CZ294525B6 - Molekula kruhové DNA s podmínečným počátkem replikace, způsob její přípravy a její použití při genové terapii - Google Patents

Molekula kruhové DNA s podmínečným počátkem replikace, způsob její přípravy a její použití při genové terapii Download PDF

Info

Publication number
CZ294525B6
CZ294525B6 CZ1998788A CZ78898A CZ294525B6 CZ 294525 B6 CZ294525 B6 CZ 294525B6 CZ 1998788 A CZ1998788 A CZ 1998788A CZ 78898 A CZ78898 A CZ 78898A CZ 294525 B6 CZ294525 B6 CZ 294525B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
dna molecule
replication
gene
protein
plasmid
Prior art date
Application number
CZ1998788A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ78898A3 (cs
Inventor
Joël Crouzet
Fabienne Soubrier
Original Assignee
Gencell Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9482580&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ294525(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Gencell Sa filed Critical Gencell Sa
Publication of CZ78898A3 publication Critical patent/CZ78898A3/cs
Publication of CZ294525B6 publication Critical patent/CZ294525B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C07K14/501—Fibroblast growth factor [FGF] acidic FGF [aFGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Abstract

Řešení se týká molekuly kruhové DNA, užitečné pro genové terapie, obsahující alespoň jednu nukleovou sekvenci zájmu, kde oblast umožňující její replikaci obsahuje počátek replikace, jehož funkce v hostitelské buňce vyžaduje přítomnost alespoň jednoho specifického proteinu, který je cizorodý pro hostitelské buňky. Řešení se také týká způsobu přípravy molekuly DNA, buněk obsahujících molekuly DNA a jejich použití v genové terapii a farmaceutického prostředku.ŕ

Description

(57) Anotace:
Řešení se týká molekuly kruhové DNA, užitečné pro genové terapie, obsahující alespoň jednu nukleovou sekvenci zájmu, kde oblast umožňující její replikaci obsahuje počátek replikace, jehož funkce v hostitelské buňce vyžaduje přítomnost alespoň jednoho specifického proteinu, který je cizorodý pro hostitelské buňky. Řešení se také týká způsobu přípravy molekuly DNA, buněk obsahujících molekuly DNA a jejich použití v genové terapii a farmaceutického prostředku.
Z 294525 B6
pXL2T74
4,S kpb
Molekula kruhové DNA s podmínečným počátkem replikace, způsob její přípravy a její použití při genové terapii
Oblast techniky
Předložený vynález se týká nové molekuly DNA s podmínečnou replikací, která je použitelná při genové terapii nebo pro přípravu rekombinantních proteinů.
Dosavadní stav techniky
Genová terapie spočívá v opravě poruch nebo anomálií tím, že vkládá genetickou informaci do buňky nebo do postiženého orgánu. Tato informace může být vložena buď in vitro do buněčného extraktu orgánu a potom reinjikována do organizmu, nebo in vivo přímo do určité tkáně. V případě DNA se jedná o molekulu s vysokou molekulovou hmotností a s negativním nábojem, jen obtížně proto samovolně prochází fosfolipidovou buněčnou membránou. Používají se tedy různé vektory, aby umožnily přenos genu: jednak virové vektory, a také chemické vektory nebo/a biochemické, přírodní nebo syntetické.
Virové vektory (retroviry, adenoviry, viry AAV a další) jsou velmi účinné, zejména pro přechod přes membrány, ale představují také určitá nebezpečí, například nebezpečí patogenity, rekombinace, replikace, imunity apod.
Chemické a/nebo biochemické vektory umožňují vyhnout se těmto nebezpečím (pro přehled, viz Behr, 1993, Cotten et Wagner, 1993). Jsou to například kationty (fosforečnan vápenatý, DEAEdextran a další), které působí tím, že tvoří sraženiny s DNA, které mohou být fagocytovány buňkami. Může se zejména jednat o lipozomy, ve kterých DNA je začleněna, a které fúzují s plazmovou membránou. Syntetické vektory pro přenos genů jsou všeobecně lipidy nebo kationické polymery, které tvoří komplexy sDNA, a tak s ní tvoří částici, nesoucí pozitivní náboj na povrchu. Pro ilustraci tohoto typu vektorů se může zejména citovat dioktadekylamidoglycylspermin (DOGS, Transfectam TM) nebo N-[l-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylamonium chlorid (DOTMA, Lipofectin TM).
Použití chemických nebo/a biochemických vektorů nebo pouhé DNA předpokládá možnost produkovat důležité množství DNA farmakologicky čisté. Vlastně v technikách genové terapie medikament je tvořen samotnou DNA, která je nezbytná pro možnost výroby v přizpůsobených množstvích a DNA, která má přijatelné vlastnosti pro terapeutické použití u člověka.
V případě nevirové vektorologie se používají plazmidy bakteriálního původu. Plazmidy všeobecně použité v genové terapii nesou (i) počátek replikace, (ii) značený gen jako je gen rezistentní k antibiotikům (kanamycin, ampicilin...) a(iii) jeden nebo více transgenů s nezbytnými sekvencemi pro jejich expresi (leucinový zip či zipy, promotor(y), polyadenylové sekvence...).
Nicméně aktuálně používaná technologie nedává úplné uspokojení.
Jednak zůstává nebezpečí rozptýlení v organizmu. To znamená, že bakterie, přítomné v organizmu, mohou, při slabé četnosti, přijímat tento plazmid. Toto má tím spíše větší pravděpodobnost v případě, že se jedná o léčení genovou terapií in vivo, ve které může být DNA rozmnožena v organizmu pacienta a může se nacházet v kontaktu s bakteriemi, které infikují tohoto pacienta, anebo také s bakteriemi komensalitní mikroflóry. Jestliže bakterie, která přijímá plazmid, je enterobakterie, taková jako E. coli, tento plazmid se může replikovat. Takový děj vede k rozšíření terapeutického genu. V případě, kde použité terapeutické geny v léčení genové terapie mohou kódovat například lymfokin, faktor růstu, lymfokin antionkogen, nebo protein, jehož funkce chybí u hostitele a umožňuje opravit genetickou chybu, rozmnožení těchto určitých genů by
-1 CZ 294525 B6 mohlo mít nekané účinky a účinky, které způsobují starosti (například, jestliže patogenní bakterie osvobodí gen lidského růstového faktoru).
A jednak plazmidy, všeobecně použité v genové nevirové terapii, mají tak markér rezistence k antibiotikům (ampicilinu, kanamycinu...). Bakterie, která přijímá takovýto plazmid, má tak podstatnou nepopiratelnou výhodu, jelikož každé autobioterapeutické léčení, které používá antibiotika stejného rodu, jako vybraný gen rezistence plazmidu, povede k selekci zmíněného plazmidu. V tomto pohledu ampicilin tvoří část β-laktamů, který je antibiotickou rodinou nej používanější na světě. Použití selekčních markérů u bakterií, které nebudou rezistentními geny k antibiotikům, budou tedy zejména výhodné. Vyhne se selekci bakterií, které by mohly dostat plazmid, který nese takovýto markér.
Je tedy zejména důležité hledat maximální omezení rozmnožení terapeutických a rezistentních genů.
Podstata vynálezu
Předložený vynález navrhuje nové molekuly DNA, použité v genové terapii nebo pro produkci rekombinantních proteinů in vitro, které se replikují jen v buňkách, které mohou doplnit určité funkce těchto nevirových vektorů.
Předložený vynález se také týká obzvláště účinné metody pro přípravu těchto molekul DNA.
Nárokové molekuly DNA mají výhodu vyloučení nebezpečí, spojeného s rozmnoženým plazmidem, jako jsou (1) replikace a rozmnožení, které mohou vést silnou expresi neřízenou terapeutickým genem, (2) rozmnožení a exprese rezistentních genů. Genová informace, obsažená v molekulách DNA podle vynálezu, obsahuje účinek na terapeutický gen nebo terapeutické geny a signály regulace jeho nebo jejich exprese, počátek replikace podmínečně funkční, který omezuje velmi silně spektrum hostitelské buňky tohoto plazmidu, selekční markér snížené velikosti, přednostně odlišující se od genu, který uděluje rezistanci k antibiotikům a v případě potřeby, fragment DNA, který umožňuje uvolnění multimerů plazmidu. Pravděpodobnost, že tyto molekuly (a tedy genetická informace, kterou obsahují) bude přenesena na mikroorganizmus a stabilně se udrží, je velmi omezena.
Vektory podle vynálezu, také popsané miniplazmidy z důvodů jejich kruhové struktury, jejichž snížené velikosti a jejich silně svinuté formy představují dostatečné následující výhody: Z důvodu jejich snížené velikosti vzhledem k plazmidům, odvozeným od ColEl klasicky použitých, molekuly DNA podle vynálezu mají potenciálně lepší biopoužitelnost in vivo. Představují zvýšenou schopnost penetrace a buněčného roznášení rozdělování. Je známo, že difuzní koeficient do tkání není přímo úměrný k molekulové hmotnosti (Jain, 1987). Zrovna tak na buněčné úrovni molekuly vysoké molekulové hmotnosti mají alespoň dobrou permeabilitu k přechodu plazmidové membrány. Mimoto pro přechod plazmidu k jádru nezávisle na jeho expresi je zvýšená molekulová hmotnost také nevýhodou, nukleární póry prosazují limit velikosti pro difúzi k jádru (Landford et al., 1986). Redukce velikosti neterapeutické složky molekuly DNA (zejména počátek replikace a selektovaný gen) podle vynálezu umožňuje také snížit velikost molekul DNA. Složka, umožňující replikaci a selekci tohoto plazmidu u bakterií (1,1 kb), je snížena faktorem 3 tím, že zhustí například 3 kb pro počátek replikace a markér rezistence vektorové složky. Toto snížení (i) molekulové hmotnosti a (ii) negativního náboje dává molekulám podle vynálezu zvýšené schopnosti difúze a tkáňové bioschopnosti buněčné a nukleární.
Předložený vynález se týká molekuly kruhové DNA, použité v genové terapii, obsahující alespoň nukleovou sekvenci zájmu, vyznačenou tím, že oblast, která umožňuje jeho replikaci, obsahuje počátek replikace, jehož funkce v hostitelské buňce vyžaduje přítomnost alespoň specifického proteinu, který se netýká uvedené hostitelské buňky.
-2CZ 294525 B6
Tato molekula DNA se může vyjádřit ve formě jedno nebo dvouvláknové a výhodně zaujímá silně svinutou formu.
Ve smyslu předloženého vynálezu hostitelské buňky mohou být různého původu. Může se jedna o buňky eukaryontní nebo prokaryotní. Podle upřednostněného způsobu provedení vynálezu se může jedna o buňky eukaryotní.
Replikace bakteriálních plazmidů vyžaduje alespoň přítomnost proteinu, kódovaného hostitels10 kou buňkou typu RNA polymerázám, Rnáza, DNA polymeráza... Z těchto důvodů, již dříve naznačených, se nemůže úplně vyloučit stím typem replikace spojené případné nebezpečí rozmnožení v léčeném organizmu. Funkce počátku replikace molekuly DNA podle vynálezu požaduje přítomnost proteinové sekvence, netýkající se hostitelské buňky. Tato charakteristika redukuje spektra hostitele nárokovaného plazmidů specifického kmenu, který exprimuje tento 15 iniciační protein. Molekula DNA v rámci předloženého vynálezu má tedy výhodně počátek replikace tzv. podmínečný.
Počátek replikace podmínečný podle předloženého vynálezu může pocházet z plazmidů nebo bakteriofágů, které sdílejí následující vlastnosti: obsahují ve svém počátku replikace opakované 20 sekvence intronů a kódují alespoň iniciační protein replikace (Rep), který je specifický. Z tohoto titulu se mohou například citovat systémy podmínečné replikace následujících plazmidů a bakteriofágů:
plazmid nebo bakteriofág specifický iniciační protein
RK2 (Stalker et al., 1981) TrfA
R1 (Ryderetal., 1981) Rep A
pSCIOl (Vocke and Bastia, 1983) Rep A
F (Murotsu et al., 1981) protein E
Rtst (Iton et al., 1982, 1987) Rep A
RSF1010 (Miao et al., 1995) Rep C
PÍ (Ábeles et al., 1984) Rep
P4 (Flensburg and Calendar, 1987) protein alfa
lambda (Moore et al., 1981) protein O
phi 82 (Moore et al., 1981) protein O phi 82
phi 80 protein O phi 80
Podle upřednostněného způsobu provedení vynálezu vznik replikace v nárokových molekulách DNA pochází z přírodního plazmidů E. coli, nazvaného R6K.
Replikační funkce R6K jsou seskupeny do fragmentu 5,5 dpb DNA (Obrázek 1), který obsahuje tři původce replikace α, β a y (y a β zajišťují 90 % replikace), a operon, kódující iniciační protein 30 replikace π a protein Bis. Minimální nezbytná genetická informace k udržení tohoto plazmidů a jeho počtu charakteristických kopií (15 kopií na genom) je obsažena ve dvou elementech: 400 pbd ori y a gen pir, jehož produkt je iniciační protein π.
Ori y může být rozdělen na dvě funkční části: střední část a aktivační element (Obrázek 1). 35 Střední část, zejména pro replikaci obsahuje introny (7 přímých repeticí 22 pdb), kde se váže protein π vyjádřený SEQ ID N°1 a segmenty, které stojí podle sebe, cílové hostitelské proteiny (IHF, DnaA).
Podle upřednostňovaného způsobu vynálezu počátek replikace nárokového vektoru je zachován 40 úplně nebo částečně počátkem replikace y plazmidů R6k a zejména úplně nebo částečně SEQ ID
N°1 nebo jedním z jeho derivátů.
-3CZ 294525 B6
Ve smyslu předloženého vynálezu termín odvozený značí všechny sekvence, které se liší od požadované sekvence z důvodu degenerace genetického kódu, získaného jednou nebo více modifikacemi genetické povahy nebo/a chemické povahy, stejně jako všechny sekvence, které hybridují s těmito sekvencemi nebo fragmenty těchto sekvencí, a jejichž produkt má naznačenou aktivitu iniciačního proteinu replikace π. Modifikací genetické povahy nebo/a povahy chemické se mohou očekávat všechny mutace, substituce, delece, adice nebo/a modifikace jednoho nebo více reziduí. Termín odvozený zahrnuje také obecné sekvence a požadované sekvence, pocházející z jiných buněčných zdrojů, zejména z buněk lidského původu nebo z jiných organizmů a, které mají aktivitu stejného typu. Takovéto obecné sekvence mohou být získány hybridizačními pokusy. Hybridizace může být provedena z bank nukleových kyselin za použití sonky původní sekvence nebo fragmentu této sekvence za striktně dojednaných podmínek (Maniatis et al., viz všeobecné techniky molekulární biologie) nebo za podmínek striktně zvýšených.
Počátek replikace, popsaný dále, který představuje výhodu tím, že má velikost velmi omezenou, je jedinečně funkční v přítomnosti specifického iniciačního proteinu, proteinu Pi, produktu genu pir (SEQ ID N°2). Tento protein, který může působit na trans je možné fyzikálně disociovat ori gamma genu pir, který by mohl být vložen do genomu buňky, vybrané jako specifická hostitelská buňka tohoto plazmidu. Mutace v π mohou porušit jeho iniciační funkce (Inuzukaet Wada, 1985) a unést zvýšení počtu kopií, odvozených od R6K, až do desetinásobného počtu počátečních kopií. Tyto substituce jsou všechny zahrnuty v doméně čtyřiceti aminokyselin, které se zde zdají odpovědné za řízení π počtu plazmidových kopií (Obrázek 2).
Podle způsobu provedení předloženého vynálezu protein π, exprimovaný v hostitelské buňce, vyplývá z exprese genu vyjádřeného SEQ ID N°2 nebo jednoho z jeho derivátů, takových jaké byly již dříve definované, zejména genu pir 116, který obsahuje mutaci vzhledem ke genu pir. Tato mutace odpovídá substituci prolinu leucinem. V této souvislosti počet kopií odvozených od R6K je v rozmezí okolo 250 kopií na genom.
Kromě podmínečného počátku replikace tak, jak již bylo dříve definováno nárokované molekuly DNA obsahují oblast, obsahující jeden nebo více genů, umožňující zajistit selekci molekuly DNA u vybraného hostitele.
Může se jednat o klasické markéry typu genu, udělující rezistenci k antibiotikům, takovým jako jsou kanamycin, ampicilin, chloramfenikol, streptomycin, spectinomycin, lividomycin nebo jiné.
Podle upřednostňovaného způsobu provedení předloženého vynálezu tato oblast je odlišná od genu, udělujícího rezistanci k antibiotikům. Může se jednat o gen, jehož produkt je nezávislý k životaschopnosti rozmnoženého hostitele za definovaných kultivačních podmínek. Může to být například:
- gen, kódující supresorovou tRNA, přírodního nebo syntetického původu. Může se jednat zejména o tRNA kodonu amber (TAG),
- gen, jehož produkt je nezbytný pro metabolizmus buňky za určitých kultivačních podmínek: gen zasahuje do biosyntézy metabolitu (aminokyselina, vitamin...), gen katabolizmu, umožňující asimilovat látky, přítomné v kultivačním médiu (zdroj dusíku nebo uhlíku)....
Podle upřednostňovaného způsobu provedení předloženého vynálezu tato oblast obsahuje kazetu exprese genu, kódujícího supresorovou tRNA specifických kodonů. Tato kyselina může být zejména vybrána mezi kyselinami, kódujícími báze Phenylalaninu, Cysteinu, Prolinu, Alaninu a Histidinu. Jedná se zejména o supresorovou tRNA kodonů amber (TAG).
Zejména v tomto případě systém použitý pro selekci, u hostitelských buněk, molekul DNA podléhajících předloženému vynálezu obsahuje dva elementy:
-4CZ 294525 B6
1) na molekule DNA gen, kódující RNA supresorového transferu kodonu amber (TAG), který se skládá z markéru selekce, řečeného genu (sup),
2) specifický hostitel, jehož jeden z genů, zejména za určitých podmínek kultivace, obsahuje kodon amber TAG. Tato buňka by mohla růst za kultivačních podmínek, pro které produkt genu, obsahujícího kodon TAG, je podstatný, pouze jestliže plazmid, umožňující expresi sup, je přítomný v buňce. Kultivační podmínky tvoří tak tlak selekce molekuly DNA. Použití geny sup mohou být přírodního původu (Glass et al., 1982) nebo mohou pocházet ze syntetické konstrukce (Normanly et al., 1986, KLeina et al., 1990).
Takovýto systém nabízí velkou flexibilitu do té míry, že podle genu, zahrnujícího mutaci amberu, je možné určit různá vybraná média. U bakterie Lactococcus lactis například kodon amber je umístěn v genu biosyntézy purinů. To umožňuje selekci plazmidu nositele genu, kódujícího supresorovou tRNA, když se bakterie rozmnožují v mléce. Takový markér má výhodu, že může být velikosti velmi malé a výhodou, že neobsahuje „cizí“ sekvence, pocházející z fágu nebo transpozonů.
Podle upřednostňovaného způsobu provedení předloženého vynálezu molekula DNA obsahuje mimoto fragment DNA, regiospecifický cíl rekombináz, který umožňuje uvolnění plazmidových multimerů.
Jeden takový fragment, včleněný na molekule kruhové DNA, jehož počátek replikace je například ori γ, umožňuje upevnit multimery takovéhoto plazmidu. takovéto multimery jsou zejména pozorovány, když molekula DNA je připravena z kmenu, nesoucího mutovanou alelu pir, která umožní rozmnožit počet kopií derivátů R6K. jako je pir-116.
Tato rekombinace může být provedena díky různým systémům, které způsobují regiospecifíckou rekombinaci mezi sekvencemi. Regiospecifícká rekombinace vynálezu je získána prostřednictvím sekvencí intramolekulámí specifické rekombinace, které jsou schopné rekombinovat mezi sebou v přítomnosti specifických proteinů, všeobecně označených rekombinázy. V tomto přesně stanoveném případě se jedná o rekombinázy XerC a XerD. Z tohoto důvodu molekul DNA podle vynálezu zahrnují všeobecně mimoto sekvenci, dovolující tuto stereospecifickou rekombinaci. Specifický rekombinační systém, přítomný v genetických konstrukcích podle vynálezu (rekombinázy a místo specifického rozpoznání), může být různého původu. Zejména specifické sekvence a použité rekombinázy mohou náležet k různým strukturním třídám a zejména k rodině rezolvázy transpozonnu Tn3 nebo k rodině integrázy bakteriofága lambda. Mezi rekombinázy, náležející k rodině transpozonů Tn3,se mohou citovat zejména rezolváza transpozonů Tn3 nebo transpozonů Tn21 a Tn522 (Stark et al., 1992), invertázy Gin bakteriofága mu nebo také rezolvázy plazmidů takových, jako rezolváza fragmentu par RP4 (Abert et al., Mol. Mikrobiol. 12 (1994), 131). Mezi rekombinázy, následující k rodině integrázy bakteriofága λ, se mohou citovat zejména integrázy fágu λ (Landy et al., Science 197 (1977) 1147), P22 a φ80 (Leong et al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468), HP1 Haemophilus influenzae (Hauser et al., J. Biol. Chem. 267 (1992), 6859), integráza Gre fágu Pl, integráza plazmidu pSAM2 (EP 350 341) nebo také FLP rekombináza plazmidu 2μ a rekombinázy XerC a XerD E. coli.
Molekuly DNA, předměty předloženého vynálezu, obsahují fragment cer přírodního plazmidu E. coli. ColEl. Použitý fragment cer je fragment Hpall 382 pdb ColEl, o kterém bylo ukázáno, že umožňuje, v cis, rozdělení multimerů plazmidů (Summers et al., 1984, Leung et al., 1985). Je také možné použít fragment Hpall-Taql menší velikosti (280 pdb) nebo fragment ještě menší (okolo 220 pdb), zahrnutý do fragmentu Hpall, který má stejné vlastnosti (Summers and Sherratt, 1988). Toto rozdělení prochází specifickou intramolekulámí rekombinaci, která zasahuje čtyři proteiny, kódované genomem E. coli: ArgR, RepA, XerC a XerD (Stirling at al., 1988, 1989, Colloms et al., 1990, Blakely et al., 1993).
-5CZ 294525 B6
Z tohoto tituluje zejména výhodné použít celek nebo část fragmentu cer ColEl nebo jeden z jeho derivátů, takových jaké jsou již dříve definovány.
Podle prokázané varianty molekuly DNA podle vynálezu mohou obsahovat mimoto sekvenci, schopnou specificky interagovat s ligandem. V upřednostňovaném způsobu se může jednat o sekvenci, schopnou tvořit hydridací triplex se specifickým oligonukleotidem. Tato sekvence dovoluje tak purifikovat molekuly podle vynálezu selektivní hybridací s imobilizovaným komplementárním oligonukleotidem na nosiči (viz přihláška vynálezu WO 96/18744). Sekvence může být umístěna v každém místě molekuly DNA podle vynálezu, tím okamžikem neurčuje funkci genu zájmu a počátku replikace.
Co se týče reprezentativní molekuly DNA podle předloženého vynálezu, že se především nárokovat plazmid pXL2774 a jeho deriváty. Ve smyslu předloženého vynálezu se chápe derivát jako vždy konstrukce, odvozené od pXL2774 a obsahující jeden nebo více genů zájmu jiných než luciferázový gen. Mohou se také citovat plazmidy pXL3029 a 3030, obsahující kazetu exprese terapeutického genu a sekvenci schopnou specificky interagovat s ligandem.
Předložený vynález se také týká metody konstrukcí specifických hostitelských buněk, zejména účinných pro tvorbu těchto terapeutických molekul DNA.
Jiný předmět předloženého vynálezu se týká metody tvorby kruhové molekuly DNA, vyznačené tím, že se kultivuje hostitelská buňka, obsahující alespoň molekulu DNA takovou, jaké je již dříve definována, a protein, exprimovaný in šitu nebo neexprimovaný, počátek replikace podmínečně účinný uvedené molekuly DNA specifické, netýkající se výše uvedené hostitelské buňky, za podmínek umožňujících selekci hostitelských buněk transformovaných výše uvedenými molekulami DNA.
Protein podmínečně funkční počátku replikace molekuly DNA je exprimován in šitu od odpovídajícího genu. Gen kódující iniciační protein replikace může být nesen vedlejším replikonem, kompatibilním s deriváty počátku replikace podmíněně použitého nebo může být začleněn do genomu hostitelské buňky rekombinací díky transpozónu, bakteriofágu nebo každým jiným vektorem. Zejména v tomto případě, kde gen exprimující protein je umístěn na vedlejším replikonu, tento replikon obsahuje zejména oblast promotoru transkripce funkční v buňce, stejně jako oblast umístěnou na 3'a, která určuje signál ukončení transkripce. Co se týče oblasti promotoru, může se jednat o oblast promotoru i přirozeně odpovědnou za expresi zkoumaného genu, když tato je schopná fungovat v buňce. Může se také jednat o sekvence promotorů genů prokaryontů nebo bakteriofágů. Například se může jednat o sekvence promotorů, vzešlý z genomu buňky.
Co se týče genů, kódujících iniciační protein replikace, mohly by být použity buď divoké geny, nebo mutované alely, umožňující získat zvýšený počet kopií specifických plazmidů (nebo derivátů) iniciačního proteinu podmiňujíc funkci počátku replikace uvedeného v molekule DNA.
Byly popsány tito mutanti pro plazmidy R6K (Inuzuka and Wada, 1985, Greener a al., 1990), Rtsl (Tarawaki and Itoh, 1985, Terawaki et al., 1990, Zeng et al., 1990), F (Seelke et al., 1982, Helsberg et al., 1985, Kawasaki et al., 1991), RK2 (Durland et al., 1990, Haugan et al., 1992, 1995), pSCIOl (Xiaetal., 1991, Goebel et al., 1991, Fang et al., 1993).
V případě, že molekula DNA má počátek replikace odvozující od plazmidů R6K, protein iniciátoru je odvozený od proteinu π tohoto plazmidů. Je především výhodné exprimovat mutovanou formu tohoto proteinu, schopného zvýšit zejména počet počátečních kopií. Proto integrovaný gen na úrovni hostitelské buňky je přednostně vyjádřený celkem nebo částí sekvence vyjádřené SEQ ID N°2 nebo jedním z jeho derivátů, zejména genem pirlló. Spojené mutace odpovídají substituci prolinu leucinem. Podle upřednostňovaného způsobu provedení vynálezu tento gen pirl 16 je přímo začleněn do genomu hostitelské buňky.
-6CZ 294525 B6
Jeden z genů specifické hostitelské buňky, nezávislý na podmínkách vybrané kultivace, obsahuje specifický kodon, rozpoznatelný supersorovou tRNA, vybranou na úrovni molekuly DNA. Podle upřednostňovaného způsobu provedení vynálezu se může jednat o kodon amber TAG. V tomto případě buňka by mohla růst v kultivačních podmínkách, pro které produkt genu obsahující kodon TAG je esenciální, jedinečně, jestliže plazmid, umožňující expresi sup, je přítomný v hostitelské buňce. Kultivační podmínky zahrnují tak tlak selekce molekuly DNA.
Gen obsahující kodon amber je gen účinkující v biosyntéze aminokyseliny argininu. tento gen argE kóduje N-acetylomithinázu (Meinnel et al., 1992) a obsahuje vtom případě kodon TAG, odpovídající bodové mutaci Gln-53 (CAG)->TAG; tlak selekce plazmidu nesoucího gen sup je tedy zajištěný kultivačním minimálním médiem M9 (Maniatis et al., 1989). Tentokrát by to mohl být také například gen biosyntézy vitaminu, nukleové bázenebo také gen umožňující použít zdroj uhlík nebo dusíku nebo každý jiný gen, jehož funkce je nezávislá na životaschopnosti buněk za vybraných kultivačních podmínek.
Hostitelská buňka je přednostně vybrána mezi kmeny E. coli a reprezentovaná zejména kmenem E. coli XAC-1.
Podle upřednostňovaného způsobu provedení vynálezu hostitelská buňka n nárokované metodě je buňka kmene E. coli XAC-1, obsahující ve svém genomu gen pir 116 a transformovaná plazmidem pXL2774 nebo jedním z jeho derivátů.
Podle varianty vynálezu hostitelská buňka v nárokované metodě je buňka prokaryotní, ve které gen endAl nebo obecný gen je inaktivní. Gen endA kóduje endonukleázu I E. coli. Tento periplazmatický enzym má aktivitu přerušení nespecifické dvouvláknové DNA (Lehman, I. R.,
G. G. Roussos and E. A. Prát (1962), J. Biol. Chem. 237: 819-828, Wright M. (1971 (J. Bacterio. 107: 87-94). Studie provedená na různých kmenech Escherichia coli (divokých nebo andA) ukázala, že degradace plazmidové DNA inkubované v extraktech těchto bakteriálních kmenů existuje v kmeni adnA+, ale ne v mutantech endA (Wnendt S. (1994) BioTechniques 17: 270272). Množství plazmidové DNA izolované z kmenů endA+ nebo mutantů endA bylo studováno společností Promega za použití jejich purifikačního systému (Shoenfeld, T., J. Mendez, D. Stors, E. Portman, B. Patterson, J. Frederiksen and C. Smith 1995. Effects of bacterial strains carrying the endAl genotype on DNA quality isolated with Wizard plazmid purification systems. Promega notes 53). Jejich závěr je následující: Množství DNA, připravené od mutantu endA, je celkově lepší než množství DNA, připravené z testovaných kmenů endA+.
Jakost příprav plazmatidové DNA je tedy určena každou kontaminací těmito endonukleázami (degradace DNA ve více nebo méně dlouhé době).
Delece nebo mutace genu může být uvažována do té míry bezproblémová, neboli mutanti, už nepředstavující tuto endonukleázovou aktivitu, se chovají úplně jako divoké bakterie (Durwald,
H. and H. Hoffman-Berling (1968). J. Mol. Biol. 34: 331-346).
Gen endAl může být inaktivován mutací, delecí úplnou nebo částečnou, přerušením, atd. Inaktivaci genu endA kmene E. coli, vybraného pro tvorbu plazmidů pCOR, může být provedena tím, že přenese díky bakteriofágu PÍ delecí AendA::TcR popsanou Cherepanovem a Wackemagelem (Cherepanov, P.R. and Wackemagel. 1995). Gel disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibioti resistance determinant. Gene 158: 9-14), nebo tím, že vymění divoké elely, přítomné v genomu bakterie zájmu, s mutovanou alelou nebo deletovanou endA. a to obecnou rekombinací. Použití tohoto typu kmenu v rámci předloženého vynálezu výhodně umožňuje zvýšit kvalitu produkované DNA.
-7CZ 294525 B6
Vynález se také týká každé rekombinantní buňky obsahující molekuly DNA, takovou jaká již byla definována. Může se jednat zejména o buňky různého původu, typu eukaryotního, prokaryontního....
Tyto buňky jsou získány všemi odborníky známými technikami, umožňujícími vložit uvedený plazmid do určité buňky. Může se zejména jednat o transformaci, elektroporaci, konjugaci, fúzi protoplastů nebo o jiné další odborníkům známé techniky.
Molekuly DNA podle vynálezu mohou být použity ve všech aplikacích vakcinačních nebo v genové terapii a buněčné terapii pro přenos genu od organizmu, tkáně nebo určité buňky nebo pro produkci rekombinantních proteinů in vitro.
Mohou být použity pro přímé podávání in vivo nebo pro modifikaci buněk in vitro nebo ex vivo z pohledu jejich implantace pacientu.
Z tohoto ohledu další předmět vynálezu se týká všech farmaceutických kompozic, obsahujících alespoň molekulu DNA takovou, jaká byla již dříve definována. Tato molekula může nebo nemusí tam být spojená s chemickým vektorem nebo/a biochemickým vektorem transfekce. Může se jednat zejména o kationty (fosforečnan vápenatý, DEAE-dextran...) o lipozomy. Spojené syntetické vektory mohou být lipidy nebo kationické polymery. Může se zejména citovat jako například takovýto vektorů DOGS (Transfectam TM) nebo DOTMA (lipofectin TM).
Farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou být formulovány z pohledu podávání, a to jako topikálně, orálně, parenterálně, intranasálně, transdermikálně atd. Nárokovaný plazmid je zejména použit ve formě injektovatelné nebo v aplikaci. Může to být směs každého farmaceuticky akceptovatelného vehikula pro injektovatelnou formulaci, zejména pro přímou injekci na úrovni místa k ošetření. Může se jednat zejména o sterilní roztoky, izotonické roztoky nebo suché kompozice, zejména lyofilizované, které po přidání, podle případu, sterilované vody nebo fyziologického séra umožňují injektovatelnou formu. Může se jednat zejména o pufry Tris nebo PBS, ve kterém je rozpuštěna glukóza nebo chlorid sodný. Přímá injekce v postižené oblastí pacienta je zajímavá, protože umožňuje soustředit terapeutický účinek na úrovni postižené tkáně. Použitá dávka může být přizpůsobena funkci různých pacientů, zejména funkcí genu, vektoru, způsobu použitého podávání, patologie nebo také doby hledaného léčení.
Molekuly DNA podle vynálezu mohou obsahovat jeden nebo více genů zájmu, totiž jednu nebo více nukleových kyselin (cDNA, gDNA, syntetickou nebo semisyntetickou DNA, atd), jejichž transkripce a případně translace v cílové buňce vytváří produkty, které mají terapeutický, vakcinální agronomický nebo veterinární význam.
Mezi geny terapeutického zájmu se mohou uvést zejména geny kódující enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny, interleukiny, interferony, TNF atd. (FR. 9203120) růstové reaktory, neuropřenašeče nebo jejich prekurzory nebo enzymy syntézy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GNF, a FGF, BFGF, NT3, NT5 and. apolipoproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE atd. (FR 9305125), dystrofín nebo minidystrofin (FR 9111947), supresorové geny nádorů: P53, Rd, Rapi A, DCC, Krev, atd (FR 9304745), geny kódující faktory zahrnuté do koagulace: Faktora VII, VIII, IX atd., sebevražedné geny: Thyamidin kináza, cytosin deamináza atd: nebo také celek nebo část přírodního nebo umělého imunoglobinu (Fab, ScFv atd.), ligand RNA (WO 91/19813) atd. Terapeutický gen může také být gen nebo antimediátorová sekvence, jehož nebo jejíž exprese v cílové buňce umožňuje řízení exprese genů nebo transkripci buněčné mRNA. Takovéto sekvence mohou být například transkribované v cílové buňce, RNA komplementární buněčné mRNA, a mohou blokovat jejich translaci v proteinu, podle technik popsaných v EP 140 308.
Gen zájmu může také být vakcinový gen, totiž gen kódující antigenový peptid, schopný vytvářet u lidí nebo zvířat imunitní odpověď z pohledu realizace vakcín. Může se jednat zejména
-8CZ 294525 B6 o specifické antigenní peptidy viru Epstein-Baarové, viry HIV, viru hepatitidy B (EP 185 573), viru pseudovztekliny nebo také virů specifických nádorů (EP 259 212).
V molekulách DNA podle vynálezu gen terapeutického, vakcinálního, agronomického nebo veterinárního významu obsahuje zejména oblast promotoru transkripční funkce v buňce nebo v cílovém organizmu stejně jako oblast umístěnou na 3' konci, která určuje signál konce transkripce a místo polyadenylace. Co se týče oblasti promotoru, může se jednat o oblast promotoru přirozeně odpovědnou za expresi požadovaného genu, když tento gen je schopný fungovat v buňce nebo organizmu. Může se také jednat o oblasti různého původu (odpovědné za expresi dalších proteinů nebo stejných syntetických). Může se zejména jednat o sekvence promotorů eukaryontních genů nebo virových genů. Například se může jednat o sekvence promotorů, vzešlých z genomu cílové buňky. Mezi eukaryotními promotory se může použít každý promotor nebo každá odvozená sekvence, stimulující nebo potlačující transkripci genu specificky nebo nespecificky, induktivně nebo neinduktivně, silně nebo slabě. Může se jednat zejména o promotory ubiquitinové (promotory genů HPRT, PGH, α-aktin, GFAP, destin, vimentin, neurovlákna keratin atd.) promotory terapeutických genů (například promotor genů MDR, CFTR, Faktor VIII, ApoAI atd.) specifický tkáňový promotor (promotor genu pyruvat-kinázy, vilinu, vazebného intestinálního proteinu na mastné kyseliny, α-aktin hladkého svalstva atd.) nebo také promotory odpovídající stimulům (receptor steroidních hormonů, receptor retinové kyseliny atd.). Může se také jednat o sekvence promotorů, vzešlých z genomu viru, například promotory genů El A a MLP adenoviru, raný promotor CMV nebo také promotor LTR RSV atd. Mimoto tyto oblasti mohou být modifikované adicií aktivační sekvence, regulací sekvence neboli umožňující expresi tkáňově specifickou nebo majoritní.
Jinak gen zájmu může také obsahovat signální sekvenci řídicí produkt, syntetizovaný v sekrečních prostředcích cílové buňky. Tato signální sekvence může být přírodní signální sekvence syntetického produktu, ale může se také jednat o každou jinou funkční signální sekvenci nebo o umělou signální sekvenci.
Podle genu zájmu, molekuly DNA podle vynálezu mohou být použity pro léčení nebo prevenci počtu patologií, včetně genetických onemocnění (dystrofie, cystické atd.) neurodegenerativních nemocí (alzheimer, parkinsonm, ALS atd.) rakovin, patologií spojených s poruchami koagulace nebo dyslipoproteinemie a počtu patologií spojených s virovými infekcemi (hepatitidy, AIDS atd.) nebo patologií v oblastech agronomických a veterinárních atd.
Jinak se předložený vynález týká použití molekul DNA s podmínečnou replikací pro produkci rekombinantních proteinů. Bakterie mohou být použity pro tvorbu proteinů různých původů eukaryontů nebo prokaryontů. Mezi bakteriemi E. coli tvoří vybraný organizmus pro expresi heterologních genů vzhledem k jeho snadné manipulaci důležitý počet systémů exprese, použitelných pro množství proteinů, které se mohou získat. Očekává se, že systém podle vynálezu je použitelný v dalších organizmech, a že trophizmus je určen povahou počátku replikace, jak je naznačeno dříve. Pro toto použití nukleová sekvence zájmu obsahuje kódovanou oblast pod řízením signálů exprese vybraného vhodného hostitele, zejména prokaiyontního hostitele. Může se jednat například o promotory Plac, Ptrp, PT7, Ptrc, Ptač, PL, PR, sekvence Shine-Dalgamo atd. (to dohromady tvoří kazetu exprese). Sekvencí nukleové kyseliny zájmu může být každá sekvence kódující protein, který má význam v oblastech farmacie, agroalimentačních oblastech, v oblastech chemie nebo agrochemie. Může se jednat o strukturní gen, o komplementární sekvence DNA, o syntetické sekvence nebo semisyntetické atd.
Kazeta exprese může být začleněna na vektoru podmínečné replikace vynálezu, tvořící tedy vektor podmínečné replikace, umožňující expresi proteinů zájmu u E. coli. Tento vektor představuje více výhod: žádné použití antibiotik pro selekci u bakterií (menší náklady, není nutná studie, co se týče přítomnosti antibiotik v konečném produktu nebo co se týče odvozených produktů potenciálně toxických), prakticky nulová pravděpodobnost roznášení plazmidů v přírodě (podmí
-9CZ 294525 B6 nečný počátek replikace), možná fermentace v úplném definovaném médiu. Uvedené příklady ukazují výhodné vlastnosti těchto podmínečných vektorů pro tvorbu rekombinantních proteinů.
Následující obrázky a příklady blíže ilustrují vynález, aniž by však vjakémkoliv směru omezovaly jeho rozsah.
Legenda k obrázkům
Obrázek 1: Funkční organizace oblasti R6K, zahrnutého do replikace.
Obrázek 2: Organizace funkční domény proteinu π plazmidu R6k.
Obrázek 3: Znázornění protokolu vložení genu pir do genomu E. coli XAC1.
Obrázek 4: Schéma konstrukce vektorů pXL2666, 2730 a 2754.
Obrázek 5: Konstrukce pXL2774.
Obrázek 6. Kinetika růstu a produkce ve dvoulitrovém fermentoru.
Obrázek 7: Kinetika růstu a produkce ve fermentoru o obsahu 800 1.
Obrázek 8: konstrukce pXL3056.
Obrázek 9: Zviditelnění proteinu aFGF produkovaného E. coli XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol 123) po indukci. Buněčné extrakty úplně denaturované jsou umístěny na polyakrylamidovém gelu 12,5%-SDS. M: značení molekulové hmotnosti (Biorad, Low range). Každý pruh je identifikován šipkou a číslem, které označuje jejich hmotnost v kDaltonech. 1: XAC-lpir-116 (pXL3056+pUC4K) neindukovaný, 2: XAC-lpir-116 (pXL3056+pUC4K) indukovaný 42 °C, 3: XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7poll23) klon 1, neindikovaný, 4: XAClpir-116 (pXL3056+PT7poll23) klon 1, indukovaný 42 °C, 5: XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7poll23) klon 2, indikovaný 42 °C, tl: 1 pg purifikovaného aFGF, t4: 4 pg puntíkovaného aFGF.
Obrázek 10: Schéma konstrukce vektorů PXL3029 a pXL3030.
I-MATERIÁLY A METODY
A) Materiál
1) Kultivační půda
Byla použita úplná půda LB, 2XTY a SO a minimální půda M9 (Maniatis et al., 1989). Gelózové půdy byly získány přídavkem 15 g agaru Difco. Tyto půdy byly doplněny antibiotiky, ampicilinem nebo kanamycinem v koncentracích 100 mg/1 ampicilinu a 50 g/1 kanamycinu. Chromogenní substráty X-Gal a X-Gluc byly použity v koncentraci 40 mg/1.
2) Kmeny E. coli, plazmidy a bakteriofágy
Použité kmeny E. coli, plazmidy a bakteriofágy jsou identifikované v následujících příkladech.
B) Metody
1) Zacházení s DNA
Izolace bakteriální DNA (plazmidová, genomická) a fágové DNA (replikační forma Ml3), digesce endonukleázami restrikce, vázání fragmentů DNA, elektrofcréza na agarose (pufr TBE) a jiné standardní techniky byly provedeny podle doporučení dodavatelů pro použití enzymů nebo
-10CZ 294525 B6 byly přizpůsobeny popsaným protokolům v „Molecular Cloning“ a Laboratory Manual“ (Maniatis et al., 1989).
Markéry velikosti použité DNA během elektroforézy jsou následující: stupnice měřítko lkbp (BRL) pro lineární fragmenty a markér silně svinuté DNA (Stratagene) pro neřízené plazmidy.
Sekvenování bylo provedeno podle Sangerovy techniky (Sanger et al., 1977) přizpůsobené automatizované metodě, která používá fluorescenční dideoxynukleotidy a Tag DNA-polymerázu (PRISM Ready Reaction DyeDideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems).
Použité oligodeoxynukleotidy (popsané „seq+n°“, viz dále) byly syntetizovány na syntetizátoru „Applied Biosystems 394 DNA/RNA synthetizer“ fosforamiditovou metodou, používající chránící skupiny β-kyanoethyly (Sinha et al., 1984). Po syntéze byla chránící skupina odstraněna působením amoniaku. Dvě srážení butanolem umožňují purifikovat a koncentrovat oligonukleotid (Sawadogo et al., 1991).
Oligonukleotidové sekvence použité pro amplifikaci PCR:
SEQ ID N°3
SEQ ID N*4
SEQ ID N’5
SEQ ID N°6
5' -GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3'
5' -GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3'
5'-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3'
5'-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3'
Reakci PCR (Saiji et al., 1985) byly provedeny za následujících podmínek ve 100 μΐ objemu. Reakční směs obsahovala 150 ng genomické DNA studovaného kmenu, 1 pg, každého ze dvou oligonukleotidů (24-mer), 10 μΐ pufru 10XPCR, jehož složení bylo následující „500 mM K.C1, 0,1% želatiny, 20 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7,5“ a 2,5 jednotek Taq DNA-polymerázy (Amplitaq Perkin-Elmer). Podmínky pro PCR na přístroji Perkin-Elmer Cetus DNA Therminal Cycler byly následující: 2 minuty při 91 °C, 30 cyklů nepřetržité denaturace (1 minuta při 91 °C), hybridace (2 minuty při 42 °C) a elongace (3 minuty při 72 °C) a konečně 5 minut při 72 °C. Takto získané produkty, řízené nebo neřízené enzymem restrikce, byly analyzovány elektroforézou na agarosovém gelu.
Analýza různých druhů plazmidů DNA topo-izomerázou byla provedena podle následujícího protokolu: Enzymy purifikované v laboratoři se inkubovaly během jedné hodiny při teplotě 37 °C. Reakční směs (celkový objem 40 μΐ) měly následující složení: 150ng plazmidů, 300 ng DNA-topoizomerázy I, nebo 150 ng DNA-gyrázy E. coli nebo 160 ng DNA-topoizomerázy IV S. aureus a 20 μΐ pufru specifického pro každý enzym. Složení pufrů je naznačeno dále:
pro DNA-topoizomerázu I: 50 mM Tris-HCl pH 7,7, 40 mM KC1, 1 mM DTT, 100 pg/ml SAB, 3 mM MgCl2, 1 mM EDTA, pro DNA-topoizomerázu IV: 60 mM Tris-HCl pH 7,7, 10 mM DTT, 100 pg/ml SAB, 6 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 350 mM glutamát de potassium, pro DNA-gyrázu: 50 mM Tris-HCl pH 7,7, 5 mM DTT, 100 pg/10 SAB, 5 mM MgCl2, 20 mM KC1.
2) Transformace E. coli
Transformace byla provedena běžně podle metody TSB (Transformation and Storage Buffer), popsané Chungem a Millerem (1988). Pro kmen jako je TG1 (Gibson et all., 1984) účinnost
-11CZ 294525 B6 získané transformace se pohybuje v rozmezí 105-106 transformantů na pg pUC4K (Vieira et Messing, 1982). Když bylo nezbytné zvýšit účinnost transformace, bakterie byly transformovány elektroporací podle doporučeného protokolu výrobce elektroporátoru (Biorad). Tato metoda neumožňuje dosáhnout účinnost až 108 až 1010 tranformantů jedním pg pUC4K.
3) Buněčná transfekce kationickým lipefektantem
Použité buňky byly myší fibroblasty NIH 3T3, zaočkované předchozí den na desky se 24 jamkami, denzity 50 000 buněk na jamku. Použité kultivační médium bylo médium DMEM, které obsahovalo 4,5 g/1 glukózy, doplněno 200 mM glutaminu a antibiotiky (5.10'3 pg/ml streptomycinu, 5.103 pg/ml penicilinu) (Gibco). Plazmatická DNA (1 pg ve 25 pl 9% roztoku NaCl) byla přimíšena, objem/objem, k suspenzi lipofektantu. Byly testovány čtyři poměry náboj lipofektantu/náboj DNA, a to 0, 3, 6 a 9. Tyto poměry byly vypočítány, když se uvažovalo, že 1 pg plazidové DNA nese 3,1 nmolů negativního náboje a že lipofektant obsahuje tři pozitivní náboje na molekulu. Po desetiminutovém kontaktu, který umožňuje tvorbu komplexu DNA/lipid, 50 pl směsi DNA-lipofektant bylo vloženo na buňky v kultivačním médiu bez séra (500 pl). Buňky byly předem dvakrát propláchnuty stejným médiem. Tak bylo zabráněno inhibici transfekce sérem. Po inkubaci (2 hodiny při teplotě 37 °C v inkubátoru za přítomnosti CO2) bylo přidáno 10 % séra z telecích jater. Buňky byly potom opět umístěny k inkubaci po dobu 24 hodin.
4) Měření aktivity luciferázy eukariontních buněk
Měření bylo provedeno 24 hodin po transfekci. Luciferáza katalyzuje oxidaci luciferinu v přítomnosti DNA, Mg2+ a O2 za současného vzniku fotonu. Úplná emise světlaje měřena luminometrem a je úměrná aktivitě luciferázy ve vzorku. Použité reagenty pocházejí od firmy Promega (Luciferase assay systém) a jsou použity podle doporučeného protokolu. Po lýzy buněk, nerozpustné frakce každého extraktu byly odděleny odstřeďováním. Dávkování bylo provedeno na 5 pl supematantu zředěném nebo nezředěném v pufru pro lýzu buněk.
5) Měření proteinové koncentrace buněčného extraktu
Měření bylo provedeno podle metody BCA (Piece) (Wiechelman et al., 1988). Etalon stupnice SAB byl vypracován v pufru pro lýzu (viz III—B—4). Dávky vzorků a jejich stupnice byly předem zpracovány, objem/objem s jodoacetamidem 0,1/pufr Tris 0,1 M, pH 8,2 během jedné hodiny při teplotě 37 °C. Toto zpracování umožňuje vyhnout se poruchám během dávky redukčního agenta (DTT), přítomného v pufru k lýze. Odečet dávky se provádí při 562 nm.
Příklad 1
Konstrukce hostitelského kmenu XAC-lpir a pir-116 obecnou rekombinací
Použitý kmen je kmen E. coli XAC-1 (Normanly et al., 1980). Výhodně gen argE tohoto kmenu obsahuje mutaci Glutamin-53 (GAC) v kodonu amber (TAG) (Meinnel et al., 1992). Gen argE patří k odlišnému operonu argECBH a kóduje enzym N-acetylomithinázu biosyntézy argininu. XAC-1 nemůže tedy syntetizovat arginin a tudíž se vyvíjí v mimální půdě. Tato auxotrofie bude odstraněna, jestliže kmen kryje plazmid, který umožňuje expresi tRNA supresoru. Bude tedy možné kultivací v minimálním médiu vybrat bakterie, které nesou takovýto plazmid. Aby tam umožnil replikaci plazmidů odvozených od R6K, bylo nezbytné vložit, obecnou rekombinací, gen pir do genomu XAC-1. gen pir (divoký nebo mutovaný) je vložen do uidA výměnou mezi divokým genem uidA a přerušenou kopií genem pir (nebo pir-116). Gen uidA kóduje β-glukuronidázu, enzym hydrolýzy β-glukuronidů. Tento gen může být aktivován bez problémů, protože není podstatný pro růst v prostředí klasické syntézy, ve které β-glukuronidy nejsou použity.
-12CZ 294525 B6
Aktivita β-glukuronidázy může být soustavná díky chromogennímu substrátu, X-Gluc, jehož hydrolýza uvolňuje modré barvivo.
1) Konstrukce sebevražedného vektoru, nesoucího kazetu KmR-uidA::pir (nebo pir-116)
Byla použita strategie, která zahrnuje jednu hostitelskou bakterii a která minimalizuje modifikace genomu kmenu zájmu. Fág M14mpl0 (Messing et Vieira, 1982) byl použit jako sebevražedný vektor (Blum et al., 1989). Mutace ambře v genu II, podstatném pro replikaci, snižuje spektrum hostitele tohoto fágu Ml3 v těchto kmenech, TG1 (supE), které produkují supresorovou tRNA amber, mohly by se tak replikovat v kmenech E. coli sup+, jako XAC-1.
Kazety BtwwHI 3,8 kpb, které obsahují rezistentní gen ke kanamycinu Tn5 a -uidA::pir nebo pir-116 byly purifikovány od M13sm34 (~uidA::pir) a 33 (pir—116) (Metcalf et al., 1994). Byly klonovány v M13mpl0 linearizované BíwmHI. Rekombinantní klony byly vybrány rozložením na želatinové půdě LB + Km po elektroporaci ve TG1 spojovací směsi. Podoba klonů byla prokázána analýzou profilu restrikce a sekvenováním oblasti odpovídající mutacipir-116.
2) Vložení pir nebo pir-116 do genomu E. coli XAC-1 obecnou rekombinací genů.
Přijatá strategie a různé zahrnuté děje jsou uvedeny na obrázku 3.
a) První děj rekombinace
Kmen XAC-1 byl transformován elektroporaci a 10, 100 nebo 2000 ng každého RF (mp\0-_uidA::pir nebo pir-116). Třetina každé směsi exprese byla rozložena na miskách LB, které obsahovaly kanamycin a inkubována přes noc při teplotě 37 °C. Fágy mp\Q-_uidA::pir nebo pir-116 se nemohou replikovat v kmenu XAC-1 (sup+). Značení KmR se tak může udržet jen integrací do genomu bakterie, přes obecnou rekombinací s divokou kopií genu uidA. Získané výsledky elektroporace se pohybovaly od 4.109 transformantů jedním pg pUC4K.
Tabulka 1:
KONSTRUKCE Počet získaných kolonií s množstvím transformované DNA
10 ng 100 ng 2000 ng
M13mplO-uidA::pír 1 41 146
M13mplO-uidA: :pir~116 0 16 124
V testovaných podmínkách počet integrantů stoupá nelineárně s množstvím DNA. Ze znalosti účinnosti transformace a velikosti RF (11,7 kpb) lze odhadnout přibližnou výši rekombinace. Když se uvažuje hmotnost 100 ng, získá se frekvence rekombinace o řádu 106.
b) Druhý děj rekombinace
Druhý děj rekombinace bude potom vybrán rezistencí kmenů kdeoxycholátu (DocR).
Pro toto provedení 5 integrantů každé konstrukce bylo položeno do kultivační půdy 2XTY s přídavkem 0,2 % deoxycholátu sodného. Byly prokázány dvě odlišné populace. Určité klony poskytují dobře viditelné poruchy po 8 hodin při teplotě 37 °C (dva klony pro konstrukci pir a tři klony pro konstrukci pir-116). Jiné klony daly hustou kulturu jen po kultivaci přes noc při teplotě 37 °C. Jak se očekávalo, byly skoro všechny Kms. Pro každou studovanou elektroporaci bylo rýhováno 50 potomků KmS na LB přidané XGluc. Po 48 hodinách při teplotě 37 °C klony
-13CZ 294525 B6
UidA+ byly bleděmodře až když ty, které podstupují nahrazení alel (případ n°l, obrázek 3), zůstaly na tomto médium (UidA-) bílé. Tabulka shrnuje analýzu fenotypů rekombinace dvojnásobně získané. Nahrazení alely podstoupily dvojnásobní rekombinanti (od 18 do 30%).
Tabulka 2:
kmen počet Km3 mezi Docs % UidA mezi Kms
XAC-1 pir-2 50/50 18
XAC-1 pir-3 50/50 24
XAC-1 pir-4 50/50 34
XAC-1 pir-IIř-l 50/50 32
XAC-1 pir-27 6-4 35/50 30
3) Kontrola charakteru Pir+ rekombinací získaných kmenů
Za účelem přesvědčení se o charakteru Pir+ získaných kmenů dvojnásobnou rekombinací, byly tři klony každé konstrukce transformovány pBW30 (metcalf et al., 1994). Získání transformantů pro všechny testované klony umožnilo ukázat funkci genů pir a pir-116, začleněných do genomu XAC-1. Ze stejných podmínek nebyl získán žádný transformant s rodičovským kmenem XAC-1. Byla sledována studie dvou klonů XAC-lpzr (B a C) a dvou klonů XAC-lpir-116 (E a D).
4) Kontrola amplifikací PCR kmenů získaných rekombinací
Pro potvrzení nahrazení alely byla provedena kontrola amplifikací PCR genomických oblastí a uidA. Každá dvojice oligonukleotidů byla vytvořena jedním oligonukleotidem, odpovídajícím inertní oblasti pir, a druhým oligonukleotidem, odpovídajícím oblasti blízké chromozomální uidA, ale nezahrnutého do fragmentu, který slouží k rekombinací. Sekvence tohoto posledně jmenovaného oligonukleotidu byla určena díky sekvenci ECOUIDAA Genbank (přístupové číslo: Ml4641). Mohla se tak ověřit přesná pozice pir v genomu bakterie. Povaha amplifíkovaných fragmentů, jejichž velikost je souhrnná s velikostí, kterou lze předpovědět, byla potvrzena digescí M1UL.
Příklad 2
Konstrukce plazmidových vektorů odvozených od R6K, který nese markér selekce sup Phe
Byly zkonstruovány vektory, které obsahují 1 ori γ R6K a gen rezistentní ke kanamycinu (pXL2666). Pozorováním multimerů pXL2666 v kmeni BW19610 (pir—116) 5 (Metcalf et al., 1993) se připravilo ke studii vlivu fragmentu cer ColEl na tento fenoment. Potom byla představena na vektoru ori γ -KmR-cer (pXL2730) kazeta exprese tRNA supresoru Penylalaninu (sup Phe). Tento vektor, pXL2760, slouží jako báze ke konstrukci vektoru, použitelného v genové terapii.
1) Konstrukce a analýza vektorů, které obsahují ori γ RK6 a gen rezistentní ke kanamycinu
a) konstrukce
Do prvního vytvořeného plazmidu pXL2666 je zahrnut rezistentní gen ke kanamycinu, pocházející od pUC4K (Vieira et messing, 1982), a počátek replikace, obsažený ve fragmentu £coRI-£<amHI 417 pbd, pocházející ze sebevražedného vektoru pUT-T7pol (Herrero et al.,
-14CZ 294525 B6
1990) (Obrázek 4). Přenos pXL2666 do kmenu BW19094 a 19610 (Metcalf et al., 1994) umožnil ukázat, že množství plazmidu je zvýšené ve kmeni pir-116 vzhledem ke stejnému plazmidu v kmeni pir. Analýza nedigerovaných plazmidu elektroforézou ukazuje, že toto zvýšení vede zároveň k objevení jakýchsi multimemích forem. Pravděpodobně je tento jev spojený s intermolekulámí rekombinací mezi několikanásobnými kopiemi plazmidu. Také byl zkonstruován pXL2730 tím, že byl klonován na pXL2666 fragment cer přírodního plazmidu E. coli ColEl, u kterého bylo prokázáno, že umožňuje v cis rozdělení dimerů plazmidů (Summers and Sherrat, 1984). Použitý fragment odpovídá fragmentu Hpall 382 pdb ColEl (Leung et al., 1984). Obsahuje specifické místo intramolekulámí rekombinace, jedinečně zahrnuje, aby byl funkční, proteiny hostitele, jejichž rekombinázyjsou XerC a XerD a vedlejší faktory jsou ArgR a PapA (Stirling et al., 1988, 1989, Colloms et al., 1990). Po zajištění, aby pozorovaný účinek byl porovnatelný díky fragmentu cer, byl zkonstruován také kontrolní plazmid pXL2754, ve kterém fragment cer byl deletován 165 pbd. Tato delece ukázala, že došlo kjeho potlačení účinku cer na rozlišení multimerů (Leung et al., 1985). Různé etapy klonování, které vedou ke konstrukci těchto plazmidů, jsou uvedeny na obrázku 4.
b) Kvantitativní a kvalitativní analýza druhůplazmidů * analýza elektroforeticky na agarosovém gelu
Analýza různých zkonstruovaných plazmidů umožnila prokázání různých plazmidových druhů, rozdílných podle použitých kmenů. Velikost nedigerovaných plazmidů byla porovnána vzhledem k DNA silně svinuté. V kmeni pir (BW19094), plazmidy pXL2666, 2754 a 2730 jsou prakticky zcela ve formě menomemí. Pruhy pod každým hlavním pruhem odpovídají různým topoizomerům, nepatrně méně svinutým jako potvrzení pozorovaného profilu po účinku DNA gyrázy s pXL2730.
V případě kmene pir-116 (BW19610) jsou profily různé: pozorují se s plazmidy pXL2666 a 2754 různé druhy, které jdou od monomerů k multimerům (2, 3 nebo 4 jednotky), majoritní forma byla dimer. Po digesci £coRI se znovu nachází jen lineární plazmidová DNA, tyto plazmidové druhy odpovídají buď multimemím plazmidům, nebo různým topoizomerům. Co se týče velikosti forem, určených předem markérem DNA silně svinuté, které byly produktem monomemího plazmidu, je silně pravděpodobné, že se jedná o multimery. Tvorba multimerů lze velmi pravděpodobně přičíst mutaci pir-116, ačkoliv dva kmeny BW19094 a BW19610 nejsou striktně izogenní (BW19610 je recA). Získaný profil s pXL2730 je rozdílný: ačkoliv multimemí formy jsou ještě viditelné, majoritní forma je monomemí. Fragment cer může tedy ulehčit rozlišení plazmidových multimerů, které byly zkonstruovány, a to nezávisle na recA VBW19610.
* analýza pro působení DNA topoizomeráz
Za účelem popření hypotézy, podle které pozorované formy ve kmenech, které nesou alelu pir—116, budou zvláštními topoizomery, každá příprava plazmidu byla podrobena účinku DNAtopoizomeráz. Aktivity různých enzymů za experimentálních podmínek jsou následující: uvolnění DNA pro DNA-topoizomerázu I E. coli, silně svinutá negativní DNA uvolněna pro DNAgyrázu E. coli, a rozpletení spletené DNA a uvolnění DNA silně svinuté DNA-topoizomerázou IV S. aureus. Účinek DNA-topoizomerázy IV umožňuje ukázat, že plazmidová forma s vysokou molekulovou hmotností nevzniká ze spletení více molekul plazmidů, v tom případě by tak byly konvertovány na monomemí druh. Funkce enzymu byla ovšem kontrolována podle přípravy DNA kinetoplastů, složených z molekul DNA smotaných (neukázáno). Aktivita uvolnění je také viditelná, protože se získá druh migrující méně než v kontrole. Účinek DNA gyrázy umožnil přeměnit topo-izomery nepatrně uvolněné v druhu nejvinutějších extrahovat bakterie (monomer uvolněné v druhu nejsvinutějším extrahovat bakterie (monomer nebo zejména dimer). Umožnil ověřit, že připravené DNA jsou majoritních druhů pro každou konstrukci. DNA-topoizomeráza I rozpletla DNA, ale částečně. To by mohlo prokazovat, že studované plazmidy zahrnují jen málo zóny jednoduchých vláken na které se tyto enzymy přednostně váží (Roca, 1995).
-15CZ 294525 B6
2) zavedení markérů selekce sup Phe na pXL2730
Byla použita kazeta exprese genu tRNA syntetického supresoru (Phe) (Kleina et al., 1990). Gen byl vložen do polypeptidového řetězce za tvorby Phenyalaninu vzhledem ke kodonů TAG. V XAC-1 umožňuje produkci proteinu ArgE dostatečně aktivního pro umožnění růstu v prostředí ochuzeném o arginin. Na plazmidu pCT-2-F (Normenly et al., 1986) sup Phe byl exprimován od syntetického promotoru, odvozeného od sekvence promotoru genu Ipp E. coli, Plpp. Zastavení transkripce je zajištěno syntetickým terminátorem oreronu rrnC. E. coli, TrrC (Normanly et al., 1986). Na obrázku 5 jsou naznačeny různé etapy klonování.
Byly provedeny různé podklony v XAC-1. Funkce kazety exprese tRNA supresoru je tedy řízena díky aktivitě β-galaktosidázy tohoto kmenu, který existuje jen v případě suprese kodonů amber genu lacZuiigam. Poslední etapa spočívá ve vložení kazety exprese sup Phe na pXL2730. Získané výsledky s fragmentem cer (B-1-b) potvrzují výběr tohoto plazmidu než pXL2666. Byl zachován rezistantní gen ke kanamycinu pro jednoduchost dalšího klonování, zejména pro doplňkové uspořádání až k finálnímu klonování (ztráta KmR).
Příklad 3
Potvrzení plazmidového vektoru pro aplikace v genové terapii transfekcí myších fibroblastů
1) Konstrukce nosného vektoru pXL2774
Za účelem otestování platnosti v genové terapii systému produkce plazmidové DNA byl vložen na pXL2760 nosný gen, použitelný v eukaryontních buňkách. Byl použit gen luc, který kóduje luciferázu zPhotinus pyralis, protože test bioluminescenčního měření je velmi citlivý, a je lineární na velké stupnici a šum pozadí způsobený endogenní aktivitou eukaryontních buněk je velmi slabý. Gen luc je pod kontrolou sekvencí amplifikačního promotoru raného genu lidských cytomegalovirů (promotor CMV), který umožňuje zvýšenou expresi. Na 3'luc se nachází oblast nepřeložená, pocházející do viru SV40, která obsahuje signál poladenylace (poly(A)+). Po středním klonování, které umožňuje zvýšení počtu volných míst restrikce, kazeta „promotor CMV/wc-poly(A)+“ je vložena na minimální vektor ori y-cer-sup Phe (pXL2760) k místu markéru KmR. Výsledný plazmid byl nazván pXL2774. Obrázek 6 naznačuje různé etapy klonování. Spojovací směs byl transformována elektroporací do XAC-\pir-l 16. Po inkubaci, která umožňuje bakteriím expresi markérů selekce a provádí se v bohatém médiu (médium SOC), je nezbytné promýt buňky dvakrát médiem M9 před vystavováním. Toto umožní vyloučit zbytkové médium, které by mohlo mít za následek šum pozadí kultury na minimálním médiu.
Médium vybrané pro podrobení buněk elektroporací je minimální médium M9, které umožňuje selekci bakterií, které exprimují supresorovou tRNA a tedy přítomnost daného plazmidu. Přídavek X-Gal umožňuje modrým zbarvením zviditelnit expresi supresorové tRNA. Boxy jsou analyzovány po 20 hodinách při teplotě 37 °C. Nepřítomnost kolonií ve srovnávacím vzorku bez DNA zajistila, že selekce je správná i s hustým rozmnožením. Všechny pokusné klony restrikcí (8) nesou plazmid, odpovídající očekávanému profilu. Takto zkonstruovaný plazmid pXL2774 byl připraven od klonu kultivovaného v jednom litru tekutého média M9 (okolo 18 hodin při teplotě 37 °C) technikou nazvanou mezi jiným měnič iontů (souprava Promega, MegPreps). Množství vzniklé DNA je 2 mg.
2) Analýza nosného vektoru pXL2774 transfektovaného do savčích buněk
Schopnost pXL2774 transfektovat eukaryontní buňky a umožnit expresi luciferázy je zvýšena transfekcí do myších fibroblastů NIH 3T3. Vektor vybraná jako reference je plazmid pXLL2622 (jedná se o plazmid PGL2 Promega, jehož promotor SV40 byl nahrazen promotorem CMV),
-16CZ 294525 B6 který nese stejnou kazetu exprese luciferázy jako pXL2774, ale na odlišném replikonu. Je odvozen od ColEl 6,2 kpb, který nese gen rezistentní kampicilinu. Tento plazmid slouží jako srovnávací. Aktivaci luciferázy (Exprimovaná vRLU, čili relativní jednotky luminiscence) jsou naznačeny v tabulce 3.
Nej lepší výsledky byly získány s poměrem „náboj lipofektantu/náboj DNA“ 6, za těchto podmínek pXL2622 a 2774 se zdají být ekvivalentní.
Tabulka 3:
PXL2622 pXL2774
poměr nápojů RLU/pg proteinů na kyvetu průměr koeficient variací % RLU/pg proteinů na kyvetu průměr koeficient variací %
0 0,0 ND* 0,0 ND*
0,0 0,0
0,0 0,0
3 9,9 106 7,6 106 22 3,3 106 2,9 106 13
6,2 106 2,9 10°
6,6 106 2,4 106
6 1,2 107 1,5 107 19 9,4 106 1,0 107 Ί
1,5 107 9,9 106
1,9 107 1,1 107
9 9,5 106 1,0 107 26 1,1 10' 6,4 106 13
7,5 106 8,3 106
1,4 107 8,5 106
*nedetekovatelné
Příklad 4
Ověření charakteru sebevražedného vektoru u E. coli plazmidů pCOR
Nereplikační vlastnost plazmidů, odvozených od R6K typu pCOR, byla ověřena pokusem elektroporace do E. coli JM109 (Yanisch-Perrson et al., 1985) plazmidů pUC4K (ori ColElKmR, (Vieira et Messing, 1982) a pXL2730 (ori stupnice R6K-KmR, viz příklad 2). Použitý elektroporátor byl Gene Pulser Biorad a elektrokompetentní buňky JMI09 byly připraveny a použity podle doporučení dodavatele (Bacterial electro-transformation and pulse controller instruction manual, catalog number 165-2098).
Elektrotransformaované buňky byly vystaveny médiu LB s přídavkem kanamycinu (50 mg/1) a inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Získané výsledky jsou uvedeny dále.
Výsledky:
Plazmid transformované množství (ng) počet transformantů účinnost (počet transformantů/ng plazmidů)
pUCK4 0,01 »2000 >2105
pXL2730 5 0 0
Tyto výsledky ukazují, že je zde minimálně 5 log rozdílů mezi transformační účinností derivátu ColEl (pUC4k) vzhledem k derivátu R6K (pXL2730) ve kmeni, neexprimující gen pir. Ve kmeni pir+ i XAC-lpir-116 účinnost elektrotransformace plazmidů, odvozených od R6K přesahuje 108 transformantů/ na pg plazmidů.
-17CZ 294525 B6
Příklad 5
Produkce plazmidové DNA kulturou vysoké denzity kmene E. coli XAC-lpir-116 (pXL2774): Postup fermentace
5.1 Kmeny: Produkce v E. coli XAC-lpir-116 (příklad 1), produkce minimálního plazmidu pXL2774. Tento plazmid obsahuje následující elementy: ori R6K-cer-tRNAampsupPhe a kazetu exprese nosného genu lucpod řízením promotoru CMV (příklad 3). Byla vyvinuta metoda vysoké produktivity pro tvorbu tohoto typu plazmidů.
5.2 Kultivační médium a podmínky
a) růstové médium
- Složení definovaného média, použitého pro kultivaci inokula (g/1): Na2HPO4 6, KH2PO4 3, NaCl 0,5, NH4C1 1, NH4H2PO4 3, glukóza 5, MgSO4.7 H2O 0,24, CaCl2.2 H2O 0,015, thiamin HC10,01.
- Složení komplexního média, použitého pro kultivaci v fed-batch (g/1): KH2PO4 8, K2HPO4 6,3, Na2HPO4 1,7, (NH4)2SO4 0,74, NH4C1 0,12, kvasniční extrakt 3, glukóza 2, MgSO4 . 7 H2O 2,4 g/1, CaCl2.2 H2O 0,015, thiamin 0,01, roztok rolí (Fe, Mn, Co, Zn, Mo, Cu, B, AI).
- Složení definovaného média pro kultivaci v fed-batch médiu identické ke komplexnímu médiu, ale kvasniční extrakt je nahrazen 2,5 g/1 NH4C1.
b) Podmínky kultivace v fed-batch
Pokusy ve dvoulitrovém fermentoru (Setric France), který obsahuje 1 1 média, byly provedeny za účelem definování optimálních podmínek růstu a produkce plazmidové DNA. Fermentor byl zaočkován 80 ml inokula, které bylo odebráno při začátku stacionární fize růstu.
Během fermentace bylo pH automaticky kontrolováno a udržováno mezi hodnotami 6,9 a 7,0 10% amoniakem (p/obj.), teplota byla udržována na 37 °C, aerace byla udržována na hodnotě 75 1/h (1,1 vvm) pod tlakem 0,2 bar a rozptýlený kyslík byl kontrolován (40% saturace vzduchu) zpětným působením a rychlostí míchání a, bylo-li nutné, obohacením čistým kyslíkem.
Všechny tyto parametry (pH, teplota, míchání, OD, O2 a CO2 ve vytékajícím plynu) byly shromážděny a vypočítány prostřednictvím fázového rozhraní HP3852, spojeného s HewlettPackard 9000.
Základní sloužení výživného média je následující: Zdroj uhlíku 50 %, síran hořečnatý 0,7 %, thiamin 0,02 %, pro komplexní médium byl přidán kvasniční extrakt v koncentraci pohybující se mezi 5 a 10 %.
Aby se přizpůsobily kultivační podmínky fermentoru o obsahu 800 1, byla připravena dvě související inokula produkované sekvence, v laboratorním měřítku: inokulum I míchané vErlenmaerově baňce a inokulum II ve dvoulitrovém fermentoru (kultivace v batch), následovala kultivace v fed-batch akultivace v sedmilitrovém fermentoru.
5.3. Výsledky
Byly studovány různé kultivační podmínky v komplexním médiu, v definovaném médiu a v různých stupních růstu. Ve všech případech po iniciační kultivaci v batch bakteriálního kmenu a konzumaci zdroje uhlíku, výživné médium bylo mícháno ve fermentoru díky peristaltické pumpě, spojené s profilem předem naprogramovaným. Tento profil byl odvozen z vedlejších pokusů, ve kterých úroveň výživy byla přizpůsobena buď míře kyslíku nebo míře konstantního růstu.
-18CZ 294525 B6
Pro snadnou extrapolaci bez fermentačních podmínek od dvoulitrového do osmisetlitrového, aby nedošlo k zesílení prokysličení média, maximální požadavek na kyslík v konci kultivace byl udržován na hodnotě 2,5 - 3 mM/min. Proto úroveň růstu mikroorganizmu byla snížena, bylo-li to nutné, na začátku vyživování účinkem komplementárního náboje.
Jak je ukázáno v tabulce 4, byly získány velmi dobré výsledky zároveň v komplexním médiu a v definovaném médiu, a to v laboratorním měřítku osmdesátilitrového fermentoru, kinetika růstu a produkce plazmidové DNA jsou téměř srovnatelné (obrázek 6 a 7).
Tabulka 4:
komplexní půda definovaná půda
fermentor (2 1 nebo 7 1) fermentor (800 1) fermentor (2 1)
doba fermentace (hodiny) 40 39 48
ph-l 0,130 0,132 0,124
DO (600 nm) 114 100 94
Xg/1 44 37 30
plazmidové DNA (mg/1 půdy) 115 100 100
plazmidové DNA (mg/gX) 2,6 2,7 3,3
X = biomasa (váha sušených buněk)
Souhrnné výsledky zdůrazňují, že:
- změna měřítka dvoulitrového fementoru na osmsetlitrový může být provedena bez jakéhokoliv problému,
- spotřebovaný kyslík je silně závislý na produkci biomasy (1,08 CVg produkované biomasy),
- plazmid je stabilní alespoň během 50 generace bez tlaku selekce,
- může se získat zvýšení biomasy, zvýšení nad 40 g sušených buněk/litr, v komplexním médiu,
- produkce plazmidové DNA přesahuje 100 mg silně svinuté DNA/litr média,
- existuje velmi dobrá korelace mezi produkcí DNA a biomasou: může se stanovit produkce 1 mg plazmidové DNA/jednotku DO, nebo také 2,7 mg plazmidové DNA/g biomasy a nebo na délce fermentace,
- použití definovaného média umožňuje také předpokládat biomasu (30 mg sušených buněk/litr) a zvýšenou produkci plazmidové DNA (100 mg/1), a to bez ztráty produktivity.
Příklad 6
Přenos pXL2774 do zvířecích buněk in vitro a in vivo
6.1 Přenos in vitro pXL2774 do zvířecích buněk
Schopnost minimálního plazmidů pXL2774 transfektovat různé buněčné linie byla testována in vitro, jak na buňkách lidského původu, tak na buňkách myšího původu. Plazmid pXL2784 byl použit jako kontrola. Obsahuje stejnou kazetu eukaryotních exprese (promotor CMV-luciferázapolyA), jako pXL2774, ale tato kazeta je odvozena od ColEl 6,4 kb, který obsahuje gen, který uděluje rezistenci ke kanamycinu u E. coli.
-19CZ 294525 B6
Testované buňky jsou následující:
buňky typ ref. Atcc / lit.
3LL myši plicní karcinom
NIH 3T3 fibroblasty myšího embrya CCL92
293 ledvinové buňky lidského embrya transformované adenovirem typu 5 CRL1573
HeLa lidský karcinom děložního hrdla CCL2
Caco-2 lidský adenokarcinom tračníku HTB37
H460 lidský karcinom plic HTB177
ECV 304 lidské endotelni buňky pupeční šňůry Takahashi et al.,1990
Podmínky transfekce byly následující:
J-l: Rozmnožení buněk hustoty 100 000 buněk na kyvetu (2 cm2, plak má 24 kyvet) v médiu DMEM (Dulbecco's modified Eagle Medium) doplněné 10 % séra z telecích jater (SVF).
J-3. Transfekce buněk 10 μΐ transfekěního roztoku, který obsahuje: 0,5 pg DNA, 150 mM NaCl, 5% glukózu a 3 mmolů lipofektantu RPR120 535 na pg DNA v 250 pl kultivačního média, s přídavkem nebo bez přídavku 10% SVF.
J-4: Obnovení kultivačního média
J-5: Promyté buňky PBS, potom lyžované 100 pl pufru pro lýzu Promega (Promega Cell Lysis Buffer El53 A). Velikost aktivity luciferázy se měří v luminometru Lumat LB 9501 (Bordhold) na 10 pl lyzátu s integrační dobou 10 sekund. Použitý reaktant je reaktant, pocházející z Promega (Promega Luciferase Assay Substráte). Výsledky, uvedené v následujících tabulkách, jsou vyjádřeny v RLU (Relative Lights Unit) po 10 pl lyzátu (průměr měření ve 4 kyvetách).
Jsou také vyznačeny variační koeficient (CV).
Výsledky transfekcí v nepřítomnosti séra jsou uvedeny dále.
typy buněk
NIH 3T3 3LL 293
pXL 2774 37 763 380 16 559 270 25 1 884 200 7 3 RLU CV
pXL 2784 113 764 24 1 723 546 101 RLU CV
typy buněk
HeLa CaCo2 H460 ECV304
pXL 2774 11 OOO 000 15 1 108 422 14 1 459 501 5 36 450 23
pXL 2784 557 930 87 93 610 40 7 563 11 168 795 40
-20CZ 294525 B6
Výsledky transfekcí v přítomnosti séra (10%) jsou uvedeny dále:
typy buněk
NIH 3T3 3LL 293
pXL 2774 50 612 590 12 566 377 18 992 500 59
pXL 2784 12 693 780 38 436 704 12 2 300 000 47
typy buněk
Hela H460 ECV304
pXL 2774 9 490 000 25 857 385 16 18 021 30
pXL 2784 1 508 480 23 433 023 27 32 074 47
Tyto výsledky zdůrazňují vysokou schopnost pXL2774 ktransfekci in vitro buněčných typů různého původu jak myšího tak i lidského. Exprese nosného genu luc umožňuje ukázat, že jeho transfekční účinnost je alespoň tak dobrá, jako účinnost plazmidu „kladického“, odvozeného od ColEl, který nese stejnou kazetu exprese luciferázy.
6.2. Přenos in vivo u zvířat (myši) pXL2774
a) Model 1: DNA do myšího holenního svalu
Plazmidová DNA v roztoku „5% glukózy, 150 mM NaCl“ je injektovaná do myšího holenního svalu OF1. Svaly byly odebrány sedm dní po injektaci, rozemlety, homogenizovány v 750 μΐ pufru pro lýzu (Cell Lysis Buffer Promega El53A) a potom odstředěny při 20 000 g po dobu 10 minut.
Velikost aktivity luciferázy je měřena v 10 μΐ supematantu po přídavku 50 μΐ reaktantu (Prometá Luciferase Assay Substate). Odečet se provede na luminometru Lumat LB9501 (Berthold) s dobou integrace 10 sekund.
Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:
plazmid pXL 2784 pXL 2774 pXL 2784 pXL 2774
počet svalů 8 8 10 10
injektovaný objem (μΐ): 30 30 33 33
μς DNA/sval 19 13,5 10 6, 25
RLU (pro 10 μΐ)
průměr 80 922 471 733 35 329 30 569
odchylka 104 573 402 602 37 041 35 774
-21CZ 294525 B6
Tyto výsledky naznačují, že plazmid podmíněně replikovaný, jako je pXL2774, je schopný transfektovat myší svalové buňky in vivo, a to se srovnatelnou účinností dokonce i vyšší než plazmid „klasický“, odvozený od ColEl, který nese stejnou kazetu exprese genu luciferázy.
b) Model 2: model nádoru 3T3 HER2
Model je následující:
- myši typu Swiss/nude dospělé samice,
- experimentální nádory, indukované po injekci 107 buněk 3T3 HER podkožně na úrovni boku,
- injekce transfekční směsi je provedena 7 dní po injekci buněk.
Injektovaný roztok: DNA je nejdříve rozpuštěna v pufru. Po přídavku všech produktů směs obsahuje další DNA, NaCl (150 nM) a 5% D-glukózy ve vodě nebo v pufru HEPES 5 mM.
Dva dny po injekci nádorová tkáň byla odebrána, odvážena, potom rozemleta a homogenizována v 750 μΐ pufru pro lýzu (Promaga Cell Lysis Buffer El 53 A). Po odstřeďování (20 000 g po dobu 10 minut bylo odebráno 10 ml supematantu, který umožnil stanovit aktivitu luciferázy. Tato aktivita je určena měřením úplné luminiscenční emise, získané po smísení s 50 μΐ reaktantu (Promega Luciferasy Assay Substate) v luminometru Lumat LB 9501 (Berthold) s integrační dobou 10 sekund.
Výsledná aktivita, stanovená v supematantu tumorálního lyzátu, je vyjádřena v RLU (Relative Lighs Units).
pufr plazmid výsledek RLU/nádor +/n
H2O nebo HEPES odchylka pg/nádor [ADN] průměr odchylka
HEPES pXL 2784 10 0,5 μρ/μΐ 744 150 682 434 6/6
pXL 2774 10 0,5 pg/μΐ 1 016 380 1 322 500 5/6
H2O pXL 2784 24 0,6 pg/pl 2 906 073 1 745 857 8/8
pXL 2774 16,8 0,4 pg/μΐ 4 292 043 4 995 187 6/6
h2o pXL 2784 7,5 0,3 pg/pl 702 554 552 207 6/7
pXL 2774 5 0,2 μς/μΐ 3 413 430 4 000 875 6/6
Tyto výsledky indikují, že plazmid v replikačních podmínkách, jako je pXL2774, je schopný transfektovat myší nádorové buňky in vivo, a to s účinností alespoň srovnatelnou s účinností plazmidu „klasického“, odvozeného od ColEl, který nese stejnou kazetu exprese genu luciferázy.
Tyto různé pokusy umožnily ukázat, že plazmid v replikačních podmínkách, zejména pXL2774, vyjadřují transfekční vlastnosti zvířecích buněk, nezbytných pro použití v genové terapii. Zejména byla ukázána:
1) schopnost pXL2774 účinně transfektovat in vitro různé typy buněk původu lidského nebo myšího,
2) schopnost pXL2774 transfektovat in vivo myší sval,
3) schopnost pXL2774 transfektovat in vivo nádorové buňky, implantované u myší.
-22CZ 294525 B6
Elektrotransformační pokusy, fermentace a transfekce umožnily tedy uvést v platnost plazmidy v replikačních podmínkách jako vektory použitelné v genové terapii, tím že ukazují,
i) že se nereplikují detekovatelným způsobem v kmeni E. coli, neexprimující gen pir (podmínečný počátek replikace), ii) že mohou být produkty v měřítku kompatibilním s průmyslovou výrobou, v médiu, které může být úplně definováno a které neobsahuje antibiotika, iii) že tyto plazmidy mohou transfektovat in vitro a spíše in vivo savčí buňky.
Příklad 7
Produkce rekombinantních proteinů in vitro
7.1. Konstrukce expresního vektoru
Aby se prokázala proveditelnost takovéhoto přístupu, byl zkonstruován expresní vektor podle kritérií již dříve popsaných (příklad 2 a 3). Tento vektor pXL3056 obsahuje:
1) bakteriální část, která zahrnuje podmínečný počátek replikace (ori γ), fragmen cer ColEl a gen zajišťující selekci u bakterií (sup),
2) kazetu exprese, založenou na sytému, popsaném Studierem (Studier et al., 1990), obsahující promotor genu 10 bakteriofágu T7, operátor lacO, gen kódující aFGF 154 (acidic Fibroblast Growth factor neboli kyselý růstový faktor, fibroblastů, forma obsahuje 154 aminokyselin) (Jaye et al., 1986Ú terminátor TF bakteriofágu T7. Tato kazeta exprese je identická kazetě, přítomné na plazmidu pXL2434, popsaném v přihlášce vynálezu WO 95/08572.
Konstrukce pXL3056 je uvedená na obrázku 8. Fragment EcoRI-BglII pXL2434 (1,1 kb), obsahující kazetu exprese a FGF, je klonován do podmínečného replikačního vektoru pXL2979 (pufírikovaný fragment 1,1 kg) na místech BglII a EcoRI pro vytvoření pXL3056.
pXL2979 vzniká ze spojení třech fragmentů:
i) fragment AccI-Xbal pXL2730 (0,8 kb, který přináší ori γ a cer), ii) fragment Narl-Sall pXL2755 (0,18 kb, který přináší gen sup Phe) iii) fragment Sall-Spel pXL2660 (1,5 kb, který přináší gen, který uděluje rezistenci ke kanamycinu).
pXL2660 vzniká z klonování fragmentu Pstl 1,2 kb pUC4K (Vieira et Messing, 1982) v pMTL22 (Chambers et al., 1988) linearizovaný Pstl.
7.2 Získání kmenu exprese
Plazmid pXL3056 je vložen transformací do kmene XAC-lpic-116. Kmen, který vzniká, je potom transformovaný plazmidem PT7pol23 (Mertens et al., 1995) při teplotě 37 °C. Aby se gen zájmu exprimoval pod řízením promotoru T7, bakterie musí obsahovat ve svém genomu na plazmidu nebo bakteriofágu kazetu, umožňující expresi RNA polymerázy bakteriofágu T7. V popsaném příkladu jsme použiti plazmid PT7pol23, spojitelný s deriváty R6K, jako je pXL3056, a který umožňuje expresi indukovatelnou teplotou RNA polymerázy bakteriofágu T7. Může se také uvažovat o lýze kmene XAC-lpir-116 lambdou DE3 (Studie et al., 1990), aby se zachoval jen plazmid a o indukování produkce RNA polymerázy T7 spíše IPTG než teplotou.
-23CZ 294525 B6
7.3 Exprese aFGF
Kmen XAC-lpir-116 (pXL3056+PT7pol23) je kultivován při teplotě 37 °C v minimálním médiu M9 s přídavkem 0,2% kasaminokyselin (DIFCO) a kanamycinu (25 pg/ml) až optické hustotě 0,6-1 při 600 nm. Kultivační půda byla ínkubována při teplotě 42 °C (indukce RNA polymerázy T7) a druhé médium bylo inkubováno při teplotě 30 °C (negativní kontrola). Stejný pokud je proveden s kmenem XAC-lpir-116 (pXL3056+pUCK4), který obsahuje srovnání exprese aFGF v nepřítomnosti RNA polymerázy T7.
Získané výsledky jsou uvedeny na obrázku 9. Ukazují, že produkce aFGF je srovnatelná nebo vyšší s produkcí, pozorovanou u BL21(DE3)(pXL2434) (WO 96/08572), což ukazuje možnost plazmidů podmínečné replikace pro expresi rekombinantních proteinů in vitro zejména u E. coli.
Příklad 8
Konstrukce vektoru pCOR, který exprimuje divoký protein p53 nebo hybrid
Tento příklad popisuje konstrukci vektorů s podmíněnou replikací podle předloženého vynálezu, obsahující nukleovou kyselinu kódující protein p53. Tyto vektory jsou použitelné pro obnovení aktivity typu p53 ve vadných buňkách (mutovaných, deletovaných) takových, jako jsou zejména nádorové buňky.
Kazeta eukaryontní exprese obsahuje následující elementy:
1) raný promotor CMV „inmediate early“ (polohy -522 až +72), následuje za vedoucí sekvencí genu thymidinkinázy viru Herpes simples typ I (poloha genu -60 až +1, vzhledem k sekvenci uvedené v článku McKnight, S.L. (1980) Nucleic Acids Res. 8: 5949-5964),
2) nukleovou kyselinu, která kóduje divoký protein p53 nebo variantu proteinu p53 tak, jak je popsáno v přihlášce vynálezu PCT/FR96/01111 (varianta V325K = V325 se sekvencí Kozák ATG),
3) polyadenilační sekvenci póly A SV40.
Tyto elementy byly umístěny ve formě fragmentu Acsl-Xbal na vektoru pCOR pXL2988 mezi místy BssHII a sSpel. pXL2988 je identický pXL2979 (příklad 7.1). nehledě na přítomnosti doplňovacího elementu, sekvenci schopnou tvořit triplex DNA slouženou z 17-násobného trinukleotidu GAA, umístěnou vedle počátku replikace gama.
Výsledné plazmidy jsou pojmenovány pXL3029 a 3030 (obrázek 10).
Účinek těchto konstrukcí byla ověřena in vitro na buňkách p53-SA0S2 v kultuře měřením aktivity transaktivačního aktivátoru proteinu p53 nebo P53superWT.
Použitá literatura
Alting-Mees, M.A., J. A., Sorge, and. J. M. Short. 1992. Methods Enzymol. 216: 483-495. Blum, P., D., Hplzschu, H.S. Kwan, D. Riggs, and S. Artz. 1989. J. Bacteriol. 171: 538-546. Brosius, J. 1989. Methods Enzymol. 216: 469-483.
Chambers, S.P., S.E. Prior, D.A. Barstow, and N. P. Minton. 1988. Gene 68: 139-149.
Chung, C.T., and R.H. Miller. 1988. Nucleic Acids Res. 16: 3580.
Colloms, S.D., P. Sýkora, G. Szatmari, and D. J. Sherrat. 1990 J. Bacteriol 1972: 6973-6980.
-24CZ 294525 B6
Datta, N., and P. Kontomichalou. 1965 Nátuře 208: 239-241.
Dickley, F., D. Nilsson, E. B. Hansen, and E. Johansen. 1995. Mol. Microbiol. 15: 839-847. Filutowicz, M., S. dellis, I. Levchenko, M. Urh, F. Wu, and D. York, 1994. Prog. in Nucleic Acid Res. and Mol. Biol. 48: 239-273.
Gibson, T. J. 1984. Ph. D Thesis. University of Cambridge.
Greener, A., M. Filutowicz, M. McEachem, and D. Helinski. 1990. Mol. Gen. Genet. 224: 24-32. Herrero, Μ., V. de Lorenzo, and K.N. Timmis. 1990. J. Bacteriol. 172: 6557-6567.
Hodgson, C.P. 1995. Bio/Technology 13: 222-225.
Inuzuka, M., and Y. Wada. 1985. EMBo J. 4: 2301-2307.
Jaye, M. et al., (1986) Science 233: 541-5.
Kleina, L. G., J. M. Masson, J. Normanly, J. Abelson, and J. H. Miller. 1990. J. Mol. Biol. 213: 705-717.
Kowalczykowski, S.C., and A. K. Eggleston. 1994. Anmnu. Rev. Biochem. 63. 9991-10043. Leung, D., W., E. Chen, G. Cachianes, and D.V. Goeddel. 1985. DNA 4: 351-355.
Maniatis, T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook. 1989. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
Meinnel, T., E. Schmitt, Y. Mechulam, and S. Blanquet. 1992. J. Bacteriol. 174: 2323-2331. Mertens, N., E. Remaut and W. Fiers. (1995) Bio/Technology 13: 175-179.
Messing, J., and J. Vieira, 1982. Gene 19: 269-276.
Metcalf, W.W., W. Jiang, and B. L. Wanner. 1994. Gene 138: 1-7.
Miller, V.L., and J. J. Mekalanos. 1988. J. Bacteriol. 170: 2575-2583.
Normanly, J., J. M. Masson, L. G. Kleina, J. Abelson, and J. H. Miller, 1986. Proč. Nati. Acad. Sci.USA 83: 6548-6552.
Normanly, J., J. M. Masson, L.G. Kleina, J. Abelson, and J. H. Miller. 1990. J. Mol. Biol. 213: 719-726.
Roca, J. 1995. TIBS 20: 156-160.
Saiki, R.K., S. Scharf, F. Faloona, K.B. Mullis, G. T. Hom, H. A. Erlich, and N. Amheim. 1985. Science 230: 1350-1354.
Sanger, F., S. Nicklen, and A. R. Coulson. 1977. Proč. Naltl. Acad. Sci USA 74: 5463-5467. Sowadogo, M., and M. W. Van Dyke. 1991. Nucleic Acids Res. 19: 674.
Scott, J. R. 1984. Microbiol. REv. 48: 1-23.
Simoes, D.A., M. Dal Jensen, E. Dreveton, M. O. Loret, S. Blanchin-Roland J. L. Uribelarrea, and J. M. Masson. 1991. Ann. N. Y. Acad. Sci. 646: 254-258.
Simon., R., U. Priefer, and A Puhler. 1983. Bio/Technology 1: 784-791.
Sinha, N. D., J. Biemat, J. McManus, and H. Koster. 1984. Nucleic Acids Res 12: 4539-4557: Stirling, C. J., G. Stwart, And D. J. Sherrat. 1988. Mol. Gen. genet. 214: 80-84.
Stirling, C. J. S. D., Colloms, J. F. Collins, G. Szatmari, and D. J. Sherrat. 1989. EMBO J. 8: 1623-1627.
Studier, F.W., A. H. Rosenberg, J. J. Dunn, and J. W. Dubendorff (1990). Methods Enzymol 185: 60-89.
Summers, D. K., and D. J. Sherrat. 1984. Cell 36: 1097-11093.
Takahashi, K., Y. Sawasaki, J. Hata, K. Mukai and T. Goto. (1990) in Vigro Cell Dev. Biol. 26: 265-74.
Vieira, J., and J. Messing. 1992. Gene 19: 259-268.
Wiechelman, K., R. Braun, and J. Fitzpatrick. 1988. Anal. Biochem. 175: 231-237. Yanisch-Perron, C. Vieira, and J. Messing (1985) Gene 33: 103-119.
Seznam sekvencí (1) Všeobecné informace:
(i) podavatel:
(A) Jméno: RHONE-POULENIC RORER S.A.
(B) Ulice: 20, Raymond ARON
-25CZ 294525 B6 (C) Město: ANTONY (D) Země: Francie (E) Směrovací číslo: 92165 (G) Telefon: (1)40.91.69.22 (H) Fax: (1)40.91.72.96 (ii) název vynálezu: Molekula kruhové DNA s podmínečným počátkem replikace, postup její přípravy a její použití v genové terapii (iii) počet sekvencí: 6 (iv) způsob luštění počítačem:
(A) Typ počítače: Tápe (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) systém využití: PC-DOS/MS-DOS (D) logika: Patentln Relase #1.0, Version # 1.30 (OEB) (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 389 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 1:
TGTCAGCCGT TAAGTGTTCC TGTGTCACTG AAAATTGCTT TGAGAGGCTC 50
TAAGGGCTTC TCAGTGCGTT ACATCCCTGG CTTGTTGTCC ACAACCGTTA 100
AACCTTAAAA GCTTTAAAAG CCTTATATAT lU A Ulil CTTATAAAAC 150
TTAAAACCTT AGAGGCTATT TAAGTTGCTG a l 1 IΛ ; Λ , 1A ATTTTATTGT 200
TCAAACATGA GAGCTTAGTA CGTGAAACAT GAGAGCTTAG TACGTTAGCC 250
ATGAGAGCTT AGTACGTTAG CCATGAGGGT TTAGTTCGTT AAACATGAGA 300
GCTTAGTACG TTAAACATGA GAGCTTAGTA CGTGAAACAT GAGAGCTTAG 350
TACGTACTAT CAACAGGTTG AACTGCTGAT CTTCAGATC 389
(2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 960 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken:jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 2:
TATACAGAAT GATGAGGTTT TTTTATGAGA CTCAAGGTCA TGATGGACGT50
GAACAAAAAA ACGAAAATTC GCCACCGAAA CGAGCTAAAT CACACCCTGG100
CTCAACTTCC TTTGCCCGCA AAGCGAGTGA TGTATATGGC GCTTGCTCCC150
ATTGATAGCA AAGAACCTCT TGAACGAGGG CGAGTTTTCA AAATTAGGGC200
TGAAGACCTT GCAGCGCTCG CCAAAATCAC CCCATCGCTT GCTTATCGAC250
AATTAAAAGA GGGTGGTAAA TTACTTGGTG CCAGCAAAAT TTCGCTAAGA300
-26CZ 294525 B6
GGGGATGATA TCATTGCTTT AGCTAAAGAG TAAAAACTCC CCTGAAGAGT TAGATCTTAA ATTCAAATGA TGAAGGATAC TTGTCTTTAA CCATATATCT CTAGCCTTAT TGGGAAAAAA GTTAACGGCA AGCTTACGCT TAAGTAGCCA AACTTATCAG GAAGCATTAC TCTAATTTTA ATTTCCGTTG ATGAGTTAAA GGAAGAGTTA AGATGGAAAT ATTGAGTACA AATACCCTGA ATGTGTTAAA TAAAGCCATT GCTGAAATTA TTTGTTGGCT TCACTGTTCA TGAAAAAGAA GAAGTTCGAA TTTGTCGTTG ATGAAGATGA ATGAAGCTTT TTTTATGAAT TTATCTGAAG GTATTTAATG AAACCGTACC TCCCAAAAAA
CTTAACCTGC CCTTTACTGC 350
CATTATTGAG TGGATAGCTT 400
AATTCACCAG AACCATAGAA 450
AATAAATTCA CAACGCAATT 500
GTATTCATCT TCTCTTTATC 550
AGAAGAAAAA TTATTTTATT 600
ACAGCTTATA CTTTTGATAA 650
CTTTCCTATT TTTAAAAGGG 700
AAAAGAAAAC AGAAATATCG 750
GGAAGAAAAA TTAGTAAGCT 800
ATTTTCTGGC GATAAAGATG 850
CTGATGCAGC TTTTCTCAAG 900
GCTAAGGGGT C-ATATATGGC 950
TAAAATTTC
960 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 3:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 24 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA io (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 3:
GACCAGTATT ATTATCTTAA TGAG (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 4:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 24 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 4:
GTATTTATG AAACCGTACC TCCC (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 5:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 24 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 5:
CTCTTTTAAT TGTCGATAAG CAAG
-27CZ 294525 B6 (2) Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 6:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 24 párů bází (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: jedno (D) konfigurace: lineární (ii) typ molekuly: cDNA (xi) popis sekvence: SEQ ID NO 6:
GCGACGTCAC CGAGGCTGTA GCCG 24
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (38)

1. Molekula kruhové DNA, užitečná pro genovou terapii, která obsahuje alespoň jednu nukleovou sekvenci zájmu včetně regulačních signálů její exprese, přičemž její transkripce a případně translace v cílové buňce vytváří produkty, které mají terapeutický, vakcinační, agronomický či veterinární význam, kde oblast, která umožňuje replikaci molekuly DNA, obsahuje podmínečný počátek replikace, pocházející z plazmidu nebo bakteriofágu, jehož funkce v hostitelské buňce vyžaduje přítomnost alespoň jednoho specifického iniciačního proteinu replikace, který je cizorodým pro hostitelskou buňku, a molekula dále obsahuje gen pro selekční markér redukované velikosti, umožňující selekci hostitelských buněk, avšak neobsahuje gen kódující specifický iniciační protein replikace.
2. Molekula DNA podle nároku 1, kde podmínečný počátek replikace pochází zplazmidu nebo z bakteriofágu, které mají počátek replikace reprezentovaný několika introny, a které kódují alespoň jeden specifický protein podmiňující funkci počátku replikace.
3. Molekula DNA podle nároku 1 nebo 2, kde podmínečný počátek replikace pochází z plazmidů nebo bakteriofágů RK2, R6K, Rl, pSCIOl, Rtsl, F, RSF1010, Pl, P4, lambda, Phi82 a Phi80.
4. Molekula DNA podle nároků 1 až 3, kde počátek replikace pochází z bakteriálního plazmidu R6K.
5. Molekula DNA podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde počátek replikace je tvořen částečně nebo úplně počátkem replikace γ plazmidu R6K.
6. Molekula DNA podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde počátek replikace je vyjádřen částečně nebo úplně sekvencí SEQ ID N°1 nebo jakoukoliv sekvencí, která se liší od sekvence ID N°1 díky degeneraci genetického kódu, nebo jakoukoliv sekvencí, která hybridizuje s těmito sekvencemi nebo fragmenty těchto sekvencí, přičemž produkt těchto sekvencí má aktivitu specifického proteinu iniciace replikace.
7. Molekula DNA podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde oblast selekčního markéru, která umožňuje selekci hostitelských buněk s inkorporovanou molekulou DNA, je odlišná od genu rezistence k antibiotikům.
-28CZ 294525 B6
8. Molekula DNA podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde oblast, která umožňuje selekci hostitelských buněk s inkorporovanou molekulou DNA, je reprezentována částečně nebo úplně expresní kazetou pro supresorovou transferovou RNA pro specifické kodony.
9. Molekula DNA podle nároku 8, kde expresní kazeta je kazeta pro supresorovou tRNA kodonů amber (TAG).
10. Molekula DNA podle kteréhokoliv z předchozích nároků, která navíc obsahuje cílovou oblast pro regiospecifickou rekombinázu.
11. Molekula DNA podle nároku 10, kde cílová oblast pro regiospecifickou rekombinázu je vybrána ze skupiny, obsahující resolvázy transpozonů Tn3, Tn21 nebo Tn522, invertázy bakteriofágu mu, resolvázy plazmidů, jako např. kódovaná fragmentem parRP4. rekombinázy integrázové rodiny bakteriofágu lambda, jako např. integrázy lambda, phi80, P22, HP1, integráza CrePl, integrázu plazmidů pSAM2, FLP rekombinázu plazmidů 2μ a rekombinázy XerC a XerD z E. coli.
12. Molekula DNA podle nároku 10 nebo 11, kde cílová oblast regiospecifické rekombinázy obsahuje částečně nebo úplně fragment cer ColEl nebo menší fragment, který má stejné vlastnosti.
13. Molekula DNA podle kteréhokoliv z předchozích nároků, přičemž molekula je plazmid pXL2774, jak je uveden na obr. 5, nebo jakýkoliv jiný konstrukt, který je odvozen od pXL2774 podle obr. 5, obsahující jeden nebo více genů zájmu odlišných od genu luciferázy.
14. Molekula DNA podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde sekvence nukleové kyseliny zájmu kóduje protein farmaceuticky nebo agroalimentačně významný nebo použitelný v biokatalýze.
15. Molekula DNA podle nároku 14, kde sekvence nukleové kyseliny zájmu kóduje protein, vybraný ze skupiny, obsahující enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny: interleukiny, interferony, TNF, atd., růstové faktory, neuropřenášeče nebo jejich prekurzory nebo enzymy syntézy, faktory trofícké, jako BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, apolipoproteiny, jako ApoAI, ApoAIV, ApoE, dystrofin nebo minidystrofin, supresorové geny nádorů, jako p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, geny, kódující faktory, podílející se na koagulaci, jako Faktory VII, VIII, IX, sebevražedné geny, jako thymidinkináza, cytosin-deamináza, celek nebo část přírodního imunoglobinu nebo umělého imunoglobinu, jako je Fab, ScFv, RNA ligand, antimediátorovou sekvenci nebo specifické antigenové peptidy viru Epstein-Barrové, viru HIV, viru hepatitidy B, viru pseudorabies nebo také specifických nádorů.
16. Způsob přípravy molekuly kruhové DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy se kultivují hostitelské buňky, obsahující alespoň:
- molekulu kruhové DNA, obsahující alespoň nukleotidovou sekvenci zájmu a oblast umožňující její replikaci, obsahující počátek replikace, jehož funkce v hostitelské buňce vyžaduje přítomnost alespoň jednoho specifického proteinu, který je pro hostitelskou buňku cizorodý, a
- protein exprimovaný in šitu nebo neexprimovaný podmiňující funkci počátku replikace, specifický a cizorodý pro hostitelské buňky, v podmínkách, které umožňují selekci hostitelských buněk transformovaných molekulami DNA.
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že gen, kódující iniciační protein replikace, je přítomný na připojeném replikonu nebo včleněn do genomu buňky.
-29CZ 294525 B6
18. Způsob podle nároku 16 nebo 17, vyznačující se tím, že se jedná o molekulu DNA, obsahující počátek replikace, tak jak je definován v nárocích 4 až 6, a tím, že protein je buď totožný nebo odvozený od proteinu π plazmidů R6K, nebo se od tohoto proteinu liší modifikací jeho sekvence, kódované nebo tvořené fragmentem tohoto proteinu, přičemž má stejnou aktivitu.
19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že protein π nebo některý z jeho derivátů je exprimovaný in šitu z genu pir, reprezentovaného SEQ ID N°2, nebo jakoukoliv jinou sekvencí vzhledem k degeneraci genetického kódu odlišnou od SEQ ID N°2, nebo jakoukoliv sekvencí, která hybridizuje s těmito sekvencemi nebo s fragmenty těchto sekvencí, přítomnými v hostitelské buňce, přičemž produkt těchto sekvencí má aktivitu specifického proteinového iniciátoru replikace.
20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že protein je exprimován z genu pir 116, vloženého v genomu buňky.
21. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 16 až 20, vyznačující se tím, že jeden z genů hostitelské buňky, který je esenciální ve vybraných podmínkách kultivace, obsahuje specifický kodon, rozpoznatelný vybranou supresorovou tRNA na úrovni molekuly DNA.
22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že gen obsahuje kodon amber TAG.
23. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 16 až 22, vyznačující se tím, že buňka je vybraná z buněk kmenů E. coli.
24. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 16 až 23, vyznačující se tím, že buňka pochází z kmene E. coli XAC-1.
25. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 16 až 24, vyznačující se tím, že se užije kmen E. coli XAC-1, obsahující ve svém genomu inkorporovaný gen pir 116, transformovaný plazmidem pXL2774, který je uveden na obr. 5, nebo jakýmkoliv konstruktem, který je odvozen od pXL2774 podle obr. 5, obsahujícím jeden nebo více genů zájmu, odlišných od genu luciferázy.
26. Rekombinantní buňka, transformovaná alespoň jednou molekulou DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, nebo molekulou DNA, připravenou způsobem podle kteréhokoliv z nároků 16 až 25.
27. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje jednu nebo více molekul DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15.
28. Použití molekuly DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15 pro in vitro nebo ex vivo transfekci genu zájmu do hostitelské buňky.
29. Použití molekuly DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15 pro výrobu prostředku pro in vivo transfekci genu zájmu do hostitelské buňky.
30. Použití molekuly DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15 pro přípravu rekombinantních proteinů in vitro.
31. Způsob přípravy rekombinantního proteinu, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se kultivuje hostitelská buňka, obsahující alespoň:
-30CZ 294525 B6
- molekulu kruhové DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 a 15 nebo připravenou způsobem podle kteréhokoliv z nároků 16 až 25, a
- specifický iniciační protein, exprimovaný in sítu nebo neexprimovaný, podmiňující funkci počátku replikace, cizorodý pro hostitelské buňky, a vytvořený rekombinantní protein se potom sklízí.
32. Způsob podle nároku 31, vyznačující se tím, že gen, kódující iniciační protein replikace, je přítomný na vedlejším replikonu neboje včleněn do genomu buňky.
33. Způsob podle kteréhokoliv z nároku 1 nebo 32, vyznačující se tím, že buňka je vybrána z kmenů E. coli.
34. Molekula DNA podle nároku 1, kde nukleová sekvence zájmu kóduje divoký nebo modifikovaný protein p53.
35. Molekula DNA podle nároku 1, kde nukleová sekvence zájmu kóduje thymidin-kinázu.
36. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že buňka je buňka kmenu E. coli endAl.
37. Molekula DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, která obsahuje navíc sekvenci schopnou specifické interakce s ligandem.
38. Molekula DNA podle nároku 15, kde nukleová kyselina zájmu kóduje protein p53.
CZ1998788A 1995-09-15 1996-09-13 Molekula kruhové DNA s podmínečným počátkem replikace, způsob její přípravy a její použití při genové terapii CZ294525B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9510825A FR2738842B1 (fr) 1995-09-15 1995-09-15 Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ78898A3 CZ78898A3 (cs) 1998-06-17
CZ294525B6 true CZ294525B6 (cs) 2005-01-12

Family

ID=9482580

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ1998788A CZ294525B6 (cs) 1995-09-15 1996-09-13 Molekula kruhové DNA s podmínečným počátkem replikace, způsob její přípravy a její použití při genové terapii

Country Status (20)

Country Link
US (3) US6977174B2 (cs)
EP (3) EP1508620B1 (cs)
JP (3) JP3818665B2 (cs)
KR (1) KR100522369B1 (cs)
AT (3) ATE284966T1 (cs)
BR (1) BRPI9610511B8 (cs)
CA (1) CA2229307C (cs)
CZ (1) CZ294525B6 (cs)
DE (3) DE69636878T2 (cs)
DK (3) DK1508620T3 (cs)
ES (3) ES2357098T3 (cs)
FR (1) FR2738842B1 (cs)
HU (1) HU224400B1 (cs)
IL (4) IL123641A0 (cs)
NO (1) NO323975B1 (cs)
PT (3) PT850310E (cs)
SK (1) SK285317B6 (cs)
TW (1) TWI231826B (cs)
WO (1) WO1997010343A1 (cs)
ZA (1) ZA967640B (cs)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7038026B2 (en) * 2000-05-26 2006-05-02 Centelion Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide
FR2738842B1 (fr) * 1995-09-15 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique
US7279313B2 (en) * 1995-09-15 2007-10-09 Centelion Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
US6156574A (en) 1997-06-23 2000-12-05 The Rockefeller University Methods of performing gene trapping in bacterial and bacteriophage-derived artificial chromosomes and use thereof
US6821759B1 (en) 1997-06-23 2004-11-23 The Rockefeller University Methods of performing homologous recombination based modification of nucleic acids in recombination deficient cells and use of the modified nucleic acid products thereof
EP0991426B2 (fr) 1997-06-30 2007-03-28 Institut Gustave Roussy Procede de transfert d'acide nucleique dans le muscle strie
US6022716A (en) * 1998-04-10 2000-02-08 Genset Sa High throughput DNA sequencing vector
CA2336590A1 (en) * 1999-06-07 2000-12-14 Cell Genesys, Inc. Hybrid yeast-bacteria cloning system and uses thereof
WO2001005962A1 (en) * 1999-07-20 2001-01-25 The Rockefeller University Conditional homologous recombination of large genomic vector inserts
FR2821855B1 (fr) † 2001-03-09 2004-04-02 Cayla Genes synthetiques et plasmides bacteriens depourvus de cpg
FR2822476B1 (fr) * 2001-03-23 2004-04-02 Aventis Pharma Sa Procedes de purification et de detection de sequences cibles d'adn double brin par interaction triple helice
WO2003004088A2 (en) 2001-07-05 2003-01-16 Aventis Pharma S.A. Method of administration of a gene of interest to the heart and vasculature
US6989261B2 (en) * 2001-12-20 2006-01-24 Eli Lilly And Company Butyrylcholinesterase variant polypeptides with increased catalytic efficiency and methods of use
US7049121B2 (en) 2001-12-20 2006-05-23 Applied Molecular Evolution Butyrylcholinesterase variant polypeptides with increased catalytic efficiency and methods of use
FI116068B (fi) 2003-09-15 2005-09-15 Fit Biotech Oyj Plc Uusi selektiojärjestelmä, siinä käyttökelpoinen vektori, bakteerisolukantoja sekä menetelmä solujen valikoimiseksi
JP4581851B2 (ja) * 2004-07-27 2010-11-17 セイコーエプソン株式会社 電気光学装置の駆動回路及び駆動方法、電気光学装置並びに電子機器
US8202727B2 (en) * 2005-05-17 2012-06-19 Ozgene Pty Ltd. Sequential cloning system
WO2007030588A1 (en) * 2005-09-07 2007-03-15 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of replicators to prevent gene silencing
US20090053295A1 (en) * 2005-10-01 2009-02-26 Charles Stout Regulatable fusion promoters
GB0606190D0 (en) 2006-03-28 2006-05-10 Isis Innovation Construct
JP5774480B2 (ja) * 2008-07-18 2015-09-09 マックスサイト インコーポレーティッド 電気穿孔を最適化するための方法
EP2221066A1 (en) 2009-02-18 2010-08-25 Sanofi-Aventis Use of VgII3 activity modulator for the modulation of adipogenesis
CA2792696C (en) 2010-03-17 2020-01-07 Association Institut De Myologie Modified u7 snrnas for treatment of neuromuscular diseases
WO2012069657A1 (en) 2010-11-26 2012-05-31 Institut Pasteur Identification of a human gyrovirus and applications.
WO2013083753A2 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Institut Pasteur Identification of a swine parecho-like virus and applications
US9550998B2 (en) 2012-08-29 2017-01-24 Nature Technology Corporation DNA plasmids with improved expression
US20150322439A1 (en) * 2012-11-19 2015-11-12 Nature Technology Corporation Replicative minicircle vectors with improved expression
CN105555954B (zh) * 2013-03-14 2019-03-26 吉恩维沃公司 改进的胸苷激酶基因
EP3456821B2 (en) 2017-09-19 2024-01-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Non-integrating dna vectors for the genetic modification of cells
WO2019057774A1 (en) 2017-09-19 2019-03-28 Deutsches Krebsforschungszentrum NON-INTEGRATING DNA VECTORS FOR THE GENETIC MODIFICATION OF CELLS
SG11202009009UA (en) 2018-03-21 2020-10-29 Nature Tech Corporation Viral and non-viral nanoplasmid vectors with improved production
WO2023241567A1 (zh) * 2022-06-13 2023-12-21 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种可提高无筛选标签质粒制备效率的野生型-突变体π蛋白切换表达系统

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4190495A (en) * 1976-09-27 1980-02-26 Research Corporation Modified microorganisms and method of preparing and using same
US4342832A (en) * 1979-07-05 1982-08-03 Genentech, Inc. Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes
US4727028A (en) * 1981-06-22 1988-02-23 Eli Lilly And Company Recombinant DNA cloning vectors and the eukaryotic and prokaryotic transformants thereof
US4654307A (en) * 1983-02-17 1987-03-31 The Research Foundation Of State University Of New York Novel bacteria containing a plasmid having a tRNA code
US4761367A (en) * 1984-11-07 1988-08-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vectors suitable for detection of eukaryotic DNA regulatory sequences
US5859208A (en) * 1988-07-06 1999-01-12 Fiddes; John C. Human basic fibroblast growth factor analog
US5198343A (en) * 1986-08-05 1993-03-30 Transgene, S.A. Method for expressing a heterologous protein in a dapD- mutant of E. coli and the strain obtained
US5591632A (en) * 1987-03-02 1997-01-07 Beth Israel Hospital Recombinant BCG
US5510099A (en) * 1987-05-01 1996-04-23 Stratagene Mutagenesis testing using transgenic non-human animals carrying test DNA sequences
US5024939A (en) * 1987-07-09 1991-06-18 Genentech, Inc. Transient expression system for producing recombinant protein
US5693622A (en) * 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
JPH03187383A (ja) * 1989-09-04 1991-08-15 Takeda Chem Ind Ltd 発現プラスミドおよびその用途
EP0485701A1 (en) * 1990-09-28 1992-05-20 American Cyanamid Company Insertion of DNA by modified transposons
TW201794B (cs) * 1991-05-03 1993-03-11 American Cyanamid Co
US5714323A (en) * 1991-08-30 1998-02-03 The University Of Medecine And Dentistry Of New Jersey Over expression of single-stranded molecules
US5444149A (en) * 1992-05-11 1995-08-22 Duke University Methods and compositions useful in the recognition, binding and expression of ribonucleic acids involved in cell growth, neoplasia and immunoregulation
US5434065A (en) * 1993-05-06 1995-07-18 President And Fellows Of Harvard College In vivo selection of microbial virulence genes
AU7568094A (en) * 1993-08-12 1995-03-14 Cytotherapeutics, Inc. Improved compositions and methods for the delivery of biologically active molecules using genetically altered cells contained in biocompatible immunoisolatory capsules
US5679647A (en) * 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
US5700657A (en) * 1993-12-13 1997-12-23 Genzyme Corporation Vectors and vector systems including genes encoding tumor suppressor proteins and producer cells transformed thereby
IL109558A (en) * 1994-05-04 2004-08-31 Yissum Res Dev Co DNA structures Derived from the SV40 virus that include DNA sequences External
AU2946695A (en) * 1994-07-08 1996-02-09 Schering Corporation Method for identifying nucleic acids encoding c-fos promoter activating proteins
DE4428402A1 (de) * 1994-08-11 1996-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Gentherapeutisches Verfahren unter Verwendung von DNA-Vektoren ohne Selektionsmarker-Gen
US5792647A (en) * 1995-02-13 1998-08-11 The Johns Hopkins University Bacterial catabolism of chitin
US6254874B1 (en) * 1995-04-13 2001-07-03 President And Fellows Of Harvard College Attenuated auxotrophic microorganisms having a combination of non-attenuating mutations and method for making same
US5763270A (en) * 1995-06-07 1998-06-09 Genemedicine, Inc. Plasmid for delivery of nucleic acids to cells and methods of use
US7279313B2 (en) * 1995-09-15 2007-10-09 Centelion Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
FR2738842B1 (fr) * 1995-09-15 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique
US7364894B2 (en) * 1995-09-15 2008-04-29 Centelion Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
US5830879A (en) * 1995-10-02 1998-11-03 St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Treatment of vascular injury using vascular endothelial growth factor
US5851808A (en) * 1997-02-28 1998-12-22 Baylor College Of Medicine Rapid subcloning using site-specific recombination
US5874259A (en) * 1997-11-21 1999-02-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Conditionally amplifiable BAC vector

Also Published As

Publication number Publication date
FR2738842A1 (fr) 1997-03-21
EP1724354A3 (fr) 2008-10-29
EP0850310A1 (fr) 1998-07-01
CA2229307C (fr) 2013-06-11
HU224400B1 (hu) 2005-08-29
PT850310E (pt) 2005-05-31
BR9610511A (pt) 1999-01-26
JP2007325603A (ja) 2007-12-20
FR2738842B1 (fr) 1997-10-31
PT1724354E (pt) 2011-03-09
IL207348A0 (en) 2010-12-30
DE69638314D1 (de) 2011-02-03
EP1508620A1 (fr) 2005-02-23
ATE352630T1 (de) 2007-02-15
DE69634043T2 (de) 2005-08-18
SK285317B6 (sk) 2006-10-05
ATE284966T1 (de) 2005-01-15
AU728231B2 (en) 2001-01-04
CZ78898A3 (cs) 1998-06-17
HUP9900018A3 (en) 2001-10-29
US6977174B2 (en) 2005-12-20
US20010014476A1 (en) 2001-08-16
ES2233975T3 (es) 2005-06-16
ES2281721T3 (es) 2007-10-01
NO981044L (no) 1998-03-10
JP3818665B2 (ja) 2006-09-06
AU6992496A (en) 1997-04-01
EP0850310B1 (fr) 2004-12-15
KR19990044683A (ko) 1999-06-25
HUP9900018A1 (hu) 1999-04-28
EP1724354A2 (fr) 2006-11-22
EP1508620B1 (fr) 2007-01-24
JP2006136328A (ja) 2006-06-01
IL173399A0 (en) 2006-06-11
BRPI9610511B8 (pt) 2016-11-08
NO323975B1 (no) 2007-07-30
JP4756014B2 (ja) 2011-08-24
SK34798A3 (en) 1998-11-04
DK0850310T3 (da) 2005-04-25
MX9802005A (es) 1998-08-30
EP1724354B1 (fr) 2010-12-22
JP4585435B2 (ja) 2010-11-24
DK1724354T3 (da) 2011-04-04
NO981044D0 (no) 1998-03-10
DE69636878T2 (de) 2007-11-08
ES2357098T3 (es) 2011-04-18
US20090149406A1 (en) 2009-06-11
ATE492642T1 (de) 2011-01-15
JP2000501281A (ja) 2000-02-08
TWI231826B (en) 2005-05-01
US20090130674A1 (en) 2009-05-21
DE69634043D1 (de) 2005-01-20
WO1997010343A1 (fr) 1997-03-20
DE69636878D1 (de) 2007-03-15
IL123641A0 (en) 1998-10-30
IL123641A (en) 2006-06-11
BR9610511B1 (pt) 2010-10-19
PT1508620E (pt) 2007-05-31
IL173399A (en) 2010-11-30
CA2229307A1 (fr) 1997-03-20
ZA967640B (en) 1997-03-25
DK1508620T3 (da) 2007-05-29
KR100522369B1 (ko) 2006-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ294525B6 (cs) Molekula kruhové DNA s podmínečným počátkem replikace, způsob její přípravy a její použití při genové terapii
US7807444B2 (en) Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
US7364894B2 (en) Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
MXPA98002005A (en) Molecules of circular dna with origin of conditional replication, its process of preparation and its use in therapy gene

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20140913