NO323975B1 - DNA-molekyl, fremgangsmate for dets fremstilling, vertcelle, farmasoytisk preparat, nevnte DNA-molekyl for medisinsk bruk samt ulike anvendelser av nevnte DNA-molekyl - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et sirkulært DNA-molekyl, fremgangsmåte for dets fremstilling, vertcelle transformert med nevnte sirkulære DNA-molekyl samt et farmasøytisk preparat omfattende nevnte sirkulære DNA-molekyl. Videre vedrører foreliggende oppfinnelse nevnte sirkulære DNA-molekyl for medisinsk bruk samt ulike anvendelser av nevnte sirkulære DNA-molekyl.

Ved genterapi korrigeres en defekt eller en anomali ved å innføre genetisk informasjon inn i den påvirkede celle eller det påvirkede organ. Denne informasjon kan innføres enten in vitro inn i en organavledet celle som videre blir reinjisert i organismen, eller in vivo, direkte i det tilsiktede vev. Dreier det seg om et molekyl med høy molekylvekt og negativ ladning, har DNA'et vanskeligheter med spontant å traversere de cellulære fosfolipid membraner. Følgelig benyttes det derfor forskjellige vektorer for å tillate overføring av genet: på den ene side virale vektorer og på den annen side kjemiske og/eller biokjemiske, naturlige eller syntetiske vektorer.

De virale vektorer (retrovirus, adenovirus, adeno-assosierte virus) er meget effektive, særlig for passasje av membraner, men oppviser visse risikofaktorer slik som patoge-nisitet, rekombinasjon, replikasjon, immunogenisitet osv.

Kjemiske og/eller biokjemiske vektorer gjør det mulig å unngå slike risikofaktorer (for et overblikk, se Behr, 1993, Cotten og Wagner, 1993). Eksempler på slike vektorer er kationer (kalsiumfosfat, DEAE-dekstran og så videre) som virker ved å denne presipitater med DNA som så kan fagocyteres av cellene. Det kan likeledes dreie seg om liposomer der DNA'et innarbeides og som så fusjoneres med plasma membranen. De syntetiske vektorer for overføring av gener er generelt lipider eller kationiske polymerer som kompleksdanner DNA og sammen med dette danner en partikkel som bærer positive ladninger på overflaten. Som illustrasjon på denne type vektorer kan særlig nevnes dioktadecylamidoglycylspermin (DOGS, Transfectam™) eller N-[l-(2,3-dioleyloksy)propyl]-N,N,N-trimetylammoniumklorid (DOTMA, Lipofectin™).

Anvendelsen av kjemiske og/eller biokjemiske vektorer eller naken DNA muliggjør produksjon av store mengder DNA av farmakologisk renhet. I de genterapeutiske teknikker består da medikamentet av selve DNAet og det er vesentlig å kunne fabrikkere, i de tilpassede mengder, DNA med de riktige egenskaper for en terapeutisk anvendelse hos mennesker.

Når det gjelder ikke-viral vektorologi, anvendes det plasmider av bakteriell opprinnelse. Plasmidene som generelt benyttes ved genterapi bærer (i) en replikasjonsopprinnelse, (ii) et markørgen som et antibiotikumresistensgen (mot kanamycin, ampicillin og så videre) og (iii) et eller flere transgener med de sekvenser som er nødvendig for deres ekspresjon (en eller flere enhancere, promotere, polyadenyleringssekvenser osv.).

Det er i EP485701 beskrevet plasmider med kondisjonale replikoner hvis funksjonalitet er avhengig av E. coli DNA-pol I, en polymerase som er naturlig til stede i en rekke prokaryote vertsceller. Videre inneholder de beskrevne plasmider et antibiotisk resistensgen.

Det er videre i US4761367 beskrevet en vektor med SV40 replikasjonsorigo som er avhengig av T-antigenet for å replikere i vertscellen. Nevnte plasmid er i stand til å replikere i en eukaryot celle.

Det er videre i Journal of bacteriology, vol. 177, no. 17, September 1995, side 4865-4871 beskrevet et DNA plasmid som er egnet for introduksjon av en nukleinsyresekvens i en prokaryot vertscelle. De beskrevne vektorer inneholder ingen signaler som muliggjør ekspresjon i eukaryote celler.

Imidlertid gir ikke den teknologi som i dag er tilgjengelig, helt og holdent tilfredsstil-lende resultater.

På den ene side foreligger det en risiko for spredning i organismen. Således kan en bakterie som er til stede i organismen, om enn med lav hyppighet, motta plasmidet.

Dette har større sjanse for å inntreffe når det dreier seg om en genterapeutisk behandling in vivo der DNA kan spres i organismen hos pasienten og kan befinne seg i kontakt med bakterier som infiserer pasienten eller også bakterier av commensal flora. Hvis bakterien som er mottager for plasmidet, er en enterobakterie som E. coli, kan dette plasmidet replikeres. Et slikt evenement fører så til en spredning av det terapeutiske gen. I den grad der de terapeutiske gener som benyttes ved genterapeutiske behandlinger kan kode for eksempel for et lymfokin, en vekstfaktor, et anti-onkogen eller et protein hvis funksjon gir feil hos verten og således tillater å korrigere en genetisk feil, kan spredning av visse av disse gener ha uforutsigelige og uønskede effekter (for eksempel hvis en patogen bakterie erverver genet av en human vekstfaktor).

På den annen side har plasmidene som generelt benyttes ved ikke-viral genterapi også en antibiotikurnresistensmarkør (mot ampicillin, kanamycin, osv.). Bakterien som erverver et slikt plasmid har således en unektelig selektiv fordel fordi enhver anti-bioterapeutisk behandling som anvender et antibiotikum fra den samme familie som den som seleksjonerer plasmidets resistensgen, kan føre til seleksjon av det angjeldende plasmid. I denne forbindelse utgjør ampicillin en del av 6-laktamene som er den anti-biotikumfamilie som benyttes oftest i dag. Anvendelsen av seleksjonsmarkører hos bakterier som ikke er resistensgener mot antibiotika er således særlig fordelaktig. Den forhindrer seleksjon av bakterier som kan motta et plasmid som bærer en slik markør.

Det er således spesielt viktig å søke maksimalt å begrense spredning av de terapeutiske gener og resistensgenene.

Foreliggende oppfinnelse har særlig til hensikt å foreslå nye DNA-molekyler som kan benyttes ved genetisk terapi eller for fremstilling av rekombinante proteiner in vitro som ikke replikeres annet enn i celler som kan komplementere visse funksjoner av disse ikke-virale vektorer.

Oppfinnelsen angår likeledes en spesielt effektiv metode for fremstilling av disse DNA-molekyler.

De krevede DNA-molekyler har fordelen av å eliminere de risikofaktorer som er forbundet med en spredning av plasmidet slik som; (1) replikasjon og spredning som kan medføre en ikke-kontrollert overekspresjon av det terapeutiske gen,

(2) spredning og ekspresjonen av resistensgenet.

Den genetiske informasjon som inneholdes i DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen omfatter således det eller de terapeutiske gener og reguleringssignåler for deres ekspresjon, en funksjonell kondisjonell replikasjonsopprinnelse som meget sterkt begrenser det cellulære vertsspektrum for dette plasmid, en seleksjonsmarkør med redusert størrelse annet enn et gen som gir resistens mot et antibiotikum og eventuelt, et DNA-fragment som tillater oppløsning av multimerer av plasmid. Sannsynligheten for at disse molekyler (eller den genetiske informasjon de inneholder) skal kunne stabilt overføres til en mikroorganisme er meget begrenset.

Vektorene ifølge oppfinnelsen, også kalt miniplasmider på grunn av deres sirkulære struktur, reduserte størrelse og superviklede form, oppviser de følgende ytterligere fordeler: På grunn av den reduserte størrelse i forhold til de klassisk benyttede plasmider som er avledet fra ColEl, har DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen potensielt en bedre biotilgjengelighet in vivo. Særlig oppviser de forbedret penetrasjonsevne og cellulær-fordeling. Videre er det erkjent at diffusjonskoeffisienten i vev er omvendt proporsjonal med molekylvekten (Jain, 1987). På det cellulære nivå har molekyler med høy molekylvekt på samme måte en mindre god permeabilitet gjennom plasma membranen. For passasje av plasmidet til kjernen, noe som er essensielt for ekspresjonen, er videre den forhøyede molekylvekt en bakdel idet de nukleære porer gir en begrenset størrelse for diffusjon mot kjernen (Landfond et al., 1986). Reduksjonen av de ikke-terapeutiske deler av DNA-molekylet (særlig replikasjonsopprinnelsen og seleksjonsgenet) ifølge oppfinnelsen tillater på samme måte å redusere størrelsen av DNA-molekylene. Den del som tillater replikasjon og seleksjon av plasmidet i bakterien (1,1 kb) er redusert med en faktor 3 og utgjør for eksempel 3 kb for delen av vektoren omfattende replikasjonsopprinnelsen og resistensmarkøren. Denne reduksjon (i) av molekylvekten og (ii) av den negative ladning, gir molekylene ifølge oppfinnelsen forbedret vevs, cellulær og nukleær diffusjon og biotilgjengelighet.

Mer spesielt angår foreliggende oppfinnelse et sirkulært DNA-molekyl som er nyttig i genterapi, hvor nevnte molekyl omfatter minst en nukleinsyresekvens av interesse og også signalene for regulering av dets ekspresjon, transkripsjon og valgfritt translasjon i den eukaryote målcellen, og som genererer produkter av terapeutisk, vaksine, agronomisk eller veterinær verdi kjennetegnet ved at: (a) regionen som muliggjør dens replikasjon omfatter et kondisjonalt replikasjonsorigo som utledes fra et plasmid eller en bakteriofag og hvis funksjonalitet i en prokaryot vertscelle krever tilstedeværelsen av minst et replikasjons-initieringsprotein som er spesifikk for nevnte plasmid eller bakteriofag og som er fremmed for nevnte prokaryote vertscelle; (b) nevnte DNA-molekyl inneholder ikke en sekvens kodende for nevnte

replikasj ons-initieringsprotein;

(c) nevnte DNA-molekyl inneholder en seleksjonsmarkør av redusert størrelse

annet enn et gen som gir resistens mot et antibiotikum; og

(d) nevnte DNA-molekyl replikerer kun i celler i stand til å komplementere nevnte initieringsprotein.

Dette DNA-molekyl kan foreligge i mono- eller dobbelstrengform og har fortrinnsvis en superviklet form.

Innenfor rammen av oppfinnelsen kan vertscellene som benyttes være av forskjellige opprinnelser. Det kan dreie seg om eukaryotiske eller prokaryotiske celler. I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen dreier det seg om prokaryotiske celler.

Replikasjon av bakterielle plasmider nødvendiggjør normal nærværet av minst et protein, som kodes av vertscellen, av typen RNA-polymerase, Rnase, DNA-polymerase osv. Av grunner som allerede tidligere er nevnt, kan man med denne type replikasjon ikke helt unngå spredning i den behandlede organisme. Fortrinnsvis krever funksjonaliteten av replikasjonsopprinnelsen for DNA-molekylet ifølge oppfinnelsen nærværet av et protein som er spesifikt og fremmed for vertscellen. Dette karakteristikum medfører en reduksjon av spekteret av verter for det krevde plasmid til spesifikke stammer som uttrykker dette initieringsprotein. DNA-molekylet som benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen har således en såkalt kondisjonellt replikasjonsorigo.

Den kondisjonelle replikasjonsorigo som anvendes ifølge oppfinnelsen stammer fra et plasmid eller en bakteriofag og hvis funksjonalitet i en prokaryot vertscelle krever tilstedeværelsen av minst et replikasjons-initieringsprotein som er spesifikk for nevnte plasmid eller bakteriofag og som er fremmed for nevnte vertcelle;. Som eksempel kan man nevne de følgende kondisjonelle replikasjonssystemer for plasmider og bakteriofager:

I henhold til en foretmkken utførelsesform av oppfinnelsen stammer replikasjonsorigoet som anvendes i DNA-molekylene som kreves ifølge oppfinnelsen, fra et naturlig plasmid av E. coli, kalt R6K.

Replikasjonsfunksjonene for R6K er gruppert i et DNA-fragment på 5,5 kpb (figur 1) omfattende 3 replikasjonsorigo a, 13 og y (y og 6 står for 90% av replikasjonen) og et operon som koder for n replikasjonsinitiatorproteinene og proteinet Bis. Den minimale, genetiske informasjon som er nødvendig for å holde dette plasmid på sitt karakteristiske kopitall (15 kopier pr. genom) er inneholdt i to elementer: de 400 bp av ori y og genet pir, der produktet er n initiator proteinet.

Ori y kan deles i to funksjonelle deler: kjernedelen og aktivatorelementet (figur 1). Kjernedelen, essensiell for replikasjonen, inneholder iteronene (7 direkte repetisjoner på 22 pdb) der proteinet n som representeres ved SEQ ID No. 1 binder seg, og flankerende segmenter som er mål for vertsproteinene (IHF, DnaA).

I henhold til en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen omfatter det kondisjonale replikasjonsorigo av den krevde vektor y replikasjonsorigoet til plasmidet R6k og mer spesielt SEQ ID No. 1.

Innenfor oppfinnelsens ramme betyr uttrykket derivat enhver sekvens som skiller seg fra den betraktede sekvens på grunn av en degenerering av den genetiske kode, oppnådd ved en eller flere modifikasjoner av genetisk og/eller kjemisk art, samt enhver sekvens som hybridiserer med disse sekvenser eller fragmenter av disse og der produktet har den indikerte aktivitet med henblikk på det initiator replikasjonsprotein, n. Med modifikasjon av genetisk og/eller kjemisk art menes enhver mutasjon, substitusjon, delesjon, addisjon og/eller modifikasjon av en eller flere rester. Uttrykket derivat omfatter likeledes sekvenser som er homologe med den angjeldende sekvens og som stammer fra andre cellulære kilder og særlig fra celler av human opprinnelse, eller andre organismer, og har en aktivitet av samme type. Slike homologe sekvenser kan oppnås ved hybridiseirngsforsøk. Hybridiseringen kan gjennomføres med utgangspunkt i nukleinsyrebanker, ved å anvende de native sekvenser eller fragmenter av disse som prober, under konvensjonelle stringensbetingelser (Maniatis et al., jevnfør også generelle teknikker i molekylærbiologien), eller fortrinnsvis under forsterkede stringensbetingelser.

Replikasjonsorigoet som beskrevet ovenfor som oppviser fordelen av å være av begrenset størrelse, er funksjonell kun i nærvær av et spesifikt initiator protein, proteinet Pi, produsert av genet pir (SEQ ID No. 2). Idet dette protein kan virke i trans, er det mulig fysisk å dissosiere ori y fra genet pir, som så kan innføres i genomet til cellen som er valgt som spesifikk vert for disse plasmider. Mutasjoner i n kan endre de inhibitoriske funksjoner (Inuzuka og Wada, 1985) og medføre en økning av antallet kopier av derivater av R6K, opptil mer enn 10 ganger antallet av opprinnelige kopier. Disse substitusjoner ligger alle innenfor et område på 40 aminosyrer som således synes ansvarlige for n kontroll av antallet plasmid kopier (figur 2).

Protein rc, uttrykt i vertscellen, kan resultere i ekspresjon av genet representert ved SEQ ID No. 2 eller et derivat derav som definert ovenfor og mer spesielt genet pir 116 som omfatter en mutasjon i forhold til genet pir. Denne mutasjon tilsvarer substitusjonen av et prolin med et leucin. I denne kontekst er antallet kopier av derivater av R6K i størrelsesorden 250 kopier pr. genom.

I tillegg til en kondisjonen replikasjonsopprinnelse som definert ovenfor inneholder de krevde DNA-molekyler en region omfattende et eller flere gener som tillater å sikre seleksjonen av DNA-molekylet i den valgte vert, hvor nevnte seleksjonsmarkør er annet enn et gen som gir resistens mot et antibiotikum. Det kan således dreie seg om et gen hvis produkt er uunnværlig for levedyktigheten for den tilsiktede vert under de definerte dyrkingsbetingelser. Det kan for eksempel være: - et gen som koder for en suppressor tRNA av naturlig eller syntetisk opprinnelse, hvor en et ambrakodon (TAG) tRNA er foretrukket; - et gen hvis produkt er nødvendig for metabolismen i cellen, under visse dyrkingsbetingelser: Et gen som er involvert i biosyntesen av en metabolitt (aminosyre, vitamin, og så videre), et katabolisme gen som tillater å ta opp en substans som er til stede i dyrkingsmediet (spesiell nitrogen- eller karbonkilde) osv.

I henhold til en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen inneholder denne region en ekspresjonskassett av et gen som koder for en suppressor tRNA for spesifikke kodoner. Denne kan særlig velges blant de som koder for basene fenylalanin, cystein, prolin, alanin og histidin. Det dreier seg helst om et suppressor tRNA av ambrakodoner (TAG). I dette spesielle tilfellet omfatter systemet som benyttes for seleksjon av DNA-molekylene som er gjenstand for oppfinnelsen, to elementer: 1) på DNA-molekylet et gen som koder for en overføringssuppressor-RNA av ambrakodonet (TAG) som utgjør seleksjonsmarkøren, kalt genet sup, og 2) en spesifikk vert hvorav et av genene, essensielt ved visse dyrkingsbetingelser, inneholder et ambrakodon TAG. Denne celle kan vokse, under dyrkingsbetingelsene for hvilke produktet av genet som inneholder kodonet TAG er essensielt, kun hvis plasmider som tillater ekspresjon av sup er til stede i cellen. Dyrkingsbetingelsene utgjør således seleksjonstrykket for DNA-molekylet. De benyttede gener sup kan være av naturlig opprinnelse (Glass et al., 1982) eller stamme fra syntetiske konstruksjoner (Normanly et al., 1986; Kleina et al., 1990).

Et slikt system gir en stor fleksibilitet i den grad det, i henhold til genet omfattende en ambramutasjon, er mulig å bestemme forskjellige selektive miljøer. Hos bakterien Lactococcus lactis er for eksempel ambrakodonet lokalisert i et gen for biosyntesen av puriner. Dette tillater seleksjon av plasmidet som bærer genet som koder for suppressor-tRNA når bakteriene multipliseres i melk. En slik markør har fordelen av å være av liten størrelse og ikke inneholde "fremmede" sekvenser som stammer fra fager eller trans-posoner.

I henhold til en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen omfatter DNA-molekylet videre et DNA-fragment som er målsekvens for setespesifikk rekombinase, som tillater oppløsning av multimerer av plasmidene.

Således tillater et slikt fragment, innført på et sirkulært DNA-molekyl og hvis replikasjonsopprinnelse for eksempel er ori y, å oppløse multimerene av et slikt plasmid. Slike. multimerer observeres særlig når DNA-molekylet fremstilles i en stamme som bærer en pir mutert allel som tillater å øke antallet kopier av derivater av R6K, som pir-116.

Denne rekombinasjon kan realiseres takket være forskjellige systemer som medfører setespesifikk rekombinasjon mellom sekvensene. Mere spesielt oppnås den setespesifikke rekombinasjon ifølge oppfinnelsen ved hjelp av spesifikke, intramolekylære rekombinasjonssekvenser som er i stand til å rekombinere seg imellom i nærvær av spesifikke proteiner, generelt kalt rekombinaser. I dette spesielle tilfellet dreier det seg om rekombinasene XerC og XerD. Av denne grunn omfatter DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen generelt i tillegg en sekvens som tillater denne setespesifikke rekombinasjon. Det setespesifikke rekombinasjonssystem som er til stede i de genetiske konstruksjoner ifølge oppfinnelsen (rekombinaser og spesifikt gjenkjennelsessete) kan være av forskjellige opprinnelser. Særlig kan de benyttede rekombinaser og de spesifikke sekvenser stamme fra forskjellige strukturelle klasser og særlig fra familien resol-vase av transposon Tn3 eller familien integrase av bakteriofagen X. Blant rekombinasene som stammer fra familien av transposon Tn3 kan man særlig nevne resolvasen av transposon Tn3 eller transposonene Tn21 og Tn522 (Stark et al., 1992); invertasen Gin av bakteriofagen mu eller også resolvasene av plasmidene som den av fragmentet par av RP4 (Abert et al, "Mol. Microbiol.", 12 (1994) 131). Blant rekombinasene som stammer fra familien av integrasene av bakteriofagen X kan man særlig nevne integrasen av fagene X (Landy et al., "Science", 197 (1977) 1147), P22 og <)>80 (Leong et al., "J. Biol. Chem.", 260 (1985) 4468), HP1 avHaemophilus influenzae (Hauser et al., "J. Biol. Chem.", 267 (1992) 6859), integrasen Cre av fagen Pl, integrasen av plasmidet pSAM2 (EP 350 341) eller også FLP-rekombinasen av plasmidet 2\ i og rekombinasene XerC og XerD av E. coli.

Fortrinnsvis inneholder DNA-molekylene som er gjenstand for foreliggende oppfinnelse fragmentet cer av det naturlige plasmid av E. coli ColEl. Fragmentet cer som benyttes er et fragment HpaU på 382 pdb av ColEl der det er vist at det tillater, i cis, oppløsning av multimerene av plasmider (Summers et al., 1984; Leung et al., 1985). Det er også mulig å benytte et fragment Hpall-Taql med mere redusert størrelse (280 pdb) eller et ennu mindre fragment (ca. 220 pdb), omfattet i fragmentet HpaJI, og som har de samme egenskaper (Summers og Sherratt, 1988). Denne oppløsning går via en spesifikk, intra-molekylær rekombinasjon der det intervenerer fire proteiner kodet av genomet av E. coli: ArgR, PepA, XerC og XerD (Stirling et al., 1988,1989; Colloms et al., 1990; Blakely et al., 1993).

I denne forbindelse er det særlig fordelaktig å benytte hele cer fragmentet av ColEl, eller et mindre fragment som har de samme egenskaper.

I henhold til en variant av utførelsesformen kan DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen videre omfatte en sekvens som spesifikt er i stand til å interagere med en ligand. På preferensiell måte dreier det seg om en sekvens som, ved hybridisering, er i stand til å danne en trippelheliks med et spesifikt oligonukleotid. Denne sekvens tillater således å rense molekylene ifølge oppfinnelsen ved selektiv hybridisering med et komplementært oligonukleotid, immobilisert på en bærer (se søknad WO 96/18744). Sekvensen kan være posisjonert på ethvert sete av DNA-molekylet ifølge oppfinnelsen forutsatt at det ikke påvirker funksjonaliteten for genet av interesse og replikasjonsopprinnelsen. Ytterligere en gjenstand for oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å fremstille et sirkulært DNA-molekyl i henhold til foreliggende oppfinnelse, kjennetegnet ved at nevnte metode omfatter: (a) dyrking av en prokaryot rekombinant vertscelle omfattende nevnte replikasjons-initieringsprotein spesifikk for nevnte replikasjonsorigo, som transformeres med nevnte sirkulære DNA-molekyl i henhold til foreliggende oppfinnelse, og (b) isolering av nevnte sirkulære DNA-molekyl produsert av den transformerte prokaryote rekombinante vertscellen.

Mere spesielt blir proteinet som kondisjonerer funksjonaliteten for replikasjonsopprinnelsen av DNA-molekylet uttrykt in situ fra et tilsvarende gen. Genet som koder for replikasjonsinitiatorisk protein kan bæres av en annex-replikon, kompatibel med derivatene av den kondisjonelle replikasjonsopprinnelse som benyttet eller også innføres i genomet av celleverten ved rekombinasjon, takket være en transposon, en bakteriofag eller en hvilken som helst annen vektor. I det spesielle tilfellet der genet som uttrykker proteinet er plassert på en annex-replikon inneholder denne sistnevnte likeledes et promoterområde for den funksjonelle transkripsjon i cellen samt et område som befinner seg ved 3' og som spesifiserer et transkripsjonen sluttsignal. Hva angår promoterområdet, kan det dreie seg om et promoterområde som naturlig er ansvarlig for ekspresjonen av det angjeldende gen når denne er i stand til å funksjonere i cellen. Det kan likeledes dreie seg om områder av forskjellig opprinnelse (ansvarlige for ekspresjonen av andre proteiner eller også syntetiske). Særlig kan det dreie seg om promotersekvenser av prokaryotiske eller bakteriofage gener. For eksempel kan det dreie seg om promoter-sekvensene fra cellens genom.

Som gener som koder for det initiatoriske protein for replikasjonen kan det benyttes enten villgener eller muterte alleler som tillater å oppnå et øket antall kopier av plasmidene som er spesifikke for det initiatoriske protein som kondisjonerer funksjonaliteten av replikasjonsopprinnelsen som benyttes i DNA-molekylet.

Slike mutanter er særlig beskrevet for plasmidene R6K (Inuzuka og Wada, 1985; Greener et al., 1990), Rtsl (Terawaki og Itoh, 1985; Terawaki et al., 1990; Zeng et al., 1990), F (Seelke et al., 1982; Helsberg et al., 1985; Kawasaki et al., 1991), RK2 (Durland et al., 1990; Haugan et al., 1992,1995), pSClOl (Xia et al., 1991; Goebel et al., 1991; Fang et al., 1993).

I det spesielle tilfellet der DNA-molekylet som benyttes har en replikasjonsopprnnelse som stammer fra plasmidet R6k, er eller stammer det initiatoriske protein fra protein n av det samme plasmid. Det er særlig fordelaktig å uttrykke en mutert form av dette protein i stand til særlig å øke antallet initialkopier. For å gjøre dette er genet som inte-greres i vertscellen fortrinnsvis representert ved hele eller en del av sekvensen som vist ved SEQ ID No. 2 eller en hvilken som helst degenerert sekvens derav, eller en hvilken som helst sekvens i stand til å hybridisere med en slik sekvens eller fragment derav, og hvis produkt har aktiviteten til replikasjons-initieringsproteinet, og mer spesielt med genet pirl 16. Den assosierte mutasjon tilsvarer substitusjon av et prolin med et leucin. I henhold til en særlig utførelsesform av oppfinnelsen, blir genet pirl 16 direkte innarbeidet i genomet av vertscellen.

Fortrinnsvis inneholder et av genene av den spesifikke vertscelle, uunnværlig under dyrkingsbetingelsene som velges, et spesifikt kodon som er gjenkjennbart av den valgte suppressor tRNA i DNA-molekylet. I henhold til en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen dreier det seg om et ambra-TAG-kodon. I dette spesielle tilfellet kan cellen vokse, under dyrkingsbetingelser der produktet av genet inneholdende TAG-kodonet er essensielt, kun hvis plasmidet som tillater ekspresjon av sup er til stede i vertscellen. Dyrkingsbetingelsene utgjør således seleksjonstrykket for DNA-molekylet.

Fortrinnsvis er genet som omfatter ambrakodonet et gen som intervenerer i biosyntesen av en aminosyre, arginin. Dette gen, ArgE, koder for en N-acetylornitinase (Meinnel et al., 1992) og omfatter i dette tilfellet et TAG-kodon omfattende en punktmutasjon Gln-53 (CAG)-> TAG; seleksjonstrykket av plasmidet som bærer genet sup sikres således ved dyrking i M9-minimumsmedium (Maniatis et al., 1989). Videre kan dette for eksempel også være et biosyntesegen av et vitamin, en nukleinbase eller også et gen som tillater å benytte en spesielle karbon- eller nitrogenkilde, eller et hvilket som helst annet gen hvis funksjonalitet er uomgjengelig for den cellulære levedyktighet under de valgte dyrkingsbetingelser.

Vertscellen velges fortrinnsvis blant stammene E. coli og representeres aller helst av stammen E. coli XAC-1.

I henhold til en særlig utførelsesform av oppfinnelsen er vertscellen som benyttes under den krevde fremgangsmåte en celle av stammen E. coli XAC-1 som i sitt genom omfatter genet pirl 16.

Vertscellen kan være en prokaryotisk celle i hvilken genet endAl eller et homologt gen er inaktivert. Genet endA koder for endonuklease I av E. coli. Dette periplasmidiske enzym har en ikke-spesifikk kuttingsaktivitet for dobbeltstreng-DNA (LR. Lehman, G.G. Roussos og E.A. Pratt (1962) "J. Biol. Chem.", 237:819-828; M. Wright (1971), "J. Bacteriol.", 107:87-94). Et studium utført på forskjellige stammer av Escherichia coli (vill eller endA) har vist at nedbrytningen av plasmidisk DNA, inkubert i ekstrakter av disse bakterielle stammer, eksisterer i stammene endA+, men ikke i mutantene endA (S. Wnendt (1994), "BioTechniques", 17:270-272). Kvaliteten av det isolerte, plasmidiske DNA av stammene endA+ eller mutantene endA er studert av firma Promega under anvendelse av deres rensesystem (T. Shoenfeld, J. Mendez, D. Storts, E. Portman, B. Patterson-!-, J. Frederiksen og C. Smith, 1995, "Effects of bacterial strains carrying the endAl genotype on DNA quality isolated with Wizard plasmid purification systems", Promega notes 53). Deres konklusjon er den følgende: kvaliteten av DNA som fremstilles fra mutantene endA er totalt bedre enn den til DNA fremstilt i de testede endA+-stammer.

Kvaliteten for de plasmidiske DNA-preparater påvirkes således ved enhver forurensning av denne endonuklease (mer eller mindre langtidsnedbrytning av DNA).

Delesjonen eller mutasjonen av genet endA kan tilsiktes uten problem dit hen at mutantene som ikke lenger oppviser denne endonuklease-aktivitet totalt oppfører seg som villbakterier (H. Durwald og H. Hoffmann-Berling (1968), "J. MoL Biol.", 34, 331-346.

Genet endAl kan inaktiveres ved mutasjon, hel eller delvis delesjon, disrupsjon, og så videre. Inaktiveringen av genet endA av stammen E. coli som er valgt for fremstilling av plasmidene pCOR kan videre spesielt realiseres ved å overføre, ved hjelp av bakteriofagen Pl, delesjonen AendA::Tc<R> som beskrevet av Cherepanov og Wackernagel (P.P. Cherepanov og W. Wackernagel, 1995, "Gene disruption in Escherichia coli: Tc<R> og Km<R> cassetts with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.", "Gene", 158:9-14) eller ved utbytting av vill-allelen som er til stede i genomet av bakterien av interesse med en allel som er mutert eller deletert for endA og dette ved homolog rekombinasjon. Anvendelsen av denne type stamme innenfor rammen av oppfinnelsen tillater på fordelaktig måte å forbedre kvaliteten av den fremstilte DNA.

Oppfinnelsen angår likeledes en hvilken som helst rekombinant celle inneholdende et DNA-molekyl som definert ovenfor. Det kan dreie seg om celler av forskjellig opprinnelse av eukaryotisk, prokaryotisk type, osv.

Disse celler oppnås på en hvilken som helst for fagmannen kjent måte som tillater inn-føring av plasmidet i en gitt celle. Det kan særlig dreie seg om transformasjon, elektro-porasjon, konjugasjon, fusjon av protoplaster eller en hvilken som helst annen kjent teknikk.

DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen kan benyttes i en hvilken som helst vaksinasjons-applikasjon eller genetisk og cellulær terapi for overføring av et gen til en organisme, et vev eller en gitt celle, eller for fremstilling av rekombinante proteiner in vitro.

Særlig kan de benyttes for en direkte administrering in vivo eller for modifikasjon av celler in vivo eller ex vivo med henblikk på deres implantering i en pasient.

I denne forbindelse er en ytterligere gjenstand for oppfinnelsen et hvilket som helst farmasøytisk preparat som omfatter minst et DNA-molekyl som definert ovenfor. Dette molekyl kan eventuelt være forbundet med en kjemisk og/eller biokjemisk transfek-sjonsvektor. Det kan særlig dreie seg om kationer (kalsiumfosfat, DEAE-dekstran, og så videre), eller liposomer. De syntetiske, assosierte vektorer kan være lipider eller kanoniske polymerer. Man kan som eksempel på slike vektorer nevne DOGS (Transfectam™) eller DOTMA (Lipofectin™).

De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen kan formuleres med henblikk på administrering ad topisk, oral, parenteral, intranasal, intravenøs, intramuskulær, sub-kutan, intraokulær eller transdermal vei, og så videre. Fortrinnsvis blir det krevde plasmid benyttet i injiserbar form eller som applikasjon. Den kan blandes med en hvilken som helst farmasøytisk akseptabel bærer for en injiserbar formulering, særlig for en injeksjon direkte i setet som skal behandles. Det kan særlig dreie seg om sterile, isotoniske oppløsninger eller tørkede preparater og særlig lyofiliserte slike som ved tilsetning av for eksempel sterilisert vann eller fysiologisk serum tillater konstitusjon av injiserbare oppløsninger. Det kan særlig dreie seg om Tris- eller PBS-buffere fortynnet i glukose eller natriumklorid. En injeksjon direkte i det angjeldende området hos pasienten er interessant fordi dette tillater å konsentrere den terapeutiske effekt på området for det påvirkede vevet. De benyttede doser kan tilpasses som funksjon av forskjellige parametere og særlig som funksjon av genet, vektoren, den benyttede admini-streringsmåte, den angjeldende patologi eller også den tilsiktede varighet av behand-lingen.

DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen kan omfatte et eller flere gener av interesse, det vil si en eller flere nukleinsyrer (cDNA, gDNA, syntetisk eller semi-syntetisk DNA, osv.) der transkripsjonen og eventuelt translasjonen i målcellen genererer produkter av terapeutisk, vaksine, agronomisk eller veterinæirnteresse.

Blant gener av terapeutisk interesse kan man særlig nevne gener som koder for enzymer, blodderivater, hormoner, lymfokiner: interleukiner, interferoner, TNF, og så videre (FR 92 03120), vekstfaktorer, neurotransmittorer eller deres forløpere eller syntese-enzymer, trofiske faktorer: BDNF, VNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, og så videre; apolipoproteiner: ApoAI, ApoATV, ApoE, og så videre (FR 9305125), dystrofin eller et minidystrofin (FR 91 11947), tumorsuppressorgener: p53, Rb, Rapi A, DCC, k-rev, og så videre (FR 93 04745), genet som koder for faktorer implikert i koaguleringen: faktorene VIL VEI, LX, og så videre, selvmordsgener: tymidinkinase, cytosindesaminase, og så videre; eller også hele eller en del av et naturlig eller kunstig immunoglobulin (Fab, ScFv, og så videre), en ligand-RNA (WO 91/19813) og så videre. Det terapeutiske gen kan likeledes være et antiretningsgen eller -sekvens hvis ekspresjon i målcellen tillater å kontrollere ekspresjonen av gener eller transkripsjonen av cellulær mRNA. Slike sekvenser kan for eksempel transkriberes, i målcellen, til RNA som er komplementær med cellulær mRNA og derved blokkere deres traduksjon til protein, i henhold til den teknikk som er beskrevet EP 140 308.

Genet av interesse kan også være et vaksineantgen, det vil si et gen som koder for anti-genisk peptid i stand til hos mennesker eller dyr å generere en immunitær respons med henblikk på realisering av vaksiner. Det kan likeledes særlig dreie seg om antigeniske peptider som er spesifikke for Epstein-Barr-virusen, HIV-virusen, hepatitt-B-virusen (EP 185 573), pseudo-hundegalskapsvirusen eller også være tumorspesifikke (EP 259 212).

I en utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse er nukleinsyresekvensen av interesse en sekvens som koder for p53 villtype eller modifisert sekvens.

I DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen inneholder generelt det terapeutiske, vaksinale, agronomiske eller veterinære gen av interesse likeledes et promoterområde for den funksjonelle transkripsjon i målcellen eller -organismen, samt et område som befinner seg ved 3' og som spesifiserer et transkripsjonelt sluttsignal og et polyadenyleringssete. Hva angår promoterområdet, kan det dreie seg om et promoterområde som naturlig er ansvarlig for ekspresjonen av det angjeldende gen når dette er i stand til å funksjonere i den angjeldende celle eller organisme. Det kan likeledes dreie seg om områder av forskjellig opprinnelse (ansvarlig for ekspresjonen av andre proteiner, eller også syntetiske). Særlig kan det dreie seg om promotersekvenser av eukaryotiske eller virale gener. For eksempel kan det dreie seg om promotersekvenser fra genomet av målcellen. Blant de eukaryotiske promotere kan man benytte enhver promoter eller avledet sekvens som stimulerer eller reprimerer transkripsjonen av et gen på eventuelt spesifikk, eventuelt induktibel, sterk eller svak måte. Det kan særlig dreie seg om ubikitære promotere (promotere av genene HPRT, PGK, ct-actin, tubulin, og så videre), promotere av inter-mediære filamenter (promoter av genene GFAP, desmin, vimentin, neurofilamenter, keratin, og så videre), promotere av terapeutiske gener (for eksempel promoteren av genene MDR, CFTR, faktor VHI, ApoAI, og så videre), vevspesifikke promotere (promoteren av genet pyruvatkinase, vilin, det intestinale bindingsprotein for fettsyrer, a-actin av den glatte muskel, og så videre) eller også promoteren som responderer på en stimulus (reseptoren av steroide hormoner, reseptoren av retinonsyre, og så videre). Videre kan det dreie seg om promotersekvenser som stammer fra genomet av en virus som for eksempel promoteren av genene El A og MLP av adenovirus, den tidlige promoter av CMV eller også promoteren av LTR, av RSV, og så videre. Videre kan promoterområdene være modifisert ved addisjon av sekvenser for aktivering, regulering eller som tillater en vevspesifikk eller majoritær ekspresjon.

I en utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse kan det heterologe terapeutiske genet kode for tymidinkinase (tk), eventuelt sur fibroblastvekstfaktor.

Videre kan genet av interesse likeledes omfatte en signalsekvens som styrer det syntetiske produkt inn i målcellens sekresjonsveier. Denne signalsekvens kan være den naturlige signalsekvens for det syntetiske produkt, men det kan også dreie seg om en hvilken som helst annen funksjonell signalsekvens eller en kunstig signalsekvens.

Alt etter genet av interesse kan DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen benyttes for behandling eller prevensjon av tallrike patologier inkludert genetiske sykdommer (dystrofi, cystisk fibrose, og så videre), neurodegenerative sykdommer (Alzheimer, Parkinson, ALS, og så videre), cancere, patologier forbundet med mangler ved koagu-lering eller ved dyslipoproteinemier, patologier forbundet med virale infeksjoner (hepatitt, AIDS, og så videre) eller på agronomisk eller veterinærmedisinsk område. Oppfinnelsen angår videre også anvendelsen av DNA-molekylene med kondisjonell replikasjon for fremstilling av rekombinante proteiner. Bakteriene kan benyttes for å fremstille proteiner av forskjellige opprinnelser, eukaryotiske eller prokaryotiske. Blant bakteriene utgjør E. coli den valgte organisme for ekspresjon av heterologe gener på grunn av den lette manupulering, det betydelige antall tilgjengelige ekspresjonssystemer og de vesentlige mengder proteiner som kan oppnås. Det antas at oppfinnelsens system kan benyttes i andre organismer, tropismen bestemmes ved replikasjonsopprinnelsens art som antydet ovenfor. For denne anvendelse omfatter nukleinsekvensen av interesse et område som koder under kontroll av egnede ekspresjonssignaler hos den valgte vert, særlig en prokaryotisk vert. Det kan for eksempel dreie seg om promoteren Plac, Ptrp, PT7, Ptrc, Ptac, PL, PR, Shine-Dalgarno-sekvensen, og så videre (denne enhet utgjør ekspresjonskassetten). Nukleinsyresekvensen av interesse kan være en hvilken som helst sekvens som koder for et protein som kan være av interesse på det farmasøytiske, agro-alimentære eller agro-kjemiske området. Det kan dreie seg om et strukturgen, en komplementær DNA-sekvens, en syntetisk eller semi-syntetisk sekvens, og så videre.

Ekspresjonskassetten kan innføres i vektoren for kondisjonell replikasjon som er gjenstand for oppfinnelsen og utgjør således en vektor for kondisjonell replikasjon som tillater ekspresjon av proteiner av interesse hos E. coli. Denne vektor oppviser flere fordeler: Ingen anvendelse av antibiotika for selektering hos bakterien (lavere omkost-ninger, ingen nødvendigheter for studier hva angår nærværet i sluttproduktet av antibiotika eller potensielt toksiske produktdeirvater), en praktisk talt nullsannsynlighet for spredning av plasmidet i naturen (kondisjonell replikasjonsopprinnelse), videre mulig fermentering i definert totalmedium. Eksemplene nedenfor viser de fordelaktige egenskaper for de kondisjonelle vektorer for fremstilling av rekombinante proteiner.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av de følgende, illustrerende eksempler under henvisning til de ledsagende tegninger, der: Figur 1 viser den funksjonelle organisering av området av R6K som er implikert i

replikasjonen,

figur 2 viser organiseringen av de funksjonelle domener av protein % av plasmidet

R6k,

figur 3 presenterer innføringsprotokollen for genet pir i genomet av E. coli XAC1,

figur 4 er et konstruksjonsskjema for vektorene pXL2666,2730 og 1754,

figur 5 viser konstruksjonen av pXL2774,

figur 6 viser kinetikken for veksten og produksjonen i en 21 fermentor,

figur 7 viser kinetikken og veksten ved produksjonen i en 8001 fermentor,

figur 8 viser konstruksjonen av pXL3056,

figur 9 viser visualiseringen av proteinet aFGF som fremstilt av E. coli XAC-lpir-116

(pXL3056+PT7pol23) etter induksjon. De denaturerte totalcelleekstrakter avsettes på polyakrylamidgel 12,5% SDS. M: molekylmassemarkør (Biorad, lav-området). Hvert bånd er identifisert ved en pil og et tall som indikerer massen i kDa. 1: XAC-lpir-116 (pXL3056+pUC4K) ikke indusert; 2: XAC-lpir-116 (pXL3056+pUC4K) indusert ved 42°C; 3: XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol23) klon 1, ikke indusert; 4: XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol23) klon 1, indusert ved 42°C; 5: XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol23) klon 2, ikke indusert; 6: XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol23) klon 2, indusert ved 42°C; ti: 1 ug renset aFGF; t4: 4 ug renset aFGF, og

figur 10 viser konstruksjonsskjemaet for vektorene pXL3029 og pXL3030.

I - MATERIALER OG METODER

A) Materialer

1) Kulturmedium

De komplette miljøer LB, 2XTY og SOC, minimummiljø M9 (Maniatis et al., 1989) benyttes. De geloserte medier oppnås ved tilsetning av 15 g Difco-agar. Hvis nødvendig blir disse miljøer videre supplert med antibiotika, ampicillin eller kanamycin, i respek-tive konsentrasjoner på 100 ug og 50 ug. De kromogene substrater X-Gal og X-Gluc anvendes i konsentrasjoner på 40 mg/l.

2) E. coli- stammer. plasmider og bakteriofager

De benyttede stammer av E. coli, plasmidene og bakteriofagene, er respektivt identifisert i eksemplene nedenfor.

B) Metoder

1) Manipulering av DNA

Isoleringen av bakteriell (plasmidisk, genomisk) og fag (replikativ form av Ml3) DNA, behandling med restriksjonsendonukleaser, liming av DNA-fragmentene, elektroforese på agarosegel (i TBE-buffer) og andre standardteknikker blir gjennomført i henhold til leverandørens anbefalinger, når det gjelder anvendelsen av enzymer holder man seg til de protokoller som er beskrevet i "Molecular Cloning: a Laboratory Manual" (Maniatis et al., 1989).

Markørene for DNA-størrelsen som benyttes under elektroforesene er de følgende: målstokk 1 kpb (BRL) for lineære fragmenter og den super-viklede DNA-markør (Stratagéne) for ikke-fordøyde plasmider.

Sekvenseringen gjennomføres i henhold til teknikken ifølge Sanger (Sanger et al., 1977) tilpasset den automatiserte metode som anvender fluorescerende dideoksynukleotider og Taq DNA-polymerasen (PRISM Ready Reaction DyeDideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems).

De benyttede oligodeoksynukleotider (kalt "seq+n°", se nedenfor) syntetiseres på en syntetisør "Applied Biosystems 394 DNA/RNA Synthesizer" ved fosforamiditt-metoden under anvendelse av B-cyanoetyl-beskyttelsesgrupper (Sinha et al., 1984). Etter syntese blir beskyttelsesgruppene fjernet ved behandling med ammoniakk. To utfellinger med butanol tillater å rense og å konsentrere oligonukleotidet (Sawadogo et al., 1991).

Oligonukleotidsekvensen som benyttes for forsterkning ved PCR:

PCR-reaksjonene (Saiki et al., 1985) gjennomføres under de følgende betingelser i et totalvolum på 100 ul. Reaksionsblandingen omfatter 150 ng genomisk DNA fra stammen som skal studeres, 1 ug av hver av de to oligonukleotidsonder (24-mer), 10 ul buffer 10XPCR, der sammensetningen er som følger: "500 mM KC1, 0,1% gelatin, 20 mM MgCl2,100 mM Tris-HCl, pH 7,5", og 2,5 enheter Taq DNA-polymerase (Amplitaq Perkin-Elmer). PCR- betingelsene på Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler-apparaturen er som følger: 2 minutter ved 91°C, 30 suksessive denaturerings-sykler (1 minutt ved 91°C), hybridisering (2 minutter ved 42°C) og forlengelse (3 minutter ved 72°C) og til slutt 5 minutter ved 72°C. De således oppnådde produkter, eventuelt fordøyd med et restriksjonsenzym, analyseres ved elektroforese på agarosegel.

Analyse av de forskjellige plasmid typene ved bruk av DNA-topo-isomeraser ble gjennomført i henhold til følgende protokoll: enzymer, renset i laboratoriet, inkuberes i 1 time ved 37°C. Reaksjonsblandingene (totalvolum: 40 ul) har følgende sammensetning: 150 ng plasmid, 300 ng DNA-topo-isomerase I, eller 150 ng DNA-gyrase av E. coli eller 160 ng DNA-topo-isomerase IV av S. aureus og 20 ul buffer som er spesifikt for hvert system. Sammensetningen for disse buffere er antydet nedenfor: for DNA-topo-isomerase I: 50 mM Tris-HCl, pH. 7,7,40 mM KC1,1 mM DTT, 100

Hg/ml SAB, 3 mM MgCl2,1 mM EDTA;

for DNA-topo-isomerase IV: 60 mM Tris-HCl, pH 7,7, 6 mM MgCl2,10 mM DTT, 100

Hg/ml SAB, 1,5 mM ATP, 350 mM kaliumglutamat;

for DNA-gyrase: 50 mM Tris-HCl, pH 7,7, 5 mM MgCl2,1,5 mM ATP, 5

mM DTT, 100 ug/ml SAB, 20 mM KC1.

2) Transformering av E. coli

Denne ble gjennomført i henhold til rutinen ifølge TSB-metoden (Transformation and Storage Buffer) som beskrevet av Chung og Miller (1988). For en stamme som TG1 (Gibson et al., 1984) er den oppnådde transformeringseffektivitet i størrelse 10<5->IO<6 >transformanter pr. ug pUC4K (Vieira og Messing, 1982). Når det er nødvendig med en ennå høyere transformering, blir bakteriene transformert ved elektroporering i henhold til den protokoll som er anbefalt av fabrikanten av elektroporatoren (Biorad). Denne metode tillater å nå opp i effektivitet på 10<8> til 1010 transformanter pr. u.g pUC4K.

3) Cellulær transfeksjon mediert av en kationisk lipofektant

De benyttede celler er murine fibroblaster NTH 3T3, sådd ut den foregående dag på 24 brønners plater i en densitet av 50 000 celler pr. brønn. Dyrkingsmediet som benyttes er DMEM-medium inneholdende 4,5 g/l glukose, supplert med 10% føtalt kalveserum og 1% oppløsninger av 200 mM glutamin og antibiotika (Streptomycin 5.IO<3> u/ml, peni-cillin 5.10<3> u.g/ml) (Gibco). Plasmid DNA (1 ug i 25 ul 9 % > NaCl) blandes, volum for volum, med en lipofektantsuspensjon. Fire forhold "lipofektantladning:DNA-ladning" prøves, nemlig 0,3, 6 og 9. Disse forhold beregnes ved å anta at 1 ug plasmid DNA bærer 3,1 nmol negative ladninger og at lipofektanten bærer 3 positive ladninger pr. molekyl. Etter kontakt i 10 minutter som tillater dannelse av komplekse DNA:lipid blir 50 u.1 DNA-lipofektantblanding innført på cellene i kulturmediet uten serum (500 ul). Cellene blir først skyllet to ganger med det samme medium. Inhiberingen av transfeksjonen ved serum unngås på denne måte. Etter innkubering (2 timer ved 37°C i en CCVinkubator) settes det 10% føtalt kalveserum til miljøet. Cellene blir deretter satt for innkubering i 24 timer.

4) Måling av luciferase- aktiviteten for de eukar<y>otiske celler

Denne gjennomføres 24 timer etter transfeksjon. Luciferasen katalyserer luciferin-oksydasjonen, i nærvær av ATP, av Mg<2+> og O2, med samtidig fremstilling av et foton. Den totale lysemisjon, målt ved hjelp av et luminometer, er proporsjonalt med prøvens luciferase-aktivitet. De benyttede reaktanter leveres av Promega (Luciferase-analyse-system) og benyttes i henhold til den gitte protokoll. Etter lysering av cellene blir den uoppløselige fraksjon av hver ekstrakt fjernet ved sentrifugering. Bestemmelsen gjennomføres på 5 ul supernatant, eventuelt fortynnet i cellenes lyseringsbuffer.

5) Måling av proteinkonsentrasionen i celleekstraktene

Denne gjennomføres i henhold til BCA-metoden (Pierce) under anvendelse av bicin-konininsyre (Wiechelman et al., 1988). y-prøven av SAB gjennomføres i lyseringsbufferen (jevnfør HI-B-4). Prøvene for bestemmelse og y-prøvene forbehandles, volum mot volum, med 0,1M iodacetamid/Tris-buffer 0,1M, pH 8,2, i 1 time ved 37°C. Denne behandling tillater å unngå interferens under bestemmelsen av reduksjonsmidlet (DTT) som er til stede i lyseringsbufferen. Gjennomføring av bestemmelsen skjer ved 562 nm.

EKSEMPEL 1:

Konstruksjon av vertsstammer XAC-pir og pir-116 ved homolog rekombinasjon. Stammen som benyttes er stammen E. coli XAC-1 (Normanly et al., 1980). Fortrinnsvis omfatter argE-genet av denne stamme en glutamin-53-mutasjon (CAG) til ambrakodon (TAG) (Meinnel et al., 1992). Genet argE stammer fra det divergerende operon argECBH og koder for et arginin-biosynteseenzym, N-acetylornitinase. XAC-1 kan således ikke syntetisere arginin og som et resultat vokser i minimummiljø. Denne auxotrofi oppheves hvis stammen skjermer et plasmid som tillater ekspresjon av et suppressor-tRNA. Det er således mulig, for dyrking i minimummiljø, å seleksjonere bakterier som bærer et slikt plasmid. For å tillate replikasjon av plasmidet som stammer fra R6K, har det vært nødvendig, ved homolog rekombinasjon, å innføre genet pir i genomet av XAC-1. Genet pir (vilt eller mutert) innføres ved locus uidA ved utbytting mellom villgenet uidA og en kopi som er avbrutt av genet pir (eller pir-116). Genet uidA koder for en B-glukuronidase, hydrolyseenzymet for fi-glukuronider. Dette gen kan inaktiveres uten problem fordi det ikke er nødvendig for veksten i klassiske, syntetiske miljøer der fl-glukuronidene ikke benyttes. Videre kan aktiviteten av B-glukuronidase følges takket være et kromogent substrat, X-Gluc, hvis hydrolyse frigir et blått pigment.

1) Konstruksjon av en selvmordsvektor som bærer kassetten " KmR- uidA::pir ( eller pir-116)

Det er her benyttet en strategi som involverer en enkelt vertsbakterie og minimaliserer modifikasjonene av genomet av stammen av interesse. Fag M13mpl0 (Messing og Vieira, 1982) benyttes som selvmordsvektor (Blum et al., 1989). En ambramutasjon i genet II, essensielt for replikasjonen, reduserer vertsspekteret for dette Ml 3 til stammer som TG1 (supE) som produserer en tRNA-suppressor av ambra; den kan således ikke replikeres i stammer av E. coli sup+, som XAC-1.

Kassettene BamHI på 3,8 kpb, inneholdende et gen for resistens mot kanamycin av Tn5 og _uidA::pir eller pir-116, er respektivt renset fra M13wm34 og 33 (Metcalf et al., 1994). De er klonet i M13mpl0, linearisert med BamHI. De rekombinante kloner er selektert ved utsåing i LB + Km agar medium, etter elektroporering i TG1 av ligerings-blandingene. Konformiteten for de oppnådde kloner har vært påvist ved restriksjons-profilanalyse og ved sekvensering av området som tilsvarer mutasjonen pir-116. 2) Innføring ved homolog rekombinasjon av genene pir eller pir- 116 i <g>enomet av E.

coli XAC- 1

Den adopterte strategi og de forskjellige, impliserte evenementer er vist i figur 3.

a) Første rekombinasjonsevenement

Stammen XAC-1 transformeres ved elektroporering med 10,100 eller 2000 ng av hver

RF (mpl0-_uidA::pir eller pir-116). En tredjedel av hver ekspresjonsblanding prøves på LB-flasker inneholdende kanamycin og inkuberes over natten ved 37°C. Fagene mpl0-_uidAA::pir eller pir-116 kan ikke replikere seg i stammen XAC-1 (sup+). Km<R->markøren kan således ikke opprettholde seg annet enn ved integrering i genomet av bakterien, via en homolog rekombinasjon med en villkopi av genet uidA. Resultatene av elektroporeringen av XAC-1 er vist i tabell 1. Transformasjonseffektiviteten som oppnås er 4.IO<9> transformanter pr. ug pUC4K.

Under de testede betingelser øker antallet integranter på ikke-lineær måte med DNA-mengden. Kjenner man transformasjonseffektiviteten og størrelsen av RF (11,7 kpb), kan man ha en omtrentlig idé om rekombinasjonsgraden. Betrakter man punktet ved 100 ng, oppnås en rekombinasjonsfrekvens i størrelsesorden IO"<6>.

b) Andre rekombinasjonsevenement

Det andre rekombinasjonsevenement selekteres deretter ved resistens for stammene mot

desoksykolat (Doc<R>).

For å gjøre dette bringes 5 integranter av hver konstruksjon i kultur i miljø 2XTY hvortil det er satt 0,2% natriumdesoksykolat. To distinkte populasjoner opptrer. Visse kloner gir en godt synlig uklarhet efter ca. 8 timer ved 37°C (to kloner for konstruksjonen pir og tre for konstruksjonen pir-116). De andre kloner gir en tett kultur kun etter en natt ved 37°C. Som ventet er de alle kvasi Km<s>. For hver av de studerte elektro-poranter utstrykes 50 Km<s->etterkommere på LB, hvortil det er satt X-Gluc. Etter 48 timer ved 37°C er UidA<+->klonene svakt blå, mens de som har vært gjenstand for en allelerstatning (tilfelle nr. 1, figur 3) forblir hvite på dette miljø (UidA"). Tabell 2 oppsummerer analysen av fenotypene i de oppnådde doble rekombinanter.

18 til 30% av de doble rekombinanter har således undergått en allel-erstatning.

3) Kontroll av Pir+-karakteren for stammene oppnådd ved rekombinasjon For å sikre Pir+-karakteren for stammene som oppnås ved dobbel rekombinasjon, har man transformert tre kloner av hver konstruksjon med pBW30 (Metcalf et al., 1994). Oppnåelsen av transformantene for hver av de testede stammer har tillatt å påvise funksjonaliteten av genene pir og pir-116 integrert i genomet av XAC-1. Under disse betingelser er det ikke oppnådd noen transformant med den parentale stamme XAC-1. Videre fortsatte man studiet av 2 kloner XAC-1 pir (B og C) og 2 kloner XAC-lpir-116 (EogD). 4) Kontroll ved forsterkning ved PCR av stammene som oppnås ved rekombinasion For å bekrefte allel-erstatningen har man ved PCR-forsterkning kontrollert de geno-miske områder på hver side av locus uidA. Hvert oligonukleotidpar består av et oligonukleotid tilsvarende et internområde av pir og et andre oligonukleotid tilsvarende et område, nær kromosomisk uidA, men ikke omfattet i fragmentet som deltok i rekombinasjonen. Sekvensen for dette sistnevnte oligonukleotid er bestemt ved hjelp av sekvensen ECOUTDAA fra Genbank (aksessnummer: M14641). Man har således kunnet verifisere den eksakte posisjonering av genet pir i bakteriens genom. Arten av de forsterkede fragmenter, hvis størrelse stemmer overens med det man har kunnet forutse, er bekreftet ved fordøyning med Mlul.

EKSEMPEL 2:

Konstruksjon av plasmidiske vektorer avledet fra R6K som bærer seleksjons-markøren sup Phe.

Man har konstruert vektorer som omfatter ori y av R6K og genet for kanamycinresistens (pXL2666). Observasjonen av multimerer av pXL2666 i stammen BW19610 (pir-116) 5 fN/ffttr.nl-f pt ni 1 QQ^ har hrnlrt s«lrf»rf»n til å etiiHf»r(» vi rim in opn av fraomi»nt<»t r. pr av ColEl på dette fenomen. Man har deretter i vektoren ori y -Km<R->cer (pXL2730) innført ekspresjonskassetten av suppressor tRNA'fenylalanin (sup Phe). Denne vektor, pXL2760, tjener som basis for konstruksjonen av vektorer som kan benyttes i genterapi. 1) Konstruksjon og analyse av vektorer som bærer ori y av R6K og kanamvcinresistens-genet

a) Konstruksjoner

I det første plasmid som konstrueres, pXL2666, stammer resistensgenet for kanamycin

fra pUC4K (Vieira og Messing, 1982) og replikasjonsopprinnelsen, inneholdt i et fragment EcoRI-BamHI på 417 pdb, stammer fra selvmordsvektoren pUT-T7pol (Herrero et al., 1990) (figur 4). Overføringen av pXL2666 i stammene BW19094 og 19610 (Metcalf et al., 1994) har tillatt å vise at mengden av plasmid økes godt i en stamme pir-116 i forhold til det samme plasmid i en stamme pir. Videre har analyse ved elektroforese av ikke-fordøyde plasmider vist at denne økning går sammen med opptredenen av visse multimere former. Sannsynligvis henger dette fenomen sammen med en intermolekylær rekombinasjon mellom de forskjellige kopier av plasmidet. Videre har man konstruert pXL2730 ved på pXL2666 å klone cer-fragmentet av det naturlige plasmid av E. coli ColEl, der det har vært vist at det i cis tillater oppløsning av dimerer av plasmidene (Summers og Sherrat, 1984). Det benyttede fragment tilsvarer et fragment HpaTI på 382 bp av ColEl (Leung et al., 1985). Det inneholder et spesifikt, intermolekylært rekom-binasjonssete; for å være funksjonelt, inneholder det kun vert proteuier inkludert rekombinasene XerC og XerD og de tilhørende faktorer ArgR og PepA (Stirling et al., 1988,1989; Colloms et al., 1990). For å sikre at virkningene som observeres virkelig skyldes fragmentet cer, har man også konstruert kontrollplasmidet pXL2754 i hvilket fragmentet cer deleteres med 165 bp. Denne delesjon har vist å oppheve virkningen av cer på oppløsningen av multimerene (Leung et al., 1985). De forskjellige kloningstrinn som fører til konstruksjonen av disse plasmider er vist i figur 4.

b) Kvantitativ og kvalitativ analyse av de plasmidiske specier.

• Analyse ved elektroforese på agarosegel.

Analyse ved elektroforese av forskjellige plasmider som er konstruert, har tillatt å påvise forskjellige plasmid varianter, variable i henhold til de benyttede kilder. Størrelsen av ikke-fordøyde plasmider er bedømt i forhold til den superviklede DNA-markør. I stammen pir (BW19094) er plasmidene pXL2666,2754 og 2730 praktisk talt helt og holdent i monomer form. Båndene under hvert hovedbånd tilsvarer forskjellige topo-isomerer, noe mindre overviklet, slik den observerte profil bekrefter etter innvirkning av DNA-gyrase med pXL2730.

Når det gjelder stammen pir-116 (BW19610), er profilene forskjellige: man observerer med plasmidene pXL2666 og 2754 forskjellige varianter som går fra monomer til multimerer (2,3 eller 4 enheter), der den majoritære form er dimeren. Etter fordøyning med EcoRI finner man ikke igjen annet enn lineært, plasmid DNA; disse plasmid variantene tilsvarer enten plasmidmultimerene eller de forskjellige topo-isomerer. Imidlertid er hele tiden størrelsen på de bestemte former etter den superviklede DNA-markør et helt produkt av dette monomere plasmid, det er således meget sannsynlig at det dreier seg om multimerer. Dannelsen av multimerer kan meget sannsynlig tilskrives mutasjonen pir-116 selv om de to stammer BW19094 og BW19610 strengt tatt ikke er isogene (BW19610 er recA). Profilen som oppnås med pXL2730 er forskjellig: selv om de multimere former ennå er synlige, er den majoritære form den monomere. Cer-fragmentet kan således lette oppløsningen av plasmidmultimerene som er konstruert og dette på en måte uavhengig av recA, i BW19610.

• Analyse etter behandling med DNA-topo-isomeraser.

For å komme bort fra hypotesen i henhold til hvilken de observerte i stammene som bærer allelen pir-116 er spesielle topo-isomerer, ble hvert plasmidpreparat underkastet innvirkning av DNA-topo-isomeraser. Aktiviteten for de forskjellige enzymer under forsøksbetingelsene er som følger: Løsgjøring av DNA for DNA-topo-isomerase I av E. coli, negativ overvikling av løsgjort DNA for DNA-gyrase av E. coli, og utgreiing av sammenfiltrede DNA'er og løsgjøring av superviklet DNA ved DNA-topo-isomerase IV av S. aureus. Virkningen av DNA-topo-isomerase IV har tillatt å vise at de plasmidiske. former med høy molekylvekt ikke skyldes sammenfiltring av flere plasmidmolekyler; i dette tilfellet ville de vært omdannet til den monomere variant. Funksjonaliteten av enzymet er kontrollert ved en fremstilling av DNA av kinetoplaster, sammensatt av (ikke-viste) sammenfiltrede DNA-molekyler. Aktiviteten av løsgjøringen er også synlig, men man oppnår varianter som migrerer mindre enn i de ikke-behandlede sammen-ligninger. Innvirkningen av DNA-gyrase har tillatt å omdanne de lett løsgjorte topo-isomerer til en mer superviklet variant som er trukket av fra bakterien (prinsipalt monomer eller dimer). Videre har den tillatt å verifisere at de fremstilte DNA'er majori-tært er i superviklet form. De således behandlede prøver tillater å bekrefte de tidligere resultater hva angår de majoritære varianter for hver konstruksjon. DNA-topo-isomerase I har klart frigitt DNA, men på partiell måte. Dette kan skyldes det faktum at de studerte plasmider ikke bærer annet enn få enkeltstrengsoner til hvilke dette enzym preferensielt binder seg (Roca, 1995).

2) Innføring av seleksionsmarkøren sup Phe på pXL2730

Man har her benyttet ekspresjonskassetten for genet av det syntetiske suppressor tRNA (Phe) (Kleina et al, 1990). Denne innfører, i polypeptidkjeden under dannelse, et fenylalanin i respons på en TAG-kodon. Videre tillater den produksjon i XAC-1 av et protein ArgE som er tilstrekkelig aktivt til å tillate en god vekst i et arginincarens medium. På plasmidet pCT-2-F (Nomanly et al., 1986) blir sup Phe uttrykt på konstitutiv måte fra en syntetisk promoter som stammer fra sekvensen av promoteren av genet lpp av E. coli, Pipp. Nedstrøms dette gen sikres transkripsjonsstansen av den syntetiske terminator av operonen rrnC av E. coli, Tmc (Normanly et al., 1986). De forskjellige kloningstrinn er antydet i figur 5.

De forskjellige under-kloninger gjennomføres i XAC-1. Funksjonaliteten for ekspresjonskassetten av suppressor tRNA blir så kontrollert ved hjelp av fi-galakto-sidase-aktiviteten av denne stamme som ikke eksisterer annet enn hvis det en suppressjon av ambrakodonet av genet lacZ„ii8am- Det siste trinn består i innføring av ekspresjonskassetten av sup Phe på pXL2730. Resultatene som oppnås med dette fragment cer (B-l-b) har ført til valget av dette plasmid i stedet for pXL2666. Man har bevart resistensgenet mot kanamycin for å lette senere kloning, særlig for å disponere over en supplementær innsikting under den endelige kloning (Km<R->tap).

EKSEMPEL 3:

Validering av den plasmidiske vektor for applikasjoner i genterapi ved transfeksjon av murine fibroblaster.

1) Konstruksjon av rapportørvektoren pXL2774

For å utprøve validiteten ved genterapi av produksjonssystemet for plasmidisk DNA, har man på pXL2760 innført en genrapportør, anvendelig i eukaryotiske celler. Man har benyttet genet lue som koder for luciferasen av Photinus pyralis fordi testen på måling av bioluminescens er meget følsom, lineær innen et vidt spektrum og bakgrunnsstøyen som skyldes endogen aktivitet i det eukaryotiske celler er meget lav. Genet lue er under kontroll av promoter-forsterkersekvensen av et tidlig gen av den humane cytomegalo-virus (promoter CMV) som tillater en høy grad av ekspresjon. 13' befinner lue seg i et ikke-translatert område som stammer fra virus SV40, som inneholder polyadenylerings-signalet (poly(A)+). Etter en intermediær kloning som tillater å øke antallet disponible restriksjonsseter, blir kassetten "promoter CMV-luc-poly(A)+" innført på den minimale ori y-vektor, cer-sup Phe (pXL2760) på plassen for markøren Km<R>. Det resulterende plasmid kalles pXL2774. Figur 6 oppsummerer de forskjellige kloningstrinn. Ligerings-blandingene transformeres ved elektroporering i XAC-lpir-116. Innkuberingen tillater at bakteriell ekspresjon av seleksjonsmarkører skjer i rikt miljø (SOC-miljø); det har således vært nødvendig å vaske cellene to ganger med M9-miljø etter utsåing. Dette har tillatt å eliminere restmiljøet som har kunnet medføre en bakgrunnsstøy for kulturen på minimum-miljø.

Det valgte miljø for utsåing av de elektroporerte celler er det minimale miljø M9 som tillater å selektere bakterier som uttrykker en suppressor tRNA og således nærværet av de herværende plasmider. Tilsetningen av X-Gal tillater, via blåfarging, å visualisere ekspresjonen av suppressor tRNA. Kolbene analyseres etter ca. 20 timer ved 37°C. Fraværet av kolonier på prøver uten DNA viser at seleksjonen er korrekt, selv med tett utspredning. Alle klonene som er undersøkt ved restriksjon (8) bærer et plasmid tilsvarende den ventede profil. Plasmidet som konstrueres på denne måte, pXL2774, er fremstilt fra en klon dyrket i 1 liter flytende M9-miljø (ca. 18 timer ved 37°C) med en teknikk som anvender blant annet en ionebytting (kitt Promega, MegaPreps). Den gjenvunne DNA-mengde er 2 mg. 2) Analyse av rapportørvektoren pXL2774. transfektert i patted<y>rceller Kapasiteten for pXL2774 til å transfektere eukaryotiske celler og å tillate ekspresjon av luciferase bedømmes ved transfeksjon i murine fibroblaster NTH 3T3. Vektoren som velges som referanse er plasmidet pXL2622 (det dreier seg om plasmidet pGL2 fra Promega hvis S V40-promoter er erstattet med promoteren CMV) som bærer den samme ekspresjonskassett for luciferase som pXL2774, men på en forskjellige replikon. Det er et derivat av ColEl på 6,2 kb, som bærer genet for ampicillinresistens. Dette plasmid tjener som sammenligning. Luciferase-aktivitetene (uttrykt som RLU, eller relative luminescensenheter) er oppsummert i tabell 3.

Forbedrede resultater oppnås med et forhold "lipofektantladning:DNA-ladning" på 6; under disse betingelser synes pXL2622 og 2774 å være ekvivalente.

EKSEMPEL 4:

Verifisering av karakteren av sekvensvektoren hos E. coli fra pCOR-plasmidene. Den ikke-replikative karakter av plasmidene som stammer fra R6K-type pCOR verifi-seres ved et elektroporeirngsforsøk i E. coli JM109 (Yanisch-Perron et al., 1985) av plasmidene pUC4K (ori ColEl-KmR (Vieira og Messing, 1982)) og pXL2730 (ori y av R6K-KmR, se eksempel 2). Den benyttede elektroporatør er Gene Pulser Biorad og de elektrokompetente celler JM109 fremstilles og brukes i henhold til produsentens protokoll (bakteriell elektrotransformering og pulskontroll-instruksjonsmanual.katalog nr. 165-2098).

De elektrotransformerte celler sås ut på LB-medium med tilsatt kanamycin (50 mg/l) og innkuberes over natt ved 37°C. De oppnådde resultater er vist nedenfor.

Resultater:

Disse resultater viser at det er minimum 5 log forskjell mellom transformasjonseffektiviteten for et derivat av ColEl (pUC4K) i forhold til et derivat av R6K (pXL2730) i en stamme som ikke uttrykker genet pir. I en pir+-stamme som XAC-lpir-116 har elektrotransformeirngseffektiviteten for plasmidet som stammer fra R6K nådd eller passert klassisk de 108 transformanter/ug plasmid.

EKSEMPEL 5:

Fremstilling av plasmidisk DNA ved høydensitetsdyrking av stammen E. coli XAC-lpir-116 (pXL2774): Fermenteringsprosess. 5. 1. Stammer: Fremstilling i E. coli XAC-lpir-116 (eksempel 1) av et minimalplasmid, pXL2774. Dette plasmid omfatter de følgende elementer: ori R6K-cer-tRNAamsupPhe og en ekpresjonskassett for rapportørgenet lue under kontroll av CMV-promoteren (eksempel 3). Det er utviklet en prosess med høy produktivitet for fremstilling av denne type plasmider.

5. 2. Miljø og dyrkingsbetingelser:

a) Dyrkingsmiljø:

• Sammensetning for det definerte miljø som benyttes for inokulum kulturene (g/l): Na2HP04 6, KH2P04 3, NaCl 0,5, NH4C11, NH4H2P04 3, glukose 5, MgS04-7H20 0,24, CaCl2-2H20 0,24, CaCl2-2H20 0,015, tiaminHCl 0,010. • Sammensetning for det komplekse miljø som benyttes for kulturene i fed-batch (g/l): KH2P04 8, KH2P04 6,3, Na2HP04 1,7, (NH4)2S04 0,74, NH4C1 0,12, leverekstrakt 3, glukose 2, MgS04-7H20 2,4 g/l, CaCl2-2H20 0,015, tiamin 0,010, saltoppløsning (Fe, Mn, Co, Zn, Mo, Cu, B, Al). • Sammensetning for det definerte miljø for kulturene i fed-batch-miljø identisk med det komplekse miljø, men leverekstrakten er erstattet med 2,5 g/l NEUC1.

b) Betingelser for dyrking ved fed-batch:

Studier i 2 liters fermentorer (Setric France) inneholdende 11 miljø er gjennomført for å

definere de optimale betingelser for vekst og produksjon av plasmid DNA. Fermentoren tilsettes 80 ml av en inokulum kultur som akkurat har nådd den stasjonære vekstfase.

Under fermenteringen blir pH-verdien kontrollert og justert automatisk mellom 6,9 og 7,0 med 10% vekt/volum ammoniakk; temperaturen holdes ved 37°C; beluftningen er fiksert til 75 l/time (1,1 wm) under et trykk på 0,2 bar og oppløst oksygen kontrolleres til 40% av luftmetningen ved retroaksjon på beluftningshastigheten og, hvis nødvendig, anrikning med rent oksygen.

Alle parametere (pH-verdi, temperatur, agitering, OD, 02 og CO2 i gassavløpene) er samlet og beregnet on-line ved hjelp av en HP3852-interface forbundet med en Héwlett-Packard 9000.

Sammensetning for næringsbasismiljø er som følger: karbonkilde 50%, magnesium-sulfat 0,7%, tiamin 0,02%; for det komplekse miljø tilsettes det leverekstrakt til en konsentrasjon fortrinnsvis mellom 5 og 10%.

For å tilpasse dyrkingsbetingelsene til fermentorer på 800 1, blir produksjonssekvenser omfattende to suksessive inokolum kulturer tilveiebrakt, i laboratoriémålestokk, inokulum I i agitert Erlenmeyer og inokulum II i 2 1 fermentor (satskultur), fulgt av en produksjonskultur i fed-batch i 7 1 fermentor.

5. 3. Resultater

Forskjellige dyrkingsbetingelser er studert i komplekst miljø, i definert miljø og ved forskjellige vekstgrader. I alle disse tilfeller ble, etter en initialkultur i sats av bakterie-stammen og forbruk av karbonkilden, alimenteringsmiljøet satt til fermentoren ved hjelp av en peristaltisk pumpe koblet til en forprogrammert tilsetningsprofil. Denne profil er dedusert fra tidligere forsøk der alimenteirngsgraden er koblet enten med mengden av oppløst oksygen eller med en konstant vekstgrad.

For videre uten vanskelighet å kunne ekstrapolere fermenteringsbetingelsene fra 21 til en fermentor på 8001 uten overoksygenering av miljøet, ble det maksimale oksygen-behov ved slutten av kulturen fiksert til 2,5 til 3 mM/min. For dette formål blir vekst-graden for mikroorganismen redusert hvis nødvendig ved innvirkning på matemengden av komplementær ladning.

Som vist i tabell 4 oppnås meget gode resultater både i komplekst miljø og definert miljø uansett om det er i laboratoriemålestokk eller i målestokk med 800 1 fermentor; vekstkinetikken og produksjonen av plasmidisk DNA er helt og holdent sammenlignbar (jevnfør figurene 6 og 7).

De totale resultater viser at:

- en forandring i fermentorskala fra 2 til 8001 kan gjennomføres uten problemer overhodet, - oksygenet som forbrukes er sterkt korrelert til den fremstilte biomasse (1,08 g (Vg fremstilt biomasse)

- plasmidet er stabilt i minst 50 generator uten seleksjonstrykk,

- man kan oppnå en øket mengde biomasse, over 40 g tørkede celler/liter i komplekst medium,

- fremstillingen av plasmidisk DNA når 100 mg superviklet DNA/l miljø,

- det foreligger en meget god korrelasjon mellom fremstillingen av DNA og bio-massen: Man kan anslå produksjonen til 1 mg plasmid DNA/OD-enhet eller også 2,7 mg plasmidisk DNA/g biomasse, og dette uansett fermenteringsvarighet, - anvendelsen av et definert miljø tillater også å komme opp i en øket mengde biomasse (30 g tørkede celler/l) og øket produksjon av plasmidisk DNA (100 mg/l), og dette uten produktivitetstap.

EKSEMPEL 6:

Overføring av pXL2774 i animalske celler, in vitro og in vivo.

6. 1. Overføring in vitro av pXL2774 i animalske celler

Kapasiteten for det minimale plasmid pXL2774 til å transfektere forskjellige cellelinjer er testet in vitro, både på celler av human opprinnelse og av murin opprinnelse. Plasmidet pXL2784 ble benyttet som sammenligning. Det inneholder den samme eukaryotiske ekspresjonskassett (promoter CMV-luciferase-polyA) som pXL2774, men er et derivat av ColEl på 6,4 kb og som omfatter genet som gir kanamycinresistens hos E. coli.

De testede celler er de følgende:

Transfeksjonsbetingelsene var som følger:

J-l: Utsåing av cellene i en densitet på 100 000 celler pr. brønn på 2 cm<2> (24 brønners plate) i DMEM-miljø (Dulbecco's modifiserte Eagle-medium) supplert med 10% føtalt kalveserum (SVF).

J-3: Transfeksjon av cellene med 10 ul av en transfeksjonsoppløsning inneholdende: 0,5

Hg DNA, 150 mM NaCl, 5% glukose og 3 nmol lipofektant RPR120 535 pr ug DNA, i 250 ul dyrkingsmiljø, eventuelt tilsatt 10% SVF. Efter en inkubasjon på 2 timer, ble miljøet erstattet med 500 ul DMEM-miljø tilsatt 10% SVF.

J-4: Fornyelse av dyrkingsmiljøet.

J-5: Vasking av cellene med PBS og etter lysering med 100 ul lyseringsbuffer Promega (Promega Cell Lysis Buffer E153 A). Bestemmelsen av luciferase-aktiviteten skjer i et Lumat LB 9501-luminometer fra Berthold på 10 ul lysat med en integrerings-varighet på 10 sekunder. Reaktantene som benyttes er fra Promega (Promega Luciferase Assay Substrate). Resultatene, oppsummert i tabellene nedenfor, uttrykkes i RLU (relative lysenheter) pr. 10 ul lysat (gjennomsnitt av målinger på 4 brønner). Variasjonskoeffisientene, CV, er også antydet.

Resultatene av transfeksjoner i fråvær av serum er summert opp som følger:

CELLETYPE

Resultatene av transfeksjoner i nærvær av serum (10%) er angitt nedenfor:

CELLETYPE

CELLETYPE

Disse resultater viser evnen hos pXL2774 til in vitro å transfektere på effektiv måte forskjellige typer celler av både murin og human opprinnelse. Ekspresjonen av rapportør-genet lue tillater å vise at dets effektivitet for transfeksjon er minst like god som den til et "klassisk" plasmid, avledet fra ColEl, som bærer den samme ekspresjonskassett av luciferase.

6. 2. Overføring in vivo hos dyr ( mus) av pXL2774

a) Modell 1: Naken DNA i den kraniale tibiale muskel hos mus.

Nakent, plasmidisk DNA i oppløsning i "glukose 5%, NaCl 150 mM" injiseres i den

kraniale tibialmuskel hos OFl-mus. Musklene fjernes 7 dager efter injeksjon, hakkes opp, homogeniseres i 750 ul lyseringsbuffer (Cell Lysis Buffer Promega El 53A) og sentrifugeres deretter ved 20 000 x g i 10 minutter.

Bestemmelsen av lucifase-aktiviteten gjennomføres på 10 ul supernatant efter tilsetning av 50 ul reaktant (Promega Luciferase Assay Substrate). Avlesningen skjer på et Lumat LB9501-luminometer fra Berthold med en integrasjonstid på 10 sekunder.

Resultatene er i tabellen nedenfor:

Disse resultater viser at et plasmid med kondisjonell replikasjon som pXL2774 klart er i stand til å transfektere muskulære celler hos mus in vivo og dette med en sammenlignbar effektivitet, sogar overlegen den til et "klassisk" plasmid avledet fra ColEl og som bærer den samme ekspresjonskassett for genet av luciferase.

b) Modell 2: Modell tumoral 3T3 HER2

Modellen er som følger:

- voksne, nakne Swiss-hunnmus,

- eksperimentelle tumorer indusert etter injeksjon av 107 3T3 HER2-celler ad sub-kutan vei i flanken, - injeksjon av transfeksjonsblandingen gjennomføres 7 dager etter injeksjon av cellene.

Injiserte oppløsninger: DNA oppløseliggjøres først i bufferen. Etter tilsetning av alle produktene inneholder blandingen, i tillegg til DNA, NaCl (150 mM) og 5% D-glukose 1 vann eller bufferen HEPES 5 mM. 2 dager etter injeksjon fjernes det tumorale vev, veies, hakkes og homogeniseres 750 ul lyseringsbuffer (Promega Cell Lysis Buffer El53 A). Etter sentrifugering ved 20 000 x g i 10 minutter fjernes 10 ul supernatant som tillater evaluering av luciferase-aktiviteten. Denne aktivitet bestemmes ved å måle den totale luminøse emisjon som oppnås etter blanding med 50 ul reaktant (Promega Luciferase Assay Substrate) i et Lumat LB 9501-luminometer fra Berthold ved en integrasjonvarighet på 10 sekunder.

Den resulterende aktivitet uttrykkes i relative lysenheter, RLU, bestemt i totaliteten av den tumorale lyseringssupernatant.

Resultater:

Disse resultater antyder at et plasmid med kondisjonell replikasjon som pXL2774 godt er i stand til å transfektere tumorale celler av mus in vivo og dette med en effektivitet som minst er sammenlignbar med den til et "klassisk" plasmid, avledet fra ColEl og som bærer den samme ekspresjonskassett av genet av luciferase.

Disse forskjellige forsøk har tillatt å vise at plasmidene med kondisjonell replikasjon og særlig pXL2774 godt viser de karakteristika for transfeksjon av animalske celler som er uunnværlig ved en anvendelse i genterapien. Mer spesielt har man vist: 1) evnen hos pXL2774 til effektivt in vitro å transfektere forskjellige cellulære typer av human eller murin opprinnelse; 2) evnen hos pXL2774 til in vivo å transfektere muskel av mus; 3) evnen hos pXL2774 til in vivo å transfektere tumorale celler implantert hos mus.

Forsøk med elektrotransformering, fermentering og transfeksjon har således tillatt å validere plasmidene med kondisjonell replikasjon som vektor for anvendelse i genterapi ved å vise

i) at de ikke replikeres på detekterbar måte i en E. coli-stamme som ikke uttrykker genet pir (kondisjonell replikasjonsopprinnelse)

ii) at de kan produseres i en målestokk sammenlignbar med en industriell produksjon i

et medium som kan være totalt definert og som ikke inneholder antibiotika; og

iii) at plasmidene kan transfektere in vitro og særlig in vivo, mammalske celler.

EKSEMPEL 7:

Fremstilling av rekombinante proteiner in vitro.

7. 1. Konstruksjon av ekspresjonsvektoren

For å vise brukbarheten av en slik tilnærming ble det konstruert en ekspresjonsvektor i henhold til de tidligere beskrevne kriterier (eksemplene 2 og 3). Denne vektor, pXL3056, inneholder: 1) den bakterielle del som omfatter den kondisjonelle replikasjonsopprinnelse (ori y), fragmentet cer av ColEl og genet som sikrer seleksjonen hos bakterien (sup) 2) ekspresjonskassetten, basert på det system som er beskrevet av Studier (Studier et al., 1990) omfatter promoteren av genet 10 av bakteriofagen T7, operatoren lacO, genet som koder for aFGF 154 (sur fibroblastvektor i en form omfattende 154 aminosyrer)

(Jaye et al., 1986), terminatoren TF av bakteriofagen T7. Denne ekspresjonskassett er identisk med den som er til stede på plasmidet pXL2434 som beskrevet av WO 96/08572.

Konstruksjonen av pXL3056 er vist i figur 8. Fragmentet EcoRI-Bgifl av pXL2434 (1,1 kb) inneholdende ekspresjonskassetten av aFGF klones i vektoren med kondisjonell replikasjon pXL2979 (renset fragment på 1,1 kb) på setene Bgin og EcoRI for å generere pXL3056.

pXL2979 er resultatet av ligering av 3 fragmenter: i) fragment Accl-Xbal av pXL2730 (0,8 kb, som bringer ori y og cer), ii) fragmentet Narl-Sall av pXL2755 (0,18 kb, som bringer genet sup Phe) og iii) fragmentet Sall-Spel av pXL2660 (1,5 kb, som bringer genet som gir kanamycinresistens).

pXL2660 er et resultat av kloning av fragmentet Pstl på 1,2 kb av pUC4K (Vieira og Messing, 1982) i pMTL22 (Chambers et al., 1988) linearisert med Pstl.

7. 2. Oppnåelse av ekspresionsstammen

Plasmidet pXL3056 innføres ved transformasjon i stammen XAC-lpir-116. Den resulterende stamme transformeres deretter med plasmidet PT7pol23 (Merten et al., 1995) ved 30°C. For å uttrykke genet av interesse under kontroll av promoteren T7, må bakterien i sitt genom, på et plasmid eller en bakteriofag, inneholdende en kassett som tillater ekspresjon av RNA-polymerase av bakteriofagen T7.1 det beskrevne eksempel benyttet man plasmidet PT7pol23, sammenlignbar med derivatene av R6K som pXL3056, og som tillater temperaturinduktibel ekspresjon av RNA-polymerase-bakteriofag T7. Man kan videre ta sikte på også å lysogenisere stammen XAC-lpir-116 med k DE3 (Studier et al, 1990) for ikke å bevare annet enn et plasmid og å indusere produksjonen av RNA-polymerase av T7 heller ved IPTG enn ved hjelp av temperaturen.

7. 3. Ekspresjon av aFGF

Stammen XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol23) dyrkes ved 30°C i minimum-miljø M9 tilsatt 0,2% kasaminosyrer (DIFCO) og kanamycin (25 \ ig/ m\) inntil en optisk densitet ved 600 nm på 0,6 til 1. Halvparten av kulturen ble så anbragt ved 42°C (induksjon av RNA-polymerase av T7), mens den andre halvdel forblir ved 30°C (negativ kontroll). Det samme forsøk gjennomføres med stammen XAC-lpir-116 (pXL3056+pUC4K) som utgjør en ekspresjonssammenligning aFGF i fravær av RNA-polymerase av T7.

Resultatene som oppnås er vist i figur 9. De viser at produksjonen av aFGF er sammenlignbar eller overlegen den som oppnås med BL21(DE3)(pXL2434) (WO 96/08572), noe som godt viser potensialet for plasmidene med konvensjonell replikasjon for å uttrykke rekombinante proteiner in vitro, særlig hos E. coli.

EKSEMPEL 8:

Konstruksjon av en vektor pCOR som uttrykker et vill- eller hybridprotein p53. Dette eksempel beskriver konstruksjonen av vektorer med kondisjonell replikasjon ifølge oppfinnelsen inneholdende en nukleinsyre som koder for et protein p53. Disse vektorer er anvendelige for å restaurere en aktivitet av typen p53 i de defekte celler (muterte, deleterte) som særlig tumorale celler.

Den eukaryotiske ekspresjonskassett inneholder de følgende elementer:

1) den tidlige CMV-promoter "immediate early" (posisjonene -522 til +72) fulgt av sekvenslederen av genet av tymidinkinase av herpes simplex, virustype I (posisjon

-60 til +1 av genet, under henvisning til sekvensen i artikkelen av McKnight, S.L.f

(1980), "Nucleic Acids Res.", 8:5949-5964);

2) en nukleinsyre som koder for villproteinet p53 eller for en variant av p53 som beskrevet i PCT/FR96/01111 (variant V325K = V325 med en Kozak-sekvens ved

ATG);

3) polyadenyleringssekvensen polyA av SV40.

Disse elementer bringes i form av et fragment Ascl-Xbal på vektoren pCOR pXL2988 mellom setene BssHTI og Spel. pXL2988 er identisk med pXL2979 (eksempel 7.1.) bortsett fra nærværet av et supplementært elem,ent, en sekvens i stand til å danne en trippel DNA-heliks bestående av 17 ganger trinukleotidet GAA, plassert ved siden av y-replikasjonsopprinnelsen.

De resulterende plasmider er kalt pXL3039 og 3030 (figur 10).

Funksjonaliteten for disse konstruksjoner er verifisert in vitro på p53-SAOS2-celler i kultur ved måling av den transkripsjonene aktivatoraktivitet av p53 eller p53superWT.

BIBLIOGRAFI

MA. Alting-Mees, J.A. Sorge og J.M. Short, 1992, "Methods Enzymol.", 216:483-495.

P. Blum, D. Holzschu, H.S. Kwan, D. Riggs og S. Artz, 1989, "J. Bacteriol.", 171:538-546.

J. Brosius, 1989, "Methods Enzymol.", 216-469-483.

S.P. Chambers, S.E. Prior, D.A. Barstow ogN.P. Minton, 1988, "Gene", 68:139-149.

C.T. Chung og R.H. Miller, 1988, "Nucleic Acids Res.", 16:3580.

S.D. Colloms, P. Sykora, G. Szatmari og D.J. Sherrat, 1990, "J. Bacteriol.", 172:6973-6980.

N. Datta og P. Kontomichalou, 1965, "Nature", 208:239-241.

F. Dickely, D. Nilsson, E.B. Hansen og E. Johansen, 1995, "Mol. Microbiol.", 15:839-847. M. Filutowicz, S. Dellis, I. Levchenko, M. Urh, F. Wu og D. York,'l994, "Prog. in Nucleic Acid Res. and Mol. Biol.", 48:239-273.

T.J. Gibson, 1984, "Ph.D Thesis", University of Cambridge.

A. Greener, M. Filutowicz, M. McEachern og D. Helinski, 1990, "Mol. Gen. Genet.", 224:24-32. M. Herrero, V. de Lorenzo og K.N. Timmis, 1990, "J. Bacteriol.", 172: 6557-6567.

CP. Hodgson, 1995, "Bio/Technology", 13:222-225.

M. Inuzuka og Y. Wada, 1985, "EMBO J.", 4:2301-2307.

M. Jaye et al., (1986), "Science", 233:541-5.

L.G. Kleina, J.M. Masson, J. Normanly, J. Abelson og J.H. Miller, 1990, "J. Mol. Biol.", 213: 705-717.

S.C. Kowalczykowshi og A.K. Eggleston, 1994, "Annu. Rev. Biohem." 63:9991-10043.

D.W. Leung, E. Chen, G. Cachianes og D.V. Goeddel, 1985, "DNA" 4:351-355.

T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambrook, 1989,, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.

T. Meinnel, E. Schmitt, Y. Mechulam og S. Blanquet, 1992, "J. Bacteriol.", 174:2323-2331.

N. Merten, E. Remaut og W. Fiers, (1995), "Bio/Technology", 13:175-179.

J. Messing og J. Vieira, 1982, "Gene", 19:269-276.

W.W. Metcalf, W. Jiang og B.L. Wanner, 1994, "Gene", 138:1-7.

V.L. Miller og J.J. Mekalanos, 1988, "J. Bacteriol.", 170:2575-2583^.

J. Normanly, L.G. Kleina, J.M. Masson, J. Abelson og J.H. Miller, 1990, "J. Mol. Biol.", 213: 719-726.

J. Roca, 1995, "TIBS", 20:156-160.

R.K. Saiki, S. Scharf, F. Faloona, K.B. Mullis, G.T. Hom, H.A. Erlich og N. Arnheim, 1985, "Science", 230:1350-1354.

F. Sanger, S. Nicklen og A.R. Coulson, 1977, "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 74:5463-5467.

M. Sawadogo og M.W. Van Dyke, 1991, "Nucleic Acids Res.", 19:674.

J.R. Scott, 1984, "Micobiol. Rev.", 48:1-23.

D.A. Simoes, M. Dal Jensen, E. Dreveton, M.O. Loret, S. Blanchm-Roland, J.L. Uribelarrea og J.M. Masson, 1991, "Ann. N.Y. Acad. Sei.", 646:254-258.

R. Simon, U. Priefer og A. Piihler, 1983, "Bio/Technology", 1:784-791.

N.D. Sinha, J. Biernat, J. McManus og H. Koster, 1984, "Nucleic. Acids Res.", 12:4539-4557.

C.J. Stirling, G. Stewart og D.J. Sherrat, 1988, "Mol. Gen. Genet.", 214:80-84.

C. J. Stirling, S.D. Colloms, J.F. Collins, G. Szatmar og D.J. Sherrat, 1989, "EMBO J." 8:1623-1627.

F.W. Studier, A.H. Rosenberg, J.J. Dunn og J.W. Dubendorff (1990), "Methods Enzymol.", 185:60-89.

D. K. Summers og D.J. Sherrat, 1984, "Cell", 36:1097-1103.

K. Takahashi, Y. Sawasaki, J. Hata, K. Mukai og T. Goto, (1990), "In Vitro Cell. Dev. Biol", 26: 265-74.

J. Vieira og J. Messing, 1982, "Gene", 19:259-268.

K. Wiechelman, R. Braun og J. Fitzpatrick, 1988, "Anal. Biochem.", 175:231-237.

C. Yanisch-Perron, J. Vieira og J. Messing (1985), "Gene", 33:103-119 13.

Claims (33)

1. Sirkulært DNA-molekyl som er nyttig i genterapi, nevnte molekyl omfatter minst en nukleinsyresekvens av interesse og også signalene for regulering av dets ekspresjon, transkripsjon og valgfritt translasjon i den eukaryote målcellen, og som genererer produkter av terapeutisk, vaksine, agronomisk eller veterinær verdi, karakterisert ved at: (e) regionen som muliggjør dens replikasjon omfatter et kondisjonalt replikasjonsorigo som utledes fra et plasmid eller en bakteriofag og hvis funksjonalitet i en prokaryot vertscelle krever tilstedeværelsen av minst et replikasjons-initieringsprotein som er spesifikk for nevnte plasmid eller bakteriofag og som er fremmed for nevnte prokaryote vertscelle; (f) nevnte DNA-molekyl inneholder ikke en sekvens kodende for nevnte replikasjons-initieringsprotein; (g) nevnte DNA-molekyl inneholder en seleksjonsmarkør av redusert størrelse annet enn et gen som gir resistens mot et antibiotikum; og (h) nevnte DNA-molekyl replikerer kun i celler i stand til å komplementere nevnte initieringsprotein.

2. DNA-molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte kondisjonale replikasjonsorigo utledes fra et bakterielt plasmid eller en bakteriofag, som omfatter et replikasjonsorigo med flere introner, og et replikasjons-initieringsprotein som er spesifikt og muliggjør funksjon av replikasjonsorigoet.

3. DNA-molekyl ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte kondisjonale replikasjonsorigo utledes fra et bakterielt plasmid eller en bakteriofag valgt fra gruppen bestående av RK2, R6K, RI, pSClOl, Rtsl, F, RSF1010, Pl, P4, lambda, Phi82 og Phi80.

4. DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at bakterieplasmidet er R6K.

5. DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at det kondisjonale replikasjonsorigo omfatter gamma-replikasjonsorigoet til plasmid R6K.

6. DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at det kondisjonale replikasjonsorigo omfatter SEQ ID No. 1.

7. DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, karakterisert ved at regionen muliggjør seleksjonen i en vertscelle som inkorporerer DNA-molekylet kodende et suppressor tRNA for spesifikke kodon.

8. DNA-molekyl ifølge krav 7, karakterisert ved at tRNA suppressoren er en suppressor tRNA for amber kodon (TAG).

9. DNA-molekylet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8, videre omfattende en mål-region for en setespesifikk rekombinase.

10. DNA-molekyl ifølge krav 9, karakterisert ved -at regionen for en setespesifikk rekombinase velges blant resolvaser og transposaser, Tn3, Tn21 eller Tn22; invertasen til bakteriofagen mu, plasmidresolvaser, slik som invertasen kodet av fragmentet par i RP4, rekombinaser fra familien bakteriofag lambda integrase, slik som integrasene lambda, phi80, P22, HP1, integrase Cre fra Pl, integrase til plasmid pSAM2, FLP-rekombinase fra plasmid 2u, og rekombinasene XerC og XerD fra E. coli.

11. DNA-molekyl ifølge krav 9 eller 10, karakterisert ved at mål-regionen for setespesifikk rekombinasjon omfatter et cer fragment fra ColEl eller et mindre fragment med de samme egenskaper.

12. DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11, karakterisert ved at nukleinsyresekvensen av interesse koder et protein av farmasøytisk interesse.

13. DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 12, karakterisert ved at nukleinsyren av interesse koder for enzymer, blodderivater, hormoner, lymfokiner, slik som interleukiner, interferoner, TNF, vekstfaktorer, neurotransmittere og forløpere derav, tropiske faktorer slik som BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, apolipoproteiner slik som ApoAI, ApoATV, ApoE, dystrofin eller minidystrofin, tumorsuppressorgener slik som p53, Rb, RapIA, DCC, k-rev, gener kodende faktorer involvert i koaguleringskaskaden slik som faktorene VU, VITI, DC, selvmordsgener slik som tymidinkinase, cytosindeaminase, hele eller deler av naturlige eller kunstige immunoglobuliner slik som Fab, ScFv, sens eller antisens sekvens, eller antigene peptider spesifikke for Epstein Barr virus, HIV, hepatitt B virus eller tumorspesifikk.

14. Fremgangsmåte for å fremstille et sirkulært DNA-molekyl i henhold til et hvilket som helst av kravene 1 til 13, karakterisert ved at nevnte metode omfatter: (c) dyrking av en prokaryot rekombinant vertscelle omfattende nevnte replikasjons-initieringsprotein spesifikk for nevnte replikasjonsorigo, som transformeres med nevnte sirkulære DNA-molekyl i henhold til kravene 1 til 13, og (d) isolering av nevnte sirkulære DNA-molekyl produsert av den transformerte prokaryote rekombinante vertscellen.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at replikasjons-initieringsproteinet er til stede som et replikon eller inkorporert inn i genomet til nevnte celle.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 14 eller 15, karakterisert ved at nevnte initieringsprotein er % protein fra plasmid R6K eller et modifisert fragment derav.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at rc proteinet eller en av dets derivater uttrykkes in situ fra genet pir med sekvensen som fremlagt i SEQ TD NO: 2, eller en hvilken som helst degenerert sekvens derav, eller en hvilken som helst sekvens i stand til å hybridisere med en slik sekvens eller fragment derav, og hvis produkt har aktiviteten til replikasjons-initieringsproteinet.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at proteinet kodes av genet pir-116 inkorporert i genomet til vertscellen.

19. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 18, karakterisert ved at seleksjonsgenet er et suppressor tRNA for spesifikke kodon, og vertscellen inneholder et gen essensielt under visse kulturbetingelser.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at nevnte gen inneholder et amber kodon (TAG).

21. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 20, karakterisert ved at nevnte celle er en E.coli stamme.

22. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 14 til 20, karakterisert ved at nevnte celle er en E.coli XAC1 stamme.

23. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 15 til 22, karakterisert ved at pir 116 genet inkorporeres i genomet til E.coli XAC1 stammen.

24. Rekombinant celle transformert med minst et DNA-molekyl i henhold til et hvilket som helst av kravene 1 til 13.

25. Farmasøytisk sammensetning omfattende minst en eller flere DNA-molekyler i henhold til et hvilket som helst av kravene 1 til 13.

26. DNA-molekyl ifølge kravene 1 til 13 for medisinsk bruk.

27. Anvendelse av DNA-molekylene ifølge kravene 1 til 13 til framstilling av rekombinante proteiner in vitro.

28. DNA-molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at nukleinsyresekvensen av interesse koder p53 villtype eller modifisert sekvens.

29. DNA-molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at det heterologe terapeutiske genet koder tymidinkinase (tk).

30. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at cellen er en E.coli endA".

31. DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 13, karakterisert ved at nevnte molekyl videre omfatter en sekvens interagerende spesifikt med et ligand.

32. DNA-molekyl ifølge krav 13, karakterisert ved at det heterologe terapeutiske genet koder sur fibroblast vekstfaktor.

33. DNA-molekyl ifølge krav 32 til medisinsk bruk.