DE69636878T2

DE69636878T2 - Zirkuläres DNA Molekül mit einem abhängigen Replikationsursprung, seine Herstellungsverfahren und seine Verwendung in der Gentherapie

Info

Publication number: DE69636878T2
Application number: DE69636878T
Authority: DE
Inventors: Joel Crouzet; Fabienne Soubrier
Original assignee: Centelion SAS
Current assignee: Centelion SAS
Priority date: 1995-09-15
Filing date: 1996-09-13
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2016-09-14
Also published as: NO981044L; SK285317B6; ATE492642T1; IL173399A; DK0850310T3; PT850310E; WO1997010343A1; ES2357098T3; BR9610511B1; US20090149406A1; DK1724354T3; TWI231826B; SK34798A3; MX9802005A; EP0850310A1; DK1508620T3; FR2738842B1; BR9610511A; JP2000501281A; JP2006136328A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges DNA-Molekül mit bedingter Replikation, das in der Gentherapie oder für die Produktion von rekombinanten Proteinen benutzt werden kann.
Die Gentherapie umfasst das Korrigieren eines Mangels oder einer Anomalie durch das Einfügen einer genetischen Information in die betroffene Zelle oder das betroffene Organ. Diese Information kann entweder in vitro in eine Zelle, die aus dem Organ herausgenommen wurde und danach wieder in den Organismus eingespritzt wird, oder in vivo direkt in das angestrebte Gewebe eingefügt werden. Da es sich um ein Molekül mit hoher Molekülmasse und negativer Ladung handelt, hat die DNA Schwierigkeiten, die Phospholipid-Zellmembrane spontan zu durchqueren. Es werden daher verschiedene Vektoren benutzt, um die Übertragung eines Gens zu ermöglichen: einerseits die viralen Vektoren und andererseits die chemischen und/oder biochemischen, natürlichen oder synthetischen Vektoren.
Die viralen Vektoren (Retrovirus, Adenovirus, adeno-assoziierter Virus ...) sind sehr wirksam, insbesondere für den Durchgang von Membranen, weisen aber eine gewisse Anzahl an Risiken auf, wie etwa die Pathogenität, die Rekombination, die Replikation, die Immunogenität ...
Die chemischen und/oder biochemischen Vektoren ermöglichen das Vermeiden dieser Risiken (für Rezensionen siehe Behr, 1993, Cotten und Wagner, 1993). Diese sind zum Beispiel Kationen (Kalziumphosphat, DEAE-Dextran ...), die so wirken, indem sie Präzipitate mit der DNA formen, die von den Zellen „phagozytisiert" werden können. Es kann sich auch um Liposome handeln, wobei die DNA eingebettet ist und die mit der plasmaartigen Membran verschmelzen. Die synthetischen Genübertragungs-Vektoren sind im Allgemeinen Lipide oder kationische Polymere, welche die DNA komplexieren und mit ihr ein Partikel formen, das positive Oberflächenladungen aufweist. Zu Darstellungszwecken dieser Art von Vektoren können besonders Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS, Transfectam^TM) oder das Chlorid von N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium (DOTMA, Lipofectin^TM) erwähnt werden.
Jedoch setzt die Benutzung von chemischen und/oder biochemischen Vektoren oder von nackter DNA die Möglichkeit voraus, große Mengen an DNA von pharmazeutischer Reinheit herzustellen. Tatsächlich umfasst in den Techniken zur Gentherapie das Medikament die DNA selbst und es ist unentbehrlich, in angepassten Mengen DNA herstellen zu können, die geeignete Eigenschaften für eine therapeutische Benutzung am Menschen aufweist.
Im Falle nicht viraler Vektorologie werden Plasmide mit bakteriellem Ursprung verwendet. Die im Allgemeinen in der Gentherapie benutzten Plasmide tragen (i) einen Replikationsursprung, (ii) einen Genmarker, wie etwa ein Gen mit Resistenz gegenüber einem Antibiotikum (Kanamycin, Ampicillin ...) und (iii) ein oder mehr Transgene mit Sequenzen, die für ihre Expression nötig sind (Enhancer, Promoter, Polyadenylierungssequenzen ...).
Die gegenwärtig vorhandene Technologie ist jedoch nicht gänzlich zufriedenstellend.
Einerseits bleibt ein Risiko der Dissemination im Organismus. Auf diese Weise kann eine im Organismus vorhandene Bakterie auf einer schwachen Frequenz dieses Plasmid empfangen. Dies geschieht umso mehr, da es sich um eine Gentherapie-Behandlung in vivo handelt, wobei die DNA im Organismus des Patienten ausgestreut werden kann und Bakterien kontaktieren kann, welche diesen Patienten infizieren, oder Bakterien der Kommensalflora. Wenn die Bakterie, die das Plasmid empfängt, eine Enterobakterie wie etwa E.coli ist, kann sich dieses Plasmid replizieren. Ein derartiges Ereignis führt also zur Dissemination des therapeutischen Gens. Sofern die therapeutischen Gene, die in den Gentherapie-Behandlungen benutzt werden, zum Beispiel Lymphokin, einen Wachstumsfaktor, ein Anti-Onkogen oder ein Protein, dessen Funktion im Wirt fehlt und somit die Korrektur eines Genfehlers ermöglicht, kodieren können, könnte die Dissemination gewisser dieser Gene unvorhersehbare und besorgniserregende Auswirkungen haben (zum Beispiel, wenn eine Pathogenbakterie das Gen eines menschlichen Wachstumsfaktors erlangt).
Andererseits besitzen die Plasmide, die im Allgemeinen in der nicht viralen Gentherapie benutzt werden, ebenfalls einen Marker mit Resistenz gegenüber einem Antibiotikum (Ampicillin, Kanamycin ...). Die Bakterie, die ein derartiges Plasmid erlangt, weist daher einen unleugbaren selektiven Vorteil auf, da jegliche Antibiotikatherapie-Behandlung, welche ein Antibiotikum derselben Familie benutzt, wie das, das das Resistenzgen des Plasmids wählt, zur Selektion des besagten Plasmids führt. In dieser Hinsicht ist das Ampicillin Teil der β-Lactame, das der Familie von Antibiotika angehört, die weltweit am meisten benutzt werden. Die Benutzung von Selektionsmarkern bei Bakterien, die keine Antibiotikum-Resistenzgene sind, wäre daher besonders vorteilhaft. Dies würde die Selektion an Bakterien verhindern, die möglicherweise ein Plasmid erhielten, das einen derartigen Marker trägt.
Daher ist es besonders wichtig, zu versuchen, die Dissemination der therapeutischen Gene und der Resistenzgene soweit wie möglich einzuschränken.
Die vorliegende Erfindung hat genau zur Aufgabe, neuartige DNA-Moleküle vorzuschlagen, die in der Gentherapie oder zur Produktion rekombinanter Proteine in vitro benutzt werden können, wobei sie sich nur in die Zellen replizieren, die gewisse Funktionen dieser nicht viralen Vektoren erfüllen können.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine besonders wirksame Methode zur Herstellung dieser DNA-Moleküle.
Die beanspruchten DNA-Moleküle weisen den Vorteil auf, dass sie die Risiken eliminieren, die mit einer Dissemination des Plasmids verbunden sind, wie etwa (1) die Replikation und Dissemination, welche eine nicht kontrollierte Überexpression des therapeutischen Gens mit sich bringen können, (2) die Dissemination und die Expression der Resistenzgene. Die genetische Information, die in dem DNA-Molekül nach der Erfindung enthalten ist, umfasst tatsächlich das/die therapeutische(n) Gen(e) und die Signale zur Regulierung seiner/ihrer Expression, einen funktionellen bedingten Replikationsursprung, der das Spektrum des Zeilwirts dieses Plasmids sehr stark einschränkt, einen Selektionsmarker mit reduzierter Größe, der sich vorzugsweise von einem Gen, das gegenüber einem Antibiotikum resistent ist, unterscheidet und gegebenenfalls ein DNA-Fragment, das die Auflösung von Plasmid-Multimeren ermöglicht. Die Wahrscheinlichkeit, dass diese Moleküle (und somit die genetische Information, die sie enthalten) auf einen Mikroorganismus übertragen werden und stabil gehalten werden, ist sehr beschränkt.
Schließlich weisen die Vektoren nach der Erfindung, die aufgrund ihrer kreisförmigen Struktur, ihrer reduzierten Größe und ihrer mehrfach gewundenen Form auch als Miniplasmide bezeichnet werden, die folgenden zusätzlichen Vorteile auf: Aufgrund ihrer reduzierten Größe im Vergleich zu den Plasmiden, die aus dem herkömmlich benutzten ColE1 abgeleitet sind, weisen die DNA-Moleküle nach der Erfindung potentiell eine bessere Biodisponibilität in vivo auf. Sie weisen vornehmlich Fähigkeit verbesserter Penetration und Zellverteilung auf. Somit ist anerkannt, dass der Diffusionskoeffizient in den Geweben umgekehrt proportional zum Molekulargewicht ist (Jain, 1987). In ähnlicher Weise weisen die Moleküle mit hohem Molekulargewicht in der Zelle eine weniger, gute Permeabilität durch die plasmaartige Membran auf. Überdies ist für den Durchgang des Plasmids zum Kern, was für seine Expression unerlässlich ist, das erhöhte Molekulargewicht ebenfalls ein Nachteil, wobei die Kernporen eine Begrenzung der Größe für die Diffusion zum Kern hin auferlegen (Landford et al., 1986). Die Reduzierung der Größe der nicht therapeutischen Teile des DNA-Moleküls (und zwar Replikationsursprung und Selektionsgen) nach der Erfindung ermöglicht ebenfalls das Verringern der Größe der DNA-Moleküle. Der Teil, der die Replikation und die Selektion dieses Plasmids bei der Bakterie ermöglicht (1,1 kb) wird um einen Faktor 3 verringert, indem zum Beispiel 3 kb für den Replikationsursprung und den Resistenzmarker-Vektorteil gezählt wird. Diese Verringerung (i) des Molekulargewichts und (ii) der negativen Ladung verleiht den Molekülen der Erfindung verbesserte Fähigkeiten zur Diffusion und zur Biodisponibilität von Gewebe, Zellen und Kernen.
Genauer betrifft die vorliegende Erfindung ein rund geformtes DNA-Molekül, das in der Gentherapie nützlich ist und zumindest eine Nukleinsequenz von Bedeutung umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Region, die ihre Replikation ermöglicht, einen Replikationsursprung umfasst, dessen Funktionalität in einer Wirtszelle das Vorhandensein von zumindest einem spezifischen Protein, und das der Wirtszelle fremd ist, erfordert.
Dieses DNA-Molekül kann eine Einstrang- oder Doppelstrang-Form aufweisen und besitzt vorzugsweise eine mehrfach gewundene Form.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung können die verwendeten Wirtszellen unterschiedlichen Ursprungs sein. Es kann sich um eukaryote oder prokaryote Zellen handeln. Nach einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um prokaryote Zellen.
Herkömmlicherweise erfordert die Replikation bakterieller Plasmide die Anwesenheit von zumindest einem Protein, das von dem Zellwirt der Art RNA-Polymerase, Rnase, DNA-Polymerase ... kodiert ist. Aus bereits eingangs erwähnten Gründen ist es nicht möglich, sich mit dieser Art von Replikation gänzlich von den möglichen Risiken der Dissemination im behandelten Organismus zu befreien. Vorzugsweise bedingt die Funktionalität des Replikationsursprungs des DNA-Moleküls nach der Erfindung die Anwesenheit eines Proteins, das für die Wirtszelle spezifisch und ihr fremd ist. Dieses Merkmal soll das Spektrum des beanspruchten Plasmidwirts auf spezifische Stämme reduzieren, die dieses initiierende Protein exprimieren. Das DNA-Molekül, das im Rahmen der vorliegenden Erfindung entwickelt wurde, besitzt also vorzugsweise einen sogenannten bedingten Replikationsursprung.
Der bedingte Replikationsursprung, der nach der vorliegenden Erfindung implementiert wird, kann aus Plasmiden oder Bakteriophagen stammen, welche sich die folgenden Merkmale teilen: in ihrem Replikationsursprung enthalten sie wiederholende Sequenzen oder Iterons und sie kodieren für zumindest ein initiierendes Protein der Replikation (Rep), das für sie spezifisch ist. Als Beispiel können die bedingten Replikationssysteme von folgenden Plasmiden und Bakteriophagen genannt werden:
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stammt der Replikationsursprung, der in den beanspruchten DNA-Molekülen implementiert wird, aus einem natürlichen Plasmid von E.coli, das R6K genannt wird.
Die Replikationsfunktionen von R6K sind in einem DNA-Fragment von 5,5 kpb (1) zusammengeschlossen, die 3 Replikationsursprünge α, β und γ (wobei γ und β 90 % der Replikation gewährleisten) und ein Operon, das für die initiierenden Replikationsproteine π und das Protein Bis kodiert, umfasst. Die minimale genetische Information, die zur Erhaltung dieses Plasmids auf einer charakteristischen Anzahl an Kopien (15 Kopien pro Genom) nötig ist, ist in zwei Elementen enthalten: den 400 pdb von ori γ und dem Gen pir, dessen Produkt das initiierende Protein π ist.
Ori γ kann in zwei funktionelle Teile geteilt sein: den Kernteil und das Aktivatorelement (1). Der Kernteil, der für die Replikation unerlässlich ist, enthält Iterons (7 direkte Wiederholungen von 22 pdb) oder verbindet sich mit dem Protein x, das in SEQ ID NR. 1 dargestellt ist, und flankierende Segmente, die Ziele der Wirtsproteine sind (IHF, DnaA).
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht der Replikationsursprung des beanspruchten Vektors ganz oder teilweise aus dem Replikationsursprung γ von Plasmid R6k und besser ganz oder teilweise aus der SEQ ID NR. 1 oder aus einem seiner Derivate.
G. Posfai et al. (Nucleic Acids Res. 22(12): 2392–2398, 1994) beschreibt ein System der Exzision und Amplifikation in vivo langer Segmente eines Genoms, das eine Alternative zum Klonen heterologer DNA bietet. Während es aus dem Genom exzidiert wird, ist das DNA-Molekül dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst:

1) eine Region, die seine Replikation ermöglicht, einen bedingten Replikationsursprung umfasst, der aus einem Plasmid oder einem Bakteriophage stammt, dessen Funktionalität in einer Prokaryontenwirtszelle das Vorhandensein von zumindest einem spezifischen initiierenden Replikationsprotein besagten Plasmids oder der Bakteriophage erfordert, das besagter Prokaryontenwirtszelle fremd ist (Gamma-ori),
2) ein rund geformtes DNA-Molekül, das besagtes initiierendes Replikationsprotein (Pi) nicht umfasst,
3) ein DNA-Molekül, das einen Selektionsmarker (Kanamycin) umfasst, und
4) ein DNA-Molekül, das nur in Zellen repliziert, die besagtes initiierendes Protein ergänzen können (1C).
5) eine Nukleinsequenz von Bedeutung und auch die Signale zur Regulierung seiner Expression (Promoter T7 oder SP6).

Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff abgeleitet jegliche Sequenz, die sich von der betreffenden Sequenz aufgrund einer Degeneration des genetischen Codes unterscheidet, was durch eine oder mehrere Abwandlungen der genetischen und/oder chemischen Beschaffenheit erhalten wird, sowie jegliche Sequenz, die mit jenen Sequenzen oder ihren Fragmenten hybridieren und deren Produkt die angegebene Aktivität hinsichtlich des initiierenden Replikationsproteins p besitzt. Mit Abwandlung der genetischen und/oder chemischen Beschaffenheit kann jegliche Mutation, Substitution, Deletion, Addition und/oder Abwandlung eines oder mehrerer Reststoffe verstanden werden. Der Begriff Derivat umfasst ebenfalls die Sequenzen, die homolog zur betreffenden Sequenz sind, welche von anderen Zellquellen und besonders von Zellen menschlichen Ursprungs oder anderen Organismen stammen und eine Aktivität derselben Art besitzen. Derartige homologe Sequenzen können mittels Hybridisierungsversuchen erhalten werden. Die Hybridisierungen können aus Nukleinsäurebanken durchgeführt werden, indem unter herkömmlich strengen Bedingungen (Maniatis et al., vgl. Allgemeine Techniken der Molekularbiologie) oder vorzugsweise unter erhöht strengen Bedingungen die native Sequenz oder ein Fragment dieser als Sonde benutzt wird.
Der oben beschriebene Replikationsursprung, der den Vorteil einer sehr begrenzten Größe bietet, ist nur in Anwesenheit eines spezifischen initiierenden Proteins, dem Protein Pi, das Produkt des Gens pir (SEQ ID NR. 2) ist, funktionell. Da dieses Protein in trans wirken kann, ist es möglich, ori gamma vom Gen pir, das in das Genom der Zelle eingefügt werden könnte, die als spezifischen Wirt dieser Plasmide gewählt wurde, physikalisch zu trennen. Mutationen in p können seine hemmenden Funktionen andern (Inuzuka und Wada, 1985) und eine Erhöhung der Anzahl an Kopien der Derivate von R6K bis zu 10 mal der Anzahl an ursprünglichen Kopien mit sich bringen. Diese Substitutionen liegen alle in einem Bereich von 40 Aminosäuren, der also für die Kontrolle durch p der Anzahl an Plasmakopien verantwortlich zu sein scheint (2).
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung resultiert das Protein p, das in der Wirtszelle exprimiert wird, aus der Expression des Gens, das in SEQ ID NR. 2 dargestellt ist oder einer seiner Derivate, wie vorhergehend definiert, und genauer des Gens pir 116, das eine Mutation hinsichtlich des Gens pir umfasst. Diese Mutation entspricht der Substitution eines Prolins durch ein Leucin. In diesem Zusammenhang liegt die Anzahl an Kopien der Derivate von R6K bei ungefähr 250 Kopien pro Genom.
Neben dem bedingten Replikationsursprung, wie vorhergehend definiert, enthalten die beanspruchten DNA-Moleküle eine Region, die ein (oder mehrere) Gen(e) umfasst, die die Selektion des DNA-Moleküls bei dem gewählten Wirt sicherstellt.
Es kann sich um einen herkömmlichen Marker der Art von Gen mit Resistenz gegenüber einem Antibiotikum handeln, wie etwa Kanamycin, Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Spectinomycin, Lividomycin oder andere.
Jedoch unterscheidet sich nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung diese Region von einem Gen, das eine Resistenz gegen ein Antibiotikum verleihen kann. Es kann sich somit um ein Gen handeln, dessen Produkt unverzichtbar für die Lebensfähigkeit des geplanten Wirts unter ganz bestimmten Zuchtbedingungen ist. Zum Beispiel kann es sein:

– ein Gen, das für einen tRNA-Suppressor natürlichen oder synthetischen Ursprungs kodiert. Besser handelt es sich um ein Amber tRNA-Kodon (TAG)
– ein Gen, dessen Produkt für den Metabolismus der Zelle unter bestimmten Zuchtbedingungen notwendig ist: ein Gen, das in der Biosynthese eines Metabolits (Aminosäure, Vitamin ...) interveniert, ein Katabolismusgen, das die Assimilierung einer Substanz ermöglicht, welche in dem Zuchtmedium anwesend ist (bestimmte Stickstoff- oder Kohlenstoffquelle) ...

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält diese Region eine Expressions-Kassette eines Gens, das für einen tRNA-Suppressor spezifischer Kodons kodiert. Dieser kann insbesondere unter jenen ausgewählt werden, die für die Basen Phenylalanin, Cystein, Prolin, Alanin und Histidin kodieren. Besser handelt es sich um einen tRNA-Suppressor der Amber-Kodons (TAG).
In diesem bestimmten Fall umfasst das System, das benutzt wird, um bei den Zellwirten die DNA-Moleküle, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, zu selektionieren, zwei Elemente: 1) auf dem DNA-Molekül ein Gen, das für eine Suppressor-Transfer-RNA für das Amber-Kodon (TAG) kodiert, das aus dem Selektionsmarker, der als (sup) Gen bezeichnet wird, besteht, und 2) ein spezifischer Wirt, wobei eines der Gene, die in bestimmten Zuchtbedingungen wichtig sind, ein Amber-Kodon TAG enthält. Diese Zelle könnte unter Zuchtbedingungen, für welche das Produkt des Gens, welches das Kodon TAG enthält, wichtig ist, einzig dann wachsen, wenn das Plasmid, welches die Expression von sup ermöglicht, in der Zelle vorhanden ist. Die Zuchtbedingungen bestehen also aus dem Druck zur Selektion des DNA-Moleküls. Die sup Gene, die benutzt werden, können natürlichen Ursprungs sein (Glass et al., 1982) oder können aus synthetischer Konstruktion sein (Normanly et al., 1986; Kleina et al., 1990).
Ein derartiges System bietet insofern eine große Flexibilität, dass es je nach Gen, das eine Amber-Mutation umfasst, möglich ist, die unterschiedlichen selektiven Medien zu bestimmen. Bei der Bakterie Lactococcus lactis befindet sich das Amber-Kodon zum Beispiel in einem Purin-Biosynthese-Gen. Dies ermöglicht die Selektion des Plasmids, der das Gen trägt, das für den tRNA-Suppressor kodiert, während sich die Bakterien in Milch vermehren. Ein derartiger Marker weist den Vorteil auf, dass er eine sehr reduzierte Größe aufweist und keine „fremden" Sequenzen enthält, welche von Phagen oder Transposonen stammen.
Nach einer bestimmten Ausführungsform der Erfindung umfasst das DNA-Molekül außerdem ein DNA-Fragment, das ein Ziel von stellenspezifischen Rekombinasen ist, was die Auflösung der Plasmid-Multimere ermöglicht.
Ein derartiges Fragment, das auf einem rund geformten DNA-Molekül eingefügt wird und dessen Replikationsursprung zum Beispiel ori gamma ist, ermöglicht das Auflösen der Multimere eines derartigen Plasmids. Derartige Multimere werden insbesondere beobachtet, wenn das DNA-Molekül in einem Stamm hergestellt wird, der ein mutiertes Allel von pir trägt, was das Erhöhen der Anzahl an Kopien der Derivate von R6K, wie pir-116, ermöglicht.
Diese Rekombination kann mittels unterschiedlicher Systeme durchgeführt werden, welche die stellenspezifische Rekombination zwischen den Sequenzen mit sich bringen. Besser wird die stellenspezifische Rekombination der Erfindung mittels spezifischen intramolekularen Rekombinationssequenzen erhalten, die zwischen sich in Anwesenheit von spezifischen Proteinen, die im Allgemeinen als Rekombinase bezeichnet werden, rekombinieren können. In diesem speziellen Fall handelt es sich um XerC und XerD Rekombinasen. Aus diesem Grund umfassen die DNA-Moleküle nach der Erfindung im Allgemeinen außerdem eine Sequenz, welche diese stellenspezifische Rekombination ermöglicht. Das spezifische Rekombinationssystem, das in den genetischen Konstruktionen nach der Erfindung anwesend ist (Rekombinasen und spezifische Erkennungsstelle), kann unterschiedliche Ursprünge haben. Genau können die spezifischen Sequenzen und die Rekombinasen, die benutzt werden, unterschiedlichen strukturellen Klassen angehören und besonders der Resolvase-Familie des Transposons Tn3 oder der Integrase-Familie des lambda Bakteriophags. Unter den Rekombinasen, die der Familie des Transposons Tn3 angehören, können besonders die Resolvase des Transposons Tn3 oder der Transposone, Tn21 und Tn522 (Stark et al., 1992); die Invertase Gin des Bakteriophags mu oder auch die Plasmid-Resolvasen, wie etwa die des par Fragmentes von RP4 (Abert et al., Mol. Microbiol. 12 (1994) 131) genannt werden. Unter den Rekombinasen, die der Integrase-Familie des Bakteriophags λ angehören, können besonders die Integrase der lambda Phagen (Landy et al., Science 197 (1977) 1147), P22 und f80 (Leong et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468), HP1 von Haemophilus influenzae (Hauser et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 6859), die Integrase Cre des Phags P1, die Integrase des Plasmids pSAM2 ( EP 350 341 ) oder auch die FLP Rekombinase des Plasmids 2μ und die Rekombinasen XerC und XerD von E.coli genannt werden.
Vorzugsweise enthalten die DNA-Moleküle, die Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind, das cer Fragment des natürlichen Plasmids vom E.coli ColE1. Das cer Fragment, das benutzt wird, ist ein HpaII Fragment von 382 pdb von ColE1, wovon gezeigt wurde, dass es, in cis, die Auflösung der Plasmid-Multimere (Summers et al., 1984; Leung et al., 1985) ermöglichte. Es ist auch möglich, ein HpaII-TaqI Fragment von kleinerer Größe (280 pdb) oder ein kleineres Fragment (ungefähr 220 pdb), das im HpaII Fragment enthalten ist und das dieselben Eigenschaften besitzt (Summers und Sherratt, 1988), zu benutzen. Diese Auflösung geht durch eine spezifische intramolekulare Rekombination, die vier Proteine mit sich bringt, welche von dem E.coli Genom kodiert sind: ArgR, PepA, XerC und XerD (Stirling et al., 1988, 1989; Colloms et al., 1990; Blakely et al., 1993).
In dieser Hinsicht ist es besonders vorteilhaft das ganze oder einen Teil des cer Fragments von ColE1 oder eines seiner Derivate, wie oben definiert, zu benutzen.
Nach einer Variante der Implementierung können die DNA-Moleküle der Erfindung außerdem eine Sequenz umfassen, die spezifisch mit einem Liganden interagieren kann. Vorzugsweise handelt es sich um eine Sequenz, die durch Hybridisierung eine Dreifachhelix mit einem spezifischen Oligonukleotid formen kann. Diese Sequenz ermöglicht das Reinigen der Moleküle der Erfindung durch selektive Hybridisierung mit einem ergänzenden Oligonukleotid, der auf einer Stütze immobilisiert ist (siehe Anmeldung WO96/18744). Die Sequenz kann an jeder beliebigen Stelle des DNA-Moleküls der Erfindung positioniert sein, solange sie die Funktionalität des Gens von Bedeutung und des Replikationsursprungs nicht beeinträchtigt.
Hinsichtlich des DNA-Moleküls, das darstellend für die vorliegende Erfindung ist, können besonders das Plasmid pXL2774 und seine Derivate beansprucht werden. Im Sinne der Erfindung wird unter Derivat jegliche Konstruktion verstanden, die vom pXL2774 abgeleitet ist und ein oder mehrere Gene von Bedeutung, das/die nicht das Luciferase-Gen ist/sind, umfasst. Es können ebenfalls die Plasmide pXL3029 und 3030 genannt werden, die eine Kassette der Expression eines therapeutischen Gens und eine Sequenz, die spezifisch mit einem Liganden interagieren kann, umfassen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Durchführung eines Verfahrens zur Konstruktion von spezifischen Wirtszellen, die für die Produktion dieser therapeutischen DNA-Moleküle besonders wirksam sind.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Produktion eines rund geformten DNA-Moleküls, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Wirtszelle züchtet mit mindestens einem DNA-Molekül, wie oben definiert, und einem Protein, das in situ oder nicht exprimiert wird und die Funktionalität des spezifischen und besagter Wirtszelle fremden Replikationsursprungs des besagten DNA-Moleküls bedingt, unter Bedingungen, die die Selektion von Wirtszellen ermöglichen, die von besagten DNA-Molekülen umgewandelt wurden.
Besser wird das Protein, das die Funktionalität des Replikationsursprungs des DNA-Moleküls bedingt, in situ aus einem entsprechenden Gen exprimiert. Das für die Replikation initiierende Protein kodierende Gen kann auf einem beigefügten Replikon vorhanden sein, das mit den Derivaten des benutzten bedingten Replikationsursprungs kompatibel ist oder in das Genom der Wirtszelle durch Rekombination dank eines Transposons, eines Bakteriophagen oder eines ganz anderen Vektors eingefügt werden. Im besonderen Fall, in dem das Gen, das das Protein exprimiert, auf einem beigefügten Replikon vorhanden ist, enthält letztgenannter ebenfalls eine Promoter-Region der funktionellen Transkription in der Zelle sowie eine Region in 3' und die ein Signal für das Ende der Transkription spezifiziert. Bezug nehmend auf die Promoter-Region kann es sich um eine Promoter-Region handeln, die natürlich für die Expression des betreffenden Gens verantwortlich ist, während diese in der Zelle funktionieren soll. Es kann sich ebenfalls um Regionen unterschiedlichen Ursprungs handeln (die für die Expression anderer Proteine verantwortlich sind, oder sogar synthetisch sind). Besonders kann es sich um Promoter-Sequenzen eukaryotischer oder prokaryotischer Gene oder Bakteriophagen handeln. Zum Beispiel kann es sich um Promoter-Sequenzen handeln, die von dem Genom der Zelle stammen.
Hinsichtlich Genen, die für das initiierende Protein der Replikation kodieren, können entweder wilde Gene oder mutierte Allelen benutzt werden, um das Erhalten einer erhöhten Anzahl an Kopien von Plasmiden (oder Derivaten) zu ermöglichen, die für das initiierende Protein spezifisch sind, welches die Funktionalität des Replikationsursprungs bedingen, der in dem DNA-Molekül implementiert wird.
Derartige Mutanten sind besonders für die Plasmide R6K (Inuzuka und Wada, 1985; Greener et al., 1990), Rts1 (Terawaki und Itoh, 1985; Terawaki et al., 1990; Zeng et al., 1990), F (Seelke et al., 1982; Helsberg et al., 1985; Kawasaki et al., 1991), RK2 (Durland et al., 1990; Haugan et al., 1992, 1995), pSC101 (Xia et al., 1991; Goebel et al., 1991; Fang et al., 1993) beschrieben worden.
In diesem bestimmten Fall, in dem das DNA-Molekül, das implementiert wird, einen Replikationsursprung besitzt, der von dem Plasmid R6k abgeleitet ist, ist das initiierende Protein das Protein p desselben Plasmids oder von diesem abgeleitet. Es ist besonders vorteilhaft, eine mutierte Form dieses Proteins zu exprimieren, das insbesondere die Anzahl an anfänglichen Kopien erhöhen kann. Dazu wird das Gen, das in die Wirtszelle integriert ist, vorzugsweise von der ganzen oder einem Teil der Sequenz dargestellt, die in SEQ ID NR. 2 oder einem seiner Derivate und vorzugsweise von dem Gen pir116 dargestellt wird. Die assoziierte Mutation entspricht der Substitution eines Prolins durch ein Leucin. Nach einer bestimmten Ausführungsform der Erfindung ist dieses Gen pir116 direkt in das Genom der Wirtszelle inkorporiert.
Vorzugsweise enthält eines der Gene der spezifischen Wirtszelle, die unter den gewählten Zuchtbedingungen wichtig ist, ein spezifisches Kodon, das von dem tRNA-Suppressor, der in dem DNA-Molekül selektioniert wurde, erkennbar ist. Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um ein Amber-Kodon TAG. In diesem bestimmten Fall kann diese Zelle unter Zuchtbedingungen, für welche das Produkt des Gens, welches das Kodon TAG enthält, wichtig ist, einzig dann wachsen, wenn das Plasmid, welches die Expression von sup ermöglicht, in der Wirtszelle vorhanden ist. Die Zuchtbedingungen bestehen also aus dem Druck zur Selektion des DNA-Moleküls.
Vorzugsweise ist das Gen, das das Amber-Kodon umfasst, ein Gen, das in der Biosynthese einer Aminosäure, dem Arginin, interveniert. Dieses Gen, argE, kodiert für eine N-acetylornithinase (Meinnel et al., 1992) und umfasst in diesem Fall ein Kodon TAG, das einer punktuellen Mutation Gln-53 (CAG)-> TAG entspricht; Der Druck der Selektion des Plasmids, das das sup Gen trägt, wird also durch Zucht in einem Minimalmedium M9 (Maniatis et al., 1989) gewährleistet. Jedoch könnte es auch zum Beispiel ein Biosynthese-Gen eines Vitamins, einer Nukleinbase oder eines Gens, das die Benutzung einer bestimmten Kohlenstoffquelle oder Stickstoffquelle ermöglicht, oder ein ganz anderes Gen, dessen Funktionalität für die Lebensfähigkeit der Zelle unter gewählten Zuchtbedingungen unverzichtbar ist, sein.
Die Wirtszelle wird vorzugsweise unter den E.coli Stämmen ausgewählt und ist besser durch den E.coli XAC-1 dargestellt.
Nach einer bestimmten Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle, die in dem beanspruchten Verfahren implementiert wird, eine Zelle des Stammes E.coli XAC-1, die in ihrem Genom das Gen pir116 umfasst und durch das Plasmid pXL2774 oder eines seiner Derivate umgewandelt ist.
Nach einer vorteilhaften Variante der Erfindung ist die Wirtszelle, die in dem beanspruchten Verfahren implementiert wird, eine prokaryote Zelle, in der das Gen endA1 oder ein homologes Gen inaktiviert ist. Das Gen endA kodiert für die Endonuklease I von E.coli. Dieses periplasmaartige Enzym besitzt eine nicht spezifische Aktivität zum Spalten des DNA-Doppelstrangs (Lehman, I. R., G. G. Roussos und E. A. Pratt (1962) J. Biol. Chem. 237: 819–828; Wright M. (1971) J. Bacteriol. 107: 87–94). Eine Studie, die auf verschiedenen Stämmen von Escherichia coli (wild oder endA) durchgeführt wurde, hat gezeigt, dass die Degradation der Plasma-DNA, die in Extrakten dieser Bakterienstämme inkubiert worden war, in den Stämmen endA+ existierten, nicht aber in den Mutanten endA (Wnendt S. (1994) BioTechniques 17: 270–272). Die Qualität der Plasma-DNA, die von den Stämmen endA+ oder den Mutanten endA isoliert wurde, wurde von der Gesellschaft Promega studiert, indem sie ihr Reinigungssystem benutzten (Shoenfeld, T., J. Mendez, D. Storts, E. Portman, B. ✝ Patterson, J. Frederiksen und C. Smith. 1995. Effects of bacterial strains carrying the endA1 genotype on DNA quality isolated with Wizard plasmid purification systems. Promega notes 53). Ihre Schlussfolgerung ist wie folgt: Die Qualität der DNA, die aus den Mutanten endA hergestellt wurde, ist insgesamt besser als diejenige der DNA, die in den getesteten Stämmen endA+ hergestellt wurden.
Die Qualität der Herstellungen der Plasmid-DNA wird somit durch die gesamte Kontaminierung durch diese Endonuklease beeinflusst (mehr oder weniger langfristige Degradation der DNA).
Die Deletion oder die Mutation des Gens endA kann ohne Probleme insofern in Betracht gezogen werden, dass die Mutanten, die nicht länger diese Endonuklease-Aktivität aufweisen, sich insgesamt wie die wilden Bakterien verhalten (Dürwald, H. und H. Hoffmann-Berling (1968) J. Mol. Biol. 34: 331–346).
Das Gen endA1 kann durch Mutation, ganze oder teilweise Deletion, Disruption usw. inaktiviert werden. Die Inaktivierung des Gens endA des Stamms von E. coli, die ausgewählt wurde, um die Plasmide pCOR zu produzieren, kann genauer durch das Transferieren, dank des Bakteriophagen P1, der Deletion ΔendA::Tc^R, von Cherepanov und Wackernagel (Cherepanov, P. P. und W. Wackernagel. 1995. Gene disruption in Escherichia coli: Tc^R and Km^R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158: 9–14) beschrieben, durchgeführt werden oder durch das Austauschen des wilden Allels, das in dem Genom der Bakterie von Bedeutung vorhanden ist, mit einem mutierten oder deletierten Allel von endA und zwar durch homologe Rekombination. Die Benutzung dieser Art von Stamm in dem Rahmen der vorliegenden Erfindung ermöglicht vorzugsweise die Verbesserung der Qualität des DNA-Produktes.
Die Erfindung betrifft auch jede beliebige rekombinante Zelle, die ein DNA-Molekül, wie oben definiert, enthält. Es kann sich um Zellen von unterschiedlichem Ursprung, eukaryot, prokaryot ... handeln.
Diese Zellen werden mittels jeder beliebigen, dem Fachmann bekannten Technik erhalten, wobei sie die Einfügung des besagten Plasmids in eine gegebene Zelle ermöglichen. Es kann sich insbesondere um Transformation, Elektroportation, Konjugation, Fusion von Protoplasten oder um jegliche andere Technik, die dem Fachmann bekannt ist, handeln.
Die DNA-Moleküle nach der Erfindung können in jeder Anwendung zur Impfung oder Gentherapie und Zelltherapie, für den Transfer eines Gens auf einen Organismus, ein Gewebe oder eine gegebene Zelle oder für die Produktion der rekombinanten Proteine in vitro benutzt werden.
Insbesondere können sie für eine direkte Verabreichung in vivo oder zur Modifizierung der Zellen in vitro oder ex vivo angesichts ihrer Implantation in einen Patienten benutzt werden.
In dieser Hinsicht betrifft eine andere Aufgabe der Erfindung jede beliebige pharmazeutische Zusammensetzung, die zumindest ein DNA-Molekül, wie oben definiert, umfasst. Dieses Molekül kann oder kann nicht darin mit einem chemischen und/oder biochemischen Transfektionsvektor assoziiert sein. Es kann sich besonders um Kationen (Kalziumphosphat, DEAE-Dextran ...), um Liposome handeln. Die assoziierten synthetischen Vektoren können kationische Lipide oder Polymere sein. Es können Vektoren wie DOGS (Transfectam TM) oder DOTMA (Lipofectin TM) als Beispiele genannt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen nach der Erfindung können im Hinblick auf die topischen, oralen, parenteralen, intranasalen, intravenösen, intramuskulären, subkutanen, intraokularen, transdermischen usw. Verabreichungen formuliert werden. Vorzugsweise wird das beanspruchte Plasmid in einspritzbarer Form oder Anwendung benutzt. Es kann mit jedem beliebigen pharmazeutisch akzeptablen Träger für eine einspritzbare Formulierung, besonders für eine direkte Injektion an der Behandlungsstelle gemischt werden. Es kann sich insbesondere um sterile isotonische Lösungen oder um trockene, und zwar lyophilisierte, Zusammensetzungen handeln, die durch die Zugabe, je nach Fall, von sterilisiertem Wasser oder physiologischem Serum die Konstitution einspritzbarer Nährlösungen ermöglicht. Es kann sich insbesondere um Tris oder PBS Puffer handeln, die in Glukose oder Natriumchlorid verdünnt sind. Eine direkte Injektion in die angegriffene Region des Patienten ist interessant, da sie das Konzentrieren der therapeutischen Wirkung an den betroffenen Geweben ermöglicht. Die verwendeten Dosen können in Abhängigkeit der unterschiedlichen Parameter und besonders in Abhängigkeit des Gens, des Vektors, der benutzten Verabreichungsart, der betreffenden Pathologie oder auch der Dauer der gesuchten Behandlung angepasst werden.
Die DNA-Moleküle der Erfindung können ein oder mehrere Gene von Bedeutung umfassen, d. h. eine oder mehrere Nukleinsäuren (cDNA, gDNA, synthetische oder halbsynthetische DNA usw.), deren Transkription und möglicherweise die Translation in der Zielzelle Produkte erzeugen, die eine therapeutische, vakzinale, agronomische oder veterinäre Bedeutung haben.
Unter den Genen von therapeutischer Bedeutung können insbesondere die Gene genannt werden, die für die Enzyme, die Blutderivate, die Hormone, die Lymphokine kodieren: Interleukine, Interferone, TNF usw. ( FR 9203120 ), Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter oder deren Präkursoren oder Syntheseenzyme, trophische Faktoren: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 usw.; die Apolipoproteine: ApoAI, ApoAIV, ApoE usw. ( FR 93 05125 ), Dystrophin oder ein Minidystrophin ( FR 9111947 ), die Tumor-Suppressor-Gene: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev usw. ( FR 93 04745 ), die Gene, die für die Faktoren kodieren, welche in der Koagulation impliziert sind: Faktoren VII, VIII, IX usw., die Suizidgene: Thymidinkinase, Zytosindesaminase usw. oder der ganze oder ein Teil eines natürlichen oder künstlichen Immunglobulins (Fab, ScFv usw.), ein RNA-Ligand (WO91/19813) usw. Das therapeutische Gen kann auch ein Antisense-Gen oder eine Antisense-Sequenz sein, dessen/deren Expression in der Zielzelle das Kontrollieren der Gene oder der Transkription der zellulären mRNAs ermöglicht. Derartige Sequenzen können zum Beispiel in der Zielzelle in RNAs transkribiert werden, die zu den zellulären mRNAs ergänzend sind und somit ihre Translation in Protein blockieren, nach der in Patent EP 140 308 beschriebenen Technik.
Das Gen von Bedeutung kann auch ein Impfgen sein, d. h. ein Gen, das für ein Antigen-Peptid kodiert, wobei es im Menschen oder im Tier eine Immunantwort erzeugt, um Impfstoffe zu erlangen. Es kann sich insbesondere um spezifische Antigen-Peptide des Epstein-Barr-Virus, des HIV-Virus, des Hepatitis B Virus ( EP 185 573 ), des Pseudorabies-Virus oder auch spezifisch für Tumoren ( EP 259 212 ) handeln.
Im Allgemeinen enthält, bei den DNA-Molekülen der Erfindung, das therapeutische, vakzinale, agronomische oder veterinäre Gen von Bedeutung auch eine Promoter-Region der funktionellen Transkription in der Zielzelle oder dem Zielorganismus sowie eine Region in 3' und die ein Signal für das Ende der Transkription und eine Polyadenylationsstelle spezifiziert. Bezug nehmend auf die Promoter-Region kann es sich um eine Promoter-Region handeln, die natürlich für die Expression des betreffenden Gens verantwortlich ist, während diese in der betreffenden Zelle oder dem betreffenden Organismus funktionieren soll. Es kann sich ebenfalls um Regionen unterschiedlichen Ursprungs handeln (die für die Expression anderer Proteine verantwortlich sind, oder sogar synthetisch sind). Besonders kann es sich um Promoter-Sequenzen eukaryoter oder prokaryoter oder viraler Gene handeln. Zum Beispiel kann es sich um Promoter-Sequenzen handeln, die von dem Genom der Zielzelle stammen. Unter den eukaryoten Promotern kann jeder beliebige Promoter oder jede beliebige abgeleitete Sequenz benutzt werden, welcher/welche die Transkription eines Gens auf spezifische oder nicht spezifische, induzierbare oder nicht induzierbare, starke oder schwache Weise stimuliert oder unterdrückt. Es kann sich ausdrücklich um ubiquitäre Promoter handeln (Promoter der Gene HPRT, PGK, a-Actin, Tubulin usw.), um Promoter mit intermediären Filamenten (Promoter der Gene GFAP, Desmin, Vimentin, Neurofilamente, Keratin usw.), Promoter von therapeutischen Genen (zum Beispiel der Promoter der Gene MDR, CFTR, Faktor VIII, ApoAI usw.), spezifische Gewebepromoter (Promoter des Gens für Pyruvatkinase, Villin, intestinalem Protein zur Fettsäurebindung, a-Actin des glatten Muskels usw.) oder Promoter, die auf einen Reiz reagieren (Empfänger von Steroidhormonen, Empfänger von Retinolsäure usw.). Ebenso kann es sich um Promoter-Sequenzen handeln, die aus dem Genom eines Virus stammen, wie beispielsweise die Promoter der Gene E1A und MLP des Adenovirus, der frühe Promoter von CMV oder auch der Promoter des LTR des RSV usw. Außerdem können diese Promoter-Regionen abgewandelt werden, indem Aktivierungs-, Regulierungssequenzen hinzugefügt werden oder eine gewebespezifische oder mehrheitlich gewebespezifische Expression ermöglicht wird.
Des Weiteren kann das Gen von Bedeutung auch eine Signalsequenz umfassen, welche das synthetisierte Produkt in die Sekretionswege der Zielzelle leitet. Diese Signalsequenz kann die natürliche Signalsequenz des synthetisierten Produkts sein, aber sie kann auch jede beliebige andere funktionelle Signalsequenz oder eine künstliche Signalsequenz sein.
Nach dem Gen von Bedeutung können die DNA-Moleküle der Erfindung für die Behandlung oder die Prävention vieler Pathologien benutzt werden, umfassend Genkrankheiten (Dystrophie, cystische Fibrose usw.), neurodegenerative Krankheiten (Alzheimer, Parkinson, ALS usw.), Krebsarten, Pathologien im Zusammenhang mit Störungen der Koagulation oder mit Dyslipoproteinämien, Krankheiten im Zusammenhang mit Infektionen (Hepatitis, AIDS usw.) oder die agronomischen und veterinären Gebiete usw.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Benutzung der DNA-Moleküle mit bedingter Replikation für die Produktion rekombinanter Proteine. Die Bakterien können benutzt werden, um verschiedene Ursprungsproteine, eukaryot oder prokaryot zu produzieren. Unter den Bakterien stellt E.coli aufgrund seiner leichten Manipulierung, der wichtigen Anzahl an verfügbaren Systemen und der wichtigen Mengen an Proteinen, die erhalten werden können, den Wahlorganismus zur Expression von heterologen Genen dar. Es versteht sich, dass das System der Erfindung in anderen Organismen benutzt werden kann, wobei der Tropismus durch die Beschaffenheit des Replikationsursprungs bestimmt wird, wie vorher angegeben. Für diese Benutzung umfasst die Nukleinsequenz von Bedeutung eine kodierende Region unter der Kontrolle der Expressionssignale, die für den gewählten Wirt geeignet sind, insbesondere einen prokaryoten Wirt. Es kann sich zum Beispiel um die Promoter Plac, Ptrp, PT7, Ptrc, Ptac, PL, PR, die Sequenz Shine-Dalgamo usw. handeln (wobei dieser Satz die Expressionskassette bildet). Die Nukleinsäuresequenz von Bedeutung kann jede beliebige Sequenz sein, die für ein Protein kodiert, das eine Bedeutung für die pharmazeutischen, Nahrungsmittel-, Chemie- oder Agrochemie-Bereiche darstellt. Es kann sich um ein Strukturgen, eine ergänzende DNA-Sequenz, eine synthetische oder halb synthetische Sequenz usw. handeln.
Die Expressionskassette kann auf dem bedingten Replikationsvektor, der Gegenstand der Erfindung ist, eingefügt werden, wobei er einen bedingten Replikationsvektor bildet, der die Expression von Proteinen von Bedeutung in E.coli ermöglicht. Dieser Vektor weist mehrere Vorteile auf: keine Benutzung von Antibiotika, um ihn in der Bakterie zu selektionieren (niedrigere Kosten, keine Studie hinsichtlich der Anwesenheit von Antibiotikum oder potentiell toxischen abgeleiteten Produkten nötig), sozusagen keine Wahrscheinlichkeit der Dissemination des Plasmids in der Natur (bedingter Replikationsursprung), mögliche Fermentierung in gänzlich definiertem Medium. Die dargestellten Beispiele zeigen die vorteilhaften Eigenschaften dieser bedingten Vektoren für die Produktion von rekombinanten Proteinen.
Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der nachfolgenden Beispiele genauer beschrieben.
Beschreibung der Figuren:
1: Funktionelle Organisation der Region R6K, die in der Replikation impliziert ist.
2: Organisation der funktionellen Bereiche des p Proteins des Plasmids R6K.
3: Darstellung des Protokolls zur Einfügung des Gens pir in das Genom von E.coli XAC1.
4: Konstruktionsschema der Vektoren pXL2666, 2730 und 2754.
5: Konstruktion von pXL2774.
6: Wachstums- und Produktionskinetik in einem 2-Liter-Fermenter.
7: Wachstums- und Produktionskinetik in einem 800-Liter-Fermenter.
8: Konstruktion von pXL3056.
9: Visualisierung des Proteins aFGF, das aus E.coli XAC-1pir-116 (pXL3056 + PT7pol23) nach der Induktion produziert wurde. Die gesamten denaturierten Zellextrakte werden auf dem 12,5 % SDS Polyacrylamidgel abgelagert. M: Molekularmasse-Marker (Biorad, Low range). Jedes Band wird mittels eines Pfeils und einer Zahl, die seine Masse in kDalton angibt, identifiziert. 1: XAC-1pir-116 (pXL3056 + pUC4K) nicht induziert; 2: XAC-1pir-116 (pXL3056 + pUC4K) induziert bei 42 °C; 3: XAC-1pir-116 (pXL3056 + PT7pol23) Klon 1, nicht induziert; 4: XAC-1pir-116 (pXL3056 + PT7pol23) Klon 1, induziert bei 42 °C; 5: XAC-1pir-116 (pXL3056 + PT7pol23) Klon 2, nicht induziert; 6: XAC-1pir-116 (pXL3056 + PT7pol23) Klon 2, induziert bei 42 °C; t1: 1 μg von gereinigtem aFGF; t4: 4 μg von gereinigtem aFGF.
10: Konstruktionsschema der Vektoren pXL3029 und pXL3030.
I – MATERIALIEN UND METHODEN
A) Materialien
1) Zuchtmedium
Es wurden die vollständigen Medien LB, 2XTY und SOC, das minimale Medium M9 (Maniatis et al., 1989) benutzt. Die Agarmedien wurden durch die Zugabe von 15 g Difco Agar erhalten. Außerdem wurden diese Medien, falls erforderlich, mit Antibiotika, Ampicillin oder Kanamycin in den jeweiligen Konzentrationen 100 mg/l und 50 mg/l supplementiert. Die chromogenen Substrate X-Gal und X-Gluc wurden in der Konzentration 40 mg/l benutzt.
2) E.coli Stämme, Plasmide und Bakteriophagen
Die E.coli Stämme, die Plasmide und die Bakteriophagen, die benutzt wurden, werden jeweils in den nachfolgenden Beispielen identifiziert.
B) Methoden
1) DNA-Manipulation
Die Isolierung der bakteriellen DNA (Plasmid-, Genom-DNA) und der Phage-DNA (replikative Form von M13), die Digestionen durch die Resktriktions-Endonukleasen, die Ligaturen der DNA-Fragmente, die Agarosegel-Elektrophorese (in TBE-Puffer) und andere standardmäßige Techniken wurden nach den Herstellerempfehlungen zur Benutzung von Enzymen durchgeführt oder durch die Anpassung an die Protokolle, die in „Molecular Cloning: a Laboratory Manual" (Maniatis et al., 1989) beschrieben sind.
Die DNA-Größe-Marker, die während den Elektrophoresen benutzt wurden, sind Folgende: 1 kpb Leiter (BRL) für die linearen Fragmente und der mehrfach gewundene DNA-Marker (Stratagen) für die nicht digerierten Plasmide.
Die Sequenzialisierung wurde nach der Technik von Sanger (Sanger et al., 1977) durchgeführt, die an die automatisierte Methode angepasst wurde, welche fluoreszierende Dideoxynukleotide und Taq DNA Polymerase benutzt (PRISM Ready Reaction DyeDideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems).
Die benutzten Oligodesoxynukleotide (die als „seq + nr." bezeichnet werden, siehe unten) wurden auf dem Synthetisierer „Applied Biosystems 394 DNA/RNA Synthesizer" mittels der Methode der Phosphoramidite, welche schützende β-Cyanoethyl-Gruppen benutzen (Sinha et al., 1984) synthetisiert. Nach der Synthese werden die schützenden Gruppen durch die Behandlung mit Ammoniak eliminiert. Zwei Präzipitationen mit Butanol ermöglichen die Reinigung und Konzentrierung des Oligonukleotids (Sawadogo et al., 1991).
Sequenz der Oligonukleotide, die zur PCR-Amplifizierung benutzt wurden:
SEQ ID NR. 3 5'-GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3'
SEQ ID NR. 4 5'-GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3'
SEQ ID NR. 5 5'-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3'
SEQ ID NR. 6 5'-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3'
Die PCR-Reaktionen (Saiki et al., 1985) wurden in den folgenden Bedingungen in einem Gesamtvolumen von 100 μl durchgeführt. Das Reaktionsgemisch umfasst 150 ng Genom-DNA des zu untersuchenden Stammes, 1 μl jeder der 2 Oligonukleotid-Primer (24-mer), 10 μl 10XPCR Puffer, dessen Zusammensetzung die folgende ist „500 mM KCl, 0,1 % Gelatine, 20 mM MgCl₂, 100 mM Tris-HCl pH-Wert 7,5'', und 2,5 Einheiten Taq DNA-Polymerase (Amplitaq Perkin-Elmer). Die PCR-Bedingungen auf dem Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler Gerät sind die Folgenden: 2 Min. bei 91 °C, 30 aufeinanderfolgende Zyklen Denaturierung (1 Min. bei 91 °C), Hybridisierung (2 Min. bei 42 °C) und Verlängerung (3 Min. bei 72 °C) und schließlich 5 Min. bei 72 °C. Die so erhaltenen Produkte, die von einem Restriktionsenzym digeriert oder nicht digeriert sind, werden mittels Elektrophorese auf Agarosegel analysiert.
Die Analyse der unterschiedlichen Plasmidarten durch die DNA-Topoisomerasen wurde nach dem folgenden Protokoll durchgeführt: Die Enzyme, die in dem Labor gereinigt wurden, werden während 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Reaktionsgemische (Gesamtvolumen: 40 μl) weisen folgende Zusammensetzung auf: 150 ng Plasmid, 300 ng DNA-Topoisomerase I oder 150 ng DNA-Gyrase von E.coli, oder 160 ng DNA-Topoisomerase IV von S. aureus und 20 μl spezifischen Puffers jedes Enzyms. Die Zusammensetzung dieser Puffer ist nachfolgend angegeben:
für die DNA-Topoisomerase I: 50 mM Tris-HCl pH-Wert 7,7, 40 mM KCl,
1 mM DIT, 100 μg/ml SAB, 3 mM MgCl₂, 1 mM EDTA;
für die DNA-Topoisomerase IV: 60 mM Tris-HCl pH-Wert 7, 7, 6 mM MgCl₂,
10 mM DTT, 100 μg/ml SAB, 1,5 mM ATP,
350 mM Kaliumglutamat;
für die DNA-Gyrase: 50 mM Tris-HCl pH-Wert 7,7, 5 mM MgCl₂,
1,5 mM ATP, 5 mM DTT, 100 μg/ml SAB, 20 mM KCl.
2) E.coli-Transformation
Diese wurde routinemäßig nach der TSB-Methode durchgeführt (Transformation and Storage Buffer) die von Chung und Miller (1988) beschrieben wurde. Für einen Stamm wie TG1 (Gibson et al. 1984) liegt die Wirksamkeit der Transformation, die erhalten wird, zwischen 10⁵ und 10⁶ Transformanten pro μg pUC4K (Vieira und Messing; 1982). Wenn eine höhere Transformationswirksamkeit nötig war, wurden die Bakterien durch Elektroporation nach dem Protokoll, das von dem Hersteller des Elektroporators (Biorad) herausgegeben wird, umgewandelt. Diese Methode ermöglicht das Erreichen von Wirksamkeiten zwischen 10⁸ und 10¹⁰ Transformanten pro μg pUC4K.
3) Durch einen kationischen Lipofektanten vermittelte Zelltransfektion
Die benutzten Zellen sind Maus-Fibroblasten NIH 3T3, die am Tag zuvor in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 50000 Zellen pro Well angeimpft wurden. Das Zuchtmedium, das benutzt wurde, ist das DMEM-Medium, das 4,5 g/l Glukose, supplementiert mit 10 % fötalem Kalbsserum und 1 % Lösungen von 200 mM Glutamin und Antibiotika (Streptomycin 5,10³ u/ml, Penizillin 5,10³ μg/ml) (Gibco) enthalt. Die Plasmid-DNA (1 μg in 25 μl NaCl 9 ‰) wird Volumen um Volumen mit einer Lipofektant-Suspension gemischt. Es werden vier „Lipofektant-Ladungen/DNA-Ladungen" Verhältnisse getestet: 0, 3, 6 und 9. Diese Verhältnisse werden unter Berücksichtigung, dass 1 μg Plasmid-DNA 3,1 nmol negativer Ladungen trägt und dass der Lipofektant 3 positive Ladungen pro Molekül umfasst, berechnet. Nach einem Kontakt von 10 Minuten, der die Bildung des Komplexes DNA/Lipid ermöglicht, werden 50 μl DNA-Lipofektant-Mischung auf den Zellen im Zuchtmedium ohne Serum (500 μl) eingefugt. Die Zellen wurden vorab 2 mal mit demselben Medium gespült. Die Inhibition der Transfektion durch das Serum wird somit verhindert. Nach der Inkubation (2 Stunden bei 37 °C in einem CO₂-Inkubator) wird dem Medium 10 % fötales Kalbsserum hinzugegeben. Die Zellen wurden dann wieder zur Inkubation für 24 Stunden zurückgegeben.
4) Messung der Luciferase-Aktivität eukaryotischer Zellen
Diese wird 24 Stunden nach der Transfektion durchgeführt. Die Luciferase katalysiert die Oxydation des Luciferins in Anwesenheit von ATP, Mg²⁺ und O₂ unter begleitender Produktion eines Photons. Die Gesamtheit an emittiertem Licht, die mittels eines Luminometers gemessen wird, ist proportional zur Luciferase-Aktivität der Probe. Die benutzten Reagenzien werden von Promega (Luciferase assay system) bereitgestellt und nach dem empfohlenen Protokoll benutzt. Nach der Zelllyse wird die unlösliche Fraktion jedes Extrakts mittels Zentrifugierung eliminiert. Die Dosierung erfolgt auf 5 μl Uberstand, der in dem Lysepuffer der Zellen verdünnt oder nicht verdünnt ist.
3) Messung der Proteinkonzentration der Zellextrakte
Diese wird nach der BCA-Methode (Pierce) unter Benutzung von Bicinchonsäure (Wiechelman et al., 1988) durchgeführt. Der standardmäßige BSA-Bereich wird in dem Lysepuffer (vgl. III-B-4) durchgeführt. Die Proben für den Assay und diejenigen des Bereichs werden, Volumen um Volumen, mit Iodoacetamid 0,1 M/Puffer Tris 0,1 M pH-Wert 8,2, während 1 Stunde bei 37 °C vorbehandelt. Diese Behandlung ermöglicht das Vermeiden von Störungen während des Assays durch das Reduzierungsagens (DTT), das in dem Lysepuffer vorhanden ist. Das Lesen des Assays erfolgt bei 562 nm.
BEISPIEL 1:
Konstruktion von Wirtsstämmen XAC-1pir und pir-116 durch homologe Rekombination
Der verwendete Stamm ist der Stamm E.coli XAC-1 (Normanly et al; 1980. Vorzugsweise umfasst das argE Gen dieses Stamms eine Glutamine-53-Mutation (CAG) in das Amber-Kodon (TAG) (Meinnel et al., 1992). Das argE Gen gehört zum divergenten argECBH Operon und kodiert für ein Arginin-Biosynthese-Enzym, N-Acetylornithinase. XAC-1 kann somit das Arginin nicht synthetisieren und infolgedessen nicht in dem minimalen Medium wachsen. Diese Auxotrophie wird aufgelöst, wenn der Stamm ein Plasmid beherbergt, das die Expression einer Suppressor-tRNA ermöglicht. Es ist also möglich, durch das Züchten in minimalem Medium, die Bakterien, welche ein derartiges Plasmid tragen, zu selektionieren. Um die Replikation der Plasmide, die von R6K abgeleitet sind, darin zu ermöglichen, war es nötig, mittels homologer Rekombination das pir Gen in das Genom XAC-1 einzufügen. Das pir Gen (wild oder mutiert) wird am Ort uidA durch den Austausch zwischen dem wilden uidA Gen und einer Kopie durch das pir Gen (oder pir-116) unterbrochen. Das uidA Gen kodiert für eine β-Glucuronidase, das Hydrolyseenzym der β-Glucuronide. Dieses Gen kann ohne Problem inaktiviert werden, das es nicht für das Wachstum in den herkömmlichen klassischen Medien nötig ist, in denen die β-Glucuronide nicht benutzt werden. Außerdem kann die β-Glucuronidase-Aktivität mittels eines chromogenen Substrats, dem X-Gluc, dessen Hydrolyse ein blaues Pigment freigibt, überwacht werden.
1) Konstruktion eines Suizid-Vektors, der die Kassette „Km^R-uidA::pir (oder pir-116) trägt
Wir haben eine Strategie benutzt, die einen einzigen bakteriellen Wirt bedingt und die Modifikationen des Genoms des Stammes von Bedeutung minimiert. Der Phage M13mp10 (Messing und Vieira; 1982) wurde als Suizid-Vektor (Blum et al., 1989) benutzt. Eine Amber-Mutation im Gen II, die zur Replikation unverzichtbar ist, reduziert das Wirtsspektrum dieses M13 auf die Stämme, wie etwa TG1 (supE), die einen Amber tRNA-Suppressor produzieren; daher kann er sich also in den Stämmen E.coli sup+, wie XAC-1, nicht replizieren.
Die Kassetten BamHI von 3,8 kpb, die das Gen, das gegenüber Kanamycin von Tn5 und _uidA::pir oder pir-116 resistent ist, enthalten, wurden gereinigt aus M13wm34 bzw. 33 (Metcalf et al; 1994). Die wurden in mit BamHI linearisiertem M13mp10 geklont. Die rekombinanten Klone wurden durch das Ausbreiten auf LB + Km Agarmedium nach der Elektoporation in TG1 der Ligaturmischungen selektioniert. Die Konformität der erhaltenen Klone wurde durch die Analyse des Restriktionsprofils und durch die Sequenzierung der Region, die der Mutation pir-116 entpricht, aufgezeigt.
2) Einfügung der pir oder pir-116 Gene in das E.coli Gen XAC-1 mittels homologer Rekombination
Die angewendete Strategie und die unterschiedlichen Ereignisse, die damit einhergehen, sind in 3 gezeigt.
a) Erstes Rekombinationsereignis
Der Stamm XAC-1 wurde mittels Elektroporation mit 10, 100 oder 2000 ng jedes RF (mp10-_uidA::pir oder pir-116) umgewandelt. Ein Drittel jedes Expressionsgemisches wurde auf LB-Platten ausgebreitet, die das Kanamycin enthalten, und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Phagen mp10-_uidA::pir oder pir-116 können sich nicht im Stamm XAC-1 (sup+) replizieren. Der Marker Km^R kann daher nur durch Integration in das Genom der Bakterie über homologe Rekombination mit der wilden Kopie des Gens uidA erhalten werden. Die Ergebnisse der Elektroporationen von XAC-1 sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Wirksamkeit der Transformation, die erhalten wurde, betrug 4,10⁹ Transformanten pro μg pUC4K.
TABELLE 1
In den Testbedingungen wächst die Anzahl an wesentlichen Bestandteilen auf nicht lineare Weise mit der Menge an DNA. In Anbetracht der Transformationswirksamkeit und der Größe von RF (11,7 kpb) erhält man eine ungefähre Vorstellung von der Rekombinationsquote. Unter Berücksichtigung des Punktes in 100 ng erhält man eine Rekombinationsfrequenz von ungefähr 10^–6.
b) Zweites Rekombinationsereignis
Das zweite Rekombinationsereignis wird dann durch die Resistenz der Stämme gegenüber Desoxycholat (Doc^R) selektioniert.
Dazu wurden 5 wesentliche Bestandteile jeder Konstruktion in das Zuchtmedium 2XTY gegeben, das mit 0,2 % Natriumdesoxycholat supplementiert ist. Es erschienen zwei deutliche Bestände. Manche Klone ergeben eine gut sichtbare Trübung nach ungefähr 8 Stunden bei 37 °C (zwei Klone für die Konstruktion pir und drei für die Konstruktion pir-116). Die anderen Klone ergaben erst nach der Nacht bei 37 °C eine dichte Zucht. Fast alle waren wie erwartet Km^s. Für jeden der untersuchten Elektroporanten wurden 50 Km^S Abkömmlinge auf LB-Medium, das mit X-Gluc supplementiert ist, gestrichen. Nach 48 Stunden bei 37 °C waren die Klone UidA⁺ hellblau, während jene, die einem Allelersatz unterzogen wurden (Fall Nr. 1, 3), auf diesem Medium weiß blieben (UidA-). Tabelle 2 fasst die Phenotypanalyse der erhaltenen Doppelrekombinante zusammen.
Zwischen 18 und 30 % der Doppelrekombinanten wurden einem Allelersatz unterzogen.
TABELLE 2
3) Kontrolle des Charakters von Pir+ der Stämme, die durch Rekombination erhalten wurden
Um sich über den Charakter von Pir+ zu versichern, welches mittels Doppelrekombination erhalten wurde, haben wir drei Klone aus jeder Konstruktion mit pBW30 (Metcalf et al., 1994) umgewandelt. Das Erhalten der Transformanten für alle getesteten Stämme ermöglichte das Aufzeigen der Funktionalität der Gene pir und pir-116, die in dem Genom XAC-1 integriert sind. Unter denselben Bedingungen wird kein Transformant erhalten mit dem parentalen Stamm XAC-1. Wir fuhren mit Studie von 2 Klonen XAC-1pir (B und C) und 2 Klonen XAC-1pir-116 (E und D) fort.
4) Kontrolle mittels PCR-Amplifikation der Stämme, die durch Rekombination erhalten wurden
Zur Bestätigung des Allelersatzes kontrollierten wir mittels PCR-Amplifikation die Genomregionen auf beiden Seiten des Ortes uidA. Jedes Oligonukleotidpaar besteht aus einem Oligonukleotiden, der einer Region in pir entspricht, und einem zweiten Oligonukleotid, der einer Region nahe dem Chromosom-uidA entspricht, jedoch nicht in dem Fragment, das der Rekombination gedient hat, enthalten ist. Die Sequenz des letztgenannten Oligonukleotids wurde dank der Sequenz ECOUIDAA der Genbank (Zugangsnummer: M14641) bestimmt. Daher konnten wir die genaue Position des Gens pir in dem Genom er Bakterie überprüfen. Die Beschaffenheit der amplifizierten Fragmente, deren Größe mit derjenigen konform ist, die erwartet werden konnte, wurde durch die Digestion mit MluI bestätigt.
BEISPIEL 2:
Konstruktion von Plasma-Vektoren, die von R6K abgeleitet sind, welche den Selektionsmarker sup Phe tragen
Wir konstruierten Vektoren, die das ori γ von R6K und das Gen, das gegenüber Kanamycin (pXL2666) resistent ist, umfassen. Die Beobachtung der Multimere von pXL2666 in dem Stamm BW19610 (pir-116) 5 (Metcalf et al; 1993) führte uns zur Studie der Wirkung des Fragments cer von ColE1 auf dieses Phänomen. Danach fügten wir die Expressionskassette vom tRNA-Suppressor Phenylalanin (sup Phe) auf dem Vektor ori γ-Km^R-cer (pXL2730) ein. Dieser Vektor, pXL2760, dient als Basis für die Konstruktion von Vektoren, die in der Gentherapie benutzt werden können.
1) Konstruktion und Analyse der Vektoren, die ori γ von R6K und das Gen mit Resistenz gegenuber dem Kanamycin umfassen
a) Konstruktionen
Im ersten Plasmid, das konstruiert wurde, pXL2666, kommt das Gen mit Resistenz gegenüber Kanamycin von pUC4K (Vieira und Messing; 1982) und der Replikationsursprung, der in einem Fragment EcoRI-BamHI von 417 pdb enthalten ist, kommt vom Suizidvektor pUT-T7pol (Herrero et al; 1990) (4). Der Transfer von pXL2666 in die Stämme BW19094 und 19610 (Metcalf et al; 1994) ermöglichte das Aufzeigen, dass die Menge an Plasmid in einem Stamm pir-116 hinsichtlich desselben Plasmids in einem Stamm pir tatsächlich erhöht wurde. Die Analyse mittels Elektrophorese der nicht digerierten Plasmide zeigt, dass diese Erhöhung Hand in Hand mit der Erscheinung von ein paar multimeren Formen geht. Wahrscheinlich ist dieses Phänomen mit einer intermolekularen Rekombination zwischen den mehreren Kopien des Plasmids verbunden. Wir haben auch pXL2730 konstruiert, indem das Fragment cer des natürlichen Plasmids von E.coli ColE1, wovon gezeigt wurde, dass es die Resolution von Plasmiddimeren in cis ermöglicht (Summers und Sherrat, 1984), auf pXL2666 geklont wurde. Das Fragment, das benutzt wurde, entspricht einem Fragment HpaII von 382 pdb von ColE1 (Leung et al., 1985). Es enthält eine spezifische intermolekulare Rekombinationsstelle; damit es funktionieren kann, impliziert es lediglich Wirtsproteine, deren Rekombinasen XerC und XerD sind, und die zugehörigen Faktoren ArgR und PepA (Stirling et al., 1988, 1989; Colloms et al., 1990). Um sicherzugehen, dass die beobachteten Auswirkungen tatsächlich vom Fragment cer sind, haben wir ebenfalls das Kontrollplasmid pXL2754 konstruiert, in dem das Fragment cer eine Deletion von 165 pdb aufweist. Diese Deletion hat sich als die Tätigkeit von cer auf die Resolution der Multimere aufhebend erwiesen (Leung et al., 1985). Die unterschiedlichen Klonschritte, welche zur Konstruktion dieser Plasmide führten, sind in 4 dargestellt.
b) Quantitative und qualitative Analyse der Plasmidarten
• Analyse mittels Agarosegel-Elektrophorese
Die Analyse mittels Elekrophorese der unterschiedlichen Plasmide, die konstruiert wurden, ermöglichte die Veranschaulichung verschiedener Plasmidarten, die je nach benutztem Stamm variabel sind. Die Größe der nicht digerierten Plasmide wurde hinsichtlich des mehrfach gewundenen DNA-Markers evaluiert. Im Stamm pir (BW19094) sind die Plasmide pXL2666, 2754 und 2730 praktisch gänzlich monomer. Die Bänder über jedem Hauptband entsprechen unterschiedlichen Topoisomeren, die leicht weniger mehrfach gewunden sind, wie dies das Profil bestätigt, das nach der Tätigkeit der DNA-Gyrase mit pXL2730 beobachtet wurde.
Im Falle des Stammes pir-116 (BW19610) sind die Profile unterschiedlich: Bei den Plasmiden pXL2666 und 2754 werden unterschiedliche Arten beobachtet, die vom Monomer zum Multimeren übergehen (2, 3 oder 4 Einheiten), wobei die Hauptform der Dimer ist. Nach der Digestion mit EcoRI findet sich lediglich lineare Plasmid-DNA wieder; diese Plasmidarten entsprechen entweder den Plasmidmultimeren oder den diversen Topoisomeren. Da die Größe der bestimmten Formen nach dem mehrfach gewundenen DNA-Marker jedoch ein ganzes Produkt von der des Monomerplasmids ist, ist es höchstwahrscheinlich, dass sie Multimere sind. Die Bildung von Multimeren ist höchstwahrscheinlich der pir-116 Mutation zuzuschreiben, obgleich die zwei Stämme BW19094 und BW19610 nicht streng genommen isogen sind (BW19610 ist recA). Das mit pXL2730 erhaltene Profil ist anders: obgleich multimere Formen immer noch sichtbar sind, ist die Hauptform die monomere Form. Das cer Fragment kann somit die Resolution unabhängig von recA, in BW19610 der von uns konstruierten Plasmid-Multimere erleichtern.
• Analyse nach der Behandlung mit DNA-Topoisomerasen
Um die Theorie zu widerlegen, dass die beobachteten Formen in den Stämmen, die das pir-116 Allel tragen, spezifische Topoisomere sind, wurde jede Plasmidherstellung der Tätigkeit der DNA-Topoisomerasen unterzogen. Die Aktivitäten der unterschiedlichen Enzyme unter Versuchsbedingungen sind wie folgt: Entspannen der DNA für die DNA-Topoisomerase I von E.coli, negative mehrfache Windung der entspannten DNA für die DNA-Gyrase von E.coli und Entwirren verschlungener DNAs und Entspannen der mehrfach gewundenen DNA durch S. aureus DNA-Topoisomerase IV. Die Tätigkeit der DNA-Topoisomerase IV machte das Auzeigen möglich, dass die Plasmidformen mit hohem Molekulargewicht nicht aus der Verschlingung mehrerer Plasmid-Moleküle resultiert; in diesem Fall wären sie dann in die Monomerart umgewandelt worden. Die Funktionalität des Enzyms wurde natürlich auf der Herstellung der Kinoplast-DNA überprüft, die aus verschlungenen DNA-Molekülen (nicht gezeigt) zusammengesetzt ist. Die Aktivität der Entspannung ist auch sichtbar, da Arten erhalten werden, die weniger als in unbehandelten Kontrollen migrieren. Die Tätigkeit der DNA-Gyrase ermöglichte das Umwandeln der leicht entspannten Topoisomere in der mehr mehrfach gewundenen Art, die aus der Bakterie extrahiert wurde (hauptsächlich Monomer oder Dimer). Ferner ermöglichte sie das Verifizieren, dass die hergestellten DNAs hauptsächlich in mehrfach gewundener Form vorliegen. Die so behandelten Proben ermöglichen das Bestätigen der oben erwähnten Ergebnisse hinsichtlich der Hauptarten für jede Konstruktion. Die DNA-Topoisomerase I entspannte die DNA tatsächlich, jedoch nur teilweise. Dies könnte auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass die untersuchten Plasmide nur wenige einsträngige Regionen enthalten, an die sich dieses Enzym vorzugsweise bindet (Roca, 1995).
2) Einfügung des Selektionsmarkers sup Phe in pXL2730
Wir benutzten die Expressionskassette des synthetischen Suppressor tRNA Gens (Phe) (Kleina et al., 1990). Diese fügt als Reaktion auf ein TAG Kodon ein Phenylalanin in die wachsende Polypeptid Kette ein. Ferner ermöglicht sie die Produktion in XAC-1 eines ArgE Proteins, das ausreichend aktiv ist, um ein gutes Wachstum in an Arginin armem Medium zu ermöglichen. sup Phe ist konstitutiv auf dem Plasmid pCT-2-F (Normanly et al; 1986) exprimiert, aus einem synthetischen Promoter, der aus der Promotersequenz P_lpp des E.coli lpp Gens abgeleitet ist. Stromabwärts dieses Gens wird die Transkription vom synthetischen Terminator T_rmC des E.coli Operons rmC (Normanly et al., 1986) gestoppt. Die unterschiedlichen Klonschritte sind in 5 angegeben.
Die unterschiedlichen Subklonierungen wurden in XAC-1 durchgeführt. Die Funktionalität der Expressionskassette des tRNA-Suppressors wird somit durch die β-Galactosidaseaktivität dieses Stamms, die nur vorhanden ist, wenn es eine Suppression des Amber-Kodons des Gens lacZ_u118am gibt, überprüft. Der letzte Schritt umfasst die Einfügung der sup Phe Expressionskassette in pXL2730. Die Ergebnisse, die mit dem cer Fragment (B-1-b) erhalten wurden, ließen uns dieses Plasmid auswählen anstatt pXL2666. Wir bewahrten das Gen mit Resistenz gegenüber Kanamycin zum leichteren späteren Klonieren auf, insbesondere, um zusätzliches Durchsieben während des endfgültigen Klonierens verfügbar zu haben (Verlust von Km^R).
BEISPIEL 3:
Die Validierung des Plasmid-Vektors für Anwendungen in der Gentherapie durch Transfektion von Mäuse-Fibroblasten
1) Konstruktion des Reporter-Vektors pXL2774
Um die Gültigkeit zur Gentherapie des Systems zur Produktion von Plasmid-DNA zu testen, fügten wir ein Reporter-Gen, das in eukaryoten Zellen benutzt werden kann, in pXL2760 ein. Wir benutzten das Gen luc, das für Photinus pyralis Luciferase kodiert, da der Test zur Messung der Biolumineszenz sehr empfindlich ist und über einen breiten Bereich linear ist, und wobei das Hintergrundgeräusch aufgrund der endogenen Aktivität eukaryoter Zellen sehr niedrig ist. Das Gen luc wird durch Promoter-Enhancer-Sequenzen eines frühen Gens (CMV-Promoter) kontrolliert, was einen hohen Grad an Expression ermöglicht. In 3' von luc befindet sich eine nicht translatierte Region, die aus dem Virus SV40 stammt, welcher das Polyadenylationssignal enthalt (poly(A)+). Nach umgehenen Klonen, was die Erhöhung der Anzahl an verfügbaren Restriktionsstelen ermöglicht, wird die „Promoter CMV-luc-poly(A)+" Kassette in den minimalen Vektor ori γ-cer-sup Phe (pXL2760) anstelle des Km^R Markers eingefügt. Das resultierende Plasmid wurde pXL2774 genannt. 6 vereinigt die diversen Klonschritte. Die Ligaturgemische wurden mittels Elekroporation in XAC-1pir-116 umgewandelt. Die Inkubtion, die ermöglicht, dass die Bakterien die Selektionsmarker exprimieren, wird in reichem Medium (SOC-Medium) durchgeführt; es war somit nötig, die Zellen zweimal mit M9 Medium zu waschen, bevor sie ausgebreitet wurden. Dies ermöglichte das Entfernen des restlichen Mediums, das auf minimalem Medium in Zucht-Hintergrundgeräusch resultiert hätte.
Das Medium, das gewählt wurde, um die elektroporierten Zellen auszubreiten, ist das minimale M9 Medium, welches die Selektion von Bakterien ermöglicht, die ein Suppressor tRNA exprimieren, und somit der Anwesenheit unserer Plasmide. Die Zugabe von X-Gal ermöglicht, mithilfe der blauen Verfärbung, die Expression des tRNA Suppressors zu visualisieren. Die Schalen werden nach ungefähr 20 Stunden bei 37 °C analysiert. Die Abwesenheit von Kolonien auf der DNA freien Kontrolle beteuert die Richtigkeit der Selektion, selbst bei dichter Animpfung. Alle mittels Restriktion (8) untersuchten Klone tragen tatsächlich ein Plasmid, das dem erwarteten Profil entspricht. Das so konstruierte Plasmid, pXL2774, wurde aus einem Klon hergestellt, der mittels einer Technik, die unter anderem einen Ionenaustausch (Promega kit, MegaPreps) bedingt, in einem Liter flüssigen M9 Medium (ungefähr 18 Stunden bei 37 °C) gezüchtet wurde. Die Menge an gesammelter DNA liegt bei 2 mg.
2) Analyse des Reporter-Vektors pXL2774, der in Säugetierzellen transfiziert wurde
Die Fähigkeit von pXL2774, eukaryote Zellen zu transfizieren und die Expression von Luciferase zu ermöglichen, wird mittels Transfektion in NIH 3T3 Maus-Fibroblasten evaluiert. Der als Referenz gewählte Vektor ist das Plasmid pXL2622 (dabei handelt es sich um das Plasmid pGL2 von Promega, dessen Promoter SV40 durch den Promoter CMV ersetzt wurde), das dieselbe Luciferase-Expressionskassete trägt wie pXL2774, aber auf einem anderen Replikon. Dies ist ein ColE1 Derivat von 6,2 kpb, welches das Gen mit der Resistenz gegenüber dem Apicillin trägt. Dieses Plasmid dient als Kontrolle. Die Luciferaseaktivitäten (die als RLU oder relative Lumineszenzeinheiten bezeichnet werden) sind in Tabelle 3 angegeben.
Die besten Ergebnisse wurden mit einer „Lipofektant-Ladungen/DNA-Ladungen" Verhältnis von 6 erhalten; unter diesen Bedingungen scheinen pXL2622 und 2774 gleichwertig zu sein.
TABELLE 3
BEISPIEL 4:
Die Verifizierung des Charakters des Suizidvektors in E.coli der pCOR Plasmide
Der nicht replizierende Charakter der Plasmide der pCOR Art, die aus R6K abgeleitet sind, wurde mittels eines Elektroporationsexperiments in E.coli JM109 (Yanisch-Perron et al., 1985) der Plasmide pUC4K (ori ColE1-KmR, (Vieira und Messing, 1982)) und pXL2730 (ori gamma von R6K-KmR, siehe Beispiel 2) verifiziert. Der Elektroporator, der benutzt wurde, ist der Biorad Gene Pulser und die elektrokompetenten JM109 Zellen werden gemäß dem Herstellerprotokoll (Bacterial electrotransformation and pulse controller instruction manual. catalog number 165-2098) hergestellt und benutzt.
Die elektrotransformierten Zellen wurden auf LB-Medium, das mit Kanamycin (50 mg/l) supplementiert ist, ausgebreitet und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend dargestellt.
Ergebnisse:
Diese Ergebnisse zeigen, dass es ein Minimum von 5 log Unterschied zwischen der Transformationswirksamkeit eines ColE1 Derivats (pUC4K) und der eines R6K Derivats (pXL2730) in einem Stamm gibt, der nicht das pir Gen exprimiert. In einem pir+ Stamm, wie etwa XAC-1pir-116, erreicht die Elektrotransformations-Wirksamkeit der von R6K abgeleiteten Plasmide herkömmlich die 108 Transformanten/pro μg Plasmid oder ubertrifft dies.
BEISPIEL 5:
Die Produktion des DNA-Plasmids durch Zucht mit hoher Dichte des E.coli Stamms XAC-1pir-116 (pXL2774): Fermentationsverfahren.
5.1. Stämme: Produktion in E.coli XAC-1pir-116 (Beispiel 1), eines minimalen Plasmids, pXL2774; dieses Plasmid umfasst die folgenden Elemente: ori R6K-cer-tRNAamsupPhe und eine Expressionskassette des luc Reporter-Gens unter der Kontrolle des CMV-Promoters (Beispiel 3). Ein Verfahren mit hoher Produktivität für die Produktion von Plasmiden dieser Art wurde entwickelt.
5.2. Zuchtmedien und -bedingungen:
a) Wachstumsmedium:

– Zusammensetzung des definierten Mediums, das für die Inoculumzuchten (g/l) benutzt wird: Na₂HPO₄ 6, KH₂PO₄ 3, NaCl 0,5, NH₄Cl 1, NH₄H₂PO₄ 3, Glukose 5, MgSO₄·7H₂O 0,24, CaCl₂·2H₂O 0,015, Thiamin HCl 0,010
– Zusammensetzung des komplexen Mediums, das für die fed-batch Zuchten (g/l) benutzt wird: KH₂PO₄ 8, K₂HPO₄ 6,3, Na₂HPO₄ 1,7, (NH₄)₂SO₄ 0,74, NH₄Cl 0,12, Hefeextrakt 3, Glukose 2, MgSO₄·7H₂O 2,4 g/l, CaCl₂·2H₂O 0,015, Thiamin 0,010, Salzlösung (Fe, Mn, Co, Zn, Mo, Cu, B, Al).
– Zusammensetzung des Mediums, das für die Zuchten im fed-batch Medium definiert wurde, das identisch mit dem komplexen Medium ist, aber das Hefeextrakt durch 2,5 g/l NH₄Cl ersetzt ist.

b) Bedingungen der fed-batch Zucht:
Studien in 2-Liter-Fermentern (Setric France), die 11 von Medium enthalten, wurden durchgeführt, um die optimalen Bedingungen zum Züchten und Produzieren von DNA-Plasmid zu definieren. Der Fermenter wurde mit 80 ml einer Inoculum-Zucht angeimpft, die am Anfang einer stationären Wachstumsphase angekommen ist.
Während der Fermentation wurde der pH-Wert automatisch zwischen 6,9 und 7,0 mit 10 % (w/v) wässrigem Ammoniak kontrolliert und eingestellt; die Temperatur wird bei 37 °C beibehalten; die Belüftung wurde auf 75 l/h (1,1 vvm) bei einem Druck von 0,2 bar festgesetzt und der aufgelöste Sauerstoff wurde auf 40 % der Luftsättigung durch Rückwirkung auf die Rührgeschwindigkeit eingestellt und, falls notwendig, durch Anreicherung mit reinem Sauerstoff.
Alle Parameter (pH-Wert, Temperatur, Rühren, OD, O₂ und CO₂ in den ausströmenden Gasen) wurden gesammelt und in Reihe über eine HP3852 Schnittstellt, die mit einem Hewlett-Packard 9000 verbunden ist, berechnet.
Die Basiszusammensetzung des Versorgungsmediums ist wie folgt: Kohlenstoffquelle 50 %, Magnesiumsulfat 0,7 %, Thiamin 0,02 %; für das komplexe Medium wurde Hefeextrakt bis zu einer Konzentration von vorzugsweise zwischen 5 und 10 % zugegeben.
Um die Zuchtbedingungen an 800-Liter-Fermenter anzupassen, wurden auf Laborebene Produktionssequenzen, die zwei aufeinanderfolgende Inoculumzuchten umfassen, durchgeführt: Inoculum I in einem agitierten Erlenmeyerkolben und Inoculum II in einem 2-Liter-Fermenter (Batch-Zuchten), gefolgt von einer fed-batch Produktionszucht, im 7-Liter-Fermenter.
5.3. Ergebnisse
Verschiedene Zuchtbedingungen wurden im komplexen Medium, im definierten Medium und bei unterschiedlichen Wachstumsraten studiert. In allen Fällen wurde nach dem anfänglichen Batch-Züchten des Bakterien-Stamms und der Konsumption der Kohlenstoffquelle das Versorgungsmedium dem Fermenter mittels einer Peristaltik-Pumpe, die mit einem vorprogrammierten Zugabeprofil gekoppelt ist, zugegeben. Dieses Profil wurde von vorhergehenden Experimenten abgeleitet, in denen die Versorgungsrate entweder durch den Grad an aufgelöstem Sauerstoff oder durch eine konstante Wachstumsrate kontrolliert wurde.
Ferner wurde, um die 2-Liter-Fermentationsbedingung ohne Schwierigkeit auf einen 800-Liter-Fermenter zu extrapolieren, ohne das Medium mit zuviel Sauerstoff anzureichern, die maximale Sauerstoffnachfrage am Ende des Züchtens auf 2,5–3 mM/Min. festgesetzt. Dazu wurde die Wachstumsrate des Mikroorganismus reduziert, wenn erforderlich, indem die Versorgungsrate der ergänzenden Ladung variiert wurde. Wie aus Tabelle 4 ersichtlich, wurden sehr gute Ergebnisse erzielt, sowohl im komplexen Medium als auch im definierten Medium, sowohl auf Laborebene als auch auf der 800-Liter-Fermenter Ebene; ferner sind das Plasmid-DNA-Wachstum und die Produktionskinetik vollständig vergleichbar (vgl. 6 und 7).
TABELLE 4
Aus den Gesamtergebnissen resultiert, dass:

– die Änderung der Fermenterebene von 2 Litern auf 800 Liter ohne jegliche Probleme durchgeführt werden kann,
– der konsumierte Sauerstoff stark mit der produzierten Biomasse korreliert (1,08 g O₂/g produzierter Biomasse),
– das Plasmid während zumindest 50 Generationen ohne Selektionsdruck stabil ist,
– eine Biomasse von mehr als 40 g trockener Zellen/Liter in komplexem Medium erhalten werden kann,
– die Plasmid-DNA-Produktion 100 mg mehrfach gewundener DNA/l Medium erreicht,
– eine sehr gute Korrelation zwischen der DNA-Produktion und der Biomasse besteht: Die Produktion kann auf 1 mg Plasmid-DNA/DO-Einheit oder 2,7 mg Plasmid-DNA/g Biomasse geschätzt werden, und das unabhängig von der Dauer der Fermentation,
– die Benutzung eines definierten Mediums auch die Erreichung einer hohen Biomasse (30 g trockener Zellen/l) und einer hohen Plasmid-DNA-Produktion (100 mg/l) ermöglicht, ohne dass ein Verlust an Produktivität vorkommt.

BEISPIEL 6:
Transfer von pXL2774 in tierische Zellen, in vitro und in vivo.
6.1. In-vitro-Transfer von pXL2774 in tierische Zellen
Die Kapazität des minimalen Plasmids pXL2774 verschiedene Zelllinien zu transfizieren wurde in vitro getestet, und zwar auf Zellen menschlichen Ursprungs wie murinen Ursprungs. Das Plasmid pXL2784 wurde als Kontrolle benutzt. Es enthält dieselbe eukaryote Expressionskassette (CMV-Promoter-Luciferase-polyA) wie pXL2774, jedoch ist dies das ColE1 Derivat von 6,4kb, das das Gen zur Verleihung von Resistenz gegenüber Kanamycin in E.coli umfasst.
Die getesteten Zellen sind wie folgt:
Die Transfektionsbedingungen waren wie folgt:

J-1: Animpfen der Zellen bei einer Dichte von 100000 Zellen pro 2 cm² Well (24-Well-Platte) im DMEM-Medium (Dulbecco's modified Eagle Medium), das mit 10 fötalem Kalbsserum (FKS) supplementiert ist.
J-3: Transfektion der Zellen um 10 μl einer Transfektionslösung, die enthalt: 0,5 μg DNA, 150 mM NaCl, 5 % Glukose und 3 nmol Lipofektant RPR120 535 pro μg DNA, in 250 μl Zuchtmedium, das mit 10 % FKS supplementiert ist. Nach einer Inkubation von 2 Stunden wird das Medium durch 500 μl DMEM-Medium, das mit 10 FKS supplementiert ist, ersetzt.
J-4: Erneuerung des Zuchtmediums
J-5: Waschen der Zellen mit PBS, gefolgt von einer Lyse mit 100 μl Promega-Lyse-Puffer (Promega Cell Lysis Buffer E153A). Der Assay der Luciferase-Aktivität wird in einem Lumat LB 9501 Luminometer (Berthold) auf 10 μl Lysat mit einer Integrationsdauer von 10 Sekunden durchgefuhrt. Der Reaktant, der benutzt wird, ist der von Promega (Promega Luciferase Assay Substrate). Die Ergebnisse, die in den nachfolgenden Tabellen zusammengefasst sind, sind in RLU (Relative Lights Unit) für 10 μl Lysat (Messdurchschnitt auf 4 Wells) ausgedrückt. Die Variationskoeffizienten (VK) sind ebenfalls angegeben.

Die Ergebnisse der Transfektionen in Abwesenheit des Serums sind nachfolgend dargestellt.
Die Ergebnisse der Transfektionen in Anwesenheit des Serums (10 %) sind nachfolgend dargestellt.
Diese Ergebnisse enthüllen die Kapazität von pXL2774 unterschiedliche Zelltypen von Mäusen und Menschen wirksam in vitro zu transfizieren. Die Expression des luc Reportergens ermöglicht das Aufzeigen, dass seine Transfektionswirksamkeit mindestens so gut ist wie diejenige des „herkömmlichen" Plasmids, das von ColE1 abgeleitet ist, das dieselbe Luciferase-Expressionskassette trägt.
6.2. In-vivo-Transfer, im Tier (Maus), von pXL2774
a) Modell 1: Nackte DNA im Maus-Schädel-Tibia-Muskel
Die nackte Plasmid-DNA, die in „5 % Glukose, 150 mM NaCl" aufgelöst ist, wird in den Schädel-Tibia-Muskel von OF1-Mäusen eingespritzt. 7 Tage nach der Injektion werden die Muskeln entfernt, zerschnitten, in 750 μl Lysepuffer (Cell Lysis Buffer Promega E153A) homogensiert und dann 10 Minuten lang bei 20000 g zentrifugiert.
Der Assay der Luciferase-Aktivität wird auf 10 μl Überstand nach der Zugabe von 50 μl Reaktant (Promega Luciferase Assay Substrate) durchgeführt. Das Ablesen geschieht auf einem Lumat LB9501 Luminometer (Berthold) mit einer Integrationsdauer von 10 Sekunden.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass ein bedingtes Replikationsplasmid wie etwa pXL2774 tatsächlich dazu imstande ist Maus-Muskelzellen in vivo zu transfizieren und dies mit vergleichbarer oder sogar besserer Wirksamkeit als ein „herkömmliches" Plasmid, das von ColE1 abgeleitet ist, welches dieselbe Luciferasegen-Expressionskassette trägt.
b) Modell 2: 3T3 HER2 Tumor-Modell
Das Modell ist wie folgt:

– Weibliche erwachsene Schweizer-/nackte Maus
– Versuchstumore, die nach der Einspritzung von 107 3T3 HER2 Zellen subkutan in die Seite induziert wurden.
– Das Transfektionsgemisch wird 7 Tage nach der Einspritzung der Zellen eingespritzt

Eingespritzte Lösungen: Zunächst wird die DNA im Puffer aufgelöst. Nach der Zugabe aller Produkte enthält das Gemisch, nebst der DNA, NaCl (150 mM) und 5 D-Glukose in Wasser oder 5 mM HEPES-Puffer.

– Zwei Tage nach der Einspritzung wird das Tumorgewebe entfernt, gewogen und dann zerschnitten und in 750 μl Lysepuffer (Promega Cell Lysis Buffer E153 A) homogenisiert. Nach der Zentrifugierung (20000 g während 10 Minuten), werden 10 μl Überstand entfernt, was das Evaluieren der Luciferase-Aktivität ermöglicht. Diese Aktivität wird durch das Messen der gesamten Lichtemission bestimmt, die erhalten wird, nachdem sie mit 50 μl Reaktant (Promega Luciferase Assay Substrate) in einem Lumat LB 9501 Luminometer (Berthold) mit einer Integrationsdauer von 10 Sekunden gemischt wird.

Die resultierende Aktivität wird in RLU (Relative Lights Units) ausgedrückt, die in dem gesamten Überstand der Tumorlyse geschätzt wird.
Ergebnisse:
Diese Ergebnisse zeigen, dass ein bedingtes Replikationsplasmid wie etwa pXL2774 tatsächlich dazu imstande ist Maus-Tumorzellen in vivo zu transfizieren und dies mit mindestens vergleichbarer Wirksamkeit als ein „herkömmliches" Plasmid, das von ColE1 abgeleitet ist, welches dieselbe Luciferasegen-Expressionskassette trägt.
Diese verschiedenen Experimente ermöglichten die Veranschaulichung, dass das bedingte Replikationsplasmid, und genauer pXL2774, tatsächlich Tierzellen-Transfektionscharakteristiken aufwiesen, die zur Benutzung in der Gentherapie unerlässlich sind. Genauer wurde folgendes gezeigt:

1) Die Kapazität von pXL2774 wirksam in vitro unterschiedliche Zelltypen von Mensch- oder Mausursprung zu transfizieren;
2) Die Kapazität von pXL2774 in vivo Maus-Muskel zu transfizieren;
3) Die Kapazität von pXL2774 in vivo in Mäuse implantierte Tumorzellen zu transfizieren

Die Elektrotransformations-, Fermentations- und Transfektions-Experimente ermöglichten das Validieren bedingter Replikations-Plasmide als Vektoren, die in der Gentherapie benutzt werden können, wobei gezeigt wird, dass

i) sie sich nicht erfassbar in einem E.coli Stamm replizierten, der das pir Gen nicht exprimiert (bedingter Replikationsursprung)
ii) sie auf einer Ebene produziert werden könnten, die mit der industriellen Produktion vergleichbar ist, und in einem Medium, das vollkommen definiert werden kann und das keine Antibiotika enthält;
iii) diese Plasmide in vitro und insbesondere in vivo Säugetierzellen transfizieren könnten.

BEISPIEL 7:
In-vitro-Produktion rekombinanter Proteine
7.1. Konstruktion des Expressionsvektors
Um die Machbarkeit eines derartigen Ansatzes aufzuzeigen, konstruierten wir einen Expressionsvektor nach den oben beschriebenen Kriterien (Beispiele 2 und 3). Dieser Vektor, pXL3056, enthält:

1) den bakteriellen Teil, der den bedingten Replikationsursprung (ori gamma), das cer Fragment von ColE1 und das Gen, das die Selektion in der Bakterie gewährleistet (sup), umfasst
2) die Expressionskassette, basierend auf dem von Studier beschriebenen System (Studier et al., 1990), umfasst den Promoter von Gen 10 des Bakteriophagen T7, den lacO Operator, das Gen, das für aFGF 154 (acidic Fibroblast Growth factor oder Fibroblast-Säurewachstumsfaktor, 154 Aminosäuren enthaltende Form) (Jaye et al., 1986) kodiert, den Terminator TF des Bakteriophagen T7. Diese Expressionskassette ist mit derjenigen identisch, die auf dem pXL2434 Plasmid vorhanden ist, welches in der Anmeldung WO96/08572 beschrieben ist.

Die Konstruktion von pXL3056 ist in 8 dargestellt. Das EcoRI-BglII Fragment von pXL2434 (1,1 kb), das die Expressionskassette von aFGF enthält, ist im bedingten Replikationsvektor pXL2979 (1,1 kb gereinigtes Fragment) an den Stellen BglII und EcoRI geklont, um pXL3056 zu erzeugen.
pXL2979 resultiert aus der Ligatur von 3 Fragmenten: i) AccI-XbaI Fragment von pXL2730 (0,8 kb, das ori gamma und cer bereitstellt) ii) NarI-SalI Fragment von pXL2755 (0,18 kb, das das sup Phe gen bereitstellt) iii) SalI-SpeI Fragment von pXL2660 (1,5 kb, das das Gen mit Resistenz gegenüber Kanamycin bereitstellt).
pXL2660 resultiert aus der Klonierung des PstI Fragments von 1,2 kb von pUC4K (Vieira und Messing, 1982) in pMTL22 (Chambers et al., 1988), mit PstI linearisiert.
7.2. Erhalten des Expressionsstamms
Das Plasmid pXL3056 wird durch Transformation in den Stamm XAC-1pir-116 eingefügt. Der resultierende Stamm wird dann durch das Plasmid PT7pol23 (Mertens et al., 1995) bei 30 °C umgewandelt. Damit das Gen von Bedeutung unter Kontrolle des Promoters T7 exprimiert werden kann, muss die Bakterie in ihrem Genom auf einem Plasmid oder Bakteriophagen eine Kassette enthalten, die die Expression der RNA-Polymerase des Bakteriophagen T7 ermöglicht. In dem beschriebenen Beispiel benutzten wird das Plasmid PT7pol23, das mit R6K Derivaten wie etwa pXL3056 kompatibel ist, und das die temperaturinduzierte Expression der Bakteriophag T7 Polymerase ermöglicht. Man kann sich aber auch vorstellen, den Stamm XAC-1pir-116 mit lambda DE3 zu lysogenisieren (Studier et al., 1990), um nur ein Plasmid zu konservieren und die Produktion von T7 RNA Polymerase durch IPTG anstatt durch Temperatur zu induzieren.
7.3. Expression von aFGF
Der Stamm XAC-1pir-116 (pXL3056 + PT7pol23) wird bei 30 °C, in minimalem Medium M9, das mit 0,2 Casaminosäuren (DIFCO) und Kanamycin (25 μg/ml) supplementiert ist, bis zu einer optischen Dichte von 600 nm von 0,6–1 kultiviert. Die Hälfte der Zucht wird dann in 42 °C gegeben (Induktion der RNA Polymerase von T7), während die andere Hälfte bei 30 °C bleibt (negative Kontrolle). Dasselbe Experiment wird mit dem Stamm XAC-1pir-116 (pXL3056 + pUC4K) durchgeführt, der eine Kontrolle für die Expression von aFGF in Abwesenheit der RNA Polymerase von T7 ausmacht.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 9 dargestellt. Sie zeigen, dass die Produktion von aFGF vergleichbar oder besser ist als jene, die mit BL21(DE3)(pXL2434) (WO96/08572) beobachtet wurde, was deutlich das Potential bedingter Replikations-Plasmide für die Expression rekombinanter Proteine in vitro, insbesondere bei E.coli, aufzeigt.
BEISPIEL 8:
Konstruktion eines pCOR Vektors, der ein wildes oder hybrides Protein p53 exprimiert.
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von bedingten Replikationsvektoren nach der Erfindung, die eine Nukleinsäure enthalten, welche für ein p53 Protein kodiert. Diese Vektoren können benutzt werden, um in fehlerhaften (mutierten, deletierten) Zellen, wie etwa insbesondere Tumorzellen, wieder eine Aktivität der Art p53 herzustellen.
Die eukaryote Expressionskassette enthält die folgenden Elemente:

1) den „Immediate-Early-", umgehend frühen, CMV Promoter (Positionen –522 bis +72), gefolgt von der Leitsequenz des Thymidinkinase-Gens des Herpes simplex Virus Typ I (Position –60 bis +1 des Gens, unter Bezugnahme auf die Sequenz im Artikel McKnight, S. t L. (1980) Nucleic Acids Res. 8: 5949–5964);
2) eine Nukleinsäure, die für das wilde Protein p53 oder für eine Variante von p53 kodiert, wie in der Anmeldung PCT/FR96/01111 (Variante V325K = V325 mit einer Kozaksequenz mit ATG) beschrieben;
3) die Polyadenylierungssequenz polyA von SV40.

Diese Elemente wurden in Form eines Fragments AscI-XbaI auf den Vektoren pCOR pXL2988 zwischen die Stellen BssHII und SpeI gegeben. pXL2988 ist mit pXL2979 identisch (Beispiel 7.1.) mit Ausnahme der Anwesenheit eines zusätzlichen Elements, einer Sequenz, die eine Dreifach-DNA-Helix formen kann, welche aus 17 mal dem Trinukleotid GAA zusammengesetzt ist, die neben den gamma Replikationsursprung gesetzt wird.
Die resultierenden Plasmide sind als pXL3029 und 3030 bezeichnet (10).
Die Funktionalität dieser Konstruktionen wurde in vitro auf den Zellen p53-SAOS2 in Zucht durch das Messen der Transkriptions-Aktivator-Aktivität von p53 oder p53superWT verifiziert.
LITERATURANGABEN

Alting-Mees, M. A., J. A. Sorge, und J. M. Short. 1992. Methods Enzymol. 216: 483–495.
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LISTE DER SEQUENZEN

Claims

Rund geformtes DNA-Molekül, das in der Gentherapie nützlich ist und zumindest eine Nukleinsequenz von Bedeutung umfasst, und auch die Signale zur Regulierung seiner Expression mit einer Promoterregion für die funktionelle Transkription in der Zelle oder dem Zielorganismus umfasst, sowie eine Region in 3', die ein Signal für das Ende der Transkription und eine Polyadenylations site spezifiziert, dadurch gekennzeichnet, dass: a. die Region, die seine Replikation ermöglicht, einen bedingten Replikationsursprung umfasst, der aus einem Plasmid oder einem Bakteriophage stammt, dessen Funktionalität in einer Prokaryotenwirtszelle das Vorhandensein von zumindest einem spezifischen initiierenden Replikationsprotein besagten Plasmids oder der Baktiophage erfordert, das besagter Prokaryotenwirtszelle fremd ist. b. Besagtes DNA-Molekül umfasst nicht besagtes initiierendes Replikationsprotein. c. Besagtes DNA-Molekül umfasst einen Selektionsmarker, und d. besagtes DNA-Molekül repliziert nur in Zellen, die besagtes initiierendes Protein ergänzen konnen.
DNA-Molekül nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass besagter bedingter Replikationsursprung von einem Plasmid oder einem Bakteriophagen stammt, der einen Replikationsursprung besitzt, der durch mehrere Iterons vertreten wird, und der für zumindest ein spezifisches Protein kodiert, und die Funktionalität seines Replikationsursprungs bedingt.
DNA-Molekül nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der bedingte Replikationsursprung von den folgenden Plasmiden oder Bakteriophagen stammen kann: RK2, R6K, R1, pSC101, Rtsl, F, RSF1010, P1, P4, Lambda, Phi82 und Phi80.
DNA-Molekül nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass besagter Replikationsursprung vom Bakterienplasmid R6K stammt.
DNA-Molekül nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass besagter Replikationsursprung ganz oder teilweise aus dem Replikationsursprung γ von Plasmid R6K besteht.
DNA-Molekül nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein π, das von Gen pir (SEQ ID Nr. 2) produziert wird, welches in das Genom der Wirtszellen eingefügt wurde, die Replikation des DNA-Moleküls in besagter Wirtszelle ermöglicht.
DNA-Molekül nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sich das in der Wirtszelle exprimierte Protein π aus der Expression eines Derivats von Gen pir ergibt, und insbesondere von Gen pir116.
DNA-Molekül nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Selektionsmarker aus einem Gen ausgewählt werden kann, dass eine Resistenz gegen ein Antibiotikum verleihen kann, und einem Gen, dessen Produkt unverzichtbar für die Lebensfähigkeit des geplanten Wirts unter ganz bestimmten Zuchtbedingungen ist.
DNA-Molekül nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, das ferner eine Sequenz umfasst, die in der Lage ist, spezifisch mit einem Bindungspartner in Wechselwirkung zu treten.
DNA-Molekül nach Patentanspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die spezifisch mit einem Bindungspartner zusammenwirken kann, eine Sequenz ist, die mit einem spezifischen Oligonukleotid durch Kreuzung eine Dreifachhelix bilden kann.
DNA-Molekül nach Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz an jeder site des DNA-Moleküls positioniert werden kann, sofern sie nicht die Funktionalität des Gens von Bedeutung und den Replikationsursprung beeinträchtigt.
DNA-Molekül nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um das Plasmid pxL2774 und seine Derivate handelt, wobei besagtes Plasmid pxL2774 eine Kassette "Promotor CMV-lucpoly(A)+" umfasst, die in den Minimalvektor oriγ-cer-sup Phe eingefügt wird.
Verfahren zur Produktion eines rund geformten DNA-Moleküls nach einem der Patentansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, das man eine Wirtszelle züchtet mit zumindest: a. einem DNA-Molekül nach einem der Patentansprüche 1 bis 12, das einen Replikationsursprung umfasst, dessen Funktionalität in der Wirtszelle das Vorhandensein von zumindest einem initiierenden spezifischen Replikationsprotein umfasst, das der besagten Wirtszelle fremd ist, und b. besagtem Protein, das in situ oder nicht exprimiert wird und die Funktionalität besagten spezifischen und besagter Wirtszelle fremden Replikationsursprungs bedingt, unter Bedingungen, die die Auswahl von Wirtszellen ermöglichten, die von besagten DNA-Molekülen umgewandelt wurden.
Verfahren nach Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das für die Replikation initiierende Protein kodierende Gen auf einem beigefügten Replikon vorhanden ist oder in das Genom besagter Zelle eingefügt wurde.
Verfahren nach Patentanspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein DNA-Molekül handelt, das einen Replikationsursprung gemäß der Definition in den Patentansprüchen 4 und 5 umfasst, und dadurch, dass besagtes Protein das Protein π des Plasmids R6K ist oder sich von diesem Protein durch Änderung seiner kodierenden Sequenz unterscheidet oder ein Fragment dieses Proteins bildet, dabei jedoch die gleiche Aktivität hat.
Verfahren nach Patentanspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass Protein π oder eines seiner Derivate in situ von dem Gen pir exprimiert wird, das in SEQ ID Nr. 2 oder in einer Sequenz, die sich von SEQ ID Nr. 2 wegen einer Degeneration des genetischen Codes unterscheidet, oder in einer Sequenz, die sich mit diesen Sequenzen oder Fragmenten derselben, falls vorhanden, in der Wirtszelle kreuzt, vertreten ist, und deren Produkt die Aktivität des spezifischen, die Replikation initiierenden Proteins hat.
Verfahren nach Patentanspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ausgehend von Gen pir 116, das in das Genom besagter Zelle eingefügt ist, exprimiert wird.
Verfahren nach einem der Patentansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass eines der Gene der Wirtszelle, die unter den ausgewählten Zuchtbedingungen unverzichtbar sind, ein spezifischen Kodon enthält, das im DNA-Molekül von dem ausgewählten ARNt-Suppressor erkennbar ist.
Verfahren nach Patentanspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass dieses Gen einen Amber-Kodon TAG enthält.
Verfahren nach einem der Patentansprüche 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle aus den E.coli-Stämmen ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Patentansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle aus dem Stamm E.coli XAC 1 stammt.
Verfahren nach einem der Patentansprüche 13 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass darin der Stamm E.coli XAC 1 eingesetzt wurde, der in seinem Genom das Gen pir 116 enthält.
Rekombinante Zelle, die von zumindest einem DNA-Molekül nach einem der Patentansprüche 1 bis 12 umgewandelt wurde.
Rekombinante Zelle nach Patentanspruch 23 vom Typ eukaryotische oder prokaryotische Zelle.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eines oder mehrere DNA-Moleküle nach einem der Patentansprüche 1 bis 12 umfasst.
DNA-Molekül nach einem der Patentansprüche 1 bis 12 als Medikament.
Benutzung eins DNA-Moleküls nach einem der Patentansprüche 1 bis 12 für die Herstellung eines Medikaments für die in vivo-Produktion von rekombinanten Proteinen.
Molekül nach Patentanspruch 26 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prävention zahlreicher Pathologien, einschließlich genetischer Krankheiten (Dystrophie, cytische Fibrose usw.), neurodegenerativer Krankheiten (Alzheimer, Parkinson, ALS usw.), Krebsarten, Pathologien im Zusammenhang mit Störungen der Koagulation oder mit Dyslipoproteinämien, Krankheiten im Zusammenhang mit Infektionen (Hepatitis, AIDS).