CZ78898A3 - Molekula kruhové DNA s podmínečným počátkem replikace, postup její přípravy a její použití v genové terapii - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nové molekuly DNA spodminečnou replikací použitelné v genové terapii nebo pro tvorbu rekombinantních proteinů.

Dosavadní stav techniky

Genová terapie spočívá v opravě poruch nebo anomálií tím, že vkládá genetickou informaci do buňky nebo do postiženého orgánu. Tato informace může být vložena buď in vitro do buněčného extraktu orgánu a potom reinjikovaná do organizmu, nebo in vivo přímo do určité tkáně. V případě, že se jedná o molekulu s vysokou molekulovou hmotností a s negativním nábojem, DNA má obtíže samovolně projít fosfolipidovou buněčnou membránou. Používají se tedy různé vektory, aby umožnily přenos genu: jednak virové vektory, a jednak chemické vektory nebo/a biochemické, přírodní nebo syntetické.

Virové vektory (retroviry, adenoviry, viry AAV...)jsou velmi účinné, zejména pro přechod přes membrány, ale představují také určitý počet nebezpečí, například: nebezpečí patogenity, rekombinace, replikace, imunity...

Chemické vektory nebo/a biochemické umožňují vyhnout se těmto nebezpečím (pro přehled, viz Behr, 1993, Cotten et Wagner, 1993). Jsou to například kationty (fosfát vápenatý, DEAE-dextran...), které jsou účinné tím, že tvoří sraženiny s DNA, které mohou být fagocytovány buňkami. Může se zejména jednat o lipozomy, ve kterých DNA je začleněna, a které fúzují s plazmovou membránou. Přenosné syntetické vektory genů jsou všeobecně lipidy nebo kationické polymery, které tvoří komplexy s DNA tak s ní a tvoří částici nesoucí pozitivní náboj na povrchu. Pro ilustraci tohoto typu vektorů se může zejména citovat dioktadekylamidoglycylspermin (DOGS, Transfectam TM) nebo N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylamonium chlorid (DOTMA, Lipofectin TM).

Použití chemických nebo/a biochemických vektorů nebo pouhé DNA předpokládá možnost produkovat důležité množství DNA farmakologicky čisté. Vlastně v technikách genové terapie medikament je tvořen samotnou DNA, která je nezbytná pro možnost výroby v přizpůsobených množstvích a DNA, která má přijatelné vlastnosti pro terapeutické použití u člověka.

V případě nevirové vektorologie se používají plazmidy bakteriálního původu. Plazmidy všeobecně použité v genové terapii nesou (i) počátek replikace, (ii) značený gen jako je gen rezistentní k antibiotiům (kanamycin, ampicilin...) a (iii) jeden nebo více transgenů s nezbytnými sekvencemi pro jejich expresi (leucinový zip či zipy, promotor(y), polyadenylové sekvence...).

Nicméně aktuálně používaná technologie nedává úplné uspokojení.

Jednak zůstává nebezpečí rozptýlení v organizmu. To znamená, že bakterie přítomné v organizmu mohou, při slabé četnosti, přijímat tento plazmid. Toto má tím spíše větší pravděpodobnost v případě, že se jedná o léčení genovou terapií in vivo, ve které může být DNA rozmnožena v organizmu pacienta a může se nacházet v kontaktu s bakteriemi, které infikují tohoto pacient anebo také s bakteriemi komensalitní mikroflóry. Jestliže bakterie, která přijímá plazmid je enterobakterie, taková jako E. coli, tento plazmid se může replikovat. Takový děj vede k rozšíření terapeutického genu. V případě, kde použité terapeutické geny v léčení genové terapie mohou kódovat například lymphokin, faktor růstu, antionkogen, nebo protein, jehož funkce chybí u hostitele a umožňuje opravit genetickou chybu, rozmnožení těchto určitých

genů by mohlo mít nečekané účinky a účinky, které způsobuji starosti (například, jestliže patogenní bakterie osvobodí gen lidského růstového faktoru).

A jednak plazmidy všeobecně použité v genové nevirové terapii mají tak markér rezistence k antibiotikům (ampicilinu, kanamycinu...). Bakterie,která přijímá takovýto plazmid má tak podstatnou nepopiratelnou výhodu, jelikož každé autobioterapeutické léčeni, které používá antibiotika stejného rodu, jako vybraný gen rezistence plazmidu, povede k selekci zmíněného plazmidu část β-laktamů, který nejpoužívanější na světě.

V tomto ohledu ampicilin tvoří je antibiotickou rodinou Použití selekčních markérů u bakterii, které nebudou resistentnimi geny k antibiotikům budou tedy zejména výhodné. Vyhne se selekci bakterií, které by mohly dostat plazmid, který nese takovýto markér.

Je tedy zejména důležité hledat maximální omezení rozmnoženi terapeutických a rezistentních genů.

Podstata vynálezu

Předložený vynález návrhuje nové molekuly DNA, použité v genové terapii nebo pro produkci rekombinantních proteinů in vitro, které se replikují jen v buňkách, které mohou doplnit určité funkce těchto nevirových vektorů.

Předložený vynález se také týká obzvláště účinné metody pro přípravu těchto molekul DNA.

Nárokované molekuly DNA mají výhodu vyloučení nebezpečí spojeného s rozmnoženým plazmidem, jako jsou (1) replikace a rozmnoženi, které mohou nést silnou expresi neřízenou terapeutickým genem, (2) rozmnožení a exprese rezistentních genů. Genová informace obsažená v molekulách DNA podle vynálezu obsahuje účinek terapeutický gen nebo terapeutické geny a signály regulace jeho nebo jejich exprese, počátek • φ φφφφ replikace podmínečně funkční, který omezuje velmi silně spektrum hostitelské buňky tohoto plazmidu, selekční markér snížené velikosti přednostně odlišující se od genu, který uděluje rezistenci k antibiotikům a v případě potřeby, fragment DNA, který umožňuje uvolnění multimerů plazmidu. Pravděpodobnost, že tyto molekuly (a tedy genetická informace, kterou obsahují) bude přenesena na mikroorganizmus a stabilně se udrží je velmi omezena.

Vektory podle vynálezu, také popsané miniplazmidy z důvodu jejich kruhové struktury, jejich snížené velikosti a jejich silně svinuté formy představují dostatečné následující výhody: Z důvodu jejich snížené velikosti vzhledem k plazmidům odvozeným od ColEl klasicky použitých, molekuly DNA podle vynálezu mají potencielně lepší biopoužitelnost in vivo. Představují zvýšenou schopnost penetrace a buněčného roznášení rozdělování. Je známo, že difúzní koeficient do tkání není přímo úměrný k molekulové hmotnosti (Jain, 1987). Zrovna tak na buněčné úrovni, molekuly vysoké molekulové hmotnosti mají alespoň dobrou permeabilitu k přechodu plazmidové membrány. Mimoto pro přechod plazmidu k jádru nezávisle na jeho expresi, zvýšená molekulová hmotnost je také nevýhodou, nukleární póry, prosazují limitu velikosti pro difúzi k jádru (Landford et al., 1986). Redukce velikosti neterapeutické složky molekuly DNA (zejména počátek replikace a selektovaný gen) podle vynálezu umožňje také snížit velikost molekul DNA. Složka umožňující replikaci a selekci tohoto plazmidu u bakterií (1,1 kb) je snížena faktorem 3 tím, že zhustí například 3 kb pro počátek replikace a markér rezistence vektorové složky. Toto snížení (i) molekulové hmotnosti a (ii) negativního náboje, dává molekulám vynálezu zvýšené schopnosti difúze a tkáňové bioschopnosti buněčné a nukleární.

Předložený vynález se týká molekuly kruhové DNA, použité v genové terapii, obsahující alespoň nukleovou • · · · • ·

sekvenci zájmu vyznačenou tím, že oblast, která umožňuje jeho replikaci obsahuje počátek replikace, jehož funkce v hostitelské buňce vyžaduje přítomnost alespoň specifického proteinu, který se netýká výše uvedené hostitelské buňky.

Tato molekula DNA se může vyjádřit ve formě jedno nebo dvouvláknové a výhodně zaujímá silně svinutou formu.

Ve smyslu předloženého vynálezu, hostitelské buňky mohou být různého původu. Může se jednat o buňky eukaryontní nebo prokaryontni. Podle upřednostněného způsobu provedeni vynálezu se může jednat o buňky eukaryontní.

Replikace bakteriálních plazmidů vyžaduje alespoň přítomnost proteinu kódovaného hostitelskou buňkou typu RNA polymerasa, Rnasa, DNA polymerasa... Z těchto důvodů již dříve naznačených se nemůže úplně vyloučit, s tímto typem replikace, případné nebezpečí rozmnožení v léčeném organizmu. Funkce počátku replikace molekuly DNA podle vynálezu požaduje přítomnost proteinové sekvence netýkající se hostitelské buňky. Tato charakteristika redukuje spektra hostitele nárokovaného plazmidů specifického kmenu, který exprimuje tento iniciační protein. Molekula DNA v rámci předloženého vynálezu má tedy výhodně počátek replikace tzv. podmínečný.

Počátek replikační podmínečný podle předloženého vynálezu může pocházet z plazmidů nebo bakteriofágů, které sdílejí následující vlastnosti: obsahují ve svém počátku replikace opakované sekvence intronů a kódují alespoň iniciační protein replikace (Rep), který je specifický. Z tohoto titulu se mohou například citovat systémy podmínečné replikace následujících plazmidů a bakteriofágů:

····

plazmid nebo bakteriofág	specifický iniciační protein
RK2 (Stalker et al., 1981)	Trf A
R1 (Ryder et al., 1981)	Rep A
pSCIOl (Vocke and Bastia, 1983)	Rep A
F (Murotsu et al., 1981)	protein E
Rtsl (Itoh et al., 1982, 1987)	Rep A
RSF1010 (Miao et al., 1995)	Rep C
PÍ (Ábeles et al., 1984)	Rep A
P4 (Flensburg and Calendar, 1987)	protein alfa
lambda (Moore et al., 1981)	protein 0
phi 82 (Moore et al., 1981)	protein 0 phi 82
phi 80	protein 0 phi 80

Podle upřednostněného způsobu provedeni vynálezu vznik replikace v nárokovaných molekulách DNA pochází z přírodního plazmidu E. coli nazvaného R6K.

Replikační funkce R6K jsou seskupeny do fragmentu 5,5 kpb DNA (Obrázek 1), který obsahuje tři původce replikace a, β a γ (γ a β zajišťují 90% replikace) a operon kódující iniciační protein replikace π a protein Bis. Minimální nezbytná genetická informace k udržení tohoto plazmidu a jeho počtu charakteristických kopií (15 kopií na genom) je obsažena ve dvou elementech: 4 00 pbd ori γ a gen pír, jehož produkt je iniciační protein π.

Ori γ může být rozdělen na dvě funkční části: střední část a aktivační element (Obrázek 1) . Střední část, zejména pro replikaci obsahuje introny (7 přímých repeticí 22 pdb), kde se váže protein π vyjádřený SEQ ID N°1 a segmenty, které • · · • · stoji vedle sebe, cílové hostitelské proteiny (IHF, DnaA).

Podle upřednostňovaného způsobu vynálezu, počátek replikace nárokovaného vektoru je zachován úplně nebo částečně počátkem replikace γ plazmidu R6k a zejména úplně nebo částečně SEQ ID N°1 nebo jedním z jeho derivátů.

Ve smyslu předloženého vynálezu termín odvozený znáči všechny sekvence, které se liší od požadované sekvence z důvodu degenerace genetického kódu získaného jednou nebo vice modifikacemi genetické povahy nebo/a chemické povahy, stejně jako všechny sekvence, které hybriduji se těmito sekvencemi nebo fragmenty těchto sekvencí, a jejichž produkt má naznačenou aktivitu iniciačního proteinu replikace π. Modifikací genetické povahy nebo/a povahy chemické se mohou očekávat všechny mutace, substituce, delece, adice nebo/a modifikace jednoho nebo více reziduí. Termín odvozený zahrnuje také obecné sekvence a požadované sekvence, pocházející z jiných buněčných zdrojů, zejména z buněk lidského původu nebo z jiných organizmů a, které mají aktivitu stejného typu. Takovéto obecné sekvence mohou být získány hybridizačními pokusy. Hybridizace může být provedena z bank nukleových kyselin za použití jako sondy původní sekvence nebo fragmentu této sekvence za striktně dojednaných podmínek (Maniatis et al., viz všeobecné techniky molekulární biologie) nebo za podmínek striktně zvýšených.

Počátek eplikace, popsán dále, který představuje výhodu, že má velikost velmi omezenou je jedinečně funkční v přítomnosti specifického iniciačního proteinu, proteinu Pi, produktu genu pir (SEQ ID N°2). Tento protein, který může působit na trans je možné fyzikálně disociovat ori gamma genu pir, který by mohl být vložen do genomu buňky vybrané jako specifická hostitelská buňka tohoto plazmidu. Mutace v π mohou porušit jeho iniciační funkce (Inuzuka et Wada, 1985) a unést zvýšení počtu kopií odvozených od R6K až do desetinásobného počtu počátečních kopií. Tyto substituce jsou • ·· · • · · · všechny zahrnuty v doméně čtyřiceti aminokyselin, které se tak zdají odpovědné za řízeni π počtu plazmidových kopií (Obrázek 2).

Podle způsobu provedení předloženého vynálezu protein π, exprimovaný v hostitelské buňce, vyplývá z exprese genu vyjádřeného SEQ ID N°2 nebo jednoho z jeho derivátů, takových jaké byly již dříve definované, zejména genu pir 116, který obsahuje mutaci vzhledem ke genu pir. Tato mutace odpovídá substituci prolinu leucinem. V této souvislosti počet kopií odvozených od R6K je v rozmezí okolo 250 kopií na genom.

Kromě podmínečného počátku replikace tak, jak již bylo dříve definováno, nárokované molekuly DNA obsahují oblast obsahující jeden nebo více genů umožňující zajistit selekci molekuly DNA u vybraného hostitele.

Může rezistenci ampicilin, lividomycin se jednat o klasické markéry typu genu udělující antibiotikům, k

chloramfenikol, nebo jiné.

takovým jako jsou kanamycin, streptomycin, spectinomycin,

Podle vynálezu rezistenci produkt je upřednostňovaného tato oblast je k antibiotikům, nezávislý k provedení od genu jednat o způsobu odlišná Může se životaschopnosti hostitele za definovaných kultivačních podmínek, například:

předloženého uděluj ícího gen, jehož rozmnoženého Může to být

-gen kódující supresorovou tRNA, přírodního nebo syntetického původu. Může se jednat zejména o tRNA kodonu amber (TAG).

-gen, jehož produkt je nezbytný pro metabolizmus buňky, za určitých kultivačních podmínek: gen zasahuje do biosyntézy metabolitu (aminokyselina, vitamín...), gen katabolizmu umožňující asimilovat látky přítomné v kultivačním médiu (zdroj dusíku nebo uhlíku)...

• ·· ·

9» ····

Podle upřednostňovaného způsobu provedeni předloženého vynálezu tato oblast obsahuje kazetu exprese genu kódujícího supresorovou tRNA specifických kodonů. Tato kyselina může být zejména vybrána mezi kyselinami kódujícími base Phenylalaninu, Cysteinu, Prolinu, Alaninu a Histidinu. Jedná se zejména o supresorovou tRNA kodonů amber (TAG).

Zejména v tomto případě systém použitý pro selekci, u hostitelských buněk, molekul DNA podléhajících předloženému vynálezu obsahuje dva elementy:

1) na molekule DNA gen kódující RNA supresorového transferu kodonů amber (TAG), který se skládá z markéru selekce, řečeného genu (sup)

2) specifický hostitel, jehož jeden z genů zejména za určitých podmínek kultivace, obsahuje kodon amber Tag. Tato buňka by mohla růst za kultivačních podmínek, pro které produkt genu obsahujícího kodon TAG je podstatný, pouze jestliže plazmid umožňující expresi sup je přítomný v buňce. Kultivační podmínky tvoří tak tlak selekce molekuly DNA. Použité geny sup mohou být přírodního původu (Glass et al., 1982) nebo mohou pocházet ze syntetické konstrukce (Normanly et al., 1986, Kleina et al., 1990).

Takovýto systém nabízí velkou flexibilitu do té míry, že podle genu zahrnujícího mutaci amberu, je možné určit různá vybraná média. U bakterie Lactococcus lactis, například kodon amber je umístěn v genu biosyntézy purinů. To umožňuje selekci plazmidu nositele genu kódujícího supresorovou tRNA když se bakterie rozmnožují v mléce. Takový markér má výhodu, že může být velikosti velmi malé a výhodu, že neobsahuje cizí sekvence pocházející z fágu nebo transpozonů.

Podle upřednostňovaného způsobu provedení předloženého vynálezu molekula DNA obsahuje mimoto fragment DNA, regiospecifický cíl rekombináz, který umožňuje uvolnění ···· ···♦· plazmidových multimerů.

Jeden takový fragment včleněný na molekule kruhové DNA, a jehož počátek replikace je například ori γ umožňující upevnit multimery takovéhoto plazmidu. Takovéto multimary jsou zejména pozorovány, když molekula DNA je připravena z kmenu nesoucího mutovanou alelu pír, která umožni rozmnožit počet kopií derivátů R6K, jako je pir-116.

Tato rekombinace může být provedena díky různým systémům, které způsobuji regiospecifickou rekombinaci mezi sekvencemi. Regiospecifická rekombinace vynálezu je získána prostřednictvím sekvencí intramolekulární specifické rekombinace, přítomnosti rekombinázy.

které jsou schopné rekombinovat mezi sebou v specifických proteinů, všeobecně označených

V tomto přesně stanoveném případě se jedná o rekombinázy XerC a XerD. Z tohoto důvodu molekuly DNA podle vynálezu zahrnují všeobecně mimoto sekvenci dovolující tuto stereospecifickou rekombinaci. Specifický rekombinační systém přítomný v genetických konstrukcích podle vynálezu (rekombinázy a místo specifického rozpoznání) mohou být různého původu. Zejména specifické sekvence a použité rekombinázy mohou náležet k různým strukturním třídám a zejména k rodině rezolvázy transpozonu Tn3_ nebo k rodině integrázy bakteriofága lambda. Mezi rekombinázy náležející k rodině transpozonu Tn3 se mohou citovat zejména rzsolváza transpozonu Tn3 nebo transpozonů Tn21 a Tn522 (Stark et al., 1992), invertázy Gin bakteriofága mu nebo také rezolvázy plazmidů takových, jako rezolváza fragmentu par RP4 (Abert et al., Mol. Microbiol. 12 (1994) 131). Mezi rekombinázy náležející k rodině integrázy bakteriofága λ, se mohou citovat zejména integrázy fágu λ (Landy et al., Science 197 (1977) 1147), P22 a φ80 (Leong et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468), HP1 Haemophilus influenzae (Hauser et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 6859), integráza Cre fágu Pl, integráza plazmidu pSAM2 (EP 350 341) nebo také FLP • · · · • · to to to to • to • · · · · ·· ···· · ··· ···· ··· ··· toto ·· toto ·· ·· rekombináza plazmidu 2μ a rekombinázy XerC a XerD E. coli.

Molekuly DNA, předměty předloženého vynálezu, obsahuji fragment cer přírodního plazmidu E. coli ColEl. Použitý fragmet cer je fragment Hpall 382 pdb ColEl, o kterém bylo ukázáno, že umožňuje, v cis, rozděleni multimerů plazmidu (Summers et al., 1984, Leung et al., 1985). Je také možné použít fragment Hpall-Taql menší velikosti (280 pdb) nebo fragment ještě menši (okolo 220 pdb), zahrnutý do fragmentu Hpall, který má stejné vlastnosti (Summers and Sherratt, 1988). Toto rozděleni prochází specifickou intramolekulární rekombinací, která zasahuje čtyři proteiny kódované genomem E. coli: ArgR, RepA, XerC a XerD (Stirling et al., 1988, 1989, Colloms et al., 1990, Blakely et al., 1993).

Z tohoto titulu je zejména výhodné použít celek nebo část fragmentu cer ColEl nebo jeden z jeho derivátů, takových jaké jsou již dříve definovány.

Podle prokázané varianty molekuly DNA vynálezu mohou obsahovat mimoto sekvenci schopnou specificky interagovat s ligandem. V upřednostňovaném způsobu se může jednat o sekvenci schopnou tvořit hybridací triplex se specifickým oligonukleotidem. Tato sekvence dovoluje tak purifikovat molekuly vynálezu selektivní hybridací s zmobilizovaným komplementárním oligonukleotidem na nosiči (viz přihláška vynálezu WO96/18744). Sekvence může být umístěna v každém místě molekuly DNA vynálezu tím okamžikem neurčuje funkci genu zájmu a počátku replikace.

Co se týče reprezentativní molekuly DNA předloženého vynálezu může se především nárokovat plazmid pXL2774 a jeho deriváty. Ve smyslu předloženého vynálezu se chápe derivát jako všechny konstrukce odvozené od pXL2774 a obsahující jeden nebo více genů zájmu jiných než luciferasový gen. Mohou se také citovat plazmidy pXL3029 a 3030 obsahující kazetu exprese terapeutického genu a sekvenci schopnou specificky • · · · interagovat s ligandem.

Předložený vynález se také týká metody konstrukcí specifických hostitelských buněk, zejména účinných pro tvorbu těchto terapeutických molekul DNA.

Jiný předmět předloženého vynálezu se týká metody tvorby kruhové molekuly DNA vyznačené tím, že se kultivuje hiostitelská buňka obsahující alespoň molekulu DNA takovou jaká je již dříve definovaná a protein exprimovaný in šitu nebo neexprimovaný, počátek replikace podmínečně účinný uvedené molekuly DNA specifické netýkající se výše uvedené hostitelské buňky za podmínek umožňujících selekci hostitelských buněk transformovaných výše uvedenými molekulami DNA.

Protein podmínečně funkční počátku replikace molekuly DNA je exprimován in šitu od odpovídajícího genu. Gen kódující iniciační protein replikace může být nesen vedlejším replikonem, kompatibilním s deriváty počátku replikace podmíněně použitého nebo může být začleněn do genomu hostitelské buňky rekombinací díky transpozónu, bakteriofágu nebo každým jiným vektorem. Zejména v tomto případě, kde gen exprimujíci protein je umístěn na vedlejším replikonu, tento replikon obsahuje zejména oblast promotoru transkripce funkční v buňce, stejně jako oblast umístěnou na 3'a která určuje signál ukončeni transkripce. Co se týče oblasti promotoru může se jednat o oblast promotoru i přirozeně odpovědnou za expresi zkoumaného genu, když tato je schopná fungovat v buňce. Může se také jednat o oblasti různých původů (odpovědných za expresi dalších proteinů nebo stejných syntetických). Může se zejména jednat o sekvence promotorů genů prokaryontů nebo bakteriofágů. Například se může jednat o sekvence promotorů vzešlých z genomu buňky.

Co se týče genů kódujících iniciační protein replikace mohly by být použity buď divoké geny, nebo mutované alely • · · · • · · · • · umožňující získat zvýšený počet kopií specifických plazmidů (nebo derivátů) iniciačního proteinu podmiňující funkci počátku replikace uvedeného v molekule DNA.

Byly popsány tito mutanti pro palzmidy R6K (Inuzuka an Wada, 1985, Greener et al., 1990), Rtsl (Terawaki and Itoh, 1985, Terawaki et al., 1990, Zeng et al., 1990), F (Seelke et al., 1982, Helsberg et al., 1985, Kawasaki et al., 1991), RK2 (Durland et al., 1990, Haugan et al., 1992, 1995), pSCIOl (Xia et al., 1991, Goebel et al., 1991, Fang et al., 1993).

V případě, že molekula DNA má počátek replikace odvozující od plazmidů R6K, protein iniciátoru je odvozený od proteinu π tohoto plazmidů. Je především výhodné exprimovat mutovanou formu tohoto proteinu schopného zvýšit zejména počet počátečních kopií. Proto integrovaný gen na úrovni hostitelské buňky je přednostně vyjádřený celkem nebo částí sekvence vyjádřené SEQ ID N°2 nebojedním z jeho derivátů, zejména genem pirll6. Spojené mutace odpovídají substituci prolinu leucinem. Podle upřednostňovaného způsobu provedení vynálezu tento gen pirll6 je přímo začleněn do genomu hostitelské buňky.

Jeden z genů specifické hostitelské buňky, nezávislý na podmínkách vybrané kultivace obsahuje specifický kodon rozpoznatelný supresorovou tRNA vybranou na úrovni molekuly DNA. Podle upřednostňovaného způsobu provedení vynálezu se může jednat o kodon amber TAG. V tomto případě buňka by mohla růst v kultivačních podmínkách, pro které produkt genu obsahující kodon TAG je esencielní, jedinečně, jestliže si plazmid umožňující expresi sup je přítomný v hostitelské buňce. Kultivační podmínky zahrnují tak tlak selekce molekuly DNA.

Gen obsahující kodon amber je gen účinkující v biosyntéze aminokyseliny argininu. Tento gen argE, kóduje N-acetylornithinasu (Meinnel et al., 1992) a obsahuje v tom • ·· · ···· • · · ·· · · · · · • · · · · · · ·· • · * · · ·· ···· · • · · · · · · · · e • · · ·· ·· ·· ·· «· případě kodon TAG odpovídající bodové mutaci Gln-53 (CAG)->TAG; tlak selekce plazmidu nesoucího gen supjea tedy zajištěný kultivačním minimálním médiem M9 (Maniatis et al., 1989). Tentokrát by to mohl být také například gen biosyntézy vitaminu, nukleové base nebo také gen umožňující použít zdroj uhlíku nebo dusíku nebo každý jiný gen, jehož funkce je nezávislá na životaschopnosti buněk za vybraných kultivačních podmínek.

Hostitelská buňka je přednostně vybrána mezi kmeny E. coli a reprezentovaná zejména kmenem E. coli XAC-1.

Podle upřednostňovaného způsobu provedení vynálezu hostitelská buňka v nárokované metodě je buňka kmene E. coli XAC-1, obsahující ve svém genomu gen pír 116 a transformovaná plazmidem pXL2774 nebo jedním z jeho derivátů.

Podle varianty vynálezu hostitelská buňka v nárokované metodě je buňka prokaryontní ve které gen endAl nebo obecný gen je inaktivní. Gen endA kóduje endonukleasu I E. coli. Tento periplazmatický enzym má aktivitu přerušení nespecifické dvouvláknové DNA (Lehman, I. R., G. G. Roussos and E. A. Pratt (1962) J. Biol. Chem. 237: 819-828, Wright M. (1971( J. Bacteriol. 107: 87-94). Studie provedená na různých kmenech Escherichia coli (divokých nebo endA) ukázala, že degradace plazmidové DNA inkubované v extraktech těchto bakteriálních kmenů existuje v kmeni endA+, ale ne v mutantech endA (Wnendt S. (1994) BioTechniques 17: 270-272). Množství plazmidové DNA izolované z kmenů endA+ nebo mutantů endA bylo studováno společností Promega za použití jejich purifikačního systému (Shoenfeld, T., J. Mendez, D. Stors, E. Portman, B. Patterson, J. Frederiksen and C. Smith 1995. Effects of bacterial strains carrying the endAl genotype on DNA quality isolated with Wizard plazmid purification systems. Promega notes 53). Jejich závěr je následující: Množství DNA připravené od mutantu endA je celkově lepší než množství DNA připravené z testovaných kmenů endA+.

Jakost příprav plazmidové DNA je tedy určena každou kontaminaci těmito endonukleasami (degradace DNA ve více nebo méně dlouhé době).

Delece nebo mutace genu může být uvažována do té míry bezproblémová neboli mutanti už nepředstavující tuto endonukleasovou aktivitu se chovají úplně jako divoké bakterie (Durwald, H. and H. Hoffman-Berling (1968) J. Mol. Biol. 34: 331-346) .

Gen endAl může být inaktivován mutací, delece úplnou nebo částečnou, přerušením, atd. Inaktivace genu endA kmene E. coli vybraného pro tvorbu plazmidů pCOR může být provedena tím, že přenese díky bakteriofágu Pl, deleci AendA::Tcpopsanou Cherepanovem a Wackernagelem (Cherepanov, P. R. and Wackernagel. 1995). Gen disruption in Escherichia coli: Tc^R and Km^R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibioti resistance determinant. Gene 158: 9-14) nebo tím, že vymění divoké alely přítomné v genomu bakterie zájmu s mutovanou alelou nebo deletovanou endA a to obecnou rekombinací. Použití tohoto typu kmenu v rámci předloženého vynálezu výhodně umožňuje zvýšit kvalitu produkované DNA.

Vynález se také týká každé rekombinantní buňky obsahující molekulu DNA, takovou jaká již byla definována. Může se jednat zejména o buňky různého původu, typu eukaryotního, prokaryontního...

Tyto buňky jsou získávány všemi odborníky známými technikami umožňujícími vložit uvedený plazmid do určité buňky. Může se zejména jednat o transformaci, elektroporaci, konjugaci, fúzi protoplastů nebo o jiné další odborníky známé techniky.

Molekuly DNA podle vynálezu mohou být použity ve všech aplikacích vakcinačních nebo v genové terapii a buněčné • ·· · terapii pro přenos genu do organizmu, tkáně nebo určité buňky nebo pro produkci rekombinantních proteinů in vitro.

Mohou být použity pro přímé podávání in vivo nebo pro modifikaci buněk in vitro nebo ex vivo z pohledu jejich implantace pacientu.

Z tohoto ohledu další předmět vynálezu se týká všech farmaceutických kompozic obsahujících alespoň molekulu DNA takovou jaká byla již dříve definovaná. Tato molekula může nebo nemusí tam být spojená s chemickým vektorem nebo/a biochemickým vektorem transfekce. Může se jednat zejména o kationty (fosforečnan vápenatý, DEAE-dextran...) o lipozomy. Spojené syntetické vektory mohou být lipidy nebo kationické polymery. Může se zejména citovat jako příklad takovýto vektorů DOGS (Transfectam TM) nebo DOTMA (lipofectin TM).

Farmacuetické kompozice podle vynálezu mohou být formulovány z pohledu podávání a to jako topikálně, orálně, parenterálně, intranasálně, intravenózně, intramuskulárně, podkožně, intraokulárně, transdermikálně atd. Nárokovaný plazmid je zejména použit ve formě injektovatelné nebo v aplikaci. Může to být směs každého farmaceuticky akceptovatelného vehikulum pro injektovatelnou formulaci, zejména pro přímou injekci na úrovni místa k ošetření. Může se jednat zejména o sterilní roztoky, izotonické roztoky nebo suché kompozice, zejména lyofilizované, které po přidání, podle případu, sterilované vody nebo fyziologického séra umožňují injektovatelnou formu. Může se jednat zejména o pufry Tris nebo PBS, ve kterém je rozpuštěna glukosa nebo chlorid sodný. Přímá injekce v postižené oblasti pacienta je zajímavá, protože umožňuje soustředit terapeutucký účinek na úrovni postižené tkáně. Použitá dávka může být přizpůsobena funkci různých parametrů zejména funkci genu, vektoru, způsobu použitého podávání, patologie nebo také doby hledaného léčeni.

EST • · · ·

Molekuly DNA vynálezu mohou obsahovat jeden nebo více genů zájmu, totiž jednu nebo vice nukleových kyselin (cDNA, gDNA, syntetickou nabo semisyntetickou DNA, atd), jejichž transkripce a případně taranslace v cílové buňce vytváří produkty, které mají terapeutický, vakcinální, agronomický nebo veterinární význam.

Mezi geny terapeutického zájmu se mohou uvést zejména geny kódující enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny, interleukiny, interferony, TNF atd. (FR.9203120) růstové faktoty, neuropřenašeče nebo jejich prekurzory nebo enzymy syntézy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, a FGF, BFGF, NT3, NT5 atd. apolipoproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE atd. (FR 93 05125), dystrofin nebo minidystrofin (FR 9111947), supresorové geny nádorů: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, atd (FR 9304745), geny kódující faktory zahrnuté do koagulace: Faktora VII, VIII, IX atd., sebevražedné geny: Thyamidin kinasa, cytosin deaminasa atd: nebo také celek nebo část přírodního nebo umělého imunoglobinu (Fab, ScFv atd), ligand RNA (WO91/19813) atd. Terapeutický gen může také být gen nebo antimediátorová sekvence, jehož nebo jejíž exprese v cílové buňce umožňuje řízení exprese genů nebo transkripci buněčné mRNA. Takovéto sekvence mohou být například transkribované v cílové buňce, RNA komplementární buněčné mRNA, a mohou blokovat jejich translaci v proteinu, podle technik popsaných v EP 140 308.

Gen zájmu může také být vakcinový gen, totiž gen kódující antigenový peptid schopný vytvářet u lidí nebo zvířat imunitní odpověď z pohledu realizace vakcin. Může se jednat zejména o specifické antigenní peptidy viru Epstein-Baarové, viru HIV, viru hepatitidy B (EP 185 573), viru pseudovstekliny nebo také virů specifických nádorů (EP 259 212).

V molekulách DNA vynálezu gen terapetického, vakcinálního, agronomického nebo veterinárního významu • ···· ·· ···· ·· ·· ·· 9 9 9 9 · 9 9· • · · · * 9 999 • 9 9 9 9 9 9 999 99

9 9 9 9 9 9 9 99

9 99 9 9 9 9 9 99 9 obsahuje zejména oblast promotoru transkripčni funkce v buňce nebo v cílovém organizmu stejně jako oblast umístěnou na 3'konci, která určuje signál konce transkripce a místo polyadenylace. Co se týče oblasti promotoru může se jednat o oblast promotoru přirozeně odpovědnou za expresi požadovaného genu, když tento gen je schopný fungovat v buňce nebo organizmu. Může se také jednat o oblasti různého původu (odpovědné za expresi dalších proteinů nebo stejných syntetických). Může se zejména jednat o sekvence promotorů eukaryotnich genů nebo virových genů. Například se může jednat o sekvence promotorů vzešlých z genomu cílové buňky. Mezi eukaryontnimi promotory se může použit každý promotor nebo každá odvozená sekvence stimulující nebo potlačující transkripci genu specificky nebo nespcificky, induktivně nebo neinduktivně, silně nebo slabě. Může jednat zejména o promotory ubiquitinové (promotory genů HPRT, PGK, a-aktin, tubulin atd.), promotory středních vláken (promotor genů GFAP, desmin, vimentin, neurovlákna, keratin atd.) promotory terapeutických genů (například promotor genů MDR, CFTR, Faktor VIII, ApoAI atd.) specifický tkáňový promotor (promotor genu pyruvat-kinasy, vilinu, vazebného intestinálního proteinu na mastné kyseliny, α-aktin hladkého svalstva atd.) nebo také promotory odpovídající stimulům (receptor steroidních hormonů, receptor retinové kyseliny atd.). Může se také jednat o sekvence promotorů vzešlých z genomu viru, například promotory genů E1A a MLP adenoviru, raný promotor CMV nebo také promotor LTR RSV atd. Mimoto tyto oblasti mohou být modifikované adicií aktivační sekvence, regulací sekvence neboli umožňující expresi tkáňově specifickou nebo majoritní.

Jinak gen zájmu může také obsahovat signální sekvenci řídící produkt syntetizovaný v sekrečních prostředcích cílové buňky. Tato signální sekvence může být přírodní signální sekvence syntetického produktu, ale může se také jednat o každou jinou funkční signální sekvenci nebo o umělou signální ···· • · ··· · ·· 0 00 * · ♦ · · · 0 0 · · 0 0 0 · 0 0 9 ·0 9990·

090 9990>99

000 99 09 90 «009 sekvenci .

Podle genu zájmu, mulekuly DNA vynálezu mohou být použity pro léčení nebo prevenci počtu patologií, včetně genetických onemocnění (dystrofie, cystické atd.) neurodegenerativni nemocí (alzheimer, parkinson, ALS atd.) rakovin, patologií spojených s poruchami koagulace nebo dyslipoproteinemie a počtu patologií spojených s virovými infekcemi (hepatitidy, AIDS atd.) nebo patologií v oblastech agronomických a veterinárních atd.

Jinak se předložený vynález týká použití molekul DNA s podmínečnou replikací pro produkci rekombinantních proteinů. Bakterie mohou být použity pro tvorbu proteinů různých původů eukaryontů nebo prokaryontů. Mezi bakteriemi E. coli tvoří vybraný organizmus pro expresi heterologních genů vzhledem k jeho snadné manipulaci důležitý počet systémů exprese použitelných pro množství proteinů, které se mohou získat. Očekává se, že systém vynálezu je použitelný v dalších organizmech, a že trophizmus je určen povahou počátku replikace, jak je naznačeno dříve. Pro toto použití nukleová sekvence zájmu obsahuje kódovanou oblast pod řízením signálů exprese vybraného vhodného hostitele, zejména prokaryontního hostitele. Může se jednat například o promotory Plac, Ptrp, PT7, Ptrc, Ptač, PL, PR, sekvence Shine-Dalgarno atd. (to dohromady tvoří kazetu exprese). Sekvencí nukleové kyseliny zájmu může být každá sekvence kódující protein, který má význam v oblastech farmacie, agroalimentačních oblastech, v oblastech chemie nebo agrochemie. Může se jednat o strukturní gen, o komplementární sekvence DNA, o syntetické sekvence nebo semisyntetické atd.

Kazeta exprese může být začleněna na vektoru podmínečné replikace vynálezu, tvořící tedy vektor podmínečné replikace umožňující expresi proteinů zájmu u E. coli. Tento vektor představuje více výhod: žádné použití antibiotik pro selekci u bakterií (menší náklady, není nutná studie, co se týče ·· · ·· · přítomnosti antibiotik v konečném produktu odvozených produktů nulová pravděpodobnost (podmínečný definovaném vlastnosti rekombinantních proteinů.

počátek médiu. těchto potencionelně roznášeni replikace),

Uvedené podmínečných • o se týče co prakticky přírodě úplném výhodné tvorbu nebo toxických), plazmidu možná fermentace příklady ukazují vektorů pro ·· · •* 9 99·

Následující obrázky a příklady blíže ilustruji vynález, aniž by však v jakémkoliv směru omezovaly jeho rozsah.

Legenda k obrázkům

Obrázek 1: Funkční organizace oblasti R6K zahrnutého do replikace

Obrázek 2: Organizace funkční domény proteinu π plazmidu R6k

Obrázek 3: Znázorněni protokolu vloženi genu pir do genomu E. coli XAC1

Obrázek 4: Schéma konstrukce vektorů pXL2666, 2730 a

2754

Obrázek 5: Konstrukce pXL2774

Obrázek 6: Kinetika růstu a produkce ve dvoulitrovém fermentoru

Obrázek 7: Kinetika růstu a produkce ve fermentoru o obsahu 800 1

Obrázek 8: Konstrukce pXL3056

Obrázek 9: Zviditelněni proteinu aFGF produkovaného E. coli XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7poll23) po indukci. Buněčné extrakty úplně denaturované jsou umístěny na polyakrylamidovém gelu 12,5%-SDS. M: značeni molekulové hmotnosti (Biorad, Low range). Každý pruh je identifikován šipkou a číslem, které označuje jejich hmotnost v kDaltonech. 1: XAC-lpir-116 (pXL3056+pUC4K) neindukovaný, 2: XAC-lpir-116 (pXL3056+pUC4K) indukovaný 42°C, 3: XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7poll23) klon 1, neindikovaný, 4: XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7poll23) klon 1, indukovaný 42°C, 5: XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7po!123) klon 2, neindukovaný, 6: XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7poll23) klon 2, indikovaný 42°C, tl: 1 μς

44 4 * · 4 44 · • 4 · 4 4 · · 4 4 · • · · 4 4 4 4 4 4 • ··· 4 44 44444

444 444 4 444 • 44 44 44 4444 44 purifikovaného aFGF, t4: 4 μς purifikovaného aFGF

Obrázek 10: Schéma konstrukce vektorů pXL3029 a pXL3030

I-MATERIÁL A METODY

A) Materiál

1) Kultivační půda

Byla použita úplná půda LB, 2XTY a SO a minimální půda M9 (Maniatis et al., 1989). Gelózové půdy byly získány přídavkem 15 g agaru Difco. Tyto půdy byly doplněny antibiotiky, ampicilinem nebo kanamycinem v koncentracích 100 mg/1 ampicilinu a 50 mg / 1 kanamycinu. Chromogenni substráty X-Gal a X-Gluc byly použity v koncentraci 40 mg /1.

2) Kmeny E. coli, plazmidy a bakteriofágy

Použité kmeny E. coli, plazmidy a bakteriofágy jsou identifikované v následujících příkladech.

B) Metody

1) Zacházení s DNA

Izolace bakteriáni DNA (plazmidová, genomická) a fágové DNA (replikačni forma M13), digesce endonukleázami restrikce, vázání fragmentů DNA, elektroforéza na agarose (pufr TBE) a jiné standartní techniky byly provedeny podle doporučení dodavatelů pro použití enzymů nebo byly přizpůsobeny popsaným protokolům v Molecular Cloning: a Laboratory Manual (Maniatis et al., 1989).

Márkry velikosti použité DNA během elektroforézy jsou následující: stupnice měřítko Ikpb (BRL) pro lineární fragmenty a markér silně svinuté DNA (Stratagene) pro neřízené plazmidy.

• ··· • · · ·· ·

Sekvenování bylo provedeno podle Sangerovy techniky (Sanger et al., 1977) přizpůsobené automatizované metodě, která používá fluorescenční dideoxynukleotidy a Tag DNA-polymerasu (PRISM Ready Reaction DyeDideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems).

Použité oligodeoxynukleotidy (popsané seq+n°, viz dále) byly syntetizovány na syntetizátoru Applied Biosystems 394 DNA/RNA Synthetizer fosforamiditovou metodou používající chránící skupiny β-kyanoethyly (Sinha et al., 1984). Po syntéze byla chránící skupina odstraněna působením amoniaku. Dvě srážení butanolem umožňují purifikovat a koncentrovat oligonukleotid (Sawadogo et al., 1991).

Oligonukleotidové sekvence použité pro amplifikai PCR:

SEQ	ID N°3	5'
SEQ	ID N°4	5'
SEQ	ID N°5	5'
SEQ	ID N°6	5'

-GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3'

-GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3'

-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3'

-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3'

Reakce PCR (Saiji et al., 1985) byly provedeny za následujících podmínek ve 100 μΐ objemu. Reakční směs obsahovala 150 ng genomické DNA studovaného kmenu, 1 gg každého ze dvou oligonukleotidů (24-mer), 10 μΐ pufru 10XPCR, jehož složení bylo následující 500 mM KC1, 0,1% želatiny, 20 mM MgCl₂, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 a 2,5 jednote Taq DNA-polymerasy (Amplitaq Perkin-Elmer). Podmínky pro PCR na přístroji Perkin-Elmer Cetus DNA Therminal Cycler byly následující: 2 minuty při 91°C, 30 cyklů nepřetržité denaturace (1 minuta při 91°C), hybridace (2 minuty při 42°C) a elongace (3 minuty při 72°C) a konečně 5 minut při 72°C. Takto získané produkty, řízené nebo neřízené enzymem restrikce byly analyzovány elektroforézou na agarosovém gelu.

Analýza různých druhů plazmidů DNA topo-isomerasou byla provedena podle následujícího protokolu: Enzymy purifikované ···· v laboratoři se inkubovaly během jedné hodiny při teplotě 37°C. Reakční směsi (celkový objem 40 μΐ) měly následující složení: 150 ng plazmidu, 300 ng DNA-topoisomerasy I, nebo 150 ng DNA-gyrasy E. coli nebo 160 ng DNA-topoisomerasy IV S. aureus a 20 μΐ pufru specifického pro každý enzym. Složení pufrů je naznačeno dále:

pro DNA-topoisomerasu I: 50 mM Tris-HCl pH 7,7, 40 mM KC1, 1 mM DTT, 100 pg / ml SAB, 3 mM MgCl,, 1 mM EDTA, pro DNA-topoisomerasu IV: 60 mM Tris-HCl pH 7,7, 10 mM DTT, 100 μg / ml SAB, 6 mM MgCl₂, 1,5 mM ATP, 350 mM glutamát de potassium, pro DNA-gyrasu: 50 mM Tris-HCl pH 7,7, 5 mM DTT, 100 μα / ml SAB, 5 mM MgCl₂, 20 mM KC1.

2) Transformace E. coli

Transformace byla provedena běžně podle metody TSB (Transformation and Storage Buffer) popsané Chungem a Millerem (1988). Pro kmen jako je TG1 (Gibson et al., 1984) účinnost získané transformace se pohybuje v rozmezí 10^{3 * 5}-10^{6 *} transformantů na gg pUC4K (Vieira et Messing, 1982). Když bylo nezbytné zvýšit účinnost transformace, bakterie byly transformovány elektroporací podle doporučeného protokolu výrobce electroporátoru (Biorad). Tato metoda umožňuje dosáhnout účinnosti až 10⁸ až 10¹⁰ transformantů jedním gg pUC4K.

3) Buněčná transfekce kationickým lipefektantem

Použité buňky byly myší fibroblasty NIH 3T3 zaočkovány předchozí den na desky se 24 jamkami, denzity 50 000 buněk na jamku. Použité kultivační médium bylo medium DMEM, které obsahovalo 4,5 g / 1 glukosy, doplněno 200 mM glutaminu a

I»·*· ·· ··*· ·« *♦ • · · · • · ··

antibiotiky ( 5.10³ μς / ml streptomycinu, 5.10³ μς / ml penicilinu) (Gibco) . Plazmatická DNA (1 μς ve 25 μΐ 9% roztoku NaCl) byla přimíšena, objem / objem, k suspenzi lipofektantu. Byly testovány čtyři poměry náboj lipofektantu / náboj DNA, a to 0, 3, 6 a 9. Tyto poměry byly vypočítány, když se uvažovalo, že 1 μς plazmidové DNA nese 3,1 nmolů negativního náboje a že lipofektant obsahuje tři pozitivní náboje na molekulu. Po desetiminutovém kontaktu, který umožňuje tvorbu komplexu DNA / lipid, 50 μΐ směsi DNA-lipofektant byl vložen na buňky v kultivačním médiu bez séra (500 μΐ). Buňky byly předem dvakrát proúláchnuty stejným médiem. Tak bylo zabráněno inhibici transfekce sérem. Po inkubaci (2 hodiny při teplotě 37°C v inkubátoru za přítomnosti CO₂) bylo přidáno 10% séra z telecích jater. Buňky byly potom opět umístěny k inkubaci po dobu 24 hodin.

4) Měření aktivity luciferasy eukariontních buněk

Měřeni bylo provedeno 24 hodin po transfekci. Luciferasa katalyzuje oxidaci luciferinu v přítomnosti DNA, Mg²⁺ a 0₂ za současného vzniku fotonu. Úplná emise světla je měřena luminometrem a je úměrná aktivitě luciferasy ve vzorku. Použité reagenty pocházejí od firmy Promega (Luciferase assay systém) a jsou použity podle doporučeného protokolu. Po lize buněk, nerozpustné frakce každého extraktu bala odděleny odstřeďováním. Dávkování bylo provedeno na 5 μΐ supernatantu zředěném nebo nezředěném v pufru pro lýzu buněk.

3) Měření proteinové koncentrace buněčného extraktu

Měřeni bylo provedeno podle metody BCA (Pierce) (Wiechelman et al., 1988). Etalon stupnice SAB byl vypracován v pufru pro lýzu (viz III-B-4). Dávky vzorků a jejich stupnice byly předem zpracovány, objem / objem s

9999 jodoacetamidem 0,1 / pufr Tris 0,1 M, pH 8,2 během jedné hodiny při teplotě 37°C. Toto zpracováni umožňuje vyhnout se poruchám během dávky redukčního agenta (DTT) přítomného v pofru k lýze. Odečet dávky se provádí při 562 nm.

PŘÍKLAD 1:

Konstrukce hostitelského kmenu XAC-lpir a pir-116 obecnou rekombinaci

Použitý kmen je kmen E. coli XAC-1 (Normanly et al., 1980). Výhodně gen argE tohoto kmenu obsahuje mutaci Glutamin-53 (CAG) v kodonů amber (TAG) (Meinnel et al., 1992). Gen argE patří k odlišnému operonu argECBH a kóduje enzym N-acetylornithinasu biosyntézy argininu. XAC-1 nemůže tedy syntetizovat arginin a tudíž se vyvíjí v minimální půdě. Tato auxotrofie bude odstraněna, jestliže kmen kryje plazmid, který umožňuje expresi tRNA supresoru. Bude tedy možné, kultivací v mininálnim médiu, vybrat bakterie, které nesou takovýto plazmid. Aby tam umožnil replikaci plazmidů odvozených od R6K, bylo nezbytné vložit, obecnou rekombinaci, gen pir do genomu XAC-1. Gen pir (divoký nebo mutovaný) je vložen do uidA výměnou mezi divokým genem uidA a přerušenou kopií genem pir (nebo pir-116). Gen uidA kóduje β-glukuronidasu, enzym hydrolýzy β-glukuronidů. Tento gen může být inaktivován bez problémů, protože není podstatný pro růst v prostředí klasické syntézy, ve které β-glukuronidy nejsou použity. Aktivita β-glukuronidasy může být soustavná díky chromogennímu substrátu, X-Gluc, jehož hydrolýza uvolňuje modré barvivo.

1) Konstrukce sebevražedného vektoru nesoucího kazetu Km^R-uidA::pir (nebo pir-116)

Byla použita strategie, která zahrnuje jednu • · ·· • · · · • · · · · ···· • · · · · · · · · · · · ··· ···· · * · ··· ·· ·» ·· ·· ·· hostitelskou bakterii a která minimalizuje modifikace genomu kmenu zájmu. Fág M14mpl0 (Messing et Vieira, 1982) byl použit jako sebevražedný vektor (Blum et al., 1989). Mutace ambře v genu II, podstatném pro replikaci, snižuje spektrum hostitele tohoto fágu M13 v těchto kmenech, TG1 (supE), které produkují supresorovou tRNA amber, mohly by se tak replikovat v kmenech E. coli sup+, jako XAC-1.

Kazety BamHI 3,8 kpb, které obsahují rezistntní gen ke kanamycinu Tn5 a -uidA::pir nebo pir-116 byly purifikovány od M13wm34 (-uidA::pir) a 33 (pir-116) (Metcalf et al., 1994).

Byly klonovány v M13mpl0 linearizované BamHI. Rekombinantní klony byly vybrány rozložením na želatinové půdě LB + Km po elektroporaci ve TG1 spojovací směsi. Podoba klonů byla prokázána analýzou profilu restrikce a sekvenováním oblasti odpovídající mutaci pir-116.

2) Vložení pir nebo pir-116 do genomu E. coli XAC-1 obecnou rekombinací genů

Přijatá strategie a různé zahrnuté děje jsou uvedeny na Obrázku 3.

a) První děj rekombinace

Kmen XAC-1 byl transformován elektroporaci a 10, 100 nebo 2000 ng každého RF (mpl0-_uidA: :pir nebo pir-116) . Třetina každé směsi exprese byla rozložena na miskách LB, keré obsahovaly kanamycin a inkubována přes noc při teplotě 37°C. Fágy mpl0-_uidA::pir nebo pir-116 se nemohou replikovat v kmenu XAC-1 (sup+) . Značení Km^R se tak může udržet jen integrací do genomu bakterie, přes obecnou rekombinací s divokou kopií genu uidA. Získané výsledky elektroporace se pohybovaly od 4.10⁹ transformantů jedním pg pUC4K.

• · ··

Tabulka 1:

KONSTRUKCE	Počet získaných kolonií s množstvím transformované DNA
10 ng	100 ng	2000 ng
M13mplO-_uídA::pir	1	41	146
M13mpl0-_uídA::pir-116	0	16	124

V testovaných podmínkách počet integrantůstoupá nelineárně s množstvím DNA. Ze znalosti účinnosti transformace a velikosti RF (ll,7kpb)lze odhadnout přibližnou výši rekombinace. Když se uvažuje hmotnost 100 ng získá se frekvence rekombinace o řádu 10⁶.

d) Druhý děj rekombinace

Druhý děj rekombinace bude potom vybrán rezistencí kmenů k deoxycholátu (Doc^R) .

Pro toto provedení 5 integrantů každé konstrukce bylo položeno do kultivační půdy 2XTY s přídavkem 0,2% deoxycholátu sodnéhoByly pokázány dvě odlišné populace. Určité klony poskytují dobře viditelné poruchy po 8 hodin při teplotě 37°C (dva klony pro konstrukci pir a tři klony pro konstrukci pir-116}. Jiné klony daly hustou kulturu jen po kultivaci přes noc při teplotě 37°C. Jak se očekáválo byly skoro všechny Km^s. Pro každou studovanou elektroporaci bylo rýhováno 50 potomků KmS na LB přidané X-Gluc. Po 48 hodinách při teplotě 37°C klony UidA+ byly bleděmodré až, když ty, které podstupují nahrazení alel (případ n°l, Obrázek 3), zůstaly na tomto médiu (UidA-) bílé. Tabulka shrnuje analýzu fenotypů rekombinace dvojnásobně získané. Nahrazení alely podstoupili dvojnásobní rekombinanti (od 18 do 30%) .

• ··♦

Tabulka 2:

kmen	počet Kms mezi DocR	% UidA' mezi Kms
XAC-1 pir-2	50/50	18
XAC-1 pir-3	50/50	24
XAC-1 pir-4	50/50	34
XAC-1 pár-116-1	50/50	32
XAC-1 pir-116'-4	35/50	30

3) Kontrola charakteru Pir+ rekombinaci získaných kmenů

Za účelem přesvědčení se o charakteru Pir+ získaných kmenů dvojnásobnou rekombinaci, byly tři klony každé konstrukce transformovány pBW30 (metcalf et al., 1994). Získání transformantů pro všechny testované klony umožnilo ukázat funkci genů pír a pir-116 začleněných do genomu XAC-1. Za stejných podmínek nebyl získán žádný transformant s rodičovským kmenem XAC-1. Byla sledována studie dvou klonů XAC-lpir (B a C) a dvou klonů XAC-lpir-116 (E a D) .

4) Kontrola amplifikací PCR kmenů získaných rekombinaci

Pro potvrzení nahrazení alely byla provedena kontrola amplifikací PCR genomických oblastí a uidA. Každá dvojice oligonukleotidů byla tvořena jedním oligonukletidem odpovídajícím interní oblasti pír a druhým oligonukleotidem odpovídajícím oblasti blízké chromozomální uidA, ale nezahrnutého do fragmentu, který sloužil k rekombinaci. Sekvence tohoto posledně jmenovaného oligonukleotidu byla určena díky sekvenci ECOUIDAA Genbank (přístupové číslo: M14641). Mohla se tak ověřit přesná pozice genu pír v genomu bakterie. Povaha amplifikováných fragmentů, jejichž velikost je souhlasná s velikostí, kterou lze předpovědět, byla ···· • · potvrzena digescí Mlul.

Příklad 2:

Konstrukce plazmidových vektorů odvozených od R6K, který nese markér selekce step Phe

Byly zkonstruovány vektory, které obsahují 1 ori γ R6K a gen rezistentní ke kanamycinu (pXL2666). Pozorováním multimerů pXL2666 v kmeni BW19610 (pir-116) 5 (Metcalf et al., 1993) se přistoupilo ke studii vlivu fragmentu cer ColEl na těmto fenoment. Potom byla představena na vektoru ori γ -Km^R-cer (pXL2730) kazeta exprese tRNA supresoru Penylalaninu (sup Phe). Tento vektor, pXL2760, slouží jako base ke konstrukci vektoru použitelného v genové terapii.

1) Konstrukce a analýza vektorů, které obsahují ori γ R6K a gen rezistentní ke kanamycinu

a) konstrukce

Do prvního plazmidu vytvořeného, pXL2666, je zahrnut rezistentní gen ke kanamycinu pocházejí od pUC4K (Vieira et messing, 1982) a počátek replikace obsažený ve fragmentu EcoRI-BamHI 417 pdb pocházejí ze sebevražedného vektoru pUT-T7pol (Herrero et al., 1990) (Obrázek 4). Přenos pXL2666 do kmenu BW19094 a 19610 (Metcalf et al., 1994) umožnil ukázat, že množství plazmidu je zvýšené ve kmeni pir-116 vzhledem ke stejnému plazmidu v kmeni pir. Analýza nedigerovaných plazmidů elektroforézou ukazuje, že toto zvýšení vede zároveň k objevení jakýchsi multimerirních fprem. Pravděpodobně tento jev je spojený s intermolekulárni rekombinaci mezi několikanásobnými kopiemi plazmidu. Také byl zkonstruován pXL2730 tím, že byl klonován na pXL2666 fragment cer přírodního plazmidu E. coli ColEl, u kterého bylo

	31	• 4 4 4 4 ♦ · 4 4 4 4 • · 4 4 4 4 • 9 · · · • ♦ « * 4 · · 4 4 4 · · 4 4 ··· ·· 9»	44 ·· • · · · • · ·· • · · 4 · 4 4 4 • 4 44
prokázáno,	že	umožňuj e	v cis	rozdělení dimerů	plazmidů
(Summers	and	Sherrat,	1984).	Použitý fragment	odpovídá
fragmentu	Hpall	382 pdb	ColEl (Leung et al., 1985).	Obsahuje

specifické místo intramolekulární rekombinace, jedinečně zahrnuje, aby byl funkční, proteiny hostitele, jejichž rekombinázy jsou XerC a XerD a vedlejší faktory jsou ArgR a PepA (Stirling et al., 1988, 1989, Colloms et al., 1990). Po zajištění, aby pozorovaný účinek byl porovnatelný díky fragmentu cer, byl zkonstruován také kontrolní plazmid pXL2754, ve kterém fragment cer byl deletován 165 pdb. Tato delece ukázala, že došlo k jako potlačení účinku cer na rozlišení multimerů (Leung et al., 1985). Různé etapy klonování, které vedou ke konstrukci těchto plazmidů jsou uvedeny na Obrázku 4.

b) Kvantitativní a kvalitativní analýza druhů plazmidů *analýza elektroforeticky na agarosovém gelu prokázání použitých porovnána (BW19094), ve formě odpovídáj i potvrzení pXL2730.

Analýza různých různých plazmidových kmenů. Velikost zkonstruovaných druhů, nedigerovaných silně

2754 a svinuté. 2730 jsou každým plazmidů umožnila rozdílných plazmidů V kmeni podle byla pir zcela prakticky hlavním pruhem vzhledem k DNA plazmidy pXL2666, monomerní. Pruhy pod různým topoizomerům, nepatrně méně svinutým jako pozorovaného profilu po účinku DNA gyrasy s

V případě kmene pir-116 (BW19610) jsou profily různé: pozorují se s plazmidy pXL2666 a 2754 různé druhy, které jdou od monomerů k multimerům (2, 3 nebo 4 jednotky), majoritní forma byla dimér. Po digesci EcoRI, se znovu nachází jen lineární plazmidová DNA, tyto plazmidové druhy odpovídají buď multimerním plazmidům, nebo různým topoizomerům. Co se týče velikost forem určených předem markérem DNA silně svinuté, které byly produktem monomerního plazmidu, je silně pravděpodobné, že se jedná o multimery. Tvorbu multimerů lze velmi pravděpodobně přičíst mutaci pir-116, ačkoliv dva kmeny BW19094 a BW19610 nejsou striktně izogenní (BW19610 je recA). Získaný profil s pXL2730 je rozdílný: ačkoliv multimerní formy jsou ještě viditelné, majoritní forma je monomerní. Fragment cer může tedy ulehčit rozlišení plazmidových multimerů, které byly jsme zkonstruovány a to nezávisle na recA v BW19610.

*analýza po působení DNA topoisomeras

Za účelem popření hypotézy, podle které pozorované formy ve kmenech, které nesou alelu pir-116, budou zvláštními topoizomery, každá příprava plazmidu byla podrobená účinku DNA-topoisomeras. Aktivity různých enzymů, za experimentálních podmínek jsou následující: uvolnění DNA pro DNA-topoisomerasu I E. coli, silně svinutá negativní DNA uvolněn DNA-gyrasu E. coli a rozpletení spletené DNA a uvolnění DNA silně svinuté DNA-topoisomerasou IV S. aureus. Účinek DNA-topoisomerasy IV umožňuje ukázat, že plazmidová forma s vysokou molekulovou hmotností nevzniká ze spletení více molekul plazmidů, v tom případě, oni by tak byly konvertovány na monomerní druh. Funkce enzymu byla ovšem kontrolována podle přípravy DNA kinetoplastů složených z molekul DNA smotaných (neukázáno). Aktivita uvolnění je také viditelná, protože se získá druh migrující méně než v kontrole. Účinek DNA gyrasy umožnil přeměnit topo-isomery nepatrně uvolněné v druhu nejsvinutějším extrahovat bakterie (monomer nebo zejména dimer). Umožnil ověřit, že připravené DNA jsou majoritně ve formě silně svinuté. Vzorky takto ošetřené umožňují potvrdit předpovězené výsledky co se týče majoritních druhů pro každou konstrukci. DNA-topoisomerasa I rozpletla DNA, ale částečně. To by mohlo prokazovat, že studované plazmidy zahrnují jen málo zóny jednoduchých vláken • · • · na které se tyto enzymy přednostně váži (Roca, 1995).

2) Zavedení markérů selekce sup Phe na pXL2730

Byla použita kazeta exprese genu tRNA syntetického supresoru (Phe) (Kleina et al., 1990). Gen byl vložen do polypeptidového řetězce za tvorby Phenyalaninu vzhledem ke kodonu TAG. V XAC-1 umožňuje produkci proteinu ArgE dostatečně aktivního pro umožnění růstu v prostředí ochuzeném o arginin. Na plazmidu pCT-2-F (Normanly et al., 1986), sup Phe byl exprimován od syntetického promotoru odvozeného od sekvence promotoru genu Ipp E. coli, Elpp. Zastavení transkripce je zajištěno syntetickým terminátorem oreronu rrnC E. coli, ErrnC (Normanly et al., 1986). Na Obrázku 5 jsou naznačeny různé etapy klonování.

Byly provedeny různé podklony v XAC-1. Funkce kazety exprese tRNA supresoru je tedy řízena díky aktivitě β-galaktosidasy tohoto kmenu, který existuje jen v případě suprese kodonu amber genu lacZ_ull8am. Poslední etapa spočívá ve vložení kazety exprese sup Phe na pXL2730. Získané výsledky s fragmentem cer (B-l-b) pXL2666. Byl zachován potvrzují výběr tohoto plzmidu než rezistentní gen ke kanamycinu pro jednoduchost dalšího klonování zejména pro doplňkové uspořádání až k finálnímu klonování (ztráta Km^R) .

Přiklad 3:

Potvrzeni plazmidového vektoru pro aplikace v genové terapii transfekci myších fibroblastů

1) Konstrukce nosného vektoru pXL2774

Za účelem otestování platnosti v genové terapii systému produkce plazmidové DNA byl vložen na pXL2760 nosný gen, použitelný v eukariontních buňkách. Byl použit gen luc, který

kóduje luciferasu z Photinus pyralis, protože test bioluminescenčního měřeni je velmi citlivý, a je lineární na velké stupnici a šum pozadí způsobený endogenní aktivitou eukariontních buněk je velmi slabý. Gen luc je pod kontrolou sekvencí amplifikačního promotoru raného genu lidských cytomegalovirů (promotor CMV), který umožňuje zvýšenou expresi. Na 3'luc se nachází oblast nepřeložená, pocházející od viru SV40, která obsahuje signál polyadenylace (poly(A)+). Po středním klonování, které umožňuje zvýšení počtu volných míst restrikce kazeta promotor CMV-luc-poly(A) +’’ je vložena na minimální vektor ori γ-cer-sup Phe (pXL2760) k místu markéru Km^R. Výsledný plazmid byl nazván pXL2774. Obrázek 6 naznačuje různé etapy klonování. Spojovací směs byla transformována elektroporací do XAC-lpir-116. Pro inkubaci, která umožňuje bakteriím expresi markérů selekce se provádí v bohatém médiu (medium SOC), je nezbytné promýt buňky dvakrát médiem M9 před vystavováním. Toto umožní vyloučit zbytkové médium, které by mohlo mít za následek šum pozadí kultury na minimálním médiu.

Médium vybrané pro podrobení buněk elektroporací je minimální médium M9, které umožňuje selekci bakterií, které exprimují supresorovou tRNA a tedy přítomnost daného plazmidů. Přídavek X-Gal umožňuje modrým zbarvením zviditelnit expresi supresorové tRNA. Boxy jsou analyzovány po 20 hodinách při teplotě 37°C. Nepřítomnost kolonií ve srovnávacím vzorku bez DNA zajistila, že selekce je správná i s hustým rozmnožením. Všechny pokusné klony restrikcí (8) nesou plazmid, odpovídající očekávanému profilu. Takto zkonstruovaný plazmid kultivovaného v jednom hodin při teplotě 37°C) pXL2774 byl připraven od klonu litru tekutého média M9 (okolo 18 technikou nazvanou mezi jiným měnič iontů (souprava Promega, MegaPreps). Množství vzniklé DNA je mg.

• ·

2) Analýza nosného vektoru pXL2774 transfektovaného do savčích buněk

Schopnost pXL2774 transfektovat eukariontní buněk a umožnit expresi luciferasy je zvýšena transfekcí do myších fibroblastů NIH 3T3. Vektor vybraný jako reference je plazmid pXL2622 (jedná se o plazmid pGL2 Promega, jehož promotor SV40 byl nahrazen promotorem CMV), který nese stejnou kazetu exprese luciferasy jako pXL2774, ale na odlišném replikonu. Je odvozen od ColEl 6,2 kpb, který nese gen rezistentní k ampicilinu. Tento plazmid slouží jako srovnávací. Aktivita luciferasy (exprimovaná v RLU, čili relativní jednotky luminiscence) jsou naznačeny v Tabulce 3.

Nej lepší výsledky byly získány s poměrem náboj lipofektantu/náboj DNA 6, za těchto podmínek pXL2622 a 2774 se zdají být ekvivalentní.

···· *· ·♦··

Tabulka 3:

	PXL2622	pXL2774
poměr nábojů	RLU/pg protejů na kyvetu	průměr	koeficient variací %	RLU/pg protejnů na kyvetu	průměr	koeficient variací o. Ό
0	o O 1	ND*		O o	ND*
0,0	o o
o o	0,0
3	9,9 106	7,6 106	22	3,3 106	2,9 106	13
6,2 106	2,9 106
6,6 10s	2,4 106
6	1,2 107	1,5 107	19	9,4 106	1,0 107	7
1,5 107	9,9 106
1,9 107	1,1 107
9	9,5 106	1,0 107	26	1,1 107	6,4 106	13
7,5 106	8,3 106
1,4 107	8,5 106

*nedekovatelné

Příklad 4: Ověření charakteru sebevražedného vektoru u E. coli plazmidů pCOR

Nereplikační vlastnost plazmidů odvozených od R6K typu pCOR byla ověřena pokusem elektroporace do E. coli JM109 (Yanisch-Perron et al., 1985) plazmidů pUC4K (ori ColEl-KmR, (Vieira et Messing, 1982) a pXL2730 (ori stupnice R6K-KmR, viz příklad 2). Použitý elektroporátor byl Gene Pulser Biorad a elektrokompetentní buňky JM109 byly připraveny a použity ·· ···· podle doporučeni dodavatele (Bacterial electro-transformation and pulse controller instruction manual, catalog number 165-2098).

Elektrotransformované buňky byly vystaveny médiu LB s přídavkem kanamycinu (50 mg / 1) a inkubovány přes noc při teplotě 37’C. Získané výsledky jsou uvedeny dále.

Výsledky:

Plazmid	transformované množství (ng)	počet transoformantů	účinnost (počet transformantů/ng plasmidu)
pUC4K	0,01	»2000	>2105
PXL2730	5	0	0

Tyto výsledky ukazují, že je zde minimálně 5 log rozdílů mezi transformační účinností derivátu ColEl (pUC4k) vzhledem k derivátu R6K (pXL2730) ve kmeni neexprimující gen pir. Ve kmeni pir+ i XAC-lpir-116, účinnost elektrotransformace plazmidů odvozených od R6K ateint nebo přesáhuje 108 transformantů/ na pg plazmidu.

Přiklad 5:

Produkce plazxnidové DNA kulturou vysoké denzity kmene E. coli XAC-lpir-116 (pXL2774): Postup fermentace

5.1. Kmeny: Produkce v E. coli XAC-lpir-116 (příklad 1), produkce minimálního plazmidu pXL2774. Tento plazmid obsahuje následující elementy: ori R6K-cer-tRNAamsupPhe a kazetu exprese nosného genu lucpod řízením promotoru CMV (příklad 3) . Byla vyvinuta metoda vysoké produktivity pro tvorbu tohoto typu plazmidů.

♦ ···

• · • ·· φφΦ· • 4· •♦· φ · Φ ·Φ

Φ «Φ

ΦΦ·♦

5.2. Kultivační médium a podmínky

a) růstové médium

- Složení definovaného média použitého pro kultivaci inokula (g / 1): Na₂HPO₄ 6, KH,PO₄ 3, NaCl 0,5, NH4C1 1, NH₄H,PO₄ 3, glukosa 5, MgSO₄ . 7 H₂O 0,24, CaCl₂ . 2 H₂O 0,015, thiamin HC1 0,01.

- Složení komplexního média použitého pro kultivaci v fed-batch (g/1): KH₂PO₄ 8, K₂HPO₄ 6,3, Na₂HPO₄ 1,7, (NH₄)₂SO₄ 0,74, NH₄C1 0,12, kvasniční extrakt 3, glukosa 2, MgSO₄ . 7 H₂O 2,4 g / 1, CaCl₂ . 2 H₂O 0,015, thiamin 0,01, roztok solí (Fe, Mn, Co, Zn, Mo, Cu, B, Al) .

- Složení definovaného média pro kultivaci v fed-batch médiu identické ke komplexnímu médiu, ale kvasniční extrakt je nahrazen 2,5 g / 1 NH₄C1.

b) Podmínky kultivace v fed-batch

Pokusy ve dvoulitrovém fermentoru (Setric France), který obsahuje 1 1 média byly provedeny za účelem definování optimálních podmínek růstu a produkce plazmidové DNA. Fermentor byl zaočkován 80 ml inokula, které bylo odebráno při začátku stacionární fáze růstu.

Během fermentace bylo pH automaticky kontrolováno a udržováno mezi hodnotami 6,9 a 7,0 10% amoniakem (p / obj.), teplota byla udržována na 37°C, aerace byla udržována na hodnotě 75 1 / h (1,1 vvm) pod tlakem 0,2 bar a rozptýlený kyslík byl kontrolován (40% saturace vzduchu) zpětným působením na rychlost míchání a, bylo-li nutné, obohacením čistým kyslíkem.

Všechny tyto parametry (pH, teplota, míchání, OD, O, a CO₂ ve vytékajícím plynu) byly shromážděny a vypočítány prostřednictvím fázového rozhraní HP3852 spojeného s • · ♦ · ·· ····

99

	39	♦ •	• · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 9 99 999 9 9 9 9 9 9 9 • ·· ·· 99 99	9 · ♦ · 9 · • · 99
Hewlett-Packard 9000.
Základní složení výživného	média	je následující:	Zdroj
uhlíku 50%, síran	horečnatý	0,7%,	thiamin 0,02%,	pro

komplexní médium byl přidán kvasnični extrakt v koncentraci pohybující se mezi 5 a 10%.

Aby se přizpůsobily kultivační podmínky fermentoru o obsahu 800 1 byla připravena dvě související inokula produkované sekvence, v laboratorním měřítku: inokulum I míchané v •Erlenmayerově baňce a inokulum II ve dvoulitrovém fermentoru (kultivace v batch), následovala kultivace v fed-batch a kultivace v sedmilitrovém fermentoru.

5.3. Výsledky

Byly studovány různé kultivační podmínky v komplexním médiu, v definovaném médiua a v různých stupníchch růstu. Ve všech případech po iniciační kultivaci v batch bakteriálního kmenu a konzumaci zdroje uhlíku, výživné médium bylo mícháno ve fermentoru díky peristaltické pumpě spojené s profilem předem naprogramovaným. Tento profil byl odvozen z vedlejších pokusů, ve kterých úroveň výživy byla přizpůsobena buď míře kyslíku nebo míře konstantního růstu.

Pro snadnou extrapolaci bez fermentačních podmínek od dvoulitrového do osmsetlitrového, aby nedošlo k zesílení prokysličení média, maximální požadavek na kyslík v konci kultivace byl udržován na hodnotě 2,5 - 3 mM / min. Proto úroveň růstu mikroorganizmu byla snížena, bylo-ti to nutné, na začátku výživování účinkem komplementárního náboje.

Jak je ukázáno v Tabulce 4, byly získány velmi dobré výsledky zároveň v komplexním médiu a v definovaném médiu, a to v laboratorním měřítku nebo i v měřítku osmdesátilitrového fermentoru, kinetika růstu a produkce plazmidové DNA jsou

4444 téměř srovnatelné (Obrázek 6 a· 7) .

Tabulka 4:

	komplexní půda	definovaná půda
fermentor (21 nebo 71)	fermentor (8001)	fermentor (21)
doba fermentace (hodiny)	40	39	48
μ h-1	0,130	0,132	0,124
DO (600nm)	114	100	94
X g/1	44	37	30
pLazmidové DNA (mg/1 půdy)	115	100	100
plazmidové DNA (mg/gX)	2,6	2,7	3,3

X=biomasa (váha sušených buněk)

Souhrnné výsledky zdůrazňují, že:

-změna měřítka dvoulitrového fermentoru na osmsetlitrový fermentor může být provedena bez jakéhokoliv problému,

-spotřebovaný kyslík je silně závislý na produkci biomasy (1,08 g 0₂ / g produkované biomasy) ,

-plazmid je stabilní alespoň během 50 generací bez tlaku selekce,

-může se získat zvýšení biomasy, zvýšení nad 40 g sušených buněk / litr, v komplexním médiu,

-produkce plazmidové DNA přesahuje 100 mg silně svinuté

DNA / litr média,

-existuje velmi dobrá korelace mezi produkcí DNA a biomasou: může se tanovit produkce 1 mg plazmidové DNA / jednotku DO, nebo také 2,7 mg plazmidové DNA / g biomasy a nebo na délce fermantace,

-použití definovaného média umožňuje také předpokládat biomasu (30 g suchých buněk / litr) a zvýšenou produkci plazmidové DNA (100 mg / 1) a to bez ztráty produktivity.

Přiklad 6:

Přenos pXL2774 do zvířecích buněk in vitro a in vivo

6.1. Přenos in vitro pXL2774 do zvířecích buněk

Schopnost minimálního plazmidu pXL2774 transfektovat různé buněčné linie byla testována in vitro, jak na buňkách lidského původu, tak na buňkách myšího původu. Plazmid pXL2784 byl použit jako kontrola. Obsahuje stejnou kazetu eukariontní exprese (promotor CMV-luciferasa-polyA) , jako pXL2774, ale tato kazeta je odvozena od ColEl 6,4 kb, který obsahuje gen, který uděluje rezistenci ke kanamycinu u E. coli.

999 9

Testované buňky jsou následující:

buňky	typ	ref. Atcc / lit.
3LL	myší plicní karcinom
NIH 3T3	fibroblasty myšího embrya	CCL92
293	ledvinové buňky lidského embrya transformované adenovirem typu 5	CRL1573
HeLa	lidský karcinom děložního hrdla	CCL2
Caco-2	lidský adenokarcinom tračníku	HTB37
H460	lidský karcinom plic	HTB177
ECV 304	lidské endotelní buňky pupeční šňůry	Takahashi et al.,1990

Podmínky transfekce byly následující:

J-l: Rozmnožení buněk hustoty 100 000 buněk na kyvetu (2 cm², plak má 24 kyvet) v médiu DMEM (Dulbecco's modified Eagle Medium) doplněné 10% séra z telecích jater (SVF).

J-3: Transfekce buněk 10 μΐ transfekčního roztoku, který obsahuje: 0,5 gg DNA, 150 mM NaCl, 5% glukosa a 3 mmolů lipofektantu RPR120 535 na μg DNA v 250 μΐ kultivačního média, s přídavkem nebo bez přídavku 10% SVF.

J-4: Obnovení kultivačního média

J-5: Promyté buňky PBS, potom lyžované 100 μΐ pufru pro lýzu Promega (Promega Cell Lysis Buffer E153 A). Velikost aktivity luciferasy se měří v luminometru Lumat LB 9501 (Berthold) na 10 μΐ lyzátu s integrační dobou 10 sekund. Použitý reaktant je reaktant pocházející z Promega (Promega Luciferase Assay Substráte). Výsledky, uvedené v následujících tabulkách, jsou vyjádřeny v RLU (Relative Lights Unit) pro 10 μΐ lyzátu (průměr měření ve 4 kyvetách).

·« A·»·

Jsou také vyznačeny variační koeficienty (CV).

Výsledky transfekcí v nepřítomnosti séra jsou uvedeny dále.

	typy buněk
	NIH 3T3	3LL	293
pXL 2774	37 763 380 16	559 270 25	1 884 200 73	RLU CV
pXL 2784		113 764 24	1 723 546 101	RLU CV

	typy buněk
	HeLa	CaCo2	H460	ECV304
pXL 2774	11 000 000 15	1 108 422 14	1 459 501 5	36 450 23
pXL 2784	557 930 87	93 610 40	7 563 11	168 795 40

Výsledky transfekcí v přítomnosti séra (10%) jsou uvedeny dále:

	typy buněk
	NIH 3T3	3LL	293
pXL 2774	50 612 590 12	566 377 18	992 500 59
pXL 2784	12 693 780 38	436 704 12	2 300 000 47

•	*	··	9··9	«9	99
•	• •	9 · • ·	• •	9 · • ·	•	• 9	•
•	* ·	• ·	•	* «99	9		9
• ···	• 9 ··	• · • 9	• 9 99	• • 9	9	99	9

	typy buněk
	Hela	H460	ECV304
pXL 2774	9 490 000 25	857 385 16	18 021 30
pXL 2784	1 508 480 23	433 023 27	32 074 47

Tyto výsledky zdůrazňují vysokou schopnost pXL2774 k transfekci in vitro buněčných typů různého původu jak myšího tak i lidského. Exprese nosného genu luc umožňuje ukázat, že jeho transfekční účinnost je alespoň tak dobrá, jako účinnost plazmidu klasického odvozeného od ColEl, který nese stejnou kazetu exprese luciferasy.

6.2. Přenos in vivo u zvířat (myší) pXL2774

a) Model 1: DNA do myšího holeního svalu

Plazmidová DNA v roztoku 5% glukosy, 150 mM NaCl je injektováná do myšího holeního svalu OF1. Svaly byly odebrány sedm dní po injektaci, rozemlety, homogenizovány v 750 μΐ pufru pro lýzu (Cell Lysis Buffer Promega E153A) a potom odstředěny při 20 000 g po dobu 10 minut.

Velikost aktivity luciferasy je měřena v 10 μΐ supernatantu po přídavku 50 μΐ reaktantu (Promega Luciferase Assay Substráte). Odečet se provede na luminometru Lumat LB9501 (Berthold) s dobou integrace 10% sekund.

Výsledky jsou uvedeny v následující Tabulce:

plazmid	pXL 2784	pXL 2774	pXL 2784	pXL 2774
počet svalů	8	8	10	10
injektovaný objem (μΐ):	30	30	33	33
pg DNA/sval	19	13,5	10	6,25
RLU (pro 10 pl)
průměr	80 922	471 733	35 329	30 569
odchylka	104 573	402 602	37 041	35 774

Tyto výsledky naznačují, že plazmid podmínečně replikovaný, jako je pXL2774, je schopný transfektovat myší svalové buňky in vivo a to se srovnatelnou účinností dokonce i vyšší než plazmid klasický odvozený od ColEl, který nese stejnou kazetu exprese genu luciferasy.

b) Model 2: model nádoru 3T3 HER2

Model je následující:

-myši typu Swiss/nude dospělé samice

-experimentální nádory indukované po injekci 107 buněk 3T3 HER2 podkožně na úrovni boku

-injekce transfekční směsi je proveden 7 dní po injekci buněk

Irijektovaný roztok: DNA je nejdříve rozpuštěna v pufru. Po přídavku všech produktů směs obsahuje další DNA, NaCl (150 mM) a 5% D-glukosy ve vodě nebo v pufru HEPES 5 mM.

Dva dny po injekci nádorová tkáň byla odebrána, odvážena potom rozemleta a homogenizována v 750 μΐ pufru pro

4··4 ·« ·· • « · lýzu (Promaga Cell Lysis Buffer E153 A) . Po odstřeďování (20 000 g po dobu 10 minut) bylo odebráno 10 ml supernatantu, který umožnil stanovit aktivitu luciferasy. Tato aktivita je určena meřením úplné luminiscenční emise získané po smísení s 50 μΐ reaktantu (Promega Luciferase Assay Substráte) v luminometru Lumat LB 9501 (Berthold) s integrační dobou 10 sekund.

Výsledná aktivita stanovena v supernatantu tumorálního lyzátu je vyjádřena v RLU (Relative Lighs Units) .

puf r	plazmid	výsledek RLU/nádor	+/n
H2O nebo HEPES	odchylka	pg/nádor	[ADN]	průměr	odchylka
HEPES	pXL 2784	10	0,5 pg/pl	744 150	682 434	6/6
	pXL 2774	10	0,5 pg/μΐ	1 016 380	1 322 500	5/6
H2O	pXL 2784	24	0,6 pg/μΐ	2 906 073	1 745 857	8/8
	pXL 2774	16,8	0,4 pg/μΐ	4 292 043	4 995 187	6/6
h2o	pXL 2784	7,5	0,3 pg/μΐ	702 554	552 207	6/7
	pXL 2774	5	0,2 pg/μΐ	3 413 430	4 000 875	6/6

Tyto výsledky indikují, že plazmid v replikačnich podmínkách, jako je pXL2774 je schopný transfektovat myší nádorové buňky in vivo a to s účinností alespoň srovnatelnou s účinností plazmidu klasického odvozeného od ColEl, který nese stejnou kazetu exprese genu luciferasy.

Tyto různé pokusy umožnily ukázat, že plazmid v replikačnich podmínkách, zejména pXL2774, vyjadřuji transfekční vlastnosti zvířecích buněk nezbytných pro použití v genové terapii. Zejména byla ukázána:

1) schopnost pXL2774 účinně transfektovat in vitro • a · ι» • · · · • * a a

A A A A A

A « · « A AA různé typy buněk původu lidského nebo myšího,

2) schopnost pXL2774 transfektovat in vivo myši sval

3) schopnost pXL2774 transfektovat in vivo nádorové buňky implantované u myší

Elektrotransformační pokusy, fermentace a transfekce umožnily tedy uvést v platnost plazmidy v replikačních podmínkách jako vektory použitelné v genové terapii, tím že ukazují,

i) že se nereplikují detekovatelným způsobem v kmeni E. coli neexprimující gen pir (podmínečný počátek replikace) ii) že mohou být produkty v měřítku kompatibilním s průmyslovou výrobou, v médiu, které může být úplně definováno a které neobsahuje antibiotika, iii) že tyto plazmidy mohou transfektovat in vitro a spíše in vivo savčí buňky.

Příklad 7:

Produkce rekombinantních proteinů in vitro

7.1. Konstrukce expresního vektoru

Aby se prokázala proveditelnost takovéhoto přístupu, byl zkonstruován expresní vektor podle kritérií již dříve popsaných (příklad 2 a 3). Tento vektor pXL3056 obsahuje:

1) bakteriální část, která zahrnuje na podmínečný počátek replikace (ori γ), fragment cer ColEl a gen zajišťující selekci u bakterií (sup)

2) kazetu exprese, založenou na systému popsaném Studierem (Studier et al., 1990) obsahující promotor genu 10 bakteriofágu T7, operátor lacO, gen kódující aFGF 154 (acidic Fibroblast Growth factor neboli kyselý růstový faktor ···· e · · · fibroblastů, forma obsahuje 154 aminokyselin) (Jaye et al., 1986) terminátor TF bakteriofágu T7. Tato kazeta exprese je identická kazetě přítomné na plazmidu pXL2434 popsaného v přihlášce vynálezu WO96/08572.

Konstrukce pXL3056 je uvedená na Obrázku 8. Fragment EcoRI-BglII pXL2434 (1,1 kb) obsahující kazetu exprese a FGF je klonován do podmínečného replikačního vektoru pXL2979 (purifikovaný fragment 1,1 kb) na místech BglII a EcoRI pro vytvoření pXL3056.

pXL2979 vzniká ze spojení třech fragmentů:

i) fragment AccI-Xbal pXL2730 (0,8 kb, která přináší ori γ a cer) ii) fragment Narl-Sall pXL2755 (0,18 kb, který přináší gen sup Phe) iii) fragment Sall-Spel pXL2660 (1,5 kb, který přináší gen, který uděluje rezistenci ke kanamycinu).

pXL2660 vzniká z klonování fragmentu Pstl 1,2 kb pUC4K (Vieira et Messing, 1982) v pMTL22 (Chambers et al., 1988) linearizovaný Pstl.

7.2. Získání kmenu exprese

Plazmid pXL3056 je vložen transformací do kmene XAC-lpir-116. Kmen, který vzniká je potom transformovaný plazmidem PT7pol23 (Mertens et al., 1995) při teplotě 37°C. Aby se gen zájmu exprimoval pod řízením promotoru T7, bakterie musí obsahovat ve svém genomu na plazmidu nebo bakteriofágu kazetu umožňující expresi RNA polymerasy bakteriofágu T7. V popsaném příkladu jsme použili plazmid PT7pol23, spojitelný s deriváty R6K jako je pXL3056, a který umožňuje expresi indukovatelnou teplotou RNA polymerasy bakteriofágu T7. Může se také uvažovat o lýze kmene

• · · φ

XAC-lpir-116 lambdou DE3 (Studier et al., 1990), aby se zachoval jen plazmid a o indukováni produkce RNA polymerasy T7 spíše IPTG než teplotou.

7.3. Exprese aFGF

Kmen XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol23) je kultivován při teplotě 37 °C v minimálním médiu M9 s přídavkem 0,2% kasaminokyselin (DIFCO) a kanamycinu (25 gg / ml) až optické hustotě 0,6-1 při 600 nm. Kultivační půda byla inkubována při teplotě 42 °C (indukce RNA polymerasy T7) a druhé médium bylo inkubováno při teplotě 30°C (negativní kontrola). Stejný pokus je proveden s kmenem XAC-lpir-116(pXL3056+pUC4K) , který obsahuje srovnání exprese aFGF v nepřítomnosti RNA polymerasy T7 .

Získané výsledky jsou uvedeny na Obrázku 9. Ukazuji, ze produkce aFGF je srovnatelná pozorovanou u BL21(DE3)(pXL2434) možnost plazmidů podmínečné rekombinantních proteinů in vitro nebo vyšší s produkcí (WO96/08572) , což ukazuje replikace pro expresi zejména u E. coli.

Příklad 8:

Konstrukce vektoru pCOR, který exprimuje divoký protein p53 nebo hybrid

Tento příklad popisuje konstrukci vektorů s podmíněnou replikací podle předloženého vynálezu obsahující nuklovou kyselinu kódující protein p53. Tyto vektory jsou použitelné pro obnovení aktivity typu p53 v vadných buňkách (mutovaných, deletovaných) takových jako jsou zejména nádorové buňky.

Kazeta eukariontní exprese obsahuje následující elementy:

Σ’ ·· ···· • 4 to ·« toto • · to · .« to to* ♦ · to f · • I · «· · ·

1) raný promotor CMV immediate early (polohy -522 až +72), následuje za vedoucí sekvencí genu thymidinkinasy viru Herpes simplex typ I (poloha genu -60 až +1, vzhledem k sekvenci uvedené v článku McKnight, S.L. (1980) Nucleic Acids Res. 8: 5949-5964),

2) nukleovou kyselinu, která kóduje divoký protein p53 nebo variantu proteinu p53 tak, jak je popsáno v přihlášce vynálezu PCT/FR96/01111 (varianta V325K = V325 se sekvencí Kozák ATG),

3) polyadenilační sekvenci póly A SV40

Tyto elementy byly umístěny ve formě fragmentu AscI-Xbal na vektoru pCOR pXL2988 mezi místy BssHII a sSpel. pXL2988 je identický pXL2979 (přiklad 7.1.) nehledě na přítomnost doplňovacího elementu, sekvenci schopnou tvořit triplex DNA složenou z 17 násobného trinukleotidu GAA, umístěnou vedle počátku replikace gamma.

Výsledné plazmidy jsou pojmenovány pXL3029 a 3030 (Obrázek 10).

Účinnost těchto konstrukcí byla ověřena in vitro na buňkách p53-SAOS2 v kultuře měřením aktivity transaktivačního aktivátoru proteinu p53 nebo p53superWT.

«· · · ···· ·« * · • Λ · ·· «4··· • ♦ · ♦ · · · ·· • 4 4 v · · · * · · 4· • · · · · · «· · · •»· · · · * · 4 · · ··

Použitá literatura

Alting-Mees, M. A., J. A. Sorge, and J. M. Short. 1992. Methods Enzymol. 216: 483-495.

Blum, P., D. Hplzschu, H. S. Kwan, D. Riggs, and S. Artz. 1989. J. Bacteriol. 171: 538-546.

Brosius, J. 1989. Methods Enzymol. 216: 469-483.

Chambers, S. P., S. E. Prior, D. A. Barstow, and N. P. Minton. 1988. Gene 68: 139-149.

Chung, C. T., and R. H. Miller. 1988 . Nucleic Acids Res. 16: 3580.

Colloms, S. D., P. Sýkora, G. Szatmari, and D. J. Sherrat. 1990 J. Bacteriol. 172: 6973-6980.

Datta, N., and P. Kontomichalou. 1965 Nátuře 208:

239-241.

Dickley, F., D. Nilsson, Ε. B. Hansen, and E. Johansen. 1995. Mol. Microbiol. 15: 839-847.

Filutowicz, M., S. Dellis, I. Levchenko, M. Urh, F. Wu,

and D. York. 1994. Prog. in Nucleic	Acid Res.	and Mol. Biol.
48: 239-273.
Gibson, T. J. 1984. Ph.D	Thesis.	University	of
Cambridge.
Greener, A., M. Filutowicz,	M. McEachern, and	D.
Helinski. 1990. Mol. Gen. Genet. 224	: 24-32.

Herrero, Μ., V. de Lorenzo, and K. N. Timmis. 1990. J.

Bacteriol. 172: 6557-6567.

Hodgson, C. P. 1995. Bio/Technology 13: 222-225.

Inuzuka, M., and Y. Wada. 1985. EMBO J. 4: 2301-2307.

Jaye, M. et al., (1986) Science 233: 541-5.

4· 4 · a · · · • · • 4 • · 4 ·4 44444 • 4 4 4 4 · ··· • · 4 * 4 44 44 4 4· «44 · 4 4 4· · σ »44 4» 44 «· «4«»

Kleina, L. G., J. M. Masson, J. Normanly, J. Abelson, and J. H. Miller. 1990. J.Mol. Biol. 213: 705-717.

Kowalczykowski, S. C., and A. K. Eggleston. 1994. Annu. Rev. Biochem. 63: 9991-10043.

Leung, D. W., E. Chen, G. Cachianes, and D. V. Goeddel. 1985. DNA 4: 351-355.

Maniatis, T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook. 1989. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.

Meinnel, T., E. Schmitt, Y. Mechulam, and S. Blanquet. 1992. J.Bacteriol. 174: 2323-2331.

Mertens,	N., E. Remaut and	W. Fiers. (	1995)
Bio/Technology	13: 175-179.
Messing,	J., and J. Vieira. 1982.	Gene 19: ěží-ěýž	•
Metcalf,	W. W., W. Jiang, and B.	L. Wanner. 1994.	Gene

138: 1-7.

Miller, V. L., and J. J. Mekalanos. 1988. J. Bacteriol. 170: 2575-2583.

Normanly, J.,	J. M.	Masson, L. G. Kleina, J.	Abelson,
and J. H. Miller.	1986.	Proč.Nati. Acad. Sci.	USA 83:
6548-6552.
Normanly, J.,	J. M.	Masson, L. G. Kleina, J.	Abelson,
and J. H. Miller. 1990. J.	Mol. Biol. 213: 719-726.

Roca, J. 1995. TIBS 20: 156-160.

Saiki, R. K., S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis, G. T. Horn, H. A. Erlich, and N. Arnheim. 1985. Science 230: 1350-1354.

Sanger, F., S. Nicklen, and A. R. Coulson. 1977. Proč. Nati. Acad. Sci USA 74: 5463-5467.

Sawadogo, M., and M. W. Van Dyke. 1991. Nucleic Acids

Res. 19: 674.

Scott,

J. R. 1984. Microbiol.

» ··· · • ·· • ♦ ♦ ·4 • 44 ·κ>4·»

Rev. 48:

• ·4 4·· • ·4 • 4· • · ·4 • 4 ·4 • 4«4

1-23.

Simoes, D. A., M. Dal S. Blanchin-Roland, J. L. 1991. Ann. N. Y. Acad. Sci.

Jensen, E. Dreveton, M. 0. Loret, Uribelarrea, and J. M. Masson. 646: 254-258.

Simon, R., U. Priefer, and A Puhler. 1983.

Bio/Technology 1: 784-791.

Sinha, N. D., J. Biernat, J. McManus, and H. Koster. 1984. Nucleic Acids Res 12: 4539-4557.

Stirling, C. J., G. Stwart, and D. J. Sherrat. 1988. Mol. Gen. Genet. 214: 80-84.

Stirling, C. J., S. D. Colloms, J. F. Collins, G.

Szatmari, and D. J. Sherrat. 1989. EMBO J. 8: 1623-1627.

Studier, F. W., A. H. Rosenberg, J. J. Dunn, and J. W.

Dubendorff (1990). Methods Enzymol 185: 60-89.

Summers, D. K.,

1097-1103.

and D. J. Sherrat. 1984. Cell 36:

Takahashi, K., Y. Sawasaki, J. Hata, K. Mukai and T. Goto. (1990) In Vitro Cell Dev. Biol. 26: 265-74.

Vieira, J., and J. Messing. 1992. Gene 19: 259-268.

Wiechelman, K., R. Braun, and J. Fitzpatrick. 1988. Anal. Biochem. 175: 231-237.

Yanisch-Perron, C. Vieira, and J. Messing (1985) Gene 33: 103-119.

4444 44««44 ···4

4 ·· •·

44

4 «9 ·· • 444

4·

4 «

• 4

Seznam sekvenci (1) Všeobecné informace:

(i) podavatel:

(A) Jméno: RHONE-POULENC RORER

(B) Ulice: 20, Raymond ARON

(C) Město: ANTONY

(D) Země: Francie

(E) Směrovací číslo: 92165

(G) Telefon: (1) 40.91.69.22

(H) Fax: (1) 40.91.72.96

S.A.

(ii) podmínečným počátkem terapii použiti v genové (iii) název vynálezu: Molekula replikace, postup její přípravy a její kruhové

DNA s počet sekvenci: 6 (iv) způsob luštění počítačem:

(A)

Typ nosiče: Tápe počítač: IBM PC kompatibilní (C) (D) systém využití: PC-DOS/MS-DOS logika: Patentln Relase #1.0, Version #1.30 (OEB) (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 389 párů básí *

·♦ ··♦· (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 1:

TGTCAGCCGT	TAAGTGTTCC	TGTGTCACTG	AAAATTGCTT	TGAGAGGCTC	50
TAAGGGCTTC	TCAGTGCGTT	ACATCCCTGG	CTTGTTGTCC	ACAACCGTTA	100
AACCTTAAAA	GCTTTAAAAG	CCTTATATAT	TCTTTTTTTT	CTTATAAAAC	150
TTAAAACCTT	AGAGGCTATT	TAAGTTGCTG	ATTTATATTA	ATTTTATTGT	200
TCAAACATGA	GAGCTTAGTA	CGTGAAACAT	GAGAGCTTAG	TACGTTAGCC	250
ATGAGAGCTT	AGTACGTTAG	CCATGAGGGT	TTAGTTCGTT	AAACATGAGA	300
GCTTAGTACG	TTAAACATGA	GAGCTTAGTA	CGTGAAACAT	GAGAGCTTAG	350
TACGTACTAT	CAACAGGTTG	AACTGCTGAT	CTTCAGATC		389

(2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 960 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 2:

TATACAGAAT GATGAGGTTT TTTTATGAGA CTCAAGGTCA TGATGGACGT50

GAACAAAAAA ACGAAAATTC GCCACCGAAA CGAGCTAAAT CACACCCTGG100

CTCAACTTCC TTTGCCCGCA AAGCGAGTGA TGTATATGGC GCTTGCTCCC150

ATTGATAGCA AAGAACCTCT TGAACGAGGG CGAGTTTTCA AAATTAGGGC200

TGAAGACCTT GCAGCGCTCG CCAAAATCAC CCCATCGCTT GCTTATCGAC250

AATTAAAAGA GGGTGGTAAA TTACTTGGTG CCAGCAAAAT TTCGCTAAGA300 «· ··♦·

GGGGATGATA TCATTGCTTT AGCTAAAGAG TAAAAACTCC CCTGAAGAGT TAGATCTTAA ATTCAAATGA TGAAGGATAC TTGTCTTTAA CCATATATCT CTAGCCTTAT TGGGAAAAAA GTTAACGGCA AGCTTACGCT TAAGTAGCCA AACTTATCAG GAAGCATTAC TCTAATTTTA ATTTCCGTTG ATGAGTTAAA GGAAGAGTTA AGATGGAAAT ATTGAGTACA AATACCCTGA ATGTGTTAAA TAAAGCCATT GCTGAAATTA TTTGTTGGCT TCACTGTTCA TGAAAAAGAA GAAGTTCGAA TTTGTCGTTG ATGAAGATGA ATGAAGCTTT TTTTATGAAT TTATCTGAAG GTATTTAATG AAACCGTACC TCCCAAAAAA

CTTAACCTGC	CCTTTACTGC	350
CATTATTGAG	TGGATAGCTT	400
AATTCACCAG	AACCATAGAA	450
AATAAATTCA	CAACGCAATT	500
GTATTCATCT	TCTCTTTATC	550
AGAAGAAAAA	TTATTTTATT	600
ACAGCTTATA	CTTTTGATAA	650
CTTTCCTATT	TTTAAAAGGG	700
AAAAGAAAAC	AGAAATATCG	750
GGAAGAAAAA	TTAGTAAGCT	800
ATTTTCTGGC	GATAAAGATG	850
CTGATGCAGC	TTTTCTCAAG	900
GCTAAGGGGT	GATATATGGC	950

960

TAAAATTTC (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 3:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 24 párů bási (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 3:

GACCAGTATT ATTATCTTAA TGAG 24 (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 4:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 24 párů bási (B) typ: nukleotid

444 4 ·· ·44· (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 4:

GTATTTATG AAACCGTACC TCCC (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 5:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 24 párů básí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 5:

CTCTTTTAAT TGTCGATAAG CAAG (2)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 6:

(i) charakteristika sekvence:

(A) délka: 24 párů bási (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 6:

Claims (37)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY

   1. Molekula kruhové

   DNA použitá v genové terapii obsahující alespoň nukleovou sekvenci zájmu, jejíž translace a případně translace v cílové buňce vytváří produkty, které mají terapeutický, vakcinační, agronomický, veterinární význam vyznačená tím, že oblast, která umožňuje její replikaci obsahuje počátek replikace pocházející z plazmidu nebo bakteriofágu, jejichž funkce v hostitelské buňce vyžaduje přítomnost alespoň specifického proteinu a netýkajícího se výše uvedené hostitelské buňky.
2. 2. Molekula DNA podle nároku 1 vyznačená tím, že podmínečný počátek replikace pochází z plazmidu nebo z bakteriofágu, které mají počátek replikace, vyjádřený několika introny, a která kóduje alespoň specifický protein podmiňující funkci počátku replikace
3. 3. Molekula DNA podle nároku 1 nebo 2 vyznačená t i m, že podmínečný počátek replikace může pocházet z plazmidů nebo následujících bekteriofágů RK2, R6K, Rl, pSCIOl, Rtsl, F, RSF1010, Pl, P4, lambda, Phi82 a Phi80.
4. 4. Molekula DNA podle nároku 1 až 3 vyznačená tím, že výše uvedený počátek replikace pochází z bakteriálního plazmidu R6K.
5. 5. Molekula DNA podle jednoho z předchozích nároků vyznačená tím, že výše uvedený počátek replikace je tvořen částečně nebo úplně počátkem replikace γ plazmidu ·♦·· ·« ····

   9999

   9 9 9 9 9 9 9 9 99

   9 9 9 9 · 9 999

   9 9 9 9 9 9 9 999 9· ♦ · · ···* ··>

   • · 9 99 99 99 9 99 9

   R6K.
6. 6. Molekula DNA podle jednoho z předchozích nároků v yznačená tím, že výše uvedený počátek replikace je vyjádřen částečně nebo úplně sekvenci SEQ ID N°1 nebo každou sekvencí, která se liší od sekvence ID N°l, vzhledem k degeneraci genetického kódu, nebo každou sekvencí, která hybriduje s těmito sekvencemi nebo fragmenty těchto sekvencí, a jejichž produkt má aktivitu specifického proteinu iniciátoru replikace.
7. 7. Molekula DNA podle jednoho z předchozích nároků v yznačená tím, že oblast, která umožňuje selekci hostitelských buněk inkorporujících výše uvedenou molekulu DNA je odlišná od genu rezistentního k antibiotikům.
8. 8. Molekula DNA podle jednoho z předchozích nároků v yznačená tím, že oblast, která umožňuje selekci hostitelských buněk inkorporujících výše uvedenou molekulu DNA je vyjádřená částečně nebo úplně kazetou exprese transferové RNA supresoru specifických kodonů.
9. 9. Molekula DNA podle nároku 8 vyznačená tím, že se jedná o kazetu exprese tRNA supresoru kodonů amber (TAG).
10. 10. Molekula DNA podle jednoho z předchozích nároků vyznačená tím, že obsahuje mimoto cílovou regiospecifickou rekombinázovou oblast.

    9999 ♦ 9 • 99 9 • 9 ♦·
11. 11. Molekula DNA podle nároku 10 vyznačená tím, že tato cílová regiospecifická rekombinázová oblast může být vybrána mezi resolvázami transposonů Tn3, Tn21 nebo Tn522, invertázami bakteriofágu mu, resolvázami plazmidů jako kódovaná fragmentem par RP4 rekombniázyrodu integrázy bakteriofágu lambda jako integrázy lambda, phi80, P22, HP1, integráza Cre Pl, integráza plazmidů pSAM2, FLP rekombináza plazmidů 2μ, a rekombinázy XerC a XerD E. coli.
12. 12. Molekula DNA podle nároku 10 nebo 11 vyznačená t í m, že tato cílová regiospecifická rekombinázová oblast obsahuje částečně nebo úplně fragment cer ColEl nebo menši fragment, který má stejné vlastnosti.
13. 13. Molekula DNA podle jednoho z předchozích nároků vyznačená tím, že se jedná o plazmid pXL2774 nebo každou jinou konstrukci, která je odvozená od pXL2774, obsahující jeden nebo více genů zájmu jiných než luciferasový gen.
14. 14. Molekula DNA podle jednoho z předchozích nároků vyznačená tím, že sekvence nukleové kyseliny zájmu kóduje protein farmaceuticky, agroalimentačně významný nebo použitelný v biokatalýze.
15. 15. Molekula DNA podle nároku 14 vyznačená tím, že sekvence nukleové kyseliny zájmu kóduje protein vybraný mezi enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny: interleukiny, interferony, TNF, atd., růstové faktory, neuropřenašeče nebo jejich prekurzory nebo enzymy syntézy, faktory trofické jako BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF,

    AAAA • · AAA · * o • AAA A A A AAA A A

    AAA AAA* AAA

    AAA A A AAA* AAA*

    NT3, NT5, apolipoproteiny jako ApoAI, ApoAIV, ApoE, dystrofin nebo minidystrofin, supresorové geny nádorů jako p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, geny kódující faktory zahrnuté do koagulace jako Faktory VII, VIII, IX, sebevražedné geny jako Thyamindin-kinasa, cytosin-deaminasa, celek nebo část přírodního imunoglobinu nebo umělého imunoglobinu jako je Fab, ScFv, RNA ligand, antimediátorová sekvence nebo specifické antigenové peptidy viru Epstein-Barrové, viru HIV, viru hepatitidy B, viru pseudovztekliny nebo také specifických nádorů.
16. 16. Postup tvorby molekuly kruhové DNA vyznačený t i m, že se kultivují hostitelské buňky obsahující alespoň:

    -molekulu kruhovou DNA obsahující alespoň nukleotidovou sekvenci zájmu a oblast umožňující její replikaci obsahující počátek replikace, jehož funkce v hostitelské buňce vyžaduje přítomnost alespoň specifického proteinu netýkající se výše uvedené hostitelské buňky, a

    -protein exprimovaný in šitu nebo neexprimovaný, podmiňující funkci výše uvedeného počátku replikace, specifický netýkající se výše uvedené hostitelské buňky, v podmínkách, které umožňují selekci transformovaných hostitelských buněk výše uvedenými molekulami DNA.
17. 17. Postup podle nároku 16 vyznačený tím, že gen kódující iniciační protein replikace je přítomný na připojeném replikonu nebo včleněn do genomu výše uvedené buňky.
18. 18. Postup podle nároku 16 nebo 17 vyznačenýt ···· • · · • · · • ·· • · · · i m, že se jedná o molekulu DNA obsahující počátek replikace, tak jak je definováno v nárocích 4 až 6 a tím, že výše uvedený protein je buď odvozený od proteinu π plazmidu R6K nebo odlišný od tohoto proteinu modifikací jeho sekvence kódované nebo tvořené fragmentem tohoto proteinu ačkoliv má stejnou aktivitu.
19. 19. Postup podle nároku 18 vyznačený tím, že protein π nebo jeden z jeho derivátů je exprimovaný in šitu z genu pír vyjádřeného SEQ ID N°2 nebo každou sekvencí odlišnou od SEQ ID N°2, vzhledem k degeneraci genetického kódu, nebo každou sekvencí, která hybriduje s těmito sekvencemi nebo s fragmenty těchto sekvencí přítomné v hostitelské buňce, a jejichž produkt má aktivitu specifického proteinu iniciátoru replikace.
20. 20. Postup podle nároku 19 vyznačený tím, že protein je exprimován z genu pir 116 zahrnutého v genomu výše uvedené buňky.
21. 21. Postup podle jednoho z nároků 16 až 20 vyznačený t i m, že jeden z nezávislých genů, ve vybraných podmínkách kultivace hostitelské buňky, obsahuje specifický kodon rozpoznatelný vybranou supresorovou tRNA na úrovni molekuly DNA.
22. 22. Postup podle nároku 21 vyznačený tím, že tento gen obsahuje kodon amber TAG.
23. 23. Postup podle jednoho z nároků 16 až 22 vyzná ···« č e n ý t i m, že buňka je vybraná mezi kmeny E. coli.
24. 24. Postup podle jednoho z nároků 16 až 23 vyznačený t i m, že buňka pochází z kmene E. coli XAC-1.
25. 25. Postup podle jednoho z nároků 16 až 24 vyznačený t i m, že uvádí kmen E. coli XAC-1 zahrnující ve svém genomu gen pir 116 transformovaný plazmidem pXL2774 nebo každou konstrukcí, která je odvozena od pXL2774 zahrnující jeden nebo více genů zájmu jiných než je luciferasový gen.
26. 26. Rekombinantní buňka transformovaná alespoň molekulou DNA podle jednoho z nároků 1 až 15 nebo takovou jaká je definovaná podle jednoho z nároků 16 až 25.
27. 27. Farmaceutická kompozice obsahující jednu nebo více molekul DNA podle jednoho z nároků 1 až 15.
28. 28. Použití molekuly DNA podle jednoho z nároků 1 až 15 pro transfekci in vitro, ex vivo nebo/a in vivo genu zájmu v hostitelské buňce.
29. 29. Použití molekuly DNA podle jednoho z nároků 1 až 15 pro tvorbu rekombinantních proteinů in vitro.
30. 30. Postup tvorby rekombinantního proteinu vyznačený t i m, že se kultivuje hostitelská buňka obsahující alespoň:

    • ·4·4 ·4 4444 44»4 et · e ·444*4 • · · · · · · ♦ ·

    4 4 4 4 4 4 4 444 44

    444 4 4 4 4444

    44444 44 44 4444

    -molekula kruhové DNA obsahující alespoň nukleovou sekvenci kódující výše uvedený rekombinantní protein a oblast umožňující jeho replikaci obsahující počátek replikace, jejíž funkce v hostitelské buňce vyžaduje přítomnost alespoň specifického proteinu netýkajícího se výše uvedené hostitelské buňky, a

    -iniciační protein exprimovaný in šitu nebo neexprimovaný podmiňující funkci výše uvedeného počátku replikace, specifického a netýkajícího se výše uvedené hostitelské buňky, potom se sklízí vytvořený rekombinantní protein
31. 31. Postup podle nároku 30 vyznačený tím, že gen kódující protein iniciátoru replikace je přítomný na vedlejším replikonu nebo včleněn do genomu výše uvedené buňky.
32. 32. Postup podle jednoho z nároků 30 nebo 31 v y z n ač e n ý t i m, že buňka je vybrána mezi kmeny E. coli.
33. 33. Molekula podle nároku 1 vyznačená tím, že nukleová sekvence zájmu kóduje divoký nebo modifikovaný protein p53.
34. 34. Molekula podle nároku 1 vyznačená tím, že nukleová sekvence zájmu kóduje thyamidin-kinasu.
35. 35. Postup podle nároku 23 vyznačený tím, že buňka je kmenu E. coli endAl.
36. 36. Molekula DNA podle jednoho z nároků 1 až 15 v yznačená tím, že obsahuje mimoto sekvenci schopnou specificky interagovat s ligandem.
37. 37. Molekula DNA podle nároku 15 vyznačená tím, že nukleová kyselina zájmu kóduje protein p53.