Die Ergebnisse der Elektroporation von XAC-1 werden in der Tabelle 1 dargestellt. Die erhaltene Umwandlungseffizienz betrug 4.10⁹ Transformanden pro μg pUC4K.
TABELLE 1
Unter den getesteten Bedingungen wächst die Integrantenanzahl nicht linear mit der DNA-Menge. Wenn man die Umwandlungseffizienz und die Größe der RF (11,7 kpb) kennt, kann man den ungefähren Rekombinationsgrad abschätzen. Unter Berücksichtigung des Punkts bei 100 ng erhält man eine Rekombinationsfrequenz in der Größenordnung von 10^–6.
b) Zweites Rekombinations-Ereignis
Das zweite Rekombinase-Ereignis wird anschließend durch die Resistenz der Stämme gegenüber Desoxycholat (Doc^R) ausgewählt.
Zu diesem Zweck wurden 5 Integranten jedes Aufbaus im Milieu 2XTY kultiviert, dem 0,2% Natrium-Desoxycholat hinzugesetzt wurden. Es sind zwei unterschiedliche Populationen aufgetreten. Einige Klone führen nach rund 8 Stunden bei 37°C zu einer gut sichtbaren Trübung (zwei Klone bei dem Aufbau Pir und drei bei dem Aufbau Pir-116). Die anderen Klone haben eine dichte Kultur erst nach der Nacht bei 37°C ergeben. Sie waren praktisch alle Km^s, wie erwartet. Bei jedem der geprüften Elektroporanden wurden 50 Nachkommen Km^s auf LB gestrichen, dem X-Gluc hinzugefügt wurde. Nach 48 Stunden bei 37°C waren die Klone UidA+ hellblau, während die, die einem Allelaustausch unterzogen worden waren (Fall Nr. 1, 3), auf diesem Milieu (UidA) weiß geblieben sind. Tabelle 2 fasst die Phänotypanalyse der erhaltenen doppelten Rekombinanten zusammen.
18 bis 30% der doppelten Rekombinanten wurden einem Allelaustausch unterzogen.
TABELLE 2
3) Kontrolle des Merkmals Pir+ der durch Rekombination erhaltenen Stämme
Um sich des Merkmals Pir+ der durch doppelte Rekombinatione erhaltenen Stämme zu vergewissern, haben wir von jedem Aufbau durch pBW30 drei Klone umgewandelt (Metcalf et al., 1994). Der Erhalt von Transformanden bei allen getesteten Stämmen hat es ermöglicht, die Funktionalität der in das Genom von XAC-1 integrierten Gene Pir und Pir-116 aufzuzeigen. Unter denselben Bedingungen wird keinerlei Umwandlung mit dem Elternstamm XAC-1 erhalten. Wir haben die Studie mit 2 Klonen XAC-1Pir (B und C) und 2 Klonen XAC-1Pir-116 (E und D) fortgesetzt.
4) Kontrolle durch Verstärkung der durch Rekombinase erhaltenen Stämme durch PCR
Zur Bestätigung des Allelaustauschs haben wir die Genombereiche auf jeder Seite des Locus uidA durch Verstärkung durch PCR kontrolliert. Jedes Oligonukleotidenpaar wird durch ein einem internen Bereich von Pir entsprechenden Bereich und einem zweiten, einem dem chromosomischen uidA nahen, jedoch nicht im Fragment, das zur Rekombination gedient hat, inbegriffenenBereich entsprechenden Oligonukleotiden gebildet. Die Sequenz dieses letzteren Oligonukleotids wurde dank der Sequenz ECOUIDAA von Genbank (Zugangsnummer: M14641) bestimmt. Somit konnten wir die genaue Positionierung des Gens Pir im Genom der Bakterie überprüfen. Die Art der verstärkten Fragmente, deren Größe mit der konform ist, die vorausgesehen werden konnte, wurde durch Verdauung durch MluI bestätigt.
BEISPIEL 2
Aufbau von aus den Selektionsmarker sup Phe tragendem R6K abgeleiteten Plasmidvektoren
Wir haben Vektoren mit dem Ori γ von R6K und dem Resistenzgen gegenüber Kanamycin (pXL2666) aufgebaut. Die Beobachtung von Multimeren von pXL2666 im Stamm BW19610 (Pir-116) 5 (Metcalf et al.; 1993) hat uns dazu gebracht, die Wirkung des Fragments cer von ColE1 auf diesem Phänomen zu prüfen. Anschließend haben wir auf dem Vektor Ori γ-Km^R-cer (pXL2730) die Expressionskassette von der Suppressor-tRNA Phenylalanin (sup Phe) eingeführt. Dieser Vektor pXL2760 dient als Basis für den Aufbau von in der Gentherapie verwendbaren Vektoren.
1) Aufbau und Analyse der das Ori γ von R6K und das Resistenzgen gegenüber Kanamycin umfassenden Vektoren
a) Aufbau
In dem ersten aufgebauten Plasmid pXL2666 entstammt das Resistenzgen gegenüber Kanamycin aus pUC4K (Vieira und Messing; 1982) und der in einem Fragment EcoR1-BamHl von 417 pdb enthaltene Replikationsstartpunkt entstammt aus dem Suizidvektor pUT-T7pol (Herrero et al., 1990) (4). Der Transfer von pXL2666 in den Stämmen BW19094 und 19610 (Metcalf et al., 1994) hat es erlaubt, aufzuzeigen, dass die Plasmidmenge in einem Stamm Pir-116 im Verhältnis zu demselben Plasmid in einem Stamm Pir deutlich erhöht ist. Die Analyse der nicht verdauten Plasmide durch Elektrophorese zeigt jedoch, dass diese Erhöhung mit dem Auftreten von einigen multimerischen Formen einhergeht. Dieses Phänomen ist wahrscheinlich mit einer intermolekularen Rekombinase zwischen den multiplen Kopien des Plasmids verbunden. Daher haben wir pXL2730 durch Klonen auf pXL2666 des Fragments cer des natürlichen Plasmids von E. coli ColE1 aufgebaut, von dem erwiesen ist, dass es in cis die Resolution der Plasmiddimere erlaubt (Sommers und Sherrat, 1984). Das eingesetzte Fragment entspricht einem Fragment Hpall von 382 pdb von ColE1 (Leung et al., 1985). Es enthält einen spezifischen intermolekularen Rekombinase-Situs; es impliziert, um funktional zu sein, nur Proteine des Wirtes, deren Rekombinasen XerC und XerD und die Zubehörfaktoren ArgR und PepA (Stirlung et al., 1988, 1989; Colloms et al., 1990) (Verb fehlt). Um sich zu vergewissern, dass die beobachteten Wirkungen effektiv auf das Fragment cer zurückzuführen sind, haben wir auch das Kontrollplasmid pXL2754 aufgebaut, in dem das Fragment cer von 165 pdb deletiert ist. Es wurde nachgewiesen, dass diese Deletion die Wirkung von cer auf die Resolution der Multimere abschafft (Leung et al., 1985). Die unterschiedlichen, zum Aufbau dieser Plasmide führenden Klonierungsstufen werden in 4 dargestellt.
b) Quantitative und qualitative Analysen der Plasmidarten
* Analyse durch Elektrophorese in Agarosegel
Die Analyse durch Elektrophorese der unterschiedlichen aufgebauten Plasmide hat den Nachweis verschiedener, gemäß den eingesetzten Stämmen variablen Plasmidarten erlaubt. Die Größe der nicht verdauten Plasmide wurde im Verhältnis zum übereingerollten DNA-Marker bewertet. In dem Stamm Pir (BW19094) weisen die Plasmide pXL2666, 2574 und 2730 praktisch vollständig eine monomerische Form auf. Die Bänder über jedem Hauptband entsprechen unterschiedlichen, etwas weniger übereingerollten Topo-Isomeren, wie das nach der Wirkung der DNA-Gyrase mit pXL2730 beobachtete Profil bestätigt.
Bei dem Stamm Pir-116 (BW19610) sind die Profile unterschiedlich: Bei den Plasmiden pXL2666 und 2754 beobachtet man unterschiedliche, vom Monomer bis zu Multimeren (2, 3 oder 4 Einheiten) reichende Arten, wobei die häufigste Form das Dimer ist. Nach der Verdauung durch EcoRi bleibt nur noch das lineare DNA-Plasmid übrig; diese Plasmidarten entsprechen entweder Plasmidmultimeren oder diversen Topo-Isomeren. Da die nach dem übereingerollten DNA-Marker bestimmte Größe der Formen ein vollständiges Produkt der Größe des Momomerplasmids ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass es sich um Multimere handelt. Die Bildung von Multimeren ist höchstwahrscheinlich auf die Mutation Pir-116 zurückzuführen, obwohl die beiden Stämme BW19094 und BW19610 nicht streng isogen sind (BW19610 ist recA). Das mit pXL2730 erhaltene Profil ist unterschiedlich: Obwohl Multimerformen immer noch sichtbar sind, ist die häufigste Form die Monomerform. Das Fragment cer kann daher die Resolution der Plasmidmultimere erleichtern, die wir aufgebaut haben, und zwar auf von recA in BW19610 unabhängige Weise.
* Analyse nach Behandlung mit der Topo-Isomerase-DNA
Um die Hypothese auszuschließen, nach der die in den das Allel Pir-116 tragenden Stämmen beobachteten Formen besondere Topo-Isomere sind, wurde jede Plasmidherstellung der Wirkung von Topo-Isomerase-DNA unterzogen. Die Aktivitäten der unterschiedlichen Enzyme unter den Versuchsbedingungen sind die folgenden: Lösung der DNA bei der Topo-Isomerase-DNA 1 von E. coli, negatives Überaufrollen der gelösten DNA bei der Gyrase-DNA von E. coli und Entflechtung der ineinander verwickelten DNA und Lösung der überaufgerollten Topo-Isomerase-DNA IV von S. aureus. Die Wirkung der Topo-Isomerase-DNA IV hat erlaubt aufzuzeigen, dass die Plasdmidformen mit hohem Molekulargewicht nicht aus der Verflechtung mehrerer Plasmidmoleküle resultierten; in diesem Fall wären sie dann in die Monomerart konvertiert. Die Funktionalität des Enzyms wurde selbstverständlich auf einem aus verflochtenen DNA-Molekülen bestehenden (nicht dargestellten) Präparat aus Kinetoplast-DNA kontrolliert. Die Lösungsaktivität ist ebenfalls sichtbar, da Arten erhalten werden, die weniger migrieren als in den nicht behandelten Kontrollelementen. Die Wirkung der Gyrase-DNA hat das Konvertieren der in der am stärksten überaufgerollten, aus der Bakterie extrahierten (hauptsächlich monomerischen oder dimerischen) hier leicht gelösten Topo-Isomere erlaubt. Darüber hinaus hat sie die Überprüfung erlaubt, dass die hergestellte DNA in den meisten Fällen in überaufgerollter Form erscheint. Die so behandelten Muster erlauben die Bestätigung der vorherigen Ergebnisse hinsichtlich der mehrheitlichen Arten bei jedem Aufbau. Die Topo-Isomerase-DNA I hat die DNA effektiv gelöst, aber nur teilweise. Dies könnte auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass die untersuchten Plasmide nur wenige einsträngige Bereiche umfassen, auf denen sich dieses Enzym bevorzugt bindet (Roca, 1995).
2) Einführung des Selektionsmarkers sup Phe auf pXL2730
Wir haben die Expressionskassette des synthetischen Suppressor-tRNA-Gens verwendet (Klein et al., 1990). Dieses führt in der sich bildenden Polypeptidkette ein Phenylalanin als Antwort auf einen Codon TAG ein. Darüber hinaus erlaubt es die Herstellung eines ausreichend aktiven Proteins ArgE in XAC-1, um ein gutes Wachstum im argininarmen Milieu zu erlauben. Auf dem Plasmid pCT-2-F (Normanly et al., 1986) wird sup Phe auf konstitutive Weise ausgehend von einem von der Sequenz des Gens Ippf von E-coli, P_lpp, abgeleiteten synthetischen Promoter ausgedrückt. Unterhalb dieses Gens wird die Beendigung der Transkription durch den synthetischen Terminator des Operons rrnC von E coli, T_mC gewährleistet (Normanly et al., 1986). Die unterschiedlichen Klonstufen werden in 5 aufgezeigt.
Die unterschiedlichen Unter-Klonierungen wurden in XAC-1 realisiert. Die Funktionalität der Expressionskassette der Suppressor-tRNA wird somit dank der Aktivität β-Galactosidase dieses Stamms kontrolliert, die nur existiert, wenn das Amber-Codon des Gens lacZ_u118am unterdrückt wird. Die letzte Stufe besteht aus der Einführung der Expressionskassette von sup Phe auf pXL2730. Die mit dem Fragment cer (B-1-b) erhaltenen Ergebnisse haben uns dazu veranlasst, dieses Plasmid zu wählen anstatt pXL2666. Das Resistenzgen gegenüber Kanamycin haben wir zum späteren leichteren Klonen aufbewahrt, insbesondere, um beim endgültigen Klonen über eine zusätzliche Sortierung zu verfügen (Verlust von Km^R).
BEISPIEL 3
Validierung des Plasmidvektors bei Anwendungen in der Gentherapie durch Transfektion von Mäuse-Fibroblasten
1) Aufbau des Prüfvektors pXL2774
Zum Testen der Gültigkeit der Gentherapie des Herstellungssystems der Plasmid-DNA haben wir auf pXL2760 ein in den eukaryotischen Zellen einsetzbares Prüfgen eingeführt. Wir haben dieses die Luciferase von Photinus pyralis kodierende Gen Luc verwendet, denn der Biolumineszenztest ist sehr sensibel, linear über ein breites Spektrum, und das auf die endogene Aktivität der eukaryotischen Zellen zurückzuführende Hintergrundgeräusch ist sehr schwach. Das Gen Luc ist unter Kontrolle der Verstärker-Promoter-Sequenzen eines frühreifen Gens des menschlichen Cytomegalovirus (Promoter CMV), das eine Expression hohen Grades erlaubt. In 3' von Luc befindet sich ein nicht übersetzter, aus dem Virus SV40 stammender Bereich, welches das Polyadenylationssignal (pol(A)+) enthält. Nach einem die Erhöhung der Anzahl von verfügbaren Restriktions-Loci erlaubenden Zwischenklonen wird die „Promoter"Kassette CMV-Luc-Poly(A)+" auf dem minimalen Vektor Ori γ-cer-sup Phe (pXU760) anstelle des Markers Km^R eingeführt. Das resultierende Plasmid wurde pXL2774 genannt. 6 fasst die unterschiedlichen Klonstufen zusammen. Die Ligaturmischungen wurden durch Elektroporation in XAC-1Pir-116 umgewandelt. Die den Bakterien die Expression der Selektionsmarker erlaubende Inkubation erfolgt im reichen Milie (Milieu SOC); es war daher notwendig, die Zellen vor dem Verteilen zweimal mit dem Milieu M9 zu waschen. Das hat die Elimination des Restmilieus erlaubt, das ein Hintergrundgeräusch der Kultur auf dem Mindestmilieu nach sich gezogen hätte.
Das zum Verteilen der der Elektroporese unterzogenen Zellen gewählte Milieu ist das Minimummilieu M9, das die Auswahl der eine Suppressor-tRNA erlaubenden Bakterien und damit des Vorhandenseins unserer Plasmide erlaubt. Das Hinzufügen von X-Gel erlaubt durch Blaufärbung die Sichtbarmachung der Expression der Suppressor-t-RNA. Die Schachteln werden nach rund 20 Stunden bei 37°C analysiert. Das Fehlen von Kolonien auf der Kontrolle ohne DNA vergewissert uns, dass die Auswahl korrekt ist, selbst bei dichten Impfungen. Alle durch Restriktion (8) untersuchte Klone tragen effektiv ein dem erwarteten Profil entsprechendes Plasmid. Das somit aufgebaute Plasmid pXL2774 wurde ausgehend von einem in einem Liter flüssigen Milieus M9 kultivierten Klon durch eine u. a. auf einen Ionenaustauscher (Kit Promega, MegaPreps) zurückgreifende Technik hergestellt (rund 18 Stunden bei 37°C). Die geerntete DNA-Menge betrug 2 mg.
2) Analyse des in den Säugetierzellen transfektierten Prüfvektors pXL2774
Die Kapazität von pXL2774 zur Transfektion der eukaryotischen Zellen und zum Ermöglichen der Expression der Luciferase wird durch Transfektion in den Mäuse-Fibroblasten NIH 3T3 bewertet. Der als Referenz gewählte Vektor ist das Plasmid pXL2622 (es handelt sich um das Plasmid pGL2 von Promega, dessen Promoter SV40 durch den Promoter CMV ersetzt wurde), das dieselbe Expressionkassette der Luciferase trägt wie pXL2774, aber auf einem unterschiedlichen Replikon. Es ist ein Derivat von ColE1 von 6,2 kpb, das das Resistenzgenz gegenüber Ampicilin trägt. Dieses Plasmid dient uns zur Kontrolle. Die Luciferase-Aktivitäten (ausgedrückt in RLU oder relativen Lumineszenz-Einheiten) sind in der Tabelle 3 identisch.
Die besten Ergebnisse wurden mit einem Verhältnis „Lipofektant-Chargen/DNA-Chargen" von 6 erhalten; unter diesen Bedingungen scheinen pXL2622 und 2774 äquivalent zu sein.
TABELLE 3
BEISPIEL 4
Überprüfung des Suizidvektor-Merkmals bei E. coli der Plasmiden pCOR
Das nicht replikative Merkmal der von R6K, Typ pCOR, abgeleiteten Plasmide wurde durch ein Elektroporations-Experiment in E. coli JM109 (Yanisch-Perron et al., 1985) der Plasmide pUC4K (Ori ColE1-KmR (Vieira und Messing, 1982) und pXL2730 (Ori Gamma von R6K-KmR, siehe Beispiel 2) überprüft. Der eingesetzte Elektroporator ist das Gen Pulser Biorad und die elektrokompetenten Zellen JM109 werden gemäß dem Protokoll des Herstellers hergestellt und eingesetzt (Bacterial electrotransformation and pulse controller instruction manual catalog number 165–2098).
Die elektrotransformierten Zellen werden auf dem mit Kanamycin (50 mg/l) angereicherten und über Nacht bei 37°C inkubierten Milieu LB verteilt. Die erhaltenen Ergebnisse werden nachstehend vorgestellt.
Ergebnisse
Diese Ergebnisse zeigen, dass es zwischen der Umwandlungseffizienz eines Derivats von ColE1 (pUC4K) im Verhältnis zu einem Derivat von R6K (pXL2730) in einem das Gen Pir nicht ausdrückenden Stamm wenigstens 5 log Unterschied gibt. In einem Stamm Pir+ wie XAC-1Pir-116 erreicht die Elektrotransformations-Effizienz der Derivate von R6K 108 Transformanden/pro μg Plasmid oder überschreitet sie klassischerweise.
BEISPIEL 5
Plasdmid-DNA-Herstellung durch hochdichte Kultur des Stamms E. coli XAC-iPr-116 (pXL2774): Fermentierungsverfahren
5.1 Stämme: Herstellung eines minimalen Plasmids pXL2774 in E. coli XAC-1Pir-116 (Beispiel 1); dieses Plasmid umfasst die folgenden Elemente: Ori R6K-certRNAamsupPhe und eine Expressionskassette des Prüfgens Luc unter der Kontrolle des Promoters CMV (Beispiel 3). Es wurde ein für die Herstellung dieses Plasmidtyps hochproduktives Verfahren entwickelt.
5.2 Kulturmilieu und -bedingungen:
a) Wachstumsmilieu:
Zusammensetzung des definierten, für die Inokulations-Kulturen verwendeten Milieus (g/l): Na2HPO4 6, KH2PO4 3, NaCl 0,5 NH4Cl 1, NH4H2PO4 3, Glukose 5, MgSO4, 7H2O 0,24, CaCl2, 2H2O 0,015, Thiamin HCl 0,010.
Zusammensetzung des komplexen, für die Kulturen im Fed-Batch verwendeten Milieus (g/l): KH2PO4 8, K2HPO4 6.3, Na2HPO4 1.7, (NH4)2SO4 0.74, NH4Cl 0.12, Hefeextrakt 3, Glukose 2, MgSO4, 7H22.4 g/l, CaCl2, 2H2O 0.015, Thiamin 0.010, Salzlösung (Fe, Mn, Co, Zn, Mo, Cu, B, Al).
Zusammensetzung des für die Kulturen im Fed-Batch definierten Milieus, das mit dem komplexen Milieu identisch ist, der Hefeextrakt jedoch durch 2.5 g/l NH4Cl ersetzt wurde.
b) Kulturbedingungen im Fed-Batch
Es wurden Studien im IIl Milieu enthaltende 2 Liter Fermentatoren (Setric France) durchgeführt, um die optimalen Wachstums- und Produktionsbedingungen von Plasmid-DNA zu definieren. Der Fermentator wurde mit 80 ml einer zu Beginn der stationären Wachstumsphase angekommenen Inokulationskultur geimpft.
Während der Fermentierung wurde der pH kontrolliert und automatisch zwischen 6,9 und 7,0 mit 10%igem Ammoniak (Vol./Gew.) angepasst; die Temperatur wird bei 37°C gehalten; die Belüftung wurde auf 75 l/h ((1.1 vvm) unter einem Druck von 0,2 bar festgelegt und der gelöste Sauerstoff wurde bei 40% der Luftsättigung durch Retroaktion auf der Rührgeschwindigkeit und, wenn notwendig, durch Anreicherung mit reinem Sauerstoff kontrolliert.
Alle Parameter (pH, Temperatur, Rühren, OD, 02 und CO2 in den Zuführgasen) wurden vermerkt und Online mittels einer an einen Hewlett Packard 9000 angeschlossenen Schnittstelle HP3852 berechnet.
Die Basiszusammensetzung des Versorgungsmilieus ist die folgende: Kohlenstoffquelle 50%, Magnesiumsulfat 0,7%, Thiamin 0,02%; bei dem komplexen Milieu wurde einer bevorzugt zwischen 5 und 10% inbegriffenen Konzentration Hefeextrakt hinzugefügt.
Zwecks Anpassung der Kulturbedingungen an die Fementation von 800 Litern wurden zwei aufeinander folgende Inokulations-Kulturen umfassende Produktionssequenzen im Umfang des Labors realisiert: Inokulation I im geschüttelten Erlenmeyer und Inokulation II im 2 Liter Fermentator (Kultur im Batch), gefolgt von einer Herstellungskultur im Fed-Batch im 7 Liter Fermentator.
5.3 Ergebnisse
Es wurden unterschiedliche Kulturbedingungen im komplexen Milieu, im definierten Milieu und zu unterschiedlichen Wachstumsraten untersucht. Nach einer anfänglichen Kultur des Bakterienstamms und Verbrauch der Sauerstoffquelle wurde das Versorgungsmilieu in allen Fällen dank einer an ein vorprogrammiertes Additionsprofil angeschlossenen peristaltischen Pumpe dem Fermentator hinzugefügt. Dieses Profil wurde aus früheren Experimenten erschlossen, in denen der Versorgungsgrad entweder dem aufgelösten Sauerstoffniveau oder einem konstanten Wachstumsgrad untergeordnet wurde.
Darüber hinaus wurde zur einfachen Extrapolation der Fermentierungsbedingungen von 2 Litern in einem Fermentator von 800 l ohne übermäßiges Oxidieren des Milieus die maximale Sauerstoffnachfrage am Ende der Kultur auf 2,5–3 mM/Min. festgelegt. Zu diesem Zweck wurde der Wachstumsgrad des Mikro-Organismus ggf. durch Einwirkung auf den Versorgungsdurchsatz der komplementären Charge verringert.
Wie Tabelle 4 aufzeigt, wurden sehr gute Ergebnisse gleichzeitig im komplexen Milieu und im definierten Milieu erzielt, sei es im gesamten Labor oder in einem 800 Liter Fermentator; die Wachstums- und Produktionskinetik der Plasmid-DNA sind darüber hinaus durchaus vergleichbar (siehe 6 und 7).
TABELLE 4
Die globalen Ergebnisse lassen Folgendes erkennen:

– Die Änderung der Größenordnung des Fermentators von 2 l auf 800 Liter kann problemlos durchgeführt werden
– Der verbrauchte Sauerstoff hängt in starkem Maße von der produzierten Biomasse ab (1.08 g 02/g produzierte Biomasse),
– Das Plasmid ist über wenigstens 5 Generationen stabil ohne Selektionsdruck
– Es kann im komplexen Milieu eine hohe Biomasse erhalten werden, die 40 g trockene Zellen/Liter übersteigt,
– Die Plasmid-DNA-Produktion erreicht 100 mg übereingerollte DNA/1 Milieu
– Es gibt eine sehr gute Korrelation zwischen der DNA-Produktion und der Biomasse: Man kann die Produktion auf 1 mg Plasmid-DNA/DO-Einheit
– schätzen, oder 2.7 mg Plasmid-DNA/g Biomasse, und zwar unabhängig von der Fermentationsdauer,
– Der Einsatz eines definierten Milieus erlaubt auch das Erreichen einer Biomasse (30 g trockene Zellen/1) und einer hohen Plasmid-DNA-Produktion (100 mg/l), und zwar ohne jede Verluste bei der Herstellung.

BEISPIEL 6
Transfer von pXL2774 in tierische Zellen, in vitro und in vivo.
6.1 Transfer in vitro von XL2774 in tierische Zellen
Die Kapazität des minimalen Plasmids pXL2774 zur Transfektion unterschiedlicher zellularer Linien wurde sowohl in den Zellen menschlichen Ursprungs als auch tierischen Ursprungs in vitro getestet. Das Plasmid pXL2784 wurde als Kontrolle verwendet. Es enthält dieselbe eukaryotische Expressionskassette (Promoter CMV-Luciferase-PolyA) wie pXL2774, aber es ist ein Derivat von ColE1 von 6,4 kb, das das die Resistenz gegenüber Kanamycin bei E. coli verleihende Gen umfasst.
Die getesteten Zellen sind die folgenden:
Die Transfektionsbedingungen waren die folgenden:
T-1: Impfen der Zellen in einer Dichte von 100.000 Zellen pro Vertiefung von 2 cm2 (Plättchen mit 24 Vertiefungen) im mit 10% fötalem Kalbsserum (SVF) zugesetztem Milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagle Medium).
T-3: Transfection der Zellen per 10 μl einer Folgendes enthaltenden Transfektionslösung: 0,5 μg DNA, 150 mM NaCl, 5% Glukose und 3 nMol Lipofektant RPR120 335 pro μg DNA in 250 μg Kulturmilieu, dem 10% SVF hinzugefügt wurden oder nicht. Nach einer Inkubation von 2 Stunden wird das Milieu durch 500 μl DMEM-Milieu ersetzt, dem 10% SVF hinzugesetzt wurden.
T-4: Erneuerung des Kulturmilieus.
T-5: Waschen der Zellen mit PBS, dann Lyse durch 100 μl Lysepuffer (Promega Cell Lysis Buffer E153 A). Die Dosierung der Luciferase-Aktivität erfolgt in einem Luminometer Lumat LB 9501 (Berthold) auf 10 μl Lysat mit einer Integrationsdauer von 10 Sekunden. Das eingesetzte Reagens ist das von Promega (Promega Luciferase Assay Substrate). Die in den folgenden Tabellen zusammengefassten Ergebnisse werden in RLU (Relative Lights Unit) für 10 μl Lysat (durchschnittliches Maß auf 4 Vertiefungen) ausgedrückt. Die Abweichungskoeffizienten (CV) werden ebenfalls angegeben.
Bei fehlendem Serum werden die Transfektionsergebnisse nachstehend vorgestellt:
Die Transfektionsergebnisse bei Vorhandensein von Serum (10%) werden nachstehend dargestellt:
Diese Ergebnisse zeigen die Kapazität von pXL2774 zur effizienten Transfektion in vitro von unterschiedlichen Zelltypen sowohl menschlichen Ursprungs als auch von Mäusen auf. Die Expression des Prüfgens Luc erlaubt es aufzuzeigen, dass seine Transfektionseffizienz wenigstens genauso gut ist wie die eines „klassischen", aus ColE1 abgeleiteten Plasmids, welches dieselbe Expressionskassette trägt wie die Luciferase.
6.2 Transfer in vivo beim Tier (Maus) von pXL2774
a) Modell 1: reine DNA im tibialen Schädelmuskel der Maus
In „Glukose 5%, NaCl 150 mM" gelöste reine Plasmid-DNA wird in den tibialen Schädelmuskel der Maus OF1 injiziert. Die Muskeln werden 7 Tage nach der Injektion entnommen, gehackt, in 750 μl Lysepuffer (Cell Lysis Buffer Promega E153A) homogenisiert, dann bei 20.000 ¥ g 10 Minuten lang zentrifugiert.
Die Luciferase-Aktivitätsdosierung wird auf 10 μl Überstand nach Hinzufügen von 50 μl Reagens (Promega Luciferase Assay Substrate) realisiert. Das Ablesen erfolgt auf dem Luminometer Lumat LB 9501 (Berthold) mit einer Integrationsdauer von 10 Sekunden.
Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle dargestellt:
Diese Ergebnisse zeigen an, dass ein Plasmid mit konditionaler Replikation wie pXL2774 durchaus zur Transfektion der Muskelzellen der Maus in vivo in der Lage ist, und zwar mit einer der eines „klassischen", von ColE1 abgeleiteten Plasmids, das dieselbe Expressionkassette des Gens der Luciferase trägt, vergleichbaren oder sogar höheren Effizienz.
b) Modell 2: Tumormodell 3T3 HER2
Das Modell ist das folgende:

– Maus vom Typ Swiss/nude, erwachsenes Weibchen
– Nach subkutaner Injektion von 107 Zellen 3T3 HER2 an der Flanke induzierte experimentale Tumore
– Die Injektion der Transfektionsmischung wird 7 Tage nach der Injektion der Zellen realisiert Injizierte Lösungen: Die DNA wird zunächst in einem Puffer gelöst. Nach Hinzufügen aller Produkte enthält die Mischung außer der DNA, NaCl (150 mM) und D-Glukose 5% in Wasser oder den Puffer HEPS 5 mM.
– Zwei Tage nach der Injektion wird das Tumorgewebe entnommen, gewogen, dann gehackt und in 750 μl Lysepuffer (Promega Cell Lysis Buffer E153 A) homogenisiert. Nach dem Zentrifugieren (20.000 g 10 Minuten lang) werden 10 μg Überstand entnommen, die die Bewertung der Luciferase-Aktivität erlauben. Diese Aktivität wird durch Messung der gesamten, nach der Mischung mit 50 μl Reagens (Promega Luciferase Assay Substrate) in einem Luminometer Lumat LB 9501 (Berthold) mit einer Integrationsdauer von 10 Minuten erhaltenen Lichtemission bestimmt.

Die daraus resultierende Aktivität wird in im gesamten Überstand der Tumorlyse geschützten RLU (Relative Lights Unit) ausgedrückt.
Ergebnisse
Diese Ergebnisse zeigen an, dass ein Plasmid mit konditionaler Replikation, wie pXL2774, durchaus zur Transfektion von Tumorzellen in vivo fähig ist, und zwar mit einer Effizienz, die der eines „klassischen", von ColE1 abgeleiteten Plasmids, das dieselbe Expressionkassette des Gens der Luciferas trägt, vergleichbaren Effizienz.
Diese unterschiedlichen Experimente haben es erlaubt aufzuzeigen, dass die Plasmiden mit konditionaler Replikation, und ganz besonder pXL2774, effektiv die zu einer Verwendung in der Gentherapie unerlässlichen Transfektionsmerkmale von tierischen Zellen aufweisen. Genauer gesagt wurde Folgendes nachgewiesen:

1) Die Kapazität von pXL2774 zur effizienten Transfektion in vitro von unterschiedlichen Zelltypen menschlichen Ursprungs oder von Mäusen;
2) Die Kapazität von pXL2774 zur Transfektion in vivo des Muskels der Maus
3) Die Kapazität von pXL2774 zur Transfektion in vivo der in die Maus eingepflanzten Tumorzellen.

Die Elektrotransformations-, Fermentierungs- und Transfektions-Experimente haben also die Validierung der Plasmiden mit konditionaler Replikation als in der Gentherapie einsetzbaren Vektor erlaubt und dabei aufgezeigt

i) dass sie sich nicht auf feststellbare Weise in einem Stamm von das Gen Pir nicht ausdrückendem (konditionaler Replikationsstartpunkt) E. coli replizierten
ii) dass sie in einer mit einer industriellen Produktion kompatiblen Größenordnung in einem Milieu hergestellt werden können, das vollständig definiert sein kann und das keine Antibiotika enthält;
iii) das diese Plasmiden in vitro und vor allem in vivo von Säugetierzellen transfektiert werden können.

BEISPIEL 7
Herstellung von rekombinanten Proteinen in vitro
7.1 Aufbau des Expressionsvektors
Zum Aufzeigen der Machbarkeit eines derartigen Ansatzes haben wir einen Expressionsvektor gemäß den zuvor beschriebenen Kriterien (Beispiele 2 und 3) aufgebaut. Dieser Vektor pXL3056 enthält:

1) den Bakterienteil, der den konditionalen Replikationsstartpunkt (Ori Gamma), das Fragment Cer von ColE1 und das die Selektion in der Bakterie (sup) gewährleistende Gen enthält.
2) Die auf dem von Studier (Studier et al., 1990) beschriebenen System basierende Expressionskassette umfasst den Promoter des Gens 10 des Bakteriophagen T7, den Operator LacO, das aFGF 154 (acidic Fibroblast Growth factor oder saurer Wachstumsfaktor der Fibroblasten, die 154 Aminosäuren umfassende Form) (Jaye et al., 1986) kodierende Gen, den Terminator TF des Bakteriophagen T7. Diese Expressionkassette ist identisch mit der auf dem im Patentantrag WO96/08572 beschriebenen Plasmid pXL2434 vorhandenen Kassette.

Der Aufbau von pXL3056 wird in 8 vorgestellt. Das die Expressionskassette von aFGF enthaltende Fragment EcoRI-BgIII von pXL2434 (1,1 kb) wird im Vektor mit konditionaler Replikation pXL2979 (gereinigtes Fragment von 1,1 kb) in den Orten BgIII und EcoRI geklont, um pXL3056 zu generieren.
pXL2979 resultiert aus der Ligatur von 3 Fragmenten: i) Fragment Accl-Xbal von pXL2730 (0,8 kb, das Ori Gamma und Cer einbringt), ii) Fragment Narl-Sall von pXL2755 (0,18 kb, das das Gen Sup Phe einbringt) iii) das Fragment Sall-Spel von pXL2660 (1,5 kb, das das die Resistenz gegenüber Kanamycin verleihende Gen einbringt).
pXL2660 resultiert aus dem Klonen des Fragments Psti von 1,2 kb von pUC4K (Vieira und Messing, 1982) in pMTL22 (Chambers et al., 1998), das durch Pstl linearisiert wird.
7.2 Erhalt des Expressionsstamms
Das Plasmid pCL3056 wird durch Transformation in dem Stamm XAC-1Pir-116 eingeführt. Der daraus resultierende Stamm wird anschließend durch das Plasmid PT7po123 (Mertens et al., 1995) bei 30°C umgewandelt. Zwecks Ausdrucks des Gens von Interesse unter Kontrolle des Promoters T7 muss die Bakterie in ihrem Genom auf einem Plasmid oder einem Bakteriophagen eine die Expression der Polymerase-DNA des Bakteriophagen T7 erlaubende Kassette enthalten. In dem beschriebenen Beispiel haben wir das mit den Derivaten von R6K, wie z. B. pXL3056 kompatible Plasmid PT7po123 verwendet, das die induzierbare Expression durch die Temperatur der Bakteriophagen-Polymerase-RNA T7 erlaubt. Man kann jedoch auch die Lysogenisation mit dem Stamm XAC-1Pir-116 durch Lambda DE3 (Studier et al., 1990) in Betracht zieheh, um nur ein Plasmid zu behalten und die Herstellung der Polymerase-RNA von T7 eher durch IPTG als durch Temperatur zu induzieren.
7.3 Expression des aFGF
Der Stamm XAC-1Pir-116 (pXL3056+PT7po123) wird bei 30°C im Mindestmilieu M9 kultiviert, dem 0,2% Casaminosäure (DIFCO) und Kanamycin (25 μg/ml) bis zu einer optischen Dichte von 600 nm von 0,6 bis 1 hinzugefügt werden. Die Hälfte der Kultur wird anschließend bei 42°C (Induktion der Polymerase-RNA von T7) platziert, während die andere Hälfte bei 30°C bleibt (negativer Test). Dasselbe Experiment wird mit dem Stamm XAC-1PIr-116 (pXL3056+pUC4K) durchgeführt, der eine Expressionskontrolle des aFGD bei fehlender RNA-Polymerase- von T7 bildet
Die erhaltenen Ergebnisse werden in 9 dargestellt. Sie zeigen, dass die Herstellung von aFGF mit der vergleichbar oder noch besser ist, die mit BL21 (DE3) (pXL2434) (WO 96/08572) beobachtet wird, was deutlich die Potenziale der Plasmide mit konditionaler Replikation für die Expression von rekombinanten Proteinen in vitro, insbesondere bei E. Coli aufzeigt.
BEISPIEL 8
Aufbau eines ein Protein p53 des Wildtyps oder Hybridtyps ausdrückenden Vektors pCOR
Dieses Beispiel beschreibt den Aufbau von erfindungsgemäßen Vektoren mit konditionaler Replikation mit einer ein Protein p53 kodierenden Nukleinsäure. Diese Vektoren sind zur Wiederherstellung einer Aktivität vom Typ p53 in defizienten (mutierten, deletierten) Zellen einsetzbar, wie z. B. insbesondere Turmorzellen.
Die eukaryotische Expressionzelle enthält die folgenden Elemente:

1) frühreifer Promoter CMV „immediate early" (Positionen –522 bis +72), gefolgt von der Leader-Sequenz des Gens der Thymidinkinase des Herpes Simplex-Virusses, Typ 2 (Position –60 bis +1 des Gens, unter Bezugnahme auf die Sequenz des Artikels McKnight, S. IL (1980) Nucleic Acids Res. 8: 5949–5964);
2) eine das Protein p53 vom Wildtyp oder eine Variante von p53 kodierende Nukleinsäure gemäß Beschreibung im Patentantrag PCT/FR96/01111 (Variante V325K= V325 mit einer Kozak-Sequenz in ATG).
3) Die Polyadenylationssequenz PolyA von SV40.

Diese Elemente wurden in Form eines Fragments Ascl- Xbal auf den Vektor pCOR pXL2988 zwischen den Orten BssHll und Spel. platziert. pX12988 ist identisch mit pXL2979 (Beispiel 7.1), mit Ausnahme des Vorhandenseins eines zusätzlichen Elements, einer zur Bildung einer dreifachen, aus dem 17-fachen Trinukleotid GAA bestehenden, neben dem Gamma-Replikationsstartpunkt platzierten DNA-Schraube fähigen Sequenz.
Die daraus resultierenden Plasmide werden pXL3029 und 3030 genannt (10).
Die Funktionalität dieser Aufbauten wurde in vitro auf Zellen p53-SAOS2 in der Kultur durch Messung der Transkriptions-Aktivations-Aktivität von p53 oder p53superWT überprüft.
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LISTE DER SEQUENZEN

Claims

DNA-Molekül von zirkulärer Form, welches in der Gentherapie nützlich ist, umfassend wenigstens eine Nukleinsäuresequenz von Interesse und gleichfalls die Regulationssignale für deren Expression, deren Transkription und gegebenenfalls Translation in der eukaryotischen Zielzelle Produkte mit einem therapeutischen, in Zusammenhang mit Impfungen bestehenden, landwirtschaftlichen oder veterinärmedizinischen Nutzen erzeugen, dadurch gekennzeichnet, dass: a. die Region, welche dessen Replikation erlaubt, einen konditionalen (abhängigen) Replikationsstartpunkt umfasst, welcher aus einem Plasmid oder einem Bakteriophagen stammt, dessen Funktionalität in einer prokaryotischen Wirtszelle die Anwesenheit von wenigstens einem Replikationsinitiationsprotein, welches für das Plasmid oder den Bakteriophagen spezifisch ist und in Bezug auf die prokaryotische Wirtszelle fremd ist, erfordert, b. das DNA-Molekül das Replikationsinitiationsprotein nicht umfasst, c. das DNA-Molekül einen Selektionsmarker von verringerter Größe, welcher von einem Gen, welches Resistenz gegen ein Antibiotikum verleiht, verschieden ist, umfasst und d. das DNA-Molekül sich lediglich in Zellen, die das Initiationsprotein komplementieren können, repliziert.
DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der konditionale Replikationsstartpunkt aus einem Plasmid oder Bakteriophagen stammt, welches bzw. welcher einen Replikationsstartpunkt aufweist, welcher durch mehrere Iterone (repetiti ve Sequenzen) repräsentiert wird, und welches bzw. welcher wenigstens ein spezifisches Protein kodiert, welches die Funktionalität von dessen Replikationsstartpunkt bedingt (konditioniert).
DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der konditionale Replikationsstartpunkt aus den folgenden Plasmiden oder Bakteriophagen stammen kann: RK2, R6K, R1, pSC101, Rtsl, F, RSF1010, P1, P4, lambda, Phi82 und Phi80.
DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Replikationsstartpunkt aus dem bakteriellen Plasmid R6K stammt.
DNA-Molekül nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Replikationsstartpunkt in seiner Gesamtheit oder zu einem Teil durch den Replikationsstartpunkt γ des Plasmids R6K gebildet wird.
DNA-Molekül nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Replikationsstartpunkt in seiner Gesamtheit oder zu einem Teil durch die Sequenz SEQ ID No. 1 angegeben wird.
DNA-Molekül nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Region, welche die Selektion der Wirtszellen, welche das DNA-Molekül enthalten, ermöglicht, in ihrer Gesamtheit oder zu einem Teil durch eine Expressionskassette einer Suppressor-Transfer-RNA für spezielle Codons repräsentiert wird.
DNA-Molekül nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Expressionskassette einer Suppressor-tRNA für Amber-Codons (TAG) handelt.
DNA-Molekül nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem eine Zielregion einer ortsspezifischen Rekombinase umfasst.
DNA-Molekül nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass diese Zielregion einer ortsspezifischen Rekombinase ausgewählt wird unter den Resolvasen der Transposons Tn3, Tn21 oder Tn522; der Invertase des Bakteriophagen mu, den Resolvasen von Plasmiden, wie jener, die durch das Fragment par von RP4 kodiert wird, den Rekombinasen aus der Familie der Integrase des Bakteriophagen lambda, wie den Integrasen von lambda, phi80, P22, HP1, der Integrase Cre von P1, der Integrase des Plasmids pSAM2, der FLP-Rekombinase des Plasmids 2 μ und den Rekombinasen XerC und XerD von E. coli.
DNA-Molekül nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass diese Zielregion einer ortsspezifischen Rekombinase die Gesamtheit oder einen Teil des cer-Fragments von ColE1 oder eines kleineres Fragments, welches die gleichen Eigenschaften aufweist, umfasst.
DNA-Molekül nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz von Interesse ein Protein von pharmazeutischem, agrarwirtschaftlichem Nutzen oder welches in der Biokatalyse einsetzbar ist, kodiert.
DNA-Molekül nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz von Interesse ein Protein kodiert, welches ausgewählt wird unter den Enzymem, den aus Blut abgeleiteten Substanzen, den Hormonen, den Lymphokinen: Interleukinen, Interferonen, TNF, den Wachstumsfaktoren, den Neurotransmitttern oder deren Synthese-Vorstufen oder -Enzymen, den trophischen Faktoren, wie BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMV, aFGF, bFGF, NT3, NT5, den Apolipoproteinen, wie ApoAI, ApoAIV, ApoE, Dystrophin oder einem Minidystrophin, den Tumorsuppressorgenen, wie p53, Ab, Rap1A, DCC, k rev, den Genen, welche Faktoren kodieren, welche an der Gerinnung beteiligt sind, wie die Faktoren VII, VIII, IX, den Suizidgenen, wie Thymidinkinase, Cytosindesaminase, der Gesamtheit oder einem Teil eines natürlichen oder künstlichen Immunglobulins, wie Fab, ScFv, einem RNA-Ligand, einer Antisinn-Sequenz oder antigenen Peptiden, welche für das Epstein Barr-Virus, das HIV-Virus, das Hepatitis B-Virus, das Pseudotollwut-Virus spezifisch sind oder ferner für Tumore spezifisch sind.
Verfahren zur Herstellung eines DNA-Moleküls von zirkulärer Form nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Wirtszelle, welche wenigstens enthält: a. ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 13, welches einen Replikationsstartpunkt umfasst, dessen Funktionalität in der Wirtszelle die Anwesenheit von wenigstens einem spezifischen und in Hinblick auf die Wirtszelle fremden Replikationsinitiationsprotein erfordert, und b. das spezifische und in Hinblick auf die genannte Wirtszelle fremde, in situ oder nicht in situ exprimierte Protein, welches die Funktionalität des Replikationsstartpunkts bedingt (konditioniert), unter Bedingungen kultiviert, welche die Selektion der durch die DNA-Moleküle transformierten Wirtszellen erlauben.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das das Replikationsinitiationsprotein kodierende Gen auf einem Replikon vorhanden ist, welches an das Genom der Zelle angefügt oder in dieses inkorporiert ist.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein DNA-Molekül, welches einen Replikationsstartpunkt, wie in den Ansprüchen 9 bis 6 definiert, umfasst, handelt und dass das Protein das Protein Π des Plasmids R6K ist oder sich von diesem Protein durch Modifizierung von dessen kodierender Sequenz unterscheidet oder ein Fragment dieses Prote ins bildet, wobei dieses nach wie vor die gleiche Aktivität aufweist.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein Π oder das eine seiner Derivate in situ exprimiert wird ausgehend von dem in SEQ ID No. 2 angegebenen Gen pir oder einer jeglichen Sequenz, welche sich von SEQ ID No. 2 aufgrund einer Degeneration des genetischen Codes unterscheidet, oder einer jeglichen Sequenz, welche mit diesen Sequenzen hybridisiert, oder Fragmenten von jenen, die in der Wirtszelle vorhanden sind und deren Produkt die Aktivität des spezifischen Replikationsinitiationsproteins aufweist.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ausgehend von dem Gen pir 116, welches in das Genom der Zelle eingebaut ist, exprimiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das eine der Gene, welche unter den gewählten Kulturbedingungen der Wirtszelle unentbehrlich sind, ein spezielles Codon enthält, welches durch die ausgewählte Suppressor-tRNA auf der Ebene des DNA-Moleküls erkannt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Gen ein Amber-Codon TAG enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle unter den Stämmen von E. coli ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle aus dem E. coli-Stamm XAC 1 stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass es den Stamm E. coli XAC 1, welcher in seinem Genom das Gen pir 116 enthält, einsetzt.
Rekombinante Zelle, welche durch wenigstens ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 13 transformiert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein oder mehrere DNA-Molekül(e) nach einem der Ansprüche 1 bis 13 umfasst.
DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 13 als Arzneimittel.
Verwendung eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 13 für die Herstellung von rekombinanten Proteinen in vitro.
Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz von Interesse ein Wildtyp-p53-Protein oder ein modifiziertes p53-Protein kodiert.
Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz von Interesse eine Thymidinkinase kodiert.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle ein E. coli-Stamm endA 1 ist.
DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem eine Sequenz, welche zur spezifischen Wechselwirkung mit einem Liganden in der Lage ist, umfasst.
DNA-Molekül nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure von Interesse den sauren Wachstumsfaktor der Fibroblasten (FGFa) kodiert.
DNA-Molekül nach Anspruch 32 als Arzneimittel.
Verwendung eines DNA-Moleküls nach einem der Ansprüche, 1 bis 13 für die Herstellung eines Arzneimittels, welches bei der Behandlung von Krebs nützlich ist.