TWI231826B - Process for the production of circular DNA molecule having a conditional origin of replication - Google Patents

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1231826 A7 B7 五、發明説明（1 ) 本發明係關於可用在基因療法中、新穎的條件複製之 DNA分子。 基因療法包括藉著將基因訊息導入受到影響的器官或細 胞内，來矯正缺陷或異常。可將該訊息在活體外導入從器 官中萃取出的細胞内，然後再注射到身體内，或是在活體 内直接導入目標組織中。就像具有高分子量和負電荷的分 子一樣，D N A在自然越過磷脂細胞膜方面有困難。因此為 了使基因轉移能夠發生，利用各種載體：一方面是病毒載 體，以及另一方面的天然或合成的化學及/或生化載體。 病毒載體（逆轉錄病毒、腺病毒、與腺有關的病毒等等） 是非常有效的，特別是越過細胞膜，但是出現一些危險， 如病原性、重組、複製、免疫原性等等。 化學及/或生化的載體容許避開這些危險(為了再回顧， 參見 Behr，1993，Cotten and Wagner 1993 )。例如藉著與 DNA形成沉澱物而產生作用的陽離子（磷酸鈣，DEAE -葡 聚糖等等），它們可以被細胞呑噬。它們也可以是其中合併 有DNA並與漿膜融合的微脂粒。合成的基因-轉移載體通 常是脂質類或陽離子性之聚合物，其與D N A複合並與之一 起形成帶有正表面電荷的顆粒。關於這類型載體的說明， 特別提及二十八烷基醯胺基甘胺醯基精胺（DOGS， TransfectamT M)，或 N-[l-(2,3 -油醯氧基）丙基]-N，N，N-三甲銨（DOTMA，LipofectinTM)。 然而化學及/或生化載體和裸露D N A的使用，需要產製 大量具有藥理學純度的D N A。這是因為在基因療法的技術 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1231826 A7 B7

五、發明説明（2 L醫藥產物由DNA本身所構成，且其必需能夠以適當的 I來製造具有適合人類治療用途之特性的DNA。 、 在非-病毒之載體學的案例中，所使用的載體為細菌來源 的質體。通常使用於基因療法中的質體帶有⑴_個複製起 點，（11) 一個標記基因，諸如對抗生素（康黴素、胺苄 素等等）有抗藥性的基因’和（111)„或多個帶有對於它們 表現所必需之序列的導人基因（例如促進基因、啟動基 聚腺答酸化作用之序列）。 然而，目前可獲得的技術並不是完全令人滿意的。 一方面仍然有在體内散播的危險。因此，體内所存在的 細菌可能以低頻率接受該質體。如果涉及在活體内的基因 治療，其中D N A可以被散播到患者的體内，並可能進入而 與感染該患者之細菌，或與共生菌落之細菌接觸，則有較 大發生此種情形的可能性。若接受質體的細菌是諸如大腸 桿菌（E. Coli)之類的腸細菌，則該質體可以被複製。然後 這樣的事件便導致治療基因的散播。只要使用在基因療法 中之治療基因能夠編碼，例如關於淋巴細胞活素，一種生 長因子，抗-致癌基因，或其在宿主中的功能是有缺陷的蛋 白貝，並因此使b可以矯正基因的缺陷，這些基因中某此 的散播可能具有不可能預見和令人煩惱的影響（例如，若病 原性細菌獲得人類生長基因子基因）。 另一方面，通常使用於非-病毒基因療法的質體，也具有 對抗生素（胺苄青黴素、康黴素等等）有抗藥性的標記。細 菌獲得了這類質體，而因此具有明顯的選擇優勢，因為任 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1231826 A7 B7 五、發明説明（3 何使用知自與選擇質體抗藥性基因相同族系之抗生素的抗 生素療法，將會導致選擇正在討論中之質體。就這一點而 口 氨下月黴素屬於冷-内醯胺類，它是全世界最常使用的 一族抗生素。因此在細菌選擇標記的使用中，不是抗生素_ 杬藥性基因的將會是特別有利的。這將能避免選出可能已 經接受帶有這類標記之質體的細菌。 因此寻找限制治療基因和抗藥性基因的散播是特別重要 的。 本發明t目的是獨特地提出可使用在基因療法中的新穎 的D N A分子，且其僅在細胞中複製，它能夠彌補這些非_ 病毒載體的某些功能。 本發明亦關於製備這些DNA分子的方法。 提出申請的DNA分子，具有移除與質體散播有關之危險 的優點，像是（1)可能導致無法控制之治療基因過度表現的 複製和散播，（2)抗藥性基因的散播和表現。在根據本發明 之D N A分子中所含有的基因訊息，有效率地包括治療基因 和調節其表現的信號，一個複製的功能條件起點，它大大 地限制了遠質體的宿主細胞範圍，一個縮小尺寸的選擇標 記’較佳的是它與傳達對抗生素之抗藥性的基因不同，= 是屬於容許質體多重體之分解作用的DNA片段。這虺分子 (因此還有它們所含有的基因訊息）被轉移到微生物中並保 持穩定的可能性是非常有限的。 最後’根據本發.明之載體也因為它們的環狀結構、它們 縮小的尺寸和它們的超螺旋形狀而被稱為迷你質體，具有 -6 - 本紙用巾國國家標準(CNS)八4規格(210 X 297公爱） ------ 1231826 A7 B7 五、發明説明（4 ) 下列的其他優點：與傳統使用的ColEl -衍生之質體相比 較，因為它們的尺寸被縮小，使得根據本發明之D N A分子 可能在活體内具有更佳的生物利用性。特定而言，它們具 有已經改良的細胞穿過和分布能力。因此，公認在組織中 的擴散系數與分子量成反比例（jain，1987)。同樣地在細胞 中’高分子量的分子通過漿膜具有較差的通透性。此外， 要使質體通過至細胞核中，這對於它的表現是必要的，高 刀子量也是不利的，核孔對於進入核中的擴散作用強加上 尺寸的限制（Landford等人，1986)。將根據本發明iDNA 分子的非-治療部份（特定是複製起點和選擇基因）縮小尺 寸，也能夠減少該D N A分子的大小。使容許該質體在細菌 中複製和選擇的部份（1 · ikb )減少3計數的因數，例如與複 製起點和抗藥性標記載體部份的3 kb。這樣減少了（i)分子 量和（1 1)負電荷，而提供經過改善的組織、細胞和細胞核 對本發明之分子的生物利用性和擴散作用。 更確切地說，本發明係關於可使用在基因療法上的環狀 DNA分子，該分子包括至少一個感興趣的核酸序列，其特 徵在於谷許它複製的區域包含了複製起點，它在宿主細胞 中的功能性需要在至少一個特定蛋白質的存在下，該蛋白 質對該宿主細胞而言是外來的。 該DNA分子可以是單-或雙_股的形式，且最好具有超螺 旋形式。 為了本發明之目的，所使用的宿主細胞可以是各種來源 的。L們可以是真核生物或原核生物細胞。根據本發明的 -7- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱) 1231826 A7 B7 五、發明説明（5 ) 較佳具體實施例，它們是原核生物細胞。 細菌質體的複製傳統上需要至少在一個蛋白質的存在 下，係由宿主細胞將其編碼成屬於，例如RN A聚合酶、 R N A酶、D N A聚合酶之類型。關於其理由已經在上文中 解釋過了，以此種複製形式不可能完全克服任何在被治療 生物中散播的可能危險。較佳的是，根據本發明之D N A分 子複製起點的功能性，需要在特定蛋白質的存在下，它對 宿主細胞而言是外來的。此項特徵的重要性在於將提出申 請之質體的宿主範圍減至表現該起始蛋白質的特定品系。 因此使得在本發明上下文中揭露的D N A分子更佳地具有所 謂的條件複製起點。 根據本發明所使用的條件複製起點，可從分享下列特徵 的質體或噬菌體開始：它們在其複製起點中含有重複序列 或反覆子（iterons )，且它們編碼至少一個對其專一的複製-起始蛋白質（Rep)。可藉著實例提及下列質體和噬菌體的 條件複製系統：

質體或噬菌體 特定的起始蛋白質 RK2 (Stalker等人，1981) TrfA R1 (Ryder 等人，1981) RepA pSClOl (Vocke和Bastia，1983) RepA F (Murotsu等人，1981) 蛋白質E . Rtsl(Itoh等人，1982，1987) RepA RSF1010(Miao 等人，1985) RepC -8- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1231826 A7 B7 五、發明説明（6 ) PI (Abeles等人，1984) RepA P4 (Flensburg和Calender，1987) Q蛋白質 λ (Moore等人，1981) 蛋白質0 phi 82 (Moore等人，1981) 來自phi 82的蛋白質0 phi 80 來自phi 80的蛋白質0 根據本發明較佳的具體實施例，在提出申請的DNA分子 中所使用的複製起點係衍生自天然的大腸样菌、叫做R 6 K 之質體。 R6K的複製功能一起聚集在5.5 kbp DNA片段中（圖1)， 包括3個複製起點α、沒和r ( r和/3供給9 0 %的複製）， 和一個編碼7Γ複製-起始蛋白質和蛋白質B i s的操縱子。在 其特有的副本號碼處（每個基因組1 5個副本），維持該質體 所需之最少量的基因訊息被包含在兩個要素中：400 bp之 ori τ和基因pir，它的產物為7Γ起始蛋白質。 ori 7*可以分成兩個功能部份··核心部份和活化劑要素 (圖1 )。複製所必需的核心部份，含有反覆子（22 bp的7個 直接重複段），對它而言，相當於序列識別1號7Γ蛋白質變 成已結合且位在側面的部份，其為宿主蛋白質的標靶 (IHF，DnaA)。 根據本發明較佳的方式，提出申請之載體的複製起點包 括質體116尺之7複製起點的全部或一部份，且較佳的是序 列識別1號的全部或一部份，或是其衍生物的其中之一。 就本發明之目的而言，衍生物一詞代表與考量到因為基 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X297公釐） 1231826 A7 B7 五、發明説明（7 因密碼簡併之故，藉著一或多種基因及/或化學性質的修 改而獲得之序列不同的任何序列，以及任何與這些序列或 其片段雜交的序列，且它們的產物具有指示有關於複製-起 始蛋白質7Γ的活性。可以明瞭基因和/或化學性質的修改 一詞，意指任何突變、取代、刪除、添加及/或一或多個 殘基的修改。衍生物一詞亦包括與所考量之序列具有同源 性的序列，衍生自其他細胞來源，特別是人類來源的細 胞或得自其他生物，並具有相同類型的活性。這類同源 的序列可藉著雜交實驗而獲得。可以從核酸庫開始，利用 天然的序列或其片段作為探針，在嚴格的傳統條件下 (ManlatlS 等人，參見General techniques 〇f bi〇 l〇gy)，或較佳的是在鬲度嚴格的條件下來完成雜交作用。 上述具有極度限制尺寸之優點的複製起點，僅在特定的 起始蛋白質，由基因pir(序列識別2號）產製之蛋白質？丨的 存在下才是具有功能的。因為該蛋白質能以反式作用，以 物理方式將ori r從pir基因中分離是有可能的，可將其導 入被選出來擔任這些質體之特定宿主的細胞之基因組中。 在江中的突變可改變其抑制功能（Inuzuka和Wada， 1985 )，並導致R6K衍生物副本數目的增加，高達副本原 始數目的1 〇倍以上。這些取代都在4 〇個胺基酸的功能部位 之内因此似乎成為受到質體副本數目中之冗控制的原因 (圖 2)。 ’、 疋根據本發明較佳的具體實施例，在宿主細胞中表現的兀 蛋白質，引起如上述之序列識別2號或其衍生物其中之— -10- 1231826 A7 -- -- B7 五、發明説明（8 ) 所代表之基因的表現，以及更特定而言，與pir基因相比較 時包含突變的基因pir 116。該突變相當於以亮胺酸來置換 脑胺酸。在上下文中，R6K衍生物的副本數目為每個基因 組約有250個副本。 除了上述的條件複製起點之外，提出申請之dna分子含 有包括一（或多）個基因的區域，而得以確保該dna分子: 已選定之宿主細胞中的選擇作用。 足可以是傳統的基因選擇標記，其提供對抗生素之抗藥 性，如康黴素、氨苄青黴素、氯黴素、鏈黴素、狀觀黴 素、黑杜黴素或其類似物。 然而，根據本發明的較佳具體實施例，該區域與提供對 杬生素之抗藥性之基因不同。因此它可以是某個基因，其 產物在限定的培養條件下，對於所面對宿主的存活是必要 的。例如它可以是： -編碼天然或合成來源之抑制子tRN A的基因。更佳的安 伯（amber)密碼子tRN A (TAG) -其產物在某些培養條件下為細胞新陳代謝所必需的基 因，那就是涉及新陳代謝產物（胺基酸、維生素等等）之 生物合成的基因，或是能夠同化培養基中所存在之物質 (特定的氮或碳源）的分解代謝基因等等。 根據本發明的較佳模式，該區域含有為了專一密碼子而 編碼抑制子t R N A的基因表現卡匣。可以選擇專一密碼 子’特別是從編碼苯丙胺酸、半胱胺酸、脯胺酸、丙胺酸 和組胺酸鹼基的那些之中選出。更特定而言，是安伯密碼 -11 - 本紙張尺度適用中_家標準(CNS) A4規格(削χ 297/涵~~ - 1231826 A7 B7 五、發明説明（9 子（T A G)的抑制子t R N A。 在這個特.殊的案例中，在宿主細胞中用來選擇屬於本發 明之主題的D N A分子的系統，包括兩個要素：丨）在該 D N A分子上，為了安伯密碼子（T A G )而編碼抑制子轉移 R N A的基因，構成選擇標記，已知如（s u p )基因，和2)特 足的宿主，它的基因中有一個在某些培養條件下是不可或 缺的’含有安伯T A G密碼子。該細胞可以在某種培養條件 下生長’對該培養條件而言，含有T A G密碼子之基因的產 物是不可或缺的，只要質體容許sup的表現出現在宿主細 胞中。因此培養條件構成了選擇1)1^八分子的壓力。所使用 的S Up基因可以是天然來源的（Glass等人，1982 )，或者也 了以由&成的構築體開始（Normanly等人，1986，Kleina等 人，1990)。 這木κ的系統提供了相當大的彈性，只要依據含有安伯突 <勺基因’決足各種選擇性介質是可能的。例如，在細菌 乳馱乳球菌（lact〇-coccus lactis)中，安伯密碼子位在嘌呤 =物合成基因上。當該細菌在牛乳中繁殖時，容許選擇攜 印、扁馬抑制子tR N A之基因的質體。這樣的質體具有非常 I 、 ^ #、，以及未含有”外來”序列、從噬菌體或轉因子開始的優 點。 根據本發明特殊的具體實施例，該D N A分子也可以含有 瞒準位W杜田Κι、 罝符兴性 < 重組酶的D N A片段，其容許質體多重體 的分解。 因此將這樣的片段導入至環狀的D N A分子上，且其複製 - -12 -本紙張尺歧公爱) 1231826 A7 -—- —____ _B7 五、發明説明（1C) )一" ~" - 起點為例如0ri r，容許這類質體之多重體的分解。特定而 T，當DNA分子在攜帶已經突變之pir對偶基因的品系， 諸如pir-116中製備時，可觀察到這類的多重體，這使得增 加R 6 K衍生物之副本數目成為有可能的。 可藉著各種在序列之間引起位置專一性重組的系統，來 完成該重組作用。更佳的是，本發明之位置專一性重組係 藉著特定的分子内重組序列而獲得，它能夠在特定蛋白 質’通常稱為重組酶的存在之下彼此重組。在這個特殊的 案例中，有重組酶XerC和XerD。為了這個理由，根據本 發明之D N A分子通常也包括容許該位置專一性重組的序 列。出現在根據本發明之基因構築體中的特殊重組系統（重 組酶和特異的辨認位置）可以是不同來源的。特定而言，所 使用的特定序列和重組酶可以屬於不同的結構分類，特別 是轉因子Tn3解結酶族系或噬菌體又整合酶族系。在屬於 轉因子Τ η 3族系的重組酶中，特別提及轉因子τ n 3或轉因 子Τη21和Τη522的解結酶（Stark等人，1992);噬菌體mu 的Gin轉化酶，或其他的質體解結酶，諸如RP4的par片段 (Abert等人，Mol· Microbiol. 12 (1994) 131 )。在屬於噬菌 體λ整合酶族系的重組酶中，特別提及噬菌體λ的整合酶 (Landy 等人，Science 197 (1977) 1 147)， P22 和 0 80 (Leong 等人，J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468)，流行性感冒嗜血桿 菌（Haemophilus influenzae)之 Η P 1 ( Hauser 等人，J. Biol. Chem· 267 (1992) 6859)，噬菌體P 1之Cre整合酶、質體 pSAM2之整合酶（歐洲專利350 341號），或另外的2 //質體 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1231826 A7 ____ B7 五、發明説明) 之FLP重組酶，以及得自大腸捍菌（E coli)的XerC^ X e r D重組酶。 較佳的是，形成本發明之主題的D n A分子含有得自天然 大腸捍菌質體ColEl的片段cei:。所使用之cer片段是一個 得自ColEl的382 bp之Hpall片段，已經顯示它引起質體多 重體的順向分解（Summers等人，1984 ; Leung等人， 1985)。使用較小尺寸（28〇 bp)的Hpall-TaqI片段，或 H p a 11片段所含有的較小片段（約22〇 )也是有可能的， 4片#又具有相同的特性（Summers和Sherratt，1988 )。藉著 特定的分子内重組而使該分解發生，其涉及四個由大腸桿 菌基因組編碼的蛋白質ArgR 、PepA 、XerC和

XerD(Stirling等人，1988、1989 ; Colloms等人，1990 ; Blakely 等人，1993 )。 在這方面，特佳的是使用C〇lEl之cer片段的全部或一部 份’或是其如同上述之衍生物的其中之一。 如同本發明的DNA分子代表物，質體pxL2774及其衍生 物是極佳的。為了本發明之目的，明暸衍生物一詞意指任 何知生自pXL2774的構築體，並含有蟲螢光素酶基因以外 的一或多個感興趣的基因。 本發明亦關於開發出建構特定宿主細胞的方法，該特定 宿王細胞對於產製這些治療用的D n A分子是特別有效率 的。 本發明的另一個目標，係關於產製環狀D n A分子的方 法’其特徵為培養含有至少一個如上定義之D n A分子，以 __ -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Μ規格(21〇χ297公爱） 1231826 A7 ______B7 五、發明説明（12 ) 及可以或不可被原位表現之蛋白質的宿主細胞，其限制條 件為該DNA分子之複製起點的功能度，它對宿主細胞而言 是專一的，並且是外來的，在容許選擇由該]〇1^八分子轉化 之宿主細胞的條件之下。 較佳的是，從相對應的基因中原位表現出限定該D n a分 子複製起點之功能度的蛋白質。編碼複製_開始蛋白質之基 因，可由附屬複製子攜帶·，其可與所使用之條件複製起點 的衍生物共存，或是可藉著重組，經由轉因子、噬菌體或 任何其他的載體’將其導入宿主細胞的基因組中。在特殊 的案例中，表現蛋白質的基因被放置在附屬複製子上，為 了在細胞中具有轉錄功能，後者也含有啟動基因區，以及 位在3 ’末端處，並對轉錄終止信號有專一性的區域。關於 啟動基因區，可以是當某基因能夠在細胞中產生功能時， 自然地引起該基因表現的啟動基因區。它也可以是不同來 源的啟動基因區（引起其他蛋白質表現），或甚至是合成的 來源。特定而言，原核生物或噬菌體的基因可以成為啟動 基因序列之案例。例如，獲自細胞基因組的也可以是啟動 基因序列之案例。 因位編碼複製-起始蛋白質之基因，可以使用野外型基因 或經過突變的對偶基因，這使得獲得更多對起始蛋白質有 專性之貝ta·(或竹生物）的副本數目是有可能的，其決定 在D N A分子中所使用之複製起點的功能性。 已經對於質體 R6K(Inuzuka 和 Wada，1985 ; Greener 等 人，1990)、Rtsl(Terawaki 和 Itoh，1985 ; Terawaki 等人， •15-

1231826 A7 B7 五、發明説明（13 ) 1990 ; Zeng等人，1990)、F (Seelke 等人，1982 ; Helsberg 等人，1985 ; Kawasaki 等人，1991)、RK2 (Durland 等人， 1990 ; Haugan 等人，1992，1995)、和 pSClOl (Xia 等人， 1991 ; Goebel 等人，1991 ; Fang 等人，1993 )特別描述了 這類突變體。 在特殊的案例中，其中所使用的D N A分子具有衍生自質 體R 6 K的複製起點，起始蛋白質則為相同質體之疋蛋白質 的衍生物。表現該蛋白質之突變形式是特佳的，它能夠有 感地增加原始副本的數目。要這樣做，合併到宿主細胞中 的基因較好是由序列識別2號所表示之序列的全部或一部 份來代表，或是其衍生物中的一個，更佳的是由pir 116基 因來代表。有關聯的突變相當於以亮胺酸來置換脯胺酸。 根據本發明的特殊具體實施例，直接將該ρπ> 116基因合併 到宿主細胞的基因組中。 衩住的是 、 〜 π、伯土、、、田肥的悬因中有一個基因，其在選 足的培養條件下是必要的，在dna分子中含有可被選擇抑 制子t^RN A辨認出來的專—密碼子。根據本發明的較佳模 式，這便是安伯TAG密碼子，在這個特殊的案例中，細胞 :以在^料養條件下生長，而料該培養條件而言，含 G密碼子之基因的產物是不可或缺的，只要質體容許 =的表現出現在宿主細胞中。因此培養條件構成了 〇ΝΑ 分子的選擇壓力。 是涉及胺基酸精胺 編碼N -乙醯基鳥胺 較佳的是，含有安伯密碼子之基因 S又之生物合成的基因。argE這個基因 ____ - 16- 本紙張尺度適财s 胁(⑽χ挪公石__ 1231826 A7 B7 五、發明説明（14 ) 酸酶（Meinnel等人，1992)，並在此案例中含有符合點突變 Gln-53 (CAG)->TAG的TAG密碼子；然後藉著培養在最低 限度之M9培養基中，提供攜帶sup基因之質體的選擇壓力 (Maniatis等人，1989)。然而，這也可以是例如，維生素或 核酸鹼基之生物合成的基因，或是另外容許使用特定之氮 或碳源的基因，或任何其他的基因，其功能性對於在所選 定之培養條件下的細胞存活能力是必要的。 最好是從大腸样菌品系中選擇宿主細胞，而更佳的是以 大腸桿菌品系XAC-1來代表之。 根據本發明的特定具體實施例，在提出申請的方法中所 使用的宿主細胞，為大腸样菌品系X A C - 1的細胞，在其基 因組中含有pir 116基因，並被質體pXL2774或其衍生物中 的一種所轉化。 本發明亦關於任何含有上述之D N A分子的重組細胞。這 可以是任何來源的細胞，例如真核生物或原核生物的細 胞。 這些細胞可藉著任何熟諳此藝者已知的，容許將該質體 導入既定細胞中的技術而獲得。這類技術尤其可以是轉 化、電穿透作用、偶聯、原生質體的融合，或是任何熟諳 此藝者已知的其他技術。 根據本發明之DNA分子也可以使用於任何疫苗接種，或 是為了將基因轉移到特定的細胞、組織或器官中的基因和 細胞療法的應用中。 特定而言，可將它們直接使用於活體内投藥，或是為了 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1231826

將它們移殖到患者骨豊内，❼使用它們纟活體外修改細胞。 在這一方面，本發明的其他主題係關於任何包括至少一 個上述的DNA分子，和藥學上可接受之載劑或稀釋劑在一 起的醫藥組合物。該分子可以或可以不必與化學及/或生 化的轉移感染載體結合在一起。這可能特別涉及陽離子（例 如磷鉍鈣或DEAE-葡聚糖）或微脂粒。聯合的合成載體可 以是陽離子聚合物或脂質類。可能提到的這類載體之實例 為 DOGS (Ti:anSfectamTM)4DOTMA(lip〇fectinTM)。 根據本發明之醫藥組合物，可以為了例如局部、口服、 非經腸、鼻内、靜脈内、肌肉内、皮下、眼内或經皮投藥 之目的來調配。提出申請的質體最好是以可注射的形式來 使用。它可以是屬於藥學上可接受之注射調配物的任何媒 劑混合’特別是為了直接注射於待處理部位。這可以包 括’尤其是滅菌的等張溶液，或脫水的組合物，特別是冷 凍乾燥的組合物，依據案例而加入滅菌的水或生理鹽水， 來製造准許注射的溶液。這可以包括，尤其是稀釋葡萄糖 或氯化鈉的Tris或P B S緩衝溶液。直接注射到患者受影響 之區域是有利的，因為它容許將治療效果濃縮在受影響之 組織的平面。所使用之劑量可依照各種變數的函數來修 改’特別是基因、載體、所使用之投藥模式、相關的病理 學或想要之治療期間的函數。 本發明之DNA分子可含有一或多個感興趣的基因，也就 是說一或多個核酸（合成的或半-合成的DNA、gDNA、 c DNA等等），它們的轉錄，可能還有它們在標靶細胞中的 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1231826 A7 B7 五、發明説明（16 轉#產生了 ’口療用、疫苗接種用、農藝或獸醫感興趣的 產物。 在具有治療重要性的基因之中，可能更特別地提及編碼 下列物貝之基因，例如酵素、血液衍生物、荷爾蒙及淋巴 細胞活素：介白素、干擾素或TNF (FR 92/〇3120)、生長 因子、神經傳遞物質，或其前驅物或合成的酵素，以及促 因子（例如 BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、 bFGF、 NT3或NT5);脫脯基脂蛋白：例如Ap〇AI、

ApoAIV 或 ApoE (FR 93/05125 )，代斯脫芬（dystrophin)或迷

你代斯脫芬（minidystro-phin ) (FR 91/1 1947)，腫瘤-抑制 基因：例如 p53 、Rb、RaplA、DCC、k-revCFR 93/04745 ) ’編碼與凝固有關之因子的基因：例如因子 V 11、V111、IX ’自殺基因：例如胸腺核嘗激酶或胞喃咬 脫胺酶；或是其他的天然或人工免疫球蛋白的全部或一部 份（Fab、ScFv 等等），以及 rna 配體（WO 91/19813)等 等。治療基因也可以是反義的序列或基因，它在標靶細胞 中的表現’使它能夠控制基因的表現或細胞mRNA的轉 錄。這類序列可以例如被轉錄到標靶細胞中，進入與細胞 mRNA互補的RNA中，並因此根據歐洲專利140,308號中描 述的技術，阻礙了它們轉譯成蛋白質。 感興趣的基因也可以是疫苗基因，也就是為了產製疫 苗，編碼抗原肽、能夠在人類或動物體内產生免疫反應的 基因。這些抗原肽特別可以是愛氏頓病毒、Η! V病毒、B 型肝炎病毒（歐洲專利185,573號）或假性狂犬病病毒的專一 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐) 1231826 五、發明説明（17 W几原肽’或者是腫瘤的專_性抗原肽（歐洲專利Mm: 號）。 · ’ 曲：般而言’本發明之DNA分子、治療用、疫苗接種用、 2藝或獸醫感興趣之基因’亦含有為了在標乾生物或細胞 中具有轉錄功能的啟動基因區，以及位在3,末端，對轉錄 終止㈣和聚腺答酸化作用位置有專一性的區域。關於該 啟動基因區，它可以是自然引起基因表現的啟動基因區， 此時即認為該區域在有關的細胞或生物中能夠產生功能。 啟動基因區也可以是不同來源的（引起其他蛋白質表現）， 或甚至是合成來源的。特定而言，啟動基因序列可以是來 自真核生物或病毒基因的。例如，啟動基因序列可以從標 輕細胞的基因組中獲得。在真核生物的啟動基因之中，可 以使用任何以專-性的或非·專—性的、可科或不-可誘 導的、強或弱的方式，來刺激或抑制基因轉錄的啟動基因 或經過衍生的序列。真核生物的啟動基因，尤其可以是到 處都有的啟動基因（例如HPRT、pGK、α _肌動蛋白或微 管蛋白之基因的啟動基因）、中間絲啟動基因（GFAP、肌 間線蛋白（desmin)、微絲蛋白（vimentin)、神經絲、角質素 等等基因的啟動基因）、治療基因的啟動基 CFTR、因子VIII、ApoAI等等基因的啟動】因二_ 專一性的啟動基因（丙酮酸激酶、絨毛素（villm)、腸脂肪 酸-結合蛋白質、平滑肌之α _肌動蛋白等等基因的啟動基 因），或疋另外對刺激有反應的啟動基因（類固醇激素受 體、視黃酸受體等等）。同樣地，啟動基因的序列可以從病 20 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公爱） 1231826 A7 B7 ) 五、發明説明（18 毒的基因組中獲得，像是例如腺病毒E丨A和M L p基因的啟 動基因、CMV早期啟動基因，或者SRsvtLTR啟動基 因。此外，可藉著加入活化或調節序列，或是容許組織_專 一性表現，或是佔優勢之組織專一性表現的序列，來修改 這些啟動基因區。 然而，感興趣的基因也可以含有信號序列，它指示被合 成的產物進入標乾細胞的分泌通道。該信號序列可以是合 成產物天然的信號序列，但它也可以是任何其他有功能的 信號序列，或人工的信號序列。 依據感興趣的基因，可使用本發明的DNA分子來治療或 預防數種病理¥，包括遺傳的疾病（例如營養障礙、纖維囊 腫）、神經變性的疾病（阿耳滋海默症或帕金森氏症、 ALS)、癌症、與凝血失調或異常脂蛋白血有關的病理學、 與病毒感染有關的病理學（例如肝炎或AIDS)，或是在農蔹 和獸醫的範圍内。 $ 藉著下列實例的幫助將能更完整地描述本發明，應該將 其視作非-限制性的解釋。 圖片的解釋： 圖1 :複製所涉及之R6K區域的功能構造。 圖2 :質體R6K之7Γ蛋白質的功能部位之構造。 圖3 :將pir基因導入大腸桿菌XACr基因组中的血 案。 〃 圖4 ·載骨豆pXL2666、2730和2754的建構計童j。 圖5 : pXL2774的建構。 -21 - 1231826 A7 B7 五、發明説明（19 Ϊ -材料和方法 A) 材料 1)培養基 使用完整的LB、2XTY和S0C培養基，以及最低限度的 M9培養基（Maniatis等人，1989)。藉著加入15克的⑶ 瓊脂而獲得瓊脂培養基。然而，如果需要可將這些培養基 補充抗生素（氨苄青黴素或康黴素），分別達到1〇〇毫克 升和50毫克/公升之濃度。使用濃度為4〇毫克/公升的色 原受酶質X-Gal和X-Gluc。 2 )大腸桿菌品系、質體及噬菌體 在下列實财分別確認所使用的大腸捍菌品系、質體和 噬菌體。 B) 方法 1) D N A的製造 細囷DNA(質體及基因組的）和噬菌體〇1^八（^13之複製 形式）的分離、利用核酸限制内切酶的消化作用、dna片 段的連接、環脂糖凝膠電泳（在TBE缓衝溶液中），以及其 他的標準技術，均根據製造者對於酵素料的建議，或是 根據在"M〇lecular Cloning : a Laborat〇ry Manual„ (Mamatis等人，！989)中描述的程序來進行。 在電泳期間所使用的DNA尺寸標記如下：ι⑸梯狀物 (肌）供直線片段使用，而超螺旋Dna標記⑽邮㈣ 則供未消化的質體使用。 根據改裝成自動方法的ς; 曰刀万凌的Sanger技術（Sanger等人， 本紙張尺度賴中國國家標準(CNS) 22 A7 B7 1231826 五、發明説明（20 ) 1977)，利用螢光二脫氧核苷酸和Taq DNA聚合酶（PRISM Ready Reaction DyeDideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Bio systems)來完成序列的訂定。 在 Applied Biosystems 394 DNA/RNA 合成器”上，藉著 類核甞酸法（PhosPhoramidite)，利用冷-氰乙基保護基團 (Sinha等人，1984)來合成所使用的寡脫氧核苷酸（以”序列 +編號，，來命名之，參見下文）。在合成之後，藉著以氣處 理而將保護基移除。以丁醇沉澱兩次，容許將寡核苷酸純 化並濃縮之（Sawadogo等人，1991)。 徂Ρ Γ R檸女作用使用之窠核甞酸的序列： 序列識別3號 5'-GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3’ 序列識別4號 5’-GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3· 序列識別5號 5’-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3f 序列識別6號 5’-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3f 以100微升之總體積，在下列的條件下完成P C R反應 (Saiki等人，1985 )。反應混合物包括150毫微克得自待研 究之品系的基因組D N A，兩種寡核甞酸引子（2 4 -體）各1 微克，1 〇微升10XPCR緩衝溶液，其組成如下：” 500 mM KC1、0.1% 明膠、20 mM MgCl2、100 mM Tris-HCn，pH 7.5’’ ’ 以及2.5 單位的 Taq DNA 聚合酶（Amplitaq Perkin-Elmer)。在 Perkin-Elmer Cetus D N A 熱循環機器上的 P C R 條件如下：在9 1 °C下2分鐘，3 0次連績的變性循環（在9 1 °C下1分鐘）、雜交（在4 2 °C下2分鐘），以及延伸作用（在7 2 。(：下3分鐘），最後在7 2 X：下5分鐘。將如此而獲得的產 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準(CMS) A4規格(210 X 297公釐） 1231826 A7 B7 五、發明説明（21 ) 物，以限制酶消化或不加以消化，藉著瓊脂糖凝膠電泳來 分析。 . 根據下列的程序，藉著D N A異構酶來進行各種質體物種 的分析：將在實驗室中純化出的酵素培養在3 7 °C下1小 時。反應混合物（總體積：4 0微升）具有下列組成：150毫 微克的質體、300毫微克的D N A異構酶I或150毫微克的大 腸样菌DNA促旋酶（gyrase)，或是160毫微克金黃色葡萄 球菌（S. aureus)的DN A異構酶IV，和各種酵素獨特的緩衝 溶液2 0微升。以下指出這些緩衝溶液的組成：

供 DNA 異構酶 I 使用的：50 mM Tris-HCl pH 7.7，40 mM KC1，1 mM DTT，100 微克 / 毫升 BSA，3 mM MgCl2，1 mM EDTA ；

供 DNA 異構酶IV使用的：60 mM Tds-HCl pH 7.7，6 mM

MgCl2，10 mM DTT，100 微克 / 毫升 BSA， 1.5 mM ATP，350 mM穀胺酸钾；

供 DNA 促旋酶使用的： 50 mM Tris-HCl pH 7.7，5 mM

MgCl2，1.5 mM ATP，5 mM DTT，100 微克 / 毫升 BSA，20 mM KC卜 2 )大腸桿菌的轉化作用 係根據由Chung和Miller (1988 )描述的TSB (轉化和儲藏 缓衝溶液）方法，依慣例來完成之。像是T G 1之品系 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1231826 A7 _____ B7 五、發明説明（22 ) (Gibson等人，1984)，所獲得的轉化效率為每微克pUc4K (VMra和Messmg ; 1982)約有1〇5-1〇6個轉化物。當需要 較鬲的轉化效率時，根據電穿透器製造者（Bi〇rad)所推薦 程序。藉著電穿透作用來轉化細菌。這個方法使得達到每 微克PUC4K具有從108到1〇1〇個轉化物之效率成為有可能 的。 3 )由陽離子性之脂染體（lip〇fectant)調節的細胞轉移感染 使用的是NIH 3T3老鼠纖維母細胞，前一天以每孔5〇,〇〇〇 個細胞的密度，將其播種在2 4 _孔的培養盤中。所使用的 培養基為DMEM培養基，含有4 5克/公升的葡萄糖，並 補充有1 0 %胎牛血清以及1% 2〇〇 mM穀胺醯胺和抗生素 (5.103單位/毫升鏈黴素，5 1〇3單位/毫升青黴素）的溶 液（Gibco)。按|^積·對_體積之基礎，將質體(在25微 升的9%NaCl中含有i微克）與脂染體混合。測試四種"脂染 f豆电荷/ D N A電荷”比例：〇、3、6和9。這些比例係考量 1微克質體DNA帶有3.1毫微莫耳負電荷，而每分子脂染體 含有3個正電荷來計算之。在容許形成〇να/脂質複合物 的10分鐘接觸時間之後，將50微升的DNA-脂染體混合物 導入在不含血清之培養基（5〇〇微升）中的細胞内。該細胞以 相同的培養基預先沖洗兩次。因此而避免了由血清引起的 轉移感染之抑制。在培養（在c〇2恆溫箱中，在3 7 t下2小 時）4後，在培養基中加入丨〇 %胎牛血清。然後再培養細胞 2 4小時。 4)測量真核生物細胞的蟲螢光素酶活性 -25- 本紙張尺度適用中@ ®家標規格(21GX297公釐) 1231826 A7 ___ B7 五、發明説明（23 ) 在轉移感染之後2 4小時進行該測量。蟲螢光素酶在 A T P、M g 2 +和0 2的存在下催化蟲螢光素的氧化作用，隨 之而產生了質子。藉著發光計測量被謗發之光的總量，與 試樣的蟲螢光素酶活性成正比。使用由promega (蟲螢光素 S母刀析系統）供應的試劑’並根據建議的程序來使用之。在 細胞溶解之後，藉著離心作用將得自每個萃取物之不溶的 部份除去。以5微升上清液來進行該分析，可以或不必將 其稀釋於細胞溶解緩衝溶液中。 5 )在細胞萃取物中測量蛋白質之濃度 這可以根據BCA方法（Pierce)，利用二辛可寧酸 (bicinchoninic acid) (Wiechelman 等人，1988 )來進行之。 在溶解緩衝溶液中製備標準B S A分布（參見111 - B - 4)。按 體積-對-體積之基礎，在3 7 °C下以0 · 1Μ破化乙醯胺/ 〇. 1Μ Tris緩衝溶液，pH 8.2預先處理待分析之試樣和那些分布1 小時。此種處理使得在分析期間，能夠避免出現在溶解缓 衝溶液中之還原試劑（DTT)的干擾。在562毫微米處讀取 分析的結果。 實例1 : 藉著同源重組來建構XAD-lpir和pir-116宿主品系 使用的品系為大腸样菌品系XAC- l(Normanly等人， 1980 )。該品系之argE基因有利地含有穀胺醯胺- 53(CAG) 成為安伯密碼子（TAG)的突變（Meinnel等人，1992)。該 argE基因屬於argECBH趨異操縱子，並編碼精胺酸的生 物合成酵素，N -乙醯基鳥胺酸酶。因此XAC-1不能合成 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1231826 A7 B7 五、發明説明（24 ) 知胺酸，而結果不能在最低限度之培養基中生長。如果該 口。系藏匿了一個容許抑制子tRNA表現的質體，將可解救 此種音養缺陷。因此藉著在最低限度之培養基中培養，選 擇帶有這類質體之細菌是有可能的。為了容許其中具有衍 生自R6K(質體者的複製，必須藉著同源重組作用將pir 基因導入XAC-1的基因組中。在uidA之處，藉著在野外 型uidA基因和被pir(或pir_ 116)基因打斷的副本之間的交 換，將pii:基因（野外型或是經過突變的）導入。該111(1八基 因編碼P -尿甘酸酶，為水解石-尿甘酸化合物的酵素。該 基因可以是失活的，而沒有任何問題，因為它對於在標準 合成培養基中的生長不是必要的，在生長時不需使用到Θ _ 尿甘酸化合物。此外，可藉著色原受酶質X _ G 1 u C來監視 /5 -尿甘酸酶的活性，其水解釋放出藍色的色素。 1)建構攜帶卡匿”KmR-nidA : : Pir(或pir-116)的自殺載 體 我們使用涉及單一細菌宿主和對感興趣品系之基因組作 取少修改的策略。使用嗤菌體Μ 1 3 mp 1 0 (Messing et Vieira 1982)作為自殺載體（biuh1等人，1989)。複製所必需的、 在基因11中的安伯突變，使該Μ 1 3的宿主範圍縮減到諸如 TG 1 (supE)之類的品系，其產生安伯抑制子tRNA ;因此 它不能在諸如XAC - 1之類的大腸桿菌sup+品系中複製。 含有Tn5之康酶素-抗藥性基因和一uidA : : pir4pir_ 1 16的：)· 8 kb BamHI卡匡，分別從Μ 1 3 w m 3 4和3 3中純化 (Metcalf等人，1994)。將它們選殖到以BamHI弄直的 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1231826 發明説明（25 Μ 1 3 m p 1 〇中。在使連接混合物電穿透到T G丨内之後，藉 著將重組的純種系平舖在LB + Km瓊脂培養基上來選擇 之藉著分析限制輪廓，並藉著定出符合pir_ 116突變之區 域的序列，顯示出所得純種系的一致性。 2)藉著同源重組將pir或pir-n6基因導入大腸捍菌xAcq 的基因組中。 在圖j中提出所採用的策略，以及所涉及的各種事件。 a )第一個重組事件 藉著電穿透作用，利用每種RF(inp丨0--UidA : : pir或 pir-116)各1 〇、1〇〇或2〇〇〇毫微克來轉化xac - 1品系。每 個表現混合物各取三分之一覆在含有康酶素的L B培養盤 上 並在 37 C 下培養過夜。mpi〇_ — uidA ·· 116益菌姐不此在品系xAC-i(SUp + )中複製。因此Km3^· 口己僅把藉著經由與基因u i d A之野外型副本的同源重組，而 整合到細菌的基因組中來維持。在表1中顯示了 XAC-1電 穿透作用的結果。所獲得的轉化效率，每微克p U C 4 K為 4 . 1 0 9個轉化物。 構築體 利用經過轉化之下列含量的DNA而獲得 的菌落數目 10毫微克 100毫微克 2000毫微克 M13mpl0-_uidA : : pir 1 41 146 M13mpl0-_uidA · ： pir-116 0 16 124 表1 -28- 本紙張尺度適用中國國豕標準(CNS) A4規格(210X 297公复) 1231826 五、發明説明（26 A7 B7 ) 在測試條件之下，整合體的數量與Dna含量以非-線性 之方式增加。指定的轉化效率和R F s ( 11 · 7 kbp )的尺寸，可 月匕具有接近重組標準的理念。藉著考量丨〇()毫微克之處， 大约獲得1 〇- 6之重組頻率。 b)第二個重組事件 然後藉著品系對脫氧膽酸酯（D 〇 c R)的抵抗力，來選擇第 二個重組事件。 要這樣做時，將每種構築體各取5個整合體，培養在補充 有0.2%脫氧膽酸鈉的2XTY培養基中。出現兩種不同的族 群。某些純種系在3 7 °C下大約8小時之後，產生明顯可見 的朦臆（兩個p i r構乘體的純種系，和三個p丨Γ _ 116構築體的 純種系）。其他的純種系在3 7 C下一夜之後，僅產生濃密 的培養物。就像預期的一樣，它們幾乎都是Km s。為了研 究每個電穿透物質，使50 Kms的後代快速地進入添加了 χ _

Glue的LB培養基中。在37。(：下48小時之後，u id Α+純種 系呈淡藍色，但是已經經歷過對偶基因置換的（案例第1 號’圖3)，在該培養基中仍維持白色（UidA-)。表2摘述了 所獲得之雙重重組體的表現型分析。 有1 8到3 0 % $雙重重組經歷了對偶基因置換。 品系 在DocR中的Kms數目 在Kms中的UidA-夕可分比 XAC-1 pir-2 50/50 18 XAC-1 pir-3 50/50 24 XAC-1 pir-4 50/50 34 XAC-1 pir-116-1 50/50 32 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 五、發明説明（27 XACpir-116-4__35/50_ 3〇__ 表2 3)檢查藉著重組而獲得之品系的pir +特性 為了確保藉著雙重重組而獲得之品系的pir +特徵，我們 以pBW3〇(Metcalf等人，1994)來轉化每種構築體各三個 純種系。所有受試品系獲得轉化物的事實，使得顯示被整 合到XAC-1基因組中之pir*pir-U6基因的功能性成為有 可能的。在相同的條件之下，利用親代的品系XAC—i沒有 獲得轉化物。我們繼續研究2 XAC-lpir純種系（B*C)以及 2 XAC-lpir-116 純種系（E和 D)。 4 )藉著P C R擴大作用來檢查由重組而獲得的品系 為了證實對偶基因置換，我們藉著PCR擴大作用來檢查 在indA部位任一側上的基因組區域。每一對寡核甞酸包括 相當於p i Γ内部區域的寡核甞酸，和相當於靠近染色體 U1 d A之區域的第二個寡核苷酸，但是不在重組提供的片 段心内。後者寡核苷酸之序列，藉著得自基因銀行的 ECOUIDAA序列（登錄編號· μ 14641 )來決定。因此我們能 夠澄貫在細菌基因組中p i Γ基因的精確位置。藉著利用 Μ 1 u I的消化作用來證實被擴大片段的尺寸，可依照該尺寸 來預期它的性質。 實例2 建構衍生自R 6 Κ、攜帶選擇標記sup phe的質體載體 建構含有得自R6K之ori r和康黴素_抗藥性基因的載體 (PXL2666)。在品系 BW19610 (pir-i16)5 中觀測pXL2666 的 •30- 本紙張尺夏適用中國目家標準(CNS) Μ規格(21〇><297公爱） -— --- 1231826 A7 B7 五、發明説明（28 ) 多重體（Metcalf等人，1993 )，引導我們去研究得自ColEl 的c e r片段對此現象的影響。然後我們將苯丙胺酸抑制子 tRNA(sup Phe)的表現卡匣導入載體od r -Km、 cer(pXL2730)中。載體pXL2760則作為建構載體的基礎， 其可用於基因療法中。 1)建構並分析含有得自R6K之od r和康黴素-抗藥性基因 的載體 a)構築體 在第一個被建構的質體PXL2666中，康黴素-抗藥性基因 係起源自 pUC4K (Vieira 和 Messing ; 1982)，而包含在 417 bp EcoRI-BamHI片段中的複製起點，係起源自自殺載體 pUT-T7pol (Herrero 等人，1990 )(圖 4 )。pXL2666 轉移到品 系BW19094和19610(Metcalf等人，1994)中，使得它能夠 顯示質體在pir-116品系中實際增加的含量，此時將其與在 p i r品系中的相同質體作比較。然而，未經消化之質體的電 泳分析，顯示增加和少量多重體形式出現的步調一致。此 一現象很可能與在質體多數複本之間的分子間重組有關。 因此，我們藉著選殖天然大腸桿菌質體C ο 1 E 1的c e r片段 來建構PXL2730，已經顯示它以順式之方式容許質體二聚 體的分解（Summers 和 Sherrat， 1984 )進入 pXL2666。所使 用之片段相當於得自ColEl的382 bp HPAII片段（Leung等 人，1985 )。它含有特異的分子間重組位置；為了產生功 能，它僅涉及包括重組酶X e r C和X e r D，以及輔助因子 ArgR和PepA白勺宿主蛋白質（Stirling等人，1988、1989 ; -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1231826 A7 B7 五、發明説明（29 )

Colloms等人，1990)。為了確保所觀察到的影響確實是因 為cer片段.，我們也建構對照質體pXL2754，其中cer片段 具有一個165 bp的刪除。顯示該刪除廢止了 c e r對多重體分 解的作用（Leung等人，1985 )。引導建構這些質體的各種 選殖步騾，出示在圖4中。 b )質體物種的定量和定性分析 •藉著瓊脂糖凝膠電泳的分析 已經建構之不同質體的電泳分析，容許證明各種根據所 使用之品系而有所變化的質體物種。評估未消化之質體和 超螺旋DN A標記有關的尺寸。在pir品系（BW19094)中， 質體pXL2666 : 2754和2730幾乎完全是單體形式。在每個 主帶上方的帶狀區，相當於稍小一點點的各種超螺旋異構 體，如同在DNA促旋酶對pXL2730作用之後，觀察到的輪 廓所證實的。 在pir_116品系（BW19610)的案例中，輪廓是不同的：對 觀察質體PXL2666和2754之不同物種而言，在從單體到多 重體（2、3或4單元）的範圍中，主要的形式是二聚體。在 以EcoRI消化之後，只發現直線狀的質體DN A ;這些質體 物種相當於質體多重體，或是各種的異構體。然而，因為 根據超螺旋D N A標記所決定的形式尺寸，是單體質體之完 整產物，所以它們極有可能是多重體。多重體的形成，最 有可能是因為pir-116的突變，雖然兩個品系BW19094和 BW19610嚴格來講都不是同基因的（BW19610為recA)。利 用pXL2730而獲得的輪廓是不同的；雖然仍可見到多重體 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1231826 A7 B7 五、發明説明（30 形式，但主要的形式是單體形式。因此cer片段能夠促進 我們已經在BW19610中建構，與r e c a無關之質體多重體的 分解。 •在利用D N A異構酶處理之後的分析 為了駁斥在帶有pir-116對偶基因之品系中所觀察到的形 式疋特兴性兴構體之理論，使每個質體製品接受D N A異構 酶的作用。在實驗條件之下，各種酵素的活性如下：關於 大腸桿菌DNA異構酶I，是使DNA放鬆，關於大腸桿菌 D N A促旋酶，是使已經放鬆的D N a形成負超螺旋，並藉 著金黃色葡萄球菌異構酶IV解開交織的DNA，再使超螺 旋之DN A放鬆。DNA異構酶IV的作用，能夠顯示高分子 量l質體形式，並非因為數個質體分子的糾纏而產生；在 此案例中，它們已經被轉變成單體之物種。酵素的功能 性，當然是在由糾纏在一起之D N A分子所組成的運動漿 D N A製品上檢查（未顯示）。放鬆的活性也是可見的，因為 所得物種比在未處理對照組中的移動得更少。DNA促旋酶 的作用，使得將稍微放鬆之異構體轉變成萃取自細菌、較 多超螺旋之物種（主要是單體或二聚體），成為有可能的。 此外，也可能證實所製備之DN A主要是超螺旋形式的。如 此處理試樣，容許證實上述有關於每個構築體之主要物種 的結果。DNA異構酶I確實放鬆了 〇ΝΑ，但是只有一部 扮。這可歸因於所研究之質體僅含有少量的單股區域，而 該酵素較喜愛與此區域結合（Roca，1995)。 2)將選擇標記SUp phe導入pXL273 0中 -33-

1231826 A7 B7 五、發明説明（31 ) 我們使用合成抑制子t RN A基因（P h e)的表現卡匣（Kleina 等人’ 1990)。如此將苯丙胺酸導入回應tag密碼子的生 長多肽鏈中。而且，它容許在XAC-1中產製ArgE蛋白 質’其具有充份的活性以便容許在缺精胺酸的培養基中良 好地生長。sup Phe基本上在質體pCT-2_F(N〇r-manly等 人，1986)上，由合成的啟動基因表現，該啟動基因係衍生 自大腸桿菌1 p p基因的啟動基因序列p丨p p。在該基因的下 游，藉著合成的終止序列，大腸样菌操縱子r r n C的使 轉錄作用停止（Normanly等人，1986)。 在XAC-1中進行各種繼代選殖。因此藉著該品系的冷_ 半礼糖苷酶活性來檢查抑制子tRN A表現卡匣的功能性， /、有在基因lacZu 1 1 8 a m之安伯密碼子受到抑制時，才出現 省酵素活性。最後步驟包括將SUp phe表現卡匣導入 pXL273〇中。利用cer片段所得到的結果，引導我 們選擇了 1¾質體而不是pXL2666 ◦我們保留了康黴素一抗 藥性基因，以便更易於後續的選殖，尤其是為了在最後的 選殖期間，具有可利用的額外篩選（KmR的喪失）。 實例3 : 藉著轉移感染老鼠的纖維母細胞，批准將質體載體應用在 基因療法中 1)建構報告者载體pXL2774 木為了測試所產製之質體DN A供全身性基因療法使用的妥 當性，我們將可使用在真核生物細胞中的報告者基因導入 PXL2760内。我們使用編碼ph〇tmus pyrans蟲螢光素酶的 -34- 本紙張公釐）

裝 丁

1231826 A7 B7 五、發明説明（32 ) 基因1 u c，因為生物發光測量試驗是非常敏感的，並在大 範圍内是線性的，而且由真核生物細胞之内源活性所引起 的背景噪音是非常低的。該1 u c基因受到人類巨大細胞病 毒早期基因的啟動基因-促進子序列（C Μ V啟動基因）控 制’其容許高量的表現。在1 u c的3 ’末端處有一個未經轉譯 的區域，起源自病毒S V 4 0，它含有聚腺甞酸化作用信號 (聚（A) + )。在容許增加可利用之限制位置數量的中間選殖 之後，將” C Μ V啟動基因-1 u c -聚（A) + ’，卡匣導入最低限度 的載體ori r - cer-sup Phe (pXL2760)中，來代體{(:爪汉標 記。已經將所得的質體命名為PXL2774。圖5整理了各種選 殖步驟。藉著電穿透作用將連接混合物轉化到X A c - 1 pir_ 116中。在豐盛的培養基（s〇c培養基）中完成培養，以便 容許細菌表現選擇標記；因此在覆蓋之前必須以M 9培養基 沖洗細胞兩次。這樣便可以移除殘餘的培養基，其將會對 最低限度的培養基產生培養背景嗓音。 選疋放在經過電穿透之細胞上的培養基為M 9最低限度之 培養基，這樣能夠選擇表現出抑制子tRNA的細菌，因此 出現了我們的質體。添加x_Gal，藉著藍色著色而能夠看 到抑制子tRNA的表現。在37t: 丁大約2〇小時之後，分析 培養皿。在不含-DNA的對照組上缺乏菌落，使我們確信 選擇是正確的’即使是密集地播種。所有藉著限制（8)來檢 ，的純種系，確實帶有符合預期輪廊的質體。如此建構的 S體？乂1^2774，從培養在—公升液態^^培養基中（在 下大約18小時）的純種系中，藉著涉及特別是離子-交換的 I_______35_ t s s 家標準

1231826 A7 B7 五、發明説明（33 )

技術（Promrga kit，MegaPreps )來製備之。所收集的DNA 含量為2毫克。 2 )分析轉移感染到哺乳動物細胞中的報告者載體pXL2774 pXL2774能夠轉移感染真核生物細胞，並容許藉著轉移 感染到N I Η 3 T 3老鼠纖維母細胞中，來評估蟲螢光素酶的 表現。選出來作為參考的載體是pXL2622(這是得自 Promega的質體pGL2，它的SV40啟動基因已經被CMV啟 動基因置換），它帶有像PXL2774 —樣的蟲螢光素酶表現卡 匣，但是有不同的複製子。這是一個6.2 kb ColEl衍生物， 其帶有氨芊青黴素-抗藥性基因。該質體係作為對照組。蟲 螢光素酶的活性（以RLU或相對的發光單位來表示）被顯示 於表3中。 利用比例為6的”脂染體電荷/ D N A電荷”，獲得了最佳 的結果；在這些條件之下，pXL2622和2774似乎是同等 6勺。 PXL2622 PXL2774 電荷 蛋白質和每孔 平均 變化係數 蛋白質和每孔 平均 變化係數 比例 的RLU/微克 (%) 的RLU/微克 (%) 0.0 0.0 0 0.0 不可檢測 0.0 不可檢測 0.0 0.0 9.9 106 3.3 106 3 6.2 106 7.6 106 22 2.9 106 2.9 106 13 -36- 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1231826 A7 B7 五、發明説明（34 ) -37- 6.6 106 2.4 106 1.2 107 9.4 106 6 1.5 107 1.5 107 19 9.9 106 1.0 107 7 1.9 107 1.1 107 9.5 106 1.1 107 9 7.5 106 1.0 107 26 8.3 106 6.4 106 13 1.4 107 8.5 106 表3 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1231826 A7 B7 五、發明説明（35 ) 參考文獻

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裝 訂

線 1231826 A7 ______B7 "Π、發明説明（38 ) 序列一覽表 (1) 共同訊息 (i) 申請者： (A) 姓名：RHONE POULENC RORERS.A. (B) 街道· 20，Avenue Raymond Aron

(C) 城市·· ANTONY

(E) 國家：FRANCE (F) 郵遞區號：92165 (G) 電話：4〇·9 i 69.22 (H) 傳真：0)40^ 72 96 (ii) 發明標題··具有條件複製起點之環狀DNA分子，其 製法及其於基因療法之用途 (iii) 序列數目：6 (iv) 電腦可讀形式·· (A) 媒體型式：磁帶 (B) 電腦：IBM PC可相容的

(C) 操作系統：PC-d〇S/MS-DOS (D) 軟體：patentIn Release #1 〇, Versi〇n #1 3〇(EPO) (2) 序列識別1號的訊息： (i)序列特徵： (A)長度：358個鹼基對 (B )類型：核:y：酸 (C)股形：單股 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1231826 A7 B7 五、發明説明（39 ) (D )局部解剖學：直線狀 (ii)分子類型：cDNA (xi)序列說明：序列識別1號：

1 TGTCAGCCGT TAAGTGTTCC TGTGTCACTG AAAATTGCTT TGAGAGCCTC

TAACGGCTTC C 1 TCACTCCCT.r ACA.l.CCCTCG Cl.i.ClTTGTCC ACAACCGTTA ΛΛ〔··(:.ΓΊ.ΛΛΛΛ Π(:.ΓΤ·ΓΛΛΛΛ(; 121 ζΧΤΤΛΤΛΤΛΤ TC.rrrrrrTT Cn.ATAAAAC Tl.AAAACCTr ΛΠΛ(:Γ·Γ：Ί·八·ΓΤ ΤΛΛ(···ΓΤΠ(:ΊΤ· 1 Ο 1 Λ.ΓΤΊ.ΛΤΛΤΊ，Λ Λ.ΓΓΓΤΛΤΤΓ.Τ Ί.ί：ΛΛ/\ί：/νίϊΤΛ ί..(:Ί':ΛΛΛ(.八Τ ΓίΛ«:Λ(:ΓΊ.ΤΛ(^

24 1 TACGTT^CCC ATCACACCTT /\CJV\CCTrrAC CCATCAGGGT TTAC.l.TCGTT AAACA'VCACA * · * 301 CCTTACTACC TTAAACATGA GAGCTTAGTA CGTGA>WC^T C>\C/^Cnv\a ΤΛ〔σΓΛ〇·ΛΤ 329 CAACAGGTTC； AACTGCTGAT CTTCACATC · (2)序列識別2號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：1659個鹼基對 (B) 類型：核甞酸 (C) 股形：單股 (D) 局部解剖學：直線狀

(ii) 分子類型：cDNA (xi)序列說明：序列識別2號：

TATACACAAT 1 ：：ATCAC:(;TTT TTTTATGAGA CTTCAAnCTrCA ΤΓ：ΛΤΓΠΛΓΓ··Γ CAACAAAAAA • · • 601 ACGAAAATTC GCCACCGAAA CGACCTAAAT CACACCCTCC CTCAACTTCC TTTGCCCGCA 661 AAGCGAGTGA TCTATA.rCGC GCTTGCTCCC 八TTCATAGCA AACAACCTCT TGAACGAGGG -42- $^：尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公爱) 1231826 A7 B7 五、發明説明（40

12 1 CCCATCGCTT CGAcrrrTTCA AAATTAGCC.C • 781 TTCGCT/V\GA GCTTATCGAC 八ATTAAAAGA 841 TAAAi\ACTCC GGGGATGATA TCATTGCTTT 901 TGAAGGATAC CCTGAACAGT TAGATCTTAA 961 TGGG八ΛΛΑΛΛ TTGTCTTTAA Aattcaccag 1021 CTATrCATCT AAT/WVTTCA (：ΛΛ(：(ϋ(:ΛΛΤτ 1081 TCTCITTATC AACITATCAG ΤΤΑΤΤΤΤΑΤΤ 1 Μ 1 AGATGGAAAT ATTTGCGTTG ATGAGTTAAA 1 201 TAAAGCCATT ATTGAGTACA AATACCCTCA 1 261 GCTGAAATTA AAAACAAAAC TGAAAAAGAA 132 1 ATTTTCTGGC σΟίΛΛΟΛΛΛΛΛ TTACTAACCT TGAACACCTT CCACCGCTCC ΓΓΛΛΛΛΤΓΛΓ · GGGTGCTAAA TTACTTGCTG CCAGCAAAAT AGCTAAAGAG CTTAACCTGC CCTTTACTGC CATTATTGAG TGCATAGCTT ATTCAAATCA 八ACCATACAA CCATATATC丁 CTACCCTTAT CriTAACGCCA Λ(:(ΓΤΊ.ΛΓ(:ΓΤ ΤΛΛ(:·1·Λί :Γ(·/\ GAACCATTAC Τ(：ΤΛΛ*ΓΤΓΓΛ ΛΓ·ΛΛαΑΑΑΑΛ GGAAGAGTTA ACAGCTTATA (ΓΤΤΤΤΤ,ΛΤΛΛ CTTTCCTATT TTTAAAAGGG ATGTGTTAAA AGAAATATCG TTTGTTCCCT TCACTCTTCA· GAAC:TTC(:AA ·ί·ΤΊ·(:ΤΓ(:ΤΊ·ί: Λ.Π:ΛΛ(:Λ.Γ(:Λ

1 381 GATAAAGATG ATCAAGCTTT TTTTATG^AT TTATCTGAAG CTGATGCACC

TTTTCTCAAG 144 1ΤΛΛΛΛτττΛΟ

ΓΧΛτττΛΛτσ aaaccgtacc tcccaaaaaa GCTAACCCGT GATAITATGCC

(2)序列識別3號的訊息： (i )序列特徵： (A )長度·· 2 4個鹼基對 (B) 類型：核苷酸 (C) 股形··單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii)分子類型：cDNA -43- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝 iT彎L k 1231826 A7 B7 五、發明説明（41 ) (xi)序列說明：序列識別3號： GACCAGTATT ATTATCTTAA TGAG 24 (2)序列識別4號的訊息： (i )序列特徵· (A) 長度：24個鹼基對 (B) 類型：核甞酸 (C) 股形：單股 (D )局部解剖學：直線狀 (ii)分子類型：cDNA (xi)序列說明：序列識別4號： GTATTTAATG AAACCGTACC TCCC 24 (2)序列識別5號的訊息： (i) 序列特徵： (A) 長度：24個鹼基對 (B) 類型：核甞酸 (C) 股形：單股 (D )局部解剖學：直線狀

(ii) 分子類型：cDNA (xi)序列說明：序列識別5號： CTCTTTTAAT TGTCGATAAG CAAG 24 (2)序列識別6號的訊息： -44 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1231826 A7 B7 五、發明説明（42 ) (i )序列特徵： (A) 長度：24個鹼基對 (B) 類型：核苷酸 (C) 股形：單股 24

(D )局部解剖學：直線狀 (ii)分子類型：cDNA (xi)序列說明：序列識別6號： GCGACGTCAC CGAGGCTGTA GCCG -45- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

Claims (1)

1. A BCD I23i8^6〇9〇12〇8〇3 號專利申請案 中文申請專利範圍替換本(93年5月)

   申請專利範圍 1. 一種用於基因療法的環狀DNA分子，該dna分子包括 至少一個所欲之核酸序列，一個區域其容許D N A分子複 製，及一個區域其插入該DNA分子中，容許選擇裔古 細胞，且該區域係對抗生素有抗藥性之基因以外的基 因，其特徵在於該DNA分子之容許複製區域包括衍生自 質體或噬菌體之複製起點，該質體或噬菌體其係選自 RK2、R6K、Rl、psci〇l、Rtsl、F、RSF1〇1〇、 PI、P4、 λ、Phi82和Phi80,其中在宿主細胞中複製起 點的功能性需要在至少一個專一性蛋白質的存在下進 行’戎蛋白質對該宿主細胞而言是外來者，且其中該所 欲之核酸序列係編碼選自下列之蛋白質：酵素、血液衍 生物、激素、淋巴細胞活素、介白素、干擾素、T N F、 生長因子、神經傳遞物質或其前驅物，或是合成酵素、 促因子、脫輔基脂蛋白、代斯脫芬（dystr〇phin)4迷你代 斯脫芬（minidystro-phin )、腫瘤-抑制基因、編碼涉及凝 固因子的基因、自殺基因、天然或人工免疫球蛋白的全 部或一部份、RN A配體、反義序列、或是愛氏頓病毒、 HI V病毒、B型肝炎病毒或假性狂犬病病毒的專一性抗 原肽，或者腫瘤專一性的抗原肽。 2. 根據申請專利範圍第1項之Dna分子，其特徵在於該複 製起點係衍生自細菌的質體R 6 K。 3·根據申請專利範圍第2項之D N A分子，其特徵在於該複 製起點包括質體R6K之r複製起點的全部或一部份。 4.根據申請專利範圍第1項之D N A分子，其特徵在於該複 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1231826 A B c D 六、申請專利範 圍 製起點係全部或部份地以序列識別1號之序列，或其衍生 物之一為代表。 5·根據申請專利範圍第1項之D N A分子，其特徵在於容許 選擇併入該D N A分子之宿主細胞的區域係全部或部份地 以專一性密碼子之抑制子轉移RN A的表現卡匣為代表。 6·根據申請專利範圍第5項之〇 N A分子，其特徵在於它是 安伯密碼子（TAG)之抑制子tRNA的表現卡匣。 7·根據申請專利範圍第1項之DNA分子，其特徵在於它也 包括位置專一性重組酶的標靶區域。 8·根據申請專利範圍第7項之DNA分子，其特徵在於該位 置專一性重組酶之標靶區域可以選自轉因子7113、Tn21 或Τη 522之解結酶的標靶區域；噬菌體轉化酶、質 體解結酶、噬菌體又整合酶族系的重組酶、得自質體 PSAM2的整合酶、得自2 #質體的FLP重組酶，以及大 腸桿菌重組酶XerC和XerD。 9’根據申凊專利範圍第8項之〇 N A分子，其中該質體解乡士 酶為R P 4 〇 1〇·根據申凊專利範圍第8項之D N A分子，其中該嗟菌體入 整合酶族系中的重組酶，係選自入、Phi8〇、p22和 Η P 1整合酶。 11·根據申請專利範圍第7項之D Ν Α分子，其特徵在於該位 置專一性重組酶的標靶區域包括全部或一部份得自 ColEl的cer片段，或其衍生物之一。 12.根據申請專利範圍第1項之d N A分子，其特徵在於它 是質體PXL2774或pXL2774之衍生物，其中蟲替井音醢 被該所欲之基因取代。 ” -2 - 本紙張尺度適用中國國家棵準(CNS) A4規格(210X297公釐） 8 8 8 8 A B c D 1231826 申請專利範圍 Xbal

   Scale：- 200 bp

   Ka f rdaa 13.根據申請專利範圍第1項之DNA分子，其係為質體 PXL2666、質體pXL2730、質體pXL2754或其衍生物，其包 括該所欲之基因

   本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇X 297公釐）

   14,根據申請專利範圍第1項之DNA分子，其中該促因子係 選自 BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aF GF、 bFGF、NT3 或 N丁 5。 15·根據申請專利範圍第1項之D N A分子，其中該脫辅基脂 蛋白係選自ApoAI、ApoAIV和ApoE。 根據申請專利範圍第1項之D N A分子，其中該腫瘤-抑 制基因係選自 p53、Rb、RaplA、DCC 或 k-rev。 17. 根據申請專利範圍第1項之D N A分子，其中該涉及凝固 之因子係選自因子VII、VIII或IX。 18. 根據申凊專利範圍第1項之d n A分子，其中該自殺基因 係選自胸腺核芸激酶或胞嘧啶脫胺酶。 19. 根據申凊專利範圍第1項之d n A分子，其中該人工免疫 球蛋白係選自Fab或ScFv。 20· —種重組細胞，其利用至少一個根據申請專利範圍第1 項之DNA分子來轉化。 21. —種用於基因療法之醫藥組合物’其包括一或多個根據 申請專利範圍第1項之D N A分子，與藥學上可接受的載 劑或稀釋劑。 -4- 本紙張尺度適用巾S S家棣準(CNS) A4規格(㈣X 297公董)~ —--一