DE19849348A1 - Linear Amplification mediated PCR (=LAM PCR) - Google Patents

Linear Amplification mediated PCR (=LAM PCR)

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Christof Von Kalle
Manfred Schmidt
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Von Kalle Christof Dr 79227 Schallstadt De Sc
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Universitaetsklinikum Freiburg
Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
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    • C12Q1/6855—Ligating adaptors

Abstract

Es wird ein hochsensitives Verfahren zur Identifikation und/oder Sequenzierung einer unbekannten DNA- oder RNA-Sequenz beschrieben, die an eine bekannte DNA- oder RNA-Region angrenzt, bei dem man DOLLAR A a) in einer ersten Stufe ein oder mehrere DNA- oder RNA-Fragmente einer oder mehrerer linearen PCR-Stufen unter Verwendung eines oder mehrerer Primer unterzieht, DOLLAR A b) die erhaltenen Einzelstränge zu Doppelsträngen auffüllt, DOLLAR A c) die Doppelstränge mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen schneidet, um glatte oder kohäsive Enden zu erzeugen, DOLLAR A d) an die geschnittenen Enden ein Oligonukleotid bekannter Sequenz anfügt und DOLLAR A e) die erhaltenen DNA-Fragmente mit bekannten Verfahren vermehrt und nachweist.

Description

Die Erfindung betrifft ein hochsensitives Verfahren zur Identifikation und/oder Sequenzierung einer unbekannten DNA- oder RNA-Sequenz, die an eine bekannte DNA- oder RNA-Region angrenzt.
Die Einführung des PCR-Verfahrens hat die DNA-Amplifikation und DNA-Analytik sehr bereichert. Unter Anwendung dieses Verfahrens ist es möglich geworden, DNA-Fragmente, auch wenn sie nur in geringer Menge vorliegen, zu vervielfältigen und nachzuweisen. Inzwischen gibt es eine Vielzahl von Varianten des PCR- Verfahrens, die für verschiedenste Problemstellungen geeignet sind. Allerdings ist ein Nachteil bekannter Verfahren, daß der Nachweis, die Charakterisierung und die Definition unbekannter DNA-Regionen, die viralen, transgenen oder genomischen Ursprungs sein können, nur begrenzt durchzuführen ist.
Bei dem PCR-Verfahren in seiner allgemeinsten Form wird ein DNA-Fragment aufgespalten in seine beiden Stränge, dann werden zwei Primer zugegeben, von denen einer an das eine Ende des einen Strangs und der andere an das andere Ende des anderen Strangs bindet und dann werden unter Verwendung einer Polymerase die Stränge jeweils aufgefüllt, wobei wieder Doppelstränge erhalten werden, die wiederum gespalten werden und wiederum für die Vermehrung eingesetzt werden können. Auf diese Weise kann DNA exponentiell vermehrt werden. Um jedoch diese Reaktion durchführen zu können, müssen die beiden Enden der DNA bekannt sein, um Primer dafür bereitstellen zu können. Dies ist jedoch häufig nicht der Fall, insbesondere, wenn man Insertions- und Integrationsstellen, Transposons, Transgenbereiche und ähnliches nachweisen will.
Um Nucleotidfragmente zu amplifizieren, deren Sequenz nur zum Teil bekannt ist, wurden verschiedene Varianten der PCR vorgeschlagen. Eine Variante, als inverse PCR bezeichnet, besteht darin, die DNA mit Restriktionsenzymen so zu schneiden, daß "klebrige Enden" (sticky ends) entstehen, die zu einem Ring cyclisiert werden, wobei dann diese Ring-DNA amplifiziert wird. In diesem Fall können zwei Primer verwendet werden, die zu dem bekannten Teil der Sequenz komplementär sind und sich nur in der Orientierung unterscheiden.
Eine weitere Variante für die Amplifikation von DNA- Bruchstücken, deren Sequenz man nur teilweise kennt, ist eine LM-PCR (Linker-vermittelte PCR), d. h. eine PCR, bei der an die DNA-Fragmente Oligonucleotide bekannter Sequenz angefügt werden. Für die PCR kann dann ein Primer verwendet werden, der mit diesem Linker bindefähig ist, und ein weiterer Primer, der mit dem bekannten Teil der DNA-Sequenz bindefähig ist.
Ein derartiges Verfahren wird beispielsweise von Guy Prod'hom et al. in "A Reliable Amplification Technique for the Characterization of Genomic DNA Sequences Flanking Insertion Sequences", FEMS Microbiology, Letters, 158 (1998) 75 bis 81 beschrieben. Dazu wird vor Durchführung des PCR-Verfahrens DNA, die ein zu amplifizierendes Gen enthält, geschnitten, dann an die Schnittstellen ein doppelsträngiger Linker in solcher Weise ligiert, daß der Linker unter den Ligierungsbedingungen stabil bleibt, aber unter den Bedingungen der PCR nach der Spaltung des Doppelstrangs bei jedem der beiden Einzelstränge jeweils an einem Ende der Linker abgespalten wird und auch nicht wieder religiert wird. Man setzt dann einen Primer zu, der komplementär ist zu dem Beginn der bekannten Sequenz und läßt zu einem Doppelstrang auffüllen. Da dieser Primer nur an einen Strang binden kann, wird nur einer der beiden Stränge dupliziert. Die neu synthetisierte DNA wird dann als Matrize in den nachfolgenden Zyklen der PCR-Reaktion verwendet, wobei dann zwei Primer eingesetzt werden, und zwar einmal der Primer, der in der ersten Stufe verwendet wurde, der spezifisch mit der bekannten DNA bindet, und als zweites ein Primer, der mit dem Linker bindet. Auf diese Weise wird das DNA-Fragment vervielfältigt, das das gesuchte Gen enthält.
Auch dieses Verfahren leidet noch unter den Nachteilen, daß aufgrund präparativer Verluste die Sensitivität und Spezifität gering sind. Eine Charakterisierung von einzelnen oder auch multiplen Insertionsflanken auf Einzelzellniveau und/oder innerhalb eines komplexen DNA-Gemisches ist mit den bekannten Verfahren nicht möglich.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein hoch­ empfindliches Verfahren zum Nachweis, zur Charakterisierung und Definition unbekannter DNA- und RNA-Regionen, die viralen, transgenen oder genomischen Ursprungs sein können, die an bekannte Sequenzen angrenzen, bis auf Einzelzellniveau bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst mit einem Verfahren zum Nachweis einer nur zum Teil bekannten DNA- oder RNA-Sequenz, bei dem man
  • a) in einer ersten Stufe ein oder mehrere DNA- oder RNA Fragmente einer oder mehrerer linearen PCR-Stufen unter Verwendung eines oder mehrerer Primer unterzieht
  • b) die erhaltenen Einzelstränge zu Doppelsträngen auffüllt,
  • c) die Doppelstränge mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen schneidet, um glatte oder kohäsive Enden zu erzeugen,
  • d) an die geschnittenen Enden ein Oligonukleotid bekannter Sequenz anfügt und
  • e) die erhaltenen DNA-Fragmente mit bekannten Verfahren vermehrt und nachweist.
Das Prinzip der Erfindung besteht darin, daß die Zielsequenz unmittelbar nach Freisetzung der DNA oder RNA aus einer oder mehreren Zellen mit einem spezifischen Oligonucleotid linear vervielfacht wird. In dieser Stufe wird nur ein Primer eingesetzt, der an den bekannten Teil der zu amplifizierenden Nucleotidsequenz bindet.
Der ausgewählte Primer setzt an der bekannten DNA- bzw. RNA- Sequenz an, komplementäre Nucleotidbausteine lagern sich an und werden über eine thermostabile DNA-Polymerase miteinander verknüpft. Dieser Reaktionsschritt, d. h. der Aufbau eines komplementären Stranges, wird vielfach wiederholt, z. B. 10- bis 100-fach, insbesondere 30- bis 70-fach. Die Sequenz der so entstandenen DNA-Stränge setzt sich aus der bekannten und der sich anschließenden unbekannten DNA-Region zusammen. Entgegen herkömmlichen PCR-Verfahren zur exponentiellen Vervielfachung von Nucleinsäuren wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in der ersten Stufe nur ein Primer verwendet. Nach der Durchführung dieser linearen PCR-Stufen wird das Reaktionsgemisch aufgereinigt, um den nächsten präparativen Schritt zu ermöglichen.
Diese Aufreinigung kann in an sich bekannter Weise erfolgen, z. B. durch Hirt-Extraktion, Ausfällung mit EtOH, Anwendung einer Silika-Matrix oder von Glaskugeln oder durch Konzentrierungsschritte.
Um jedoch die Sensitivität und Spezifität des Verfahrens zu erhöhen, wird bevorzugt die Abtrennung mit Hilfe eines spezifisch bindenden Paares durchgeführt, wobei der in der ersten Stufe verwendete Primer einen Partner eines spezifisch bindenden Paares gebunden trägt und nach Durchführung der linearen PCR mit Hilfe des zweiten spezifisch bindenden Partners die Einzelstränge (= Ziel DNA) abgetrennt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden daher
  • a) in einer ersten Stufe ein oder mehrere DNA- oder RNA- Fragmente einer oder mehrerer linearen PCR-Stufen unter Verwendung eines oder mehrerer Primer durchführt, wobei der oder die Primer mit einem Partner eines spezifisch bindenden Paares versehen ist,
  • b) mit Hilfe des zweiten Partners des spezifisch bindenden Paares solche Einzelstrangfragmente, die den ersten bindenden Partner tragen, aus der Reaktionsmischung abtrennt,
  • c) die erhaltenen Einzelstränge zu Doppelsträngen auffüllt,
  • d) die Doppelstränge mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen schneidet, um glatte oder kohäsiven Enden zu erzeugen,
  • e) an die geschnittenen Enden ein Oligonukleotid bekannter Sequenz anfügt und
  • f) die erhaltenen DNA-Fragmente mit bekannten Verfahren vermehrt und nachweist.
Für diese bevorzugte Ausführungsform wird ein Primer eingesetzt, der einen Partner eines spezifisch bindenden Paares aufweist, wobei der andere Partner des spezifisch bindenden Paares dazu verwendet wird, die Stränge dann aus der Reaktionslösung abzutrennen.
Nach der linearen Vervielfältigung der Zielsequenz wird dann der mit einem Partner eines spezifisch bindenden Paares versehene Strang durch Zugabe des anderen Partners des spezifisch bindenden Paares abgetrennt, wobei der zweite Partner, der zum Abtrennen verwendet wird, bevorzugt an Kugeln, eine Säulenmatrix oder der Oberflächenbeschichtung von Röhrchen immobilisiert ist.
Spezifisch bindende Paare sind auf dem Gebiet der Biotechnologie weithin bekannt. Das bekannteste und am häufigsten eingesetzte Paar ist die Kombination aus Biotin und Avidin bzw. Streptavidin. In einer bevorzugten Ausführungsform wird daher der Primer biotinyliert und Avidin oder Streptavidin immobilisiert an Kügelchen oder der Oberfläche des Röhrchens eingesetzt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Kügelchen, die das Avidin oder Streptavidin immobilisiert aufweisen, magnetisch, so daß sie noch leichter aus der Lösung abgetrennt werden können.
Mit Hilfe des immobilisierten Partners wird der den biotinylierten Primer tragende Strang aus der Reaktionsmischung entfernt und von den nicht umgesetzten Verbindungen befreit. Bevorzugt werden in üblicher Weise mehrere Waschschritte durchgeführt.
Die über das spezifisch bindende Paar immobilisierte Ziel-DNA kann dann festphasengebunden weiterbehandelt werden, um letztendlich eine exponentielle PCR durchführen zu können zum Nachweis bzw. zur Detektion. Dazu werden zuerst die Stränge aufgefüllt zu Doppelsträngen, und dann die freien Enden der Stränge mit passenden Restriktionsenzymen geschnitten, um glatte oder kohäsive Enden zu erzeugen, an die dann ein Oligonucleotid bekannter Sequenz oder ein Poly-tail angefügt werden kann.
Der so erhaltenen Doppelstrang kann dann in einem PCR-Verfahren in üblicher Weise amplifiziert werden. Er weist auf beiden Seiten eine bekannte Sequenz auf, für die dann Primer bereitgestellt werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die die Ziel-DNA enthaltenden Doppelstränge mit einem doppelsträngigen Oligonucleotid, dessen Nucleotidsequenz bekannt ist, versehen. Dann werden die Stränge in an sich bekannter Weise denaturiert, d. h. in Einzelstränge aufgespalten, und dann eine erste exponentielle Vervielfachung der DNA-Stränge durchgeführt. Hierzu werden mindestens zwei Primer verwendet, von denen einer mit dem bekannten Teil der Ziel-DNA bindet, während der andere komplementär zu dem Oligonucleotid mit bekannter Sequenz ist.
Im Anschluß an diese Amplifizierung können entweder noch weitere exponentielle PCR-Stufen, gegebenenfalls unter Verwendung anderer Primer durchgeführt werden, oder die DNA kann mit an sich bekannten Diagnoseverfahren untersucht werden. Bevorzugt wird die DNA durch Gelelektrophorese, Sequenzierung oder Blotting-Verfahren weiter untersucht. Diese Verfahren sind dem Fachmann bekannt und bedürfen hier keiner näheren Erläuterung.
Es wurde gefunden, daß der Einsatz einer linearen Vervielfältigung im ersten Reaktionsschritt zur Vervielfachung des Ausgangsmaterials führt und auftretende Verluste in den nachfolgenden präparativen Schritten kompensiert. Bei einer 50- fachen Vervielfachung der Zielsequenz können bereits 98% der nachfolgend auftretenden Verluste ausgeglichen werden. Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann überraschend eine unerwartet hohe Sensitivität und Spezifität erzielt werden, die durch eine Kombination der einzelnen Schritte nicht hätte erwartet werden können.
Auch die in der bevorzugten Ausführungform in der zweiten Stufe durchgeführte spezifische Abtrennung der Ziel-DNA führt zu einer weiteren Steigerung der Empfindlichkeit und Selektivität des erfindungsgemäßen Verfahrens, da durch das Abtrennen über spezifisch bindende Paare das Hintergrundrauschen sehr stark vermindert werden kann.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, eine bisher nicht erreichte Sensitivität und Spezifität zu erzielen. Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Verfahren ausgezeichnet geeignet, um DNA-Fragmente, von denen nur ein Teil der Sequenz bekannt ist, zu vervielfältigen und zu analysieren.
Durch die Kombination von linearer Amplifikation, spezifischen Selektions- und Amplifikationsschritten wird eine mit anderen Methoden nicht erreichbare Sensitivität und Spezifität erzielt. Außerdem ergibt sich infolge der Möglichkeit eines simultanen Nachweises multipler Insertionsflanken innerhalb eines Reaktionsgemisches eine enorme Kosten- und Zeitersparnis.
Das erfindungsgemäß bereitgestellte LAM-PCR-Verfahren kann einfach durch die Auswahl spezifischer Primer auf eine beliebige Zielsequenz, sei sie transgenen, viralen, retroviralen oder genomischen Ursprungs - übertragen werden. Aufgrund des hohen Auflösungsvermögens ist ein schnelles Screening multipler Insertionsflanken innerhalb einer Probe mit geringsten Mengen an DNA möglich.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind auch Markierungs- und Gentherapiestudien möglich. Es können nicht nur Klonalitätsanalysen, sondern auch reine Momentaufnahmen durchgeführt werden, z. B. bei der hämatopoietischen Repopulation nach einer Transplantation, einer Kompetition zwischen retroviralen markierten Zellen des Transplantats und im Körper verbliebenen Zellen und es können Zellreihen und Zellgenerationen verfolgt werden, z. B. bei der Hämatopoiese. Weiterhin ist eine "Target Site Selection" von retroviralen Integraten, z. B. bei HIV, möglich. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch geeignet als Selektionsmethode zum Auffinden transkriptionell aktiver Bereiche und zur Analyse verschiedener Substanzen bezüglich der Förderung oder Hemmung der retroviralen Integration eingesetzt zu werden.
Auch zur Untersuchung von Transposons bei der Insertionsmutagenese und für ein "bacterial strain typing", z. B. bei Mykobacterium tuberkulosis ist das Verfahren anwendbar. Transgene Pflanzen und Tiere können ebenfalls untersucht werden. Das Verfahren eignet sich für eine Resistenz-Genlokalisation bei Kulturpflanzen und eine Transgenanalytik bei jungen Tieren ohne nachfolgende, Mortalisierung.
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde zur simultanen Charakterisierung multipler retroviraler Integrationsflanken durchgeführt. Dazu wurde genomische DNA aus HeLa-Zellklonen analysiert, die mit dem von murinem Leukämievirus abgeleiteten Vektor pLN transduziert wurden. 10 pg genomischer DNA pro transduziertem HeLa-Klon innerhalb eines Gemisches von 1 µg nicht transduzierter genomischer DNA, äquivalent einer DNA Menge von 1,5 Zellen mit diploidem Genom, waren ausreichend, um die vorhandenen retroviralen Integrationsflanken nachzuweisen. Dies entspricht einem Auflösungsvermögen von mehr als 0,001%.
Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel erläutert.
Beispiel
Das Beispiel betrifft die klonale Analyse von transduzierten hämatopoietischen Stamm-Zellen durch Charakterisierung der retroviralen Integrationsstellen.
Es wurde eine retrovirale Integrationsanalyse von transduzierten hämatopoietischen Zellen im Laufe einer klinischen Genmarkierungsstudie durchgeführt. Periphere Blutstammzellen (PBS) eines CML-Patienten (chronische myeloische Leukämie) wurden transduziert mit einem retroviralen Vektor (pNL) der auf MLV (Moloney Murine Leukemia) basiert. Nach Reinfusion der markierten Zellen wurde jeweils eine Fraktion des peripheren Blutes zu verschiedenen Zeiten analysiert im Hinblick auf das Vorhandensein von retroviralen Integrationsstellen.
Durch Southern Blot-Analyse konnte die Identität der aufgefundenen DNA-Fragmente bestätigt werden. Mit bisher bekannten Methoden können derartige Untersuchungen nicht durchgeführt werden. Eine weitere Analyse und Sequenzierung ermöglicht die Identifizierung von einzelnen gutartigen und bösartigen Stammzellklonen. Für die Analyse wurde folgendermaßen vorgegangen:
Zunächst erfolgte eine lineare Vervielfachung (lineare PCR) der Ziel-Sequenzen unmittelbar nach Freisetzung der DNA aus den Zellen mit spezifischen, biotinylierten Oligonukleotiden.
Nach Zugabe der Primer, der Nukleotide und der Taq-Polymerase wurde der Amplifikationsschritt 50 Mal wiederholt. Im Unterschied zu der normalen PCR wurde nur ein Primer verwendet. Da der Primer biotinyliert ist, banden die amplifizierten DNA- Sequenzen an paramagnetische Kügelchen, die mit Streptavidin gekoppelt waren.
Der zu dem an die Kügelchen gekoppelten DNA-Strang komplementäre Strang wurde mit Hilfe des Hexanukleotid-Primings aufgebaut. Die nun doppelsträngige DNA wurde mit dem Restriktionsenzym Sse9I geschnitten, wodurch kohesive Enden entstehen. An diese Ziel-DNA wurde eine sogenannte Linker- Kassette angelagert und mit Hilfe einer Ligasereaktion verbunden. Bei der Linker-Kasette handelt es sich um ein teilweise doppelsträngiges Oligonukleotid. Die Ziel-DNA wurde anschließend denaturiert und mit Hilfe der PCR-Reaktion amplifiziert. Hierbei wurde ein Primer so gewählt, daß er sich an die bereits bekannte DNA-Region anlagert. Der andere Primer lagert sich an die Linker-Kassette an. Bei der Amplifikation wurde zunächst 10% des so entstandenen Produkts einer 1.PCR mit 28 Zyklen unterzogen, wobei ein verwendeter Primer aus dem bekannten DNA-Bereich ebenfalls in biotinylierter Form zugegeben wurde. Dieses erste PCR-Produkt wurde mittels Magnetic Capture abgetrennt. Mit 10% des so entstandenen Produkts wurde eine 2.PCR = nested PCR mit 28 Zyklen durchgeführt. 20% dieses 2.PCR-Produkts wurden über Gelelektrophorese (2%ige Agarose) aufgetrennt, auf eine Nylonmembran geblottet, mit einer zu der bekannten DNA-Sequenz homologen Digoxigenin-markierten Sonde hybridisiert und über Chemilumineszenz detektiert.
Die Ergebnisse sind in der anliegenden Fig. 1 dargestellt. Die Überschriften über den einzelnen Gelspuren haben die folgende Bedeutung:
M: Digoxygenin-markierter Molekulargewichtsstandard
d8: 8 Tage nach Reinfusion
d13: 13 Tage nach Reinfusion
d14: 14 Tage nach Reinfusion
d15: 15 Tage nach Reinfusion
d21: 21 Tage nach Reinfusion
d124: 124 Tage nach Reinfusion
d-7: 7 Tage vor Reinfusion (negative Kontrolle) +K: 20 pg von transduzierter und 1 µg von nicht transduzierter DNA von Helazellen
-K: Kontrolle mit Wasser
Nach der ersten Amplifikation wurden alle Reaktionsschritte an Festphase durchgeführt. Die Aufreinigung zwischen den einzelnen Schritten erfolgte per Magnet. Das "verbrauchte" Reaktionsgemisch wurde einfach per Pipette abgezogen. Es wurde dann einmal mit Wasser nachgewaschen und dann das für den nächsten Reaktionsschritt benötigte Reaktionsgemisch in das Gefäß zugegeben. Das bedeutet, daß alle Reaktionsschritte bis hin zum ersten exponentiellen Vervielfachungsschritt (1. PCR) in einem Reaktionsgefäß durchgeführt wurden.

Claims (16)

1. Verfahren zur Identifikation und/oder Sequenzierung einer unbekannten DNA- oder RNA-Sequenz, die an eine bekannte DNA- oder RNA-Region angrenzt, unter Verwendung eines PCR- Verfahrens, bei dem man
  • a) in einer ersten Stufe ein oder mehrere DNA- oder RNA Fragmente einer oder mehrerer linearen PCR-Stufen unter Verwendung eines oder mehrerer Primer unterzieht,
  • b) die erhaltenen Einzelstränge zu Doppelsträngen auffüllt,
  • c) die Doppelstränge mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen schneidet, um glatte oder kohäsive Enden zu erzeugen,
  • d) an die geschnittenen Enden ein Oligonukleotid bekannter Sequenz anfügt und
  • e) die erhaltenen DNA-Fragmente mit bekannten Verfahren vermehrt und nachweist.
2. Verfahren zur Identifikation und/oder Sequenzierung einer DNA- oder RNA-Sequenz nach Anspruch 1, bei dem man
  • a) in einer ersten Stufe ein oder mehrere DNA- oder RNA- Fragmente einer oder mehrerer linearen PCR-Stufen unter Verwendung eines oder mehrerer Primer durchführt, wobei der oder die Primer mit einem Partner eines spezifisch bindenden Paares versehen ist,
  • b) mit Hilfe des zweiten Partners des spezifisch bindenden Paares solche Einzelstrangfragmente, die den ersten bindenden Partner tragen, aus der Reaktionsmischung abtrennt,
  • c) die erhaltenen Einzelstränge zu Doppelsträngen auffüllt,
  • d) die Doppelstränge mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen schneidet, um glatte oder kohäsiven Enden zu erzeugen,
  • e) an die geschnittenen Enden ein Oligonukleotid bekannter Sequenz anfügt und
  • f) die erhaltenen DNA-Fragmente mit bekannten Verfahren vermehrt und nachweist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als spezifisch bindendes Paar Biotin und Avidin bzw. Streptavidin verwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe a) einen oder mehrere mit Biotin markierte Primer verwendet und diese(n) unmittelbar nachfolgend durch spezifische Bindung an Avidin oder Streptavidin aus der Reaktionsmischung abtrennt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den zweiten Partner des spezifisch bindenden Paares an Kugeln oder beschichteten Röhrchen immobilisiert.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Aufbau des komplementären DNA- Strangs Hexanukleotid-Priming verwendet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Aufbau des komplementären DNA- Strangs degenerierte Primer verwendet.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Stufe 1a) und 2b) erhaltenen DNA-Fragmente an Festphase zu Doppelsträngen komplettiert.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufen 1c) und 2d) an Festphase durchführt.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe 1d) und 2e) an Festphase durchführt und die Ziel-DNA somit entsprechend einer "Festphasen-LM-PCR" unmittelbar nachfolgend vermehrt.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man in den Stufen 1d) und 2e) als Oligonukleotid eine Linker Kassette ligiert.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß man in den Stufen 1d) und 2e) ein Poly (A, T, G oder C)-Tailing durchführt.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man anschließend die Ziel-DNA denaturiert und mit einem PCR-Verfahren amplifiziert, wobei für das PCR- Verfahren ein Primer verwendet wird, der zu dem Linker komplementär ist und ein zweiter Primer verwendet wird, der zu dem bekannten Teil der DNA-Region komplementär ist.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die mit dem ersten PCR-Verfahren gewonnene Ziel-DNA einer zweiten Vervielfachung unter Verwendung eines Nested-PCR-Verfahrens unterzogen wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im Anschluß an die Amplfikation die Ziel- DNA mit Gelelektrophorese, durch Blotting-Verfahren oder Sequenzierung nachgewiesen wird.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische Lokalisierung von Transposons, retroviralen Integrationsereignissen, retroviralen Vektoren, transkriptionell aktiven Bereichen, Resistenzgenen und/oder Transgenen nachgewiesen, vervielfältigt, identifiziert und/oder sequenziert werden.
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