KR100522369B1 - 조건성 복제기원을 지닌 환상 디엔에이분자, 이의 제조방법 및 유전자 요법에 있어서 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

복제 허용영역이 숙주세포에 이종인 적어도 하나의 특이적 단백질의 존재를 요하는 숙주세포에서의 기능성을 갖는 복제기원을 갖는 것을 특징으로 하는, 적어도 하나의 해당 핵산서열을 포함하는, 유전자 요법에 유용한 환상 DNA 분자. 이러한 DNA 분자의 제조방법, 이를 이입하는 세포 및 유전자 요법에서의 이의 용도 또한 기술됨.

Description

조건성 복제기원을 지닌 환상 디엔에이 분자, 이의 제조방법 및 유전자 요법에 있어서 이의 용도
본 발명은 유전자 요법에 사용될 수 있거나 재조합 단백질 생산을 위한 조건 적 복제 DNA 분자에 관한 것이다.
유전자 요법은 유전정보를 병에 걸린 기관이나 세포 중으로 도입함으로써 결손이나 비정상을 교정하는 데에 있다. 이러한 정보는 기관에서 추출된 세포 중으로 시험관내에서 도입된 다음 체내로 재주입되거나, 생체내에서 표적 조직 중으로 직접 도입될 수 있다. DNA는 분자량이 높고 음전하를 띠기 때문에 인지질 세포막을 자발적으로 횡단하는 데에 어려움을 겪는다. 따라서, 각종 벡터가 유전자 전달이 일어날 수 있도록 하기 위하여 사용되고 있다: 한편으로는 바이러스 벡터, 및 다른 한편으로는 천연 또는 합성 화학 및/또는 생화학 벡터.
바이러스 벡터(레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-수반 바이러스 등)는 특히 막 횡단용으로 매우 효과적이지만, 병원성, 재조합, 복제, 면역원성 등과 같은 수 많은 위험이 도사리고 있다.
화학 및/또는 생화학 벡터는 이러한 위험성을 피할 수 있게 해준다[참조문헌: Behr, 1993, Cotten and Wagner 1993]. 예를 들면, 이들은 세포에 의해 "식균작용을 받게" 될 수 있는 DNA와 침전물을 형성함으로써 작용을 하는 양이온(인산칼슘, DEAE-덱스트란 등)이다. 이들은 또한 DNA가 이입되거나 원형질막과 융합되는 리포솜일 수도 있다. 합성 유전자-전달 벡터는 DNA와 복합체를 이루고 이와 표면 양 전하를 띠는 입자를 형성하는 일반적으로 지질 또는 양이온 중합체이다. 이러한 유형의 벡터의 실례로는 특히 디옥타데실아미도글리실스퍼민 (DOGS, TransfectamTM) 또는 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 (DOTMA, LipofectinTM)을 들 수 있다.
그러나, 화학 및/또는 생화학 벡터나 네이키드 DNA의 사용은 약리학적 순도를 지닌 DNA의 대량생산 가능성을 암시한다. 이에 대한 이유는 유전자 요법 기술에 있어서, 의약 제품이 DNA 자체로 구성되거나 사람에 치료용으로 적당한 특성을 지닌 DNA를 적정량 제조할 수 있어야 함이 필수이기 때문이다.
비-바이러스 벡터학의 경우, 사용 벡터는 세균 기원의 플라스미드이다. 유전자 요법에 일반적으로 사용되는 플라스미드는 (i) 복제기원, (ii) 항생물질 내성 유전자와 같은 마커 유전자 및 (iii) 발현에 필요한 서열을 갖는 하나 이상의 트랜스진(인핸서, 프로모터, 폴리아데닐화 서열 등)을 운반한다.
그러나, 현재 이용될 수 있는 기술은 전적으로 만족스럽지는 않다.
한편, 체내 전이의 위험이 여전히 존재하게 된다. 따라서, 체내에 존재하는 세균은 낮은 빈도로 이러한 플라스미드를 수용할 수 있다. DNA가 환자의 체내에서 전이될 수 있고 이러한 환자 또는 공생 미생물총의 세균에 감염하는 세균과 접촉될 수 있는 생체내 유전자 요법 치료를 수반하는 경우 이러한 일이 일어날 가능성은 더 크다. 플라스미드 수용 세균이 이.콜라이와 같은 장내세균이면, 이러한 플라스미드는 복제될 수 있다. 이어서 이러한 일은 치료 유전자의 전이를 이끈다. 유전자 요법 치료에 사용된 치료 유전자가 예를 들면, 림포카인, 생장인자, 항-종양유전자 또는 숙주내에서 기능이 결손되고 따라서 유전적 결함을 바로 잡을 수 있게 하는 단백질을 암호화하는 한, 이들 유전자 중 일부의 전이는 예견할 수 없고 근심을 자아내는 영향을 준다(예를 들면, 병원성 세균이 사람 생장 인자 유전자를 획득하는 경우).
한편, 비-바이러스 유전자 요법에 일반적으로 사용되고 있는 플라스미드는 또한 항생물질(앰피실린, 카나마이신 등) 내성 마커를 보유하고 있다. 따라서, 이러한 플라스미드를 획득하는 세균은 플라스미드 내성 유전자를 선별하는 것과 동일 계통으로부터의 항생물질을 사용하는 어떠한 항생제 요법으로도 해당 플라스미드의 선별을 도출하게 되므로 부정할 수 없는 선택적인 장점이 있다. 이와 관련하여, 앰피실린은 전세계적으로 가장 빈번히 사용되고 있는 항생제 계열인 β-락탐에 속한다. 따라서, 항생제-내성 유전자가 아닌 선별마커를 세균에 사용하는 것이 특히 유리할 것이다. 이렇게 함으로써 이러한 마커를 운반하는 플라스미드를 수용할 수 있는 세균의 선별이 회피된다.
따라서, 치료 유전자와 내성 유전자 전이를 가능한 한 많이 제한하도록 모색하는 것이 특히 중요하다.
도 1: 복제에 관여된 R6K 영역의 기능적 구성도.
도 2: 플라스미드 R6K의 π 단백질의 기능성 영역의 구성도.
도 3: pir 유전자를 이.콜라이 XAC1의 게놈 중으로 도입하기 위한 프로토콜 예시도.
도 4: 벡터 pXL2666, 2730 및 2754에 대한 작제 개략도.
도 5: pXL2774의 작제도.
도 6: 2L 발효조에서의 생장 및 생산 동역학.
도 7: 800L 발효조에서의 생장 및 생산 동역학.
도 8: pXL3056의 작제도.
도 9: 유도 후 이.콜라이 XAC-1pir-116 (pXL3056+PT7po123)에 의하여 생성된 aFGF 단백질의 가시도.
변성된 총 세포 추출물을 12.5% SDS 폴리아크릴아미드 겔상에 침착시킨다. M: 분자량 마커(Biorad, 낮은 범위). 각각의 밴드는 화살표와 분자량을 kD로 나타낸 도면으로 확인된다. 1: 유도되지 않은 XAC-1pir-116(pXL3056+pUC4K); 2: 42℃에서 유도된 XAC-1pir-116 (pXL3056+pUC4K): XAC-1pir-116(pXL3056+PT7po123) 클론 1, 비유도; 4: XAC-1pir-116(pXL3056+PT7po123) 클론 1, 42℃에서 유도; 5: XAC-1pir-116(pXL3056+PT7po123)클론 2, 비유도; 6: XAC-1pir-116(pXL3056+PT7po123) 클론 2, 42℃에서 유도; t1: 1 ㎍의 정제된 aFGF; t4: 4 ㎍의 정제된 aFGF.
도 10: 벡터 pXL3029 및 pXL3030에 대한 작제 개략도.
I- 재료 및 방법
A) 재료
1) 배양배지
완전 LB, 2XTY 및 SOC 배지 및 최소 M9 배지(Maniatis et al., 1989)가 사용된다. 한천배지는 15 g의 디프코 한천을 첨가하여 수득한다. 또한, 필요하다면, 이들 배지를 항생제(앰피실린 또는 카나마이신)로 각각 100 ㎎/ℓ 및 50㎎/ℓ의 농도로 보충한다. 발색원 기질 X-Gal 및 X-Gluc를 40 ㎎/ℓ의 농도로 사용한다.
2) 이.콜라이 균주, 플라스미드 및 박테리오파지
사용된 이.콜라이 균주, 플라스미드 및 박테리오파지는 하기 실시예에서 각각 확인된다.
B) 방법
1) DNA의 조작
세균 DNA(플라스미드 및 게놈성) 및 파지 DNA(M13의 복제형)의 분리, 제한 엔도뉴클레아제 분해, DNA 단편의 연결, 아가로스 겔 전기영동(TBE 완충액 중) 및 기타 표준기술을 효소 사용의 경우 제조업자의 권장에 따라, 또는 문헌[참조: "Molecular Cloning: a Laboratory Manual" (Maniatis et al., 1989]에 따라 수행한다.
전기영동 중에 사용된 DNA 크기 마커는 다음과 같다: 선형단편의 1 kb 래더(BRL) 및 비분해 플라스미드의 경우 슈퍼코일 DNA 마커(Stratagene).
서열분석은 형광 디데옥시뉴클레오타이드 및 Taq DNA 폴리머라제(PRISM Ready Reaction DyeDideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems)를 사용하여 자동화 방법에 맞춘 생거 기술(Sanger et al, 1977)에 따라 수행한다.
사용된 올리고데옥시뉴클레오타이드("seq+no."로 표시, 하기 참조)는 β-시아노에틸 보호그룹(Sinha et al., 1984)을 사용하여, 포스포라미다이트법에 의하여 "Applied Biosystems 394 DNA/RNA 합성기"상에서 합성된다. 부탄올에 의한 2회 침전으로 올리고뉴클레오타이드가 정제되고 농축된다(Sawadogo et al., 1991).
PCR 증폭에 사용된 올리고뉴클레오타이드의 서열:
서열번호 3
서열번호 4
서열번호 5
서열 번호 6
PCR 반응(Saki et al., 1985)을 하기의 조건하에 총 용적 100㎕에서 수행한다. 반응 혼합물은 연구될 균주로부터의 150 ng의 게놈 DNA, 각각의 두 올리고뉴클레오타이드 프라이머 (24량체) 1 ㎍, 10XPCR 완충제 10 ㎕, 하기와 같이 "500 mM KCl, 0.1% 젤라틴, 20 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5"인 조성물, 및 Tag DNA 폴리머라제(Amplitaq Perkin-Elmer) 2.5 단위를 포함한다. Perkin-Elmer Cetus DNA 열 사이클러기 상의 PCR 조건은 하기와 같다: 91℃에서 2분, 30 연속 사이클의 변성 (91℃에서 1분), 하이브리드화 (42℃에서 2분) 및 신장 (72℃에서 3분), 72℃에서 5분. 이렇게하여 수득된 제한 효소로 분해되거나 분해되지 않은 산물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석한다.
DNA 토포이소머라제에 의한 다양한 플라스미드 종의 분석이 하기의 절차에 따라 수행된다: 실험실에서 정제된 효소를 1시간 동안 37℃에서 배양한다. 반응 혼합물(총 용적: 40 ㎕)은 하기의 조성을 가진다: 플라스미드 150 ng, DNA 토포이소머라제 I 300 ng 또는 이. 콜라이 DNA 자이라제 150 ng, 또는 S. 아우레우스 DNA 토포이소머라제 IV 160 ng 및 각각의 효소에 특정한 완충제 20 ㎕. 이러한 완충제의 조성을 하기와 같이 나타낸다:
DNA 토포이소머라제 I에 대해서: 50 mM 트리스-HCl pH 7.7, 40 mM
KCl, 1 mM DTT, 100 ㎍/㎕ BSA,
3 mM MgCl2, 1 mM EDTA;
DNA 토포이소머라제 IV에 대해서: 60 mM 트리스-HCl pH 7.7, 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 100 ㎍/㎕
BSA, 1.5 mM ATP, 350 mM 칼륨
글루타메이트;
DNA 자이라제에 대해서: 50 mM 트리스-HCl pH 7.7, 5 mM MgCl2, 1.5 mM ATP, 5 mM DTT, 100 ㎍/㎖ BSA, 20 mM KCl.
2) 이. 콜라이의 형질전환
이것을 Chung과 Miller에 의해 기재된 TSB(형질전환 및 저장 완충제) 방법(1988)에 따라 통상적으로 수행한다. TG1(Gibson et al., 1994)과 같은 균주에 있어서, 수득된 형질전환 효율은 pUC4K ㎍당 약 105 내지 106 형질전환체이다(Vieira and Messing; 1992). 더욱 높은 형질전환 효율이 필요할 경우, 세균을 전기투공기 제조업자(Biorab)에 의해 추천된 절차에 따라서 전기투공에 의해서 형질전환한다. 이러한 방법이 pUC4K ㎍당 약 108 내지 1010 효율의 달성을 가능하게 한다.
3) 양이온성 리포펙턴트에 의해 매개되는 세포 형질감염
사용된 세포는 웰당 50,000 세포의 밀도로 하루전에 24-웰 플레이트로 시딩된 NIH 3T3 마우스 섬유아세포이다. 사용된 배양 배지는 4.5 g/l의 글루코스를 함유하고 10% 태송아지 혈청및 200 mM 글루타민 및 항생제(5.103 u/㎖ 스트렙토마이신, 5.103 ㎍/㎖ 페니실린)의 1% 용액으로 보충된 DMEM 배지이다. 플라스미드 DNA (9 ‰ NaCl 25 ㎕ 중의 1 ㎍)를 용적에 대한 용적 기준으로 리포펙턴트의 현탁액과 혼합한다. 네 개의 "리포펙턴트 전하/DNA 전하" 비 0, 3, 6, 9로 시험된다. 이러한 비는 플라스미드 DNA 1 ㎍이 음전하 3.1 nmol을 운반하고 리포펙턴트가 분자당 3 양전하를 함유하는 것으로 고려함으로써 계산된다. DNA/지질 복합체의 형성을 허용하는 10분의 접촉 시간 후, DNA-리포펙턴트 혼합물 50 ㎕를 혈청-비함유 배양 배지 (500 ㎕) 중에서 세포로 도입한다. 세포를 이 동일한 매질과 두번 예비세정한다. 이렇게하여 혈청에 의한 형질감염의 억제가 회피된다. 배양(CO2 배양기내 37℃에서 2시간) 후, 10% 태송아지 혈청을 매질에 첨가한다. 이어서 세포를 24시간 동안 재배양한다.
4) 진핵 세포의 루시퍼라제 활성의 측정
형질감염후 24시간 수행한다. 루시퍼라제는 광자의 동시 생성과 함께 ATP, Mg2+ 및 O2의 존재하에 산화를 촉매한다. 광도계로 측정된, 방출된 빛의 총량은 샘플의 루시퍼라제 활성에 비례한다. 사용된 시제는 Promega (루시퍼라제 분석 시스템)에 의해 공급되고 추천된 절차에 따라 사용된다. 세포의 용해후, 각각의 추출물로부터의 불용성 분획을 원심분리에 의해 제거한다. 세포 용해 완충제에 희석될 수 있거나 될 수 없는 현탁액 5 ㎕에서 분석을 수행한다.
5) 세포 추출물내의 단백질 농도 측정
바이신크로닌산을 사용하는 BCA 방법(Pierce)(Wiechelman et al., 1988)에 따라 수행한다. 표준 BSA 범위가 용해 완충제(비교. III-B-4)에서 제조된다. 분석될 샘플 및 범위의 샘플을 용적에 대한 용적 기준으로 0.1 M 요오도아세타미드/0.1 M 트리스 완충제, pH 8.2로 1시간 동안 37℃에서 예비처리한다. 이 처리는 분석 동안 용해 완충제에 존재하는 환원제(DTT)의 간섭을 방지함을 가능하게 한다. 분석 결과는 562 nm로 판독된다.
실시예 1
상동 재조합에 의한 XAD-1pir 및 pir-116 숙주균주의 작제
사용된 균주는 이. 콜라이 균주 XAC-1(Normanly et al., 1980)이다. 이 균주의 argE 유전자는 유리하게도 글루타민-53(CAG)의 앰버 코돈(TAG)의 돌연변이를 포함한다 (Meinnel et al., 1992). argE 유전자는 argECBH 분기 오페론에 속하고 아르기닌 생합성 효소인 N-아세틸오르니티나제를 암호화한다. 그러므로, XAC-1은 아르기닌을 합성할 수 없고, 따라서 최소 배지에서 생장할 수 없다. 이러한 영양요구주는 균주가 억제자 tRNA의 발현을 허용하는 플라스미드를 지닐 경우 감소될 것이다. 이렇게하여 최소 배지에서 배양함으로써 이러한 플라스미드를 운반하는 세균을 선별함이 가능해질 것이다. R6K로부터 유도된 플라스미드의 복제를 허용하기 위해서, 상동 재조합에 의해서 pir 유전자를 XAC-1의 게놈으로 도입하는 것이 필수적이다. pir 유전자(야생형 또는 돌연변이)를 uidA 좌에서 야생형 uidA 유전자와 pir(또는 pir-116) 유전자에 의해 중단된 카피간의 교환에 의해 도입한다. uidA 유전자는 β-글루쿠로나이드의 가수분해를 위한 효소인 β-글루쿠로니다제를 암호화한다. 이러한 유전자는 β-글루쿠로나이드가 사용되지 않는 표준 합성 배지에서의 생장에 필수적이지 않으므로 여타의 문제없이 불활성화할 수 있다. 추가로, β-글루큐로니다제 활성은 가수분해가 청색 색소를 방출시키는 색소원 기질인 X-Gluc에 의해서 모니터링할 수 있다.
1) 카세트 "KmR-uidA: :pir (또는 pir-116)을 운반하는 자기불활화 벡터의 작제
단일 세균 숙주를 수반하고 해당 균주의 게놈으로의 변형을 최소화하는 전략을 사용한다. 파지 M13mp10(Messing et Vieira; 1992)을 자기불활화 벡터(Blum et al., 1988)로서 사용한다. 복제에 필수적인 유전자 II내 앰버 돌연변이는 앰버 억제자 tRNA를 생성하는 TG1(supE)과 같은 균주에 대한 이 M13의 숙주 스펙트럼을 감소시키고 그러므로 XAC-1과 같은 이. 콜라이 sup+ 균주에서 복제할 수 없게될 것이다.
Tn5 및 _uidA: :pir 또는 pir-116의 카나마이신-내성 유전자를 함유하는 3.8 kb BamHI 카세트를 M13wm34 및 33(Metcalf et al., 1994)으로부터 각각 정제한다. 이들을 BamHI를 사용하여 선형화된 M13mp10으로 클로닝한다. 연결 혼합물을 TG1으로 전기투공한 후 재조합 클론을 LB+Km 아가 배지 상에서 플레이팅함으로써 선택한다. 수득된 클론의 부합성을 제한 프로필을 분석함으로써 pir-116 돌연변이에 상응하는 영역을 서열화함으로써 나타낸다.
2) 상동 재조합에 의한 pir 또는 pir-116의 coli XAC-1 게놈으로의 도입
채택된 전략 및 수반된 다양한 사건이 도 3에 제시되었다.
a) 제 1 재조합 사건
XAC-1 균주를 각각 RF(mp10-_uidA: : pir 또는 pir-116) 10, 100 또는 2000 ng으로 전기투공에 의해 형질전환한다. 각각의 발현 혼합물의 1/3을 카나마이신을 함유하는 LB 플레이트 상에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 배양한다. mp10-_uidA: :pir-116 파지는 균주 XAC-1 (sup+)에서 복제할 수 없다. 그러므로, Kmr 마커만이 유전자 uidA의 야생형 카피로의 상동 재조합에 의한 세균의 게놈으로의 통합에 의해 유지될 수 없다. XAC-1의 전기투공의 결과를 표 1에 나타내었다. 수득된 형질전환 효율은 pUC4K ㎍당 4.109 형질전환체이다.
[표 1]
시험 조건하에서, 통합체의 수는 DNA 양과 비-직선 방식으로 증가한다. 형질전환 효율 및 RF의 크기(11.7 kbp)가 부여될 경우, 재조합 수준에 대한 적합한 발상을 갖출 수 있다. 100 ng에서의 지점을 고려함으로써, 약 10-6의 재조합 효율을 수득한다.
b) 제 2 재조합 사건
제 2 재조합 사건은 디옥시클로레이트 (DocR)에 대한 균주의 내성에 의해 선택될 것이다.
이것을 실행하기 위해서, 각각의 작제의 5 통합체를 0.2% 나트륨 디옥시클로레이트로 보충된 2XTY 배지에서 배양한다. 별개의 두 개체군이 나타난다. 특정 클론은 37℃에서 8시간 후 매우 명백한 탁도를 생성한다 (pir 작제에 대해 2 클론, pir-116 작제에 대해 3 클론). 다른 클론은 단지 37℃에서 하룻밤 후에 조밀한 배양을 생성한다. 이들은 예상된 바와 같이 거의 모두 Km2이다. 연구된 전기투공체 각각에 대하여, 50 Kms 자손을 X-Gluc로 보충된 LB 배지 위로 스트리킹한다. 37℃에서 48시간 후, UidA+ 클론은 담청색으로 되고 반면에 대립유전자 치환(도 3의 사건 번호 1)을 수행한 것들은 이 배지(UidA-) 상에 흰색으로 잔존한다. 표 2에 수득된 이중 재조합체 표현형 분석이 요약된다.
이중 재조합체의 18 내지 30%가 대립유전자 치환이 일어났다.
3) 재조합에 의해 수득된 균주의 Pir+ 특성 검사
이중 재조합에 의해 수득된 균주의 Pir+ 특성을 보장하기 위해서, 각각의 작제를 pBW30(Metcalf et al., 1994)을 사용하여 3개의 클론으로 형질전환한다. 형질전환체가 모든 시험 균주에 대해 수득된다는 사실은 XAC-1의 게놈으로 통합된 pir 및 pir-116 유전자의 기능성을 나타냄을 가능하게 한다. 2 XAC-1pir 클론 (B 및 C)과 2 XAC-1pir-116 클론 (E 및 D)을 계속해서 연구한다.
4) PCR 증폭에 의한 재조합에 의해 수득된 균주의 검사
대립유전자 치환을 확인하기 위해서, PCR 증폭에 의해 일면의 uidA 좌에서 게놈 영역을 검사한다. 각 쌍의 올리고뉴클레오타이드는 pir의 내부 영역에 상응하는 올리고뉴클레오타이드와 염색체 uidA에 인접한 영역에 상응하는 제 2 올리고뉴클레오타이드로 이루어져 있지만, 재조합을 위해 제공하는 단편내에 있지 않다. 제 2 올리고뉴클레오타이드의 서열은 Genbank (access number: M14641)로부터의 ECOUIDAA 서열에 의해서 측정한다. 이렇게하여 세균 게놈내 pir 유전자의 정확한 위치를 입증할 수 있다. 크기가 예상될 수 있는 것을 따르는 증폭된 단편의 성질이 M1uI을 사용한 분해에 의해 확인된다.
실시예 2
선별 마커 sup Phe를 운반하는 R6K로부터 유도된 플라스미드 벡터의 작제
R6K로부터의 ori γ 및 카나마이신-내성 유전자를 함유하는 벡터(pXL2666)를 작제한다. 균주 BW19610 (pir-116) 5 (Metcalf et al., 1993)내 pXL2666 멀티머의 관찰은 이러한 현상에 대한 ColE1으로부터의 cer 단편의 영향을 연구하게 한다. 이어서 페닐알라닌 억제자 tRNA (sup Phe)의 발현 카세트를 벡터 ori γ-KmR-cer (pXL2730)로 도입한다. 이 벡터 pXL2760은 유전자 치료에 사용할 수 있는 벡터의 작제를 위한 기재로서 제공된다.
1) R6K로부터의 ori γ및 카나마이신-내성 유전자를 함유하는 벡터의 작제 및 분석
a) 작제
작제된 제 1 플라스미드인 pXL2666에서, 카나마이신-내성 유전자는 pUC4K(Vieira and Messing)으로부터 생성하고 417 bp EcoRI-BamHI 단편에 함유된 복제의 오리진은 자기불활화 벡터 pUT-T7pol(Herrero et al., 1990)(도 4)로부터 생성한다. pXL2666의 균주 BW19094 및 19610(Metcalf et al., 1994)으로의 전달은 플라스미드의 양이 pir 균주의 동일한 플라스미드와 비교할 때 사실상 pir-116 균주에서 증가됨을 나타내는 것을 가능하게 한다. 이러한 현상은 플라스미드 다중 카피간의 분자내 재조합과 매우 그럴듯하게 연관되어 있다. 따라서, cis에서 플라스미드 이량체(Summers and Sherrat, 1984)의 pXL2666으로의 해결을 허용함을 나타낸 천연 이. 콜라이 플라스미드, ColE1의 cer 단편을 클로닝함으로써 pXL2730을 작제한다. 사용된 단편은 ColE1(Leung et al., 1985)으로부터의 382 bp HPAII 단편에 해당한다. 이것은 특정 분자간 재조합을 함유하고; 기능 발휘를 위해서, 리컴비나제 XerC 및 XerD와 부속 인자 ArgR PepA (Stirling et al., 1988, 1989; Colloms et al., 1990)를 포함하는 숙주 단백질만을 수반한다. 관찰된 효과가 사실상 cer 단편으로 인한 것임을 보장하기 위해서, 또한 cer 단편이 165 bp 결실을 갖는 대조군 플라스미드 pXL2754를 작제한다. 이 결실이 다량체(Leung et al., 1985)의 분해에 대한 cer의 작용을 없애는 것으로 나타난다. 이러한 플라스미드의 작제를 야기하는 다양한 클로닝 단계가 도 4에 제시된다.
b) 플라스미드 종의 정량 및 정성 분석
·아가로스 겔 전기영동에 의한 분석
작제된 상이한 플라스미드의 전기영동 분석은 사용된 균주에 따라 변할 수 있는 다양한 플라스미드 종에 대한 설명을 허용한다. 비분해 플라스미드의 크기를 수퍼코일링된 DNA 마커에 대해 측정한다. pir 균주(BW19094)에서, 플라스미드 pXL2666, 2754 및 2730은 거의 전부 단량체 형태이다. 각각의 주요 밴드외의 밴드는 pXL2730에 대한 DNA 자이라제의 작용후 관찰되는 프로필에 의해 확인되는 바와 같이 다양한 매우 덜 수퍼코일링된 토포이소머에 해당한다.
pir-116 균주 (BW19610)의 경우에, 프로필이 다르고: 플라스미드 pXL2666 및 2754와 함께 단량체 내지 다량체(2, 3 또는 4 유닛) 범위에서 관찰되며, 주요 형태는 이량체이다. E.coRI으로의 분해후, 선형 플라스미드 DNA만이 발견되고; 이러한 플라스미드 종은 플라스미드 다량체 또는 다양한 토모이소머에 해당한다. 하지만, 수퍼코일링된 DNA 마커에 따라 측정되는 형태의 크기가 단량체 플라스미드 크기의 전체 생성물이므로, 이들이 다량체임이 매우 그럴듯하다. 다량체의 형성은 pir-116 돌연변이 때문이라는 것이 가장 그럴듯하지만, 두 균주 BW19094 및 BW19610은 엄밀히 말해서 동일유전성은 아니다 (BW19610은 recA이다). pXL2730으로 수득된 프로필은 다르고; 멀티머 형태가 여전히 가시적이지만, 주요 형태는 단량체 형태이다. 이렇게하여 cer 단편은 recA와 무관하게 BW19610에서 작제된 플라스미드 멀티머의 분해을 촉진할 수 있다.
pir-116 대립유전자를 운반하는 균주에서 관찰되는 형태가 특정 토포이소머라는 이론을 증명하기 위해서, 각각의 플라스미드 제조물을 DNA 토포이소머라제의 작용에 투입한다. 실험 조건하의 다양한 효소의 활성은 하기와 같다: 이. 콜라이 DNA 토포이소머라제 I를 위해 DNA를 이완하고, 이. 콜라이 DNA 자이라제를 위해 이완된 DNA를 네가티브 수퍼코일링하고, 얽혀진 DNA를 풀고 S. 아우레우스 DNA 토포이소머라제 IV에 의해 수퍼코일링된 DNA를 이완한다. DNA 토포이소머라제 IV의 작용은 고분자량 플라스미드 형태가 여러 플라스미드 분자의 얽힘으로부터 유발되지 않음을 나타내는 것을 가능하게 하고; 이러한 경우에, 이들이 단량체 종으로 전환되었다. 효소의 기능성은 물론 얽힌 DNA 분자(도시되지 않음)로 이루어진 키네토플라스트 DNA의 제조시에 검사된다. 릴렉세이션 활성은 또한 처리되지 않은 대조군에서 보다 덜 이동하는 종이 수득되므로 가시적이다. DNA 자이라제의 작용은 매우 릴렉싱된 토포이소머를 세균(주로 단량체 또는 이량체)으로부터 추출된 좀더 수퍼코일링된 종으로 전환함을 가능하게 한다. 추가로, 이것이 제조된 DNA가 주로 수퍼코일링된 형태임을 증명할 수 있게 한다. 이렇게하여 처리된 샘플은 상기의 결과가 각각의 작제물에 대한 주요 종에 대하여 확인되도록 한다. DNA 토포이소머라제 I은 사실상 DNA를 릴렉싱하지만 단지 부분적으로 릴렉싱한다. 이것은 연구된 플라스미드가 이 효소가 바람직하게 결합하는 (Roca, 1995) 약간의 일본쇄 영역만을 함유한다는 사실에 기인할 수 있다.
2) 선별 마커 sup Phe의 pXL2730으로의 도입
합성 억제자 tRNA 유전자 (Phe) (Kleina et al., 1990)의 발현 카세트를 사용한다. 이것은 페닐알라닌을 TAG 코돈에 상응하는 신장하는 폴리펩타이드로 도입한다. 추가로, 이것은 아르기닌-부족 배지에서 우수한 생장을 허용하도록 충분히 활성적인 ArgE 단백질의 XAC-1에서의 생성을 허용한다. sup Phe는 이. 콜라이 lpp 유전자의 프로모터 서열인 Plpp로부터 유도된 합성 프로모터로부터 플라스미드 pCT-2-F(Normanly et al., 1986) 상에 구조적으로 발현된다. 이 유전자의 다운스트림에서, 전사가 이. 콜라이 오페론 rrnC (Normanly et al., 1986)의 합성 종결자인 TrrnC에 의해 중단된다. 다양한 클로닝 단계가 도 5에 도시된다.
다양한 서브클로닝을 XAC-1에서 수행한다. 따라서, 억제자 tRNA 발현 카세트의 기능성은 단지 유전자 lacZu118am의 앰버 코돈일 경우에 존재하는 이 균주의 β-갈락토시다제 활성에 의해서 검사한다. 최종 단계는 sup Phe 발현 카세트의 pXL2730으로의 도입으로 이루어진다. cer 단편 (B-l-b)으로 수득된 결과는 pXL2666보다 이 플라스미드를 선택하게 한다. 특히 최종 클로닝(KmR의 손실) 도중 허용되는 추가의 스크리닝을 위해서, 후속 클로닝의 용이함을 위한 카나마이신-내성 유전자를 보유한다.
실시예 3
마우스 섬유아세포의 형질감염에 의한 유전자 치료에서의 적용을 위한 플라스미드 벡터의 확인
1) 리포터 벡터 pXL2774의 작제
플라스미드 DNA를 생성하기 위한 시스템의 유전자 치료를 위한 확인을 시험하기 위해서, 진핵 세포에서 사용할 수 있는 리포터 유전자를 pXL2760으로 도입한다. 생발광 측정 시험이 매우 민감하고 큰 범위에 걸쳐서 일정하므로 진핵 세포의 내생 활성으로 인한 백그라운드 노이즈는 매우 낮다. luc 유전자를 높은 수준의 발현을 허용하는 인간 사이토메갈로바이러스 초기 유전자(CMV 프로모터)에 의해 조절한다. 폴리아데닐화 시그널 (폴리(A)+)을 함유하는, 바이러스 SV40으로부터 생성된 luc의 3' 말단의 비해독 영역이 존재한다. 허용되는 제한 부위의 수가 증가되도록 하는 직접 클로닝후, "CMV 프로모터-luc-폴리(A)+" 카세트를 KmR 마커 대신에 최소 벡터 ori γ-cer-sup Phe (pXL2760)으로 도입한다. 생성된 플라스미드를 pXL2774라고 지칭한다. 도 6은 다양한 클로닝 단계를 도시한다. 연결 혼합물을 XAC-1pir-116으로 전기투공에 의해 형질전환한다. 세균이 선별 마커를 표현하게 하는 배양을 풍부한 배지(SOC 배지)에서 수행하고; 따라서, 플레이팅하기 전에 세포를 두번 M9 배지로 세척함이 필수적이다. 이것은 최소 배지 상에 배양 백그라운드 노이즈를 유발하는 잔류 배지를 제거하는 것을 가능하게 한다.
전기투공된 세포를 플레이팅하기 위해 선택된 배지는 억제자 tRNA를 발현하는 세균을 선택함 및 이렇게하여 플라스미드의 존재를 가능하게 하는 M9 최소 배지이다. X-Gal의 첨가는 청색 착색에 의해서 억제자 tRNA를 가시화함을 가능하게 한다. 37℃에서 20시간 후 디쉬를 분석한다. DNA-비함유 대조군상의 콜로니의 부재는 심지어 조밀한 시딩으로도 선택이 옳다는 것을 보장한다. 제한(8)에 의해 시험된 모든 클론은 사실상 예상된 프로필에 상응하는 플라스미드를 운반한다. 이렇게하여 작제된 플라스미드, pXL2774를 대립형질간에 이온-교환(Promega kit, MegaPreps)을 수반하는 기술에 의해서 액체 M9 배지 1리터에 배양된(37℃에서 약 18시간) 클론으로부터 제조한다. 수집된 DNA의 양은 2 mg이다.
2) 포유동물 세포로 형질감염된 리포터 벡터 pXL2774의 분석
pXL 2774의 진핵세포 형질감염능 및 루시퍼라제 발현 허용능을 NIH 3T3 마우스 섬유아세포로의 형질감염에 의해 평가한다. 참고로서 선택된 벡터는 pXL2774와 동일한 루시퍼라제 발현 카세트를 운반하지만 다른 레플리콘에서가 아닌 플라스미드 pXL2622(이것은 SV40 프로모터가 CMV 프로모터에 의해서 치환된 Promega로부터의 플라스미드 pGL2이다)이다. 이것은 앰피실린-내성 유전자를 운반하는 6.2 kb colE1 유도체이다. 이 플라스미드가 대조군으로서 제공된다. 루시퍼라제 활성(RLU 또는 상대적인 발광 단위로서 표현됨)을 표 3에 도시하였다.
최상의 결과가 "리포펙턴트 전하/DNA 전하"비 6으로 수득되고 이러한 조건하에 pXL2622 및 2774은 동등한 것으로 보인다.
실시예 4
pCOR 플라스미드의 이. 콜라이내 자기불활화 벡터 성질의 확인
R6K로부터 유도된 pCOR-형 플라스미드의 비-복제성이 플라스미드 pUC4K (ori ColEI-KmR, (Vieira and Messing, 1982)) 및 pXL2730 (R6K-KmR로부터의 ori 감마, 실시예 2 참조)의 JM109 이. 콜라이(Yanisch-Perron et al., 1985)내 전기투공 실험에 의해서 확인된다. 사용된 전기투공기는 Biorad Gene Pulser이고 일렉트로컴피턴트 JM109 세포를 제조업자의 절차(Bacterial electro-transformation and pulse controller construction manual catalry number 165-2098)에 따라 제조하고 사용한다.
카나마이신(50 mg/l)으로 보충된 LB 배지상에서 전기형질전환된 세포를 플레이팅시키고 37℃에서 밤새 배양한다. 수득된 결과는 하기에서 나타내고 있다.
결과
이러한 결과는 pir 유전자가 발현하지 않는 균주 중에서 ColEI 유도체 (pUC4K) 및 R6K 유도체 (pXL2730)와의 형질전환에 대한 효능면에서 최소 log 5 정도의 차이를 보이고 있음을 나타내고 있다. XAC-1pir-116과 같은 pir+ 균주에서, R6K-유도 플라스미드의 전기형질전환 효능은 통상적으로는 플라스미드의 108 형질전환체/μg에 이르거나 이를 초과한다.
실시예 5
이. 콜라이 균주 XAC-1pir-116의 고-밀도 배양에 의한 플라스미드 DNA의 생성: 발효 공정
5.1. 균주: 이. 콜라이 XAC-1pir-116에서 최소 플라스미드, pXL2774의 생성 (실시예 1); 이 플라스미드는 하기 성분을 포함한다: ori R6K-cer-tRNAamsupPhe 및 CMV 프로모터의 통제하에 놓인 luc 리포터 유전자의 발현 카세트(실시예 3). 이러한 유형의 플라스미드의 생성을 위한 고-생산성 공정이 개발되었다.
5.2. 배양 배지 및 조건:
a) 증식 배지:
접종 배양을 위해 사용된 규정 배지의 조성물 (g/l): Na2HPO4 6, KH2PO4 3, NaCl 0.5, NH4Cl 1, NH4H2PO4 3, 글루코스 5, MgSO4.7H2O 0.24, CaCl2.2H2O 0.015, 티아민 HCl 0.010.
페드-배치 배양을 위해 사용된 복합 배지의 조성물(g/l): KH2PO48, K2HPO4 6.3, Na2HPO4 1.7, (NH4)2SO4 0.74, NH4Cl 0.12, 효모 추출물 3, 글루코스 2, MgSO4.7H2O 2.4 g/l, CaCl2.2H2O 0.015, 티아민 0.010, 염 용액 (Fe, Mn, Co, Zn, Mo, Cu, B, Al).
2.5 g/l의 NH4Cl이 효모 추출물을 대신하는 경우를 제외하고는 복합 배지와 일치하는 페드-배치 배지에서 배양을 위한 규정 배지의 조성물
b) 페드-배치 배양의 조건:
플라스미드 DNA을 증식시키고 생성하기 위한 최적 조건을 규정하기 위해 배지 1 리터를 함유하는 2-리터 발효조(Setric France)에서 연구를 수행한다. 증식이 정지기의 시작 부위에 도달된 접종 배양액의 80 ml를 발효조에 접종한다.
발효 동안, pH는 통제되고 10%(w/v) 암모니아수로 6.9 내지 7.0 사이에서 자동으로 조절된다; 온도는 37℃에서 유지된다; 통기는 75 l/h(0.2바의 압력에서(1.1 vvm))로 정해지고 용존 산소는 교반 속도상에서의 반동에 의하거나, 필요하다면, 순수 산소로 강화되어 40%의 공기 포화도에 맞게 조정된다.
모든 파라미터(pH, 온도, 교반, OD, O2 및 방출 가스중의 CO2)는 HP3852 표면을 경유하여 Hewlett-Packard 9000과 연결된 라인에서 집결되고 계산되어진다.
공급 배지의 염기 조성은 하기와 같다: 50% 탄소원, 0.7% 황산 마그네슘, 0.02% 티아민; 복합 배지의 경우에는, 5 내지 10%의 바람직한 농도를 위해 효모 추출물이 첨가된다.
800-리터 발효조를 위한 배양 조건을 조정하기 위해서, 실험실적 규모로, 두가지 연속 접종 배양으로 구성된 생성 서열을 달성한다: 교반된 원뿔 플라스크 중의 접종 I 및 2-리커 발효조 중의 종균 II(배치 배양), 이후 7-리터 발효조에서 패드-배치 생성 배양이 뒤따른다.
5.3. 결과
복합 배지, 규정 배지 중에서, 그리고 다양한 증식 속도에서 다양한 배양 조건을 연구한다. 모든 경우에 있어서, 세균 균주의 초기 배치 배양 및 탄소원의 소모 후, 예비-프로그램화된 첨가 프로필과 결합된 연동 펌프에 의해 공급 배지를 발효조로 첨가한다. 이 프로필은 용존 산소의 수준에 의하거나 일정 증식 속도에 의해 공급 속도가 조절되는 이전 실험으로부터 추론되어진다.
또한, 배지의 과산소화없이 800 l 발효조를 위한 2-리터 발효 조건을 어려움없이 추론하기 위해서, 배양의 마지막시기의 최대 산소 요구량은 2.5-3 mM/min로 정해진다. 이를 위해서, 필요하다면, 보충분의 공급 속도를 변화시킴으로서 미생물의 증식 속도를 감소시킨다.
표 4에서 보는 바와 같이, 실험실적 규모와 800-리터 발효조 규모 모두, 복합 배지 및 규정 배지 모두에서 매우 좋은 결과를 수득하고 있다; 또한, 플라스미드 DNA 증식과 생성 역학이 전체적으로 비교되고 있다(비교. 도 6 및 7).
전체적인 결과로부터 다음이 도출된다:
- 2 리터에서 800 리터까지 발효조의 규모를 변화시켜 어떠한 문제도 없이 수행될 수 있다.
- 소모된 산소는 생성된 생체량과 강하게 상관되어 있다(생성된 생체량의 1.08 g O2/g).
- 플라스미드는 선택압없이 최소 50 세대동안은 안정하다.
- 복합 배지에서는 40 g 건조 세포/리터 이상의 고 생체량이 수득될 수 있다.
- 플라스미드 DNA 생성은 100 mg 초나선 DNA/l 배지에 이른다.
- DNA 생성 및 생체량 사이에는 매우 좋은 상관 관계가 있다: 생성은 발효 기간과는 상관없이, 1 mg의 플라스미드 DNA/OD 단위, 또는 대안으로 2.7 mg의 플라스미드 DNA/g 생체량으로 산정될 수 있다.
- 규정 배지의 사용은 또한 생산성의 어떠한 손실없이 고 생체량(30 g의 건조 세포/l) 및 고 플라스미드 DNA 생성(100 mg/l)을 가능하게 해 준다.
실시예 6
시험관 및 생체내에서, pXL2774의 동물 세포로의 전달
6.1. 시험관내에서 pXL2774 의 동물 세포로의 전달
시험관내, 인간 기원 및 쥐 기원의 두가지 세포상에서 다양한 세포주로 형질감염시키기 위한 최소 플라스미드 pXL2774의 수용능력을 시험한다. pXL2784 플라스미드는 대조를 위해 사용된다. 이는 pXL2774와 동일한 진핵세포 발현 카세트(CMV 프로모터-루시퍼라제-polyA)를 함유하지만, 이것은 이. 콜라이에서 카나마이신 내성을 부여하는 유전자를 포함하는 6.4 kb의 ColE1 유도체이다.
시험된 세포는 하기와 같다:
형질감염 조건은 하기와 같다:
D-1: 10% 태 송아지 혈청(FCS)으로 보충된 DMEM 배지(Dulbecco's 변형 Eagle 배지)에서 2 ㎠ 웰 (24-웰 플레이트) 당 100,000 세포의 밀도에서 세포의 접종.
D-3: 다음을 함유한 10 μl의 형질감염 용액에 의한, 세포의 형질감염: 10%의 FCS로 보충되거나 되지않은 250μl의 배양 배지에서, 0.5 μg의 DNA, 150 mM NaCl, 5% 글루코스 및 3 nmol의 RPR120 535 리포펙턴트/μg의 DNA. 2 시간 동안 배양 후, 10%의 FCS로 보충된 500 μl의 DMEM 배지로 이 배지를 치환한다.
D-4: 배양 배지의 재생
D-5: PBS로 세포를 세척한 후, 프로메가 용해 완충액(프로메가 세포 용해 완충액 E153 A) 100 μl로 세포를 용해시킨다. 통합 후 10 초가 지남과 동시에, 용해액 10 μl상의 Lumat LB 9501 광도계에서 루시퍼라제 활성 분석을 수행한다. 사용된 반응물은 프로메가(프로메가 루시퍼라제 분석 기질)로부터 기인한다. 하기 표에서 대조된 결과물은 10μl의 용해액(4 웰상에서 측정된 값의 평균)을 위해 RLU(상대적 광 단위)에서 발현된다. 변이 계수(CV)도 또한 제공되고 있다.
혈청 부재하에 형질감염에 대한 결과를 하기에서 나타내고 있다.
혈청(10%) 존재하에 형질감염의 결과를 하기에서 나타내고 있다:
이러한 결과는 시험관내, 쥐 및 인간 기원 모두의 다양한 세포 유형에 효과적으로 형질감염시키기 위한 pXL2774의 허용 능력을 나타내고 있다. luc 리포터 유전자의 발현은 형질감염의 효능이 루시퍼라제의 동일한 발현 카세트를 수반하는 ColE1으로부터 유도된 "표준" 플라스미드의 것과 적어도 비등비등하다.
6.2. pXL2774 의 생체내 , 동물(쥐)로의 전달
a) 모델 1: 쥐 두개 경골 근육에서의 네이키드 DNA
"5% 글루코스, 150 mM NaCl"에서 용해된 네이키드 플라스미드 DNA를 OF1 쥐의 두개 경골 근육으로 주입시킨다. 주입 후 7일만에 근육을 제거하고, 절단하며, 750μl의 용해 완충액(프로메가 세포 용해 완충액 E153A)에서 균질화시킨 다음 10분간 20,000 x g에서 원심분리시킨다.
50μl의 시약(프로메가 루시퍼라제 분석 기질)을 첨가한 후 10μl의 상등액상에서 루시퍼라제 활성 분석을 수행한다. 통합 후 10초가 경과됨과 동시에 Lumat LB9501 광도계(Berthold)상에서 판독을 행한다.
결과는 하기 표에서 나타내고 있다.
이러한 결과는 pXL2774와 같은 조건성 복제 플라스미드가 실제로는 생체내 쥐 근육 세포를 형질감염시킬 수 있고 루시퍼라제 유전자의 동일한 발현 카세트를 수반하는 ColE1으로부터 유도된 "표준" 플라스미드의 것과 견줄만하거나 좀더 우수한 효능을 가지고 위와같은 것을 행할 수도 있다.
b) 모델 2: 3T3 HER2 종양 모델
모델은 하기와 같다:
- 스위스/누드 성숙한 암놈형 쥐
- 피하에 의해 측면으로 107 3T3 HER2 세포의 주입 후 유도된 실험용 종양
- 세포의 주입 7일 후 주입된 형질감염 혼합물
- 주입된 용액: 완충액에 최초로 용해된 DNA. 모든 생성물의 첨가 후, 혼합물은 물 또는 5 mM HEPES 완충액에서 DNA외에도, NaCl (150 mM) 및 5%D-글루코스를 함유하고 있다.
- 주입 후 2일이 경과한 후, 종양을 제거하고, 중량을 과한 다음 절단하고 750 μl의 용해 완충액(프로메가 세포 용해 완충액 E153 A)에서 균질화시킨다. 원심분리(10분간 20,000 x g)시킨 후, 10 μl의 상등액을 제거하고 루시퍼라제 활성을 평가한다. 이러한 활성은 통합 후 10초가 경과됨과 동시에 Lumat LB 9501 광도계 (Berthold)에서 50μl의 시약과 혼합시킨 후 수득된 총 광 방출량을 측정함으로서 측정된다.
결과적인 활성도는 전 종양 용해 상등액에서 평가된 RLU(상대적 광 단위)로 표현된다.
결과:
이러한 결과는 pXL2774와 같은 조건성 복제 플라스미드가 실제로는 생체내에서 쥐 종양 세포를 형질감염시킬 수 있고 루시퍼라제 유전자의 동일한 발현 카세트를 수반하는 ColE1으로부터 유도된 "표준" 플라스미드의 것과 적어도 견줄만한 효능을 가지고 그렇게 할 수 있다.
이러한 다양한 실험은 조건성 복제 플라스미드, 좀더 특히 pXL2774가 실제로 유전자 요법에서 용도상 필수적인 동물 세포 형질감염 특성을 가지고 있음을 입증 가능하도록 해준다. 좀더 상세하게는, 하기에서 나타내고 있다:
1) 시험관내, 인간 또는 쥐 기원의 다양한 세포형에서 효과적으로 형질감염시키기 위한 pXL2774의 수용능력;
2) 생체내, 쥐 근육에서 형질감염시키기 위한 pXL2774의 수용능력;
3) 생체내, 쥐로 이식된 종양 세포를 형질감염시키기 위한 pXL2774의 수용능력.
전기형질전환, 발효 및 형질감염 실험은 조건성 복제 플라스미드가 유전자 요법에서 사용될 수 있는 벡터로서 타당함을 하기의 i) ii) 및 iii)을 근거로 들어 입증 가능하게 해 주고 있다.
i) 조건성 복제 플라스미드는 pir 유전자(복제의 조건성 기원)를 발현하지 않는 이. 콜라이 균주에서 검출될 정도로 복제하지는 않는다.
ii) 조건성 복제 플라스미드는 전체적으로 규정될 수 있고 항생제를 함유하지 않은 배지에서, 공업적 생산에 견줄만한 규모로 생성도될 수 있다.
iii) 이 플라스미드는 시험관내 및 특히 생체내, 포유동물 세포에서 형질감염할 수 있다.
실시예 7
시험관내에서 재조합 단백질의 생성
7.1. 발현 벡터의 작제
이러한 접근법의 가능성을 보여주기 위해, 본 발명자는 앞서 기술된 기준(실시예 2 및 3)에 따라 발현 벡터를 작제한다.
이 벡터, pXL3056은 하기의 1) 및 2)를 함유한다:
1) 복제의 조건성 기원(ori gamma), ColE1의 cer 단편 및 세균에서 선별가능하게 해주는 유전자(sup)를 포함하는 세균 부분
2) 박테리오파지 T7의 유전자 10의 프로모터, lacO 오퍼레이터, aFGF 154(154개의 아미노산을 함유한 형태인, 산성 섬유아세포 증식 인자)(Jaye et al., 1986)를 암호화하는 유전자, 박테리오파지 T7의 TF 터미네이터를 포함하고, Studier(Studier et al., 1990)에 의해 기술된 시스템을 기본으로 한, 발현 카세트. 이 발현 카세트는 출원 WO 96/08572에서 기술된 pXL2434상에서의 것과 일치한다.
pXL3056의 작제는 도 8에서 나타내고 있다. aFGF 발현 카세트를 함유한 pXL2434의 EcoRI-BglII 단편(1.1kb)은 pXL3056을 형성하기 위해 BglII 및 EcoRI 자리에서 pXL2979 조건성 복제 벡터(정제된 단편 1.1 kb) 중으로 클로닝된다.
pXL2979는 3 단편의 결합으로 생긴 결과물이다: i) pXL2730의 AccI-XbaI 단편(ori gamma 및 cer을 제공하는 0.8 kb), ii) pXL2755의 NarI-SalI 단편(sup phe 유전자를 제공하는 0.18 kb), iii) pXL2660의 SalI-SpeI 단편(카나마이신-내성 유전자를 제공하는 1.5 kb).
pXL2660은 PstI로 선형화된 pMTL22(Chamber et al., 1988)에서 pUC4K(Vieira and Messing, 1982)의 1.2 kb PstI 단편의 클로닝으로인해 생긴 결과물이다.
7.2. 발현 균주의 생성
형질전환에 의해 플라스미드 pXL3056을 XAC-1pir-116으로 도입시킨다. 그리고 나서 생성된 균주를 30℃에서, 플라스미드 PT7pol123(Merten et al., 1995)에 의해 형질전환시킨다. T7 프로모터의 통제하에 관심있는 유전자를 발현시키기 위해서, 세균은 자신의 게놈에서, 플라스미드 또는 박테리오파지상에, 박테리오파지 T7의 RNA 중합효소의 발현을 허락하는 카세트를 함유해야한다. 기술된 실시예에서, 본 발명자는 pXL3056과 같은 R6K 유도체와 견줄 수 있는 플라스미드 PT7po123을 사용하였는데, 이는 박테리오파지 T7 RNA 중합효소의 온도-유도성 발현을 허용한다. 그러나, 이것은 또한 온도에 의해서라기 보다는 IPTG에 의해 한가지 플라스미드만을 보유하거나 T7 RNA 중합효소의 생성을 유도하기 위해 람다 DE3(Studier et al., 1990)로 XAC-1pir-116 균주를 용원화시키는데 직면할 수 있다.
7.3. aFGF의 발현
0.6-1의 600 nm에서 광학 밀도를 초과하여, 0.2%의 카스아미노산(DIFCO) 및 카나마이신(25 μg/ml)으로 보충된 M9 최소 배지 중에서, XAC-1pir-116 균주(pXL3056+PT7po123)를 30℃에서 배양한다. 그리고 나서 배지의 반은 42℃(T7 RNA 중합효소의 유도)로 두고, 그 반면 나머지 반은 30℃(음성 조절)로 유지시킨다. T7 RNA 중합효소 부재하에 aFGF의 발현을 위해 대조를 구성하는 XAC-1pir-116(pXL3056+pUC4K) 균주로 동일한 실험을 수행한다.
수득된 결과는 도 9에서 나타내고 있다. 이 결과는 aFGF의 생성이 BL21(DE3)(pXL2434)(WO 96/08572)로 관찰된 것과 견줄만하거나 이보다 우수함을 보여주고 있는데, 이는 시험관내, 특히 E.coli에서 재조합 단백질의 발현을 위한 조건성 복제 플라스미드의 포텐셜을 명백히 보여주고 있다.
실시예 8
야생형 또는 혼성 p53 단백질을 발현시키는 pCOR 벡터의 작제.
본 실시예는 p53 단백질을 암호화하는 핵산을 함유한 본 발명에 따라 조건성 복제 백터의 작제를 기술하고 있다. 이 벡터는 특히, 종양 세포와 같은 결손(돌연변이, 결실) 세포에서 p53-형 활성을 회복시키기 위해 사용될 수 있다.
진핵세포 발현 카세트는 하기의 성분을 함유하고 있다:
1) CMV "즉시" 프로모터(위치 -522 에서 +72)에 이어 유형 I 허프스 심플렉스 바이러스의 타이미딘 카이네이즈 유전자의 선도 서열(위치 유전자의 -60 에서 +1, McKnight, S. +L.의 논문 중의 서열 참조 (1980) Nucleic Acids Res. 8:5949-5964);
2) 출원 PCT/FR 96/01111(V325K 변이체 = V325 + 코작 서열 + ATG) 야생형 p53 단백질 또는 p53 변이체를 암호화하는 핵산;
3) SV40의 폴리A 폴리아데닐화 서열.
이러한 성분들은 BssHII 및 SpeI 자리 사이에서 pCOR 벡터 pXL2988상에서 단편 AscI-XbaI의 형태로 놓여있다. pXL2988은 부가적인 성분, 복제의 감마 기원을 따라 놓여진, 17배의 트리누클레오티드 GAA로 구성된 DNA 삼중 나선을 형성할 수 있는 서열의 존재를 제외하고는 pXL2979(실시예 7.1)와 일치한다.
생성된 플라스미드는 pXL3029 및 3030(도 10)으로 명명된다.
이러한 작제의 기능성은 p53 또는 p53superWT의 전사-활성자 활성을 측정함으로서 시험관내 배양중의 p53-SAOS2상에서 입증된다.
서열목록
(1)일반정보
(i)출원인:
(A) 성명: 롱프랑 로라 소시에테 아노님
(B) 거리: 아브뉴 레이몽 아롱 20
(C) 시: 앙토니
(E) 국명: 프랑스
(F) 우편번호: 92165
(G) 전화: (1) 40.91.69.22
(H) 팩시밀리: (1) 40.91.72.96
(ii)발명의 명칭: 조건성 복제기원을 갖는 환상 DNA, 이의 제조방법 및 유전자 요법에 있어서 이의 용도
(iii)서열수: 6
(v)컴퓨터 판독 형태:
(A)매체형: 테이프
(B)컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C)운영 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D)소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 #1.30(EPO)
(2) 서열번호 1에 대한 정보:
(i)서열특징:
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(B)유형: 뉴클레오타이드
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(2) 서열번호 2에 대한 정보:
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(2) 서열번호 3에 대한 정보:
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(2) 서열번호 4에 대한 정보:
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(ii)분자형: cDNA
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(2) 서열번호 5에 대한 정보:
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(ii)분자형: cDNA
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(2) 서열번호 6에 대한 정보:
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(D)토폴로지: 선형
(ii)분자형: cDNA
(xi)서열배열: 서열번호 6:
본 발명의 요지는 유전자 요법에 사용될 수 있거나 시험관 내 재조합 단백질 생산용으로 사용될 수 있고 이들 비-바이러스 벡터의 특정 기능을 보충할 수 있는 세포에서만 복제하는 DNA 분자를 특이적으로 생산하는 것이다.
본 발명은 또한, 이러한 DNA 분자 제조에 특히 효과적인 방법에 관한 것이다.
청구되는 DNA 분자는 (1) 치료 유잔자의 비통제성 과발현을 유도할 수 있는 복제 및 전이, (2) 내성 유전자의 전이 및 발현과 같은, 플라스미드의 전이와 결부된 위험요소를 제거하는 장점이 있다. 본 발명에 따른 DNA 분자에 들어있는 유전자정보는 치료 유전자(들) 및 이(들)의 발현 조절용 시그널, 이러한 플라스미드의 숙주세포 스펙트럼을 현격히 제한하는 기능 조건성 복제기원, 바람직하게는 항생제 내성을 부여하는 유전자와는 상이한 축소된 크기의 선별마커 및, 경우에 따라 플라스미드 다량체의 분해를 허용하는 DNA 분자를 효과적으로 포함한다. 미생물에 전달되고 안정하게 유지되는 이들 분자 (및 이들이 함유하고 있는 유전정보)의 확률은 극히 제한된다.
최종적으로, 본 발명에 따른 벡터는 또한 환상 구조, 축소된 크기 및 슈퍼코일형태로 인하여 미니플라스미드로도 언급되며, 다음과 같은 부수적인 장점을 지니고 있다: 통상적으로 사용되는 ColE1-유도된 플라스미드에 비해 감소된 크기를 감안하면, 본 발명에 따른 DNA 분자는 잠정적으로는 더 우수한 생체내 생물학적이용성을 지닌다. 특히, 이들은 향상된 세포 침투 및 분포능을 지닌다. 따라서, 조직에서의 확산계수가 분자량에 반비례함이 숙지된다[참조문헌: Jain, 1987]. 이와 유사하게, 고분자량 분자는 원형질막을 가로지는 투과성이 불충분하다. 또한, 플라스미드가 발현에 필수적인 핵 중으로 통과하기 위해서는, 고분자량은 또한 불리하며, 크기를 부여하는 핵공은 핵 중으로의 확산을 제한한다[참조문헌: Landford et al., 1986]. 본 발명에 따른 DNA 분자의 비-치료부분(특히 복제기원 및 선별 유전자)의 크기 감소는 또한 DNA 분자의 크기 감소를 가능하게 한다. 세균 내 플라스미드(1.1 kb)의 복제 및 선별을 허용하는 부분은 3배까지, 예를 들면, 복제 기원 및 내성 마커 벡터 부분의 경우 3kb로 감소된다. 분자량(i) 및 음전하(ii)의 이러한 감소는 향상된 조직, 세포 및 핵 생체이용율 및 확산을 본 발명의 분자에 부여한다.
더욱 정확하게 말해서, 본 발명은 유전자 요법에 유용한 환상 DNA 분자에 관한 것이며, 이러한 분자는 적어도 하나의 해당 핵산서열을 포함하며, 복제를 허용하는 영역은 숙주세포에서의 기능발휘에 숙주세포에 이종인 적어도 하나의 특정 단백질의 존재를 요하는 복제기원을 포함함을 특징으로 한다.
이러한 DNA 분자는 일본쇄 또는 이본쇄 형태이고 유리하게는 슈퍼코일 형태를 보유한다.
본 발명의 목적상, 사용되는 숙주세포는 다양한 기원을 띨 수 있다. 이들은 진핵세포 또는 원핵세포일 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에 따라, 이들은 원핵세포이다.
세균 플라스미드의 복제는 숙주세포에 의하여 암호화되는, RNA 폴리머라제, Rnase, DNA 폴리머라제 등과 같은 유형의 적어도 하나의 단백질의 존재를 요한다. 앞서 이미 설명한 이유로 해서, 이러한 유형의 복제로는 처리 유기체내 전이의 여타 가능한 위험을 완전히 극복할 수가 없다. 유리하게는, 본 발명에 따른 DNA 분자의 복제기원의 기능발휘에는 숙주세포에 이종인 특정 단백질의 존재를 요한다. 이러한 특징의 중요성은 개시자 단백질을 발현하는 특정 균주에 대한 청구 플라스미드의 숙주 스펙트럼을 감소시키는 것이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서 개발된 DNA 분자는 유리하게도 소위 말하는 조건성인 복제기원을 보유한다.
본 발명에 따라 사용된 조건성 복제기원은 다음과 같은 특징을 공유하는 플라스미드 또는 박테리오파지로부터 기원할 수 있다: 이들은 복제 반복서열, 즉 이테론을 함유하고, 이들은 자체에 특이적인 적어도 하나의 복제-개시 단백질(Rep)을 암호화한다. 예를 들면, 하기 플라스미드 또는 박테리오파지의 조건성 복제 시스템을 들 수 있다:
본 발명의 바람직한 양태에 따라, 청구된 DNA 분자에 사용된 복제기원은 R6K로 언급되는 천연 이.콜라이로부터 유도된다.
R6K의 복제기능은 3종의 복제기원 알파, 베타 및 감마(감마와 베타가 복제의 90% 제공) 및 π 복제-개시자 단백질 및 단백질 Bis를 암호화하는 오페론을 포함하는 5.5 kbp DNA 단편(도 1)에 함께 그룹으로 묶었다. 이러한 플라스미드를 자신의 특징적인 카피수(게놈 당 15 카피)로 유지하는데 요하는 최소량의 유전정보가 두 요소안에 들어 있다: ori 감마 및 유전자 π(이의 산물은 π 개시자 단백질이다).
Ori 감마는 두 기능성 부분으로 세분된다: 코어 부분과 활성자 요소(도 1). 복제에 필수적인 코어 부분은 서열번호 1로 표현된 π 단백질이 결합되는 이테론(22 bp의 7 번의 직접 반복물), 및 숙주 단백질(IHF, DnaA)의 표적물인 플랭킹 단편을 함유한다.
본 발명의 바람직한 양식에 따라, 청구된 벡터의 복제기원은 플라스미드 R6K의 복제의 감마 기원으로 완전히 또는 부분적으로, 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 완전히 또는 부분적으로 또는 이의 유도체 중 하나로 이루어진다.
본 발명의 목적상, 유도체라는 용어는 유전적 및/또는 화학적 성질의 하나 이상의 변형에 의하여 수득된 유전암호의 축퇴성을 고려한 서열과 상이한 여타 서열, 및 이러한 서열 또는 이들의 단편과 하이브리드화하고 산물이 복제-개시자 단백질 π에 대하여 표시한 활성을 보유하는 여타 서열을 나타낸다. 유전적 및/또는 화학적 성질의 변형이란 용어는 여타 돌연변이, 치환, 결실, 부가 및/또는 하나 이상의 잔기의 변형을 언급하는 것으로 이해될 수 있다. 유도체란 용어 또한 기타 세포원, 특히 사람 기원의 세포로부터, 또는 기타 유기체로부터 유도되고 동형의 활성을 보유하는, 해당 서열과 상동성인 서열도 포함한다. 이러한 상동서열은 하이브리드화 실험에 의하여 수득될 수 있다. 하이브리드화는 엄격한 통상조건[참조문헌: Maniatis et al., cf. General techniques of molecular biology], 또는 바람직하게는 매우 엄격한 조건하에서, 천연서열 또는 이의 단편을 탐침으로서 사용하여, 핵산 라이브러리를 출발물질로 하여 수행될 수 있다.
매우 한정된 크기의 장점을 지닌 상기 복제기원은 유전자 pir(서열번호 2)에 의해 생성된 특정 개시자 단백질인 단백질 Pi의 존재하에서만 기능을 띤다. 이러한 단백질이 트랜스로 작용할 수 있으므로, pir 유전자로부터 ori 감마를 물리적으로 해리시킬 수 있으며, 이는 이들 플라스미드에 대한 특정 숙주로서 선택되는 세포의 게놈 중으로 도입될 수 있다. π에서의 돌연변이는 자신의 억제기능을 변경시킬 수 있으며[Inuzuka and Wada, 1985) R6K 유도체의 카피수를 초기 카피수의 10 배 이상까지 증가시킬 수 있다. 이러한 치환은 40 종의 아미노산 영역 내 모두에서 일어나며, 따라서 플라스미드 카피수의 π에 의한 조절에 관여하는 것으로 보인다(도 2).
본 발명의 유리한 양태에 따라, 숙주세포에서 발현된 π 단백질은 상기의 서열번호 2로 표현된 유전자 또는 이의 유도체 중 하나, 특히 pir 유전자와 비교시 돌연변이를 포함하는 유전자 pir 116의 발현으로 생겨난다. 이러한 돌연변이는 프롤린을 루이신으로 치환한 것에 해당한다. 이러한 맥락에서, R6K 유도체의 카피수는 게놈 당 약 250 카피이다.
전술한 조건성 복제기원외에도, 청구된 DNA 분자는 선택숙주내 DNA 분자의 선별 보장을 가능하게 해주는 하나(이상의) 유전자(들)을 포함하는 영역을 함유한다.
이는 카나마이신, 앰피실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 스펙티노마이신, 리비도마이신 등과 같은 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자형의 통상적인 마커일 수 있다.
그러나, 본 발명의 바람직한 양태에 따라, 이러한 영역은 항생제 내성을 부여하는 유전자와는 상이하다. 따라서, 이는 규정된 배양조건하에서 산물이 숙주의 생존능에 필수적인 유전자일 수 있다. 이러한 유전자로는 예를 들면:
- 천연 또는 합성 기원의 억제자 tRNA 암호화 유전자. 이는 더욱 바람직하게는 앰버 코돈 tRNA(TAG)이다.
-산물이 특정 배양조건하에서 세포 대사에 필수인 유전자, 즉 대사산물(아미노산, 비타민 등)의 생합성에 수반된 유전자, 또는 배양배지(특정 질소원 또는 탄소원)에 존재하는 물질의 동화를 가능케 하는 이화작용 유전자 등.
본 발명의 바람직한 양식에 따라, 이러한 영역은 특이적 코돈에 대한 억제자 tRNA를 암호화하는 유전자의 발현 카세트를 함유한다. 이러한 후자는 특히 페닐알라닌, 시스테인, 프롤린, 알라닌 및 히스티딘 염기를 암호화하는 것들 중에서 선택될 수 있다. 더욱 특별하게는 앰버 코돈(TAG)에 대한 억제자 tRNA이다.
이러한 특정의 경우에, 본 발명의 요지인 DNA 분자를 숙주세포에서 선별하는데 사용되는 시스템은 두 요소를 포함한다: 1) DNA 상, (sup) 유전자로 알려져 있는 선별마커를 구성하는 앰버 코돈(TAG)에 대한 억제자 tRNA를 암호화하는 유전자 및 2) 특정 배양조건하에서 필수적인 유전자 중 하나가 앰버 TAG 코돈을 함유하는 특정 숙주. 이러한 세포는 TAG 코돈을 함유하는 유전자 산물이 필수적인 배양조건하에서, sup의 발현을 허용하는 플라스미드가 세포에 존재할 경우에만 생장할 수 있다. 따라서, 배양조건은 DNA 분자 선택압을 구성한다. 사용된 sup 유전자는 천연기원(Glass et al., 1982)일 수 있거나 합성작제[참조문헌: Normanly et al., 1986, Kleina et al., 1990]로부터 기원할 수 있다.
이러한 시스템은 앰버 돌연변이를 함유하는 유전자에 따라 크나큰 융통성을 제공하므로, 각종 선별배지의 결정이 가능하다. 예를 들면, 락토코커스 락티스 세균의 경우, 앰버 코돈은 퓨린 생합성 유전자에 위치되어 있다. 이렇게 하여 세균이 우유에서 증식할 때 억제자 tRNA를 암호화하는 유전자를 운반하는 플라스미드의 선별이 허용된다. 이러한 마커는 매우 크기가 작고 파지나 트랜스포손 기원의 어떠한 "이종" 서열도 함유하지 않는 장점이 있다.
본 발명의 특정 양태에 따라, DNA 분자는 또한 플라스미드 다량체의 분해를 허용하는 부위-특이성 리콤비나제에 대한 표적물인 DNA 단편도 포함한다.
따라서, 환상이고 복제기원이 예를 들면, ori 감마인 DNA 분자상으로 도입된 이러한 단편은 이러한 플라스미드의 다량체의 분해를 허용한다. 이러한 다량체는 특히, DNA 분자가 pir-116과 같은 pir의 돌연변이된 대립유전자를 운반하는 균주에서 제조될 때 관찰되며, 이렇게 하여 R6K 유도체의 카피수를 증가시키는 것이 가능해진다.
이러한 재조합 현상은 서열 간의 부위-특이성 재조합을 수반하는 각종 시스템을 사용하여 성취될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 부위-특이성 재조합은 일반적으로 재조합으로 언급되는 특정 단백질의 존재하에서 상호 재조합시킬 수 있는 특정 분자내 재조합 서열에 의하여 수득된다. 이러한 특정의 경우에, 이들은 리콤비나제 XerC 및 XerD이다. 이러한 이유로 해서, 본 발명에 따른 DNA 분자는 일반적으로 이러한 부위-특이성 재조합을 허용하는 서열도 포함한다. 본 발명에 따른 유전자 작제물에 존재하는 특이적 재조합 시스템(리콤비나제 및 특이적 인식부위)는 상이한 기원일 수 있다. 특히, 사용된 특이적 서열 및 리콤비나제는 상이한 구조 부류, 및 특히 트랜스포손 Tn3 레졸바제 계통 또는 박테리오파지 λ 인테그라제 계열에 속할 수도 있다. 트랜스포손 Tn3 계통에 속하는 리콤비나제 중에서, 특히 트랜스포손 Tn3 또는 트랜스포손 Tn21 및 Tn522(Stark et al., 1992)의 레졸바제; 박테리오파지 mu의 Gin 인버타제 또는 플라스미드 레졸바제, 예를 들면, RP4의 par 단편의 것[참조문헌: Abert et al., Mol. Microbiol. 12 (1994) 131]을 들 수 있다. 박테리오파지 λ 인테그라제 계통에 속하는 리콤비나제로는, 특히 파지 λ의 인테그라제[참조문헌: Landy et al., Science 197 (1977) 1147], P22 및 ρ80[참조문헌: Leong et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468], 헤모필루스 인플루엔재의 HP1[참조문헌: Hauser et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 6859], 파지 P1의 Cre 인테그라제, 플라스미드 pSAM2의 인테그라제(EP 350 341) 또는 2μ 플라스미드의 FLP 리콤비나제 및 이.콜라이로부터의 XerC 및 XerD 리콤비나제를 들 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 요지를 구성하는 DNA 분자는 천연 이.콜라이 플라스미드 ColE1으로부터의 단편 cer을 함유한다. 사용되는 cer 단편은 플라스미드 다량체의 분해를 시스로 일으키는 것으로 보이는 ColE1으로부터의 382 bp HpaII 단편이다[참조문헌: Summers et al., 1984; Leung et al., 1985]. HpaII 단편에 들어있고 동일 특성을 지닌 소형 크기(280 bp) 또는 소형 단편(약 220 bp)의 HpaII-TaqI 단편을 사용하는 것이 또한 가능하다[참조문헌: Summers and Sherratt 1988]. 이러한 분해는 특이적 분자내 재조합에 의하여 일어나며, 이.콜라이의 게놈에 의해 암호화된 4종의 단백질: ArgR, PepA, XerC 및 XerD를 수반한다[참조문헌: Stirling et al., 1988, 1989; Colloms et al., 1990, Blakely et al., 1993].
이와 관련하여, 전술한 바와 같은 ColE1의 cer 단편 또는 이의 유도체 중 하나의 전부 또는 일부를 사용하는 것이 특히 유리하다.
실행 별법에 따라, 본 발명의 DNA 분자는 또한 리간드와 특이적으로 상호작용할 수 있는 서열도 포함한다. 바람직하게는, 이는 하이브리드화에 의하여 특이적 올리고뉴클레오타이드와 3중 나선을 형성할 수 있는 서열이다. 따라서 이러한 서열은 지지체상에 부동화된 상보성 올리고뉴클레오타이드와의 선택적 하이브리드화에 의하여 본 발명의 분자를 정제하는 것이 가능하게 한다(WO 96/18744 참조). 서열은 본 발명의 DNA 분자내 어떠한 부위에도 위치할 수 있으며, 단 복제 기원 및 해당 유전자의 기능성에 영향을 미치지 않아야 한다.
본 발명의 대표적인 DNA 분자로서, 플라스미드 pXL2774및 이의 유도체가 가장 특별하게 청구될 수 있다. 본 발명의 목적상, 유도체라는 용어는 pXL2774로부터 유도되고 루시퍼라제 유전자를 제외한 하나 이상의 유전자를 함유하는 여타 작제물을 말한다. 치료 유전자의 발현 카세트 및 리간드와 특이적으로 상호작용할 수 있는 서열을 함유하는 플라스미드 pXL3029 및 3030도 언급될 수 있다.
본 발명은 또한 이들 치료 DNA 분자의 생산에 특히 효과적인, 특이적 숙주 세포의 작제방법의 개발에 관한 것이다.
본 발명의 다른 요지는 전술한 바와 같은 적어도 하나의 DNA 분자 및 동일 반응계에서 발현되거나 되지 않을 수도 있고 특이적이고 숙주세포에 이종인 DNA 분자의 복제기원의 기능성을 조건화하는 단백질을 함유하는 숙주 세포를 DNA 분자에 의하여 형질전환된 숙주세포의 선별을 허용하는 조건하에서 배양함을 특징으로 하는, 환상 DNA 분자의 생산방법에 관한 것이다.
더욱 바람직하게는, DNA 분자의 복제기원 기능성을 조건화하는 단백질은 상응하는 유전자로부터 동일반응계에서 발현된다. 복제-개시 단백질을 암호화하는 유전자는 트랜스포손, 박테리오파지 또는 여타 벡터를 사용하여, 재조합에 의하여 숙주세포 게놈 중으로 도입될 수 있거나 사용된 조건성 복제기원과 상용성인 부속 레플리콘에 의하여 전달될 수 있다. 단백질을 발현하는 유전자가 부속 레플리콘상에 위치한 특별한 경우에, 후자는 또한 세포내 기능성 전사를 위한 프로모터 영역, 및 3′말단에 위치하고 전사 종결 시그널을 규정하는 영역도 함유한다. 프로모터 영역과 관련하여, 이는 후자가 세포에서 기능을 발휘할 수 있는 경우 고려되는 유전자의 발현에 자연적으로 관여하는 프로모터 영역일 수 있다. 이는 또한 상이한 기원(다른 단백질 발현에 관여) 또는 심지어 합성 기원일 수도 있다. 특히, 진핵세포 또는 박테리오파지 유전자에 대한 프로모터 서열일 경우일 수도 있다. 예를 들면, 세포게놈으로부터 수득된 프로모터 서열의 경우일 수도 있다.
복제-개시 단백질 암호화 유전자로서, 야생형 유전자 또는 DNA 분자에 사용된 복제기원의 기능성을 조건화하는 개시자 단백질에 특이성을 보이는 플라스미드(또는 유도체)의 증가된 카피수 수득을 가능하게 하는 돌연변이된 대립유전자를 사용할 수 있다.
이러한 돌연변이체는 특히 플라스미드 r6k에 대하여 기술되어 왔다[참조문헌: Inuzuka and Wada, 1985; Greener et al., (1980)], Rts1 [참조문헌:Terawaki and Itoh, 1985, Terawaki et al., 1990; Zeng et al., 1990)], F[참조문헌:Seelke et al., 1982; Helsberg et al., 1985; Kawasaki et al., 1991], RK2[참조문헌:Durland et al., 1990; Haugan et al., 1992, 1995)], pSC101[참조문헌:Xia et al., 1991; Goebel et al., 1991; Fang et al., 1993].
사용된 DNA 분자가 플라스미드 R6K로부터 유도된 복제기원을 보유하는 특별한 경우에, 개시자 단백질은 이러한 동일 플라스미드의 π 단백질의 유도체이다. 초기 카피수를 적절하게 증가시킬 수 있는 이러한 단백질의 돌연변이형을 발현시키는 것이 특히 유리하다. 이와 같이 수행하기 위해서는, 숙주세포 중으로 이입된 유전자가 바람직하게는 서열번호 2로 나타낸 서열 또는 이의 유도체의 전부 또는 일부 및 더욱 바람직하게는 pir 유전자로 표현된다. 연관된 돌연변이는 루이신에 의한 프롤린의 치환에 상응한다. 본 발명의 특정 양태에 따라, 이러한 pir 116 유전자는 숙주세포 게놈 중으로 직접 이입된다.
이와 달리, 선택된 배양조건하에서 필수적인 특정 숙주 세포의 유전자 중 하나는 DNA 분자내 선택된 억제자 tRNA에 의하여 인지될 수 있는 특정 코돈을 함유한다. 본 발명의 바람직한 양식에 따라 이는 앰버 TAG 코돈이다. 이러한 특별한 경우에, 세포는 TAG 코돈을 함유하는 유전자의 산물이 필수적인 배양조건하에서, 오직 sup의 발현을 허용하는 플라스미드가 숙주세포에 존재할 경우에만 생장할 수 있다. 배양조건은 따라서 DNA 분자의 선택압을 구성한다.
바람직하게는, 앰버 코돈을 함유하는 유전자는 아르기닌 아미노산의 생합성에 관여하는 유전자이다. 이러한 유전자 argE는 N-아세틸오르니티나제를 암호화하고(Meinnel et al., 1992), 이 경우에 점 돌연변이 Gln-53(CAG) → TAG에 상응하는 TAG 코돈을 함유하고 있으며; 이어서 최소 M9 배지[참조문헌: Maniatis et al., 1989]에서 배양함으로써 sup 유전자를 운반하는 플라스미드의 선택압이 제공된다. 그러나, 이는 또한 예를 들면, 비타민 또는 핵산 염기의 생합성 유전자 또는 특정 질소원 또는 탄소원 사용을 허용하는 유전자 또는 기능성 선택된 배양조건하에서 세포 생존능에 필수인 여타 유전자일 수 있다.
숙주세포는 바람직하게는 이.콜라이 균주에서 선택되고 더욱 바람직하게는 균주 이. 콜라이 XAC-1로 대표된다.
본 발명의 특정 양태에 따라, 청구된 방법에 사용된 숙주세포는 자신의 게놈에 pir 116 유전자를 함유하고 플라스미드 pXL2774 또는 이의 유도체 중 하나로 형질전환된 이. 콜라이 균주 XAC-1 세포이다.
본 발명의 유리한 별법에 따라, 청구방법에 사용된 숙주세포는 endA1 유전자 또는 상동성 유전자가 불활성화되는 진핵세포이다. endA 유전자는 이. 콜라이의 엔도뉴클레아제 I을 암호화한다. 이러한 외질 효소는 이본쇄 DNA를 절단하는 비특이적 활성을 갖고있다[참조문헌: Lehman, I. R., G. G. Roussons and E. A. Pratt (1962) J. Biol. Chem. 237; 819-828; Wright M. (1971) J. Bacteriol. 107: 87-94). 이.콜라이(야생형 또는 endA)의 각종 균주에 대하여 수행된 연구는 이들 세균 균주의 추출물에서 배양한 플라스미드 DNA의 분해가 endA+ 균주에는 존재하지만 endA+ 돌연변이체에는 존재하지 않았음을 보여준다. [참조문헌: Wnendt S. (1994) BioTechniques 17: 270-272]. endA+ 균주 또는 endA 돌연변이체로부터 분리된 플라스미드 DNA의 품질에 관하여 자체 정제 시스템을 사용하는 Promega사에 의하여 연구되었다[참조문헌: Shoenfeld, T., J. Mendez, D. Storts, E. Portman, B.+Patterson, J. Frederiksen and C. Smith. 1995. Effects of bacterial strains carrying the endA1 genotype on DNA quality isolated with Wizard plasmid purification systems. Promega notes 53]. 이들의 결론은 다음과 같다: endA 돌연변이체로부터 제조된 DNA의 품질은 시험된 endA+ 균주에서 제조된 DNA의 것보다 전체적으로 양호하다.
플라스미드 DNA 제제의 품질은 따라서 이러한 엔도뉴클레아제(DNA의 비교적 장기간 분해)로의 오염에 의해 영향을 받는다.
endA 유전자의 결실 또는 돌연변이는 이러한 엔도뉴클레아제 활성을 더 이상 갖지 않는 돌연변이체가 전체 유사 야생형 세균에 작용하는 한 어려움 없이 구상될 수 있다[참조문헌: Durwald, H. and H. Hoffmann-Berling (1968) J. Mol. Biol. 34: 331-346].
endA1 유전자는 돌연변이, 완전 또는 부분 결실, 붕괴 등에 의하여 불활성화시킬 수 있다. pCOR 플라스미드 생산을 위해 선택된 이.콜라이 균주의 endA 유전자의 불활성화는 특히 P1 박테리오파지를 사용하여, Cherepanov 및 Wackernagel[참조문헌: Cherepanov, P. P. and W. Wackernagel. 1995. Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158:9-14]에 의하여 기술된 ΔendA: :TcR 결실을 전이시키거나 해당 세균의 게놈에 존재하는 야생형 대립유전자를 상동재조합에 의하여 endA의 돌연변이 또는 결실 대립유전자와 교환함으로써 성취될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 균주의 이러한 유형의 사용은 생성된 DNA의 품질 개선을 유리하게 가능하게 한다.
본 발명은 또한 전술한 DNA 분자를 함유하는 여타 재조합 세포에 관한 것이다. 이는 진핵세포, 원핵세포 등 유형의 각종 기원의 세포일 수 있다.
이들 세포는 주어진 세포로의 플라스미드 도입을 허용하는 당해분야의 전문가에 공지된 기술로 수득된다. 이러한 기술은 특히 형질전환, 전기투공, 접합, 원형질 융합 또는 당해분야의 전문가에 공지된 여타 기술일 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 분자는 백신처리 또는 유전자를 소정세포, 조직 또는 유기체로 전달하기 위한 유전자 및 세포 요법, 또는 시험관내 재조합 단백질 생산용으로 사용될 수 있다.
특히, 이들은 이들의 환자내 이식을 위하여, 생체내 직접투여용 또는 시험관내 또는 생체외에서의 세포 변형용으로 사용될 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명의 다른 요지는 전술한 바와 같은 적어도 하나의 DNA 분자를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 이러한 분자는 화학적 및/또는 생화학적 형질감염 벡터와 연계되거나 연계되지 않을 수 있다. 이러한 과정에는 특히 양이온(인산칼슘, DEAE-덱스트란 등) 또는 리포솜이 수반된다. 연계된 합성 벡터는 양이온 중합체 또는 지질일 수 있다. 언급될 수 있는 이러한 벡터의 예로는 DOGS(TransfectamTM) 또는 DOTMA(lipofectinTM)이다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피 투여 등 용으로 제형될 수 있다. 청구된 플라스미드는 바람직하게는 주사형 또는 도포형으로 사용된다. 이는 주사제형용, 특히 치료부위로의 직접주입용으로 약학적으로 허용되는 어떠한 비히클과도 혼합시킬 수 있다. 이는 특히 멸균액, 등장액 또는 사례에 따라 멸균수 또는 생리식염수의 첨가로 주사액으로의 제조를 허용하는 건조 조성물, 특히 동결건조 조성물을 수반할수 있다. 이는 특히 글루코스 또는 염화나트륨에 희석한 트리스 또는 PBS 완충액을 수반할 수 있다. 환자의 환부로의 직접주사가 유리한데 그 이유는 치료효과가 환부조직 수준에 집중되도록 하기 때문이다. 사용된 용량은 각종 파라미터의 함수로서, 특히 유전자, 벡터, 사용된 투여방식, 관련 병리 또는 원하는 치료 지속기간의 함수로서 순응될 수 있다.
본 발명의 DNA 분자는 하나 이상의 해당 유전자, 즉 전사 및, 가능하게는 표적세포에서의 해독으로 치료, 백신, 농학 또는 수의학적 목적의 산물을 생성하는 하나 이상의 핵산(합성 또는 반합성 DNA, gDNA, cDNA 등)을 함유할 수 있다.
언급될 수 있는 치료목적의 유전자로는 효소, 혈액 유도체, 호르몬 및 림포카인: 인터류킨, 인터페론, TNF 등 (FR 92/03120), 생장인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소, 및 영양인자(BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 등; 아포리포단백질: ApoAI, ApoAIV, ApoE 등 (FR 93/05125), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀 (FR 91/11947) 암호화 유전자, 종양-억제 유전자: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등(FR 93/04745), 응고 관련인자: 인자 VII, VIII, IX 등을 암호화하는 유전자, 자기불활화 유전자: 티미딘 키나제, 사이토신 데아미나제 등; 또는 천연 또는 합성 임뮤노글로불린 (Fab, ScFv 등)의 전부 또는 일부, RNA 리간드(WO 91/19813) 등이다. 치료 유전자는 또한 표적세포에서의 발현이 유전자 발현 또는 세포 mRNA의 전사의 조절을 가능케 하는 안티센스 서열 또는 유전자일 수도 있다. 이러한 유전자는 EP 140,308에 기재된 기술에 따라, 예를 들면, 표적세포에서, 세포 mRNA와 상보적인 RNA로 전사되어 단백질로의 해독을 차단할 수 있다
해당 유전자는 또는 백신화 유전자, 즉, 백신생산을 위한, 사람이나 동물에서 면역반응을 생성할 수 있는 항원성 펩타이드를 암호화하는 유전자일 수 있다. 이들 항원성 펩타이드는 특히 엡스타인 바 바이러스, HIV 바이러스, B형 간염 바이러스(EP 185,573), 또는 의-광견병 바이러스의 특이적 항원성 펩타이드, 또는 종양의 특이적 항원성 펩타이드일 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 DNA 분자에 있어서, 치료, 백신, 농학 또는 수의학 목적의 유전자는 또한 표적 유기체 또는 세포내 기능적 전사를 위한 프로모터 영역, 및 전사 종결 시그널 및 폴리아데닐화 부위를 규정하는 3′말단에 위치한 영역도 함유한다. 프로모터 영역과 관련하여, 관련 세포 또는 유기체에서 기능을 발휘할 수 있을 때 고려되는 유전자의 발현에 자연히 관여하는 프로모터 영역일 수 있다. 프로모터 영역은 또한 상이한 기원(다른 단백질의 발현에 관여) 또는 심지어는 합성기원의 영역일 수도 있다. 특히, 이들은 진핵세포 또는 바이러스 유전자로부터의 프로모터일 수도 있다. 예를 들면, 이들은 표적세포 게놈으로부터 수득된 프로모터 서열일 수 있다. 사용될 수 있는 진핵세포 프로모터는 특이적 또는 비특이적인 유도성이거나 비유도성의 강력하거나 약한 방식으로 유전자의 전사를 자극하거나 억압하는 여타 프로모터 또는 유도서열이다. 진핵세포 프로모터는 특히 편재성 프로모터(HPRT, PGK, α-액틴, 튜불린 등에 대한 유전자의 프로모터), 중간 필라멘트 프로모터(GFAP, 데스민, 비멘틴, 뉴로필라멘트, 케라틴 등에 대한 유전자의 프로모터), 치료 유전자 프로모터(예를 들면, MDR, CFTR, 인자 VIII, ApoAI 등에 대한 유전자의 프로모터), 조직-특이성 프로모터(피루베이트 키나제, 비닐린, 장 지방산-결합 단백질, 평활근의 α-액틴 등에 대한 유전자의 프로모터) 또는 자극에 반응하는 프로모터(스테로이드 호르몬 수용체, 레티노산 수용체 등)일 수 있다. 이와 유사하게, 이들은 바이러스의 게놈으로부터 수득된 프로모터 서열, 예를 들면, 아데노바이러스 E1A 및 MLP 유전자의 프로모터, CMV 초기 프로모터 또는 RSV의 LTR 프로모터일 수 있다. 추가로, 이들 프로모터 영역은 활성화 또는 조절 서열 또는 조직 특이성 발현 또는 우세하게 조직 특이성인 발현을 허용하는 서열을 첨가함으로써 변형시킬 수 있다.
더욱이, 해당 유전자는 또한 합성산물을 표적세포의 분비경로로 지시하는 시그널 펩타이드를 함유할 수 있다. 이러한 시그널 서열은 합성산물의 천연 시그널 서열일 수 있지만, 또한 여타의 기능성 시그널 서열 또는 인공 시그널 서열일 수도 있다.
해당 유전자에 따라, 본 발명의 DNA 분자는 유전질환(영양실조, 낭포성 섬유증 등), 신경퇴행성 질환(알쯔하이머 질환, 파킨슨 질환, ALS 등), 암, 응고장애 또는 이상지단백혈증 관련 병리, 바이러스 감염 관련 병리(간염, AIDS 등), 또는 농학 및 수의학 분야 등을 포함한, 몇몇 질환의 치료 또는 에방용으로 사용될 수 있다.
더욱이, 본 발명은 또한 재조합 단백질 생산을 위한 조건성 재조합 DNA 분자의 용도에 관한 것이다. 세균은 각종 기원, 진핵 또는 원핵세포의 단백질 생산에 사용될 수 있다. 세균 중에서, 이.콜라이는 조작의 용이성, 이용가능한 발현 시스템의 많은 수 및 수득될 수 있는 다량의 단백질의 견지에서 이종 유전자 발현을 위한 선택의 유기체를 구성한다. 본 발명의 시스템이 다른 유기체에 사용될 수 있고, 전술한 바와 같이 친화성이 복제기원의 성질에 의해 결정됨이 이해된다. 이러한 용도를 위해서, 해당 핵산 서열은 선택된 숙주, 특히 진핵세포 숙주용으로 적당한 발현 시그널의 조절하에 잇는 암호화 영역을 포함한다. 이들은 예를 들면, Plac, Ptrp, PT7, Ptrc, Ptac, PL 또는 PR 프로모터, 샤인-달가노 서열 등(이러한 세트는 발현 카세트를 구성한다)일 수 있다. 해당 핵산서열은 제약, 농식품, 화학 또는 농화학 분야에서 가치있는 단백질을 암호화하는 여타 서열일 수 있다. 이는 구조 유전자, 상보성 DNA 분자 서열, 합성 또는 반합성 서열 등 일 수 있다.
발현 카세트는 본 발명의 요지인 조건성 복제 벡터 중으로 도입될 수 있으며, 이에 따라 이.콜라이내 단백질 발현을 허용하는 조건성 복제 벡터를 구성하게 된다. 이러한 벡터는 몇가지 장점이 있다: 세균내 이의 선별에 항생제를 사용하지 않는다는 점(비용감소, 완제품내 항생제 또는 잠정적인 유독성의 유도 산물의 존재에 관한 연구의 불필요), 사실상 플라스미드(조건성 복제 기원) 전이 확률의 거의 없음, 완전히 규정된 배지에서의 가능한 발효. 주어진 실시예는 재조합 단백질 생산을 위한 이러한 조건성 벡터의 유리한 특성을 보여준다.
본 발명은 비제한성 설명으로 고려되어야 하는 하기 실시예의 도움으로 더욱 상세히 기술될 것이다.

Claims (29)

  1. 해독에 의해 치료, 백신, 작물학 또는 수의학적 중요성을 갖는 산물을 생성하는 적어도 하나의 해당 핵산서열을 포함하며, 복제 허용 영역이 플라스미드 또는 박테리오파지로부터 유도되고 숙주세포 내에서 기능하기 위해 상기 숙주세포에 대해 이종인 적어도 하나의 특이성 단백질의 존재를 요하는 조건성 복제기원을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세균 세포 내에서 염색체외 형태로 안정한 염색체 외 환상 DNA 분자로서, 상기 조건성 복제기원은 플라스미드 R6K의 γ 복제기원이며, 상기 DNA 분자는,
    (a) 루시퍼라제(luc) 유전자가 해당 핵산서열로 치환된 도 5에 도시된 pXL2774와 같은 구조를 가지거나,
    (b) 도 8에 도시된 pXL3056 또는 도 10에 도시된 pXL3029 또는 pXL3030과 같은 구조를 가지거나, 또는
    (c) aFGF, p53 또는 p53superWT 유전자가 해당 핵산서열로 치환된 도 8에 도시된 pXL3056 또는 도 10에 도시된 pXL3029 또는 pXL3030과 같은 구조를 가지는 염색체 외 환상 DNA 분자.
  2. 제 1 항에 있어서, 복제기원이 서열번호 1의 서열로 표현됨을 특징으로 하는 DNA 분자.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 분자가 이입된 숙주 세포의 선별을 허용하는 영역이 특이적 코돈에 대한 억제자 tRNA의 발현 카세트에 의해 표현되는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
  4. 제 3 항에 있어서, 앰버 코돈(TAG)에 대한 억제자 tRNA의 발현 카세트임을 특징으로 하는 DNA 분자.
  5. 제 1 항에 있어서, 부위-특이성 리콤비나제의 표적 영역을 또한 포함함을 특징으로 하는 DNA 분자.
  6. 제 5 항에 있어서, 부위-특이성 리콤비나제에 대한 표적영역이 ColE1의 cer영역을 포함함을 특징으로 하는 DNA 분자.
  7. 제 1 항에 있어서, 루시퍼라제(luc) 유전자가 해당 핵산서열로 치환된 도 5에 도시된 바의 플라스미드 pXL2774인 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
  8. 제 1 항에 있어서, 해당 핵산서열이 제약 또는 농식품 목적의 단백질 또는 생촉매작용에 사용될 수 있는 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 DNA 분자.
  9. 제 8 항에 있어서, 해당 핵산서열이 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인 인터류킨, 인터페론, TNF, 생장인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성효소, 영양인자, 아포리포단백질, 종양-억제 유전자, 응고 관련인자, 자기불활화 유전자, RNA 리간드, 엡스타인 바 바이럿, HIV 바이러스, B형 간염바이러스 또는 의-광견병 바이러스의 안티센스 서열 또는 특이적 항원성 펩타이드, 또는 종양-특이성을 띠는 항원성 펩타이드 중에서 선택된 어느 하나의 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 DNA 분자.
  10. 적어도 하기를 함유하는 숙주세포를:
    숙주세포에서의 기능을 위해 숙주세포에 이종인 적어도 하나의 특이적 단백질의 존재를 요하는 복제기원을 포함하는 제 1 항에 따른 하나의 환상 DNA 분자, 및
    상기 복제기원의 기능을 조건화하며 상기 숙주세포에 대해 특이성이고 이종인 단백질;
    상기 DNA 분자에 의해 형질전환된 숙주세포의 선별을 허용하는 조건하에서 배양함을 특징으로 하는, 제 1 항에 따른 환상 DNA 분자의 생산방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 복제-개시 단백질을 암호화하는 유전자가 부수적인 레플리콘에 또는 세포게놈 내로 이입된 레플리콘에 존재함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 단백질이 플라스미드 R6K의 π단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, π단백질이 숙주세포에 존재하고 산물이 특이적 복제-개시 단백질의 활성을 갖는 서열번호 2로 표현된 pir 유전자로부터 자체내 발현됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 단백질이 세포 게놈 중으로 이입된 pir116 유전자로부터 발현됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 선택된 배양조건하에서 필수적인 숙주세포 유전자 중 하나가 DNA 분자내 선택된 억제자 tRNA에 의하여 인지될 수 있는 특이적 코돈을 함유함을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 유전자가 앰버 TAG 코돈을 함유함을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 세포가 이.콜라이 균주로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 세포가 이.콜라이 균주 XAC-1로부터 유도됨을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 유전자 pir116이 자신의 게놈 중으로 이입되어졌으며, 루시퍼라제(luc) 유전자가 해당 핵산서열에 의해 치환된 플라스미드 pXL2774로 형질전환된 이.콜라이 균주 XAC-1을 사용함을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항에 따른 적어도 하나의 DNA 분자 또는 제 10 항 또는 제 11 항에 따른 방법으로 형질전환된 재조합 세포.
  21. 적어도 하기를 함유하는 숙주세포를:
    제 1 항에 따른 DNA 분자, 및
    복제기원의 기능을 조건화하며, 숙주세포에 대해 특이성이고 이종인 플라스미드 R6K의 π 단백질;
    배양한 다음 생성된 재조합 단백질을 수확함을 특징으로 하는, 재조합 단백질의 생산방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 복제 개시 단백질 암호화 유전자가 부착 레플리콘상에 존재하거나 세포의 게놈 중으로 이입되어 있음을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 세포가 이.콜라이 균주 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1 항에 있어서, 해당 핵산서열이 야생형 또는 변형된 p53 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 DNA 분자.
  25. 제 1 항에 있어서, 해당 핵산서열이 티미딘 키나제를 암호화함을 특징으로 하는 DNA 분자.
  26. 제 17 항에 있어서, 세포가 이.콜라이 endA1 균주임을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1 항에 있어서, 리간드와 특이적으로 상호작용할 수 있는 서열을 또한 포함함을 특징으로 하는 DNA 분자.
  28. 제 9 항에 있어서, 해당 핵산서열이 p53 단백질을 암호화함을 특징으로 하는 DNA 분자.
  29. 제 9 항에 있어서, 상기 해당 핵산서열은 BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, ApoAI, ApoAIV, ApoE, 디스트로핀, 미니디스트로핀, p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 티미딘 키나제, 사이토신 데아미나제, Fab, 또는 ScFv을 암호화하는 DNA 분자.
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