DE3203537C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene
Verfahren zur Überführung eines speziellen eukaryontischen
Gens eines Genoms in Escherichia coli. Die Ansprüche
2 bis 5 betreffen Ausgestaltungen des Verfahrens.
Bisher ist es nur in unbefriedigender Weise möglich, ein
Gen mit einer speziellen Leistung, die technisch ausgenutzt
werden soll, in Escherichia coli zu überführen.
Zur Problematik vergleiche man Science, 210 (1980) 1334.
Erfindungsgemäß wird nun ein Verfahren zur Überführung
eines speziellen eukaryontischen Gens eines Genoms in Escherichia
coli vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist,
daß man
- (i) in an sich bekannter Weise DNS-Material, das ein Genom mindestens einmal umfaßt, das das spezielle Gen aktiv oder inaktiv enthält, zu sich überlappenden DNS-Fragmenten zerschneidet,
- (ii) bis (v) in an sich bekannter Weise jedes DNS-Fragment mit einem Vektor, bei dem es sich um deletierte Phagen Lambda oder lambdoide Phagen oder Cosmide handelt, koppelt, die gebildeten Koppelungsprodukte in vitro verpackt, die gebildeten In-Vitro-Verpackungsprodukte in Escherichia coli transduziert (d. h. eine Genbank bildet) und die Koppelungsprodukte repliziert,
- (vi) in an sich bekannter Weise die Koppelungsprodukte (gegebenenfalls nach einer In-Vivo-Verpackung) aus den Escherichia-coli-Hybriden (und gegebenenfalls aus der Verpackung) isoliert,
- (vii) in an sich bekannter Weise die isolierten (und gegebenenfalls
oligomerisierten) Koppelungsprodukte in
etablierte animalische Zellen transferiert, die das spezielle
Gen nicht oder inaktiviert enthalten, und ein Gemisch aus
- (a) Zellen ohne aufgenommenes Koppelungsprodukt und Zellen mit jeweils einem Koppelungsprodukt oder
- (b) Zellen ohne aufgenommenes Koppelungsprodukt und Zellen mit jeweils mehreren und gegebenenfalls auch jeweils nur einem Koppelungsprodukt erhält,
- (viii) bis (x) in an sich bekannter Weise die im erhaltenen Gemisch enthaltenen Zellen repliziert und auf Zellen mit jeweils ein oder mehreren aufgenommenen Koppelungsprodukten selektioniert, die das spezielle Gen umfassen, und aus den selektionierten Zellen mit einem Gehalt an speziellem Gen jeweils die gesamte DNS isoliert,
- (xi) die isolierte DNS in vitro in Phagenpartikel verpackt,
- (xii) in an sich bekannter Weise die gebildeten In-Vitro- Verpackungsprodukte in Escherichia coli transduziert und
- (xiii) (a) sofern Zellgemische (a) oder (b) gemäß Stufe (vii) gebildet wurden, in an sich bekannter Weise die gebildeten Escherichia-coli-Hybride repliziert oder (b) sofern Zellgemisch (b) gemäß Stufe (vii) gebildet wurden, in an sich bekannter Weise (gegebenenfalls nach Replikation der gebildeten Escherichia-coli-Hybride) die Stufen (vi) bis (xiii) (a) durchführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich allgemein folgendermaßen
beschreiben. Aus der DNS von Zellen, die ein gesuchtes
Gen enthalten, wird mit Hilfe von Vektoren eine
Genbank in Escherichia coli hergestellt. DNS dieser Genbank
wird in Animalzellen transferiert. Die Zellen, die
das gesuchte Gen erhalten haben, werden durch seine Wirkung
identifiziert und isoliert. Nach Vermehrung dieser
Zellen wird ihre DNS isoliert. Die transferierte und isolierte
DNS, die das gesuchte Gen enthält, wird in vitro
in Phagenpartikel verpackt und durch Infektion in
Escherichia coli kloniert.
Im einzelnen kann man dabei folgendermaßen vorgehen.
Herstellung der Genbank. DNS aus Zellen, die das gesuchte
Gen enthalten, wird in überlappenden Fragmenten in bestimmten
Vektoren eingebaut, so daß das gesamte Genom dieser
Zellen vollständig repräsentiert ist. Bei den Vektoren
handelt es sich um deletierte Phagen Lambda oder lambdoide
Phagen oder Cosmide, welche zusammen mit beispielsweise
animaler DNS in Escherichia coli replizieren
können und in vitro in Phagenpartikel verpackbar sind.
Zweckmäßigerweise werden sie ein oder mehrerer Selektionsmarker
für Escherichia coli und eukaryontische Zellen enthalten.
In dieser Form kann die Genbank vermehrt und
konserviert werden.
Transfer der Genbank-DNS in animalische Zellen. Durch Transfer
der Genbank-DNS werden die in Escherichia coli klonierten
Gene in animalische Zellen transferiert. Mit Hilfe der
auf den Vektoren enthaltenen Selektionsmarker können die
Zellen isoliert werden, in die klonierte DNS transferiert
wurde. Auch in Form der Animalzellklone kann die Zellbank vermehrt
und konserviert werden. Die Isolierung des Zellklons,
der das gesuchte Gen enthält, wird im wesentlichen durch
die Eigenschaft des Genproduktes bestimmt. Es können z. B. Bioassays,
Selektionstests, immunologische Nachweisverfahren
oder Enzymtests vorgesehen werden.
Reisolierung der transferierten Gene. Nach Vermehrung der
Zellen, die das gesuchte Gen enthalten, wird daraus hochmolekulare
DNS präpariert. Die Eigenschaften der mittransferierten
Vektoren erlauben eine In-Vitro-Verpackung der
transferierten DNS in Phagenpartikeln. Mit diesen Phagenpartikeln
können Escherichia-coli-Zellen infiziert und
daraus in beliebiger Menge die klonierte DNS gewonnen werden.
Mit einem zweiten Transfer der so isolierten DNS in animalische
Zellen ist eine Kontrolle auf Funktion möglich.
Bisher erfolgte die Isolierung von eukaryontischen Genen
(von wenigen speziellen Ausnahmen abgesehen) nach folgendem
Schema:
- 1. Isolierung von RNS. Dazu ist es notwendig, genügend Gewebe oder Zellen zur Verfügung zu haben, die das spezifische Gen ausreichend exprimieren. Das ist oft nicht möglich, da viele Gene nur sehr wenig exprimiert werden oder die Beschaffung des Gewebes (beispielsweise von menschlichen Hormondrüsen) sehr schwierig ist.
- 2. Herstellung einer doppelsträngigen DNS-Kopie (cDNS) von der RNS und Klonieren in Escherichia coli.
- 3. Identifizierung des gewünschten cDNS-Klons. Die Identifizierung
ist meist nur indirekt möglich, da
- - häufig keine vollständigen cDNS-Klone erhalten werden (vor allem bei großen Genprodukten) und
- - eine richtige und stabile Expression von eukaryontischen Genen in Escherichia coli nicht erwartet werden kann.
- Deshalb sind auch zur Identifizierung meist größerer Mengen an spezifischer RNS notwendig. Die genetische Information der cDNS entspricht meist nicht der des zellulären Gens, wobei Regulationssequenzen fehlen.
- 4. Herstellung einer Cosmid- oder Lambda-Genbank aus chromosomaler DNS. Die Stufen (i) bis (v) des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechen diesem bekannten Stand der Technik.
- 5. Isolierung des zellulären Gens durch Hybridisierung der Genbank-Klone mit radioaktiv markierter cDNS. Demgegenüber ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf die Verfügbarkeit von speziellem Gewebe angewiesen. Eine RNS- Isolierung und cDNS-Klonierung ist nicht erforderlich. Da bisher nach Gentransfer immer Expression der transferierten Gene gefunden wurde, kann man folgern, daß die genetische Information der Genbank-Klone in funktionelle Produkte umgesetzt wird, für deren Nachweis viele, sehr sensitive Methoden eingesetzt werden können. Aus der einmal etablierten Animalzell-Genbank können sehr viele unterschiedliche Gene isoliert werden.
Der Fachmann ist mit der Herstellung von Genbanken mit
Hilfe von Vektoren vertraut. Für den Transfer in animalische
Zellen muß man modifizierte Vektoren vorsehen,
die eine Selektion der transfizierten Zellen erlauben. Als
Beispiele für selektionierbare Gene seien das Thymidinkinasegen
(TK) aus dem Herpes-simplex-Virus (HSV) oder
Huhn, Adenosinphosphoribosyltransferase (APRT), Hyphoxanthin-
und/oder Guanosinphosphoribosyltransferase (H/GPRT)
aus animalischen Zellen oder Escherichia-coli-Zellen angeführt.
Beispielsweise sind auch isolierte Gene verfügbar,
die Methotrexat- bzw. Neomycinresistenz kodieren.
Aufgrund der dem Fachmann zur Verfügung stehenden Nachweismethoden
kann er ohne weiteres ermitteln, ob sich im
Rahmen des vorgeschlagenen Verfahrens ein bestimmtes Gen
exprimieren läßt. Das kann beispielsweise nicht der Fall
sein bei bestimmten Immunoglobulinen, sofern deren Gene
nicht aus Gewebe isoliert wurden, in denen sie aktiviert
sind. Der Fachmann kann sich auch darüber ohne weiteres
Klarheit verschaffen, ob ein Gen in der Genbank nicht
enthalten ist, weil es die Replikation von Escherichia
coli oder den darin enthaltenen Koppelungsprodukten mittelbar
oder unmittelbar beeinträchtigt.
Das in das Verfahren eingesetzte Genmaterial kann beispielsweise
animalischen oder menschlichen Ursprungs sein.
Man kann also in das erfindungsgemäße Verfahren DNS-Material
einsetzen, das ein Genom mindestens einmal, vorzugsweise
mindestens zweimal umfaßt. Unter "überlappendem
Schneiden" wird im vorliegenden Zusammenhang verstanden,
daß das DNS-Material in Stufe (i) derart geschnitten wird,
daß das gesuchte Gen mindestens in einem Fragment
ungeschnitten vorliegt. Man kann das DNS-Material dazu
beispielsweise mit einem einzigen Enzym in Verdünnung
schneiden, so daß das Enzym nicht an allen denkbaren
Schnittstellen, sondern nur statistisch angreift.
Bei dem Vektor der Stufen (ii) bis (v) handelt es sich
um ein Cosmid oder einen Phagen,
nämlich einen Phagen Lambda oder einen lambdoiden
Phagen.
Hinsichtlich des Koppelns, des Verpackens, des Transduzierens
und Replizierens der Stufen (ii) bis (v) und der
Stufen (xi) bis (xiii) des erfindungsgemäßen Verfahrens
sei beispielsweise auf die DE-PS 28 14 039, und die
darin angeführte Literatur hingewiesen, deren Offenbarungsgehalt
hier voll einbezogen wird. Das Verpacken der
Stufe (iii) ist für das spätere Verpacken der Stufe (xi)
wichtig, da bereits bei der Stufe (iii) dafür Sorge getragen
wird, daß verpackbare Koppelungsprodukte durch das
erfindungsgemäße Verfahren geschleust werden.
Bei der Stufe (vi) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann
man so vorgehen, daß man
- (a) im Fall von Cosmidhybriden als Koppelungsprodukten in an sich bekannter Weise die Koppelungsprodukte aus den Escherichia-coli-Hybriden isoliert oder
- (b) im Fall von Cosmidhybriden als Koppelungsprodukten in an sich bekannter Weise die Koppelungsprodukte in den Escherichia-coli-Hybriden in vivo verpackt, sofern die Escherichia-coli-Hybride einen Phagen Lambda oder einen lambdoiden Phagen enthalten, der durch Temperaturinduktion eine Hülle bilden kann, die verpackten Koppelungsprodukte aus den Escherichia-coli-Hybriden isoliert und die Koppelungsprodukte aus der Verpackung isoliert und gegebenenfalls (durch Ligasenbehandlung) oligomerisiert oder
- (c) im Fall von Hybriden von Phagen Lambda oder lambdoiden Phagen als Koppelungsprodukten in an sich bekannter Weise die Koppelungsprodukte isoliert und gegebenenfalls (durch Ligasenbehandlung) oligomerisiert.
Bei den Ausführungsformen (b) und (c) der erfindungsgemäßen
Stufe (vi) werden die Voraussetzungen für eine
erneute Verpackung dadurch verbessert, daß die Stufe (vi)
über Verpackungsprodukte abläuft.
Man kann also bei der Stufe (vi) des erfindungsgemäßen
Verfahrens in linearer Form isolierte Koppelungsprodukte
in an sich bekannter Weise durch Ligasenbehandlung oligomerisieren.
Der in der erfindungsgemäßen Stufe (vii) vorgesehene
Transfer in animalische Zellen ist erforderlich, da man
das gesuchte Gen im allgemeinen in Escherichia coli nicht
erkennen wird.
Bei der erfindungsgemäßen Stufe (vii) ist es möglich,
daß die Zellen kein Koppelungsprodukt oder ein Koppelungsprodukt
oder mehrere Koppelungsprodukte aufnehmen, wobei
die aufgenommenen Koppelungsprodukte das gesuchte Gen
enthalten können oder auch nicht.
Für eine anschließende Selektion bei der erfindungsgemäßen
Stufe (ix) ist es zweckmäßig, daß man auf Zellen mit
jeweils ein oder mehreren aufgenommenen Koppelungsprodukten
selektioniert und danach auf Zellen mit einem
Koppelungsprodukt mit speziellem Gen oder mehreren Koppelungsprodukten
selektioniert, von denen mindestens ein
Koppelungsprodukt das spezielle Gen enthält.
Bei Zellen mit jeweils mehreren aufgenommenen Koppelungsprodukten
erhält man nach den erfindungsgemäßen Stufen
(x) bis (xii) Escherichia-coli-Kolonien, die sich hinsichtlich
der eingebrachten Verpackungsprodukte unterscheiden,
so daß eine erneute Kontrolle mit animalischen
Zellen, d. h. ein erneutes Durchlaufen der erfindungsgemäßen
Stufen (vi) bis (xiii) zweckmäßig ist.
Nach Durchführung der erfindungsgemäßen Stufe (x) wurde
Überraschenderweise festgestellt, daß bei der erfindungsgemäßen
Stufe (xi) das Koppelungsprodukt aus der isolierten
DNS herausgeschnitten wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch das folgende
Schema noch näher erläutert. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens kann man sich bei einzelnen Stufen
an sich bekannter Maßnahmen bedienen, wobei einschlägige
Literatur tabellarisch einzelnen Verfahrensstufen zugeordnet
wurde.
- 1. Hohn, B, and Collins, J. (1980) A small cosmid for efficient cloning of large DNA fragments. Gene 11, 291-298.
- 2. Collins, J. (1979) Escherichia coli Plasmids Packageable in Vitro in Bacteriophage Particles. Meth. Enzymol. 68, Acad. Press. 309-326
- 3. Maniatis, T., Ross, C. H., Lacy, E., Lauer, J., O′Connell, C. and Quon, D. (1978) The Isolation of Structural Genes from Libraries of Eucaryotic DNA. Cell 15, 687-701.
- 4. Hohn, B. (1979) In Vitro Packaging of λ and Cosmid DNA Meth. Enzymol. 68, Acad. Press. 299-309.
- 5. Vollenweider, H. J., Flandt, M. and Szybalski, W. (1980) Construction and properties of a ColE1 : Tn3-cos plasmid for determining RNA polymerase binding sites on ColE1 and Tn3. Gene 9, 157-169.
- 6. Kahn, M., Kolter, R., Thomas, Ch., Figurski, D., Meyer, R., Remaut, E. and Helinski D. R. (1979) Plasmid Cloning Vehicles Derived from Plasmids ColE1, F, R6K and RK2. Meth. Enzymol. 68, Acad. Press. 268-280.
- 7. Williams, B. G., Blattner, F. R., Jaskunas, S. R. and Masayasu, N. (1977) Insertion of DNA Carrying Ribosomal Protein Genes of Escherichia coli into Charon Vector Phages. J. Biol. Chem. 252, 7344-7354.
- 8. Scangos, G. and Ruddle, F. H. (1981) Mechanismus and applications of DNA-mediated gene transfer in mammalian cells - a review. Gene 14, 1-10.
- 9. Research News (Allgemeines) (1980) Gene Transfer Moves Ahead. Science, Vol. 210, 1334-1336.
- 10. Wigler, M., Pellicer, A., Silverstein, S. and Axel, R. (1978) Biochemical Transfer of Single-Copy Eucaryotic Genes Using Total Cellular DNA as Donor. Cell 14, 725- 731.
- 11. Perucho, M., Hanahan, D., Lipsich, L. and Wigler, M. (1980) Nature 285, 207-210.
Um die rekombinanten Cosmid-Moleküle an einer einzigen
Stelle zu spalten, wurde eine In-Vivo-Verpackung von
Cosmid-Molekülen gewählt. Eine derartige In-Vivo-Verpackung
erreicht man am leichtesten durch Induktion von
lambda-Lysogen. Während des Verpackungsvorgangs sollen
die rekombinanten Cosmide allein an der cos-Stelle geöffnet
werden. Da erwartet wurde (11), daß zirkulare Moleküle
mit nur einer cos-Stelle mit geringer Ausbeute verpackt
werden, wurden Cosmide mit 2 cos-Stellen entwickelt
(Fig. 1). Um die Brauchbarkeit von pHC79-2cos für den
genannten Zweck zu testen, wurden E.-coli-Genpools gebildet.
Folgendes wurde getestet:
- (a) Die Möglichkeit der Bildung einer repräsentativen Genbank.
- (b) Der Wirkungsgrad einer In-Vivo-Verpackung von rekombinanten Cosmiden.
- (c) Die Möglichkeit, die Repräsentation eines spezifischen Gens nach Vermehrung und In-Vivo-Verpackung unverändert beizubehalten.
Es wurde hochmolekulare chromosomale DNS von E. coli 5K
mit Sau 3A teilweise gespalten, um Fragmente mit einer
Durchschnittsgröße von etwa 40 Kb zu erhalten. Diese mit
Sau 3A gespaltene chromosomale DNS wurde mit pHC79 bzw.
pHC79-2cos verknüpft, die mit BamHI gespalten worden waren.
Nach einer In-Vitro-Verpackung der gespaltenen DNS
wurden die verpackten Cosmide in HB101 oder das lysogene
Derivat BHB3064 transduziert. Es wurden Kolonien selektioniert,
die gegen Ampicillin resistent waren. Etwa 80%
der Klone waren Tetracyclin-sensitiv, was echte Rekombinanten
ohne oligomere Cosmide anzeigte. Die Durchschnittslänge
der Hybridcosmide betrug 40 bis 50 Kb. Es wurde die
Repräsentation spezieller Gene in dem Genpool analysiert,
indem man die Häufigkeit testete, mit der die pro- und
die leu-Mutationen von HB101 und BHB3064 in den Hybridklonen
komplementiert wurden (5). Gemäß Clarke and Carbon
(12) sind etwa 311 Klone dieser Größe erforderlich, um
ein spezielles Gen mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,95
zu finden; man würde also von mindestens 0,3% der Hybridklone
erwarten, daß sie irgendein spezielles Gen tragen.
Für eine große Anzahl von Klonen und eine statistische
Verteilung von Fragmenten sollte dieser Wert 0,9% erreichen
(5). Drei von vier Poolen (Tabelle I) ergaben
Werte, die man für eine statistische Verteilung von geklonten
Sequenzen erwartet. Eine Restriktionsanalyse von
Cosmid-DNS für einzelne pro⁺- und leu⁺-Kolonien zeigte,
daß diese Klone eine ganze Reihe von überlappenden chromosomalen
Fragmenten enthielten. Etwa 70% der Klone, die
sich von pHC79-2cos ableiteten, hatten ihre Tandem-cos-
Struktur beibehalten. Diese Feststellung stimmt mit den
Ergebnissen beim Verpacken von lambda-Chromosomen mit
mehreren cos-Stellen überein (13).
Die In-Vivo-Verpackung von Cosmiden ist bekannt (8, 14).
Bei Voruntersuchungen mit E. coli 1400 wurde eine relativ
geringe Ausbeute für eine Cosmidverpackung, ein
sehr geringer Phagenhintergrund bzw. -untergrund und
keine Instabilität der geklonten Sequenzen festgestellt.
Andererseits wurde mit W3110 (lambdacIts857 Sam 7) eine
Verpackung von bis zu 8 × 10⁹ ApR-Transduktionspartikeln/
ml festgestellt, jedoch war erwartungsgemäß die Verpackung
von endogenen lambda-Phagen gleichfalls sehr hoch. Ferner
wurde eine Instabilität der Hybridcosmide festgestellt,
und zwar möglicherweise da zelluläre und Phagenrekombinationssysteme
aktiv waren. Schließlich wurde BHB3064
[von B. Hohn; HB101 (lambda i⁴ cIts red3 B2 Sam 7)] für
weitere Versuche verwendet.
Um den Einfluß der cos-Stellen-Duplikation auf den In-
Vivo-Verpackungsgrad festzustellen, wurden zwei Cosmidpaare
verwendet. Es wurden pCos 41 und pCos 44 von Prolinunabhängigen
Klonen gewählt, da ihre Eca I-Spaltungsprodukte
einen identischen Eindruck mit Ausnahme der 1,65-Kb-
Bande machten, die anzeigt, daß das Tandem-BglII-Fragment
(Fig. 1) in pCos 44 vorliegt. pCos 41 enthält eine einzige
cos-Stelle. Es wurde ein zusätzliches Cosmidpaar mit einer
bzw. zwei cos-Stellen durch In-Vivo-Verpacken von pCos 34
gebildet, das zwei cos-Stellen enthält (Fig. 2). Eine
In-Vivo-Verpackung von Tandem-cos-Strukturen kann zur
Deletion von DNS zwischen den cos-Stellen führen (13).
Drei von zehn getesteten Klonen hatten eine cos-Stelle
mit einem BglII-Fragment verloren. Einer davon (pCos 31)
wurde für weitere Untersuchungen verwendet.
Von E. coli 1400 und BHB3064 beherbergte Cosmide mit
einer (pCos 31, pCos 41) oder zwei (pCos 34, pCos 44) cos-
Stellen ließ man bis zu etwa 5 × 10⁷ Zellen/ml bei 30°C
wachsen. Der lysogene Lambda Phage wurde induziert, indem
man auf 45°C 30 min lang erhitzte und 3 h lang bei 37°C
verpacken ließ. Die Anzahl der verpackten Cosmide wurde
durch Transduktion in HB101 bestimmt (Tabelle II).
Es wurden bis zu 30 oder 80 Transduktionsteilchen pro induzierte
Zelle für Cosmide mit 1 bzw. 2 cos-Stellen gefunden.
Die Anzahl der Plasmidkopien wurden nicht bestimmt,
jedoch wurde für Cosmide, die in entsprechender Weise gebildet
worden waren, eine Kopienanzahl von etwa 5 pro Zelle
angegeben (6). So sprechen die Ergebnisse für einen
gewissen Replikationsumfang der Cosmide nach Temperaturverschiebung
und für einen hohen Verpackungsgrad. Tabelle
II zeigt ferner, daß Cosmide mit zwei Tandem-cos-Stellen
etwa 2- bis 4mal mehr Transduktionspartikel als die korrespondierenden
Cosmide mit einer cos-Stelle lieferten.
Diese Feststellung war etwas unerwartet, da bekannt ist,
daß Lambda-Ringe mit einer cos-Stelle viel schlechtere
Verpackungssubstrate als Ringe mit einer cos-Verdoppelung
sowohl in vivo als auch in vitro sein sollen (11, 15). Die
Anzahl von Transduktionspartikeln pro induzierte Zellen
fiel mit steigender Zelldichte ab, jedoch ist die Gesamtausbeute
an verpackten Cosmiden bei Zelldichten von 1 bis
2 × 10⁸ ml am größten. Für Cosmide mit 2 cos-Stellen können
Titer von bis zu 10¹⁰ Transduktionspartikeln/ml bei
BHB 3064 erreicht werden. Dadurch wurde eine präparative
Isolation von Transduktionspartikeln möglich (8). Die
verpackte DNS wurde aus den Partikeln extrahiert und mit
BglII abgebaut. Fig. 2 zeigt, daß das 1,65 Kb-cos-Fragment
bei verpackter pCos-31-DNS fehlt und daß zwei neue
Banden mit einer Länge von 1,3 und 0,35 Kb auftreten. Diese
Beobachtung stimmt mit den Werten überein, die für
das rechte und linke BglII-Endfragment von lambda-Charon4A
(16) mit einer Ableitung des cos-Fragments gemäß (6)
ermittelt wurden. Bei einem Abbau von verpackter pCos 34-
DNS mit BglII werden diese Fragmente gleichfalls gebildet,
jedoch ist die 1,65-Kb-Bande noch vorhanden, jedoch nicht
in molaren Mengen.
Eine Lambda-Verpackung hängt vom Vorliegen von zwei cos-
Regionen der gleichen Orientierung, die durch eine DNS mit
einer Länge von 75 bis 105% des Lambda-Genoms getrennt
sind, jedoch nicht von den inneren Sequenzen ab (11).
Demgemäß sollten Cosmidpoole, die diesen Anforderungen
entsprechen, mit etwa gleichem Wirkungsgrad und ohne Gesamtänderung
der Genrepräsentation verpackt
werden können. Um diese Annahme zu testen, wurden
E.-coli-Genpoole getestet (Tabelle I). Die gegen Ampicillin
resistenten Kolonien wurden von den Platten heruntergewaschen,
auf etwa 10⁷ Zellen/ml verdünnt und bis zu etwa 10⁸
Zellen/ml wachsen gelassen. Es wurden Verdünnungen dieser
Kulturen verwendet, um die Genrepräsentation vor der In-
Vivo-Verpackung zu testen. Nach einer In-Vivo-Verpackung
wurden die verpackten Cosmide zum Infizieren von HB101
verwendet. Es wurden gegen Ampicillin resistente Transduktanten
für eine Prolin- und Leucin-Prototrophie selektioniert.
Es wurde keine signifikante Änderung der relativen Häufigkeit
von pro- und leu-Prototrophen ermittelt (Tabelle I).
(Stufen i bis v) Für eine durch Einbringen von DNS bewirkte
Genübertragung wurde in pHC79-2cos das 3,6 Kb-
BamHI-Fragment von M2 (17) eingeführt, das das HSV-Thymidinkinasegen
enthält, einen selektiven Marker in Ltk--Zellen. pHC79-2cos/tk
(Fig. 1) wurden an der einzigen ClaI-Stelle geschnitten und
mit Mausleber-DNS verknüpft, die teilweise mit TaqI geschnitten
worden war. Nach einer In-Vitro-Verpackung und
Transduktion in BHB3064 wurde ein Klon (pCostk511) aus dem
Mausgenpool isoliert und für weitere Experimente verwendet.
(Stufen vi b1 bis vi b4) Es wurde lineare pCostk-511-DNS
nach einer In-Vivo-Verpackung in Transduktionspartikel
isoliert (Fig. 3). Die isolierte lineare pCostk-511-DNS
wurde mit einem 20fachen Überschuß von Lambda-DNS verknüpft,
um die klebrigen Enden gegen einen möglichen
Nukleaseangriff während des Transformationsvorgangs zu
schützen und funktionelle cos-Stellen zu rekonstruieren.
(Stufe vii) Die Ligationsmischung wurde zur Transformation
von Ltk--Zellen verwendet. Es wurden etwa 1000 Kolonien/µg
an pCostk-511-DNS nach einer HAT-Selektion ermittelt (18).
(Stufe viii) Man ließ Mischungen von etwa 10 HAT-resistenten
Transformanten zu Massenkulturen wachsen. (Stufe ix) Eine
"Southern"-Analyse von mit EcoRI abgebauter chromosomaler
DNS zeigte Banden von 6,7; 8,4; und größer 20 Kb; es
handelt sich um Größen, die für Vektoren mit cos-Stellen
erwartet wurden, die durch Verknüpfen von klebrigen Enden
von Phagen und Cosmiden gewonnen wurden (Fig. 4). (Stufen
x bis xii) Es wurde hochmolekulare DNS zum Freisetzen von
Cosmid-DNS durch In-Vitro-Verpacken und nachfolgende Transduktion
in E. coli HB101 verwendet. (Stufe xiii) In zwei Experimenten
wurden etwa 50 gegen Ampicillin resistente Kolonien
pro µg DNS isoliert (Tabelle III). Es wurde Cosmid-
DNS aus diesen Klonen gewonnen und durch Restriktionsenzymanalyse
analysiert (Fig. 3). Es wurden drei Cosmidtypen
ermittelt: zwei von ihnen (pCostk-511/23 und pCostk-
511/42) waren mit pCostk-511 mit ein bzw. zwei cos-Stellen
identisch, der dritte Cosmidtyp (pCostk-511/41) erfuhr eine
Umlagerung, höchstwahrscheinlich infolge einer Rekombination
mit benachbarten Lambda-Sequenzen. Dieser Typ wurde stärker
freigesetzt, vermutlich wegen seiner größeren Größe (46 Kb).
Er vertrat 80% aller freigesetzten Cosmide. pCostk-511 ist
nur etwa 38 Kb lang, so daß seine Größe in der Nähe des
unteren Grenzwertes für ein wirksames Verpacken liegt (11).
(Stufen vi c1 bis viii) Es wurde angenommen, daß das Freisetzen
von transferierter DNS durch eine In-Vitro-Verpackung
auch für lambda-Sequenzen möglich sein sollte.
Daher wurde DNS eines lambda-Hybridklons (λchtk-1) (3) verwendet,
die das Hühnchenthymidinkinasegen als Selektionsmarker
für eine durch Einbringen von DNS bewirkte Genübertragung
in Ltk--Zellen enthält. Vor der Transformation
wurde λchtk-1-DNS oligomerisiert, um die cos-Stellen beizubehalten.
(Stufen ix bis xi) Die DNS von HAT-resistenten
Zellen wurde aus Klonmischungen bzw. Subklonen isoliert
und für eine Southern-Hybridisierung und In-Vitro-Verpackung
verwendet (Tabelle III). Es wurden λchtk-1-Phagen
durch Hybridisieren zu einem Plasmid identifiziert, das das
Hühnchenthymidinkinasegen enthielt (3). Das Restriktionsmuster
und die Southern-Hybridisierung von vier durch
Flecken (plaque) gereinigten Phagen fiel so aus, wie sie
für λchtk-1 erwartet wurden (Fig. 5).
Es wurde pHC79 mit BglII geschnitten; die Fragmente wurden
aus einem präparativen Agarosegel isoliert. Das kleinere
Fragment mit 1,65 Kb, das die cos-Stelle enthielt, wurde unter
Bedingungen verknüpft, bei denen hauptsächlich 2 bis
3 Moleküle verknüpft wurden. Die resultierenden Oligomeren
wurden durch Agarosegelelektrophorese getrennt. Die
DNS der Bande, die dem Dimeren des 1,65-Kb-Fragments entsprach,
wurde isoliert und mit dem großen BglII-Fragment
des pHC79 verknüpft, das zuvor mit alkalischer Phosphatase
behandelt worden war. Die nach der Ligation resultierende
DNS wurde zum Transformieren von HB101 verwendet; mehrere
Transformanten wurden daraufhin selektioniert, ob ein
Dimeres des 1,65 Kb-BglII-Fragments vorlag. Das Vorliegen
des Dimeren BglII-Fragments wurde bestätigt, indem man
Plasmid-DNS von ApR, TcR-Klonen mit BglII und EcaI schnitt.
Ein BglII-Abbau liefert dieselben Fragmente wie pHC79,
wobei jedoch die 1,65-Kb-Bande doppelt so stark ausgebildet
ist. EcaI spaltet pHC79-2cos zweimal und liefert ein
Fragment der gleichen Größe wie das kleine BglII-Fragment,
das aus den Tandem-cos-Stellenträgerfragmenten freigesetzt
wird. Es können sämtliche Enzyme, die zum Klonen mit pHC79
(6) verwendet werden können, gleichfalls mit pHC79-2cos
verwendet werden, wobei EcaI ausgenommen ist.
Das Cosmid pHC79-2cos/tk wurde dadurch gebildet, daß man
das 3,6-Kb-BamHI-Fragment, das das HSV-Thymidinkinasegen
trug, in die BamHI-Stelle des pHC79-2cos einsetzte. Die
Restriktionskarte für pHC79-2cos/tk ist in Fig. 1 wiedergegeben.
(a) (Stufe i) Es wurde DNS von E. coli 5K teilweise mit
Sau 3A abgebaut, wobei Fragmente mit einer Durchschnittslänge
von etwa 40 Kb erhalten wurden. (Stufe ii a) Diese
DNS wurde mit einem 6fachen molaren Überschuß von mit
BamHI gespaltenem pHC79 bzw. pHC79-2cos verknüpft. Die
DNS-Gesamtkonzentration während der Verknüpfung betrug
etwa 300 µg/ml.
(b) Es wurde hochmolekulare DNS aus Mausleber isoliert und
teilweise mit TaqI abgebaut. Nach einer Phenolextraktion
und einer Äthanolfällung wurde die DNS mit pHC79-2cos/tk
(das mit ClaI abgebaut worden war) unter entsprechenden
Bedingungen verknüpft.
(Stufe iii) Das In-Vitro-Verpacken von verknüpfter DNS
und das Transduzieren von Cosmiden in HB101 wurde gemäß
(6) durchgeführt. Der Verpackungsgrad betrug 2 × 10⁴ bis
2 × 10⁵ Transduktionsteilchen je µg Fremd-DNS. (Stufe iv)
Die Transduktion in lambda-Lysogene wurde bei 30°C
durchgeführt.
Es wurde mit E. coli 1400, λBAM; E. coli W3110, λcIts857
Sam 7 und BHB3064 (HB101, λi⁴cIts red 3 b2 Sam 7) gearbeitet.
(Stufe v) Es wurden lambda-lysogene Stämme, die Cosmide
beherbergten, bis zu 1 × 10⁸ Zellen/ml bei 30°C wachsen
gelassen. (Stufe vi b1) Man induzierte durch Erhitzen auf
45°C 30 min lang und ließ 3 h lang bei 37°C verpacken.
(Stufen vi b2 bis vi b3) Die verpackten Cosmide wurden
gemäß (8) isoliert.
Es wurde rekombinante Cosmid-DNS des Klons pCostk-511
nach der In-Vivo-Verpackung (8) isoliert. Die lineare
pCostk-511-DNS bzw. λchtk-1-DNS wurde in vitro mit Hilfe
der kohäsiven Enden verknüpft. Der Verknüpfungsgrad wurde
durch eine Agarosegelelektrophorese (0,2%) bestimmt.
(Stufe vi b4) Etwa die Hälfte der DNS lag in Form von
Ketten von 3 oder mehr Molekülen vor. Bei einem Versuch
(Versuche 5 und 6 in Tabelle III) wurde die verknüpfte
λchtk-1-DNS, die aus mindestens drei Molekülen bestand,
vor dem Transfer in Ltk--Zellen isoliert. (Stufen vii bis
ix) Ltk--Zellen wurden gemäß (9) transformiert. Southern-
Analyse und radioaktive Markierung von DNS mit Hilfe von
"nick translation" wurde gemäß (10) durchgeführt.
(Stufen x bis xi) Es wurde hochmolekulare DNS (≅ 150 Kb)
aus tk⁺-Kolonien (9) isoliert und zum Freisetzen von
Transformations-DNS durch In-Vitro-Verpacken verwendet.
Es wurden etwa 300 ng hochmolekulare DNS pro Verpackungsmischung
zugegeben (6). (Stufen xii bis xiii) Es wurden
gegen Ampicillin resistente Kolonien nach einer Transduktion
freigesetzter Cosmide in HB101 isoliert. Lambda-Klone
wurden nach Infektion von LE392 isoliert.
Fig. 1: Aufbau von pHC79-2cos/tk. Die Zahlen geben den
Abstand von der EcoRI-Schnittstelle in Kilobasenpaaren an
(Kb). Die selektionierbaren Marker sind das Thymidinkinasegen
(TK) des Herpes-simplex-Virus und die Ampicillin-
Resistenz (ApR). cos markiert die Stelle von kohäsiven
lambda-Enden (6). Beim pHC79-2cos fehlt das BamHI-Fragment,
das das tk-Gen enthält.
Fig. 2: Linearisierung von Cosmid-DNS durch In-Vivo-Verpackung.
Agarosegelektrophorese von mit BglII geschnittener
DNS von:
(a) lambda-Charon 4A;
(b) pCos 31, als ccc-DNS isoliert;
(c) pCos 31, aus Transduktionsteilchen isoliert;
(d) pCos 34-ccc-DNS;
(e) pCos 34 aus Transduktionsteilchen;
(f) pHC79;
(g) pHC79-2cos.
(b) pCos 31, als ccc-DNS isoliert;
(c) pCos 31, aus Transduktionsteilchen isoliert;
(d) pCos 34-ccc-DNS;
(e) pCos 34 aus Transduktionsteilchen;
(f) pHC79;
(g) pHC79-2cos.
Die Proben wurden auf 65°C 10 min erhitzt, um die klebrigen
Enden vor dem Aufbringen auf das Gel zu schmelzen. l und r
bezeichnen das linke bzw. das rechte BglII-Fragment von
Lambda-Charon 4A.
Fig. 3: Restriktionsanalyse von Cosmiden die aus hochmolekularer
DNS transformierter Ltk--Zellen freigesetzt worden
sind. Die DNS-Fragmente wurden unter Anwendung einer horizontalen
Agarosescheibengelelektrophorese getrennt.
(A) BglII-Abbauprodukte von
(1) linearer pCostk-511-DNS, die aus Transduktionsteilchen isoliert wurde;
(2) pCostk-511/42;
(3) pCostk-511/23;
(4) pCostk-511/41; und
(5) pHC79-2cos/tk.
(1) linearer pCostk-511-DNS, die aus Transduktionsteilchen isoliert wurde;
(2) pCostk-511/42;
(3) pCostk-511/23;
(4) pCostk-511/41; und
(5) pHC79-2cos/tk.
l und r zeigen die Position des linken und rechten BglII-
Fragments von Lambda-Charon 4A an. Die Stirnbande des
Streifens 1 geht höchstwahrscheinlich auf endogene lambda-
DNS zurück.
(B) BamHI-Abbauprodukte von
(1) pCostk-511/42;
(2) pCostk-511/41; und
(3) pCostk-511/23.
(1) pCostk-511/42;
(2) pCostk-511/41; und
(3) pCostk-511/23.
Der Pfeil markiert das 3,6 Kb-Fragment, das das Thymidinkinasegen
enthält.
(C) Eca I-Abbauprodukte von
(1) pCostk-511/42;
(2) pCostk-511/41; und
(3) pCostk-511/23.
(1) pCostk-511/42;
(2) pCostk-511/41; und
(3) pCostk-511/23.
Der Pfeil markiert das 1,65-Kb-Fragment, das das Vorliegen
von zwei Tandem-cos-Fragmenten im pCostk-511/42 anzeigt.
Fig. 4: Southern-Analyse von DNS aus transformierten Ltk--
Zellen. Es wurde hochmolekulare DNS aus transformierten Mauszellen
mit EcoRI geschnitten und die Fragmente wurden auf
einem Agarosegel (1%) getrennt. Die DNS wurde auf ein
Nitrozellulosefilter übertragen und mit pHC79-2-cos/tk-DNS
hybridisiert, die durch "nick translation" mit ³²P markiert
worden war.
(a) Ltk--λchtk-250,1
(b) Ltk-pCostk-511-17 und
(c) Ltk-pCostk-511-19.
(b) Ltk-pCostk-511-17 und
(c) Ltk-pCostk-511-19.
Die Größen sind in Kb angegeben.
Fig. 5: Analyse von λchtk-Phagen, die aus hochmolekularer
DNS transformierter Mauszellen durch In-Vitro-Verpacken
freigesetzt wurden. Die DNS von vier freigesetzten Phagen
wurde mit EcoRI (A, B), EcoRI und HindIII (C, D) und
HindIII (E, F) geschnitten. Die Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese
getrennt, fleckenförmig auf Nitrozellulosefilter
aufgetragen und mit pchtk-2-DNS hybridisiert,
die einer "nick translation" unterworfen worden war (3).
A, C und E betreffen das mit Ethidiumbromid gefärbte Gel,
B, D und F die entsprechenden Autoradiogramme.
(1) λchtk-8/1;
(2) λchtk-250,1/1;
(3) λchtk-250,1/3;
(4) λchtk-250,1/3; und
(5) lambda-Charon 4A.
(2) λchtk-250,1/1;
(3) λchtk-250,1/3;
(4) λchtk-250,1/3; und
(5) lambda-Charon 4A.
λchtk-8/1 wurde aus DNS eines einzigen HAT-resistenten Klons
freigesetzt (Tabelle III, Versuch 4), λchtk-250,1/1, 3 und
4 aus DNS einer Mischung von etwa 100 Klonen (Tabelle III,
Versuch 3).
Im folgenden werden verwendete technische Ausdrücke, insbesondere
verwendete Biomaterialien näher erläutert. Bezüglich
der verwendeten Biomaterialien soll der Fachmann alle Informationen
erhalten, die ihn in die Lage versetzen, das erfindungsgemäße
Verfahren mit den genannten oder entsprechenden
Biomaterialien mit dem erfindungsgemäßen Erfolg ohne weiteres
durchzuführen.
Zur genetischen Nomenklatur vgl. man insbesondere Literatur
B 22.
- ApR: Ampicillin-Resistenz
- BamHI: Restriktionsendonuklease
- Bgl II: Restriktionsendonuklease
- BHB3064: vgl. E. coli
- BHB3064 (HB101, λi⁴cIts red3 b2 Sam7): vgl. E. coli
- ccc-DNS: kovalent geschlossene ringförmige DNS
- cfu: Kolonie bildende Einheit
- ClaI: Restriktionsendonuklease
- cos-Stelle: Literatur A1, Seite 291
- EcaI: Literatur A1, Seite 293
- EcoRI: Restriktionsendonuklease
- E. coli 5K: DSM 1454; Lieferant für pro- und leu-Gene in Verpackungstestexperimenten (hsr-, hsm⁺, thr-, thi-)
- E. coli 1400: Literatur B7, Seite 2382; lysogenisiert mit λ 5/2; wichtig: lysogener Stamm mit mutierten Rekombinationsgenen, Temperaturinduktion führt zur Bildung von Phagenproteinen und Lysis der Zellen; snp E, snp F, hss-, met-, rec A 56
- E. coli 1400, λBAM: Literatur B7
- E. coli 3110: vgl. E. coli W 3110
- E. coli 3110 (λcIts857 Sam7): vgl. E. coli W 3110 (cITs 857 Sam7)
- E. coli BHB3064 = HB101; lysogenisiert mit λi⁴cIts red3 b2 Sam7; wichtig: temperatur-induzierbarer (cIts) Lambda-lysogener Stamm mit mutiertem Phagen-Rekombinationsystem (red3) und Lysissystem (Sam7), d. h. durch Temperaturerhöhung wird die Bildung von Phagenproteinen induziert, Rekombination der DNS und Lysis der Zellen ist unterdrückt; In-Vivo-Verpackungsstamm
- E. coli BHB3064 (HB101, λi⁴cIts red3 b2 Sam7): vgl. vorstehend
- E. coli HB101: DSM 1452; Literatur A1, Seite 292, und B 20; pro-, leu-, thi-, lacY-, hsdR-, endA-, recA-, rpsL20, ava 14,
galK2, xyl5, mtl1-1, supE44; wichtig: defektes E.-coli-Rekombinationssystem (recA-) und Restriktionssystem (hsdR-); Teststamm für pro- und leu-Komplementation
- E. coli LE392 = ED 8654; Literatur B19; supE, supF, hsdR-, hsdM⁺, met-, trpR; wichtig: Phagenteststamm, erlaubt auch die Vermehrung von Phagen mit Amber-Mutation (z. B. Sam7) wegen der Suppressormutationen (supE, supF)
- E. coli W3110: Literatur B21, Seite 535; entspricht fast dem Wildtyp von E. coli K12
- E. coli W3110 (λcIts857 Sam7) = W3110; lysogenisiert mit temperatur-induzierbarem, Lysis-defekten Lambda-Phagen gcIts857 Sam7; In-Vivo-Verpackungsstamm, weniger geeignet wegen funktionierendem Rekombinationssystem und hoher Phagenproduktion, wird normalerweise zur Isolierung von λ-Standard-DNS verwendet
- HAT = HAT-Medium; Literatur A10, Seite 731
- HB101: vgl. E. coli
- HindIII: Restriktionsendonuklease
- HSV: Herpes-Simplex-Virus; Literatur A10, Seite 725
- HSV-Thymidinkinasegen: Literatur A10, Seite 725
- Kb: Kilobasenpaare
- Lambda-Charon 4A: Literatur A3, Seite 687
- λchtk-Phagen: Phagen Lambda, die das Hühner-Thymidinkinasegen enthalten
- λchtk-1: Literatur A11, Seite 208
- λchtk-8/1, λchtk-250,1/1, λchtk-250,1/3 und λchtk- 250,1/4: λchtk-Phagen, die durch In-Vitro-Verpackung von DNS aus mit λchtk-1 transformierten Mauszellen isoliert wurden (vgl. den speziellen experimentellen Teil)
- LE392: vgl. E. coli
- leu⁺: leuchin-unabhängig
- leu-: leuchin-abhängig
- Ltk-λchtk-250,1: Ltk-Zellen, die mit λchtk-1 transformiert wurden (vgl. den speziellen experimentellen Teil)
- Ltk--Zellen: Maus-Zellinie (von M. Wigler); wichtig: stabile Linie mit defektem Thymidinkinasegen, keine Spontanrevertanten; Literatur A10, Seite 730
- Ltk-pCostk-511-17 und Ltk-pCostk-511-19: Ltk-Zellen, die mit pCostk-511 transformiert wurden
- M2: Literatur B17
- nick translation: Methode zur Herstellung von radioaktiv markierter DNS mit hoher spezifischer Aktivität; ausgehend von einem Bruch in einem der komplementären DNS-Stränge (nick) wird mit Hilfe von DNS-Polymerase und radioaktiven Nukleotiden eine Kopie des intakten Stranges synthetisiert; Literatur A10, Seite 730
- pchtk-2: Literatur A11, Seite 208
- pCos 31 (1 cos-Stelle), pCos 34 (2 cos-Stellen), pCos 41 (1 cos-Stelle) und pCos 44 (2 cos-Stellen): Cosmide, die die pro-- Mutation von HB101 komplementieren (ca. 40-45 Kb)
- pCostk-511: Derivat von pHC79-2cos/tk, das Mäuseleber-DNS enthält (ca. 38 Kb)
- pCostk-511/23, pCostk-511/41 und pCostk-511/42: Cosmide, die durch In-Vitro-Verpacken aus DNS von mit pCostk-511 transformierten Mauszellen isoliert wurden
- BamHI: Restriktionsendonuklease
- Bgl II: Restriktionsendonuklease
- BHB3064: vgl. E. coli
- BHB3064 (HB101, λi⁴cIts red3 b2 Sam7): vgl. E. coli
- ccc-DNS: kovalent geschlossene ringförmige DNS
- cfu: Kolonie bildende Einheit
- ClaI: Restriktionsendonuklease
- cos-Stelle: Literatur A1, Seite 291
- EcaI: Literatur A1, Seite 293
- EcoRI: Restriktionsendonuklease
- E. coli 5K: DSM 1454; Lieferant für pro- und leu-Gene in Verpackungstestexperimenten (hsr-, hsm⁺, thr-, thi-)
- E. coli 1400: Literatur B7, Seite 2382; lysogenisiert mit λ 5/2; wichtig: lysogener Stamm mit mutierten Rekombinationsgenen, Temperaturinduktion führt zur Bildung von Phagenproteinen und Lysis der Zellen; snp E, snp F, hss-, met-, rec A 56
- E. coli 1400, λBAM: Literatur B7
- E. coli 3110: vgl. E. coli W 3110
- E. coli 3110 (λcIts857 Sam7): vgl. E. coli W 3110 (cITs 857 Sam7)
- E. coli BHB3064 = HB101; lysogenisiert mit λi⁴cIts red3 b2 Sam7; wichtig: temperatur-induzierbarer (cIts) Lambda-lysogener Stamm mit mutiertem Phagen-Rekombinationsystem (red3) und Lysissystem (Sam7), d. h. durch Temperaturerhöhung wird die Bildung von Phagenproteinen induziert, Rekombination der DNS und Lysis der Zellen ist unterdrückt; In-Vivo-Verpackungsstamm
- E. coli BHB3064 (HB101, λi⁴cIts red3 b2 Sam7): vgl. vorstehend
- E. coli HB101: DSM 1452; Literatur A1, Seite 292, und B 20; pro-, leu-, thi-, lacY-, hsdR-, endA-, recA-, rpsL20, ava 14,
galK2, xyl5, mtl1-1, supE44; wichtig: defektes E.-coli-Rekombinationssystem (recA-) und Restriktionssystem (hsdR-); Teststamm für pro- und leu-Komplementation
- E. coli LE392 = ED 8654; Literatur B19; supE, supF, hsdR-, hsdM⁺, met-, trpR; wichtig: Phagenteststamm, erlaubt auch die Vermehrung von Phagen mit Amber-Mutation (z. B. Sam7) wegen der Suppressormutationen (supE, supF)
- E. coli W3110: Literatur B21, Seite 535; entspricht fast dem Wildtyp von E. coli K12
- E. coli W3110 (λcIts857 Sam7) = W3110; lysogenisiert mit temperatur-induzierbarem, Lysis-defekten Lambda-Phagen gcIts857 Sam7; In-Vivo-Verpackungsstamm, weniger geeignet wegen funktionierendem Rekombinationssystem und hoher Phagenproduktion, wird normalerweise zur Isolierung von λ-Standard-DNS verwendet
- HAT = HAT-Medium; Literatur A10, Seite 731
- HB101: vgl. E. coli
- HindIII: Restriktionsendonuklease
- HSV: Herpes-Simplex-Virus; Literatur A10, Seite 725
- HSV-Thymidinkinasegen: Literatur A10, Seite 725
- Kb: Kilobasenpaare
- Lambda-Charon 4A: Literatur A3, Seite 687
- λchtk-Phagen: Phagen Lambda, die das Hühner-Thymidinkinasegen enthalten
- λchtk-1: Literatur A11, Seite 208
- λchtk-8/1, λchtk-250,1/1, λchtk-250,1/3 und λchtk- 250,1/4: λchtk-Phagen, die durch In-Vitro-Verpackung von DNS aus mit λchtk-1 transformierten Mauszellen isoliert wurden (vgl. den speziellen experimentellen Teil)
- LE392: vgl. E. coli
- leu⁺: leuchin-unabhängig
- leu-: leuchin-abhängig
- Ltk-λchtk-250,1: Ltk-Zellen, die mit λchtk-1 transformiert wurden (vgl. den speziellen experimentellen Teil)
- Ltk--Zellen: Maus-Zellinie (von M. Wigler); wichtig: stabile Linie mit defektem Thymidinkinasegen, keine Spontanrevertanten; Literatur A10, Seite 730
- Ltk-pCostk-511-17 und Ltk-pCostk-511-19: Ltk-Zellen, die mit pCostk-511 transformiert wurden
- M2: Literatur B17
- nick translation: Methode zur Herstellung von radioaktiv markierter DNS mit hoher spezifischer Aktivität; ausgehend von einem Bruch in einem der komplementären DNS-Stränge (nick) wird mit Hilfe von DNS-Polymerase und radioaktiven Nukleotiden eine Kopie des intakten Stranges synthetisiert; Literatur A10, Seite 730
- pchtk-2: Literatur A11, Seite 208
- pCos 31 (1 cos-Stelle), pCos 34 (2 cos-Stellen), pCos 41 (1 cos-Stelle) und pCos 44 (2 cos-Stellen): Cosmide, die die pro-- Mutation von HB101 komplementieren (ca. 40-45 Kb)
- pCostk-511: Derivat von pHC79-2cos/tk, das Mäuseleber-DNS enthält (ca. 38 Kb)
- pCostk-511/23, pCostk-511/41 und pCostk-511/42: Cosmide, die durch In-Vitro-Verpacken aus DNS von mit pCostk-511 transformierten Mauszellen isoliert wurden
- pHC79: Literatur A1
- pHC79-2cos: pHC79 mit 2 cos-Stellen
- pHC79-2cos/tk: pHC79-2cos mit HSV-Thymidinkinasegen
- pro⁺: Prolin-unabhängig
- pro-: Prolin-abhängig
Sau 3A: Restriktionsendonuklease
- Southern-Analyse: auch Southern-blot-Analyse oder Southern- Hybridisierung; eine von E. M. Southern entwickelte Technik, bei der im Gel aufgetrennte DNS-Fragmente durch gerichtete Diffusion auf Nitrocellulosepapier übertragen werden (blot); die DNS wird durch Backen (z. B. 3 h bei 60°C) am Nitrocellulosefilter fixiert; durch Hybridisieren mit speziellen radioaktiven Proben kann die Größe von spezifischen Gen-Fragmenten analysiert werden; Literatur B10, Seite 6200 und B23
- Tandem-cos-Stellen: zwei in gleicher Richtung hintereinander angeordnete cos-Stellen
- Ta I: Restriktionsendonuklease
- TK: Thymidinkinasegen
- tk-Gen: Thymidinkinasegen
- tk⁺: bildet Thymidinkinase
- tk-: bildet Thymidinkinase nicht
- W3110: vgl. E. coli
- W3110 (λcIts857 Sam7) vgl. E. coli
- pHC79-2cos: pHC79 mit 2 cos-Stellen
- pHC79-2cos/tk: pHC79-2cos mit HSV-Thymidinkinasegen
- pro⁺: Prolin-unabhängig
- pro-: Prolin-abhängig
Sau 3A: Restriktionsendonuklease
- Southern-Analyse: auch Southern-blot-Analyse oder Southern- Hybridisierung; eine von E. M. Southern entwickelte Technik, bei der im Gel aufgetrennte DNS-Fragmente durch gerichtete Diffusion auf Nitrocellulosepapier übertragen werden (blot); die DNS wird durch Backen (z. B. 3 h bei 60°C) am Nitrocellulosefilter fixiert; durch Hybridisieren mit speziellen radioaktiven Proben kann die Größe von spezifischen Gen-Fragmenten analysiert werden; Literatur B10, Seite 6200 und B23
- Tandem-cos-Stellen: zwei in gleicher Richtung hintereinander angeordnete cos-Stellen
- Ta I: Restriktionsendonuklease
- TK: Thymidinkinasegen
- tk-Gen: Thymidinkinasegen
- tk⁺: bildet Thymidinkinase
- tk-: bildet Thymidinkinase nicht
- W3110: vgl. E. coli
- W3110 (λcIts857 Sam7) vgl. E. coli
- 1. Scangos, G. and Ruddle, F. H. (1981) Gene 14, 1-10.
- 2. Stiles, J. I., Szastall, J. W., Young, A. T., Wu, R., Consaul, S. and Sherman, F. (1981) Cell 25, 277-284.
- 3. Perucho, M., Hanahan, D., Lipsich, L. and Wigler, M. (1980) Nature 285, 207-210.
- 4. Hanahan, D., Lane, D., Lipsich, L., Wigler, M. and Botchan, M. (1980) Cell 21, 127-139.
- 5. Collins, J. and Brüning, H. (1978) Gene 4, 85-107.
- 6. Hohn, B. and Collins, J. (1980) Gene 11, 291-298.
- 7. Cami, B. and Kourilsky, P. (1978) Nucleic Acids Res. 5, 2381-2390.
- 8. Vollenweider, H. J., Fiandt, M., Rosenvold, E. C. and Szybalski, W. (1980) Gene 9, 171-174.
- 9. Wigler, M., Pellicer, A., Silverstein, S., Axel, R., Urlaub, G. and Chasin, L. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1373-1376.
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- 23. Southern, E. M., J. Mol. Biol. 98 (1975) 503-518.
Claims (5)
1. Verfahren zur Überführung eines speziellen eukaryontischen
Gens eines Genoms in Escherichia coli, dadurch gekennzeichnet,
daß man
- (i) in an sich bekannter Weise DNS-Material, das ein Genom mindestens einmal umfaßt, das das spezielle Gen aktiv oder inaktiv enthält, zu sich überlappenden DNS-Fragmenten zerschneidet,
- (ii) bis (v) in an sich bekannter Weise jedes DNS-Fragment mit einem Vektor, bei dem es sich um deletierte Phagen Lambda oder lambdoide Phagen oder Cosmide handelt, koppelt, die gebildeten Koppelungsprodukte in vitro verpackt, die gebildeten In-Vitro- Verpackungsprodukte in Escherichia coli transduziert (d. h. eine Genbank bildet) und die Koppelungsprodukte repliziert,
- (vi) in an sich bekannter Weise die Koppelungsprodukte (ggf. nach einer In-Vivo-Verpackung) aus den Escherichia-coli-Hybriden (und ggf. aus der Verpackung) isoliert,
- (vii) in an sich bekannter Weise die isolierten (und ggf. oligomerisierten)
Koppelungsprodukte in etablierte animalische Zellen
transferiert, die das spezielle Gen nicht oder inaktiviert enthalten,
und ein Gemisch aus
- (a) Zellen ohne aufgenommenes Koppelungsprodukt und Zellen mit jeweils einem Koppelungsprodukt oder
- (b) Zellen ohne aufgenommenes Koppelungsprodukt und Zellen mit jeweils mehreren und ggf. auch jeweils nur einem Koppelungsprodukt erhält,
- (viii) bis (x) in an sich bekannter Weise die im erhaltenen Gemisch enthaltenen Zellen repliziert und auf Zellen mit jeweils ein oder mehreren aufgenommenen Koppelungsprodukten selektioniert, die das spezielle Gen umfassen, und aus den selektionierten Zellen mit einem Gehalt an speziellem Gen jeweils die gesamte DNS isoliert,
- (xi) die isolierte DNS in vitro in Phagenpartikel verpackt,
- (xii) in an sich bekannter Weise die gebildeten In-Vitro-Verpackungsprodukte in Escherichia coli transduziert und
- (xiii) (a) sofern Zellgemische (a) oder (b) gemäß Stufe (vii) gebildet wurden, in an sich bekannter Weise die gebildeten Escherichia-coli-Hybride repliziert oder (b) sofern Zellgemisch (b) gemäß Stufe (vii) gebildet wurden, in an sich bekannter Weise (ggf. nach Replikation der gebildeten Escherichia-coli-Hybride) die Stufen (vi) bis (xiii) (a) durchführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man bei Stufe (i) Fragmente mit ausschließlich übereinstimmenden
Enden erzeugt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man bei der Stufe (vi) gemäß Anspruch 1
in linearer Form isolierte Koppelungsprodukte in an sich bekannter
Weise durch Ligasenbehandlung oligomerisiert.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß man bei
der Stufe (vi) gemäß Anspruch 1
- (a) im Fall von Cosmidhybriden als Koppelungsprodukten in an sich bekannter Weise die Koppelungsprodukte aus den Escherichia-coli-Hybriden isoliert oder
- (b) im Fall von Cosmidhybriden als Koppelungsprodukten in an sich bekannter Weise die Koppelungsprodukte in den Escherichia-coli-Hybriden in vivo verpackt, sofern die Escherichia-coli-Hybride einen Phagen Lambda oder einen lambdoiden Phagen enthalten, der durch Temperaturinduktion eine Hülle bilden kann, die verpackten Koppelungsprodukte aus den Escherichia-coli-Hybriden isoliert und die Koppelungsprodukte aus der Verpackung isoliert und ggf. (durch Ligasenbehandlung) oligomerisiert oder
- (c) im Fall von Hybriden von Phagen Lambda oder lambdoiden Phagen als Koppelungsprodukten in an sich bekannter Weise die Koppelungsprodukte isoliert und ggf. (durch Ligasenbehandlung) oligomerisiert.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß man bei den Stufen (viii)
bis (x) gemäß Anspruch 1 auf Zellen mit jeweils ein oder
mehreren aufgenommenen Koppelungsprodukten selektioniert
und danach auf Zellen mit jeweils ein oder mehreren aufgenommenen
Koppelungsprodukten selektioniert, die das spezielle
Gen umfassen.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19823203537 DE3203537A1 (de) | 1982-02-03 | 1982-02-03 | Verfahren zur ueberfuehrung eines speziellen gens eines genoms in escherichia coli |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19823203537 DE3203537A1 (de) | 1982-02-03 | 1982-02-03 | Verfahren zur ueberfuehrung eines speziellen gens eines genoms in escherichia coli |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3203537A1 DE3203537A1 (de) | 1983-08-04 |
DE3203537C2 true DE3203537C2 (de) | 1990-09-13 |
Family
ID=6154629
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19823203537 Granted DE3203537A1 (de) | 1982-02-03 | 1982-02-03 | Verfahren zur ueberfuehrung eines speziellen gens eines genoms in escherichia coli |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE3203537A1 (de) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61132187A (ja) * | 1984-11-30 | 1986-06-19 | Banyu Pharmaceut Co Ltd | 新規コスミドベクタ−及びそれを用いる遺伝子バンクの製造方法 |
JPH0898690A (ja) * | 1994-05-09 | 1996-04-16 | Banyu Pharmaceut Co Ltd | 新規コスミドベクターを用いる遺伝子バンクの製造法 |
-
1982
- 1982-02-03 DE DE19823203537 patent/DE3203537A1/de active Granted
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Publication number | Publication date |
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DE3203537A1 (de) | 1983-08-04 |
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