HU224400B1 - Cirkuláris DNS-molekula feltételes replikációs origóval, eljárás elõállítására és génterápiában való alkalmazása - Google Patents

Cirkuláris DNS-molekula feltételes replikációs origóval, eljárás elõállítására és génterápiában való alkalmazása Download PDF

Info

Publication number
HU224400B1
HU224400B1 HU9900018A HUP9900018A HU224400B1 HU 224400 B1 HU224400 B1 HU 224400B1 HU 9900018 A HU9900018 A HU 9900018A HU P9900018 A HUP9900018 A HU P9900018A HU 224400 B1 HU224400 B1 HU 224400B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
dna molecule
replication
gene
protein
plasmid
Prior art date
Application number
HU9900018A
Other languages
English (en)
Inventor
Joël Crouzet
Fabienne Soubrier
Original Assignee
äá+ůá<ć!+
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9482580&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU224400(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by äá+ůá<ć!+ filed Critical äá+ůá<ć!+
Publication of HUP9900018A1 publication Critical patent/HUP9900018A1/hu
Publication of HUP9900018A3 publication Critical patent/HUP9900018A3/hu
Publication of HU224400B1 publication Critical patent/HU224400B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/501—Fibroblast growth factor [FGF] acidic FGF [aFGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

A találmány tárgya egy cirkuláris alakú DNS-molekula, amely agénterápiában hasznos, és amely legalább egy kívántnukleinsavszekvenciát tartalmaz, azzal jellemezve, hogy areplikációját lehetővé tevő terület egy olyan replikációs origóttartalmaz, melynek a gazdasejtben való működőképessége legalább egyspecifikus, az említett gazdasejtre nézve idegen fehérje jelenlététigényli. A találmány tárgya a megfelelő, az említett DNS-molekulákelőállítására szolgáló eljárás is, valamint azok alkalmazása agénterápiában.

Description

A találmány tárgya egy új feltételes replikációjú DNS-molekula, amely a génterápiában vagy rekombináns proteinek termelésére használható, továbbá előállítása és alkalmazása.
A génterápia abból áll, hogy egy hiányosságot vagy rendellenességet kijavítunk egy genetikai információnak az érintett sejtbe vagy szervbe történő bevezetésével. A genetikai információt in vitro, egy, a szervből kivett sejtbe vezethetjük be, és ekkor a módosított sejtet a szervezetbe visszaültetjük, vagy közvetlenül in vivő az érintett szövetbe építhetjük be. Mivel nagy molekulatömegű és negatív töltésű molekuláról van szó, a DNS nehezen tud spontán átjutni a foszfolipid-sejtmembránokon. A géntranszfer lehetővé tételéhez tehát különböző vektorokat alkalmaznak: egyrészt virális vektorokat, másrészt természetes vagy szintetikus kémiai vagy biokémiai vektorokat.
A virális vektorok (retrovírusok, adenovirusok, adenoasszociált vírusok stb.) igen hatékonyak a membránokon való áthaladás tekintetében, de bizonyos kockázatokkal rendelkeznek, például a patogenitás, a rekombináció, a replikáció, az immunogenitás stb.
A kémiai és/vagy biokémiai vektorok lehetővé teszik, hogy elkerüljük ezeket a kockázatokat [összefoglalóként lásd Behr (1993), Cotten et Wagner (1993)]. Ilyenek például a kationok (kalcium-foszfát, DEAE-dextrán stb.), melyek úgy hatnak, hogy a DNS-sel csapadékot képeznek, amelyet a sejtek „fagocitálni” tudnak. De szó lehet liposzómákról is, melyekbe beépítették a DNS-t, és melyek a plazmamembránnal fuzionálnak. A szintetikus géntranszfer vektorok általában lipidek vagy kationos polimerek, melyek komplexbe viszik a DNS-t, és felületén pozitív töltést hordozó részecskét képeznek vele. Erre a vektorra példaképpen említhetjük a dioktadecil-amidoglicil-spermint (DOGS, Transfectam™) vagy az N-[1-(2,3-dioleil-oxi)-propil]-N,N,N-trimetil-ammóniumot (DOTMA, Lipofectin™).
A kémiai és/vagy biokémiai vektorok vagy a csupasz DNS alkalmazása azonban magában foglalja annak a lehetőségét, hogy jelentős mennyiségben termeljünk farmakológiailag tiszta DNS-t. A génterápiás eljárásokban a gyógyszer magából a DNS-ből áll, és alapvető, hogy megfelelő mennyiségben tudjunk előállítani az emberi terápiás felhasználáshoz megfelelő tulajdonságokkal rendelkező DNS-t.
A nem virális vektorok esetében bakteriális eredetű plazmidokat dolgoztak ki. A géntechnológiában általánosan alkalmazott plazmidok hordoznak (i) egy replikációs origót, (ii) egy markergént, például egy antibiotikum- (kanamicin, ampicillin stb.) rezisztencia-gént, és (iii) egy vagy több transzgént az expressziójukhoz szükséges szekvenciákkal [enhancer(ek), promoter(ek), poliadenilációs szekvenciák stb.].
A jelenleg elérhető technológiák azonban nem teljesen kielégítőek.
Egyrészről fennmarad a szervezetben való szétszóródás veszélye. így egy, a szervezetben jelen levő baktérium kis gyakorisággal felveheti a plazmidot. Ennek nagyobb a valószínűsége, ha in vivő génterápiás kezelésről van szó, ahol a DNS szétszóródhat a beteg szervezetében, és a beteget fertőző, vagy a természetes flórához tartozó baktériumok közelébe kerülhet. Ha a plazmidot fogadó baktérium egy enterobaktérium, mint az E. coli, a plazmid képes replikálódni. Egy ilyen esemény tehát a terápiás gén elterjedéséhez vezet. Abban az esetben, ha a génterápiában alkalmazott terápiás gének például limfokint, növekedési faktort, antionkogént vagy egy olyan fehérjét kódolnak, melynek működése a gazdában hibát okoz, és így teszi lehetővé egy genetikai hiba kijavítását, ezen gének közül bizonyosak elterjedése előreláthatatlan, és figyelemre méltó hatásokkal járhat (például ha egy patogén baktérium egy humán növekedési faktor génjét szerzi meg).
Másrészről a nem virális génterápiában általánosan használt plazmidok rendelkeznek egy antibiotikumrezisztencia-markerrel (ampicillin, kanamicin stb.). Egy ilyen plazmidot megszerző baktérium tehát tagadhatatlan szelektív előnyre tesz szert, mivel minden antibiotikus terápiás kezelés, amely ugyanabba a családba tartozó antibiotikumot használ, mint a plazmidot szelektáló rezisztenciagén, a kérdéses plazmid szelektálásához vezet. Ebben a tekintetben az ampicillin a β-laktámokhoz tartozik, amely a világon a leghasználatosabb antibiotikumcsalád. Tehát különösen előnyös lenne olyan szelekciós markerek alkalmazása a baktériumoknál, melyek nem antibiotikumrezisztencia-gének. Ezzel elkerülnénk a markert hordozó plazmidot megszerzett baktériumok szelekcióját.
Különösen fontos tehát, hogy a terápiás gének és a rezisztenciagének szétszóródását minimálisra próbáljuk korlátozni.
A találmány tárgya egy új DNS-molekula, amelyet a génterápiában vagy rekombináns fehérjék in vitro előállítására alkalmazhatunk, és amely csak a nem virális vektorok bizonyos funkcióit komplementálni képes sejtekben replikálódik.
A találmány tárgya egy különösen hatékony eljárás ilyen DNS-molekulák előállítására.
Az igényelt DNS-molekulák előnye, hogy megszüntetik a plazmid szétszóródásával kapcsolatos veszélyeket, például a (1) terápiás gén szabályozatlan túlzott mértékű expressziójához vezető replikációt és szétszóródást, (2) a rezisztenciagének elterjedését és expresszióját. A találmány szerinti DNS-molekulákban levő genetikai információ magában foglalja a terápiás gént vagy géneket, és az expressziójukhoz szükséges regulációs jeleket, egy működőképes feltételes replikációs origót, amely erősen korlátozza a plazmid gazdaspektrumát, egy redukált méretű szelekciós markert, amely előnyösen különbözik egy antibiotikumrezisztenciát biztosító géntől, és adott esetben egy DNS-fragmentumot, amely a plazmid multimerek felbontását teszi lehetővé. Annak a valószínűsége, hogy egy ilyen molekula (és így a tartalmazott genetikai információ) átkerül egy mikroorganizmusba, és stabil módon fennmarad, nagyon korlátozott.
Végül a találmány szerinti vektorok, melyeket miniplazmidoknak is nevezünk, cirkuláris szerkezetük, redukált méretük, és szuperhelikális alakjuk miatt, a kö2
HU 224 400 Β1 ciós iniciátorfehérjét (Rep) kódolnak, mely rájuk nézve specifikus. Példaképpen a következő plazmid és bakteriofág feltételes replikációs rendszereket említhetjük meg:
vetkező további előnyöket mutatják: a klasszikusan alkalmazott ColE1-eredetű plazmidokhoz viszonyított redukált méretük miatt a találmány szerinti DNS-molekulák potenciálisan jobb biodiszponibilitással rendelkeznek in vivő. Részletesen javított sejtbehatolási és sejteloszlási képességgel rendelkeznek. Felismerték, hogy a szöveti diffúziós konstans fordítottan arányos a molekulatömeggel [Jain (1987)]. Ezenkívül sejtes szinten a nagy molekulatömegű molekulák plazmamembránon való áthatolási képessége kevésbé jó. Ezenkívül a plazmidnak a magba való behatolása szempontjából, ami expressziójához elengedhetetlen, a nagy molekulatömeg szintén hátrány, mivel a magmembrán pórusai mérethatárt képeznek a mag felé történő diffúzió számára [Landford et al. (1986)]. A DNS-molekula nem terápiás része (replikációs origó és szelekciós gén például) méretének találmány szerinti lecsökkentése lehetővé teszi a DNS-molekulák méretének lecsökkentését is. A plazmid baktériumokban való replikációját és a szelekcióját lehetővé tevő része (1,1 kb) egy hármas faktorral csökken, 3 kb-t számolva a vektor replikációs origót és rezisztenciamarkert tartalmazó részére. Ez az (i) molekulatömeg és (ii) negatívtöltés-csökkenés a találmány szerinti molekuláknak javított sejt-, szövet- és nukleáris diffúziós és biodiszponibilitási tulajdonságokat biztosít.
Pontosabban a találmány tárgya egy cirkuláris DNS-molekula, amely a génterápiában hasznos, amely legalább egy fontos nukleinsavszekvenciát tartalmaz, azzal jellemezve, hogy a replikációját lehetővé tevő terület tartalmaz egy olyan replikációs origót, amelynek működése a gazdasejtben legalább egy specifikus, és a gazdasejtre nézve idegen fehérje jelenlétét kívánja meg.
A DNS-molekula egy vagy kettős láncú lehet, előnyösen szuperhelikális formájú.
A találmány keretein belül a felhasznált gazdasejtek különböző eredetűek lehetnek. Eukarióta vagy prokarióta sejtekről lehet szó. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint prokarióta sejtekről van szó.
A bakteriális plazmidok replikációjához klasszikusan legalább egy RNS-polimeráz, RN-áz, DNS-polimeráz stb. típusú, a gazdasejt által kódolt protein jelenléte szükséges. A már korában bemutatott okok miatt ezzel a típusú replikációval nem tudjuk teljes mértékben elkerülni a kezelt szervezetben való szétszóródás lehetséges veszélyét. Előnyösen a találmány szerinti DNS-molekula replikációs origójának működőképessége egy specifikus, a gazdasejtre nézve idegen protein jelenlétét követeli meg. Ennek a jellemzőnek az előnye, hogy az igényelt plazmid gazdaspektrumát redukálja az iniciátorfehérjét specifikusan kifejező törzsekre. A találmány keretein belül felhasznált DNS-molekula tehát előnyösen egy úgynevezett feltételes replikációs origóval rendelkezik.
A találmány keretein belül kidolgozott feltételes replikációs origó plazmidokból vagy bakteriofágokból származhat, melyek a következő tulajdonságokkal rendelkeznek: replikációs origójukban ismételt vagy iterált szekvenciákat tartalmaznak, és legalább egy repliká-
Plazmid vagy bakteriofág Specifikus iniciátorfehérje
RK2 [Stalker etal. (1981)] TrfA
R1 [Ryder etal. (1981)] RepA
pSC101 [Vocke et Bastia (1983)] RepA
F [Murotsu et al. (1981)] E protein
Rts1 [ltoh etal. (1982,1987)] RepA
RSF1010 [Miao et al. (1995)] RepC
P1 [Abeles et al. (1984)] RepA
P4 [Flensburg et Calendar (1987)] alfa-protein
lambda [Moore et al. (1981)] O protein
phi 82 [Moore et al. (1981)] a phi 82 O proteinje
phi 80 a phi 80 O proteinje
A találmány egy előnyös megvalósítási módjában az igényelt DNS-molekulában levő replikációs origó egy természetes, R6K-nak nevezett E. coli-plazmidból származik.
Az R6K replikációs funkciói egy 5,5 kb DNS-fragmentumon csoportosulnak (1. ábra), amely 3 replikációs origót, a, β és γ (γ és β biztosítja a replikáció 90%-át), és egy π replikációs iniciátorfehérjéket és a Bis fehérjét kódoló operont tartalmaz. A plazmid jellemző kópiaszámban (15 kópia genomonként) való fenntartásához szükséges minimális genetikai információt két elem tartalmazza: a γ origó 400 bp-ja és a pír gén, melynek terméke a π iniciátorfehérje.
A γ-origó két funkcionális részre osztható: a core-rész és az aktivátorelem (1. ábra). A replikációhoz elengedhetetlen core-rész tartalmazza az iteronokat (22 bp közvetlen ismétlődése 7-szer), ahova az 1. számú szekvencián bemutatott π-fehérje kötődik, és az azt körülvevő részeket, melyek a gazdafehérjék (IHF, DnaA) célszekvenciái.
A találmány egy előnyös megvalósítási módjában az igényelt vektor replikációs origóját teljesen vagy részben az R6K plazmid γ replikációs origója, előnyösebben az 1. számú szekvencia vagy annak egy része, vagy azok származéka alkotja.
A találmány keretein belül a származék kifejezés jelöl minden, az illető szekvenciától a genetikai kód degeneráltsága miatt eltérő szekvenciát, melyet egy vagy több genetikai és/vagy kémiai módosítással kaptunk, valamint minden, ezekkel a szekvenciákkal vagy ezek fragmentumaival hibridizálódó szekvenciát, melyek terméke rendelkezik a jelzett aktivitással a π replikációs iniciátorfehérje tekintetében. Genetikai és/vagy kémiai módosításon értjük egy vagy több maradék bármely mutációját, szubsztitúcióját, delécióját, addícióját és/vagy módosítását. A származék kifejezés
HU 224 400 Β1 magában foglalja az illető szekvenciával homológ olyan szekvenciákat is, melyek más sejtes forrásból származnak, például humán eredetű vagy más szervezetből eredő sejtekből, és ugyanolyan típusú aktivitással rendelkeznek. Ilyen homológ szekvenciákat kaphatunk hibridizációs kísérletekkel. A hibridizációt nukleinsavbankokból kiindulva valósíthatjuk meg, szondaként a természetes szekvenciát vagy annak egy fragmentumát alkalmazva, a szokásos szigorú körülmények között [Maniatis et al., vö. a molekuláris biológia általános technikáival], vagy előnyösen megnövelt erősségű körülmények között.
A fentebb leírt replikációs origó, amely azzal az előnnyel rendelkezik, hogy nagyon kis méretű, kizárólag egy specifikus iniciátorfehérje, a π-protein jelenlétében működőképes, amely a pir gén terméke (2. számú szekvencia). Ez a fehérje képes transz-helyzetben hatni, ezért a gamma-origót a pir géntől fizikailag elválaszthatjuk, mely utóbbit a plazmidra specifikus gazdasejtként választott sejt genomjába vezethetjük be. A π mutációi megváltoztathatják inhibitorfunkcióját [Inuzuka et Wada, Embo J. 4, 2301-2307 (1985)], és ez az R6K-származékok kópiaszámának növekedését vonhatja maga után, egészen a kiindulási kópiaszám 10-szereséig. Ezeket a szubsztitúciókat mind egy 40 aminosavas dómén tartalmazza, amelyről úgy tűnik, hogy a plazmid kópiaszámának a π által történő szabályozásáért felelős (2. ábra).
A találmány egy előnyös megvalósítási módjában a gazdasejtben kifejeződő π-protein a 2. számú szekvencián bemutatott gén, vagy annak egy, a korábbiakban definiált származéka, még előnyösebben a pir-116 gén expressziójának eredménye, mely utóbbi a pir génhez viszonyítva egy mutációt tartalmaz. Ez a mutáció egy prolin egy leucinnal való helyettesítésének felel meg. Ebben az esetben az R6K-származékok kópiaszáma 250 kópia körüli genomonként.
Egy, a korábbiakban definiált feltételes replikációs origón kívül az igényelt DNS-molekulák tartalmaznak egy területet, amely egy (vagy több), a DNS-molekula választott gazdában történő szelekcióját biztosító gént tartalmaz.
Szó lehet klasszikus, egy antibiotikumra, például kanamicinre, ampicillinre, kloramfenikolra, sztreptomicinre, spektinomicinre, lividomicinre, vagy másokra rezisztenciát biztosító gén típusú markerekről.
A találmány egy előnyben részesített megvalósítási módja szerint azonban ez a terület nem egy antibiotikumrezisztencia-gén. Egy olyan génről lehet szó, melynek terméke meghatározott tenyésztési körülmények között a gazdasejt életképességéhez szükséges. Lehet például:
- egy természetes vagy szintetikus eredetű szuppresszor tRNS-t kódoló gén. Előnyösen az amber kodon (TAG) tRNS-éről van szó,
- egy gén, melynek terméke a sejt metabolizmusához szükséges bizonyos tenyésztési körülmények között: egy metabolit (aminosav, vitamin stb.) bioszintézisében részt vevő gén, a tápközegben jelen levő anyag (különleges nitrogénvagy szénforrás) asszimilációját lehetővé tevő katabolikus gén stb.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint ez a terület egy specifikus kodon szuppresszor tRNS-ét kódoló gén expressziós kazettáját tartalmazza. Ez például a fenil-alanin-, risztéin-, prolin-, alaninés hisztidinmaradékot kódolók közül választott kodon lehet. Még előnyösebben egy amber kodon (TAG) szuppresszor tRNS-éről van szó.
Ebben a különleges esetben a találmány tárgyát képező DNS-molekulák gazdasejtben való szelekciójához alkalmazott rendszer két elemet tartalmaz: 1. a DNS-molekulán egy amber kodon (TAG) szuppresszor transzfer-RNS-ét kódoló sup gén, amely a szelekciós markert képezi, és 2. egy specifikus gazda, melynek egy génje, ami bizonyos tenyésztési körülmények között esszenciális, egy TAG amber kodont tartalmaz. Ez a sejt olyan körülmények között, melyekhez a TAG kodont tartalmazó gén terméke esszenciális, csak akkor tud nőni, ha a sup expresszióját lehetővé tevő plazmid jelen van a sejtben. A tenyésztési körülmények képezik tehát a szelekciós nyomást a DNS-molekulára. A használt sup gének természetes eredetűek lehetnek [Glass et al. (1982)], vagy szintetikus konstrukciókból származhatnak [Normanly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6548-6552 (1986); Kleina et al., J. Mól. Bioi. 213, 705-717(1990)].
Egy ilyen rendszer nagy flexibilitást biztosít abban az esetben, ha az amber mutációt hordozó gén alapján különböző szelektív tápközegeket tudunk meghatározni. A Lactococcus lactis baktériumnál például az amber kodon a purinbioszintézis egy génjében helyezkedik el. Ez lehetővé teszi a szuppresszor tRNS-t kódoló gént hordozó plazmid szelekcióját, amikor a baktérium tejben osztódik. Egy ilyen markernek megvan az az előnye is, hogy nagyon kis méretű, és nem tartalmaz „idegen”, fágokból vagy transzpozonokból származó szekvenciákat.
A találmány egy különleges megvalósítási módjában a DNS-molekula tartalmaz többek között egy DNS-fragmentumot, amely helyspecifikus rekombinázok célszekvenciája, és amely lehetővé teszi a plazmid multimerek felbontását.
Egy ilyen cirkuláris DNS-molekulába beépített fragmentum, melynek replikációs origója például a gamma-origó, lehetővé teszi a plazmid multimerjeinek felbontását. Ilyen multimereket például akkor figyelhetünk meg, amikor a DNS-molekulát a pir egy mutáns allélját, például a pir-116-ot hordozó törzsben állítjuk elő, ami az R6K-származékok kópiaszámának növelését teszi lehetővé.
A rekombinációt különböző rendszerek segítségével valósíthatjuk meg, melyek a szekvenciák közötti helyspecifikus rekombinációhoz vezetnek. Előnyösebben a találmány szerinti helyspecifikus rekombinációt intramolekuláris rekombinációs szekvenciák útján kapjuk meg, melyek képesek specifikus, általában rekombináznak nevezett proteinek jelenlétében egymás között rekombinálódni. Ebben a konkrét esetben a XerC és XerD rekombinázokról van szó. Ezért a találmány
HU 224 400 Β1 szerinti DNS-molekulák tartalmaznak általában többek között egy szekvenciát, amely ezt a helyspecifikus rekombinációt lehetővé teszi. A találmány szerinti genetikai konstrukciókban jelen levő specifikus rekombinációs rendszer (rekombinázok és specifikus felismerőhely) különböző eredetű lehet. Részletesen az alkalmazott specifikus szekvenciák és rekombinázok különböző szerkezeti osztályokhoz tartozhatnak, például a Tn3 transzpozon reszolvázcsaládjában vagy a lambda-bakteriofág integrázcsaládjába. A Tn3 transzpozon családjába tartozó rekombinázok közül különösen a Tn3 transzpozon, vagy a Tn21 és a Tn522 transzpozonok reszolvázát [Stark et al. (1992)]; a mu bakteriofág Gin invertázát, vagy plazmidok reszolvázait, például az RP4 pár fragmentumának reszolvázát [Abert et al., Mól. Microbiol. 12, 131 (1994)] említhetjük meg. A λ-bakteriofág integrázának családjába tartozó rekombinázok közül különösen a lambda [Landy et al., Science 197, 1147 (1977)], P22 és <p80 [Leong et al., J. Bioi. Chem. 260, 4468 (1985)], a Haemophilus influenzáé HP1 fágja [Hauser et al., J. Bioi. Chem. 267, 6859 (1992)] fágok integrázát, a P1 fág Cre integrázát, a pSAM2 plazmid integrázát [EP 350 341], vagy a 2μ plazmid FLP rekombinázát, és az E. coli XerC és XerD rekombinázait említhetjük meg.
Előnyösen a találmány tárgyát képező DNS-molekulák a természetes E. coli-plazmid, a ColE1 cer fragmentumát tartalmazzák. Az alkalmazott cer fragmentum a ColE1 382 bp Hpall fragmentuma, melyről kimutatták, hogy cisz-helyzetben lehetővé teszi a plazmid multimerek felbontását [Summers et al., Cell 36, 1097-1103 (1984); Leung et al., DNA 4, 351-355 (1985)]. Használhatunk egy kisebb méretű Hpall-Taql fragmentumot is (280 bp), vagy egy még kisebb (kb 220 bp) fragmentumot, amelyet a Hpall fragmentum tartalmaz, és amely ugyanazokkal a tulajdonságokkal rendelkezik [Summers et Sherrat (1988)]. A felbontás egy specifikus intramolekuláris rekombináció útján valósul meg, melyben négy, az E. coli genomja által kódolt fehérje vesz részt: ArgR, PepA, XerC és XerD [Stirling et al., Mól. Gén. Génét. 214, 80-84 (1988); Stirling et al., EMBO J. 8, 1623-1627 (1989); Colloms et al., J. Bacteriol. 172, 6973-6980 (1990); Blakely et al., (1993)].
Ebből a célból különösen előnyös, ha a ColE1 cer fragmentumát vagy annak egy részét alkalmazzuk, vagy azok egy korábbiakban meghatározott származékát.
Egy kidolgozott változat szerint a találmány szerinti DNS-molekula többek között tartalmaz egy szekvenciát, amely képes specifikusan kölcsönhatásba lépni egy ligandummal. Előnyös módon egy olyan szekvenciáról van szó, amely hibridizációval hármas hélixet tud kialakítani egy specifikus oligonukleotiddal. Ez a szekvencia így lehetővé teszi a találmány szerinti molekulák tisztítását egy hordozón immobilizált komplementer oligonukleotiddal való szelektív hibridizációval [lásd a WO 96/18744 számon közzétett bejelentést], A szekvencia a találmány szerinti DNS-molekulában bárhol elhelyezkedhet, ahol nincs hatással a kívánt gén és a replikációs origó működésére.
A találmányt reprezentáló DNS-molekulaként különösen a pXL2774 plazmidot és származékait igényelhetjük. A találmány keretein belül származékon értünk minden konstrukciót, amely a pXL2774-ből származik, és egy vagy több, a luciferáztól eltérő kívánt gént tartalmaz. Megemlíthetjük a pXL3029 és 3030 plazmidokat is, melyek egy terápiás gén expressziós kazettáját és egy ligandummal specifikus kölcsönhatást létesíteni képes szekvenciát tartalmaznak.
A találmány tárgya egy eljárás is specifikus gazdasejtek kialakítására, melyek különösen hatékonyak az ilyen terápiás DNS-molekulák előállítására.
A találmány egy másik tárgya egy eljárás cirkuláris DNS-molekulák előállítására, azzal jellemezve, hogy legalább egy, a korábbiakban definiált DNS-molekulát és egy in situ vagy nem in situ kifejeződő, a gazdasejtre nézve specifikus és idegen, az említett DNS-molekula replikációs origójának működését szabályozó fehérjét tartalmazó gazdasejtet az említett DNS-molekulákkal transzformált gazdasejtek szelektálását lehetővé tevő körülmények között tenyésztünk.
Előnyösebben a DNS-molekula replikációs origóját szabályozó fehérje in situ egy megfelelő génből kiindulva fejeződik ki. A replikációs iniciátorfehérjét kódoló gént egy csatolt replikon hordozhatja, amely kompatibilis az alkalmazott feltételes replikációs origó származékaival, vagy amelyet a gazdasejt genomjába rekombinációval vezetünk be, egy transzpozon, egy bakteriofág vagy bármely más vektor segítségével. Abban az esetben, ha a fehérjét kifejező gén egy csatolt replikonon helyezkedik el, ez utóbbi tartalmaz egy, a sejtben működőképes transzkripciós promoterterületet is, valamint egy 3’-irányban elhelyezkedő területet, amely egy transzkripciós végjelet határoz meg. Ami a promoterterületet illeti, amennyiben feltételezhető, hogy az működőképes a sejtben, az adott gén expressziójáért természetes körülmények között felelős promoterről lehet szó. Eltérő eredetű területekről is lehet szó (melyek más proteinek expressziójáért felelősek, vagy szintetikusak). Részletesebben prokarióta vagy bakteriofág gének promoterszekvenciáiról lehet szó. Például szó lehet a sejt genomjából származó promoterszekvenciákról.
Replikációs iniciátorfehérjét kódoló génként vagy vad géneket használhatunk, vagy olyan mutáns alléleket, melyek lehetővé teszik, hogy megnövelt kópiaszámú, a DNS-molekulában levő replikációs origó működését irányító iniciátorfehérjére specifikus plazmidokat (vagy származékokat) kapjunk.
Ilyen mutánsokat írtak le például az R6K [Inuzuka et Wada, Embo J. 4, 2301-2307 (1985); Greeneret al., Mól. Gén. Génét. 224, 24-32 (1990)], az Rts1 [Terawaki et ltoh (1985); Terawaki et al. (1990); Zeng et al. (1990)], az F [Seelke et al. (1982); Helsberg et al. (1985); Kawasaki et al. (1991)], az RK2 [Durland et al. (1990); Haugan et al. (1992,1995)], és a pSC1010 [Xia et al. (1991); Goebel et al. (1991); Fang et al. (1993)] plazmidok esetében.
Abban a különleges esetben, ha a DNS-molekula az R6K plazmidból származó replikációs origóval ren5
HU 224 400 Β1 delkezik, az iniciátorfehérje ugyanennek a plazmidnak a π-proteinje, vagy annak származéka. Különösen előnyös, ha a fehérjének egy olyan mutánsát fejezzük ki, amely jelentősen megnöveli a kiindulási plazmid kópiaszámát. Ehhez a gazdasejtbe integrálódott gén előnyösen a 2. számú szekvencia vagy annak egy része, vagy ezek egy származéka, és még előnyösebben a pir-116 gén. A megfelelő mutáció egy prolin leucinnal való helyettesítésének felel meg. A találmány egy különleges megvalósítási módjában a pir-116 gén közvetlenül a gazdasejt genomjába épült be.
Előnyösen a specifikus gazdasejt génjeinek egyike, amely elengedhetetlen a választott tenyésztési körülmények között, tartalmaz egy specifikus kodont, amelyet a DNS-molekula szintjén szelektált szuppresszor tRNS felismer. A találmány egy előnyben részesített megvalósítási módja szerint egy TAG amber kodonról van szó. Ebben az esetben a sejt olyan körülmények között, melyekhez a TAG kodont tartalmazó gén terméke szükséges, csak akkor képes növekedni, ha a sup expresszióját lehetővé tevő plazmid jelen van a gazdasejtben. A tenyésztési körülmények képezik tehát a szelekciós nyomást a DNS-molekulára.
Előnyösen az amber kodont tartalmazó gén egy aminosav, az arginin bioszintézisében részt vevő gén. Ez a gén, az argE, egy N-acetil-ornitinázt kódol [Meinnel et al., J. Bacteriol. 174, 2323-2331 (1992)], és ebben az esetben egy TAG kodont tartalmaz, amely egy Gln-53 (CAG)->TAG pontmutációnak felel meg; a sup gént hordozó plazmidra ható szelekciós nyomást tehát M9 minimálközegben való tenyésztéssel biztosítjuk [Maniatis T. et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]. De a gén lehet egy vitamin, egy nukleotidbázis bioszintézisgénje is, vagy egy bizonyos szén- vagy nitrogénforrás felhasználását lehetővé tevő gén, vagy bármely más gén, melynek működése elengedhetetlen a sejt életképességéhez a választott tenyésztési körülmények között.
A gazdasejtet előnyösen az E. coli törzsek közül választjuk, még előnyösebben az az E. coli XAC-1 törzs.
A találmány egy különleges megvalósítási módja szerint az igényelt eljárásban használt gazdasejt az E. coli XAC-1 törzs egy sejtje, amely genomjában a pir-116 gént tartalmazza, és a pXL2774 plazmiddal, vagy annak származékával van transzformálva.
A találmány egy előnyös változatában az igényelt eljárásban használt gazdasejt egy prokarióta sejt, melyben az endA1 gén, vagy egy homológ gén inaktivált. Az endA gén az E. coli-endonukleáz l-et kódolja. Ez a periplazmatikus enzim a kettős szálú DNS-t nem specifikusan vágó aktivitással rendelkezik [Lahman et al., J. Bioi. Chem. 237, 819-828 (1962); Wright, J. Bacteriol 107, 87-94 (1971)]. Egy az Escherichia coli különböző törzsein (vad vagy endA) végzett vizsgálat kimutatta, hogy a baktériumtörzsek kivonataiban inkubált plazmid DNS az endA+ törzseknél lebomlott, míg nem bomlott le az endA mutánsoknál [Wendt S., BioTechniques 17, 270-272 (1994)]. Az endA+ vagy a mutáns endA törzsekből izolált plazmid DNS minőségét a Promega cég saját tisztítási rendszerüket alkalmazva vizsgálta [Shoenfeld et al., Effects of bacterial strains carrying the endA1 genotype on DNA quality isolated with Wizard plasmid purification Systems. Promega notes 53 (1995)]. Következtetésük a következő: az endA mutánsból előállított DNS minősége általában jobb, mint a tesztelt endA+ törzsekben előállított DNS-é.
A plazmid-DNS-preparátumok minőségét tehát minden ennek az endonukleáznak köszönhető szennyeződés befolyásolja (a DNS hosszabb-rövidebb darabokra való lebomlása).
Az endA gént probléma nélkül deletálhatjuk vagy mutáltathatjuk abban az esetben, ha a mutánsok nem mutatva többé ezt az endonukleázaktivitást, általánosságban úgy viselkednek, mint a vad baktériumok [Dürwald et al., J. Mól. Bioi. 34, 331-346 (1968)].
Az endA1 gént inaktiválhatjuk mutációval, teljes vagy részleges delécióval, megszakítással stb. A pCOR plazmidok termeléséhez választott E. coli törzs endA génjének inaktiválását pontosabban úgy valósíthatjuk meg, hogy egy P1 bakteriofág segítségével átvisszük a Cherepanov és Wackernagel által leírt AendA::TcR deléciót [Cherepanov et Wackernagel, Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR casettes with the option of Flpcatalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158, 9-14 (1995)], vagy hogy a kérdéses baktériumban levő vad alléit kicseréljük egy mutáns vagy deléciós endA alléira homológ rekombinációval. Ennek a törzsnek az alkalmazása a találmány keretein belül előnyösen lehetővé teszi a termelt DNS minőségének javítását.
A találmány tárgya minden rekombináns, a korábbiakban definiált DNS-molekulát tartalmazó sejt is. Különböző, eukarióta, prokarióta stb. eredetű sejtekről lehet szó.
A sejteket bármely a szakember számára ismert eljárással megkaphatjuk, ami lehetővé teszi az említett plazmidnak egy adott sejtbe történő bevezetését. Például transzformációról, elektroporációról, konjugációról, protoplasztfúzióról vagy bármely más, a szakember számára ismert eljárásról lehet szó.
A találmány szerinti DNS-eket bármely vakcinációs vagy gén- és sejtterápiás alkalmazásban felhasználhatjuk, egy génnek egy szervezetbe, szövetbe vagy egy adott sejtbe történő átvitelére, vagy rekombináns proteinek in vitro termelésére.
Pontosabban a találmány szerinti DNS-ek közvetlen in vivő beadásához, vagy sejtek in vitro vagy ex vivő, egy betegbe való beültetés céljából végzett módosításához alkalmazhatók.
Ebben a tekintetben a találmány tárgya minden gyógyszerkészítmény, amely legalább egy, a korábbiakban definiált DNS-molekulát tartalmaz. A molekula egy kémiai és/vagy biokémiai transzfekciós hordozóhoz kapcsolódhat. Pontosabban kationokról (kalcium-foszfát, DEAE-dextrán stb.), liposzómákról lehet szó. A kapcsolódó szintetikus vektorok lipidek vagy kationos polimerek lehetnek. Ilyen vektorokra példaként említhetjük a DOGS-t (Transfectam TM) vagy a DOTMA-t (lipofectin TM).
HU 224 400 Β1
A találmány szerinti gyógyszerkészítményeket helyi, orális, parenterális, intranazális, intravénás, intramuszkuláris, szubkután, intraokuláris, transzdermikus stb. bevezetés céljából formulázhatjuk. Az igényelt plazmidot előnyösen injektálható formában vagy külsőleg alkalmazzuk. Bármely az injektálható formulázáshoz gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval keverhető. Különösen steril, izotóniás sóoldatokról lehet szó, vagy szárított, például liofilezett készítményekről, melyek az adott esettől függően steril víz vagy fiziológiás szérum hozzáadásával injektálható oldatok előállítását teszik lehetővé. Például glükóz- vagy nátrium-klorid-oldatban oldott Tris- vagy PBS-pufferről lehet szó. A betegbe közvetlen az érintett területre beadott injekció előnyös, mivel lehetővé teszi, hogy a terápiás hatást az érintett szövetekre összpontosítsuk. Az alkalmazott dózist különböző paraméterek, nevezetesen a gén, a hordozó, az alkalmazott beadási mód, az illető betegség, vagy a vizsgált kezelés időtartama függvényében választhatjuk meg.
A találmány szerinti DNS-molekulák egy vagy több olyan fontos gént tartalmazhatnak, azaz egy vagy több nukleinsavat (cDNS, gDNS, szintetikus vagy félig szintetikus DNS stb.), melynek transzkripciója, és adott esetben transzlációja a célsejtben terápiás, vakcináló, agronómiái vagy állatgyógyászati hatással rendelkező terméket hoz létre.
A terápiás gének közül különösen az enzimeket, vérszármazékokat, a hormonokat, a limfokineket: interleukinok, interferonok, TNF stb. [FR 9203120], a növekedési faktorokat, a neurotranszmittereket vagy azok prekurzorait vagy szintézisenzimeit, a trofikus faktorokat: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 stb., az apolipoproteineket: ApoAI, ApoAlV, ApoE stb. [FR 9305125], a disztrofint vagy egy minidisztrofint [FR 9111947], a tumorszuppresszorgéneket: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev stb. [FR 9304745], a véralvadásban szerepet játszó faktorokat kódoló géneket: VII., Vili., IX. stb. faktorok, az öngyilkos géneket: timidinkináz, citozin-dezamináz stb., vagy egy természetes, vagy mesterséges immunglobulin egészét vagy részét (Fab, ScFv stb.), egy ligandum RNS-t [WO 91/19813] stb. említhetjük meg. A terápiás gén lehet egy antiszensz szekvencia vagy gén is, melynek expressziója a célsejtben lehetővé teszi, hogy a sejt mRNS-ének transzkripcióját vagy gének expresszióját szabályozzuk. Az ilyen szekvenciák a célsejtben átíródhatnak például a sejt-mRNS-sel komplementer RNS-sé, és így gátolhatják annak fehérjévé történő transzlációját, az EP 140 308 számú szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint.
A kívánt gén lehet egy vakcinálógén is, azaz egy antigénpeptidet kódoló gén, amely embernél vagy állatnál immunválaszt indukál, vakcinák létrehozása céljából. Például az Epstein-Barr-vírusra, a HIV-vírusra, a hepatitis B vírusára [EP 185 573], az Aujeszky-betegség vírusára vagy tumorokra [EP 259 212] specifikus peptidantigénekről lehet szó.
Általában a találmány szerinti DNS-molekulában a kívánt terápiás, vakcináló, agronómiái vagy állatgyógyászati gén tartalmaz egy, a célsejtben vagy a célszervezetben működőképes transzkripciós promoterrégiót is, valamint egy 3’-irányban elhelyezkedő területet, amely egy transzkripciós terminációs szignált és egy poliadenilációs helyet határoz meg. Ami a promoterrégiót illeti, a kívánt gén expressziójáért természetes módon felelős promoterrégióról lehet szó, amennyiben arról feltételezhető, hogy működőképes az adott sejtben vagy szervezetben. De szó lehet eltérő eredetű (más fehérjék expressziójáért felelős, vagy szintetikus) területekről is. Például eukarióta vagy virális gének promotereit említhetjük meg. Például a célsejt genomjából származó promoterszekvenciákról lehet szó. Az eukarióta promoterek közül bármely olyan promoterről vagy annak származékszekvenciájáról szó lehet, amely egy gén transzkripcióját specifikus vagy nemspecifikus, indukálható vagy nem indukálható módon, erősen vagy gyengén elősegíti vagy visszaszorítja. Különösen a mindenütt jelen levő promotereket (a HPRT, PGK, α-aktin, tubulin stb. gének promoterei), az intermedier filamentumok promotereit (a GFAP, dezmin, vimentin, neurofilamentumok, keratin stb. gének promoterei), terápiás gének promotereit (például az MDR, CFTR, Vili faktor, ApoAI stb. gének promoterei), szövetspecifikus promotereket (a piruvátkináz, a viliin, a zsírsavkapcsoló bélprotein, a simaizom α-aktinja stb. gének promotere), vagy egy ingerre válaszoló promotereket (szteroidhormonok receptorai, retinsavreceptor stb.) alkalmazhatjuk. Ezenfelül egy vírus genomjából származó promoterszekvenciákról is szó lehet, például az adenovírusok E1A és MLP génjeinek promoterei, a CMV korai promotere, vagy az RSV LTR-ének promotere stb. Másrészt ezeket a promoterrégiókat aktivációs, regulációs vagy szövetspecifikus, vagy nagymértékű expressziót lehetővé tevő szekvenciák hozzáadásával módosíthatjuk is.
Másrészt a kívánt gén egy szignálszekvenciát is tartalmazhat, amely a szintetizált terméket a célsejt szekréciós útvonalaira irányítja. Ez a szignálszekvencia a szintetizált termék természetes szignálszekvenciája is lehet, de szó lehet bármely működőképes szignálszekvenciáról vagy egy mesterséges szignálszekvenciáról is.
A kívánt géntől függően a találmány szerinti DNS-molekulákat számos betegség kezelésére vagy megelőzésére használhatjuk, beleértve a genetikai betegségeket (disztrófia, cisztikus fibrózis stb.), a neurodegenerativ betegségeket (Alzheimer, Parkinson, ALS stb.), a rákokat, a véralvadási rendellenességekkel vagy diszlipoproteinémiával kapcsolt betegségeket, avirális fertőzésekkel kapcsolt betegségeket (hepatitis, AIDS stb.), vagy használhatjuk agronómiái vagy állatgyógyászati területen.
Másrészt a találmány tárgya feltételes replikációjú DNS-molekulák alkalmazása rekombináns proteinek termelésére. A baktériumokat alkalmazhatjuk a különböző eredetű, eukarióta- vagy prokariótafehérjék termelésére. A baktériumok közül az E. colit választjuk heterológ gének kifejezésére, mivel könnyű manipulálni, számos expressziós rendszer hozzáférhető, és jelentős mennyiségű fehérjét kaphatunk. Természetesen a ta7
HU 224 400 Β1 lálmány szerinti rendszer más szervezetekben is használható, mivel a tropizmust a replikációs origó természete határozza meg, amint azt korábban jeleztük. Egy ilyen alkalmazáshoz a kívánt nukleinsav tartalmaz egy kódolórégiót a választott, különösen prokarióta gazdához alkalmas expressziós szignálok kontrollja alatt. Például a Piac, Ptrp, PT7, Ptrc, Ptac, PL, PR promoterekről, a Shine-Dalgarno-szekvenciáról stb. lehet szó (ez az együttes képezi az expressziós kazettát). A kívánt nukleinsav bármely, a gyógyászat, a mező- és élelmiszer-gazdaság, a kémia vagy az agrokémia területén előnyöket mutató proteint kódoló szekvencia lehet. Szó lehet struktúrgénről, komplementer DNS-ről, szintetikus vagy félig szintetikus szekvenciáról stb.
Az expressziós kazettát a találmány tárgyát képező feltételes replikációjú vektorba építhetjük be, amelyek így egy kívánt protein expresszióját E. coliban lehetővé tevő feltételes replikációjú vektort alkotnak. A vektor több előnnyel is rendelkezik: nem szükséges antibiotikum alkalmazása a baktériumban történő szelektálásra (alacsonyabb költség, nem szükséges a termékben az antibiotikum vagy potenciálisan toxikus termékszármazék jelenlétének vizsgálata), gyakorlatilag nulla valószínűségű, hogy a plazmid a természetben szétterjed (feltételes replikációs origó), teljesen meghatározott közegben lehetséges a fermentáció. A példák bemutatják a feltételes vektorok rekombináns proteinek termelésében mutatkozó előnyös tulajdonságait.
A találmányt a következő példák segítségével szemléltetjük, amelyek azonban nem korlátozzák a találmány oltalmi körét, csupán illusztrációként szolgálnak.
Az ábrák leírása
1. ábra: Az R6K replikációban részt vevő területének funkcionális szerveződése.
2. ábra: Az R6K plazmid π-proteinje funkcionális doménjeinek szerveződése.
3. ábra: A pír gén E. coli XAC-1 genomjába történő bevezetése menetének bemutatása.
4. ábra: A pXL2666, 2730, 2754 vektorok kialakításának vázlata.
5. ábra: A pXL2774 kialakítása.
6. ábra: A növekedés és termelés kinetikája l-es fermentorban.
7. ábra: A növekedés és termelés kinetikája
800 l-es fermentorban.
8. ábra: A pXL3056 kialakítása.
9. ábra: Az E. coli XAC-1p/r-í 16 (pXL3056+PT7pol23) által termelt aFGF fehérje kimutatás indukció után. A denaturált teljes sejtkivonatokat 12,5% SDS-poliakrilamid gélre helyeztük. M: molekulatömeg-marker (Biorad, alacsony molekulatömeg sorozat). Miden sávot egy nyíl és egy szám jelez, amely a tömeget jelzi k-daltonban.
1: nem indukált XAC-1 pir-116 (pXL3056+pUC4K);
2: 42 °C-on indukált XAC-1 pir-116 (pXL3056+pUC4K);
3: nem indukált XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol23) 1. klón;
4: 42 °C-on indukált XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol23) 1. klón;
5: nem indukált XAC-1 pir-116 (pXL3056+PT7pol23) 2. klón;
6: 42 °C-on indukált XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol23) 2. klón; t1:1 pg tisztított aFGF; t4: 4 pg tisztított aFGF.
10. ábra: A pXL3029 és pXL3030 vektorok kialakításának vázlata.
/. Anyagok és módszerek
A) Anyagok
1. Tápközegek
Teljes LB, 2XTY és SOC közegeket, és minimál M9 közeget használtunk [Maniatis T. et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)]. A gélesített táptalajokat 15 g Difco agar hozzáadásával kaptuk. Ezenfelül, ahol szükséges, a közegeket antibiotikumokkal, 100 mg/l koncentrációjú ampicillinnel vagy 50 mg/l koncentrációjú kanamicinnel egészítettük ki. Az X-Gal és az S-Gluc kromogén szubsztrátumokat 40 mg/l koncentrációban alkalmaztuk.
2. E. coli törzsek, plazmidok és bakteriofágok
Az alkalmazott E. coli törzseket, -plazmidokat és -bakteriofágokat az itt következő példákban adjuk meg.
B) Módszerek
1. DNS-manipuláció
A bakteriális (plazmid, genomiális) és a fág (az M13 replikatív formája) DNS izolálását, a restrikciós endonukleázos emésztéseket, a DNS-fragmentumok ligálását, az agarózgél-elektroforézist (TBE-pufferben), és más standard eljárásokat a forgalmazók előírásai szerint végeztük az enzimet alkalmazó eljárásoknál, vagy a „Molecular Cloning, a Laboratory Manual” helyen leírtaknak megfelelően [Maniatis T. et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)].
Az elektroforézisek során használt DNS-méretmarkerek a következők: 1 kb minta (BRL) a lineáris fragmentumok esetében, és szuperhelikális DNS-marker (Stratagene) az emésztetlen plazmidok esetében.
A szekvenálást Sanger módszerével végeztük [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)], melyet a fluoreszcens didezoxinukleotidokat és Taq DNS-polimerázt alkalmazó automatizált eljáráshoz adaptáltunk (PRISM Ready CyeDideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems).
A használt oligodidezoxinukleotidokat (melyeket n° számú szekvenciaként jelölünk, lásd alább) Applied Biosystems 394 DNA/RNA Synthetiser szintetizátorral szintetizáltuk a foszfor-amidit-módszerrel, β-ciano-etil-védőcsoportokat használva [Sinha et al., Nucleic Acids Rés. 12, 4539-4557 (1984)]. A szintézis után a védőcsoportokat ammónium-hidroxiddal távolítottuk el. Két butil-alkoholos kicsapás lehetővé teszi az oligonukleotidok tisztítását és koncentrálását [Sawadago et al., Nucleic Acids Rés. 19, 674 (1991)].
HU 224 400 Β1
A PCR amplifikáláshoz alkalmazott oligonukleotidok szekvenciája:
3. számú szekvencia 5’-GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3’
4. számú szekvencia 5'-GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3’
5. számú szekvencia 5’-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3'
6. számú szekvencia 5-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3’
A PCR reakciókat [Saiki et al., Science 230, 1350-1354 (1985)] a következő feltételek között végeztük, 100 pl össztérfogatban. A reakcióközeg 150 ng genomiális DNS-t tartalmaz a vizsgálandó törzsből, 1 pg-ot mindkét oligonukleotidprimerből (24-mer), 10 μΙ 10XPCR-puffert, melynek összetétele a következő: 500 mM KCI, 0,1% zselatin, 20 mM MgCI2,100 mM Tris-HCI (pH 7,5), valamint 2,5 egység Taq DNS-polimerázt (Amplitaq Perkin-Elmer). A PCR-körülmények a Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler készüléken a következők: 2 perc 91 °C-on, 30 egymást követő denaturáló (1 perc 91 °C-on), hibridizációs (2 perc 42 °C-on) és elongációs (3 perc 72 °C-on) ciklus, és végül 5 perc 72 °C-on. A kapott termékeket, melyeket vagy emésztettünk egy restrikciós enzimmel, vagy nem, agarózgél-elektroforézissel vizsgáltuk.
A különböző fajtájú plazmidok DNS topoizomerázos vizsgálatát a következő módszerrel végeztük: A laboratóriumban tisztított enzimeket 1 órán át inkubáltuk 37 °C-on. A reakcióelegy (össztérfogat 40 pl) összetétele a következő: 150 ng plazmid, 300 ng DNS topoizomeráz I, vagy 150 ng E. coli DNS giráz, vagy 160 ng S. aureus DNS topoizomeráz IV és 20 μΙ az adott enzimre specifikus puffer. A pufferek összetételét itt adjuk meg:
a DNS topoizomeráz l-hez: 50 mM Tris-HCI (pH 7,7), mM KCI, 1 mM DTT, 100 pg/ml SAB, 3 mM
MgCI2, 1 mM EDTA a DNS topoizomeráz IV-hez: 60 mM Tris-HCI (pH 7,7), mM MgCI2, 10 mM DTT, 100 pg/ml SAB, 1,5 mM
ATP, 350 mM kálium-glutamát a DNS girázhoz: 50 mM Tris-HCI (pH 7,7), 5 mM
MgCI2, 1,5 mM ATP, 5 mM DTT, 100 pg/ml SAB, mM KCI.
2. E. coli transzformálása
Ezt rutineljárással, a Chung és Miller által leírt TSB- (Transformation and Storage Buffer) módszer szerint végeztük [Nucleic Acids Rés. 16, 3580 (1988)]. Egy olyan törzs esetében, mint a TG1 [Gibson et al., Ph. D Thesis, University of Cambridge (1984)], a transzformáció kapott hatásfoka 105-106 transzformáns a pUC4K pg-jára [Vieira et Messing, Gene 19, 259-268 (1982)]. Ha ennél magasabb transzformációs hatásfok szükséges, a baktériumokat elektroporációval transzformáljuk, az elektroporátor gyártója (Biorad) által ajánlott eljárás szerint. Ez az eljárás 108—101° transzformáns pUC4K pg-onként hatásfok elérését teszi lehetővé.
3. Kationos lipofektáns által közvetített transzfekció
Az alkalmazott sejtek az egér NIH 3T3 fibroblasztok, melyeket előző nap 24 lukú tenyésztőlemezre oltottunk, 50 000 sejt/lyuk sűrűséggel. Az alkalmazott tenyésztőközeg a 4,5 g/l glükózt tartalmazó, 10% borjúmagzatszérummal, 1% 200 mM glutaminoldattal és antibiotikumokkal (5-103 pg/ml streptomicin, 5Ί03 pg/ml penicillin) (Gibco) kiegészített DMEM közeg. A plazmid DNS-t (1 pg 25 pl 9%-os NaCI-ban) azonos térfogatú lipofektáns szuszpenzióval keverjük. Négy lipofektáns/DNS töltés arányt teszteltünk: 0, 3, 6 és 9. Ezeket az arányokat annak a figyelembevételével számoltuk, hogy 1 pg plazmid DNS 3,1 nmol negatív töltést hordoz, és hogy a lipofektáns 3 pozitív töltést hordoz molekulánként. 10 perces érintkeztetés után, amely lehetővé teszi a DNS/lipid komplex kialakulását, 50 pl DNS lipofektáns elegyet adunk a szérum nélküli közegben (500 pl) lévő sejtekhez. A sejteket előzőleg 2-szer mostuk ugyanazzal a közeggel. így elkerüljük a transzfekció szérum általi gátlását. Az inkubáció után (2 óra 37 °C-on CO2-inkubátorban) a közeget 10% borjúmagzatszérummal egészítettük ki. A sejteket ezután visszatettük inkubálni 24 órára.
4. Eukarióta sejtek luciferázaktivitásának mérése
Ezt 24 órával a transzfekció után végeztük. A luciferáz a luciferin oxidációját katalizálja ATP, Mg2+ és O2 jelenlétében, egy foton kibocsátása kíséretében. Az összes fénykibocsátás, melyet egy luminométerrel mértünk, arányos a minta luciferázaktivitásával. Az alkalmazott reagenseket a Promega forgalmazza (Luciferase assay system), melyeket az ajánlott módszer szerint alkalmaztunk. A sejtek lízise után minden kivonat oldhatatlan frakcióját centrifugálással távolítottuk el. A mérést 5 pl felülúszón végeztük, melyet vagy hígítottunk sejtlízispufferben, vagy nem.
5. A sejtkivonatok proteinkoncentrációjának mérése
Ezt a BCA-módszer szerint végeztük (Pierce), bicinkoninsavat használva [Wiechelman et al., Anal. Biochem. 175, 231-237 (1988)]. A SAB-etalon-skálát lízispufferben hoztuk létre (vö. III-B-4). A mérendő mintákat, és a skála mintáit előzetesen azonos térfogatú 0,1 M jód-acetamid/0,1 M Tris-puffer (pH 8,2)-rel kezeltük 1 órán át 37 °C-on. A kezelés lehetővé teszi, hogy elkerüljük a lízispufferben jelen levő redukálószerrel (DTT) való interferenciát a mérés közben. A leolvasást 562 nm-nél végezzük.
1. példa
XAC-1pirés pir-116 gazdatörzsek kialakítása homológ rekombinációval
A felhasznált törzs az E. coli XAC-1 törzs [Normanly et al. (1980)]. A törzs argE génje előnyösen tartalmazza a glutamin-53 (CAG) mutációját amber kodonná (TAG) [Meinnel et al., J. Bacteriol. 174, 2323-2331 (1992)]. Az argE gén a divergáló argECBH operonhoz tartozik, és egy argininbioszintézis-enzimet kódol, az N-acetil-ornitinázt. Az XAC-1 tehát nem képes arginint szintetizálni, és eb9
HU 224 400 Β1 bői következően minimálközegen nőni. Ez az auxotrófia megszűnik, ha a törzs egy szuppresszor tRNS expresszióját lehetővé tevő plazmidra tesz szert. Lehetséges tehát, hogy minimáltápközeggel szelektáljuk azokat a baktériumokat, melyek egy ilyen plazmidot hordoznak. Hogy lehetővé tegyük az R6K-eredetű plazmidok replikációját, be kell vezetnünk homológ rekombinációval a pír gént az XAC-1 genomjába. A pír gént (vad vagy mutáns) az uidA lokuszba a vad uidA gén és annak a pir (vagy pir-116) gén által megszakított kópiája közötti kicserélődéssel vezettük be. Az uidA gén egy β-glükuronidázt kódol, a β-glükuronidok hidrolízisenzimét. Ezt a gént gond nélkül inaktiválhatjuk, mivel nem szükséges a klasszikus szintetikus tápközegeken való növekedéshez, melyekben nem használunk β-glükuronidokat. Ezenfelül a β-glükuronidáz-aktivitást egy kromogén szubsztrát, az X-Gluc segítségével követhetjük, melynek hidrolízise kék pigmentet szabadít fel.
1. A KmR-uidA::pir (vagy pir-116) kazettát hordozó öngyilkos vektor kialakítása
Egyetlen baktériumgazdát használó eljárást alkalmaztunk, amely minimalizálja a kívánt törzs genomjának megváltozását. Az M13mp10 fágot [Messing et Vieira, Gene 19, 269-276 (1982)] használtuk öngyilkos vektorként [Blum et al., J. Bacteriol. 171, 538-546 (1989)]. A replikációhoz szükséges II génben levő amber mutáció az M13 gazdaspektrumát olyan törzsekre korlátozza, mint a TG1 (supE), melyek amber szuppresszor tRNS-t termelnek; a fág tehát nem tud E. coli sup+ törzsekben, például az XAC-1-ben replikálódni.
A 3,8 kb BamHI fragmentumot, mely a Tn5 kanamicinrezisztencia-génjét és az uidA:.p;r vagy az uidA:.p/'r-f 16 kazettát tartalmazza, M13wm34 és 33ból tisztítottuk [Metcalf et al., Gene 138, 1-7 (1994)]. Ezután ezeket BamHI-gyel linearizált M13mp10-be klónoztuk. A rekombináns kiónokat gélesített LB+Km tápközegen való szélesztéssel szelektáltuk, a ligációs elegy TG1-be történt elektroporációja után. A kapott kiónok hasonlóságát restrikciós analízises profilokkal, és a pir-116 mutációnak megfelelő terület szekvenálásával mutattuk ki.
2. A pir vagy pir-116 gének bevezetése az E. coli
XAC-1 genomjába homológ rekombinációval
Az alkalmazott stratégiát és a különböző használt eljárásokat a 3. ábrán mutatjuk be.
a) Első rekombinációs esemény
Az XAC-1 törzset elektroporációval transzformáltuk 10, 100 vagy 2000 ng RF-fel (mp10_idA::p/'r vagy pir-116). Az expressziós elegyek egyharmadát kanamicintartalmú LB-lemezekre szélesztettük, és egy éjszakán át inkubáltuk 37 °C-on. Az mp10_uidA:;p/'r vagy pir-116 fágok csak az XAC-1 (sup+) törzsben képesek replikálódni. A KmR marker tehát csak akkor marad fenn, ha beépül a baktérium genomjába az uidA gén vad kópiájával történt homológ rekombináció útján. Az XAC-1 elektroporációs eredményeit az 1. táblázatban mutatjuk be. A transzformáció kapott hatásfoka 4-109 transzformáns/gg pUC4K.
1. táblázat
Konstrukció A transzformált DNS-mennyiségekkel kapott telepek száma
10 ng 100 ng 2000 ng
M13mp 10 u idA: :pir 1 41 146
M13mp10 uidA:.p/'r-116 0 16 124
A vizsgált körülmények között az integránsok száma a DNS-mennyiséggel nem lineárisan nő. A transzformáció hatásfokának és az RF-ek méretének (11,7 kb) ismeretében közelítőleg képet alkothatunk a rekombináció gyakoriságáról. A 100 ng pontot nézve 10-6 nagyságú rekombinációs gyakoriságot kapunk.
b) Második rekombinációs esemény
A második rekombinációs eseményt a törzsek dezoxikolátrezisztenciája (DocR) alapján szelektáljuk.
Ehhez mindegyik konstrukcióból 5 integránst 0,2% nátrium-dezoxikoláttal kiegészített 2XTY közegen tenyésztettünk. Két elkülönült populáció jelent meg. Bizonyos kiónok látható zavarosodást mutatnak körülbelül 8 óra 37 °C-os tenyésztés után (két klón a pir konstrukciókból, és három a pir-116-ból). A többi klón csak egyéjszakás 37 °C-os tenyésztés után adott sűrű tenyészetet. Ezek majdnem mindegyike Kms volt, amint vártuk. Minden vizsgált elektroporáns esetében 50 Kms származékot X-Gluc-kal kiegészített LB-közegre oltottunk. 48 óra 37 °C-os tenyésztés után az UidA* kiónok halványkékek lettek, míg az allélhelyettesítésen átesettek (1. számú eset, 3. ábra) fehérek maradtak ezen a közegen (UidA-). A 2. táblázat a kapott kettős rekombinánsok fenotípusos vizsgálatát foglalja össze.
A kettős rekombinánsok 18-30%-a esett át allélhelyettesítésen.
2. táblázat
Törzs Kms-ek száma a DocR-ek között UidA- aránya a Kms-ek között
XAC-1 pir-2 50/50 18
XAC-1 pir-3 50/50 24
XAC-1 pir-4 50/50 34
XAC-1 pir-116-1 50/50 32
XAC-1 pir-116-4 35/50 30
3. A rekombinációval kapott törzsek Pir+ jellegének kontrollja
A kettős rekombinációval kapott törzsek Pir+ jellegének biztosítására mindegyik konstrukcióból három kiónt transzformáltunk pBW30-cal [Metcalf et al., Gene 138, 1-7 (1994)]. A tesztelt törzsek mindegyikénél a transzformánsok nyerése lehetővé teszi, hogy az XAC-1 genomjába beépült pir és pir-116 gének működőképességét bemutassuk. Ugyanilyen körülmények között nem kaptunk transzformánst a szülő XAC-1 törzzsel. Két XAC-1p/r (B és C) és két
HU 224 400 Β1
XbC-t pir-116 (E és D) kiónt további vizsgálatnak vetettünk alá.
4. A rekombinációval kapott törzsek kontrollja
PCR-amplifikációval
Az allélhelyettesítés alátámasztására PCR-amplifikációval kontrolláltuk az uidA lokusz genomiális régióit egyik és másik részről. Mindegyik oligonukleotidpár egy, a pír belső területének megfelelő oligonukleotidból és egy második, a kromoszomális uidA-hoz közeli területnek megfelelő oligonukleotidból áll, amelyet azonban a rekombinációra szolgáló fragmentum nem tartalmaz. Ez utóbbi oligonukleotid szekvenciáját a Genbank ECOUIDAA szekvenciájának (azonosító szám: M14641) segítségével határoztuk meg. így igazolni tudtuk a pir gén pontos elhelyezkedését a baktérium genomjában. Az amplifikált fragmentumokat, melyek mérete megegyezik az előre várttal, Mlul-emésztéssel igazoltuk.
2. példa
R6K-ból származó plazmidvektorok kialakítása, melyek a sup Phe szelekciós markert hordozzák Olyan vektorokat állítottunk elő, melyek az R6K γ-origóját és a kanamicinrezisztencia-gént tartalmazzák (pXL2666). Mivel a BW19610 (pir-116) 5 törzsben [Metcalf et al., (1993)] a pXL2666 multímerjeit figyeltük meg, vizsgáltuk a ColE1 cer fragmentumának erre a jelenségre gyakorolt hatását. Ezután a y-ori-KmR-cer (pXL2730) vektorba bevezettük a fenil-alanin szuppresszor tRNS (sup Phe) expressziós kazettáját. Ez a vektor, a pXL2760 szolgál a génterápiában használható vektorok kialakításának alapjául.
1. Az R6K γ-origót és a kanamicinrezisztencia-gént hordozó vektorok kialakítása és vizsgálata a) Vektorkialakítás
Az első kialakított plazmidban, a pXL2666-ban a kanamicinrezisztencia-gén a pUC4K-ból származik [Vieira et Messing, Gene 19, 259-268 (1982)], a replikációs origó, melyet egy 417 bp EcoRI-BamHI fragmentum tartalmaz, az öngyilkos pUT-T7pol vektorból származik [Herrero et al., (1990)] (4. ábra). A pXL2666 plazmid átvitele a BW19094 és 19610 törzsekbe [Metcalf et al., Gene 138, 1-7 (1994)] lehetővé tette, hogy bemutassuk, hogy a plazmid mennyisége valóban megnövekedik egy pir-116 törzsben, ha ugyanannak a plazmidnak egy pir törzsben levő mennyiségéhez hasonlítjuk. Mégis az emésztetlen plazmidok elektroforézises vizsgálata azt mutatta, hogy a növekedés együtt jár néhány multimerforma megjelenésével. Valószínűleg ez a jelenség kapcsolt a plazmid több kópiájának molekulái közötti rekombinációval. Létrehoztuk a pXL2730-at, a pXL-be klónozva a ColE1 természetes E. coli-plazmid cer fragmentumát, melyről kimutatták, hogy lehetővé teszi cisz-helyzetben a plazmid dimerek felbontását [Summers et Sherrat, (1984)]. Az alkalmazott fragmentum a ColE1 egy 382 bp-os Hpall fragmentumának felel meg [Leung et al., DNA 4, 351-355 (1985)]. Egy specifikus molekulák közötti rekombinációs helyet tartalmaz; működőképességéhez kizárólag gazdaproteineket, köztük a XerC és
XerC rekombinázt és a járulékos ArgR és PepA faktorokat igényli [Stirling et al., Mól. Gén. Génét. 214, 80-84 (1988); Stirling et al., Embo J. 8, 1623-1627 (1989); Colloms et al., J. Bacteriol. 172, 6973-6980 (1990)]. Hogy biztosak lehessünk, hogy a megfigyelt hatások valóban a cer fragmentumnak köszönhetőek, elkészítettük a pXL2754 kontrollplazmidot is, melyben a cer fragmentumból 165 bp deletált. Erről a delécióról kimutatták, hogy megszünteti a cer hatását a multimerek felbontására [Leung et al., DNA 4, 351-355 (1985)]. A különböző, ezen plazmidokhoz vezető klónozási lépéseket a 4. ábrán mutatjuk be.
b) A plazmidfajták kvalitatív és kvantitatív elemzése
- Agarózgél-elektroforézises vizsgálat
A különböző kialakított plazmidok elektroforézises vizsgálata lehetővé tette, hogy kimutassuk a különböző plazmidfajtákat, amelyek a használt törzsektől függően változnak. Az emésztetlen plazmidok méretét a szuperhelikális DNS-markerhez viszonyítva becsültük. A pir törzsben (BW 19094) a pXL2666, 2754 és 2730 plazmidok gyakorlatilag teljesen monomer formában voltak. A fő sávok feletti sávok a különböző, kissé kevésbé szuperhelikális topoizomereknek felelnek meg, amint a pXL2730 DNS giráz hatása után megfigyelt profilja is alátámasztja.
A pir-116 törzsek esetében (BW 19610) a profilok eltérőek: a pXL2666 és 2754 plazmidokkal különböző, a monomertől a multimerekig (2, 3 vagy 4 egység) terjedő fajtákat figyeltünk meg, a fő forma a dimer. EcoRl-emésztés után csak lineáris plazmid DNS-t találtunk; ezek a plazmidfajták vagy a plazmid multimereknek, vagy a különböző topoizomereknek felelnek meg. Mivel a formák szuperhelikális DNS-marker alapján meghatározott mérete a monomer plazmidok méretének egész számú többszöröse, nagyon valószínű, hogy multimerekről van szó. A multimerek kialakulása valószínűleg a pir-116 mutációnak köszönhető, annak ellenére, hogy a két törzs, a BW19094 és a BW19610 nem teljes mértékben izogén (a BW19610 recA). A pXL2730-cal kapott profil eltérő: bár a multimerformák még láthatóak, a fő forma a monomerforma. A cer fragmentum tehát képes megkönnyíteni az előállított plazmid multimerek felbontását, és ez független a recA-tól, a BW19610-ben.
- DNS topoizomerázos kezelés utáni vizsgálat
Annak a hipotézisnek a megcáfolására, amely szerint a pir-116 alléit hordozó törzsekben megfigyelt formák különböző topoizomerek lennének, minden plazmidpreparátumot DNS topoizomeráz hatásának tettünk ki. A különböző enzimek aktivitása a kísérleti körülmények között a következő volt: a DNS relaxálása az E. coli DNS topoizomeráz I esetében, a relaxált DNS negatív szuperhélixszé tekerése az E. coli DNS giráz esetében, és az összegömbölyödött DNS legombolyítása és a szuperhelikális DNS relaxálása S. aureus DNS topoizomeráz IV esetében. A DNS topoizomeráz IV hatása lehetővé teszi, hogy kimutassuk, hogy a nagy molekulatömegű plazmidformák nem több plazmidmolekula összegombolyodásának eredményei; ebben az esetben ezek visszaalakultak volna monomerformává. Az
HU 224 400 Β1 enzim működőképességét természetesen egy kinetoplaszt DNS-preparátumon ellenőriztük, amely összegömbölyödött DNS-molekulákból áll (nem mutatjuk). A relaxációs aktivitás szintén látható, mivel kevésbé migráló fajtákat kaptunk, mint a nem kezelt kontrolioknál. A DNS giráz hatása lehetővé tette, hogy a kissé relaxált topoizomereket a baktériumból kivont, legjobban szuperhélixszé tekeredett formákká alakítsuk át (monomer vagy dimer főleg). Ezenfelül lehetővé tette annak az igazolását is, hogy az előállított DNS-ek főleg szuperhelikális formában vannak. Az így kezelt minták lehetővé tették az előző eredmények alátámasztását, ami a konstrukciók fő formáját illeti. A DNS topoizomeráz I valóban relaxálta a DNS-t, de részleges módon. Ez annak a ténynek köszönhető, hogy a vizsgált plazmidok csak kevés egyszálú területet tartalmaznak, ahol az enzim elsődlegesen kapcsolódik [Roca, TIBS 20, 156-160 (1995)].
2. A sup Phe szelekciós marker bevezetése a pXL2730-ba
A szintetikus (Phe) szuppresszor tRNS gén expressziós kazettáját használtuk [Kleina et al., J. Mól. Bioi. 213, 705-717 (1990)]. Ez a kialakuló polipeptidláncba egy TAG kodonra válaszként egy fenil-alanint épít be. Ezenfelül lehetővé teszi, hogy a XAC-1-ben az argininhiányos közegen való jó növekedéshez elegendő mértékben aktív ArgE protein termelődjön. A pCT-2-F plazmidon [Normanly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6548-6552 (1986)] a sup Phe konstitutív módon fejeződik ki egy szintetikus, az E. coli Ipp génjének promoterszekvenciájából származó promoterből, a P|pp-ből kiindulva. A gén alatt a transzkripció leállítását az E. coli rrnC operonjának egy szintetikus terminátora, a TrrnC biztosítja [Normanly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6548-6552 (1986)]. A különböző klónozási lépéseket az 5. ábrán mutatjuk be.
Különböző szubklónozásokat végeztünk XAC-1ben. így ellenőriztük a szuppresszor tRNS expressziós kazetta működőképességét a törzs β-galaktozidáza aktivitásának köszönhetően, amely csak akkor létezik, ha a lacZu118am gén amber kodonja szuppresszált. Az utolsó lépés abból áll, hogy a sup Phe expressziós kazettát beépítjük a pXL2730-ba. A cer fragmentummal kapott eredmények miatt (Β-1-b) inkább ezt a plazmidot választottuk, mint a pXL26660-at. Megőriztük a kanamicinrezisztencia-gént a további klónozás megkönnyítésére, nevezetesen azért, hogy egy további szűrési lehetőséggel rendelkezzünk a végső klónozás során (a KmR elvesztése).
3. példa
A plazmidvektorok értékelése génterápiás alkalmazások szempontjából egérfibroblasztok transzfekciójával
1. A pXL2774 riporter plazmid kialakítása
A plazmid-DNS-termelő rendszer génterápiában való használhatóságának tesztelésére a pXL2760-ba beépítettünk egy riportergént, amely eukarióta sejtekben használható. A Photinus pyralis luciferázát kódoló luc gént alkalmaztuk, mivel a biolumineszcenciamérő eljárás igen érzékeny, nagy tartományban lineáris, és az eukarióta sejtek endogén aktivitásának köszönhető alapzaj igen gyenge. A luc gén a humán citomegalovírus egy korai génjének promoteramplifikáló szekvenciáinak irányítása alatt áll (CMV promoter), ami magas szintű expressziót tesz lehetővé. A luc-tól 3’-irányban egy nem transzlálódó terület van, amely az SV40 vírusból származik, és ami a poliadenilációs szignált tartalmazza [poli(A)+]. Egy köztes klónozási lépés után, amely az elérhető restrikciós helyek számának növelését tette lehetővé, a CMV promoter-luc-poli(A)+ kazettát a γ-origó-cer-sup Phe (pXL2760) minimális vektorba építettük be a KmR marker helyére. Az eredményként kapott plazmidot pXL2774-nek neveztük. A 6. ábra a különböző klónozási lépéseket foglalja össze. A ligációs elegyeket elektroporációval XAC-1p/r-7 16-ba transzformáltuk. Az inkubációt, amely lehetővé teszi, hogy a baktériumok a szelekciós markereket expresszálják, teljes tápközegben (SOC-közeg) végeztük; a sejteket tehát a szélesztés előtt kétszer mosni kellett M9 közeggel. Ez tette lehetővé a tápközegmaradványok eltávolítását, melyek minimálközegen való tenyésztésnél alapzajhoz vezettek volna.
Az elektroporált sejtek szélesztéséhez választott közeg az M9 minimálközeg, amely lehetővé teszi a szuppresszor tRNS-t kifejező baktériumoknak, tehát plazmidjaink jelenlétének szelektálását. X-Gal hozzáadása lehetővé teszi a kék festődés révén a szuppresszor tRNS kifejeződésének vizualizálását. A tenyészeteket körülbelül 20 óra 37 °C-on való tenyésztés után vizsgáltuk. A DNS nélküli vakmintában a telepek hiánya biztosított minket arról, hogy a szelekció korrekt, még sűrű szélesztésnél is. Minden restrikcióval vizsgált klón (8) valóban egy plazmidot hordozott, ami a várt profilnak felelt meg. Az így kialakított plazmidot, a pXL2774-et az egyik egy liter folyékony M9 közegben tenyésztett klónból kiindulva állítottuk elő (körülbelül 18 óra 37 °C-on), egy többek között egy ioncserélést is felhasználó módszerrel (Promega kit, MegaPreps). Az összegyűjtött DNS mennyisége 2 mg.
2. Az emlőssejtekbe transzfektált pXL2774 riporter plazmid vizsgálata
A pXL2774 képességét arra, hogy eukarióta sejteket transzfektáljon, és lehetővé tegye a luciferáz kifejezését, NIH 3T3 egérfibroblasztok transzfektálásával vizsgáltuk. A referenciaként választott vektor a pXL2622 plazmid (a Promega pGL2 plazmidjáról van szó, amelyben az SV40 promotert a CMV promoterrel helyettesítettük), amely ugyanazt a luciferáz expressziós kazettát hordozza, mint a pXL2774, de eltérő replikonon. Ez egy 6,2 kb-os ColE1-származék, amely az ampicillinrezisztencia-gént hordozza. A plazmid kontrollként szolgált. A luciferázaktivitást (melyet RLUban, relatív lumineszcenciaegységben fejezünk ki) a 3. táblázatban mutatjuk be.
A legjobb eredményeket akkor kaptuk, amikor a lipofektáns töltése/DNS töltése arány 6 volt; ilyen körülmények között a pXL2622 és a pXL2774 azonosnak tűnik.
HU 224 400 Β1
3. táblázat
pXL2622 pXL2774
Töltésarány RLU/pg protein lyukanként Átlag Variációs koefficiens RLU/pg protein lyukanként Átlag Variációs koefficiens
0 0,0 0,0 0,0 nem határozható meg 0,0 0,0 0,0 nem határozható meg
3 9,9-106 6,2-106 6,6-106 7,6-106 22 3.3- 106 2,9-106 2.4- 106 2,9-106 13
6 1,2-107 1,5-107 1,9-107 1,5-107 19 9,4-106 9,9-106 1,1-107 1,0-107 7
9 9.5- 106 7.5- 106 1,4-107 1,0-107 26 1,1-107 8,3-106 8,5-107 6,4-106 13
4. példa
A pCOR plazmidok öngyilkos vektor jellegének iga- 25 zolása E. colinál
Az R6K-ból származó, pCOR típusú plazmidok nem replikatív jellegét a pUC4K (ColE1 ori-KmR) [Vieira et Messing, Gene 19, 259-268 (1982)] és pXL2730 (R6K gamma-ori-KmR, lásd 2. példa) E. coli JM109-be 30 [Yannish-Perron et al., Gene 33, 103-119 (1985)] való elektroporációjával igazoltuk. Az alkalmazott elektroporátor a Gene Pulser Biorad, az elektrokompetens JM109 sejteket a gyártó előírásai szerint állítottuk elő és alkalmaztuk [Bacterial electro-transformation and 35 pulse controller instruction manual. Katalógusszám: 165-2098],
Az elektrotranszformált sejteket kanamicinnel (50 mg) kiegészített LB-agarra szélesztettük, és egy éjszakán át inkubáltuk 37 °C-on. A kapott eredményeket 40 lentebb mutatjuk be.
Eredmények:
Plazmid Transzfor- máit mennyiség Transzfor- mánsok száma Hatásfok (transzfor- mánsok száma/ng plazmid)
pUC4K 0,01 >2000 >2-105
pXL2730 5 0 0
Az eredmények azt mutatják, hogy legalább 5 nagyságrendnyi különbség van egy ColE1-származék (pUC4K) transzformációs hatásfoka és egy R6K-származék (pXL2730) transzformációs hatásfoka között olyan törzsben, amely nem fejezi ki a pir gént. Pir+ törzsben, amilyen az XAC-1pir-116, az R6K-ból származó plazmidok elektrotranszformációs hatásfoka klasszikusan eléri vagy meghaladja a 108 transzformáns/mg plazmid nagyságot.
5. példa
Plazmid DNS termelése az E. coli XAC-tpir-116 (pXL2774) törzse nagy sűrűségű tenyésztésével: fermentációs eljárás
5.1. Törzsek
Egy minimálplazmid, a pXL2774 termelése E. coli XAC-1p/rfí6-ban (1. példa); A plazmid a következő elemeket tartalmazza: R6K ori-cer-tRNSamsupPhe és a luc riportergén egy expressziós kazettája a CMV promoter kontrollja alatt (3. példa). Kifejlesztettünk egy nagy termelékenységű eljárást az ilyen típusú plazmidok termelésére.
5.2. Tápközegek és tenyésztési körülmények
a) Növesztő tápközeg
- A tenyészet inokulumokhoz alkalmazott definiált tápközeg összetétele (g/l): 6 Na2HPO4, 3KH2PO4, 0,5 NaCI, 1 NH4CI, 3 NH4H2PO4, 5 glükóz, 0,24 MgSO4, 7 H2O, 0,015 CaCI2, 2 H2O, 0,010 tiamin HCI.
- A feed-batch tenyésztéshez alkalmazott komplex tápközeg összetétele (g/l): 8 KH2PO4,
6,3 K2HPO4, 1,7 Na2HPO4, 0,74 (NH4)2SO4, 0,12 NH4Ci, 3 élesztőkivonat, 2 glükóz, 2,4 g/l MgSO4, 7 H2O, 0,015 CaCi2, 2 H2O, 0,010 tiamin, sóoldat (Fe, Mn, Co, Zn, Mo, Cu, B, Al).
- A feed-batch tenyésztéshez alkalmazott definiált tápközeg azonos a komplex közeggel, de az élesztőkivonatot 2,5 g/l NH4CI helyettesíti.
b) A feed-batch tenyésztés körülményei 1 I tápközeget tartalmazó 2 literes fermentorban (Setric Francé) vizsgálatokat végeztünk, hogy megha55 tározzuk az optimális feltételeket a plazmid DNS növekedéséhez és termeléséhez. A fermentort a stacionárius növekedési fázis elejéről származó inokulumtenyészetből 80 ml-rel oltottuk be.
A fermentáció alatt a pH-t kontrolláltuk, és automa60 tikusan 6,9 és 7,0 között tartottuk 10%-os (tömeg/térfo13
HU 224 400 Β1 gat) ammónium-hidroxiddal; a hőmérsékletet 37 °C-on tartottuk; a szellőzést 75 l/h-ra állítottuk be (1,1 wm) 0,2 bar nyomás alatt, és az oldott oxigént a levegő telítettségének 40%-ára állítottuk be a rázatás sebességének szabályozásával, és ha szükséges, tiszta oxigénnel való dúsítással.
Minden paramétert (pH, hőmérséklet, rázatás, OD, O2 és CO2 a kifolyóban) egy Hewlett-Packard 9000-hez kapcsolt HP3852 interface segítségével összegyűjtöttük és lineárisan ábrázoltunk.
A tápláló tápközeg alapösszetétele a következő: szénforrás 50%, magnézium-szulfát 0,7%, tiamin 0,02%; a komplex közeghez 6 és 10% közötti koncentrációban élesztőkivonatot adtunk.
A feltételek 800 literes fermentorhoz való adaptálásához két egymás utáni inokulumtenyészetet tartalmazó termelési folyamatot végeztünk, laboratóriumi léptékben: I. inokulum rázatott Erlenmeyerben, és II. inokulum 2 literes fermentorban (batch tenyésztés), melyet feed-batch termelő tenyésztés követ 7 literes fermentorban.
5.3. Eredmények
Különböző tenyésztési körülményeket vizsgáltunk komplex közegben, definiált közegben, különböző növekedési rátánál. Minden esetben a baktériumtörzs kezdeti batch tenyésztése és a szénforrás elfogyasztása után tápláló tápközeget adtunk a fermentorba egy előre programozott addíciós profilhoz kapcsolt perisztaltikus pumpa segítségével. A profilt megelőző kísérletek alapján következtettük ki, melyekben a táplálási rátát az oldott oxigén aránya, vagy egy konstans növekedési ráta szabályozta.
Ezenfelül ahhoz, hogy nehézség nélkül extrapolálhassuk a 2 literes fermentációs körülményeket 800 l-es fermentorra a közeg túloxigenizálódása nélkül, a maximális oxigénigényt a tenyésztés végén 2,5-3 mM/percre állítottuk be. Ehhez a mikroorganizmus növekedési rátáját lecsökkentettük, ha ez szükséges volt, a komplementer alkotórész táplálásának a hozamra gyakorolt hatásával.
Amint a 4. táblázat mutatja, nagyon jó eredményeket kaptunk mind komplex, mind definiált tápközegen, mind laboratóriumi, mind 800 literes léptékben; a növekedés és a DNS-termelés kinetikája ráadásul teljes mértékben összehasonlítható (vő. 6. és 7. ábra).
4. táblázat
Komplex tápközeg Definiált tápközeg
2 vagy 7 l-es fer- mentor 800 l-es fermentor 2 l-es fermentor
A fermentáció időtartama (óra) 40 39 48
μ h-1 0,130 0,132 0,124
OD(600 nm) 114 100 94
Xg/I 44 37 30
Komplex tápközeg Definiált tápközeg
2 vagy 7 l-es fermentor 800 l-es fermentor 2 l-es fermentor
Plazmid DNS (mg/l tápközeg) 115 100 100
Plazmid DNS (mg/gX) 2,6 2,7 3,3
X=biomassza (száraz sejttömeg)
Az általános eredmények arra utalnak, hogy:
- a 2 l-es fermentorról 800 literesre való léptékváltást minden probléma nélkül elvégezhetjük,
- a felhasznált oxigén mennyisége erősen korrelál a termelt biomasszával (1,08 g 02/g termelt biomassza),
- a plazmid legalább 50 generáción át stabil szelekciós nyomás nélkül,
- komplex közegben megnövekedett, 40 g száraz sejt/liternél nagyobb mennyiségű biomasszát kaphatunk,
- a plazmid DNS termelése eléri a 100 mg szuperhelikális DNS/I tápközeg mennyiséget,
- nagyon jó korrelációban van a DNS-termelés és a biomassza: a termelést 1 mg plazmid DNS/OD egység, vagy 2,7 mg plazmid DNS/g biomassza alapján becsülhetjük, és ez független a fermentáció időtartamától,
- a definiált tápközeg alkalmazása lehetővé teszi, hogy megnövekedett biomasszát (30 g száraz sejt/l) és plazmid-DNS-termelést (100 mg/l) érjünk el, és mindezt a termelékenység elvesztése nélkül.
6. példa
A pXL2774 átvitele állati sejtekbe, in vitro és in vivő
6.1. A pXL2774 in vitro átvitele állati sejtekbe A minimális pXL2774 plazmid képességét arra, hogy különböző sejtvonalakat transzfektáljon, in vitro teszteltük, humán és egéreredetű sejteken. A pXL2784-et használtuk kontrollként. Ez ugyanazt az eukarióta expressziós kazettát (CMV promoter luciferáz-poliA) tartalmazza, mint a pXL2774, de ez egy 6,4 kb ColE1-származék, amely az E. colinak kanamicinrezisztenciát biztosító gént tartalmazza.
A vizsgált sejtek a következők:
Sejtek Típus ATCC referencia/bibliográfia
3LL egér-tüdőkarcinóma
NIH 3T3 egérembrió-fibro- blasztok CCL92
293 5 típusú adenovírussal transzformált humán embrionális vesesejtek CRL1573
HU 224 400 Β1
Táblázat (folytatás)
Sejtek Típus ATCC referencia/bibliográfia
HeLa humán méhnyakkarcinóma CCL2
Caco-2 humán béladenokarcinóma HTB37
H460 humán nem kissejtes tüdőkarcinóma HTB177
ECV 304 humán köldökzsinórendothelialíssejtek Takahashi et al., In Vitro Cell Dev. Bioi. 26, 265-74 (1990)
A transzfekciós körülmények a következők voltak:
1. nap: a sejtek oltása 100 000 sejt/2 cm2 lyuk sűrűséggel (24 lyukas tenyésztőlemez) 10% borjúmagzatszérummal (FBS) kiegészített DMEM (Dulbecco-féle módosított Eagle Médium) közegbe.
3. nap: a sejtek transzfekciója 10 μΙ transzfekciós eleggyel, amelynek tartalma: 0,5 pg DNS, 150 mM NaCI, 5% glükóz és 3 nmol RPR120 535 lipofektáns DNS pg-onként, 250 pl tenyésztőközegben, amelyet egyes esetekben 10% FBS-sel egészítettünk ki. 2 órás inkubálás után a közeget 500 pl 10% FBS-sel kiegészített DMEM-közegre cseréltük.
4. nap: A tenyészközeg megújítása
5. nap: A sejtek mosása PBS-ben, majd lízis 100 pl Promega lízispufferrel (Promega Cell Lyzis Buffer E153 A). A luciferázaktivitás mérését Lumat LB 9501 luminométerben (Berthold) végeztük 10 pl lizátumon, 10 másodperc integrációs időtartammal. Az alkalmazott reagens a Promega reagense (Promega luciferase Assay Substrate). Az eredményeket 10 pl lizátumra (4 lyukon végzett mérés átlaga) RLU-ban (relatívlumineszcencia-egység) kifejezve a következő táblázatokban foglaljuk össze. A variációs koefficienseket is megadtuk.
A szérum hiányában végzett transzfekciós eredmények a következők.
sejttípus
NIH 3T3 3LL 293
PXL2774 RLU 37 763 380 559 270 1 884 200
CV 16 25 73
pXL2784 RLU 113 764 1 723 546
CV 24 101
sejttípus
HeLa CaCo2 H460 ECV304
pXL2774 11 000 000 1 108 422 1 459 501 36 450
15 14 5 23
PXL2784 557 930 93 610 7 563 468 795
87 40 11 40
A szérum jelenlétében (10%) végzett transzfekciós eredményeket itt mutatjuk be.
sej ttípus
NIH 3T3 3LL 293
pXL2774 RLU 50 612 590 566 377 992 500
CV 12 18 59
pXL2784 RLU 12 693 780 436 704 2 300 000
CV 38 12 47
HU 224 400 Β1
Táblázat (folytatás)
sejttípus
HeLa H4 60 ECV304
PXL2774 9 490 000 857 385 18 021
25 16 30
pXL2784 1 508 480 433 023 32 074
23 27 47
Az eredményekből az következik, hogy a pXL2774 képes hatékony módon transzfektálni in vitro különböző, mind egér-, mind humán eredetű sejttípusokat. A luc riportergén expressziója lehetővé tette annak kimutatását, hogy a transzfekciós hatékonyság legalább annyira 20 jó, mint egy klasszikus, ColE1-eredetű plazmidé, amely ugyanazt a luciferáz expressziós kazettát hordozza.
6.2. A pXL2774 irt vivő átvitele állatoknál (egérnél)
a) 1. modell: csupasz DNS egér kraniális sípcsontizmába 25
A csupasz plazmid DNS-t 5% glükóz, 150 mM
NaCI-oldatban OF1 egerek kraniális sípcsontizmába injektáltuk. Az izmokat 7 nappal az injekció után kivettük, aprítottuk, 750 μΙ lízispufferben (Cell Lysis Buffer Promega E153A) homogenizáltuk, majd 20 000 g-vel centrifugáltuk 10 percen át.
A luciferázaktivitás mérését 10 μΙ felülúszón végeztük el 50 μΙ reagens (Promega Luciferase Assay Substrate) hozzáadása után. A leolvasást Lumat LB9501 luminométerben (Berthold) végeztük 10 másodperces integrációs idővel.
Az eredményeket a következő táblázatban adjuk meg.
plazmid pXL2784 pXL2774 pXL2784 pXL2774
izmok száma 8 8 10 10
injektált térfogat (μΐ) 30 30 33 33
pg DNS/izom 19 13,5 10 6,25
RLU (10 μΙ-re)
átlag 80 922 471 733 35 329 30 569
szórás 104 573 402 602 37 041 35 774
Az eredmények azt jelzik, hogy egy feltételes repli- 45 kációjú plazmid, mint a pXL2774, valóban képes az egér izomsejtjeit transzfektálni in vivő, és ennek hatékonysága összehasonlítható, ha nem nagyobb, egy klasszikus, ColE1-eredetű plazmid transzfekciós hatékonyságával, amely ugyanazt a luciferáz gén 50 expressziós kazettát hordozza.
b) 2. modell: tumoros 3T3 HER2 modell
A modell a következő:
- Swiss/csupasz típusú nőnemű felnőtt egerek
- A kísérleti tumort 107 3T3 HER2 sejt szubkután 55 lágyékba történt injektálása után indukáltuk.
- A transzfekciós elegy injektálását 7 nappal a sejtek injektálása után végeztük.
Injektált oldat: A DNS-t először feloldottuk a pufferben. 60
Minden anyag hozzáadása után az elegy tartalmaz a DNS-en kívül NaCI-ot (150 mM) és 5% D-glükózt vízben, vagy 5 mM HEPES-pufferben.
- Két nappal az injekció után a tumoros szövetet kivettük, lemértük, majd felaprítottuk, és 750 μΙ lízispufferben (Promega Cell Lysis Buffer E153A) homogenizáltuk. Centrifugálás után (20 000 g 10 percig) 10 μΙ felülúszót levettünk, ami a luciferázaktivitás becslését tette lehetővé. Az aktivitást a teljes fénykibocsátás mérésével határoztuk meg 50 μΙ reagenssel (Promega Luciferase Assay Substrate) való elegyítés után Lumat LB9501 luminométerben (Berthold) 10 másodperces integrációs idővel.
A teljes tumoros lízis felülúszóban becsült aktivitást RLU-ban (Relatíve Light Units) fejeztük ki.
HU 224 400 Β1
Eredmények:
puffer plazmid eredmény RLU/tumor +/n
HjO vagy HEPES referencia pg/tumor [ DNS] in j . old. végső konc átlag szórás
HEPES pX12784 10 0,5 pg/l 744 150 682 434 6/6
pXL2774 10 0,5 pg/l 1 016 380 1 322 500 5/6
H2O PX12784 24 0, 6 pg/l 2 906 073 1 745 857 8/8
PXL2774 16,8 0,4 pg/l 4 292 043 4 995 187 6/6
h2o PX12784 7,5 0,3 pg/l 702 554 552 207 6/7
PXL2774 5 0,2 pg/l 3 413 430 4 000 875 6/6
Az eredmények azt jelzik, hogy egy feltételes replikációjú plazmid, mint a pXL2774, valóban képes egér tumoros sejteket in vivő transzfektálni, és a transzfekció hatásfoka legalább összehasonlítható egy klasszikus, ColE1-eredetű, ugyanazt a luciferáz gén expressziós kazettát hordozó plazmidéval.
A különböző kísérletek lehetővé tették, hogy bemutassuk, hogy a feltételes replikációjú plazmidok, és különösen a pXL2774 valóban rendelkeznek a génterápiás alkalmazáshoz elengedhetetlen transzfekciós tulajdonságokkal. Pontosabban bemutattuk, hogy:
1. a pXL2774 képes hatékonyan transzfektálni in vitro különböző típusú, humán vagy egéreredetű sejteket;
2. a pXL2774 képes in vivő transzfektálni egérizmot;
3. a pXL2774 képes in vivő transzfektálni egérbe ültetett tumoros sejteket.
Az elektrotranszformációs, fermentációs és transzfekciós kísérletek tehát lehetővé tették, hogy a feltételes replikációs vektorokat a génterápiában alkalmazható vektorokként értékeljük, bemutatva, hogy
i) nem replikálódnak detektálható módon a pír gént ki nem fejező E. coli törzsben (feltételes replikáció);
ii) ipari termeléshez megfelelő léptékben termelhetők, olyan tápközegben, mely lehet teljesen definiált, és amely nem tartalmaz antibiotikumokat;
iii) a plazmidok in vitro és különösen in vivő képesek transzformálni emlőssejteket.
7. példa
Rekombináns proteinek termelése in vitro
7.1. Expressziós vektorok kialakítása
Egy ilyen megközelítés megvalósíthatóságának bemutatására egy expressziós vektort hoztunk létre a korábban leírt feltételek szerint (2. és 3. példák). A vektor, a pXL3056 tartalmazza:
1. a bakteriális részt, amely a feltételes replikációs origóból (gamma-origó), a ColE1 cer fragmentumából és a baktériumoknál való szelekciót biztosító génből (sup) áll;
2. az expressziós kazettát, amely a Studier által leírt rendszeren alapul [Studier et al., Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990)], amely tartalmazza a T7 bakteriofág 10. génjének promoterét, a lacO operátort, az aFGF 154-et kódoló gént (Acid Fibroblast Growth Faktor, vagy savas fibroblaszt növekedési faktor, a 154 aminosavat tartalmazó forma) [Jaye et al., Science 233, 541-5 (1986)], a T7 bakteriofág TF terminátorát. Az expressziós kazetta azonos a pXL2434-en jelen levővel, melyet a WO96/08572 számon közzétett bejelentésben írtak le.
A pXL3056 kialakítását a 8. ábrán mutatjuk be. A pXL2434 Bglll fragmentumát (1,1 kb), amely az aFGF expressziós kazettát tartalmazza, a feltételes replikációjú pXL2979 vektorba (1,1 kb tisztított fragmentum) klónozzuk a Bglll és EcoRI helyekre, hogy a pXL3056-ot hozzuk létre.
A pXL2979 3 fragmentum ligálásának eredménye: i) a pXL2730 Accl-Xbal fragmentuma (0,8 kb, a gamma-origót és a cert hordozza), ii) a pXL2755 Narl-Spel fragmentuma (0,18 kb, a sup Phe gént hordozza), iii) a pXL2660 Sall-Spel fragmentuma (1,5 kb, a kanamicinrezisztencia-gént hordozza).
A pXL2660 a pUC4K [Vieira et Messing, Gene 19, 259-268 (1982)] 1,2 kb Pstl fragmentumának a Pstl-gyel linearizált pMTL22-be [Chambers et al., Gene 68, 139-149 (1988)] való klónozásának eredménye.
7.2. Az expressziós törzs létrehozása
A pXL3056 plazmidot transzformációval bevezettük az XAC-1pir116 törzsbe. A kapott törzset ezután a PT7pol23 plazmiddal [Mertens et al., Bio/Technology 13, 175-179 (1995)] transzformáltuk 30 °C-on. Ahhoz, hogy a kívánt gént a T7 promoter kontrollja alatt fejezzük ki, a baktériumnak tartalmaznia kell genomjában, egy plazmidon vagy bakteriofágon egy T7 bakteriofág RNS-polimeráz expresszióját lehetővé tevő kazettát. Az ismertetett példában a PT7pol23 plazmidot alkalmaztuk, amely kompatibilis az R6K-származékokkal, amilyen a pXL3056 is, és amely hőmérséklet indukálható módon teszi lehetővé a T7 bakteriofág RNS-poli17
HU 224 400 Β1 merázának expresszióját. De azt is elképzelhetjük, hogy az XAC-1 p/r-1 16 törzset a lambda-DE3-mal [Studier et al., Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990)] lizogenizáljuk, hogy csak egyetlen plazmidot őrizzen meg, és a T7 RNS-polimeráz termelését inkább IPTG-vel in- 5 dukáljuk, mint a hőmérséklettel.
7.3. Az aFGF expressziöja
Az XAC-1 pir-116 (pXL3056+PT7pol23) törzset 30 °C-on tenyésztjük M9 minimáltáptalajon, melyet 0,2% kazaminosavakkal (DIFCO) és kanamicinnel 10 (25 pg/ml) egészítettünk ki, amíg az 600 nm-nél mért optikai denzitás el nem éri 0,6-1 értéket. A tenyészet felét ekkor 42 °C-ra helyeztük (a T7 RNS-polimeráz indukciója), míg a másik felét 30 °C-on hagytuk (negatív kontroll). Ugyanezt a kísérletet végeztük el az XAC-1 pir-116 15 (pXL3056+pUC4K) törzzsel is, amely a T7 RNS-polimeráz nélküli aFGF expressziós kontroll.
A kapott eredményeket a 9. ábrán mutatjuk be.
Ezek azt mutatják, hogy az aFGF-termelés összehasonlítható vagy magasabb a BL21(DE3) 20 (pXL2434)-gyel [WO 96/08572] megfigyeltnél, ami azt támasztja alá, hogy a feltételes replikációjú plazmidok valóban képesek rekombináns proteineket expresszálni in vivő, például E. coliban.
8. példa
Egy pCOR vektor kialakítása, amely a vad vagy hibrid p53 proteint fejezi ki A példa a találmány szerinti feltételes replikációjú, egy p53 proteint kódoló nukleinsavat tartalmazó vekto- 30 rok kialakítását írja le. Ezeket a vektorokat p53 típusú aktivitás visszaállítására használhatjuk deficiens (mutáns, deletált) sejtekben, amilyenek például a tumoros sejtek.
Az eukarióta expressziós kazetta a következő elemeket tartalmazza:
1. CMV korai „immediate early” promoter (-522±72 helyzet), melyet az I. típusú Herpes simplex vírus timidinkináz-génjének leaderszekvenciája követ (-60±1 helyzet a génen, a McKnight S. L. cikk [Nucleic Acids Rés. 8, 5949-5964 (1980)] szekvenciájára hivatkozva);
2. a vad p53 proteint, vagy egy p53 variánst kódoló nukleinsav, például a PCT/FR96/01111 számú bejelentésben leírtak szerint (V325K=V325 egy Kozák szekvenciával az ATG-nél);
3. az SV40 poliA poliadenilációs szekvenciája.
Az elemeket egy Ascl-Xbal fragmentum formájában a pCORpXL2988 vektorba a BssHII és Spel helyek közé helyeztük. A pXL2988 azonos a pXL2979-cel (7.1. példa), attól egy kiegészítő elem meglétében tér csak el, ez egy 17-szer GAA trinukleotidból álló, DNS hármas hélixet kialakítani képes szekvencia, amely a gamma replikációs origó mellett helyezkedik el.
A kapott plazmidokat pXL3029-nek és 3030-nak neveztük el (10. ábra).
A konstrukciók működőképességét in vitro p53-SAOS2 sejttenyészeteken igazoltuk a p53 vagy a p53superWT transzkripciós aktivátor aktivitásának mérésével.
SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE (1) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 389 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLAK SZÁMA: egyetlen (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGTCAGCCGT TAAGTGTTCC TGTGTCACTG AAAATTGCTT TGAGAGGCTC TAAGGGCTTC 60 TCAGTGCGTT ACATCCCTGG CTTGTTGTCC ACAACCGTTA AACCTTAAAA GCTTTAAAAG 120 CCTTATATAT TCTTTTTTTT CTTATAAAAC TTAAAACCTT AGAGGCTATT TAAGTTGCTG 180 ATTTATATTA ATTTTATTGT TCAAACATGA GAGCTTAGTA CGTGAAACAT GAGAGCTTAG 240 TACGTTAGCC ATGAGAGCTT AGTACGTTAG CCATGAGGGT TTAGTTCGTT AAACATGAGA 300 GCTTAGTACG TTAAACATGA GAGCTTAGTA CGTGAAACAT GAGAGCTTAG TACGTACTAT 360 CAACAGGTTG AACTGCTGAT CTTCAGATC 389 (2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 960 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLAK SZÁMA: egyetlen (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TATACAGAAT GATGAGGTTT TTTTATGAGA CTCAAGGTCA TGATGGACGT GAACAAAAAA 60
ACGAAAATTC GCCACCGAAA CGAGCTAAAT CACACCCTGG CTCAACTTCC TTTGCCCGCA 120
HU 224 400 Β1
AAGCGAGTGA TGTATATGGC GCTTGCTCCC ATTGATAGCA AAGAACCTCT TGAACGAGGG CGAGTTTTCA AAATTAGGGC TGAAGACCTT GCAGCGCTCG CCAAAATCAC CCCATCGCTT GCTTATCGAC AATTAAAAGA GGGTGGTAAA TTACTTGGTG CCAGCAAAAT TTCGCTAAGA GGGGATGATA TCATTGCTTT AGCTAAAGAG CTTAACCTGC CCTTTACTGC TAAAACTCC CCTGAAGAGT TAGATCTTAA CATTATTGAG TGGATAGCTT ATTCAAATGA TGAAGGATAC TTGTCTTTAA AATTCACCAG AACCATAGAA CCATATATCT CTAGCCTTAT TGGGAAAAAA AATAAATTCA CAACGCAATT GTTAACGGCA AGCTTACGCT TAAGTAGCCA GTATTCATCT TCTCTTTATC AACTTATCAG GAAGCATTAC TCTAATTTTA AGAAGAAAAA TTATTTTATT ATTTCCGTTG ATGAGTTAAA GGAAGAGTTA ACAGCTTATA CTTTTGATAA AGATGGAAAT ATTGAGTACA AATACCCTGA CTTTCCTATT TTTAAAAGGG ATGTGTTAAA TAAAGCCATT GCTGAAATTA AAAAGAAAAC AGAAATATCG TTTGTTGGCT TCACTGTTCA TGAAAAAGAA GGAAGAAAAA TTAGTAAGCT GAAGTTCGAA TTTGTCGTTG ATGAAGATGA ATTTTCTGGC GATAAAGATG ATGAAGCTTT TTTTATGAAT TTATCTGAAG CTGATGCAGC TTTTCTCAAG GTATTTAATG AAACCGTACC TCCCAAAAAA GCTAAGGGGT GATATATGGC TAAAATTTAC
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960 (3) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLAK SZAMA: egyetlen (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GACCAGTATT ATTATCTTAA TGAG 24 (4) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLAK SZÁMA: egyetlen (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GTATTTAATG AAACCGTACC TCCC 24 (5) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLAK SZÁMA: egyetlen (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CTCTTTTAAT TGTCGATAAG CAAG 24 (6) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleotid (C) SZÁLAK SZÁMA: egyetlen (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (xi) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCGACGTCAC CGAGGCTGTA GCCG 24

Claims (34)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Cirkuláris DNS-molekula, amely a génterápiában hasznos, legalább egy fontos nukleinsavszekvenciát és ennek expressziójához szabályozószignálokat tartalmaz, melynek transzkripciója és adott esetben transzlációja az eukarióta célsejtben terápiás, vakcináié, mezőgazdasági vagy állatgyógyászati hatással rendelkező terméket eredményez, azzal jellemezve, hogy
    a) a replikációját lehetővé tevő régió egy plazmidból vagy bakteriofágból származó olyan feltételes replikációs origót tartalmaz, melynek egy prokarióta gazdasejtben való működőképessége legalább egy olyan replikációiniciációs protein jelenlétét igényli, amely a plazmidra vagy a bakteriofágra specifikus, az említett prokarióta gazdasejtre nézve viszont idegen,
    b) az említett DNS-molekula nem tartalmazza a replikációiniciációs proteint,
    c) az említett DNS-molekula tartalmaz egy csökkentett méretű olyan szelekciós markert, amely egy antibiotikummal szembeni rezisztenciát kölcsönző géntől eltérő,
    d) az említett DNS-molekula csak olyan sejtekben replikálódik, amelyek az iniciációs proteint komplementálni képesek.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a feltételes replikációs origó egy olyan plazmidból vagy bakteriofágból származik, amely több iteronból álló replikációs origóval rendelkezik, és amely legalább egy olyan specifikus proteint kódol, amely replikációs origójának működését szabályozza.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a feltételes replikációs origó a következő plazmidokból vagy bakteriofágokból származhat: RK2, R6K, R1, pSC101, Rts1, F, RSF1010, P1, P4, lambda, Phi82 és Phi80.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az említett replikációs origó az R6K bakteriális plazmidból származik.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az említett replikációs origó teljesen vagy részben az R6K plazmid γ replikációs origója.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az említett replikációs origót teljesen vagy részben az 1. számú szekvencia alkotja.
  7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy az említett DNS-molekulát tartalmazó gazdasejtek szelekcióját lehetővé tevő régiót egészében vagy részben egy specifikus kodonokra szuppresszor transzfer-RNS expressziós kazettája képezi.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy egy amber kodonokra (TAG) szuppresszor tRNS expressziós kazettáról van szó.
  9. 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy többek között helyspecifikus rekombinázra egy célterületet is tartalmaz.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a helyspecifikus rekombináz célterület a Tn3, Tn21 vagy Tn522 transzpozonok reszolvázai, a mu bakteriofág invertáza, plazmid reszolvázok, például az RP4 pár fragmentum által kódolt reszolváz, a lambda-bakteriofág integrázcsaládjának, például a lambda-, phi80, P22, HP1 integrázainak rekombinázai, a P1 Cre integráz, a pSAM2 plazmid integráza, a 2μ plazmid FLP-rekombináza és az E. coli XerC és XerD rekombinázai közül választott.
  11. 11. A 9. vagy a 10. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a helyspecifikus rekombináz célterület a ColE1 cer fragmentumának vagy egy ugyanolyan tulajdonságokkal rendelkező kisebb fragmentumnak egésze vagy része.
  12. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a fontos nukleinsavszekvencia egy olyan proteint kódol, amely gyógyászatilag, agrár-, élelmiszer-gazdaságilag hasznos vagy biokatalízisben alkalmazható.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a fontos nukleinsavszekvencia egy, az enzimek, a vérből származtatható anyagok, a hormonok, a limfokinok: interleukinok, interferonok, TNF, a növekedési faktorok, a neurotranszmitterek vagy azok prekurzorai vagy szintézisenzimei, a trofikus faktorok, így BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, az apolipoproteinek, mint az ApoAI, ApoAlV és ApoE, a disztrofin vagy egy minidisztrofin, a tumorszuppresszorgének, mint a p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, a véralvadásban szerepet játszó faktorokat, mint a VII., Vili., IX. faktorok, kódoló gének, a szuicid gének, mint timidinkináz és citozin-dezamináz, egy természetes vagy mesterséges immunglobulin, mint az Fab, ScFv egésze vagy egy része, egy RNS-ligandum, egy antiszensz szekvencia vagy az Epstein-Barr-vírusra, HIV-vírusra, hepatitis B-vírusra vagy pszeudorabies (Aujeszky-betegség) vírusra specifikus antigénpeptidek vagy tumorspecifikus antigénpeptidek közül választott proteint kódol.
  14. 14. Eljárás az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti cirkuláris DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy egy olyan gazdasejtet, amely tartalmaz legalább:
    a) egy olyan replikációs origót magában foglaló, az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti cirkuláris DNS-molekulát, amelynek a gazdasejtben való működőképességéhez legalább egy olyan specifikus replikációiniciációs protein jelenlétére van szükség, amely az említett gazdasejtre nézve idegen; és
    b) a specifikus és az említett gazdasejtre nézve idegen, in situ vagy nem in situ kifejeződő fehérjét, amely az említett replikációs origó működését szabályozza, az említett DNS-molekulákkal transzformált gazdasejtek szelekcióját lehetővé tevő körülmények között tenyésztünk.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a replikációs iniciátorproteint kódoló gén egy csatolt replikonon vagy egy, a sejt genomjába beépült replikonon van jelen.
    HU 224 400 Β1
  16. 16. A 14. vagy a 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-molekula egy olyan DNS-molekula, amely egy, a 4-6. igénypontok bármelyikében meghatározott replikációs origót tartalmaz, és az említett protein az R6K plazmid π-proteinje vagy ettől a proteintől kódolószekvenciája módosulásában különböző protein, vagy ennek a proteinnek egy ugyanolyan aktivitással rendelkező fragmentuma.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a π-protein vagy egy származéka in situ fejeződik ki a 2. számú szekvenciával megadott pír génből, vagy a 2. számú szekvenciától a genetikai kód degeneráltsága miatt eltérő bármely szekvenciából, vagy bármely, ezekkel a szekvenciákkal hibridizáló szekvenciából, vagy ezek olyan fragmentumaiból, amelyek a gazdasejtben jelen vannak, és amelyek terméke a specifikus replikációs iniciátorprotein aktivitásával rendelkezik.
  18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehéije a sejt genomjába beépült pir-116 génből fejeződik ki.
  19. 19. A 14-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy azon gének egyike, amelyek a választott tenyésztési körülmények között a gazdasejt részére nélkülözhetetlenek, egy olyan specifikus kodont tartalmaz, amely a DNS-molekula szintjén a kiválasztott szuppresszor tRNS által felismerhető.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gén egy TAG amber kodont tartalmaz.
  21. 21. A 14-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtet az E. coli törzsek közül választjuk.
  22. 22. A14-21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejt az E. coli XAC-1 törzsből származik.
  23. 23. A 15-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a genomjában a pir-116 gént tartalmazó E. coli XAC-1 törzset alkalmazzuk.
  24. 24. Rekombináns sejt, amely legalább egy, az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekulával van transzformálva.
  25. 25. Gyógyszerkészítmény, amely egy vagy több, az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekulát tartalmaz.
  26. 26. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekula mint gyógyszer.
  27. 27. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti molekula alkalmazása rekombináns proteinek in vitro termelésére.
  28. 28. Az 1. igénypont szerinti molekula, azzal jellemezve, hogy a fontos nukleinsavszekvencia egy vad típusú vagy módosított p53 proteint kódol.
  29. 29. Az 1. igénypont szerinti molekula, azzal jellemezve, hogy a fontos nukleinsavszekvencia egy timidinkinázt kódol.
  30. 30. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejt egy E. coli endA1 törzs.
  31. 31. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy egy ligandummal specifikus kölcsönhatásra képes szekvenciát is tartalmaz.
  32. 32. A 13. igénypont szerinti DNS-molekula, azzal jellemezve, hogy a fontos nukleinsavszekvencia a savas fibroblaszt növekedési faktort (aFGF) kódolja.
  33. 33. A 32. igénypont szerinti DNS-molekula mint gyógyszer.
  34. 34. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti DNS-molekula alkalmazása rák kezelésében hasznos gyógyszertermék előállítására.
HU9900018A 1995-09-15 1996-09-13 Cirkuláris DNS-molekula feltételes replikációs origóval, eljárás elõállítására és génterápiában való alkalmazása HU224400B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9510825A FR2738842B1 (fr) 1995-09-15 1995-09-15 Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique
PCT/FR1996/001414 WO1997010343A1 (fr) 1995-09-15 1996-09-13 Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP9900018A1 HUP9900018A1 (hu) 1999-04-28
HUP9900018A3 HUP9900018A3 (en) 2001-10-29
HU224400B1 true HU224400B1 (hu) 2005-08-29

Family

ID=9482580

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9900018A HU224400B1 (hu) 1995-09-15 1996-09-13 Cirkuláris DNS-molekula feltételes replikációs origóval, eljárás elõállítására és génterápiában való alkalmazása

Country Status (20)

Country Link
US (3) US6977174B2 (hu)
EP (3) EP0850310B1 (hu)
JP (3) JP3818665B2 (hu)
KR (1) KR100522369B1 (hu)
AT (3) ATE284966T1 (hu)
BR (1) BRPI9610511B8 (hu)
CA (1) CA2229307C (hu)
CZ (1) CZ294525B6 (hu)
DE (3) DE69638314D1 (hu)
DK (3) DK1508620T3 (hu)
ES (3) ES2357098T3 (hu)
FR (1) FR2738842B1 (hu)
HU (1) HU224400B1 (hu)
IL (4) IL123641A0 (hu)
NO (1) NO323975B1 (hu)
PT (3) PT1508620E (hu)
SK (1) SK285317B6 (hu)
TW (1) TWI231826B (hu)
WO (1) WO1997010343A1 (hu)
ZA (1) ZA967640B (hu)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7038026B2 (en) 2000-05-26 2006-05-02 Centelion Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide
FR2738842B1 (fr) * 1995-09-15 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique
US7279313B2 (en) * 1995-09-15 2007-10-09 Centelion Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
US6156574A (en) 1997-06-23 2000-12-05 The Rockefeller University Methods of performing gene trapping in bacterial and bacteriophage-derived artificial chromosomes and use thereof
US6821759B1 (en) 1997-06-23 2004-11-23 The Rockefeller University Methods of performing homologous recombination based modification of nucleic acids in recombination deficient cells and use of the modified nucleic acid products thereof
BR9810369A (pt) 1997-06-30 2000-09-05 Rhone Poulenc Rorer Sa Processo de transferência de ácido nucleico para o interior de um ou mais músculos estriados, in vivo, composição, ácido mucleico e campo elétrico, e, produto de combinação
US6022716A (en) 1998-04-10 2000-02-08 Genset Sa High throughput DNA sequencing vector
WO2000075299A1 (en) * 1999-06-07 2000-12-14 Cell Genesys, Inc. Hybrid yeast-bacteria cloning system and uses thereof
WO2001005962A1 (en) * 1999-07-20 2001-01-25 The Rockefeller University Conditional homologous recombination of large genomic vector inserts
FR2821855B1 (fr) † 2001-03-09 2004-04-02 Cayla Genes synthetiques et plasmides bacteriens depourvus de cpg
FR2822476B1 (fr) * 2001-03-23 2004-04-02 Aventis Pharma Sa Procedes de purification et de detection de sequences cibles d'adn double brin par interaction triple helice
AU2002325346A1 (en) 2001-07-05 2003-01-21 Aventis Pharma S.A. Method of administration of a gene of interest to the heart and vasculature
US6989261B2 (en) * 2001-12-20 2006-01-24 Eli Lilly And Company Butyrylcholinesterase variant polypeptides with increased catalytic efficiency and methods of use
US7049121B2 (en) 2001-12-20 2006-05-23 Applied Molecular Evolution Butyrylcholinesterase variant polypeptides with increased catalytic efficiency and methods of use
FI116068B (fi) 2003-09-15 2005-09-15 Fit Biotech Oyj Plc Uusi selektiojärjestelmä, siinä käyttökelpoinen vektori, bakteerisolukantoja sekä menetelmä solujen valikoimiseksi
JP4581851B2 (ja) * 2004-07-27 2010-11-17 セイコーエプソン株式会社 電気光学装置の駆動回路及び駆動方法、電気光学装置並びに電子機器
EP1882036B1 (en) * 2005-05-17 2012-02-15 Ozgene Pty Ltd Sequential cloning system
WO2007030588A1 (en) * 2005-09-07 2007-03-15 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of replicators to prevent gene silencing
WO2007041350A2 (en) * 2005-10-01 2007-04-12 Charles Stout Regulatable fusion promoters
GB0606190D0 (en) 2006-03-28 2006-05-10 Isis Innovation Construct
EP2310500B1 (en) * 2008-07-18 2015-03-11 Maxcyte, Inc. Methods for optimizing electroporation
EP2221066A1 (en) 2009-02-18 2010-08-25 Sanofi-Aventis Use of VgII3 activity modulator for the modulation of adipogenesis
ES2566553T3 (es) 2010-03-17 2016-04-13 Association Institut De Myologie ARNnp U7 modificados para el tratamiento de las enfermedades neuromusculares
EP2643343A1 (en) 2010-11-26 2013-10-02 Institut Pasteur Identification of a human gyrovirus and applications.
WO2013083753A2 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Institut Pasteur Identification of a swine parecho-like virus and applications
AU2013309488A1 (en) 2012-08-29 2015-03-05 Nature Technology Corporation DNA plasmids with improved expression
WO2014077863A1 (en) * 2012-11-19 2014-05-22 Nature Technology Corporation Replicative minicircle vectors with improved expression
EP2970945B1 (en) * 2013-03-14 2024-05-01 GenVivo, Inc. Improved thymidine kinase gene
DK3456821T4 (da) 2017-09-19 2024-04-15 Deutsches Krebsforsch Ikke-integrerende dna-vektorer til genetisk modifikation af celler
WO2019057774A1 (en) 2017-09-19 2019-03-28 Deutsches Krebsforschungszentrum NON-INTEGRATING DNA VECTORS FOR THE GENETIC MODIFICATION OF CELLS
EP3768846B1 (en) 2018-03-21 2023-06-21 Aldevron, L.L.C. Viral and non-viral nanoplasmid vectors with improved production
WO2023241567A1 (zh) * 2022-06-13 2023-12-21 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种可提高无筛选标签质粒制备效率的野生型-突变体π蛋白切换表达系统

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4190495A (en) * 1976-09-27 1980-02-26 Research Corporation Modified microorganisms and method of preparing and using same
US4342832A (en) * 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
US4727028A (en) * 1981-06-22 1988-02-23 Eli Lilly And Company Recombinant DNA cloning vectors and the eukaryotic and prokaryotic transformants thereof
US4654307A (en) * 1983-02-17 1987-03-31 The Research Foundation Of State University Of New York Novel bacteria containing a plasmid having a tRNA code
US4761367A (en) * 1984-11-07 1988-08-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vectors suitable for detection of eukaryotic DNA regulatory sequences
US5859208A (en) * 1988-07-06 1999-01-12 Fiddes; John C. Human basic fibroblast growth factor analog
US5198343A (en) * 1986-08-05 1993-03-30 Transgene, S.A. Method for expressing a heterologous protein in a dapD- mutant of E. coli and the strain obtained
US5591632A (en) * 1987-03-02 1997-01-07 Beth Israel Hospital Recombinant BCG
US5510099A (en) * 1987-05-01 1996-04-23 Stratagene Mutagenesis testing using transgenic non-human animals carrying test DNA sequences
US5024939A (en) * 1987-07-09 1991-06-18 Genentech, Inc. Transient expression system for producing recombinant protein
US5693622A (en) * 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
JPH03187383A (ja) * 1989-09-04 1991-08-15 Takeda Chem Ind Ltd 発現プラスミドおよびその用途
EP0485701A1 (en) * 1990-09-28 1992-05-20 American Cyanamid Company Insertion of DNA by modified transposons
TW201794B (hu) * 1991-05-03 1993-03-11 American Cyanamid Co
US5714323A (en) * 1991-08-30 1998-02-03 The University Of Medecine And Dentistry Of New Jersey Over expression of single-stranded molecules
US5444149A (en) * 1992-05-11 1995-08-22 Duke University Methods and compositions useful in the recognition, binding and expression of ribonucleic acids involved in cell growth, neoplasia and immunoregulation
US5434065A (en) * 1993-05-06 1995-07-18 President And Fellows Of Harvard College In vivo selection of microbial virulence genes
EP1179350A3 (en) * 1993-08-12 2003-01-02 Cytotherapeutics, Inc. Encapsulated cell system for implantation into the human CNS
US5679647A (en) * 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
US5700657A (en) * 1993-12-13 1997-12-23 Genzyme Corporation Vectors and vector systems including genes encoding tumor suppressor proteins and producer cells transformed thereby
IL109558A (en) * 1994-05-04 2004-08-31 Yissum Res Dev Co DNA structures Derived from the SV40 virus that include DNA sequences External
AU2946695A (en) * 1994-07-08 1996-02-09 Schering Corporation Method for identifying nucleic acids encoding c-fos promoter activating proteins
DE4428402A1 (de) * 1994-08-11 1996-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Gentherapeutisches Verfahren unter Verwendung von DNA-Vektoren ohne Selektionsmarker-Gen
US5792647A (en) * 1995-02-13 1998-08-11 The Johns Hopkins University Bacterial catabolism of chitin
US6254874B1 (en) * 1995-04-13 2001-07-03 President And Fellows Of Harvard College Attenuated auxotrophic microorganisms having a combination of non-attenuating mutations and method for making same
US5763270A (en) * 1995-06-07 1998-06-09 Genemedicine, Inc. Plasmid for delivery of nucleic acids to cells and methods of use
US7364894B2 (en) * 1995-09-15 2008-04-29 Centelion Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
FR2738842B1 (fr) * 1995-09-15 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique
US7279313B2 (en) * 1995-09-15 2007-10-09 Centelion Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
US5830879A (en) * 1995-10-02 1998-11-03 St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Treatment of vascular injury using vascular endothelial growth factor
US5851808A (en) * 1997-02-28 1998-12-22 Baylor College Of Medicine Rapid subcloning using site-specific recombination
US5874259A (en) * 1997-11-21 1999-02-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Conditionally amplifiable BAC vector

Also Published As

Publication number Publication date
EP0850310B1 (fr) 2004-12-15
EP1724354A3 (fr) 2008-10-29
ATE284966T1 (de) 2005-01-15
JP3818665B2 (ja) 2006-09-06
EP1508620A1 (fr) 2005-02-23
ES2281721T3 (es) 2007-10-01
DE69634043T2 (de) 2005-08-18
IL173399A0 (en) 2006-06-11
EP1508620B1 (fr) 2007-01-24
PT850310E (pt) 2005-05-31
SK34798A3 (en) 1998-11-04
FR2738842B1 (fr) 1997-10-31
TWI231826B (en) 2005-05-01
PT1724354E (pt) 2011-03-09
MX9802005A (es) 1998-08-30
NO323975B1 (no) 2007-07-30
JP2007325603A (ja) 2007-12-20
ES2233975T3 (es) 2005-06-16
IL123641A (en) 2006-06-11
CZ294525B6 (cs) 2005-01-12
BR9610511B1 (pt) 2010-10-19
NO981044L (no) 1998-03-10
ATE492642T1 (de) 2011-01-15
US20090130674A1 (en) 2009-05-21
KR100522369B1 (ko) 2006-10-24
ZA967640B (en) 1997-03-25
US20010014476A1 (en) 2001-08-16
JP4585435B2 (ja) 2010-11-24
DE69636878T2 (de) 2007-11-08
CA2229307A1 (fr) 1997-03-20
BR9610511A (pt) 1999-01-26
DE69636878D1 (de) 2007-03-15
JP2000501281A (ja) 2000-02-08
IL207348A0 (en) 2010-12-30
ATE352630T1 (de) 2007-02-15
IL123641A0 (en) 1998-10-30
NO981044D0 (no) 1998-03-10
HUP9900018A1 (hu) 1999-04-28
CZ78898A3 (cs) 1998-06-17
PT1508620E (pt) 2007-05-31
EP1724354A2 (fr) 2006-11-22
DK1724354T3 (da) 2011-04-04
CA2229307C (fr) 2013-06-11
DE69638314D1 (de) 2011-02-03
HUP9900018A3 (en) 2001-10-29
AU6992496A (en) 1997-04-01
JP4756014B2 (ja) 2011-08-24
ES2357098T3 (es) 2011-04-18
BRPI9610511B8 (pt) 2016-11-08
JP2006136328A (ja) 2006-06-01
KR19990044683A (ko) 1999-06-25
US6977174B2 (en) 2005-12-20
EP1724354B1 (fr) 2010-12-22
IL173399A (en) 2010-11-30
DK0850310T3 (da) 2005-04-25
AU728231B2 (en) 2001-01-04
FR2738842A1 (fr) 1997-03-21
WO1997010343A1 (fr) 1997-03-20
US20090149406A1 (en) 2009-06-11
SK285317B6 (sk) 2006-10-05
DE69634043D1 (de) 2005-01-20
DK1508620T3 (da) 2007-05-29
EP0850310A1 (fr) 1998-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU224400B1 (hu) Cirkuláris DNS-molekula feltételes replikációs origóval, eljárás elõállítására és génterápiában való alkalmazása
US7807444B2 (en) Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
US7364894B2 (en) Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
MXPA98002005A (en) Molecules of circular dna with origin of conditional replication, its process of preparation and its use in therapy gene

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20050714

GB9A Succession in title

Owner name: AVENTIS PHARMA S.A., FR

Free format text: FORMER OWNER(S): AVENTIS PHARMA S.A., FR; CENTELION, FR; GENCELL SA,, FR; RHONE-POULENC RORER S.A., FR

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees