DE3226515A1

DE3226515A1 - Expressionsvektoren

Info

Publication number: DE3226515A1
Application number: DE19823226515
Authority: DE
Inventors: James J. Anderson; Herman 20760 Gaithersburg Chu, Md.; Kevin M. 20034 Bethesda Ulmer, Md.
Original assignee: Genex Corp
Current assignee: Genex Corp
Priority date: 1981-08-10
Filing date: 1982-07-15
Publication date: 1983-02-17
Also published as: IT8267895A0; FR2511033A1; IT1156378B; IE53607B1; NL8202851A; IL66263A; IE821707L; GB2104901B; IL66263A0; JPS5838300A; AU8592582A; FR2511033B1; GB2104901A; BE893837A

Description

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PATENTANWÄLTE

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) · Dl PL.-I NG. W. EITLE . DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEHN

DIPL.-ING, K. FOCHSLE . DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABEILASTRASSE 4 . D-8000 M 0 NCHEN BI . TELE FON (089) »11087 · TELEX 05-29619 (PATHE)

37 190 m/hl

Genex Corporation,
Rockville, Maryland / USA

Expressionsvektoren

Die Erfindung betrifft Expressionsvektoren.

Auf dem Gebiet der Gentechnologie wird zur Erzielung der Expression eines fremden Proteins durch einen prokaryontischen Organismus im allgemeinen eine Methode angewandt, die darin besteht, daß der Organismus mit.einem Plasmid, das derart modifiziert wurde, daß es die genetische Information zur Spezifizierung des gewünschten Fremdproteins enthält, transformiert wird. Verschiedene eukaryontische Gene wurden mit Erfolg in Plasmide insertiert und veranlassen - nach Einführung in die prokaryontischen Organismen diese Organismen ein fremdes Protein zu exprimieren. In dieser Weise wurde von der Produktion menschlichen Interferons, menschlichen Wachstumhormons, menschlichen Insulins, Hühner-Ovalbumin, Somatostatin und dergl. durch genetisch modifizierte Stämme von Escherichi coli berichtet. Taniguichi, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 5230-5233 (1980); Villa-Komaroff, L. et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Ύ5_, 3727-3731 (1978); und Goeddel, D.V. et al. Nature, 28J[, 544 (1979).

Die Konstruktion eines Organismus, der in der Lage ist, ein Premdprotein zu exprimieren, schließt eine Anzahl von Schritten ein. Zu allererst wird das Gen, welches die Instruktionen für die Biosynthese des gewünschten Proteins -trägt, identifiziert und isoliert. Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von Genen unterscheiden sich deutlich voneinander, doch kann jedes Verfahren angewandt werden, bei welchem das gewünschte Gen in im wesentlichen reiner Form erhalten werden kann.

Eine häufig angewandte Methode zum Erhalt eukaryontischer Gene beginnt mit der Isolierung der Boten- oder messenger-RNA (mRNA) . Die Proteinsynthese wird in den Zellen durcli das Verfahren der Transkription initiiert, welches die enzymatische Synthese einer RNA-Kette, welche mit einem DNA-template korrespondiert, umfaßt. Die auf diese Weise gebildete RNA tritt in Wechselwirkung mit dem Proteinsynthetisierenden Apparat der Zelle, um das Protein zu produzieren. Die durch ein bestimmtes Gen spezifizierte RNA (und welche somit ein bestimmtes Protein spezifiziert), wird messenger-RNA genannt. Wenn die Zelle Protein produziert,liegt mRNA in viel größeren Konzentrationen vor als das Gen, welches die Protein-synthetisierende Information trägt. Zusätzlich liegt die mRNA im allgemeinen i einer -Form vor, die zur Isolation und Reinigung besser verfügbar ist als chromosomale DNA. Konventionelle Reinigungsmethoden, wie Dichtegradientensedimentation, Affinitäts-Chromatographie und Elektrophorese können angewandt werden, um mRNA aus Zelllysaten oder -homogenaten zu isolieren. Diese Methoden wurden z.B. angewandt, um Insulin-mRNA aus Pankreas-Zellen zu gewinnen

L C ü s/ IO

(Villa-Komaroff, L., et al., Literatur wie vorstehend) sowie Interferon-mRNA aus Human-L eukocyt (Goeddel, D.V. et al., Nature, 287, 411 (1980)) und Fibroblastzelllinien (Taniguchi, T., et al., Literatur wie oben).

Die so erhaltene mRNA kann dann verwendet werden, um ein einzelsträngiges DNA-Molekül herzustellen (bekannt als Komplementär-DNA (cDNA)) (Ullrich et al., Science, 196, 1313 (1977)). Das erhaltene einzelsträngige DNA-Molekül hat eine 3'-terminale Haarnadelstruktur, die einen Primer für die darauffolgende Synthese eines zweiten DNA-Stranges unter Verwendung des Enzymes DNA-Polymerase darstellt. Der Ring (loop), welcher die zwei DNA-Stränge verbindet, wird dann gebrochen (z.B. unter Verwendung des Enzymes Sl Nuclease), wodurch sich ein cDNA-Segment ergibt, welches identisch mit dem ursprünglichen Gen ist. Die erhaltene cDNA wird im allgemeinen isoliert und gereinigt, z.B. durch Gelelektrophorese, und ihre Struktur kann durch Sequenzanalyse oder Restriktionskartierung bestätigt werden. Die Enden der so erhaltenen DNA-Segmente können modifiziert werden, wie im nachfolgenden beschrieben wird, um die Insertion in einen Transfervektor zu erleichtern.

Gene können in prokaryontische Zellen via Transfervektoren, die im allgemeinen Plasmide oder Bacteriophagen darstellen, in welche das interessierende Gen insertiert worden ist, eingeführt werden. Wenn der Zweck der Einführung des Gens in einen Organismus darin liegt, das Gen zu amplifizieren (d.h. verwertbare Mengen des Gens durch Klonen zu erhalten), wird der Transfervektor manchmal als

"Klonierungsvektor" bezeichnet. Wenn der Zweck der Einführung des Gens in einen Organismus darin liegt, eine Proteinexpression zu erhalten, so wird der Transfervektor manchmal als "Expressionsvektor" bezeichnet. Die vorliegen-35

de Erfindung betrifft neue Transfervektoren, und insbesondere Plasmid-Expressionsvektoren. Plasmide sind relativ kleine geschlossene Ringe von DNA. Das zunehmende Verständnis der Wirkung der Restriktionsendonuklease-Enzyme und die Entdeckung und Isolierung einer Anzahl derartiger Enzyme machen es für den Molekularbiologen möglich, Plasmide zu charakterisieren und sie für eine verbesserte Verwertung als Transfervektoren zu modifizieren. So kann z.B.nicht gewünschte DNA weggelassen und so die Größe des Plasmids reduziert werden? Restriktionsstellen zur Insertion eines Gens können maßgeschneidert (tailored) werden; und selektierbare Gene, wie Antibiotikaresistenz, können in ein Plasmid insertiert werden.

Das reine "splicing" eines Gens in ein Plasmid sichert nicht die Proteinexpression. Die Proteinsynthese erfordert die Gegenwart verschiedener Kontrollsignale in der Nachbarschaft des Gens. Guarante, L., et al., Cell, 2Q_, 543-553 (1980). Diese· Signale iniziieren, regulieren und terminieren sowohl die mRNA-Transkription und die mRNA-Translation (d.h. Protein-Synthese) . Es wurde gefunden, daß Köntrollsignale, die in Verbindung mit der Synthese eines bestimmten Proteins durch ein Bakterium stehen, angewandt werden können zur Kontrolle der Synthese eines Fremdproteins durch ein Bakterium.

Diese Erkenntnis wurde mit Vorteil angewandt, um vielfältige Plasmid-Expressionsvektoren zu konstruieren. Roberts, T.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76>, 760-764 (1979); Guarante, et al., Literaturstelle wie vorstehend).

Die mit der Proteinsynthese assoziierten Kontrollsignale werden graphisch in Fig. 1 der Zeichnungen dargestellt, welche ein Segment einer doppelsträngigen DNA darstellt, assoziiert mit der Kontrolle der Enzyme, die bei der Biosynthese von Tryptophan (trp) involviert sind. "P" stellt

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- ίο -

eine Basenpaarsequenz dar, welche als die Promotorregion bekannt ist. Während der Proteinsynthese signalisiert die Promotorregion die Initiierung der mRNA-Transkription. "O" stellt eine Basenpaarsequenz dar, die als Operatorregion bekannt ist. Diese Region kontrolliert - in Verbindung mit einem Repressor - die Menge der mRNA-Transkription. Zum Beispiel tritt bei der Tryptophan-Biosynthese überschüssiges Tryptophan in Wechselwirkung mit einem Repressor und vermindert das Niveau von trp mRNA-Transkription. Obwohl die Promotor- und Operator-Regionen graphisch getrennt dargestellt sind, können einige Operatorregionen uUntersequenzen innerhalb einer Promotorsequenz darstellen. "S-D" stellt eine Basenpaarsequenz dar, die als Shine-Dalgarno-Sequenz bekannt ist. Diese Sequenz ist ein Signal, durch welche der Proteinsynthetisierende Apparat (das Ribosom) die mRNA erkennt. Somit ist die Shine-Dalgarno-Sequenz für die mRNA-Synthese nicht erforderlich, jedoch für die Proteinsynthese. "ATG" stellt den Methionin- oder Initiator-Codon dar. Dieser Codon ist das Signal für den Start der Proteinsynthese in Bakterien.

Diese Signale sind - zu einem großen Teil - idiosynkratisch, indem verschiedene Organismen verschiedene Codes verwerten. Wenn daher aus diesem Grunde ein eukaryontisches Gen, welches die eukaryontischen Regulationsregionen enthält, in ein Plasmid insertiert und dann in eine prokaryontische Zelle insertiert wird, kann es sein, daß die Zelle weder Protein noch mRNA exprimiert, aufgrund des Nichterkennens der erforderlichen KontrollSequenzen. Andererseits kann eine Promotor-Operator-Region, die assoziiert ist mit der Synthese eines bestimmten Proteins in einem prokaryontischen Organismus, an ein eukaryontisches Gen gebunden werden; ei*¹ Plasmid-Klon, der eine derartige Kombination enthält, kann den Protein-synthetisierenden Apparat eines derartiges prokaryontischen Organismus verwerten, um ein fremdes Protein zu exprimieren.

Von dieser Entdeckung haben die Molekularbiologen mit Vorteil Gebrauch gemacht, um die sogenannten".transportierbaren (portable) Promotoren" zu synthetisieren (Roberts, T.M., et al., Literaturstelle wie vorstehend). Derartige "portable" Promotoren, die in Fig. 2 illustriert sind, enthalten Promotor-, Operator- und Shine-Dalgarno-Regionen, die von einem bestimmten Wirtsorganismus erkannt werden können. Sie sind an jedem Ende von spezifischen ^λ Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen begrenzt, die es ihnen erlauben, nach geeigneter enzymatischer Behandlung herausgeschnitten und anderswo insertiert zu werden. Vorzugsweise haben einander gegenüberIiogande Enden eines derartigen "portable" Proinotors Basenpaarsequenzen, die mit verschiedenen Restriktionsenzymen korrespondieren. In Fig. 2 sind diese Enden mit X und Y markiert, wobei diese unterschiedlichen Restrik-

• tionsenzymen entsprechen, die willkürlich mit. X und Y bezeichnet worden sind. Eine solche Struktur gewährleistet die richtige Orientierung des portable Promotors in bezug auf das zu exprimierende Gen; es schafft auch eine einzige Insertionsstelle in dem resultierenden Plasmid (wie nachstehend diskutiert) . Ein Plasmid, wie es in Fig. 3 dargestellt ist, welches Restriktionsstellen X und Y aufweist, die mit jedem Ende des portable . .Promotors korrespondieren, kann durch Abbau (digestion) mit geeigneten Restriktionsenzymen geöffnet werden und der portable Promotor darin insertiert werden, z.B. unter Verwendung des Enzyms Ϊ4 Ligase. Das erhaltene Plasmid (Fig. 4) kann als ein Expressionsvektor verwendet werden.

Um einen solchen Expressionsvektor zu verwerten, wird das gewünschte Gen wie vorstehend beschrieben isoliert und seine Enden werden chemisch modifiziert, um Sequenzen entsprechend dem Y Restriktionsenzym aufzuweisen. Wenn das Gen keinen Initiierungs- und Terminierungscodon besitzt, muß jedes Ende so modifiziert werden, daß es derartige Coclons einschließt. Nach dem öffnen des Plasmids mit dem Restriktions-

enzym Y kann das modifizierte Gen insertiert werden, um das gewünschte Plasmid zu schaffen (Fig. 5).

Die Tranformation eines geeigneten prokaryontischen Organismus mit einem solchen Plasmid kann in einer Expression des fremden Proteins unter Kontrolle der Tryptophan-Kontrollsignale resultieren. In der Tat kann jegliche bakterielle Promotor-Operator-Shine-Dalgarno-Region für diesen Zweck eingesetzt werden.

Wie vorstehend erläutert sollten Gene, die in bisher bekannte Transfervektoren insertiert werden, Initiierungs- und Terminierungssxgnale tragen. Im Falle der Terminierungssignale ist dieses Erfordernis nicht besonders schwierig *> zu handhaben, da beim Isolieren" des Gens ein Restriktionsenzym in der Weise ausgewählt werden kann, daß der Terminierungscodon mit eingeschlossen ist; es macht dabei nichts aus, wenn zusätzliche DNA (nach dem Terminierungscodon) ebenfalls erhalten wird..

Andererseits kann der räumliche Abstand (spacing) zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem Initixerungscodon sehr wichtig sein (Guarante, L., et al., Literaturstelle wie vorstehend). Ein Restriktionsenzym zu finden, welches ein Gen aus einem längeren DNA-Strang auf solche Weise herausschneidet, daß der Initixerungscodon erhalten wird, ohne auch nicht erwünscht lange "leader"-Anteile der DNA zu erhalten, ist ein glücklicher Zufall. Häufiger wird das Gen in einer solchen Weise durchgeschnitten, daß der Initiierungscodpn und ein Teil des Gens verlorengehen. Die verlorene DNA, der Initiierungscodon und ein. geeigneter "leader" müssen dann im allgemeinen auf enzymatische oder chemische Weise erneut angefügt werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, einen neuen Expressionsvektor zur Einführung eines Gens in einen prokaryontischen Organismus zu schaffen.

Diese Aufgabe wird durch einen Expressionsvektor gelöst, welcher eine geschlossen ringförmige DNA umfaßt, und Signale besitzt, so daß er in der Lage ist, in einer prokaryontischen Wirtszelle repliziert zu werden und im weiteren umfaßt:

a) Promotor, Operator und Translations-Initiations-

Sequenzen, die für die prokaryontische Wirtszelle erkennbar sind;

b) eine Shine-Dalgarno-Sequenz und ein Initiatorcodon innerhalb der Translations-Initiationssequenz; und

c) eine Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuklease, welche in der Nachbarschaft des Initiatorcodons liegt, und welche nach dem Spalten den genannten Initiatorcodon oder dessen Komplement innerhalb der Translations-Initiationssequenz beläßt.

Der neue Expressionsvektor gemäß der Erfindung wird in Fig. 6 der Zeichnungen dargestellt. Pig. 6 zeigt ein zirkuläres Plasmid mit einem Promotor, Operator, Shine-Dalgarno-Regionen und dem Methionin (ATG)-Initiatorcodon. Eine Stelle für eine Restriktionsendonuklease (willkürlich mit Z bezeichnet) befindet sich nächst dem Initiatorcodon. Ein derartiger Transfervektor kann sehr vielseitig sein, da nach dem öffnen des Plasmids mit einer Restriktionscndonuklease Z und Insertierung eines Gens, das Plasmid alle Signale aufweisen wird, die -für die mRNA-Transkription und für die Translation des Gens, welche das gewünschte fremde Protein codiert, erforderlich sind.

In dem Plasmid-Expressionsvektor gemäß der Erfindung kann die Zusammensetzung und Länge des Segmentes zwischen der 35

Shine-Dalgarno-Sequenz und dem Initiatorcodon akkurät und reproduzierbar kontrolliert werden. Somit kann dieses Segment auf ein bestimmtes verwendetes Promotor-Operator-System maßgeschneidet werden, um die Genexpression zu optimieren. Außerdem besitzt der Expressionsvektor eine Insertionsstelle, die so lokalisiert ist, daß die Spaltung des Plasmids mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease den Initiatorcodon in der Translations-Initiatorsequenz beläßt. Auf :diese Weise stört die Manipulierung des Expressionsvektors zur Insertierung eines Gens nicht die Translations-Initiationssequenz, und diese Sequenz bleibt intakt, unabhängig davon, daß das Gen insertiert wird. In der vorliegenden Beschreibung umfaßt der Ausdruck "Translations-Initiationssequenz" die Shine-Dalgarno-Sequenz (Ribosombindungsstelle), den Initiatorcodon (gewöhnlich ATG) und das DNA-. Segment zwischen diesen zwei Sequenzen.

Die Expressionsvektoren gemäß der Erfindung können abgeleitet werden von Plasmiden vom Wild-Typ oder Modifikationen derselben. Vorteilhafterweise hat das als Ausgangsmaterial ausgewählte Plasmid Replikationsfunktionen, die durch nachfolgende Manipulationen nicht beeinflußt werden. Diese Replikationsfunktionen gewährleisten, daß der endgültige Transfervektor in der gewünschten Weise der Replikationskontrolle unterliegt,d.h. in multiplen Kopien oder einer einzigen Kopie pro Zelle oder in einer kontrollierbaren Anzahl von Kopien, pro Zelle vorliegen wird. Ein derartiges Plasmid-Ausgangsmaterial ist auch vorzugsweise klein dimensioniert. Dadurch daß es klein ist, ist das Plasmid in der Lage, große Geninsertierungen zu akzeptieren, die Transformation der Zellen ist erleichtert und das Plasmid leitet nicht unnötigerweise große Mengen an zellulärer Energie und Nährstoffen für die Produktion von nicht gewünschten Makro-

molekülen ab. Vorteilhafterweise ist das Plasmid kleiner als ca. 10 Kilobasen und vorzugsweise liegt es im Bereich von ca. 2 Kilobasen zu ca. 5 Kilobasen.

Um einen Expressionsvektor gemäß der Erfindung herzustellen, werden Kontrollsignale, die mit der RNA-Transkription und Translation assoziiert sind, in das Ausgangsplasmid insertiert. Obwohl derartige Kontrollsignale in jeder Form vorliegen können, die von dem beabsichtigten Wirtsorganismus erkannt '.WiTd/ werden bestimmte Systeme bevorzugt. Die Promotor-Operator-Regionen, die mit der prokaryontisohen Proteinsynthese assoziiert sind, variieren in ihrer Effizienz, Im allgemeinen ist ein hocheffizientes System bevorzugt, da ein solches System in einem hohen Niveau der Protein-

1-5 expression resultiert. Bekannte-Promotor-Operator-Systeme, die insbesondere bei der Synthese der neuen Transfervektoren gemäß der Erfindung geeignet sind, sind die Escherichia-Systeme für die Kontrolle des Lactose-(Iac)- und Tryptophan-(trp) -Metabolismus und die Promotor-Operator-Region (P₁-) des Bacteriophagen λ. Die Iac- und trp-Systeme sind im allgemeinen für die Synthese der vorliegenden Expressionsvektoren bevorzugt.

Diese Kontrollsignale können durch Herausschneiden aus irgendeiner DNA, in welcher sie vorliegen, erhalten werden. Die Methode des Herausschneidens wird von den Restriktionsenzymen abhängen, die verfügbar sind, und der Gegenwart geeigneter Restriktionsstellen, die das System begrenzen. Die Promotor-, Operator- und Shine-Dalgarno-Regionen werden vorzugsweise als ein intaktes Segment der DNA gewonnen. Das herausgeschnittene DNA-Segment, welches die gewünschten Signale enthält, wird dann in das Plasmid insertiert, wobei man sich konventioneller Verfahren zur Geninsertion bedient.
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JZZOO

Andererseits kann ein Plasmid verwendet werden, welches bereits die gewünschten Kontrollsignale enthält, als Ausgangsmaterial zur Synthese des Expressionsvektors gemäß der Erfindung. Ein besonders bevorzugtes Plasmid-Ausgangsmaterial wird als pGLiO1 bezeichnet und wurde von Guarante, L., et al., Literatur wie vorstehend, beschrieben, auf welches hiermit Bezug genommen wird. Dieses Plasmid, welches graphisch in Fig. 7 dargestellt ist, enthält Restriktionsstellen für jedes der Enzyme EcoRI und EcvuII und trägt Gene für die Ampicillin-Resistenz. Dieses Plasmid enthält auch die Promotor-Operator-Shine-Dalgarno-Sequenzen eines E. coli lac-Operons. Das System wurde von einer Iac UV5 Mutante durch Abbau mit AIuI Restriktionsendonuklease abgeleitet. Die UV5 Mutation macht den lac-Promotor gegenüber katabolischer Repression durch ein katabolisches Gen-Aktivator-Protein (CAP) unempfindlich. Die AIuI-Enden dos Promotor-Operator-Shine-Dalgarno-Segmentes wurden modifiziert, um EcoRI und BamHI kohäsive Enden zu schaffen, und dieses Segment wurde in Plasmid pBR322 insertiert (Bolivar, F., et al., Gene, ^, 74 (1977)) nach Abbau mit EcoRI und BamHI, wobei. Plasmid pGL101 hergestellt wurde.

Ein Plasmid, wie pGL101, oder ein Promotor-Operator-Shine-Dalgarno-Segment, wie z.B. das zur Konstruktion des Plasmids pGL101 verwendete, kann vorteilhafterweise modifiziert werden, so daß es die Initiatorcodon-Restriktionsstellen-Konfiguration des Expressionsvektors gemäß der Erfindung enthält. Zur Durchführung dieser Modifikation kann eine Restriktionsenzymstelle, welche den Initiatorcodon enthalt (z.B. ATG) als Teil seiner Erkennungsequenz zu dem Segment, welches die Promotor-Operator-Shine-Dalgarno-Sequenzen enthält, zugefügt werden. Alternativ kann eine Erkennungssequenz für ein Enzym vom Typ, wonach die Erkennungssequenz von der Schnittstelle durch eine gewisse Zahl von nicht spezifischen Nukleotidbasenpaaren getrennt ist, verwen-

det werden. Der nicht spezifische Anteil der Sequenz würde in diesem Falle den Initiatorcodon enthalten. Zum Beispiel schneidet das Restriktionsenzym Hgal bei 5 bis 10 Basenpaaren von der Sequenz GACGC; deshalb könnte eine Restriktionsstelle für dieses Enzym den Initiatorcodon in dem nicht spezifischen 5-bis 10-Basenpaar-Segment umfassen. Die Restriktionsstelle liegt vorteilhafterweise innerhalb 3 Basenpaaren des Initiatorcodons, und vorzugsweise ist die Restriktionsstelle so positioniert, daß nach Spaltung mit der Restriktionsendonuklease, die Translations-Initiationssequenz mit dem Initiatorcodon oder dessen Komplement endet.

Die Sequenz, welche den Initiatorcodon enthält, kann in einfacher Weise in ein Plasmid insertiert oder an ein ■ lineares DNA-Segment als ein .synthetischer "linker" mit glattem {blunt) Ende .angefügt werden, d.h. ein DNA-Segment, welches aus individuellen Nukleotiden synthetisiert ist. Im Falle des Plasmids pGL101 kann z.B. das Plasmid an der Erkennungsstelle nächst der Shine-Dalgarno-Sequenz mit PvuII geöffnet und der synthetische "linker"' durch Verbindung am glatten Ende (blunt end ligation) insertiert werden. (Anmerkung: PvuII bildet bündige bzw. ebene

(flush) Endschnitte).
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Eine bevorzugte Restriktionsenzym-Erkennungssequenz stellt die für das Enzym Sphl dar. Diese Erkennungssequcnz ist ein Hexanukleotid, welches den ATG-Initiatorcodon enthält. Die Erkennungssequenz für dieses Enzym wird in Fig. 8 gezeigt, und die Lokationen für die Schnitte sind durch eine gestrichelte Linie angezeigt.

Diese neue Restriktionsstellen-Initiatorcodon-Konfiguration schafft verschiedene deutliche Vorteile. Eine einzige bzw. einzigartige Insertionsstelle wird in das Plasmid eingeführt,

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din Gf'ijonwart dos. Initlatorcodons ist gewährleistet und der Abstand zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem Initiatorcodon kann präzise kontrolliert werden.

Obwohl die Bedeutung des Abstandes zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem Initiatorcodon nicht aufgeklärt ' ist, nimmt man an, daß dieser Abstand für ^eine" effiziente Proteinexpression wichtig ist.

Vorzugsweise ist dieser Abstand angenähert dem natürlichen Abstand für das angewandte Promotor-Operator-System, welcher im allgemeinen im Bereich zwischen ca. 0 und ca. 22 Basenpaaren liegt, vorzugsweise von ca. 3 bis ca. 7 Basenpaaren. Dieser Abstand kann auf einfache Weise durch Regeln der Größe des synthetischen "linkers"·, welcher für die Addition des Initiatorcodons verwendet wird, kontrolliert werden. Die Sequenzlänge kann durch entsprechende Auswahl optimiert werden, die sich nach der Leistung bzw. Wirkung der Organismen richtet, welche Plasmide mit Sequenzen verschiedener Länge enthalten.

Da ein Gen selten eine besondere Restriktionsstelle am Anfang' seiner Codierungssequenz aufweist, ist eine gewisse Modifizierung des Gens im allgemeinen erforderlich, bevor dieses in den Expressionsvektor insertiert werden kann. Wenn' die gewünschten Restriktionsstellen in der Nähe des Genanfangs und an und oder nahe dem Genende liegen, resultiert der Abbau durch das Restriktionsenzym in der Gewinnung .eines etwas längeren oder kürzeren DNA-Segmentes als das wirkliche Gen.

Das herausgeschnittene Gen kann in einfacher Weise in den Expressionsvektor insertiert werden, jedoch wird das durch den Organismus, in welchem der Vektor insertiert ist, exprimierte Protein etwas unterschiedlich von natürlichem Protein sein; typischerweise wird es eine längere oder kürzere Aminosäuresequenz aufweisen als das natürlich vorkommende Protein. In vielen Fällen sind diese Unterschiede nicht

signifikant, da das resultierende Protein eine im wesentlichen äquivalente Aktivität aufweisen wird. Wenn andererseits die Struktur des Proteins kritisch ist, wird das herausgeschnittene Gen vorteilhafterweise modifiziert, um die ursprüngliche Struktur wieder herzustellen, oder alternativ kann das erhaltene Protein modifiziert werden, um die natürliche Struktur zu schaffen.

Häufiger besitzen die fremden Gene keine geeigneten Restriktionsstellen entsprechend der einzigen Restriktionsinsertionsstelle des Expressionsvektors. In dieser Situation wird das Gen dann im allgemeinen unter Verwendung von einem oder mehr Restriktionsenzymen herausgeschnitten, welche an geeigneten Lokationen in der Nähe des Genanfangs oder Genendes schneiden. Die Enden des Gens werden dann modifiziert durch sogenannte "chewing back" mit einer Exonuklease, um überschüssige DNA zu entfernen und durch Zugabe von" linker"', die Basenpaarsequenzen enthalten, welche mit der Restriktionsinsertionsstelle des Expressionsvektors korrespondieren. Wenn bei der Isolierung des Gens Segmente des Gens selbst entfernt werden, kann die genetische Information, die in solchen Segmenten enthalten ■ ist,(soweit bekannt), ebenfalls - sofern dies gewünscht wird - mit Hilfe synthetischer "linker¹ erneut angefügt werden.

Um "linker¹¹, welche die gewünschte Restriktionsenzymstelle enthalten, an jedes Ende des Gens anzufügen, wird jedes Ende . vorteilhafterweise glatt (blunt) gemacht, d.h. einzelsträngige Extensionen werden entfernt. Wenn die Endmodifikationen, wie sie oben beschrieben werden, nicht in glatten (blunt) Enden resultieren, können die Enden durch bekannte Verfahren glatt gemacht werden (Ullrich, et al., Literatur vorstehend).

Wenn man einmal das mit glatten Enden versehene Gen erhalten hat, können vorher synthetisierte "linker" durch Ligation am glatten Ende (blunt end ligation) unter Verwendung von z.B. Enzym T4 DNA Ligase angefügt werden. Dann wird durch Abbau des modifizierten Gens mit dem Restriktionsenzym, welches mit der im "linker" enthaltenen Stelle korrespondiert, jegliche überschüssige "linker"entfernt und man erhält ein Gen mit kohäsiven Enden. Das modifizierte Gen kann dann in geeigneter Weise in den Transfervektor insertiert werden, welcher mit einem Restriktionsenzym geöffnet wurde. Die Insertion des Gens in den Expressionsvektor gemäß der Erfindung reformiert den Initiatorcodon.

Es versteht sich von selbst, daß die Expressionsvektoren, wie sie her beschrieben werden, sehr vielseitig sein können. , Sie können zur Einführung einer großen Vielfalt von eukaryontischen Genen in prokaryontische Organismen verwendet werden. Die Expression von fremdem Protein durch derartige Organismen kann unter die Kontrolle effizienter Promotor-Operator-Systeme gestellt werden. Wenn außerdem einmal ein Plasmid, welches eine Promotor-Operator-Shine-Dalgarno-Initiator-Codonsequenz enthält, erhalten wurde, so kann die. gesamte Sequenz geeigneterweise kloniert und zur Insertion in andere Vektoren herausgeschnitten werden, wobei man sich bekannter Methoden der Gentechnologie bedient. Auf diese Weise können spezialisierte Tramsfervektoren auf spezifische Situationen maßgeschneidert (tailored) werden.

Obwohl die vorliegende Erfindung im Zusammenhang mit gewissen spezifischen Plasmiden, Genen und Kontrollsequenzen beschrieben worden ist, soll sie dadurch nicht beschränkt werden, sondern sie soll vielmehr in Übereinstimmung mit den Ansprüchen breit interpretiert werden. Die Erfindung wird im weiteren durch die folgenden Beispiele näher erläutert, die jedoch diese nicht limitieren sollen.

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Beispiel I

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Der Zweck des in diesem Beispiel beschriebenen Experimentes war es, das gal K (Galactokinase) Gen von E. coli unter die Kontrolle des lac-Operators/Promotors zu plazieren, wobei ein Expressionsvektor verwendet wurde, der gemäß der vorliegenden Erfindung konstruiert wurde. Kurz gesagt, wurde das Protokoll'in drei Operationen eingeteilt: (1) Der Vektor PGL101 (Taniguichi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA TT_i 5230, 1980) wurde modifiziert, so daß eine synthetische DNA-Sequenz, welche die Endonuklease Sphl Erkennungsstelle als Code enthielt, an einem einzigen PvuII-Stellen-Operator-Distal an die lac-Kibosom-Bindungsstelle gebunden wurde, wobei eine Hybrid-Translations-Initiationsstelle einschließlieh dem ÄTG-Codon entsprechend dem folgenden Schema geschaffen wurde (Anmerkung: der neue Vektor wird mit pGX951 bezeichnet) :

pGLlOl

Iac o/p

Pvull Spaltstelle

AGGAACAGGATC TCCTTGTCCTAG

PvuII Endonuklease

Iac ο/ρ

AGGAACAG TCCTTGTC

+Spill. LINKER GCATGC ' CGTACG

LIGATION

Iac o/p

AGGAACAGGCATGC TCCTTGTCCGTACG

SphT. RESTRICTION

PGX951

Iac ο/ρ

AGGAACAGGCATG TCCTTGTCC

Trans1ations-Initiations sie lie

(2) Ein Restriktionsfragment, welches das gal K (Galactokinase) Gen enthielt, wurde modifiziert, so daß seine N-terminale Sequenz einen gebundenen (ligated) Sphl-"linker" umfaßte, welcher ein Komplement zu einem neuen ATG-Initiationscodon und einem neuen zweiten Codon bildete, wobei die gesamte folgende ursprüngliche Sequenz im Korrektur-Ableserahmen beibehalten wurde. Das folgende Schema illustriert die gal K Gen-Modifikation:

Hindlll Stelle

Auffüllen der Restriktionsenden

ursprünglicher N-terminaler Codon

AGAAATGAGTCTGA
TCTTTACTCAGACT

gal K Gen

Accl

Stelle

ψ Hi

AGTCTGA GACT

Hinfl Restriktionsstelle

Hinfl

gal K

Accl

DNA POLYMERASE (KLENOW) + dATP, dCTP, TTP

AGTCTGA

TCAGACT

aagcatgcttagtctga ttcctacgaatcagact"

Sphl

+ linker AAGCATGCTT
TTCGTACGAA

Ligation

Sphl Stelle

aagcatgctt "ttcctacgaa'

codon

CTTAGTCTGA •"wTACGAATCAGACT

qal K

AACGATG TTG

(3) Lig.ation von (2) und (1) entsprechend dem folgenden Schema, rekonstituiert eine vollständige Translations-Initiationsstelle, welche eine In-Phase-Synthese von Galctokinase erlaubt:

Vektor: pGX951

insertieren:

Iac o/p

AGGAACAGGCATG TCCTTGTCC

CTTAGTCTGA qal K

CTACGAATCAGACT

LIGATION

_2_^al

AGGAACAGGCATGCTTAGTC TCCTTGTCCGTACGAATCAG"

tränslationsinitiations--

STELLE

25 Experimentelle Verfahren

1. Herstellung des Vektors pGX951

Plasmid pCL101 wurde wie von Taniguichi et al., Proc. Natl 30 Acad. Sei. USA, 77: 5230 (1980) beschrieben, hergestellt.

Gereinigte Plasmid-DNA wurde aus geklärten Zell-Lysaten (Hershfield et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 7U 3455 (1974)) durch zwei aufeinanderfolgende Banden (bandings) in CsCl-Gradienten gereinigt. Ein Reaktionsgemisch wurde bereitet, das ein Volumen von 50 μΐ aufwies und folgendes enthielt: 15 \xg Plasmid pGL101 DNA, 25 Einheiten Endonuklease PvuII (New England Biolabs) und Puffersalze, Endkonzentration von 50 mM NaCl, 6 mM Tris - HCl, pH 7,4, 6 mM MgCl₂, 1OmM Mercaptoethanol und 100 ng Rinderserumalbumin pro ml. Diese Pufferformulierung wird im folgenden als "50 inM Salzpuffer" bezeichnet. Nach Inkubation für 1 h bei 37°C wurden 0,8 Einheiten Kälberdarm-alkalische Phosphatase (Boehringer-Mannheim) zugegeben und die Inkubation für 30 min bei 65⁰C fortgesetzt. Das Gemisch wurde durch Elektrophorese in 1 % Agarose (Sea-Plaque, Marine Colloids) durch Standardmethoden (Selker et al., J. Bacteriol., 129; 388 (1977) aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurde das lineare Plasmid durch Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht, aus dem Gel geschnitten und nach der Methode von Langridge et al., Anal. Biochem., 103: 264 (1980) extrahiert. Das synthetische Oligonukleotid /GCATGC. ("linker") wurde nach der Triestermethode (Itakura, ¹CGTACG'

et al., J. Biol. Chem., 25J3: 4592 (1975)) hergestellt.

Der synthetische Linker wurde mit Kinase in 20 μΐ Reaktionsvolumen, welches 5 \xg Linker, 1 mM Dinatrium«-ATP (P-L Biochemicals), 10 Einheiten T4 Polynukleotidkinase (P-L Biochemicals), 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl,, 5 mM Dithiothreitol, 0,1 mM Spermidin (Sigma) und 0,1 mM Dinatrium EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) enthielt, behandelt (kinased).. Das Reaktionsgemisch wurde bei 37⁰C 1 h lang, dann bei 65⁰C 5 min lang inkubiert. Ein Anteil von 4 μΐ dieses Gemisches wurde zu einer Lösung gegeben,

' ·

die 2 ng Plasmid pGL101, gespalten mit PvuII Endonuklease (oben) , 1 mM Dinatrium-ATP, 10 mM Dithiothreitol, 100 fig Rinderserumalbumin pro ml, 300 Einheiten T4 DNA Ligase (New England Biolabs), 50 mM Tris-HCl, pH 7,6 und 5 mM MgGl₂ in einem Volumen von 20 μΐ enthielt.

Das Reaktionsgemisch wurde 14 h lang bei 12⁰C inkubiert. Dieses Gemisch wurde dann verwendet, um E. coil Stamm N 100 zu transformieren. Die Zellen wurden nach der Methodo von Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 69^: 2110,

(1972) für die Transformation kompetent gemacht. Eine 10 μΐ Portion des Ligationsgemisches wurde zu 0,2 ml eiskalter Zellsuspension gegeben und auf Eis 1 h lang inkubiert. Das Gemisch wurde dann 2 min bei 42⁰C durch Wärmeschock behandelt und bei 24⁰C 10 min lang stehengelassen. 3 ml LB-Kulturflüssigkeit (broth) (10 gm Trypton, 5 gm Hefeextrakt, 10 gm NaCl pro 1) wurden zugegeben und die Zellen 1 h lang bei 37⁰C inkubiert. Volumen von 0,1 ml wurden auf Platten gegeben, die 1,5 % Agar, LB-KuIturflüssigkeit und 100 μg/ml Ampicillin enthielten. Nach 16-stündiger Inkubation wurden ca. 200 Kolonien gezählt, im Vergleich zu 10 in einem Kontrollgemi.sch, welches den Linker nicht enthielt. 10 dieser Kolonien waren über Nacht in 10 ml Volumen von LB-Kulturflüssigkeit gewachsen. * Es wurde gezeigt, daß die isolierte DNA durch Sphl-Endonuklease einmal geschnitten wurde durch PvuII nicht geschnitten wurde, im Vergleich zum Ausgangsplasmid pGLi01, welches von Sphl nicht geschnitten, jedoch von PvuII einmal geschnitten wurde. Das neue Plasmid wurde als pGX9 bezeichnet. Eine gereinigte DNA-Preparation von 50 |j.g wurde durch Sphl geschitteh und mit Kälberdarm-alkalischer Phosphatase, wie vorstehend beschrieben, behandelt.

* Lysate wurden wie beschrieben hergestellt. 35

■ ■ - - 26 -

2. Ligation von synthetischem Linker an ein hergestelltes Fragment, welches gal K enthält.

Die Quelle für gal K stellte die Plasmid pKO-I DNA dar, die wie vorstehend beschrieben gereinigt wurde. Das Plasmid und die Restriktionsdaten wurden von Dr. Keith McKenney erhalten (McKenney, K., et al. ).

Das gal K Gen wurde von einem Restriktionsfragment erhalten, welches durch HindIII-und Accl-Stellen (Fig.9) begrenzt war. Das Reaktionsgemisch enthielt "50 mM Salzpuffer" (sie vorstehend), 50 μg pKO-I Plasmid DNA und 70 Einheiten Hindlll Endonuklease (Bethesda Research Labs) in einem Volumen von 125 μΐ. Nach 2 h bei .37⁰C wurde die DNA mit 2 Volumen Ethanol ausgefällt, durch Zentrifugation gesammelt, getrocknet und in 55 μΐ tUO wieder aufgelöst. Ein Volumen von 20 μΐ Puffersalze.n (5x konzentrierter "50 m_M'Salzpuffer") wurde zugegeben plus 25 μΐ Endonuklease Accl (10 Einheiten, New England Biolab). Inkubation für

2.5 h bei 37^ÜC, dann bei 65°C für 5 min. Die DNA wurde

wiederum mit Ethanol, wie vorstehend beschrieben, ausgefällt und getrocknet. Es wurde dann ein teilweiser Abbau (digest) mit Endonuklease HinfI durchgeführt; dies wurde deshalb durchgeführt, da außer der speziellen HinfI-Stelle am N-Terminus von gal K eine interne Hinfl-Stelle vorliegt, die intakt gelassen werden mußte. Das Reaktionsgcmisch von 240 μ.1. enthielt 5,7 Einheiten Ilinfl (Bethesda Research Lab) ,

9.6 μg der HindiII - Accl Fragment-DNA und den "50 mM Salzpuffer". Die Inkubation erfolgte 2,5 min lang bei 37°C, anschließend 15 min lang bex65°C. Die DNA wurde mit 50 μΐ Phenol extrahiert, das verbleibende Phenol mit Ether entfernt und die DNA mit 2 Volumen Ethanol ausgefällt. Der Niederschlag (pellet) wurde mit 4 Volumen 70%igem Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das "partielle" Gemisch wurde dann durch DNA-Polymerase "filled in", um die "sticky"

Restriktionsenden zu glatten (blunt) Enden für die Linker-Ligation umzuwandeln. Ein Reaktionsgemisch von 4 0 μΐ enthielt 3,2 μg der Hinf-I "partiellen" DNA (siehe oben) , 4 μΐ Polymerase Puffer (Bethesda Research Labs Nick-Translation -Kit), 10 mM MgCl₃, 4 Einheiten DNA-Polymcrase "Klenow" (Boehringer-Mannheim) und 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP und TTP (Bethesda Research Labs). Dieses Gemisch wurde 20 min bei 23⁰C, dann 15 min bei 65⁰C inkubiert. Ligation eines synthetischen Oligonukleotids , AAGCATGCTT .

^v TTCGTACGAA '

wurde durchgeführt, welcher eine Behandlung mit Kinase (kinasing) des vorstehenden "linkers" folgte. Ein Reaktionsgemisch von 40 μΐ enthielt "50 mM Salzpuffer", wie vorstehend unter (1) beschrieben, 3 μg des DNA~Partialabbaup3:oduktes (partial digest), 2 μg mit Kinase behandelter Linker und 1500 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs). Dies wurde 20 h bei 20⁰C, dann 15 min bei 65°C inkubiert. Zu dem gekühlten Gemisch wurden 20 Einheiten SphI Endonukleaüo zugegeben und die Inkubation bei 37⁰C 1 h lang fortgesetzt.

Das Gemisch wurde mit 20 μΐ Phenol extrahiert, restliches Phenol mit Ether entfernt, und 2 Volumen Ethanol verwendet, um die DNA zu präzipitieren. Daraufhin wurde mit 70%igem Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet, und dann die DNA in 20 μΐ Ligasepuffer (siehe oben), welcher 2,5 μg Plasmid pGX9 51 (geschnitten mit Sjjhl und mit Phosphata.se wie vorstehend behandelt), 1000 Einheiten T4 DNA.bigase (New England Biolabs) und 0,5 mM ATP enthielt, wieder aufgelöst. Das Gemisch wurde 16h bei 20⁰C, dann 15 min lang bei 65°C inkubiert. Nach dem Kühlen wurden 10 Einheiten Endonuklease Smal (Bethesda Research Labs) zugegeben, um Moleküle, welche eine Sequenz zwischen Hindlll und Hinfl-Stellen (Fig. 9) enthielten, zu linearisieren. Es folgte Inkubation für 1 h bei 37⁰C, dann für 15 min bei 65⁰C. Daraufhin wurde das abgekühlte (chilled) Gemisch

verwendet, um 200 μΐ E. coli Stamm N100 gal K zu transformieren, welcher wie vorstehend kompetent gemacht und transformiert worden war. Die Zellen wurden auf McConkey- · Agarplattcn ausgestrichen, welche 1 % Galactose und 100 μg/ml Ampicillin enthielten. Nach 16-stündiger Inkubation wurden die Kolonien ausgezählt. Die roten Kolonien, die nun in der Lage waren, das gal K Gen zu exprimieren, wurden gereinigt und DNA-Preparationen, wie vorstehend beschrieben,.hergestellt. Die DNA wurde einer Restriktionsanalyse unterworfen, um den erwarteten Aufbau (pattern) zu bestätigen. Die Restriktionskarte von Plasmid pKO-I in der gal K Region ist in Fig. 9 der Zeichnungen wiedergegeben. Die Zahlen in Fig. 9 beziehen sich auf den Abstand in den Basenpaaren. Symbole: E = Endonuklease EcoRI, H = ΗίηάΙ_ΙΙ^> HF = Hinf I, A = Acc I, S = Smal. Die Linie, die mit "gal K" markiert ist, zeigt die Position des gal K (Galactokinase).Gens. Der Galactokinase-produzierende Stamm, der nach diesem Verfahren hergestellt worden ist, wurde als pGx951 bezeichnet und bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, als ATCC Nr. 31917 deponiert.

Leerseite

Claims

3226S1S EITLE <&* PATENTANWÄLTE DR. ING. E. HOFFMANN (l?30-Wi) . DIPL.-ING. W. EITLE · DR. RER. NAT. K.HOFFMANN · DIPL.-ING. W. LEH N DIPL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN " · ARABELLASTRASSE 4 · D-8000 MO NCHEN .81 · TELEFON (08?) 9Π087 . TELEX 05-29619 (PATHE) 37 190 m/hl Genex Corporation, Rockville, Maryland/ USA Expressionsvektoren Patentansprüche

1. Expressionsvektor zur Einführung eines Gens in einen prokaryontischen Organismus, gekennzeichnet durch einen geschlossenen DNA-Ring, welcher Signale aufweist, die es ermöglichen, daß er in einer prokaryontischen Wirtszelle repliziert wird und welcher im weiteren umfaßt:

a) Promotor, Operator und Translations-Initiationssequenzen,· welche durch die prokaryontische Wirtszelle erkennbar sind;

b) eine Shine-Dalgarno-Sequenis und ein Initiatorcodon innerhalb der Translations-Initiationssequenz; und c) eine Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuklease, welche nächst dem Initiatorcodon spaltet, wobei sie den Initiatorcondon oder dessen Komplement inner- · ' - *

halb der Translations-Initiationssequenz beläßt.

2. Expressionsvektor gemäß Anspruch 1, dadurch g e kennzeichnet, daß die genannte Restriktionsendonuklease innerhalb drei Basenpaaren des Initiatorcodons oder dessen Komplement spaltet.

3. Expressionsvektor gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Restriktionsendonuklease in der Weise spaltet, daß die Translations-Initiationssequenz mit dem Initiatorcodon oder dessen Komplement endet.

4. Expressionsvektor gemäß Anspruch 1, dadurch g e -

kennzeichnet, daß der genannte Initiatorcodon in der Erkennungssequenz für die genannte Restriktionsendonuklease enthalten ist.

5. Expressionsvektor gemäß Anspruch 1, dadurch g e -

kennzeichnet, daß der genannte Initiatorcodon in der Erkenmingssequenz für die Restriktionsendonuklease, Sphl, enthalten ist.

6. Expressionsvektor gemäß Anspruch 1,2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssequenz für die genannte Restriktionsendonuklease von der Spaltstelle der Restriktionsendonuklease durch eine Mehrzahl von nicht spezifischen Nukleotidbasenpaaren getrennt ist.

7. Exprossionsvektor gemäß Anspruch 6, dadurch " gekennzeichnet , daß die Restriktionsendonuklease Hgal darstellt. ·

.

8. Expressionsvektor gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet , daß der Initiatorcodon von der Shine-Dalgarnosequenz durch 0 bis ca. 22 Basenpaaren getrennt ist.

.9. Expressionsvektor gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Initiatorcodon von der Shine-Dalgarno-Sequenz durch ca. 3 bis ca. 7 Basenpaaren getrennt ist.

10. Expressionsvektor gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das genannte Gen ein prokaryontisches Gen, ein eukaryontisches Gen oder eine synthetische DNA-Sequenz, welche ein spezifisches Polypeptid codiert,-darstellt.

11. Expressionsvektor gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet , daß die prokaryontische Wirtszelle Escherichia coli darstellt, und der Promoter, der Operator und die Shihe-Dalgarno-Sequenz abgeleitet sind von den Iac- oder trp-Operons von E. coli.

12. Expressionsvektor gemäß Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet , daß die profcaryontische Wirtszelle Escherichia coli darstellt, und der Promotor, der Operator und die Shine-Dalgarno-Sequenzen von einem Bacteriophagen abgeleitet sind.

13. Bakterium der Gattung Escherichia, gekennzeichnet durch einen Expressionsvektor gemäß Anspruch 11.

14. Bakterium der Gattung Escherichia, gekennzeichnet durch einen Expressionsvektor gemäß Anspruch

15. Ein im wesentlichen reines DNA-Segment, dadurch g e kennzeichnet/ daß es im wesentlichen besteht aus:

a) Promotor, Operator und Translations-Initiationssequenzen, welche durch einen prokaryontischen Wirtsorganismus erkennbar sind;

b) eine Shine-Dalgarno-Sequenz und ein Initiatorcodon innerhalb dor Translntions-Initiationssequenz; und c) eine Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuklease, welche "rjächst dem Initiatorcodon oder dessen Komplement '. ,. in · der Translations-Initiationssequenz spaltet.

16. DNA-Segment gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß die genannte Restriktionsendonuklease innerhalb drei Basenpaaren des Initiatorcodons oder dessen Komplement spaltet.

17. DNA-Segment gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß die Restriktionsendonuklease in der Weise spaltet,' daß die Translations-Initiationssequenz mit dem Initiatorcodon oder dessen Komplement endet.

18. DNA-Segment gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Initiatorcodon innerhalb der Erkennungssequenz für die genannte Restriktionsendonuklease enthalten ist.

19. DNA-Segment gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß der genannte Initiatorcodon

in der Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease, Sphlj enthalten ist.

20. DNA-Segment gemäß Anspruch 15, 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungssequenz für die genannte Restriktionsendonukleaso

von der Spaltstelle der Restriktionsendonuklease durch eine Mehrzahl von nicht spezifischen Nukleotidbasenpaaren getrennt ist.
10

21. DNA-Segment gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet , daß die Restriktionsendonuklease Hgal darstellt.

22. DNA-Segment gemäß Anspruch 15, 16, 17, 18 oder 19, dadurch gek ennzeichnet, daß der Initiatorcodon von der Shine-Dalgarno-Sequenz durch 0 bis ca. 22 Basenpaare getrennt ist.

23. DNA-Segment gemäß Anspruch 22, dadurch g e k e η η ze lehnet, daß der Initiatorcodon von der Shine-Dalgarno-Sequenz durch ca.3 bis ca. 7 Basenpaare getrennt ist.

24. DNA-Segment gemäß Anspruch 15, 16, 17, 18 oder 19, dadurch gekennz eichnet, daß der Promotor, der Operator und die Shine-Dalgarno-Sequenzen von den lac- oder trp-Operons · von E.coil abgeleitet sind.

25.DNA-Segment gemäß Anspruch 15, 16, 17, 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet , daß der Promotor, der Operator und die Shine-Dalgarno-Sequenzen von einem Bacteriophagen abgeleitet sind.