SK285317B6 - Molekula kruhovej DNA s podmienečným začiatkom replikácie, spôsob jej prípravy a jej použitie v génovej terapii - Google Patents

Molekula kruhovej DNA s podmienečným začiatkom replikácie, spôsob jej prípravy a jej použitie v génovej terapii Download PDF

Info

Publication number
SK285317B6
SK285317B6 SK347-98A SK34798A SK285317B6 SK 285317 B6 SK285317 B6 SK 285317B6 SK 34798 A SK34798 A SK 34798A SK 285317 B6 SK285317 B6 SK 285317B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
dna molecule
replication
gene
plasmid
protein
Prior art date
Application number
SK347-98A
Other languages
English (en)
Other versions
SK34798A3 (en
Inventor
J�El Crouzet
Fabienne Soubrier
Original Assignee
Centelion
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9482580&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK285317(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Centelion filed Critical Centelion
Publication of SK34798A3 publication Critical patent/SK34798A3/sk
Publication of SK285317B6 publication Critical patent/SK285317B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/501—Fibroblast growth factor [FGF] acidic FGF [aFGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

Opisuje sa molekula kruhovej DNA, použiteľná v génovej terapii, obsahujúca aspoň nukleovú sekvenciukódujúcu požadovaný produkt a oblasť umožňujúcu jej replikáciu, ktorá obsahuje začiatok replikácie,ktorého funkcia v hostiteľskej bunke vyžaduje prítomnosť špecifického proteínu, ktorý sa netýka uvedenej hostiteľskej bunky. Taktiež sa opisuje spôsob jej prípravy, bunky obsahujúce uvedené molekuly DNA a ich použitie v génovej terapii.

Description

Predložený vynález sa týka novej molekuly DNA s podmienečnou replikáciou použiteľnou v génovej terapii alebo na tvorbu rekombinantných proteínov.
Doterajší stav techniky
Génová terapia spočíva v oprave porúch alebo anomálií tým, že vkladá genetickú informáciu do bunky alebo do postihnutého orgánu. Informácia sa môže vložiť buď in vitro do bunkového extraktu orgánu a potom reinjikovať do organizmu, alebo in vivo priamo do určitého tkaniva. V prípade, že ide o molekulu s vysokou molekulovou hmotnosťou a s negatívnym nábojom, DNA má ťažkosti samovoľne prejsť fosfolipidovou bunkovou membránou. Používajú sa rôzne vektory, aby umožnili prenos génu: buď vírusové vektory, alebo chemické vektory, a/alebo biochemické, prírodné alebo syntetické.
Vírusové vektory (retrovírusy, adenovírusy, vírusy AAV...) sú veľmi účinné, hlavne na prechod cez membrány, ale predstavujú tiež určitý počet nebezpeči, napríklad: nebezpečie patogenity, «kombinácie, replikácie, imunity....
Chemické vektory a/alebo biochemické umožňujú vyhnúť sa tomuto nebezpečiu (na prehľad, pozri Behr, 1993, Cotten et Wagner, 1993). Napríklad sú to katióny (fosfát vápenatý, DEAE-dextrán...), ktoré sú účinné tým, že vytvárajú zrazeniny s DNA, ktoré sa môžu fagocytovať bunkami. Najmä môže ísť o lipozómy, v ktorých DNA je začlenená, a ktoré fúzujú s plazmovou membránou. Prenosné syntetické vektory génov sú všeobecne lipidy alebo katiónové polyméry, ktoré tvoria komplexy s DNA a tvoria s ňou časticu, ktorá nesie pozitívny náboj na povrchu. Na ilustráciu tohto typu vektorov sa môže citovať najmä dioktadekylamidoglycylspermín (DOGS, Transfectam TM) alebo N-[l-(2,3-dioleyloxy)propylJ-N,N,N-trimetylamónium chlorid (DOTMA, Lipofectin TM).
Použitie chemických a/alebo biochemických vektorov alebo iba DNA predpokladá možnosť produkovať dôležité množstvo DNA farmakologicky čistej. V technikách génovej terapie medikament je tvorený samotnou DNA, ktorá je nevyhnutná na možnú výrobu v prispôsobených množstvách a DNA, ktorá má prijateľné vlastnosti na terapeutické použitie u človeka.
V prípade nevírusovej vektorológie sa používajú plazmidy bakteriálneho pôvodu. Plazmidy použité všeobecne v génovej terapii nesú (i) začiatok replikácie, (ii) označený gén ako je gén rezistentný na antibiotikum (kanamycín, ampicilín...) a (iii) jeden alebo viac transgénov s nevyhnutnými sekvenciami na ich expresiu (leucínový zip alebo zipy, promótor(y), polyadenylové sekvencie...).
Aktuálne používaná technológia nie je úplne uspokojivá.
Zostáva nebezpečie rozptýlenia v organizme. To znamená, že baktérie prítomné v organizme môžu, pri slabej početnosti, prijímať tento plazmid. Väčšia pravdepodobnosť je skôr v prípade, že ide o liečenie génovou terapiou in vivo, v ktorej DNA môže byť rozmnožená v organizme pacienta a môže sa nachádzať v kontakte s baktériami, ktoré infikujú tohto pacienta alebo tiež s baktériami komensalitnej mikroflóry. Ak baktéria, ktorá prijíma plazmid je enterobaktéria, taká ako E. coli, tento plazmid sa môže replikovať. Takýto dej vedie k rozšíreniu terapeutického génu. V prípade, kde použité terapeutické gény v liečení génovej terapie môžu kódovať napríklad lymfokín, faktor rastu, antionkogén alebo proteín, ktorého funkcia chýba u hostiteľa a umožňuje opraviť genetickú chybu, rozmnoženie týchto určitých génov by mohlo mať nečakané účinky a účinky, ktoré spôsobujú problémy (napríklad, ak patogénne baktérie oslobodia gén ľudského rastového ťaktora).
Napriek tomu plazmidy všeobecne použité v génovej nevírusovej terapii majú tak marker rezistencie na antibiotiká (ampicilín, kanamycín...). Baktéria, ktorá prijíma takýto plazmid, má tak podstatnú nepopierateľnú výhodu, nakoľko každé autobioterapeutické liečenie, ktoré používa antibiotiká rovnakého rodu, ako vybraný gén rezistencie plazmidu, povedie k selekcii zmieneného plazmidu. V tomto ohľade ampicilín tvorí časť β-laktámu, ktorý je antibiotickou rodinou najpoužívanejší na svete. Použitie selekčných markerov pri baktériách, ktoré nebudú rezistentnými génmi na antibiotiká, budú teda najviac výhodné. Vyhne sa selekcii baktérií, ktoré by mohli dostať plazmid, ktorý takýto marker nesie.
Dôležité je najmä hľadať maximálne obmedzenie rozmnoženia terapeutických a rezistentných génov.
Podstata vynálezu
Predložený vynález navrhuje nové molekuly DNA, použité v génovej terapii alebo na produkciu rekombinantných proteínov in vitro, ktoré sa replikujú len v bunkách, ktoré môžu doplniť určité funkcie týchto nevírusových vektorov.
Predložený vynález sa tiež týka zvlášť účinnej metódy na prípravu molekúl DNA.
Nárokované molekuly DNA majú výhodu vylúčenia nebezpečia spojeného s rozmnoženým plazmidom, ako sú (1) replikácia a rozmnoženie, ktoré môžu niesť silnú expresiu neriadenú terapeutickým génom, (2) rozmnoženie a expresia rezistentných génov. Génová informácia obsiahnutá v molekulách DNA podľa vynálezu obsahuje účinný terapeutický gén alebo terapeutické gény a signály regulácie jeho alebo ich expresie, začiatok replikácie podmienečne funkčnej, ktorý veľmi silno obmedzuje spektrum hostiteľskej bunky tohto plazmidu, selekčný marker zmenšenej veľkosti prednostne sa odlišujúci od génu, ktorý udeľuje rezistenciu na antibiotiká a v prípade potreby, fragment DNA, ktorý umožňuje uvoľnenie multimérov plazmidu. Pravdepodobnosť, že tieto molekuly (a teda genetická informácia, ktorú obsahujú) budú prenesené na mikroorganizmus a stabilne sa udržia, je veľmi obmedzená.
Vektory podľa vynálezu, tiež opísané miniplazmidy z dôvodov ich kruhovej štruktúry, ich zmenšenej veľkosti a ich silno zvinutej formy predstavujú dostatočné nasledujúce výhody: Z dôvodu ich zmenšenej veľkosti vzhľadom na plazmidy odvodené od ColEl klasicky použitých, molekuly DNA podľa vynálezu majú potenciálne lepšiu biopoužiteľnosť in vivo. Predstavujú zvýšenú schopnosť penetrácie a bunkového roznášania rozdeľovania. Je známe, že difúzny koeficient do tkanív nie je priamo úmerný k molekulovej hmotnosti (Jain, 1987). Práve tak na bunkovej úrovni, molekuly vysokej molekulovej hmotnosti majú aspoň dobrú permeabilitu na prechod plazmidovej membrány. Okrem toho na prechod plazmidu k jadru nezávisle od jeho expresie, zvýšená molekulová hmotnosť je tiež nevýhodou, nukleárne póry presahujú limit veľkosti na difúziu k jadru (Landford et al., 1986). Redukcia veľkosti nctcrapeutickej zložky molekuly DNA (najmä začiatok replikácie a selektovaný gén) podľa vynálezu umožňuje tiež zmenšiť veľkosť molekúl DNA. Zložka umožňujúca replíkáciu a selekciu tohto plazmidu pri baktériách (1,1 kb) je znížená faktorom 3 tým, že zhustí napríklad 3 kb na začiatok replikácie a
SK 285317 Β6 marker rezistencie vektorovej zložky. Zníženie (i) molekulovej hmotnosti a (ii) negatívneho náboja, dáva molekulám vynálezu zvýšené schopnosti difúzie a tkanivovej bioschopnosti bunkovej a nukleárnej.
Predložený vynález sa týka kruhovej molekuly DNA, použitej v génovej terapii, obsahujúcej aspoň nukleovú sekvenciu záujmu vyznačujúcu sa tým, že oblasť, ktorá umožňuje jej replikáciu, obsahuje začiatok replikácie, ktorého funkcia v hostiteľskej bunke vyžaduje prítomnosť aspoň špecifického proteínu, ktorý sa netýka uvedenej hostiteľskej bunky.
Molekula DNA sa môže vyjadriť vo forme jedno alebo dvojvláknovej a výhodne zaujíma silno zvinutú formu.
V zmysle predloženého vynálezu, hostiteľské bunky môžu byť rôzneho pôvodu. Môže ísť o bunky eukaryotické alebo prokaryotické. Podľa uprednostneného spôsobu uskutočnenia vynálezu môže ísť o bunky eukaryotické.
Replikácia bakteriálnych plazmidov vyžaduje aspoň prítomnosť proteínu kódovaného hostiteľskou bunkou typu RNA polymeráza, RNAáza, DNA polymeráza.... Z týchto dôvodov označených už skôr sa nemôže úplne vylúčiť, s týmto typom replikácie, prípadné nebezpečie rozmnoženia v liečenom organizme. Funkcia začiatku replikácie molekuly DNA podľa vynálezu požaduje prítomnosť proteínovej sekvencie, ktorá sa netýka hostiteľskej bunky. Táto charakteristika redukuje spektrá hostiteľa nárokovaného plazmidu špecifického kmeňa, ktorý exprimuje iniciačný proteín. Molekula DNA v rámci predloženého vynálezu má teda výhodne začiatok replikácie tzv. podmienečný.
Podmienečný začiatok replikácie podľa predloženého vynálezu môže pochádzať z plazmidov alebo bakteriofágov, ktoré majú nasledujúce vlastnosti: obsahujú vo svojom začiatku replikácie opakované sekvencie intrónov a kódujú aspoň iniciačný proteín replikácie (Rep), ktorý je špecifický. Z tohto titulu je možné napríklad citovať systémy podmienečnej replikácie nasledujúcich plazmidov a bakteriofágov:
plazmid alebo bakteriofág Špecifický iniciačný proteín
RK2 (Stalker et al 1981) Trf A
Rl (Ryder et al , 1381) Rep A
pSCIOl (Vocke and Bastia,1983) Rep A
F (Muroteu et al. 1981) proteín E
Rtel (Itoh et al. 1982, 1987) Rep A
RSF1010 (Miao et al., 1995) Rep C
PI [Abeles et al. 1984) Rep A
pla2mid alebo bakteriofág špecifický iniciačný proteín
P4 (Flenaburg and Calendar, 1987) proteín alfa
lambda (Moore et al.f 1981) proteín o
phi 82 (Moore et al., 1981) proteín O phi 82
phi 80 proteín O phi 80
Podľa uprednostneného spôsobu uskutočnenia vynálezu vznik replikácie v nárokovaných molekulách DNA pochádza z prírodného plazmidu E. coli nazývaného R6K.
Replikačné funkcie R6K sú zoskupené do fragmentu
5,5 kpb DNA (obrázok 1), ktorý obsahuje troch pôvodcov replikácie β a γ (γ a β zaisťujú 90 % replikácie) a operón kódujúci iniciačný proteín replikácie π a proteín Bis. Minimálna nevyhnutná genetická informácia na udržanie tohto plazmidu ajeho počtu charakteristických kópií (15 kópií na genóm) je obsiahnutá v dvoch elementoch: 400 pbd ori γ a gén pir, ktorého produkt je iniciačný proteín π.
Ori sa môže rozdeliť na dve funkčné časti: stredná časť a aktivačný element (obrázok 1). Stredná časť, najmä na replikáciu obsahuje intróny (7 priamych repetícií 22 pdb), kde sa viaže proteín π vyjadrený SEQ ID NO: 1 a segmenty, ktoré stoja vedľa seba, cieľové hostiteľské proteíny (IHF, DnaA).
Podľa uprednostňovaného spôsobu vynálezu začiatok replikácie nárokovaného vektora je zachovaný úplne alebo čiastočne začiatkom replikácie γ plazmidu R6k a najmä úplne alebo čiastočne SEQ ID NO: 1 alebo jedným z jeho derivátov.
V zmysle predloženého vynálezu termín odvodený znamená všetky sekvencie, ktoré sa odlišujú od požadovanej sekvencie z dôvodu degenerácie genetického kódu získaného jednou alebo viacerými modifikáciami genetickej povahy a/alebo chemickej povahy, rovnako ako všetky sekvencie, ktoré hybridizujú s týmito sekvenciami alebo fragmentárni týchto sekvencií, a ktorých produkt má naznačenú aktivitu iniciačného proteínu replikácie π. Modifikáciou genetickej povahy a/alebo chemickej povahy sa môžu očakávať všetky mutácie, substitúcie, delécie, adície a/alebo modifikácie jedného alebo viacerých rezíduí. Termín odvodený zahŕňa tiež všeobecné sekvencie a požadované sekvencie, pochádzajúce z iných bunkových zdrojov, najmä z buniek ľudského pôvodu alebo z iných organizmov a ktoré majú aktivitu rovnakého typu. Takéto všeobecné sekvencie sa môžu získať hybridizačnými pokusmi. Hybridizácia sa môže uskutočniť z bánk nukleových kyselín s použitím ako sondy pôvodnej sekvencie alebo fragmentu tejto sekvencie pri striktne dohodnutých podmienkach (Maniatis et al., pozri všeobecnú techniku molekulárnej biológie) alebo pri podmienkach striktne zvýšených.
Začiatok replikácie, opísaný ďalej, ktorý predstavuje výhodu, že má veľkosť veľmi obmedzenú, je jedinečne funkčný v prítomnosti špecifického iniciačného proteínu, proteínu Pi, produktu génu pir (SEQ ID NO: 2). Tento proteín, ktorý pôsobí na trans, je možné fyzikálne disociovať ori gamma génu pir, ktorý by mohol byť vložený do genómu bunky vybranej ako špecifická hostiteľská bunka tohto plazmidu. Mutácie v π môžu porušiť jeho iniciačné funkcie (Inuzuka et Wada, 1985) a vyvolať zvýšenie počtu kópií odvodených od R6K až do desaťnásobného počtu začiatočných kópií. Substitúcie sú všetky zahrnuté v doméne štyridsiatich aminokyselín, ktoré sa tak zdajú zodpovedné za riadenie π počtu plazmidových kópií (obrázok 2).
Podľa spôsobu uskutočnenia predloženého vynálezu proteín π, exprimovaný v hostiteľskej bunke, vyplýva z expresie génu vyjadreného SEQ ID NO: 2 alebo jedného z jeho derivátov, takých aké boli už skôr definované, najmä génu pir 116, ktorý obsahuje mutáciu vzhľadom na gén pir. Mutácia zodpovedá substitúcii prolínu leucínom. V tejto súvislosti počet kópií odvodených od R6K je v rozsahu asi 250 kópií na genóm.
Okrem podmienečného začiatku replikácie tak, ako už bolo skôr definované, nárokované molekuly DNA obsahujú oblasť obsahujúcu jeden alebo viac génov umožňujúcu zaistiť selekciu molekuly DNA pri vybranom hostiteľovi.
Môže ísť o klasické markery typu génu udeľujúce rezistenciu na antibiotiká, takým ako sú kanamycín, ampicilín, chloramfenikol, streptomycín, spectinomycín, lividomycín alebo iné.
Podľa uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia predloženého vynálezu táto oblasť je odlišná od génu udeľujúceho rezistenciu na antibiotiká. Môže ísť o gén, ktorého produkt je nezávislý od životaschopnosti rozmnoženého hostiteľa pri definovaných kultivačných podmienkach. Môže to byť napríklad:
- gén kódujúci supresorovú tRNA, prírodného alebo syntetického pôvodu. Môže ísť najmä o tRNA kodónu amber (TAG).
- gén, ktorého produkt je nevyhnutný pre metabolizmus bunky, pri určitých kultivačných podmienkach: gén zasahuje do biosyntézy metabolitu (aminokyselina, vitamín...), gén katabolizmu umožňujúci asimilovať látky prítomné v kultivačnom médiu (zdroj dusíka alebo uhlíka)...
Podľa uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia predloženého vynálezu táto oblasť obsahuje kazetu expresie génu kódujúceho supresorovú tRNA špecifických kodónov. Kyselina sa môže vybrať najmä medzi kyselinami kódujúcimi zásadu fenylalanínu, cysteínu, prolínu, alaninu a histidínu. Ide najmä o supresorovú tRNA kodónov amber (TAG).
Najmä v tomto prípade systém použitý na selekciu, pri hostiteľských bunkách, molekúl DNA podliehajúcich predloženému vynálezu obsahuje dva elementy:
1. na molekule DNA gén kódujúci RNA supresorového transferu kodónu amber (TAG), ktorý sa skladá z markeru selekcie, uvedeného génu (sup),
2. špecifický hostiteľ, ktorého jeden z génov najmä s určitými podmienkami kultivácie, obsahuje kodón amber TAG. Táto bunka by mohla rásť pri kultivačných podmienkach, pre ktoré produkt génu obsahujúceho kodón TAG je podstatný, iba ak plazmid umožňujúci expresiu sup je prítomný v bunke. Kultivačné podmienky tak tvoria tlak selekcie molekuly DNA. Použité gény sup môžu byť prírodného pôvodu (Glass et al., 1982) alebo môžu pochádzať zo syntetickej konštrukcie (Normanly et ak, 1986, Kleina et al., 1990).
Takýto systém ponúka veľkú flexibilitu do tej miery, že podľa génu zahŕňajúceho mutáciu amberu, je možné určiť rôzne vybrané médiá. Pri baktérii Lactococcus lactis, napríklad kodón amber je umiestnený v géne biosyntézy purínov. Umožňuje to selekciu plazmidu nositeľa génu kódujúceho supresorovú tRNA, keď sa baktérie rozmnožujú v mlieku. Takýto marker má výhodu, že môže mať veľkosť veľmi malú a výhodu, že neobsahuje „cudzie“ sekvencie pochádzajúce z fágu alebo transpozónov.
Podľa uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia predloženého vynálezu molekula DNA obsahuje okrem toho fragment DNA, regiošpecifický cieľ rekombináz, ktorý umožňuje uvoľnenie plazmidových multimérov.
Jeden takýto fragment včlenený na molekule kruhovej DNA, a jeho začiatok replikácie je napríklad ori umožňujúci upevniť multiméry takéhoto plazmidu. Takéto multiméry sú pozorované najmä, keď molekula DNA je pripravená z kmeňa nesúceho mutovanú alelu pir, ktorá umožní rozmnožiť počet kópií derivátov R6K, akoje pir-116.
Rekombinácia sa môže uskutočniť vďaka rôznym systémom, ktoré spôsobujú regiošpecifickú rekombináciu medzi sekvenciami. Regiošpecifická rekombinácia vynálezu sa získa prostredníctvom sekvencií intramolekulámej špecifickej rekombinácie, ktoré sú schopné rekombinovať medzi sebou v prítomnosti špecifických proteínov, všeobecne označených rekombinázy. V tomto presne stanovenom prípade ide o rekombinázy XerC a XerD. Z tohto dôvodu molekuly DNA podľa vynálezu všeobecne zahŕňajú okrem toho sekvenciu dovoľujúcu túto stereošpecifickú rekombináciu. Špecifický rekombinačný systém prítomný v genetických konštrukciách podľa vynálezu (rekombinázy a miesto špecifického rozpoznania) môže byť rôzneho pôvodu. Najmä špecifické sekvencie a použité rekombinázy môžu patriť k rôznym štruktúrnym triedam a najmä k rodine rezolvázy transpozónu Tn3 alebo k rodine integrázy bakteriofága lambda. Medzi rekombinázami patriacimi k rodine transpozónu Tn3 môžeme citovať najmä rezolvázu transpozónu Tn3 alebo transpozónov Tn21 a Tn522 (Stark et al., 1992), invertázy Gin bakteriofága mu alebo tiež rezolvázy takých plazmidov, ako rezolváza fragmentu par RP4 (Abert et al., Mol. Microbiol. 12 (1994) 131). Medzi rekombinázami patriacimi k rodine integrázy bakteriofága lambda, môžeme citovať najmä integrázy fága lambda (Landy et al., Science 197 (1977) 1147), P22 a 80 (Leong et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468), HP1 Haemophilus influenzae (Hauser et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 6859), integráza Cre fága PI, integráza plazmidu pSAM2 (EP 350 341) alebo tiež FLP rekombináza plazmidu 2 μ a rekombinázy XerC a XerD E. coli.
Molekuly DNA, predmety predloženého vynálezu, obsahujú fragment cer prírodného plazmidu E. coli ColEl. Použitý fragment ccr je fragment Hpall 382 pdb ColEl, ktorý ukázal, že umožňuje, v cis, rozdelenie multimérov plazmidov (Summers et al., 1984, Leung et al., 1985). Je tiež možné použiť fragment Hpall-Taql menšej veľkosti (280 pdb) alebo fragment ešte menší (asi 220 pdb), zahrnutý do fragmentu Hpall, ktorý má rovnaké vlastnosti (Summers and Sherratt, 1988). Rozdelenie prechádza špecifickou intramolekulámou rekombináciou, ktorá zasahuje štyri proteíny kódované genómom E. coli: ArgR, RepA, XerC a XerD (Stirling et al., 1988, 1989, Colloms et al., 1990, Blakelyetal., 1993).
Z tohto titulu je najmä výhodné použiť celok alebo časť fragmentu cer ColEl alebo jeden z jeho derivátov takých, aké sú už skôr definované.
Podľa preukázaného variantu molekuly DNA vynálezu môžu obsahovať okrem toho sekvenciu schopnú špecificky interagovať s ligandom. V uprednostňovanom spôsobe môže ísť o sekvenciu schopnú tvoriť hybridizáciou triplex so špecifickým oligonukleotidom. Táto sekvencia dovoľuje purifikovať molekuly vynálezu selektívnou hybridizáciou s imobilizovaným komplementárnym oligonukleotidom na nosiči (pozri prihláška vynálezu WO 96/18744). Sekvencia môže byť umiestnená v každom mieste molekuly DNA podľa vynálezu, a tým okamihom neurčuje funkciu génu záujmu a začiatku replikácie.
Čo sa týka reprezentatívnej molekuly DNA predloženého vynálezu môže sa predovšetkým nárokovať plazmid pXL2774 a jeho deriváty. V zmysle predloženého vynálezu sa chápe derivát ako všetky konštrukcie odvodené od pXL2774 a obsahujúce jeden alebo viac génov iných záujmov ako luciferázový gén. Môžu sa taktiež citovať plazmidy pXL3029 a 3030 obsahujúce kazetu expresie terapeutického génu a sekvenciu schopnú špecificky interagovať s ligandom.
Predložený vynález sa tiež týka metódy konštrukcie špecifických hostiteľských buniek, účinných najmä na tvorbu týchto terapeutických molekúl DNA.
Iný predmet predloženého vynálezu sa týka metódy tvorby kruhovej molekuly DNA vyznačenej tým, že sa kultivuje hostiteľská bunka obsahujúca aspoň takú molekulu DNA, aká je už skôr definovaná a proteín exprimovaný in situ alebo neexprimovaný, začiatok replikácie podmienečne účinný uvedenej molekuly DNA špecifickej, netýkajúcej sa uvedenej hostiteľskej bunky pri podmienkach umožňujúcich selekciu hostiteľských buniek transformovaných uvedenými molekulami DNA.
Proteín podmienečne funkčný začiatku replikácie molekuly DNA je exprimovaný in situ od zodpovedajúceho génu. Gén kódujúci iniciačný proteín replikácie môže sa niesť vedľajším replikónom, kompatibilným s derivátmi podmienene použitého začiatku replikácie alebo sa môže začleniť do genómu hostiteľskej bunky rekombináciou vďaka transpozónu, bakteriofágu alebo každým iným vektorom. Najmä v tomto prípade, kde gén exprimujúci proteín je umiestnený na vedľajšom replikóne, tento replikón obsahuje najmä oblasť promótora transkripcie funkčnej v bunke, takisto ako oblasť umiestnenú na 3' konci, a ktorá určuje signál ukončenia transkripcie. Čo sa týka oblasti promótora, môže ísť o oblasť promótora aj prirodzene zodpovednú za expresiu skúmaného génu, keď táto je schopná fungovať v bunke. Môže tiež ísť o oblasti rôznych pôvodov (zodpovedných za expresiu ďalších proteínov alebo rovnakých syntetických). Môže ísť najmä o sekvencie promótorov génov prokaryotov alebo bakteriofágov. Napríklad môže isť o sekvencie promótorov pochádzajúcich z genómu
Co sa týka génov kódujúcich iniciačný proteín replikácie, mohli by sa použiť buď divé gény, alebo mutované alely umožňujúce získať zvýšený počet kópií špecifických plazmidov (alebo derivátov) iniciačného proteínu podmieňujúce funkciu začiatku replikácie uvedeného v molekule DNA.
Opísali sa tieto mutanty pre plazmidy R6K (Inuzuka an Wada, 1985, Greener et al., 1990), Rtsl (Terawaki and Itoh, 1985, Terawaki et al., 1990, Zeng et al., 1990), F (Seelke et al., 1982, Helsberg et al., 1985, Kawasaki et al., 1991), RK2 (Durland et al., 1990, Haugan et al., 1992, 1995), pSCIOl (Xia et al., 1991, Goebel et al., 1991, Fang etal., 1993).
V prípade, že molekula DNA má začiatok replikácie odvodzujúci sa od plazmidu R6K, proteín iniciátora je odvodený od proteínu π tohto plazmidu. Predovšetkým je výhodné exprimovať mutovanú formu tohto proteínu schopného zvýšiť najmä počet začiatočných kópií. Integrovaný gén na úrovni hostiteľskej bunky je preto prednostne vyjadrený celkom alebo časťou sekvencie vyjadrenej SEQ ID NO: 2 alebo jedným z jeho derivátov, najmä génom pirl 16. Spojené mutácie zodpovedajú substitúcii prolínu leucínom. Podľa uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia vynálezu gén pirl 16 je priamo začlenený do genómu hostiteľskej bunky.
Jeden z génov špecifickej hostiteľskej bunky, nezávislý od podmienok vybranej kultivácie obsahuje špecifický kodón rozpoznateľný supresorovou tRNA vybranou na úrovni molekuly DNA. Podľa uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia vynálezu môže ísť o kodón amber TAG. V tomto prípade by bunka mohla rásť v kultivačných podmienkach, pre ktoré produkt génu obsahujúci kodón TAG je esenciálny, zvlášť, ak plazmid umožňujúci expresiu sup je prítomný v hostiteľskej bunke. Kultivačné podmienky tak zahŕňajú tlak selekcie molekuly DNA.
Gén obsahujúci kodón amber je gén účinkujúci v biosyntéze aminokyseliny arginínu. Tento gén argE kóduje N-acetylomitinázu (Meinnel et al., 1992), a v tom prípade obsahuje kodón TAG zodpovedajúci bodovej mutácii Gln53 (CAG)—>TAG; tlak selekcie plazmidu nesúceho gén sup je zaistený kultivačným minimálnym médiom M9 (Maniatis et al., 1989). V tomto prípade by to mohol byť tiež napríklad gén biosyntézy vitamínu, nukleovej bázy alebo tiež gén umožňujúci použiť zdroj uhlíka alebo dusíka, alebo každý iný gén, ktorého funkcia je nezávislá od životaschopnosti buniek s vybranými kultivačnými podmienkami.
Hostiteľská bunka je prednostne vybraná medzi kmeňmi E. coli a reprezentovaná najmä kmeňom E. coli XAC-1.
Podľa uprednostňovaného spôsobu uskutočnenia vynálezu hostiteľská bunka v nárokovanej metóde je bunka kmeňa E. coli XAC-1, obsahujúca vo svojom genóme gén pir 116 a transformovaná plazmidom pXL2774 alebo jedným z jeho derivátov.
Podľa variantu vynálezu hostiteľská bunka v nárokovanej metóde je bunka prokaryotická, v ktorej gén endAl alebo všeobecný gén je inaktivny. Gén endA kóduje endonukleázu I E, coli. Tento periplazmatický enzým má aktivitu prerušenia nešpecifickej dvojvláknovej DNA (Lehman,
I. R., G. G. Roussos and E. A. Pratt (1962) J. Biol. Chem. 237: 819 - 828, Wright M. (1971) (J. Bacteriol. 107: 87 - 94). Štúdia uskutočnená na rôznych kmeňoch Escherichia coli (divých alebo endA) ukázala, že degradácia plazmidovej DNA inkubovanej v extraktoch týchto bakteriálnych kmeňov existuje v kmeni endA+. ale nie v mutantoch endA (Wnendt S. (1994) BioTechniques 17: 270 - 272). Množstvo plazmidovej DNA izolovanej z kmeňov endA+ alebo z mutantov endA sa študovalo spoločnosťou Promega s použitím ich purifikačného systému (Shoenfeld, T., J. Mendez, D. Stors, E. Portman, B. Patterson, J. Frederikson and C. Smith 1995, Effects of bacterial strains carrying the endAl genotype on DNA quality isolated with Wizard plazmid purification systems, Promega notes 53). Ich záver je nasledujúci: Množstvo DNA pripravenej z mutantu endA je celkovo lepšie ako množstvo DNA pripravenej z testovaných kmeňov endA+.
Akosť prípravy plazmidovej DNA je teda určená každou kontamináciou týmito endonukleázami (degradácia DNA vo viac alebo menej dlhom čase).
Delécia alebo mutácia génu sa môže považovať do tej miery bezproblémová alebo mutanty nepredstavujúce už túto endonukleázovú aktivitu sa chovajú úplne ako divé baktérie (Durwald, H. and H. Hoffman-Berling (1968) J. Mol. Biol. 34:331 -346).
Gén endAl môže byť inaktivovaný mutáciou, úplnou alebo čiastočnou deléciou, prerušením atď. Inaktivácia génu endA kmeňa E. coli vybraného na tvorbu plazmidov pCOR sa môže uskutočniť tým, že prenesie vďaka bakteriofágu PI, deléciu endA::TcR opísanú Cherepanovom a Wackemagelom (Cherepanov, P. R. and Wackemagel. 1995. Gen disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibioti resistance determinant. Gene 158: 9 - 14) alebo tým, že vymení divé alely prítomné v genóme baktérie záujmu s mutovanou alelou alebo deletovanou endA a to všeobecnou rekombináciou. Použitie tohto typu kmeňa v rámci predloženého vynálezu výhodne umožňuje zvýšiť kvalitu produkovanej DNA.
Vynález sa tiež týka každej rekombinantnej bunky obsahujúcej molekulu DNA, takú aká už bola definovaná. Môže ísť najmä o bunky rôzneho pôvodu, typu eukaryotického, prokaryotického....
Tieto bunky sa získavajú všetkými odborníkom známymi technikami umožňujúcimi vložiť uvedený plazmid do určitej bunky. Môže ísť najmä o transformáciu, elektroporáciu, konjugáciu, fúziu protoplastov alebo o iné techniky známe odborníkom.
Molekuly DNA podľa vynálezu sa môžu použiť vo všetkých vakcinačných aplikáciách alebo v génovej terapii a bunkovej terapii na prenos génu do organizmu, tkaniva alebo určitej bunky, alebo na produkciu rekombinantných proteínov in vitro.
Používajú sa na priame podávanie in vi vo alebo na modifikáciu buniek in vitro, alebo ex vivo z pohľadu ich implantácie pacientovi.
Z tohto pohľadu ďalší predmet vynálezu sa týka všetkých farmaceutických kompozícií obsahujúcich aspoň molekulu DNA takú, aká bola definovaná už skôr. Táto molc kula môže alebo nemusí tam byť spojená s chemickým vektorom a/alebo biochemickým vektorom transfekcie. Môže ísť najmä o katióny (fosforečnan vápenatý, DEAE-dcxtrán...), o lipozómy. Spojené syntetické vektory môžu byť lipidy alebo katiónové polyméry. Ako príklad môžeme citovať vektory DOGS (Transfectam TM) alebo DOTMA (lipofectin TM).
Farmaceutické kompozície podľa vynálezu môžu byť formulované z pohľadu podávania a to tak topikálne, orálne, parenterálne, intranasálne, intravenózne, intramuskulárne, podkožné, intraokuláme, transdermikálne atď. Nárokovaný plazmid je použitý najmä vo forme injikovateľnej alebo v aplikácii. Môže to byť zmes každého farmaceutický akceptovateľného vehikula na injikovateľnú formuláciu, najmä na priamu injekciu na úrovni miesta na ošetrenie. Môže ísť najmä o sterilné roztoky, izotonické roztoky alebo suché kompozície, najmä lyofilizované, ktoré po pridaní, podľa prípadu, sterilizovanej vody alebo fyziologického séra umožňujú injikovateľnú formu. Môže ísť najmä o pufry Tris alebo PBS, v ktorých je rozpustená glukóza alebo chlorid sodný. Priama injekcia v postihnutej oblasti pacienta je zaujímavá, pretože umožňuje sústrediť terapeutický účinok na úrovni postihnutého tkaniva. Použitá dávka sa môže prispôsobiť funkcii rôznych parametrov, najmä funkcii génu, vektora, spôsobu použitého podávania, patológii alebo tiež času hľadaného liečenia.
Molekuly DNA vynálezu môžu obsahovať jeden alebo viac génov záujmu, totiž jednu alebo viac nukleových kyselín (cDNA, gDNA, syntetickú alebo semisyntetickú DNA, atď), ktorých transkripcie prípadne translácie v cieľovej bunke vytvárajú produkty, ktoré majú terapeutický, vakcinálny, agronomický alebo veterinársky význam. Medzi génmi terapeutického záujmu môžeme uviesť najmä gény kódujúce enzýmy, krvné deriváty, hormóny, lymfokíny, interleukíny, interferóny, TNF atď. (FR.9203120), rastové faktory, neuroprenášače alebo ich prekurzory, alebo enzýmy syntézy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF a FGF, BFGF, NT3, NT5 atď. apolipoproteíny: ApoAI, ApoAIV, ApoE atď. (FR 93 05125), dystrofm alebo minidystrofín (FR 9111947), supresorové gény nádorov: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev atď. (FR 9304745), gény kódujúce faktory zahrnuté do koagulácie: faktory VII, VIII, IX atď., samovražedné gény: tymidín kináza, cytozín deamináza atď: alebo tiež celok alebo časť prírodného alebo umelého imunoglobulínu (Fab, ScFv atď.), ligand RNA (WO91/19813) atď. Terapeutický gén môže byť tiež gén alebo antimediátorová sekvencia, ktorého alebo ktorej expresia v cieľovej bunke umožňuje riadenie expresie génov alebo transkripciu bunkovej mRNA. Takéto sekvencie môžu byť napríklad prepisované v cieľovej bunke, RNA komplementárnej bunkovej mRNA a môžu blokovať ich transláciu v proteine, podľa techník opísaných v EP 140 308.
Gén záujmu môže byť tiež vakcínový gén, teda gén kódujúci antigénový peptid schopný vytvárať u ľudí alebo zvierat imunitnú odpoveď z pohľadu realizácie vakcín. Môže ísť najmä o špecifické antigénne peptidy vírusu Epstein-Baarovej, vírusu HIV, vírusu hepatitídy B (EP 185 573), vírusu pseudobesnoty alebo tiež vírusov špecifických nádorov (EP 259 212).
V molekulách DNA vynálezu gén terapeutického, vakcinálneho, agronomického alebo veterinárneho významu obsahuje najmä oblasť promótora transkripčnej funkcie v bunke alebo v cieľovom organizme rovnako ako oblasť umiestnenú na 3'konci, ktorá určuje signál konca transkripcie a miesto polyadenylácie. Čo sa týka oblasti promótora, môže ísť o oblasť promótora prirodzene zodpovednú za expresiu požadovaného génu, keď tento gén je schopný fungovať v bunke alebo organizme. Môže tiež ísť o oblasti rôzneho pôvodu (zodpovedné za expresiu ďalších proteínov alebo rovnakých syntetických). Môže najmä ísť o sekvenciu promótorov eukaryotických génov alebo vírusových génov. Napríklad môže ísť o sekvencie promótorov pochádzajúcich z genómu cieľovej bunky. Medzi eukaryotickými promótormi sa môže použiť každý promótor alebo každá odvodená sekvencia stimulujúca alebo potláčajúca transkripciu génu špecificky alebo nešpecifický, induktívne alebo neinduktívne, silno alebo slabo. Môže ísť najmä o promótory ubikvitinové (promótory génov HPRT, PGK, a-aktín, tubulín atď ), promótory stredných vlákien (promótor génov GFAP, desmin, vimentin, neurovlákna, keratin atď.) promótory terapeutických génov (napríklad promótor génov MDR, CFTR, Faktor VIII, ApoAI atď.) špecifický tkanivový promótor (promótor génu pyruvát-kinázy, vilínu, väzbového intestinálneho proteínu na mastné kyseliny, a-aktín hladkého svalstva atď.) alebo tiež promótory zodpovedajúce stimulom (receptor steroidných hormónov, receptor retínovej kyseliny atď.). Môže tiež ísť o sekvencie promótorov pochádzajúcich z genómu vírusu, napríklad promótory génov E1A a MLP adenovírusu, raný promótor CMV alebo tiež promótor LTR RSV atď. Okrem toho tieto oblasti sa môžu modifikovať adíciou aktivačnej sekvencie, reguláciou sekvencie alebo umožňujú expresiu tkanivovo špecifickú alebo majoritnú.
Gén záujmu môže tiež obsahovať signálnu sekvenciu riadiacu produkt syntetizovaný v sekrečných prostriedkoch cieľovej bunky. Signálna sekvencia môže byť prírodná signálna sekvencia syntetického produktu, ale tiež môže ísť o každú inú funkčnú signálnu sekvenciu alebo o umelú signálnu sekvenciu.
Podľa génu záujmu, molekuly DNA vynálezu sa môžu použiť na liečenie alebo prevenciu počtu patológií, vrátane genetických ochorení (dystrofie, cystické atď.) neurodegeneratívne ochorenia (alzheimer, parkinson, ALS atď.) rakovín, patológií spojených s poruchami koagulácie alebo dyslipoproteinémie a počtu patológií spojených s vírusovými infekciami (hepatidídy, AIDS atď.) alebo patológií v oblastiach agronomických a veterinárnych atď.
Predložený vynález sa týka použitia DNA s podmienečnou replikáciou na produkciu rekombinantných proteínov. Baktérie sa môžu použiť na tvorbu proteínov rôznych pôvodov eukaryotov alebo prokaryotov. Medzi baktériami E. coli tvoria vybraný organizmus na expresiu heterológnych génov vzhľadom na jeho ľahkú manipuláciu, dôležitý počet systémov expresie použiteľných kvôli množstvu proteínov, ktoré sa môžu získať. Očakáva sa, že systém vynálezu je použiteľný v ďalších organizmoch, a že tropizmus je určený povahou začiatku replikácie, ako je naznačené už skôr. Na toto použitie nukleová sekvencia záujmu obsahuje kódovanú oblasť pod riadením signálov expresie vybraného vhodného hostiteľa, najmä prokaryotického hostiteľa. Môže ísť o promótory Plač, Ptrp, PT7, Ptrc, Ptac, PL, PR, sekvenciu Shine-Dalgamo atď. (spolu to tvorí kazetu expresie). Sekvenciou nukleovej kyseliny záujmu môže byť každá sekvencia kódujúca protein, ktorý má význam v oblastiach farmácie, agroalimentačných oblastiach, v oblastiach chémie alebo agrochcmie. Môže ísť o štruktúrny gén, o komplementárnu sekvenciu DNA, o syntetické sekvencie alebo semisyntetické atď.
Kazeta expresie môže byť začlenená do vektora podmienečnej replikácie, umožňujúci expresiu proteínov záujmu u E. coli. Tento vektor predstavuje viac výhod: žiadne použitie antibiotík na selekciu pri baktériách (menšie náklady, nie je potrebná štúdia, čo sa týka prítomnosti antibiotík v konečnom produkte alebo čo sa týka odvodených
SK 285317 Β6 produktov potenciálne toxických), prakticky nulová pravdepodobnosť roznášania plazmidov v prírode (podmienečný začiatok replikácie), možná fermentácia v úplnom definovanom médiu. Uvedené príklady ukazujú výhodné vlastnosti týchto podmienečných vektorov na tvorbu rekombinantných proteínov.
Nasledujúce obrázky a príklady bližšie ilustrujú vynález, bez toho, aby v akomkoľvek smere obmedzovali jeho rozsah.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1: Funkčná organizácia oblasti R6K zahrnutého do replikácie.
Obrázok 2: Organizácia funkčnej domény proteínu π plazmidu R6K.
Obrázok 3: Znázornenie protokolu vloženia génu pir do genómu E. coli XAC1.
Obrázok 4: Schéma konštrukcie vektorov pXL2666, 2730 a 2754.
Obrázok 5: Konštrukcia pXL2774.
Obrázok 6: Kinetika rastu a produkcie v dvojlitrovom fermentore.
Obrázok 7: Kinetika rastu a produkcie vo fermentore s obsahom 8001.
Obrázok 8: Konštrukcia pXL3056.
Obrázok 9: Zviditeľnenie proteínu aFGF produkovaného E. coli XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7poll23) po indukcii. Bunkové extrakty úplne denaturované sú umiestnené na polyakrylamidovom géli 12,5 %-SDS. M: označenie molekulovej hmotnosti (Biorad, Low range). Každý pruh je identiftkovaný šípkou a číslom, ktoré označuje ich hmotnosť v kD.
1: XAC-lpir-116 (pXL3056+pUC4K) neindukovaný, 2: XAC-lpir-116 (pXL3056+pUC4K) indukovaný 42 °C, 3: XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7poll23) kloň 1, neindikovaný, 4: XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7poll23) kloň 1, indukovaný 42 °C, 5: XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7poll23) kloň 2, neindukovaný, 6: XAC- lpir-116 (pXL3056+PT7poll23) kloň 2, indikovaný 42 °C, tl; 1 pg puriflkovaného aFGF, t4: 4 pg purifikovaného aFGF.
Obrázok 10: Schéma konštrukcie vektorov pXL3029 a pXL3O3O
Príklady uskutočnenia vynálezu
1-Materiál a metódy
A) Materiál
1. Kultivačná pôda
Použila sa úplná pôda LB, 2ΧΊΎ a SO a minimálna pôda M9 (Maniatis et al., 1989). Gélové pôdy sa získali prídavkom 15 g agaru Difco. Pôdy sa doplnili antibiotikami, ampicilínom alebo kanamycínom s koncentráciami 100 mg/1 ampicilínu a 50 mg/1 kanamycínu. Chromogénne substráty X-Gal a X-Gluc sa použili s koncentráciou 40 mg/1.
2. Kmene E. coli, plazmidy a bakteriofágy
Použité kmene E. coli, plazmidy a bakteriofágy sú identifikované v nasledujúcich príkladoch.
B) Metódy
1. Zaobchádzanie s DNA
Izolácia bakteriálnej DNA (plazmidová, genomická) a fágovej DNA (replikačná forma M13), digescia reštrikčnými endonukleázami, viazanie fragmentov DNA, elektroforéza na agaróze (pufor TBE) a iné štandardné techniky sa uskutočnili podľa odporučení dodávateľov na použitie enzýmov alebo sa prispôsobili opísaným protokolom v „Molecular Cloning: a Laboratory Manual“ (Maniatis et al., 1989).
Markery veľkosti použitej DNA v priebehu elektroforézy sú nasledujúce: stupnica - meradlo 1 kpb (BRL) pre lineárne fragmenty a marker silno zvinutej DNA (Stratagene) pre neriadené plazmidy.
Sekvenovanie sa uskutočnilo podľa Sangerovej techniky (Sanger et al., 1977) prispôsobenej automatizovanej metóde, ktorá používa fluorescenčné dideoxynukleotidy a TagDNA-polymerázu (PRISM Ready Reaction DyeDideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems).
Použité oligodeoxynukleotidy (opísané „seq+n“, pozri ďalej) sa syntetizovali na syntetizátore „Applied Biosystems 394 DNA/RNA Synthctizer“ fosforamiditovou metódou používajúcou chrániace skupiny β-kyanoetyly (Sinha et al., 1984). Po syntéze sa chrániaca skupina odstránila pôsobením amoniaku. Dve zrážania butanolom umožňujú purifikovať a koncentrovať oligonukleotid (Sawadogo et al., 1991).
Oligonukleotidové sekvencie použité na amplifikáciu PCR: SEQ ID NO: 3 5'-GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3'
SEQ ID NO: 4 5'-GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3'
SEQ ID NO: 5 5'-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3'
SEQ ID NO: 6 5'-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3'
Reakcie PCR (Saiji et al., 1985) sa uskutočnili s nasledujúcimi podmienkami v 100 μΐ objemu. Reakčná zmes obsahovala 150 ng genomickej DNA študovaného kmeňa, 1 μg každého z dvoch oligonukleotidov (24-mer), 10 μΐ pufra 10XPCR, ktorého zloženie bolo nasledujúce: 500 mM KC1, 0,1% želatíny, 20 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 a 2,5 jednotiek Taq DNA-polymerázy (Amplitaq Perkin-Elmer). Podmienky na PCR na prístroji Perkin-Elmer Cetus DNA Therminal Cycler boli nasledujúce: 2 minúty pri 91 °C, 30 cyklov nepretržitej denaturácie (1 minúta pri 91 °C), hybridizácia (2 minúty pri 42 °C) a elongácia (3 minúty pri 72 °C) a nakoniec 5 minút pri 72 °C. Takto získané produkty, riadené alebo neriadené reštrikčným enzýmom, sa analyzovali elektroforézou na agarózovom géli.
Analýza rôznych druhov plazmidov DNA topoizomerázou sa uskutočnila podľa nasledujúceho protokolu: Enzýmy purifikované v laboratóriu sa inkubovali v priebehu jednej hodiny pri teplote 37 °C. Reakčné zmesi (celkový objem 40 μΐ) mali nasledujúce zloženie: 150 ng plazmidu, 300 ng DNA-topoizomerázy I alebo 150 ng DNA-gyrázy E. coli, alebo 160 nm DNA-topoizomerázy IV S.aureus a 20 μΐ pufra špecifického pre každý enzým. Zloženie pufrov je naznačené ďalej:
pre DNA-topoizomerázu I: 50 mM Tris-HCl pH 7,7, 40 mM KC1, 1 mM DTT, 100 pg/ml SAB, 3 mM MgCl2, 1 mM EDTA, pre DNA-topoizomerázu IV: 60 mM Tris-HCl pH 7,7, 10 mM DTT, 100 pg/ml SAB, 6 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 350 mM glutamát draselný, pre DNA-gyrázu: 50 mM Tris-HCl pH 7,7, 5 mM DTT, 100 pg/ml SAB, 5 mM MgCL, 20 mM KC1.
2. Transformácia E. coli
Transformácia sa uskutočnila bežne podľa metódy TSB (Transformation and Storage Buffer) opísanej Chungom a Millerom (1988). Pre kmeň ako je TG1 (Gibson et al., 1984) účinnosť získanej transformácie sa pohybuje v rozsahu 105 - 106 transformantov na pg pUC4K (Vieira et Messing, 1982). Keď bolo nevyhnutné zvýšiť účinnosť transformácie, baktérie sa transformovali elektroporáciou podľa odporučeného protokolu výrobcu elektroporátora (Biorad). Táto metóda umožňuje dosiahnuť účinnosť až 108 až 1010 transformantov jedným pg pUC4K.
3. Bunková transfekcia katiónovým lipefektantom
Použité bunky boli myšacie fibroblasty NIH 3T3 zaočkované predchádzajúci deň na dosky s 24 jamkami, density 50 000 buniek na jamku. Použité kultivačné médium bolo médium DMEM, ktoré obsahovalo 4,5 g/1 glukózy, doplnené 200 mM glutamínu a antibiotikami (5.103 pg/ml streptomycínu, 5.103pg/ml penicilínu) (Gibco). Plazmatická DNA (1 pg v 25 pl 9 % roztoku NaCI) sa primiešala, objem/objem, k suspenzii lipofektantu. Testovali sa štyri pomery nábojov lipofektantu/náboj DNA a to 0, 3, 6 a 9. Tieto pomery sa vypočítali, keď sa uvažovalo, že 1 pg plazmidovej DNA nesie 3,1 nmólov negatívneho náboja, a že lipofektant obsahuje tri pozitívne náboje na molekulu. Po desaťminútovom kontakte, ktorý umožňuje tvorbu komplexu DNA/lipid, 50 pl zmesi DNA-lipofektant sa vložil na bunky v kultivačnom médiu bez séra (500 pl). Bunky sa vopred dvakrát prepláchlí rovnakým médiom. Zabránilo sa tak inhibícii transfekcie sérom. Po inkubácii (2 hodiny pri teplote 37 °C v inkubátore s prítomnosťou CO2) sa pridalo 10 % séra z teľacej pečene. Bunky sa potom znova umiestnili na inkubáciu počas 24 hodín.
4. Meranie aktivity luciferázy eukaryotických buniek
Meranie sa uskutočnilo 24 hodín po transfekcii. Luciferáza katalyzuje oxidáciu luciferínu v prítomnosti DNA, Mg2+ a O2 pri súčasnom vzniku fotónu. Úplná emisia svetla je meraná luminometrom a je úmerná aktivite luciferázy vo vzorke. Použité reagenty pochádzajú od firmy Promega (Luciferase assay systém) a použijú sa podľa odporučeného protokolu. Po lýze buniek, nerozpustné frakcie každého extraktu sa oddelili odstreďovaním. Dávkovanie sa uskutočnilo na 5 pl supematante zriedenom alebo nezriedenom v pufri na lýzu buniek.
5. Meranie proteínovej koncentrácie bunkového extraktu
Meranie sa uskutočnilo podľa metódy BCA (Píerce) (Wiechelman et al., 1988). Etalón stupnice SAB sa vypracoval v pufri na lýzu (pozri I1I-B-4). Dávky vzoriek a ich stupnica sa vopred spracovali, objem/objem s jódoacetamidom Ο,ΙΜ/pufor Tris 0,1 M, pH 8,2 v priebehu jednej hodiny pri teplote 37 °C. Toto spracovanie umožňuje vyhnúť sa poruchám v priebehu dávky redukčného agenta (DTT) prítomného v pufri na lýzu. Odpočet dávky sa uskutočňuje pri 562 nm.
Príklad 1
Konštrukcia hostiteľského kmeňa XAC-lpir a pir-l16 všeobecnou rekombináciou
Použitý kmeň je kmeň E. coli XAC-1 (Normanly et al., 1980). Gén argE tohto kmeňa výhodne obsahuje mutáciu Glutamín-53 (CAG) v kodóne amber (TAG) (Meinnel et al., 1992). Gén argE patrí k odlišnému operónu argECBH a kóduje enzým N-acetylomitinázu biosyntézy arginínu. XAC-1 nemôže teda syntetizovať arginín, a teda sa vyvíja v minimálnej pôde. Táto auxotrofía sa odstráni, ak kmeň kryje plazmid, ktorý umožňuje expresiu tRNA supresora. Bude teda možné, kultiváciou v minimálnom médiu, vybrať baktérie, ktoré nesú takýto plazmid. Aby umožnil replikáciu plazmidov odvodených od R6K, nevyhnutné bolo vložiť, všeobecnou rekombináciou, gén pir do genómu XAC-1. Gén pir (divý alebo mutovaný) je vložený do uidA výmenou medzi divým génom uidA a prerušenou kópiou génom pir (alebo pir-116). Gén uidA kóduje β-glukuronidázu, enzým hydrolýzy β-glukuronidov. Tento gén sa môže inaktivovať bez problémov, pretože nie je podstatný pre rast v prostredí klasickej syntézy, v ktorej β-glukuronidy nie sú použité. Aktivita β-glukuronidázy môže byť sústavná vďaka chromogénnemu substrátu X-Gluc, ktorého hydrolýza uvoľňuje modré farbivo.
1. Konštrukcia samovražedného vektora nesúceho kazetu KmR-uidA::pir (alebo pir-116)
Použila sa stratégia, ktorá zahŕňa jednu hostiteľskú baktériu, a ktorá minimalizuje modifikácie genómu kmeňa záujmu. Fág M14mpl0 (Messing et Vieira, 1982) sa použil ako samovražedný vektor (Blum et al., 1989). Mutácia ambre v géne II, podstatnom pre replikáciu, znižuje spektrum hostiteľa tohto fágu M13 v týchto kmeňoch, TG1 (supE), ktoré produkujú supresorovú tRNA amber, by sa tak mohli replikovať v kmeňoch E. coli sup+, ako XAC-1.
Kazety BamHI 3,8 kpb, ktoré obsahujú rezistentný gén ku kanamycínu Tn5 a-uidA::pir alebo pir-l 16 sa purifikovali od M13wm34 (-uidA::pir) a 33 (pir-l 16) (Metcalf et al., 1994). Klonovali sa v M13mpl0 linearizovanej BamHI. Rekombinatné klony sa vybrali rozložením na želatínovej pôde LB + Km po elektroporácii v TG1 spojovacou zmesou. Podoba klonov sa preukázala analýzou profilu reštrikcie a sekvenovaním oblasti zodpovedajúcej mutácii pir-116.
2. Vloženie pir alebo pir-l 16 do genómu E. coli XAC-1 všeobecnou rekombináciou génov
Prijatá stratégia a rôzne zahrnuté deje sú uvedené na obrázku 3.
a) Prvý dej rekombinácie
Kmeň XAC-1 sa transformoval elektroporáciou a 10, 100 alebo 2000 ng každého RF (mpl0-_uidA::pir alebo pir116). Tretina každej zmesi expresie sa rozložila na miskách LB, ktoré obsahovali kanamycín a inkubovala sa cez noc pri teplote 37 °C. Fágy mpl0-_uidA::pir alebo pir-l 16 sa nemôžu replikovať v kmeni XAC-1 (sup+). Označenie Km sa tak môže udržať len integráciou do genómu baktérie, cez všeobecnú rekombináciu s divou kópiou génu uidA. Získané výsledky elektroporácie sa pohybovali od 4.109 transformantov jedným pg pUC4K.
Tabuľka 1
Konštrukcia Počet tiskaných kolónií s množstvom transformonej DNA
10 ng 100 ng 2000ng
M13mplO-_uídA::pír 1 41 146
M13mpl0-_UÍdA::pir-16 0 16 124
SK 285317 Β6
V testovaných podmienkach počet integrantov stúpa nelineárne s množstvom DNA. Zo znalosti účinnosti transformácie a veľkosti RF (11,7 kpb) je možné odhadnúť približnú výšku rekombinácie. Keď sa uvažuje hmotnosť 100 ng, získa sa frekvencia rekombinácie rádu 10'6.
b) Druhý dej rekombinácie
Druhý dej rekombinácie bude vybraný na základe rezistencie kmeňov k deoxycholátu (DocR).
Na toto uskutočnenie 5 integrantov každej konštrukcie sa položilo do kultivačnej pôdy 2XTY s prídavkom 0,2 % deoxycholátu sodného. Preukázali sa dve odlišné populácie. Určité klony poskytujú dobre viditeľné poruchy po 8 hodinách pri teplote 37 °C (dva klony pre konštrukciu pir a tri klony pre konštrukciu pir-116). Iné klony mali hustú kultúru len po kultivácii cez noc pri teplote 37 °C. Podľa očakávania boli skoro všetky Kms. Pre každú študovanú elektroporáciu bolo ryhovaných 50 potomkov Kms na LB pridanej X-Gluc. Po 48 hodinách pri teplote 37 °C klony UidA+ boli bledomodré až dovtedy, pokiaľ klony, ktoré podstupujú nahradenie alel (prípad 1, obrázok 3), zostali na tomto médiu (UidA-) biele. Tabuľka zahŕňa analýzu fenotypov rekombinácie získanej dvojnásobne. Nahradenie alely podstúpili dvojnásobné rekombinanty (od 18 do 30 %).
Tabuľka 2
kmeň počet Kms medzi DocR % UidA’ medzí Kms
XAC-1 pir-2 50/50 18
XAC-1 pir-3 50/50 24
XAC-1 pir-4 50/50 34
XAC-1 pir-116-1 50/50 32
KAC-1 pir-116-4 35/5Q 30
3. Kontrola charakteru Pir+ rekombináciou získaných kmeňov
S cieľom presvedčenia sa o charaktere Pir+ získaných kmeňov dvojnásobnou rekombináciou, boli tri klony každej konštrukcie transformované pBW30 (metcalf et al., 1994). Získanie transformantov pre všetky testované klony umožnilo ukázať funkciu génov pir a pir-116 začlenených do genómu XAC-1. Pri rovnakých podmienkach sa nezískal žiadny transformant s rodičovským kmeňom XAC-1. Sledovala sa štúdia dvoch klonov XAC-1 pir (B a C) a dvoch klonovXAC-lpir-116(EaD).
4. Kontrola amplifikácií PCR kmeňov získaných rekombináciou
Na potvrdenie nahradenia alely sa uskutočnila kontrola amplifikácií PCR genomických oblastí a uidA. Každá dvojica oligonukleotidov sa tvorila jedným oligonukleotidom zodpovedajúcim internej oblasti pir a druhým oligonukleotidom zodpovedajúcim oblasti blízkej chromozomálnej uidA, ale nezahrnutého do fragmentu, ktorý slúžil na rekombináciu. Sekvencia tohto naposledy menovaného oligonukleotidu sa určila vďaka sekvencii ECOUIDAA Genbank (prístupové číslo: M14641). Overila sa tak presná pozícia génu pir v genóme baktérie. Povaha amplifikovaných fragmentov, ktorých veľkosť je súhlasná s veľkosťou, ktorú je možné predpokladať, sa potvrdila digesciou Mlul.
Príklad 2
Konštrukcie plazmidových vektorov odvodených od R6K, ktorý nesie marker selekcie sup Phe
Skonštruovali sa vektory, ktoré obsahujú 1 ori R6K a gén rezistentný na kanamycín (pXL2666). Pozorovaním multimérov pXL2666 v kmeni BW19610 (pir-116) 5 (Metcalf et al., 1993) sa pristúpilo ku štúdii vplyvu fragmentu cer ColEl na tento fenomén. Na vektore ori y-KmR-cer (pXL2730) bola potom predstavená kazeta expresie tRNA supresora fenylalanínu (sup Phe). Vektor pXL2760 slúži ako báza na konštrukciu vektora použiteľného v génovej terapii.
1. Konštrukcia a analýza vektorov, ktoré obsahujú ori γ R6K a gén rezistentný na kanamycín
a) konštrukcia
Do prvého plazmidu vytvoreného, pXL2666, je zahrnutý rezistentný gén na kanamycín pochádzajúcemu od pUC4K (Vieira et messing, 1982) a začiatok replikácie obsiahnutý vo fragmente EcoRI-BamHI 417 pdb pochádzajúci zo samovražedného vektora pUT-T7pol (Herrero et al., 1990) (obrázok 4). Prenos pXL2666 do kmeňa BW19094 a 19610 (Metcalf et al., 1994) umožnil ukázať, že množstvo plazmidu je zvýšené v kmeni pir-116 vzhľadom na rovnaký plazmid v kmeni pir. Analýza nedigerovaných plazmidov elektroforézou ukazuje, že toto zvýšenie vedie zároveň k objaveniu nejakých multimémych foriem. Pravdepodobne tento jav je spojený s intermolekulámou rekombináciou medzi niekoľkonásobnými kópiami plazmidu. Tiež sa skonštruoval pXL2730 tým, že sa klonoval na pXL2666 fragment cer prírodného plazmidu E. coli ColEl, pri ktorom sa preukázalo, že umožňuje v cis rozdelenie dimérov plazmidov (Summers and Sherrat, 1984). Použitý fragment zodpovedá fragmentu Hpall 382 pdb ColEl (Leung et al., 1985). Obsahuje špecifické miesto intramolekulámej rekombinácie, jedinečne zahŕňa, aby bol funkčný, proteíny hostiteľa, ktorých rekombinázy sú XerC a XerD a vedľajšie faktory sú ArgR a PepA (Stirling et al., 1988, 1989, Colloms et al., 1990). Po zaistení, aby pozorovaný účinok bol porovnateľný vďaka fragmentu cer, sa skonštruoval tiež kontrolný plazmid pXL2754, v ktorom fragment cer sa deletoval 165 pdb. Delécia ukázala, že došlo ako k potlačeniu účinku cer na rozlíšenie multimérov (Leung et al., 1985). Rôzne etapy klonovania, ktoré vedú ku konštrukcii týchto plazmidov, sú uvedené na obrázku 4.
b) Kvantitatívna a kvalitatívna analýza druhov plazmidov * elektroforetická analýza na agarózovom géli
Analýza rôznych skonštruovaných plazmidov umožnila preukázanie rôznych plazmidových druhov, rozdielnych podľa použitých kmeňov. Veľkosť nedigerovaných plazmidov sa porovnala vzhľadom k DNA silno zvinutej. V kmeni pir (BW19094), plazmidy pXL2666, 2754 a 2730 sú prakticky celkom vo forme monomémej. Pruhy pod každým hlavným pruhom zodpovedajú rôznym topoizomérom, nepatrne menej zvinutým ako potvrdenie pozorovaného profilu po účinku DNA gyrázy s pXL2730.
V prípade kmeňa pir-116 (BW19610) sú profily rôzne: pozorujú sa s plazmidmi pXL2666 a 2754 rôzne druhy, ktoré idú od monomérov k multimérom (2, 3 alebo 4 jednotky), majoritná forma je dimér. Po digescii EcoRI sa znova nachádza len lineárna plazmidová DNA, tieto plazmidové druhy zodpovedajú buď multimémym plazmidom, alebo rôznym topoizomérom. Čo sa týka veľkosti foriem určených vopred markerom DNA silno zvinutej, ktoré boli produktom monomémeho plazmidu, je veľmi pravdepodobné, že ide o multiméry. Tvorbu multimérov je možné veľmi
SK 285317 Β6 pravdepodobne pripočítať mutácii pir-116, aj keď dva kmene BW 19094 a BW19610 nie sú striktne izogénne (BW19610 je recA). Získaný profil s pXL2730 je rozdielny: aj keď multiméme formy sú ešte viditeľné, majoritná forma je monoméma. Fragment cer teda môže uľahčiť rozlíšenie plazmidových multimérov, ktoré sa skonštruovali a to nezávisle od recA v BW 19610.
*analýza po pôsobení DNA topoizomeráz
S cieľom poprieť hypotézu, podľa ktorej pozorované formy v kmeňoch, ktoré nesú alelu pir-116, budú zvláštnymi topoizomérmi, každá príprava plazmidov sa podrobila účinku DNA-topoizomeráz. Aktivity rôznych enzýmov, pri experimentálnych podmienkach sú nasledujúce: uvoľnenie DNA pre DNA-topoizomerázu I E. coii, silno zvinutá negatívna DNA uvoľňujúca DNA-gyrázu E. coli a rozpletenie spletenej DNA a uvoľnenie DNA silno zvinutej DNA-topoizomerázou IV S. aureus. Účinok DNA-topoizomerázy IV umožňuje ukázať, že plazmidová forma s vysokou molekulovou hmotnosťou nevzniká zo spletenia viacerých molekúl plazmidov, v tom prípade by boli konvertované na monomémy druh. Funkcia enzýmu sa kontrolovala podľa prípravy DNA kinetoplastov zložených z molekúl DNA zmotaných (neukázané). Aktivita uvoľnenia je tiež viditeľná, pretože sa získa druh migrujúci menej ako v kontrole. Účinok DNA gyrázy umožnil premeniť topoizoméry nepatrne uvoľnené v najzvinutejšom druhu, extrahovať baktérie (monomér alebo najmä dimér). Umožnil overiť, že pripravené DNA sú majoritné vo forme silno zvinutej. Takto ošetrené vzorky umožňujú potvrdiť predpovedané výsledky čo sa týka majoritných druhov pre každú konštrukciu. DNA-topoizomeráza I rozplietla DNA, ale len čiastočne. To by mohlo preukazovať, že študované plazmidy zahŕňajú len málo oblastí jednoduchých vlákien, na ktoré sa tieto enzýmy prednostne viažu (Roca, 1995).
2. Zavedenie markerov selekcie sup Phe na pXL2730
Použila sa kazeta expresie génu tRNA syntetického supresora (Phe) (Kleina et al., 1990). Gén sa vložil do polypeptidového reťazca pri tvorbe fenylalanínu vzhľadom na kodón TAG. V XAC-1 umožňuje produkciu proteínu ArgE dostatočne aktívneho na umožnenie rastu v prostredí ochudobnenom o arginín. Na plazmide pCT-2-F (Normanly et al., 1986), sup Phe sa exprimoval od syntetického promótora odvodeného od sekvencie promótora génu lpp E. coli, Plpp. Zastavenie transkripcie je zaistené syntetickým terminátorom operónu rmC E. coli, TrrmC (Normanly et al., 1986). Na obrázku 5 sú naznačené rôzne etapy klonovania.
Uskutočnili sa rôzne podklony v XAC-1. Funkcia kazety expresie tRNA supresora je riadená vďaka aktivite β-galaktozidázy tohto kmeňa, ktorý existuje len v prípade supresie kodónu amber génu lacZu]|8am. Posledná etapa spočíva vo vložení kazety expresie sup Phe do pXL2730. Získané výsledky s fragmentom cer (B-l-b) potvrdzujú výber tohto plazmidu ako pXL2666. Zachoval sa rezistentný gén na kanamycín, aby ďalšie klonovanie bolo jednoduché a najmä na doplnkové usporiadanie až k finálnemu klonovaniu (strata KmR).
Príklad 3
Potvrdenie plazmidového vektora na aplikácie v génovej terapii transfekciou myšacích fibroblastov
1. Konštrukcia nosného vektora pXL2774
S cieľom otestovať platnosť systému produkcie plazmidovej DNA v génovej terapii vložil sa do pXL2760 nos ný gén, použiteľný v cukaryotických bunkách. Použil sa gén luc, ktorý kóduje luciferázu z Photinus pyralis, pretože test bioluminescenčného merania je veľmi citlivý, a je lineárny na veľkej stupnici a šum pozadia spôsobený endogénnou aktivitou eukaryotických buniek je veľmi slabý. Gén luc je pod kontrolou sekvencií amplifikačného promótora raného génu ľudských cytomegalovírusov (promótor CMV), ktorý umožňuje zvýšenú expresiu. Na 3'luc sa nachádza nepreložená oblasť, pochádzajúca z vírusu SV40, ktorá obsahuje signál polyadenylácie (poly(A)+). Po strednom klonovaní, ktoré umožňuje zvýšenie počtu voľných miest reštrikcie, kazeta „promótor CMV-luc-poly(A)+“ je vložená na minimálny vektor ori γ -cer-sup Phe (pXL2760) k miestu markera KmR. Výsledný plazmid sa nazval pXL2774. Obrázok 6 naznačuje rôzne etapy klonovania. Spojovacia zmes sa transformovala elektroporáciou do XAC-lplr-l 16. Na inkubáciu, ktorá umožňuje baktériám expresiu markerov selekcie a uskutočňuje sa v bohatom médiu (médium SOC), je nevyhnutne premyť bunky dvakrát médiom M9 pred vystavovaním. To umožní vylúčiť zvyškové médium, ktoré by mohlo mať za následok šum pozadia kultúry na minimálnom médiu.
Médium vybrané na podrobenie buniek elektroporácii je minimálne médium M9, ktoré umožňuje selekciu baktérií, ktoré exprimujú supresorovú tRNA a teda prítomnosť daného plazmidu. Prídavok X-Gal umožňuje modrým zafarbením zviditeľniť expresiu supresorovej tRNA. Boxy sú analyzované po 20 hodinách pri teplote 37 °C. Neprítomnosť kolónií v porovnávanej vzorke bez DNA zaistila, že selekcia je správna aj s hustým rozmnožením. Všetky pokusné klony reštrikcií (8) nesú plazmid, zodpovedajúci očakávanému profilu. Takto skonštruovaný plazmid pXL2774 sa pripravil z klonu kultivovaného v jednom litri tekutého média M9 (asi 18 hodín pri teplote 37 °C) technikou, nazvanou menič iónov (súprava Promega, MegaPreps). Množstvo vzniknutej DNA je 2 mg.
2. Analýza nosného vektora pXL2774 transfekovaného do cicavčích buniek
Schopnosť pXL2774 transfekovať eukaryotické bunky a umožniť expresiu luciferázy je zvýšená transfekciou do myšacích fibroblastov NIH 3T3. Vektor vybraný ako referencia je plazmid pXL2622 (ide o plazmid pGL2 Promega, ktorého promótor SV40 sa nahradil promótorom CMV), ktorý nesie rovnakú kazetu expresie luciferázy ako pXL2774, ale na odlišnom replikóne. Odvodený je od Co1E1 6,2 kpb, ktorý nesie gén rezistentný na ampicilín. Tento plazmid slúži ako porovnávací. Aktivita luciferázy (exprimovaná v RLU, čiže relatívnej jednotky luminiscencie) je naznačená v tabuľke 3.
Najlepšie výsledky sa získali s pomerom „náboj lipofektantu/náboj DNA“ 6, s týmito podmienkami pXL2622 a 2774 sa zdajú byť ekvivalentné.
Tabuľka 3
pXL2522 PXL2774
pomer nábojov RLC/gg proteínov na kyvetu priemer koef. variácií t RLU/gg proteínov prie- koef. variácií %
0,0 0, 0
0 0,0 ND* 0,0 ND*
0,0 0,0
9,9.105 7,6 .10« 3,3.106 2,9 .10S
3 6,2.106 22 2,9.106 13
6,6.106 2,4.105
pXL2622 pXL2774
pomer nábojov RLU/gg proteínov na kyvetu prie- mer koef. variácií * RLU/pg proteínov prie- mer koef. variácií *
6 1,2.107 1,5 ,107 19 9,4.106 L, 0 ,107 7
1,5.107 9,9.106
1,9.107 1,1.107
3 9,5.106 1,0 107 26 1,1.107 6,4 .10« 13
7,5.106 8,3.106
1,4.107 8,5.106
*nedetekovatcľné
Príklad 4
Overenie charakteru samovražedného vektora pri E. coli plazmidoch pCOR
Nereplikačná vlastnosť plazmidov odvodených od R6K typu pCOR sa overila pokusom elektroporácie do E. coli JM109 (Yanisch-Perron et al., 1985) plazmidov pUC4K (ori ColEl-KmR, Vieira et Messing, 1982) a pXL2730 (ori stupnica R6K-KmR, pozri príklad 2). Použitý elektroporátor bol Gene Pulser Biorad a elektrokompetentné bunky JM109 sa pripravili a použili podľa odporučenia dodávateľa (Bacterial electro-transformation and pulse controller instruction manual, catalog number 165-2098).
Elektrotransformované bunky sa vystavili médiu LB s prídavkom kanamycínu (50 mg/1) a inkubovali sa cez noc pri teplote 37 °C. Získané výsledky sú uvedené ďalej.
Výsledky:
flazmid transformovaná množstvo (ng) počet tranBformantov účinnoeť (počet transformancov/ /ng plazmidu)
pUC4K 0, 01 »2000 >2105
pXL2730 5 0 0
Výsledky ukazujú, že je tu minimálne 5 log rozdielov medzi transformačnou účinnosťou derivátu ColEl (pUC4k) vzhľadom na derivát R6K (pXL2730) v kmeni neexprimujúcom gén pir. V kmeni pir+ aj XAC-lpir-116, účinnosť elektrotransformácie plazmidov odvodených od R6K má viac ako 108 transformantov/na pg plazmidu.
Príklad 5
Produkcia plazmidovej DNA kultúrou vysokej denzity kmeňa E. coli XAC-lpir-116 (pXL2774) : Postup fermentácie
5.1. Kmene: Produkcia v E. coli XAC-lpir-116 (príklad 1), produkcia minimálneho plazmidu pXL2774. Tento plazmid obsahuje nasledujúce elementy: ori R6K-cer-tRNAam-supPhe a kazetu expresie nosného génu lucpod riadením promótora CMV (príklad 3). Bola vyvinutá metóda vysokej produktivity na tvorbu tohto typu plazmidov.
5.2. Kultivačné médium a podmienky
a) rastové médium
- Zloženie definovaného média použitého na kultiváciu inokula (g/1): Na2HPO4 6, KH2PO4 3, NaCl 0,5, NH4C1 1, NH4H2PO4 3, glukóza 5, MgSO4 . 7 H2O 0,24, CaCl2. 2 H2O 0,015, tiamín HC1 0,01.
- Zloženie komplexného média použitého na kultiváciu vo fed-batch (g/1): KH2PO4 8, K2HPO4 6,3, Na2HPO4 1,7, (NH4)2SO4 O,74,NH4C10,12, kvasinkový extrakt 3, glukóza 2, MgSO4.7 H2O 2,4 g/1, CaCl2. 2 H2O 0,015, tiamín 0,01, roztok solí (Fe, Mn, Co, Zn, Mo, Cu, B, Al).
- Zloženie definovaného média na kultiváciu vo fed-batch médiu identické ku komplexnému médiu, ale kvasinkový extrakt je nahradený 2,5 g/1 NH4C1.
b) Podmienky kultivácie vo fed-batch
Pokusy v dvojlitrovom fermentore (Setric France), ktorý obsahuje 1 1 média sa uskutočnili na definovanie optimálnych podmienok rastu a produkcie plazmidovej DNA. Fermentor sa zaočkoval 80 ml inokula, ktoré sa odobralo pri začiatku stacionárnej fázy rastu.
V priebehu fermentácie sa pH automaticky kontrolovalo a udržiavalo medzi hodnotami 6,9 a 7,0 10 % amoniakom (p/obj.), teplota sa udržiavala na 37 °C, aerácia sa udržiavala na hodnote 75 1/h (1,1 wm) pod tlakom 0,2 bar a rozptýlený kyslík sa kontroloval (40 % saturácie vzduchu) spätným pôsobením na rýchlosť miešania a ak bolo potrebné, obohatením čistým kyslíkom.
Všetky tieto parametre (pH, teplota, miešanie, OD, O2 a CO2 vo vytekajúcom plyne) sa zhromaždili a vypočítali prostredníctvom fázového rozhrania HP3852 spojeného s Hewlctt-Packard 9000.
Základné zloženie výživného média je nasledujúce: zdroj uhlíka 50 %, síran horečnatý 0,7 %, tiamín 0,02 %, pre komplexné médium sa pridal kvasinkový extrakt s koncentráciou pohybujúcou sa v rozsahu 5 a 10 %.
Aby sa kultivačné podmienky prispôsobili fermentoru s obsahom 800 1, pripravili sa dve súvisiace inokulá produkovanej sekvencie, v laboratórnom meradle: inokulum I miešané v Erlenmayerovej banke a inokulum II v dvojlitrovom fermentore (kultivácia v batch), nasledovala kultivácia vo fed-batch a kultivácia v sedemlitrovom fermentore.
5.3. Výsledky
Študovali sa rôzne kultivačné podmienky v komplexnom médiu, v definovanom médiu a v rôznych stupňoch rastu. Vo všetkých prípadoch po iniciačnej kultivácii v batch bakteriálneho kmeňa a konzumácii zdroja uhlíka, výživné médium sa miešalo vo fermentore vďaka peristaltickej pumpe spojenej s profilom naprogramovaným vopred. Tento profil sa odvodil z vedľajších pokusov, v ktorých úroveň výživy sa prispôsobila buď miere kyslíka alebo miere konštantného rastu.
Na ľahkú extrapoláciu bez fermentačných podmienok od dvojlitrového do osemstolitrového fermentora, aby neprišlo k zosilneniu prekysličenia média, maximálna požiadavka na kyslík na konci kultivácie sa udržiavala na hodnote 2,5 - 3 mM/min. Preto úroveň rastu mikroorganizmu sa znížila, ak to bolo potrebné, na začiatku vyživovania účinkom komplementárneho náboja.
Ako sa ukázalo v tabuľke 4, získali sa veľmi dobré výsledky zároveň v komplexnom médiu a v definovanom médiu, a to v laboratórnom meradle alebo aj v meradle osemdesiatlitrového fermentora, kinetika rastu a produkcia plazmidovej DNA sú takmer porovnateľné (obrázok 6 a 7).
Tabuľka 4
komplexná pôda definovaná pôda
fermentor 2 alebo 7 1 fermentor (800 1) fermentor (2 1)
doba fermentácie (hodiny! 40 39 48
μ h-l 0,130 0,132 0,124
DO (€00 nal 114 100 94
X g/1 44 37 30
plazmidovej DNA (mg/1 pôdy) 115 100 100
plazmidovej DNA (mg/gX) 2,6 2,7 3,3
X = biomasa (váha sušených buniek)
Súhrnné výsledky zdôrazňujú, že:
- zmena meradla dvojlitrového fermentora na osemstolitrový fermentor sa môže uskutočniť bez akéhokoľvek problému,
- spotrebovaný kyslík je silno závislý od produkcii biomasy (1,08 g O2/g produkovanej biomasy),
- plazmid je stabilný aspoň v priebehu 50 generácií bez tlaku selekcie,
- môže sa získať zvýšenie biomasy, zvýšenie nad 40 g sušených buniek/liter, v komplexnom médiu,
- produkcia plazmidovej DNA presahuje 100 mg silno zvinutej DNA/liter média,
- existuje veľmi dobrá korelácia medzi produkciou DNA a biomasou: môže sa stanoviť produkcia 1 mg plazmidovej DNA/jednotka DO, alebo tiež 2,7 mg plazmidovej DNA/g biomasy a/alebo na dĺžke fermentácie,
- použitie definovaného média umožňuje tiež predpokladať biomasu (30 g suchých buniek/liter) a zvýšenú produkciu plazmidovej DNA (100 mg/l) a to bez straty produktivity.
Príklad 6
Prenos pXL2774 do zvieracích buniek in vitro a in vivo
6.1. Prenos in vitro pXL2774 do zvieracích buniek
Schopnosť minimálneho plazmidu pXL2774 transfekovať rôzne bunkové línie sa testovala in vitro, tak na bunkách ľudského pôvodu, ako aj na bunkách myšacieho pôvodu. Plazmid pXL2784 sa použil ako kontrola. Obsahuje rovnakú kazetu eukaryotickej expresie (promótor CMV-luciferáza-polyA), ako pXL2774, ale táto kazeta je odvodená od ColEl 6,4 kb, ktorý obsahuje gén, a ktorý udeľuje rezistenciu na kanamycín pri E. coli.
Testované bunky sú nasledujúce:
bunky typ ref.Atcc/1
3LL tnyéací pľúcny karcinôtn
NIH 3T3 fibroblasty myšacieho embrya CCL92
293 obličkové bunky ľudského embrya transformované adenovírusom typu 5 CRL1573
HeLa ľudský karcinfim krčku maternice CCL2
Caco-2 ľudský adenokarcinóni tračníka HTB37
bunky typ ref.Xtcc/l
H460 ľudský karcir.óm pľúc HTB177
ECV 304 ľudské endoteliálne bunky pupočnej Šnúry Takahashi et al.,1990
Podmienky transfekcie boli nasledujúce:
J-l: Rozmnoženie buniek hustoty 100 000 buniek na kyvetu (2 cm2, plak má 24 kyviet) v médiu DMEM (Dulbecco's modified Eagle Médium) doplnené 10 % séra z teľacej pečene (SVF).
J-3: Transfekcia buniek 10 μί transfekčného roztoku, ktorý obsahuje: 0,5 μg DNA, 150 mM NaCl, 5 % glukózy a 3 mmóly lipofektantu RPR120 535 na pg DNA v 250 μί kultivačného média, s prídavkom alebo bez prídavku 10 % SVF.
J-4: Obnovenie kultivačného média.
J-5: Premyté bunky PBS, potom lyzované 100 μί pufra na lýzu Promega (Promega Celí Lysis Buffer E153 A). Veľkosť aktivity luciferázy sa meria v luminometri Lumat LB 9501 (Berthold) na 10 μί lyzátu s integračným časom 10 sekúnd. Použitý reaktant je reaktant pochádzajúci z Promega (Promega Luciferase Assay Substráte). Výsledky, uvedené v nasledujúcich tabuľkách, sú vyjadrené v RLĽ (Relative Lights Unit) pre 10 μ] lyzátu (priemer merania v kyvetách). Taktiež sú vyznačené variačné koeficienty (CV).
Výsledky transfekcií v neprítomnosti séra sú uvedené ďalej.
typy buniek
MIH 3T3 3LL 293
pXL 2774 50 612 590 12 566 377 18 992 S00 59
pXL 2784 12 693 780 38 436 704 12 2 300 000 47
typy buniek
Hela H460 ECV304
pXL 2774 9 490 000 25 857 385 16 18 C21 30
pXL 2784 1 508 480 23 433 023 27 32 074 47
Tieto výsledky zdôrazňujú vysokú schopnosť pXL2774 pre transfekciu in vitro bunkových typov rôzneho pôvodu, tak myšacieho, ako aj ľudského. Expresia nosného génu luc umožňuje ukázať, že jeho transfekčná účinnosť je aspoň tak dobrá, ako účinnosť plazmidu „klasického“ odvodeného od ColEl, ktorý nesie rovnakú kazetu expresie luciferázy.
6.2. Prenos in vivo pri zvieratách (myšiach) pXL2774 a) Model 1: DNA do myšacieho holenného svalu
Plazmidová DNA v roztoku „5% glukózy, 150 mM NaCl“ je injektovaná do myšacieho holenného svalu OF1. Svaly sa odobrali sedem dni po injikácii, rozomleli, homogenizovali sa v 750 μί pufra na lýzu (Celí Lysis Buffer Promega E153A) a potom sa odstredili pri 20 000 g počas 10 minút.
Veľkosť aktivity luciferázy sa merala v 10 μί supematantu po prídavku 50 μί reaktantu (Promega Luciferase Assay Substráte). Odpočet sa uskutoční na luminometri Lumat LB9501 (Berthold) s časom integrácie 10 sekúnd.
Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke:
plazmid pXL 2784 pXL 2774 pXL 27B4 pXL 2774
počet svalov 6 3 10 10
injektovaný objem (μί): 30 30 33 33
μg ΕΝΑ/sval 19 13,5 10 6,25
RLU (pre 10 μΐ)
priemer 80 922 471 733 35 329 30 569
odchýlka 104 573 402 602 37 041 35 774
Výsledky naznačujú, že plazmid podmienečne replikovaný, ako je pXL2774, je schopný transfekovať myšacie svalové bunky in vivo a to s porovnateľnou účinnosťou dokonca aj vyššou ako plazmid „klasický“ odvodený od ColEl, ktorý nesie rovnakú kazetu expresie génu lucifcrázy.
b) Model 2: model nádoru 3T3 HER2
Model je nasledujúci:
- myši typu Swiss/nude dospelé samice,
- experimentálne nádory indukované po injekcii 107 buniek 3T3 HER2 podkožné na úrovni boku,
- injekcia transfekčnej zmesi je vykonaná 7 dní po injekcii buniek.
Injikovaný roztok: DNA sa najskôr rozpustí v pufri. Po prídavku všetkých produktov zmes obsahuje ďalšiu DNA, NaCl (150 mM) a 5 % D-glukózy vo vode alebo v pufri HEPES 5 mM.
Dva dni po injekcii sa nádorové tkanivo odobralo, odvážilo a potom rozomlelo a homogenizovalo v 750 μΙ pufra na lýzu (Promaga Celí Lysis Buffer E153 A). Po odstreďovaní (20 000 g počas 10 minút) sa odobralo 10 ml supernatantu, ktorý umožnil stanoviť aktivitu luciferázy. Táto aktivita je určená meraním úplnej luminiscenčnej emisie získanej po zmiesení s 50 μΐ reaktantu (Promega Luciferase Assay Substráte) v luminometri Lumat LB 9501 (Berthold) s integračným časom 10 sekúnd.
Výsledná aktivita stanovená v supematante tumorálneho lyzátu je vyjadrená v RLU (Relative Lighs Units).
pufor plazmid výsledok RLU/nádor +/n
H-C alebo HEPES odchýlka μα/ /n&dor [ADN] priemer odchýlka
HEPES pXL 2794 DXL 2774 10 10 0,5 μ^/μΐ 0,5 jtg/μΐ 744 150 1 016 380 682 434 1 322 500 6/6
H2O pXL 2784 PXL 2774 24 16,8 0,6 μα/μΐ 0.4 μ?/μΐ 2 906 073 4 292 043 1 745 857 4 995 187 8/8 6/6
h2o pXL 27B4 BXL 2774 7,5 5 0,3 gg/μΐ 0,2 pg/μΐ 702 554 3 413 430 5S2 207 4 000 875 6/7 6/5
Výsledky indikujú, že plazmid v replikačných podmienkach, ako je pXL2774, je schopný transfekovať myšacie nádorové bunky in vivo a to s účinnosťou aspoň porovnateľnou s účinnosťou plazmidu „klasického“ odvodeného od ColEl, ktorý nesie rovnakú kazetu expresie génu luciferázy.
Rôzne pokusy umožnili ukázať, že plazmid v replikačných podmienkach, najmä pXL2774, vyjadrujú transfekčné vlastnosti zvieracích buniek nevyhnutných na použitie v génovej terapii. Najmä sa preukázala:
1. schopnosť pXL2774 účinne transfekovať in vitro rôzne typy buniek ľudského pôvodu alebo myšacieho,
2. schopnosť pXL2774 transfekovať in vivo myšací sval,
3. schopnosť pXL2774 transfekovať in vivo nádorové bunky implantované pri myšiach.
Elektrotransformačné pokusy, fermentácia a transfekcia umožnili teda uviesť do platnosti plazmidy v replikačných podmienkach ako vektory použiteľné v génovej terapii, tým že ukazujú,
i) že sa nereplikujú detegovateľným spôsobom v kmeni E. coli neexprimujúce gén pir (podmienečný začiatok replikácie), ii) že produkty môžu byť v meradle kompatibilnom s priemyselnou výrobou, v médiu, ktoré môže byť úplne definované a ktoré neobsahuje antibiotiká, iii) že tieto plazmidy môžu transfekovať in vitro a skôr in vivo cicavčie bunky.
Príklad 7
Produkcia rekombinantných proteinov in vitro
7.1. Konštrukcia expresného vektora
Aby sa preukázala uskutočniteľnosť takéhoto prístupu, skonštruoval sa expresný vektor podľa kritérií už skôr opísaných (príklad 2 a 3). Tento vektor pXL3056 obsahuje:
1. bakteriálnu časť, ktorá zahŕňa podmienečný začiatok replikácie (ori γ), fragment cer ColEl a gén zaisťujúci selekciu pri baktériách (sup),
2. kazetu expresie, založenú na systéme opísanom Studierem (Studier et al., 1990) obsahujúcu promótor génu 10 bakteriofágu T7, operátor lacO, gén kódujúci aFGF 154 (acidic Fibroblast Growth factor alebo kyslý rastový faktor fibroblastov, forma obsahuje 154 aminokyselín) (Jaye et al., 1986) terminátor TF bakteriofágu T7. Táto kazeta expresie je identická kazete prítomnej na plazmide pXL2434 opísanom v prihláške vynálezu WO96/08572.
Konštrukcia pXL3056 je uvedená na obrázku 8. Fragment EcoRI-BglII pXL2434 (1,1 kb) obsahujúci kazetu expresie a FGF je klonovaný do podmienečného replikačného vektora pXL2979 (purifikovaný fragment 1,1 kb) na miestach BglII a EcoRI na vytvorenie pXL3056. pXL2979 vzniká zo spojenia troch fragmentov:
i) fragment AccI-Xbal pXL2730 (0,8 kb, ktorý prináša ori a cer), ii) fragment Narl-Sall pXL2755 (0,18 kb, ktorý prináša gén sup Phe), iii) fragment Sall-Spel pXL2660 (1,5 kb, ktorý prináša gén, ktorý udeľuje rezistenciu na kanamycin).
pXL2660 vzniká z klonovania fragmentu PstI 1,2 kb pUC4K (Vieira et Messing, 1982) v pMTL22 (Chambers et al., 1988) linearizovaný PstI.
7.2. Získanie kmeňa expresie
Plazmid pXL3056 sa vložil transformáciou do kmeňa XAC-lpir-116. Kmeň, ktorý vznikol, sa potom transformoval plazmidom PT7pol23 (Mertens et al., 1995) pri teplote 37 °C. Aby sa gén záujmu exprimoval pod riadením promótora T7, baktérie musia obsahovať vo svojom genóme na plazmide alebo bakteriofágu kazetu umožňujúcu expresiu RNA polymerázy bakteriofágu T7. V opísanom príklade sa použil plazmid PT7pol23, spojiteľný s derivátmi R6K ako je pXL3056, a ktorý umožňuje expresiu indukovateľnú teplotou RNA polymerázy bakteriofágu T7. Môže sa tiež uvažovať o lýze kmeňa XAC-lpir-116 lambdou DE3 (Studier et al., 1990), aby sa zachoval len plazmid a o indukovaní produkcie RNA polymerázy T7 skôr IPTG ako teplotou.
7.3. ExpresiaaFGF
Kmeň XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol23) je kultivovaný pri teplote 37 °C v minimálnom médiu M9 s prídavkom 0,2 % kasaminokyselín (DIFCO) a kanamycínu (25 pg/rnl) do optickej hustoty 0,6 - 1 pri 600 nm. Kultivačná pôda sa inkubovala pri teplote 42 °C (indukcia RNA polymerázy T7) a druhé médium sa inkubovalo pri teplote 30 °C (negatívna kontrola). Taký istý pokus je uskutočnený s kmeňom XAC-lpir-116(pXL3056+pUC4K), ktorý obsahuje porovnanie expresie aFGF bez prítomnosti RNA polymerázy T7.
Získané výsledky sú uvedené na obrázku 9. Ukazujú, že produkcia aFGF je porovnateľná alebo vyššia s produkciou pozorovanou pri BL21(DE3)(pXL2434) (WO96/08572), čo ukazuje možnosť plazmidov podmienečnej replikácie na expresiu rekombinantných proteinov in vitro najmä pri E. coli.
SK 285317 Β6
Príklad 8
Konštrukcia vektora pCOR, ktorý exprimuje divý proteín p53 alebo hybrid
Príklad opisuje konštrukciu vektorov s podmienečnou repiikáciou podľa predloženého vynálezu obsahujúcu nukleovú kyselinu kódujúcu proteín p53. Tieto vektory môžeme použiť na obnovenie aktivity typu p53 v chybných bunkách (mutovaných, deletovaných), takých, ako sú najmä nádorové bunky.
Kazeta eukaryotickej expresie obsahuje nasledujúce elementy:
1. raný promótor CMV „immediate early“ (polohy -522 až +72), nasleduje za vedúcou sekvenciou génu tymidínkinázy vírusu Herpes simplex typ I (poloha génu -60 až +1, vzhľadom na sekvenciu uvedenú v článku McKnight, S. L. (1980) Nucleic Acids Res. 8: 5949 - 5964),
2. nukleovú kyselinu, ktorá kóduje divý proteín p53 alebo variant proteínu p53 tak, ako je to opísané v prihláške vynálezu PCT/FR96/01111 (variant V325K = V325 so sekvenciou Kozák ATG),
3. polyadenylačnú sekvenciu poly A SV40.
Tieto elementy sa umiestnili vo forme fragmentu AscI-Xbal na vektore pCOR pXL2988 medzi miestami BssHII a sSpeJ. pXL2988 je identický pXL2979 (príklad 7.1.) nehľadiac na prítomnosť doplňovacieho elementu, sekvenciu schopnú tvoriť triplex DNA zloženú zo 17-násobného trinukleotidu GAA, umiestnenú vedľa začiatku replikácie.
Výsledné plazmidy sú pomenované pXL3029 a 3030 (obrázok 10).
Účinnosť týchto konštrukcií sa overila in vitro na bunkách p53-SAOS2 v kultúre meraním aktivity transaktivačného aktivátora proteínu p53 alebo p53superWT.
Použitá literatúra
Alting-Mees, M. A., J. A. Sorge, and J. M. Short. 1992. Methods Enzymol. 216: 483 - 495.
Blum, P. D. Hplzschu, H. S. Kwan, D. Riggs, and S. Artz. 1989. J. Bacteriol. 171:538-546.
Brosius, J. 1989. Methods Enzymol. 216: 469 - 483. Chambers, S. P., S. E. Prior, D. A. Barstow, and N. P. Minton. 1988. Gene 68: 139 - 149.
Chung, C. T., and R. H. Miller. 1988. Nucleic Acids Res. 16: 3580.
Colloms, S. D., P. Sýkora, G. Szatmari, and D. J. Sherrat. 1990 J. Bacteriol. 172: 6973 - 6980.
Datta, N., and P. Kontomichalou. 1965 Náture 208: 239 -241.
Dickley, F., D. Nilsson, E. B. Hansen, and E. Johansen. 1995. Mol. Microbiol. 15: 839 - 847.
Filutowicz, M., S. Dellis, I. Levchenko, M. Urh, F. Wu, and D. York. 1994. Prog. in Nucleic Acid Res. and Mol. Biol. 48:239 - 273.
Gibson, T. J. 1984. Ph. D Thesis. University of Cambridge. Greener, A., M. Filutowicz, M. McEachem, and D. Helinski. 1990. Mol. Gen. Genet. 224: 24 - 32.
Herrero, M., V. de Lorenzo, and K. N. Timmis. 1990. J. Bacteriol. 172: 6557-6567.
Hodgson, C. P. 1995. Bio/Technology 13: 222 - 225. Inuzuka, M., and Y. Wada. 1985. EMBO J. 4: 2301 - 2307. Jaye, M. et ah, (1986) Science 233: 541 - 5.
Kleina, L. G., J. M. Masson, J. Normanly, J. Abelson, and J. H. Miller. 1990. J. Mol. Biol. 213: 705 - 717.
Kowalczykowski, S. C., and A. K. Eggleston. 1994. Annu. Rev. Biochem. 63: 9991 - 10043.
Leung, D. W., E. Chen, G. Cachianes, and D. V. Goeddel. 1985. DNA 4: 351 - 355.
Maniatis, T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook. 1989. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.
Meinnel, T., E. Schmitt, Y. Mechulam, and S. Blanquet. 1992. J. Bacteriol. 174: 2323 - 2331.
Mcrtcns, N., E. Remaut and W. Friers. (1995) Bio/Technology 13: 175 - 179.
Messing, J., and J. Vieira. 1982. Gene 19: 269 - 276.
Metcalf, W. W., W. Jiang, and B. L. Wanner. 1994. Gene 138: 1 -7.
Miller, V. L., and J. J. Mekalanos. 1988. J. Bacteriol. 170: 2575 - 2583.
Normanly, J., J. M. Masson, L. G. Kleina, J. Abelson, and J. H. Miller. 1986. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6548 -6552.
Normanly, J., J. M. Masson, L. G. Kleina, J. Abelson, and J. H. Miller. 1990. J. Mol. Biol. 213: 719 - 726.
Roca, J. 1995. TIBS20: 156- 160.
Saiki, R. K., S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis, G. T.
Hom, H. A. Erlich, and N. Amhcim. 1985. Science 230: 1350- 1354.
Sanger, F., S. Nicklen, and A. R. Coulson. 1977. Proc. Natl. Acad. Sci USA 74: 5463 - 5467.
Sawadogo, M., and M. W. Van Dýke. 1991. Nucleic Acids Res. 19: 674.
Scott, J. R. 1984. Microbiol. Rev. 48: 1-23.
Simoes, D. A., M. Dal Jensen, E. Dreveton, M. O. Loret, S. Blanchin-Roland, J. L. Uribelarrea, and J. M. Masson. 1991. Ann. N. Y. Acad. Sci. 646: 254 - 258.
Šimon, R., U. Priefer, and A. Puhler. 1983. Bio/Technology 1: 784-791.
Sinha, N. D., J. Biemat, J. McManus, and H. Koster. 1984. Nucleic Acids Res 12: 4539 - 4557.
Stirling, C. J., G. Stwart, and D. J. Sherrat. 1988. Mol. Gen. Genet. 214: 80-84.
Stirling, C. J., S. D. Colloms, J. F. Collins, G. Szatmari, and D. J. Sherrat. 1989. EMBO J. 8: 1623 - 1627.
Studier, F. W., A. H. Rosenbcrg, J. J. Dunn, and J. W. Dubendorff (1990). Methods Enzymol 185: 60 - 89.
Summers, D. K., and D. J. Sherrat. 1984. Celí 36: 1097 -1103.
Takahashi, K., Y. Sawasaki, J. Hata, K. Mukai and T. Goto. (1990) In Vitro Celí Dev. Biol. 26: 265 - 74.
Vieira, J., and J. Messing. 1992. Gene 19: 259 - 268.
Wiechelman, K., R. Braun, and J. Fitzpatrick. 1988. Anál. Biochem. 175: 231 - 237.
Yanisch-Perron, C. Vieira, and J. Messing (1985) Gene 33: 103 - 119.
Zoznam sekvencií (1) Všeobecné informácie:
(i) podávateľ (A) Meno: RHONE-POULENC RORER S. A.
(B) Ulica: 20, Raymond ARON (C) Mesto: ANTON Y (D) Štát: Francúzsko (E) Smerovacie číslo: 92165 (G) Telefón: (1)40.91.69.22 (H) Fax: (1)40.91.72.96 (ii) názov vynálezu : Molekula kruhovej DNA s podmienečným začiatkom replikácie, postup jej prípravy a jej použitie v génovej terapii (iii) počet sekvencií: 6 (i v) počítačom čitateľná forma:
(A) typ nosiča: Tápe (B) počítač: IBM PC kompatibilný (C) operačný systém : PC-DOS/MS-DOS (D) logika: Patentln Relase #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) Informácie o sekvencii SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 389 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO 1:
TGTCAGCCGT TAAGTGTTCC TGTGTCACTG AAAATTGCTT TGAGÄGGCTC 50
TAAGGGCTTC TCAGTGCGTT ÄCA7CCCTGG CTTGTTGTCC ACAACCGTTA 100
GCTTTAAAAG CCTTAIATAT TCTTTTTTTT CTTATAAAAC 150
TTAAÄACCTT AGAGGCTATT TAACTľGCTG ATTTATATTA ATTTTAITGT 200
TCAAACATGA GAGCTTAGTA CGTGAAACAT GAGAGCTTAG TACGTTAGCC 250
ATGAGAGCT* AGTACGTTAG CCATGAGGGT TTAGTTCGTT AAACATGAGA 300
GCTTAGTACG TTAAACATGA GAGCTTAGTA CGTGAAACAT GAGAGCTTAG 3S0
TACGTACTAT CAÄCAGGTTG AACTGCTGAT CTTCAGATC 389
(2) Informácie o sekvencii SEQ ID NO: 2:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 960 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO 2:
TATACAGAAT GATGAGGTTT TTTTMGAGA CTCAAGGTCA TGATGGACGT 50 GAACAAAAAA ACGAAAATTC GCCACCGAAA CGAGCTAAAT CACACCCTGG 100 CTCAACTTCC TITGCCCGCA AAGCGAGTGA TGTATATGGC GCTTGCTCCC 150 ATTGATAGCA AAGAACCTCT TGAACGAGGG CGAGTTTTCA AAATTAGGGC 200 TGAAGACCTT GCAGCGCTCG CCÄAAATCAC CCCA1CGCTT GCTTATCGAC 250 AATTAAAAGA GGGTGGTAAA TTACTTGGTG CCAGCAAAAJ TTCGCTAAGA 3CC GGGGATGATA TCATTGCTTT AGCXAAAGAG CTTAACCTGC CCTTTACTGC 3 50 TAAAAAC7CC CCTGAAGAGT TAGATCTTAA CATTATTGAG TGGATäGCTT 400 ATTGAAATGA TGAAGGATAC TTGICTTTAA AATTCACCAG AACCATAGAA 4 5C CCATATATCT CTAGCCTTAT TGGGAAAAÄA AATAAATTCA CAACGCAATT 5CO GTTAACGGCA AGCTTACGCT TAAGTAGCCA GTATTCATCT TCTCTTTATC 550 AACTTATCAG GAAGCATTAC TCTAATTTTA AGAAGAAAAA TTATTTTATT 600 ATTTCCGTTG AľGAGTTAAA GGAAGAGTTA ACAGCTTAľA CTTTTGATAA 650 AGATGGAAAT ATTGAGTACA AÄIACCCTGA CTTTCCTATT TTTAÄAAGGC- 700 ATGTGTTAAA TAÄÄGCCATT GCTGAAATTA AAAAGAAAAC AGÄAATATCG ?SO TTTGTTGGCT TCACTGTTCA TGAAAAAGAA GGAAGAAAÄA TTAGTAAGCT 8CC GAAGTTCGAA TTTGTCGTTQ ATGAAGATGA ATTFKTGGC GATAAAGATG 950 ATGAAGCTTI TTTTATGAAT TTATCTGAAG CTGÄTGCAGC TTTTCTCAAG 900 GTATTTÄATG AAACCGTACC TCCCÄAAAAA GCTAAGGGGT GATATATGGC 950 TAAAATTTC 950 (2) Informácie o sekvencii SEQ ID NO: 3:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 24 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO 3:
GACCAGTATT ATTATCTTAA TGAG 24 (2) Informácie o sekvencii SEQ ID NO: 4:
(1) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 24 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO 4: GTATTTATG AAACCGTACC TCCC 24 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 5:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 24 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO 5:
CTCTTTTAAT TGTCGATAAG CAAG 24 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 6:
(i) charakteristika sekvencie:
(A) dĺžka: 24 párov báz (B) typ: nukleotid (C) počet vlákien: jedno (D) konfigurácia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNA (xi) opis sekvencie: SEQ ID NO 6:

Claims (32)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Molekula kruhovej DNA použiteľná v génovej terapii obsahujúca aspoň jednu nukleovú kyselinu terapeutického záujmu a signály regulácie expresie, ktorej transkripcia a translácia v cieľovej bunke vytvárajú produkt záujmu, vyznačujúca sa tým, že
    a) uvedená molekula DNA obsahuje podmienečný začiatok replikácie, ktorý-je odvodený z plazmidu alebo bakteriofága, a ktorých funkčnosť v prokaryotickej bunke vyžaduje prítomnosť replikačného iniciačného proteínu, ktorý je špecifický pre uvedený plazmid alebo bakteriofág, a ktorý je cudzí pre prokaryotickú hostiteľskú bunku,
    b) uvedená molekula DNA neobsahuje replikačný iniciačný proteín,
    c) uvedená molekula DNA obsahuje selekčný marker redukovanej veľkosti, ktorý je odlišný od génu udeľujúceho rezistenciu na antibiotikum, a
    d) uvedená molekula DNA sa replikuje len v bunkách schopných komplementovať uvedenený iniciačný proteín.
  2. 2. Molekula DNA podľa nároku 1,vyznačujúca sa tým, že podmienečný začiatok replikácie pochádza z plazmidu alebo z bakteriofága, ktoré majú začiatok replikácie vyjadrený niekoľkými intrónmi, a ktorá kóduje aspoň špecifický proteín podmieňujúci funkciu začiatku replikácie.
  3. 3. Molekula DNA podľa nároku 1 alebo 2, vyz Bičujúca sa tým, že podmienečný začiatok replikácie môže pochádzať z plazmidov alebo nasledujúcich bakteriofágov RK2, R6K, Rl, pSCIOl, Rtsl, F, RSF1010, PI, P4, lambda, Phi82 a Phi80.
  4. 4. Molekula DNA podľa nároku 1 až 3, vyznačujúca sa tým, že uvedený začiatok replikácie pochádza z bakteriálneho plazmidu R6K.
  5. 5. Molekula DNA podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že uvedený začiatok replikácie je tvorený čiastočne alebo úplne začiatkom replikácie plazmidu R6K.
  6. 6. Molekula DNA podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že uvedený začiatok replikácie je vyjadrený čiastočne alebo úplne sekvenciou SEQ ID NO: 1 alebo každou sekvenciou, ktorá sa odlišuje od sekvencie SEQ ID NO: 1, vzhľadom na degeneráciu genetického kódu.
  7. 7. Molekula DNA podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa t ý m , žc oblasť, ktorá umožňuje selekciu hostiteľských buniek inkorporujúcich uvedenú molekulu DNA, je vyjadrená čiastočne alebo
    SK 285317 Β6 úplne kazetou expresie transferovej RNA supresora špecifických kodónov.
  8. 8. Molekula DNA podľa nároku 7, vyznačujúca sa t ý m , že ide o kazetu expresie tRNA supresora kodónov amber (TAG).
  9. 9. Molekula DNA podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že ďalej obsahuje cieľovú regiošpecifickú rekombinázovú oblasť.
  10. 10. Molekula DNA podľa nároku 9, vyznačujúca sa tým, že táto cieľová regiošpecifická rekombinázová oblasť sa môže vybrať medzi resolvázami transpozónov Tn3, Tn2j. alebo Tn522, invertázami bakteriofága mu, resolvázami plazmidov ako kódovaná fragmentom par RP4 rekombinázy rodu integrázy bakteriofága lambda ako integrázy lambda, Phi80, P22, HP1, integráza Cre Pl, integráza plazmidu pSAM2, FLP rekombináza plazmidu 2 a rekombinázy XerC a XerD E. coli.
  11. 11. Molekula DNA podľa nároku 9 alebo 10, vyznačujúca sa tým, že táto cieľová regiošpecifická rekombinázová oblasť obsahuje celý alebo časť fragmentu cer ColEl alebo menší fragment, ktorý má rovnaké vlastnosti.
  12. 12. Molekula DNA podľa jedného z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúca sa tým, že sekvencia nukleovej kyseliny záujmu kóduje proteín farmaceutický, agroalimentačne významný alebo použiteľný v biokatalýze.
  13. 13. Molekula DNA podľa nároku 12, vyznačujúca sa tým, že sekvencia nukleovej kyseliny záujmu kóduje proteín vybraný medzi enzýmami, krvnými derivátmi, hormónmi, lymfokínmi: interleukíny, interferóny, TNF, rastové faktory, neuroprenášače alebo ich prekurzory, alebo enzýmy syntézy, trofické faktory ako BDNF, CNTF, NGF, 1GF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, apolipoproteíny ako ApoAl, ApoAIV, ApoE, dystrofín alebo minidystrofín, supresorové gény nádorov ako p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, gény kódujúce faktory zahrnuté do koagulácie ako faktory VII, VIII, IX, samovražedné gény ako tymindín-kináza, cytozín-deamináza, celok alebo časť prírodného imunoglobulínu alebo umelého imunoglobulínu ako je Fab, ScFv, RNA ligand, antisense sekvencia alebo špecifické antigénové peptidy vírusu Epstein-Barrovej, vírusu HIV, vírusu hepatitídy B, vírusu pseudobesnoty alebo tiež špecifických nádorov.
  14. 14. Spôsob produkcie molekuly kruhovej DNA, vyznačujúci sa tým, že sa kultivujú hostiteľské bunky obsahujúce aspoň:
    - molekulu kruhovej DNA obsahujúcu aspoň nukleotidovú sekvenciu záujmu a oblasť umožňujúcu jej replikáciu obsahujúcu začiatok replikácie, ktorého funkcia v hostiteľskej bunke vyžaduje prítomnosť aspoň špecifického proteínu, ktorý sa netýka uvedenej hostiteľskej bunky, a
    - iniciačný proteín replikácie exprimovaný in situ alebo neexprimovaný, podmieňujúci funkciu uvedeného začiatku replikácie, ktorý sa špecificky netýka uvedenej hostiteľskej bunky, v podmienkach, ktoré umožňujú selekciu transformovaných hostiteľských buniek uvedenými molekulami DNA.
  15. 15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa t ý m , že gén kódujúci iniciačný proteín replikácie je prítomný na pripojenom replikóne alebo včlenený do genómu uvedenej bunky.
  16. 16. Spôsob podľa nároku 14 alebo 15, vyznačujú c i sa t ý m , že ide o molekulu DNA obsahujúcu začiatok replikácie, tak ako je definované v nárokoch 4 až 6, a tým, že uvedený proteín je buď odvodený od proteínu π plazmidu R6K, alebo je odlišný od tohto proteínu modi fikáciou jeho sekvencie kódovanej alebo tvorenej fragmentom tohto proteínu, aj keď má rovnakú aktivitu.
  17. 17. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa t ý m , že proteín π alebo jeden z jeho derivátov je exprimovaný in situ z génu pir vyjadreného SEQ ID NO: 2 alebo každou sekvenciou rôznou od SEQ ID NO: 2, vzhľadom na degeneráciu genetického kódu, alebo každou sekvenciou, ktorá hybridizuje s týmito sekvenciami alebo s fragmentmi týchto sekvencii prítomnými v hostiteľskej bunke, a ktorých produkt má aktivitu špecifického proteínu iniciátora replikácie.
  18. 18. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa t ý m , že proteín je exprimovaný z génu pir 116 zahrnutého v genóme uvedenej bunky.
  19. 19. Spôsob podľa jedného z nárokov 14 až ^vyznačujúci sa tým, že jeden z génov hostiteľskej bunky, ktoré sú nevyhnutné vo vybraných podmienkach kultivácie, obsahuje špecifický kodón rozpoznateľný vybranou supresorovou tRNA na úrovni molekuly DNA.
  20. 20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa t ý m , že tento gén obsahuje kodón amber TAG.
  21. 21. Spôsob podľa jedného z nárokov 14 až 20, v y značujúci sa t ý m, že bunka je vybraná medzi kmeňmi E. coli.
  22. 22. Spôsob podľa jedného z nárokov 14 až 21, v y značujúci sa t ý m, že bunka pochádza z kmeňa E. coli XAC-1.
  23. 23. Spôsob podľa jedného z nárokov 14 až 22, v y značujúci sa tým, že uvádza kmeň E. coli XAC-1, zahŕňajúci vo svojom genóme gén pir 116 transformovaný plazmidom pXL2774 alebo každou konštrukciou, ktorá je odvodená od pXL2774, zahŕňajúcu jeden alebo viac génov záujmu iných ako je luciferázový gén.
  24. 24. Rekombinantná bunka transformovaná aspoň jednou molekulou DNA podľa jedného z nárokov 1 až 13.
  25. 25. Farmaceutická kompozícia obsahujúca jednu alebo viac molekúl DNA podľa jedného z nárokov 1 až 13.
  26. 26. Použitie molekuly DNA podľa jedného z nárokov 1 až 13 na prípravu liečiva na transfekciu in vitro, ex vivo a/alebo in vivo génu záujmu v hostiteľskej bunke.
  27. 27. Použitie molekuly DNA podľa jedného z nárokov 1 až 13 na tvorbu rekombinantných proteínov in vitro.
  28. 28. Molekula podľa nároku 1, vyznačujúca sa t ý m , že nukleová sekvencia záujmu kóduje divý alebo modifikovaný proteín p53.
  29. 29. Molekula podľa nároku 1, vyznačujúca sa t ý m , že nukleová sekvencia záujmu kóduje tymidin-kinázu.
  30. 30. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa t ý m , že bunka je kmeňa E. coli endAl.
  31. 31. Molekula DNA podľa jedného z nárokov 1 až 13, vyznačujúca sa tým, že ďalej obsahuje sekvenciu schopnú špecificky interagovať s ligandom.
  32. 32. Molekula DNA podľa nároku 13, vyznačujúca sa t ý m , žc nukleová kyselina záujmu kóduje proteín p53.
SK347-98A 1995-09-15 1996-09-13 Molekula kruhovej DNA s podmienečným začiatkom replikácie, spôsob jej prípravy a jej použitie v génovej terapii SK285317B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9510825A FR2738842B1 (fr) 1995-09-15 1995-09-15 Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique
PCT/FR1996/001414 WO1997010343A1 (fr) 1995-09-15 1996-09-13 Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK34798A3 SK34798A3 (en) 1998-11-04
SK285317B6 true SK285317B6 (sk) 2006-10-05

Family

ID=9482580

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK347-98A SK285317B6 (sk) 1995-09-15 1996-09-13 Molekula kruhovej DNA s podmienečným začiatkom replikácie, spôsob jej prípravy a jej použitie v génovej terapii

Country Status (20)

Country Link
US (3) US6977174B2 (sk)
EP (3) EP0850310B1 (sk)
JP (3) JP3818665B2 (sk)
KR (1) KR100522369B1 (sk)
AT (3) ATE284966T1 (sk)
BR (1) BRPI9610511B8 (sk)
CA (1) CA2229307C (sk)
CZ (1) CZ294525B6 (sk)
DE (3) DE69636878T2 (sk)
DK (3) DK0850310T3 (sk)
ES (3) ES2281721T3 (sk)
FR (1) FR2738842B1 (sk)
HU (1) HU224400B1 (sk)
IL (4) IL123641A0 (sk)
NO (1) NO323975B1 (sk)
PT (3) PT850310E (sk)
SK (1) SK285317B6 (sk)
TW (1) TWI231826B (sk)
WO (1) WO1997010343A1 (sk)
ZA (1) ZA967640B (sk)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7038026B2 (en) * 2000-05-26 2006-05-02 Centelion Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide
FR2738842B1 (fr) * 1995-09-15 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique
US7279313B2 (en) * 1995-09-15 2007-10-09 Centelion Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
US6821759B1 (en) 1997-06-23 2004-11-23 The Rockefeller University Methods of performing homologous recombination based modification of nucleic acids in recombination deficient cells and use of the modified nucleic acid products thereof
US6156574A (en) 1997-06-23 2000-12-05 The Rockefeller University Methods of performing gene trapping in bacterial and bacteriophage-derived artificial chromosomes and use thereof
CZ299473B6 (cs) 1997-06-30 2008-08-06 Rhone-Poulenc Rorer S. A. Nukleová kyselina a elektrické pole jako sdruženýprodukt pro prenos nukleové kyseliny do bunek prícne pruhovaného svalstva
US6022716A (en) 1998-04-10 2000-02-08 Genset Sa High throughput DNA sequencing vector
WO2000075299A1 (en) * 1999-06-07 2000-12-14 Cell Genesys, Inc. Hybrid yeast-bacteria cloning system and uses thereof
AU6229800A (en) * 1999-07-20 2001-02-05 Rockefeller University, The Conditional homologous recombination of large genomic vector inserts
FR2821855B1 (fr) † 2001-03-09 2004-04-02 Cayla Genes synthetiques et plasmides bacteriens depourvus de cpg
FR2822476B1 (fr) * 2001-03-23 2004-04-02 Aventis Pharma Sa Procedes de purification et de detection de sequences cibles d'adn double brin par interaction triple helice
AU2002325346A1 (en) 2001-07-05 2003-01-21 Aventis Pharma S.A. Method of administration of a gene of interest to the heart and vasculature
US6989261B2 (en) * 2001-12-20 2006-01-24 Eli Lilly And Company Butyrylcholinesterase variant polypeptides with increased catalytic efficiency and methods of use
US7049121B2 (en) 2001-12-20 2006-05-23 Applied Molecular Evolution Butyrylcholinesterase variant polypeptides with increased catalytic efficiency and methods of use
FI116068B (fi) 2003-09-15 2005-09-15 Fit Biotech Oyj Plc Uusi selektiojärjestelmä, siinä käyttökelpoinen vektori, bakteerisolukantoja sekä menetelmä solujen valikoimiseksi
JP4581851B2 (ja) * 2004-07-27 2010-11-17 セイコーエプソン株式会社 電気光学装置の駆動回路及び駆動方法、電気光学装置並びに電子機器
CA2608636C (en) * 2005-05-17 2015-02-10 Frank Koentgen Sequential cloning system
US8716021B2 (en) * 2005-09-07 2014-05-06 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of replicators to prevent gene silencing
EP2386564B1 (en) * 2005-10-01 2014-07-16 Charles Stout Regulatable fusion promoters
GB0606190D0 (en) 2006-03-28 2006-05-10 Isis Innovation Construct
CN102124102B (zh) * 2008-07-18 2013-12-18 麦克赛特股份有限公司 优化电穿孔的方法
EP2221066A1 (en) 2009-02-18 2010-08-25 Sanofi-Aventis Use of VgII3 activity modulator for the modulation of adipogenesis
EP2547768B1 (en) 2010-03-17 2015-12-30 Association Institut de Myologie Modified u7 snrnas for treatment of neuromuscular diseases
US9403880B2 (en) 2010-11-26 2016-08-02 Institut Pasteur Identification of a human gyrovirus and applications
WO2013083753A2 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Institut Pasteur Identification of a swine parecho-like virus and applications
WO2014035457A1 (en) 2012-08-29 2014-03-06 Nature Technology Corporation Dna plasmids with improved expression
WO2014077863A1 (en) 2012-11-19 2014-05-22 Nature Technology Corporation Replicative minicircle vectors with improved expression
WO2014153205A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Epeius Biotechnologies Corporation Thymidine kinase diagnostic assay for gene therapy applications
WO2019057774A1 (en) 2017-09-19 2019-03-28 Deutsches Krebsforschungszentrum NON-INTEGRATING DNA VECTORS FOR THE GENETIC MODIFICATION OF CELLS
EP3456821B2 (en) 2017-09-19 2024-01-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Non-integrating dna vectors for the genetic modification of cells
SG11202009009UA (en) 2018-03-21 2020-10-29 Nature Tech Corporation Viral and non-viral nanoplasmid vectors with improved production
WO2023241567A1 (zh) * 2022-06-13 2023-12-21 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种可提高无筛选标签质粒制备效率的野生型-突变体π蛋白切换表达系统

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4190495A (en) * 1976-09-27 1980-02-26 Research Corporation Modified microorganisms and method of preparing and using same
US4342832A (en) * 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
US4727028A (en) * 1981-06-22 1988-02-23 Eli Lilly And Company Recombinant DNA cloning vectors and the eukaryotic and prokaryotic transformants thereof
US4654307A (en) * 1983-02-17 1987-03-31 The Research Foundation Of State University Of New York Novel bacteria containing a plasmid having a tRNA code
US4761367A (en) * 1984-11-07 1988-08-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vectors suitable for detection of eukaryotic DNA regulatory sequences
US5859208A (en) * 1988-07-06 1999-01-12 Fiddes; John C. Human basic fibroblast growth factor analog
US5198343A (en) * 1986-08-05 1993-03-30 Transgene, S.A. Method for expressing a heterologous protein in a dapD- mutant of E. coli and the strain obtained
US5591632A (en) * 1987-03-02 1997-01-07 Beth Israel Hospital Recombinant BCG
US5510099A (en) * 1987-05-01 1996-04-23 Stratagene Mutagenesis testing using transgenic non-human animals carrying test DNA sequences
US5024939A (en) * 1987-07-09 1991-06-18 Genentech, Inc. Transient expression system for producing recombinant protein
US5693622A (en) * 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
JPH03187383A (ja) * 1989-09-04 1991-08-15 Takeda Chem Ind Ltd 発現プラスミドおよびその用途
EP0485701A1 (en) * 1990-09-28 1992-05-20 American Cyanamid Company Insertion of DNA by modified transposons
TW201794B (sk) * 1991-05-03 1993-03-11 American Cyanamid Co
US5714323A (en) * 1991-08-30 1998-02-03 The University Of Medecine And Dentistry Of New Jersey Over expression of single-stranded molecules
US5444149A (en) * 1992-05-11 1995-08-22 Duke University Methods and compositions useful in the recognition, binding and expression of ribonucleic acids involved in cell growth, neoplasia and immunoregulation
US5434065A (en) * 1993-05-06 1995-07-18 President And Fellows Of Harvard College In vivo selection of microbial virulence genes
WO1995005452A2 (en) * 1993-08-12 1995-02-23 Cytotherapeutics, Inc. Improved compositions and methods for the delivery of biologically active molecules using genetically altered cells contained in biocompatible immunoisolatory capsules
US5679647A (en) * 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
US5700657A (en) * 1993-12-13 1997-12-23 Genzyme Corporation Vectors and vector systems including genes encoding tumor suppressor proteins and producer cells transformed thereby
IL109558A (en) * 1994-05-04 2004-08-31 Yissum Res Dev Co DNA structures Derived from the SV40 virus that include DNA sequences External
AU2946695A (en) * 1994-07-08 1996-02-09 Schering Corporation Method for identifying nucleic acids encoding c-fos promoter activating proteins
DE4428402A1 (de) * 1994-08-11 1996-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Gentherapeutisches Verfahren unter Verwendung von DNA-Vektoren ohne Selektionsmarker-Gen
US5792647A (en) * 1995-02-13 1998-08-11 The Johns Hopkins University Bacterial catabolism of chitin
US6254874B1 (en) * 1995-04-13 2001-07-03 President And Fellows Of Harvard College Attenuated auxotrophic microorganisms having a combination of non-attenuating mutations and method for making same
US5763270A (en) * 1995-06-07 1998-06-09 Genemedicine, Inc. Plasmid for delivery of nucleic acids to cells and methods of use
US7279313B2 (en) * 1995-09-15 2007-10-09 Centelion Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
US7364894B2 (en) * 1995-09-15 2008-04-29 Centelion Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
FR2738842B1 (fr) * 1995-09-15 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique
US5830879A (en) * 1995-10-02 1998-11-03 St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Treatment of vascular injury using vascular endothelial growth factor
US5851808A (en) * 1997-02-28 1998-12-22 Baylor College Of Medicine Rapid subcloning using site-specific recombination
US5874259A (en) * 1997-11-21 1999-02-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Conditionally amplifiable BAC vector

Also Published As

Publication number Publication date
NO981044L (no) 1998-03-10
ATE492642T1 (de) 2011-01-15
IL173399A (en) 2010-11-30
DK0850310T3 (da) 2005-04-25
PT850310E (pt) 2005-05-31
WO1997010343A1 (fr) 1997-03-20
ES2357098T3 (es) 2011-04-18
BR9610511B1 (pt) 2010-10-19
US20090149406A1 (en) 2009-06-11
DK1724354T3 (da) 2011-04-04
TWI231826B (en) 2005-05-01
SK34798A3 (en) 1998-11-04
MX9802005A (es) 1998-08-30
EP0850310A1 (fr) 1998-07-01
DK1508620T3 (da) 2007-05-29
FR2738842B1 (fr) 1997-10-31
BR9610511A (pt) 1999-01-26
JP2000501281A (ja) 2000-02-08
JP2006136328A (ja) 2006-06-01
US20010014476A1 (en) 2001-08-16
EP0850310B1 (fr) 2004-12-15
PT1508620E (pt) 2007-05-31
FR2738842A1 (fr) 1997-03-21
HU224400B1 (hu) 2005-08-29
ATE284966T1 (de) 2005-01-15
JP4585435B2 (ja) 2010-11-24
AU6992496A (en) 1997-04-01
DE69638314D1 (de) 2011-02-03
DE69636878T2 (de) 2007-11-08
NO323975B1 (no) 2007-07-30
EP1724354A2 (fr) 2006-11-22
HUP9900018A3 (en) 2001-10-29
IL123641A0 (en) 1998-10-30
IL207348A0 (en) 2010-12-30
CA2229307A1 (fr) 1997-03-20
CZ78898A3 (cs) 1998-06-17
US20090130674A1 (en) 2009-05-21
ZA967640B (en) 1997-03-25
ES2281721T3 (es) 2007-10-01
BRPI9610511B8 (pt) 2016-11-08
JP3818665B2 (ja) 2006-09-06
EP1724354B1 (fr) 2010-12-22
KR100522369B1 (ko) 2006-10-24
US6977174B2 (en) 2005-12-20
EP1508620A1 (fr) 2005-02-23
IL173399A0 (en) 2006-06-11
AU728231B2 (en) 2001-01-04
EP1508620B1 (fr) 2007-01-24
KR19990044683A (ko) 1999-06-25
JP4756014B2 (ja) 2011-08-24
IL123641A (en) 2006-06-11
NO981044D0 (no) 1998-03-10
DE69634043T2 (de) 2005-08-18
ES2233975T3 (es) 2005-06-16
CA2229307C (fr) 2013-06-11
JP2007325603A (ja) 2007-12-20
DE69634043D1 (de) 2005-01-20
HUP9900018A1 (hu) 1999-04-28
CZ294525B6 (cs) 2005-01-12
DE69636878D1 (de) 2007-03-15
PT1724354E (pt) 2011-03-09
EP1724354A3 (fr) 2008-10-29
ATE352630T1 (de) 2007-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK285317B6 (sk) Molekula kruhovej DNA s podmienečným začiatkom replikácie, spôsob jej prípravy a jej použitie v génovej terapii
US7807444B2 (en) Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
US7364894B2 (en) Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
MXPA98002005A (en) Molecules of circular dna with origin of conditional replication, its process of preparation and its use in therapy gene

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20150913